ES2497641T3 - Dirección a la regulación de VEGF-B de transportadores de ácidos grasos para modular enfermedades humanas - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de VEGF-B para su uso en el tratamiento de una dislipidemia en un sujeto humano, en donde dicho agente se selecciona de entre: (a) un anticuerpo anti VEGF-B o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y (b) un oligonucleótido antisentido que inhibe la transcripción o la traducción de VEGF-B, expresado opcionalmente a partir de un vector de expresión.

Description

Dirección a la regulación de VEGF-B de transportadores de ácidos grasos para mooular enfermedades humanas

5 Antecedentes de la invención

Las proteínas de transporte de ácidos grasos (FATP) son proteínas unidas a membrana que transportan ácidos grasos libres (FFA) a traves de la membrana plasmática, y son por lo tanto responsables de la captación celular de FFA del espacio extracelular. Chiu el al., indican que la sobreexpresión transgénica de FATP1 en el corazón conduce a un aumento de la captación de lipidos, lipotoxicidad y míopatia cardiaca (Cira Res., 96: 225-233, 2005). Chiu et al. ilustran la necesidad critica de una captación controlada de FFA en los tejidos. Los FFA acumulados que no se oxidan de forma apropiada pueden ser tóxicos para las células.

La familia de FATP de proteinas comprende seis miembros (FATP 1-6) con patrones de expresión definidos. Dos de

15 los tejidos más relevantes para considerar con respecto a metabolismo de ácidos grasos y resistencia a insulina son tejido adiposo y músculo esquelético. La expresión de FATP1 es alta en ambos tejidos, mientras que FATP4 es mucho menor (siendo su sitio principal de expresión el intestino delgado), pero ambos se han ligado a la resistencia a insulina y parámetros asociados. FATP1 se ha ligado a resistencia a insulina y se expresa en tejido adiposo y músculo esquelético (Kim el al, J. Clin. Inves!., 113: 756-763, 2004). FATP2 está localizada en peroxisomas del hígado y riñón y está implicada en la activación tanto de ácidos biliares como de ácidos grasos (Mihalik el al., J. Biol. Chem., 277: 24771-24779, 2002). FATP4 también se ha ligado a parámetros relacionados con la resistencia a insulina y se expresa en los intestinos, hígado y tejido adiposo. FATP 2, 3 Y 5 se expresan en el hígado y riñón. FATP6 se expresa casi exclusivamente en el corazón (Gimeno el al., J. Biol. Chem., 278: 16039-16044, 2003).

25 También se ha sugerido que la acumulación de lipidos en tejidos particularmente de músculo esquelético, induce síndrome de resistencia a insulina (también conocido como el sindrome metabólico diabético). Se ha mostrado que FATP4 por análisis de enlace es un gen candidato en el síndrome de resistencia a insulina caracterizado por dislipidemia, hipertensión y el estado procoagulante (Gertow el al., Clin. Endocrinol. Metab., 89: 392-399, 2004). De forma similar, FATP1 se ha ligado a lipemia poslpand rial elevada y alteraciones en la distribución de tamaños de partículas LDL (Gertow el al., Atherscler., 167: 265-273,2003). Puede encontrarse una revisión de proteínas de transporte de ácidos grasos y su papel en la resistencia a insulina en Fisher el al., Curro Opin. lipldol. 16: 173-178, 2005. La acumulación aberrante de lipidos está estrechamente relacionada con efectos lipotóxicos perjudiciales, resistencia a la insulina, alteraciones del metabolismo tanto de lipidos como de hidratos de carbono y otras caracteristicas del sindrome metabólico (Unger et al., Endocrinol., 144: 5159-5164, 2004). Por lo tanto, existe la

35 necesidad de nuevos materiales y métodos para modular la expresión de FATP ylo actividad in vivo, para profilaxis o terapia de diversas enfermedades y afecciones que están influidas por las FATP.

La presente invención surge de estudios descritos adicionalmente en el presente documento que ligan de nuevo el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular B (VEGF-B) con la modulación de FATP.

La Solicitud de Patente publicada de los Estados Unidos 2006/088882A1 (Jain et al) propone el uso de anticuerpos para disminuir la actividad del receptor 1 de VEGF para su uso en la disminución del peso corporal total y el porcentaje de grasa corporal en un mamífero. Sin embargo, no proporciona indicios de dirigir especificamente VEGF-B para el tratamiento de cualquier forma de dislipidemia. De hecho, ha habido incertidumbre anteriormente

45 acerca del papel de VEGF-B. Por el contrario, el inventor ha relacionado ahora VEGF-B con la expresión de componentes de la maquinaria de transporte de ácidos grasos y ha demostrado que ratones deficientes en VEGF-B tienen menos gotas lipídicas en el tejido cardiaco en comparación con ratones normales, lo que sugiere un papel de VEGF-B en el control de la captación de lipídos del torrente sanguíneo, por ejemplo, como ahora se reívindica en el presente documento.

Sumario de la invencíón

La presente invención proporciona un inhibidor de VEGF-B para su uso en el tratamiento de una dislípidemia en un sujeto humano, incluyendo hipercolesterolemia y/o hipertrigliceridemia, en donde dicho agente se selecciona de 55 entre:

(a)

un anticuerpo anti VEGF-B o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(b)

un oligonucleótido antisentido que inhibe la transcripción o la traducción de VEGF-B, expresado opcionalmente a partir de un vector de expresión.

Dicho uso incluye además opcionalmente una o más etapas de controlar uno o más parámetros en el sujeto, para confirmar la segu ridad y/o eficacia del tratamiento ylo para optimizar la dosificación. Por lo tanto, por ejemplo, el uso comprende además opcionalmente controlar marcadores lipídicos en una muestra biológica que comprende un tejido o fluido del sujeto. Los tejidos ejemplares incluyen bíopsias de cualquier órgano (hígado, riñón, columna,

65 corazón, vaso, íntestino, etc.) o píel o pelo, por ejemplo. Los fluidos ejemplares íncluyen sangre, líquido cefalorraquídeo, semen, saliva u otras secreciones o excreciones.

Los anticuerpos que inmunorreaccionan (se unen) con VEGF-B (también conocidos como anticuerpos de VEGF-B o anticuerpos anti VEGF-B); para su uso de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos que se unen a múltiples isoformas de VEGF-B, así como anticuerpos que muestran unión preferente o especificidad por una isoforma, tal

5 como un anticuerpo de VEGF-B167 o un anticuerpo de VEGF-Bl66.

Las composiciones adecuadas para administración incluyen en la puesta en práctica de la invención uno o más componentes adicionales tales como diluyentes, adyuvantes, vehiculos, conservantes, saporiferos farmacéuticamente aceptables, u otros aditivos convencionales descritos en el presente documento yfo conocidos en el campo.

Ad icionalmente, un inh ibidor de VEGF-B como se ha analizado anteriormente puede ser para su uso en coterapia. La administración de múltiples compuestos terapéuticos puede ser simultánea (en mezd a o separados), secuencial,

o separada en el tiempo durante un periodo de tratamiento.

Descripción detallada de la invención

El inventor ha demostrado que varias FATP y LPL endoteliales están regulados negativamente en animales deficientes en VEGF-B, y por el contrario algunas FATP y LPL están regulados positivamente en condiciones de sobreexpresión de VEGF-B. Estos datos sugieren que VEGF-B modula la expresión de FATP y LPL, Y de este modo tanto la hidrólisis de triglicéridos en situación, así como la captación de FFA del torrente sanguíneo a diversos parénquimas. El análisis directo de la acumulación de lipidos en corazones de ratón normales y deficientes en VEGF-B por tinción con Oil Red O han verificado esta posibilidad, ya que se visualizan gotas lipídicas abundantes en secciones tisulares de animales normales, mientras que las secciones tisulares de animales deficientes en VEGF-B

25 contienen muy pocas, si contienen alguna, gotas lipídicas. Se postula que la expresión controlada por VEGF-B de FATP y expresión de LPL tienen implicaciones en varias enfermedades importantes como cáncer, diabetes, obesidad, enfermedades cardiovasculares y enfermedades degenerativas neurológicas, como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y esClerosis lateral amielotrófica (ALS).

En cáncer, la expresión (o sobreexpresión) de VEGF-B puede controlar el estado de energia de las células tumorales proporcionando combustible de alta energía como FFA, y afectando de este modo a la velocidad de crecimiento, asi como otros parámetros fisiológicos de tumores (tanto células tumorales como estroma). Además, VEGF-B puede tener un papel en el síndrome de debilitamiento muscular, denominado caquexia, que afecta aproximadamente al 50% de todos los pacientes con cáncer y se ve frecuentemente en pacientes con insuficiencias

35 cardiacas o renales. En pacientes con caquexia, se postula que la terapia con VEGF-B para mejorar la captación de FFA tiene un valor terapéutico.

En diabetes, VEGF-B puede modular la captación de lipidos en sangre a las células endoteliales, y la expresión aberrante (especialmente sobreexpresión) puede dar como resultado dislipidemia, una afección hallada en muchos pacientes diabéticos como parte del síndrome metabólico. En estados resistentes a insulina tales como obesidad, el metabolismo de ácidos grasos y la homeostasis están Claramente alterados. La eliminación de ácidos grasos y capacidad de almacenamiento en tejido adiposo están alterados, y los ácidos grasos pueden acumularse en la circulación y en tejidos no adiposos tales como músculo esquelético del higado en forma de triacilglicerol, diacilglicerol, ceramidas y acil-CoA grasos. Dicha acumulación de lípidos ectópicos está estrechamente relacionada

45 con efectos lipotóxicos deletéreos, resistencia a insulina, alteraciones del metabolismo tanto de lipidos como de carbohidratos y otras características del síndrome metabólico (Unger el al., Endocrinol., 144: 5159-5164, 2004).

En enfermedad cardiovascular, se sabe que VEGF-B estimula la revascularización después de un infarto de miocardio (véase Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N°: 2003-0008824) y VEGF-B puede tener este efecto estimulando la captación de FFA al miocardio y estimulando indirectamente la revascularización proporcionando un mejor estado de energía en el miocardio.

En enfermedades neurodegenerativas como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, pruebas crecientes sugieren que parte de la patofisiologia de estas enfermedades es un defecto cerebrovascular que puede

55 manifestarse en aporte nulricional reducido a las neuronas, y posterior muerte neuronal. Dado que VEGF-B se expresa abundantemente en el cerebro y puede ser responsable de al menos un aspecto de la captación de nutrientes a las células, es decir, FFA, se postula que la pérdida, o regulación negativa de VEGF-B puede alterar la captación de FFA en las neuronas, y provocar de este modo insuficiencia nutricional de las neuronas que conduce a muerte neuronal. Otras enfermedades neuronales, como ALS, también pueden estar causadas por un defecto cerebrovascular (Storkebaum el al., Na!. Neurosci., 8: 85-92, 2005; Storkebaum el al., Bioessays, 26: 943-943, 2004; Storkebaum et al., J. Clin. Inves!., 113: 14-18,2004).

El factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-B) se expresa abundantemente en varios órganos con una alta renovación metabólica, como el corazón, músculo esquelético, grasa parda, c6rtex cerebral y en células parietales 65 secretoras gástricas. Se ha documentado bien que todos estos órganos y células usan ácidos grasos libres (FFA) como su principal fuente para la producción de energía en condiciones fisiológicas normales. La fuente final de FFA

para la mayoría de las células es el plasma en el que la albúmina del suero es la proteína de transporte principal. El FFA derivado de plasma tiene que atravesar la pared de los vasos sanguineos para usarse por las células parenquimales que requieren energía del corazón, músculos, grasa parda, cerebro, etc. (Van der Vusse et al., Adv. Exp. Med. Biol, 441: 181-191, 1998).

VEGF-B se une al receptor de VEGF 1 (VEGFR-1) que se expresa principalmente por células endoteliales de la pared de los vasos sanguíneos. los animales deficientes en VEGF-B son principalmente normales, lo que sugiere que VEGF-B no tiene un papel importante en el desarrollo del sistema vascular durante la embriogénesis, ni tiene un papel esencial en el mantenimiento del sistema vascular en animales adultos. En ciertas situaciones de tensión (por

10 ejemplo, después de un infarto de miocardio inducido de forma experimental), sin embargo, los animales deficientes en VEGF-B no se recuperan ni revascularizan la zona infartada del corazón tan bien como los ratones normales (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 200510214280).

El término "VEGF-B" como se usa en el presente documento abarca los polipéptidos identificados como VEGF-B en

15 la Patente de Estados Unidos N° 6.331.301, así como la Solicitud de Estados Unidos publicada N° 200310008824 . Un AONc de VEGF-B humano y secuencia de aminoácidos deducida se exponen en la SEC ID N°: 1 y 2, respectivamente.

VEGF-B comprende, pero sin limitación, las isoformas tanto del VEGF-B167 (SEC ID N°: 3) como de VEGF-B167 de

20 ratón (SEC ID N°: 7) y/o VEGF-Bl66 humano (SEC ID N°: 4) y VEGF-Bl86 de ratón (SEC ID N°: 8) o un fragmento o análogo de las mísmas que tenga la capacidad de unirse a VEGFR-l. los análogos activos pueden mostrar al menos 85% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90% de identidad de secuencia, particularmente preferentemente al menos 95% de ídentídad de secuencia, y especialmente preferentemente al menos 98% de identidad de secuencia con los polipéplidos de VEGF-B naturales, como se determina por análisis de BLAST. la

25 sustancia activa típicamente incluirá la secuencia de aminoácidos Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-CysXaa-Gly-Cys-Cys (donde Xaa puede ser cualquier aminoácido) (SEC ID N°: 9) que es característica de VEGF-B. los ejemplos describen ensayos in vilro e in vivo para confirmar que cualquier análogo de VEGF-B seleccionado tenga actividad moduladora de FATP. También se contempla que neuropi lina-1 tiene actividad moduladora de FATP ya que es un correceptor para la unión de VEGF-B con VEGFR-1 .

A. Preparación de AON que codifica polipéplidos de VEGF-B

Puede obtenerse fácilmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de VEGF-B de una diversidad de maneras, incluyendo, sin limitación, síntesis química, exploración de biblioteca de ADNc o genómica, 35 exploración de biblioteca de expresión y/o amplificación por PCR de AONc. Estos métodos y otros útiles para aislar dicho AON se exponen, por ejemplo, en Sambrook, el al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual ," Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbar, N. Y. (1989), en Ausubel, et al., eds., ·Current Protocols In Molecular Biology," Current Protocols Press (1994), y en Berger y Kimmel, "Methods In Enzymology: Gulde To Molecular Cloning Techniques," vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987). En una realización, las secuencias de

40 ácido nudeico que codifican VEGF-B son secuencias de mamífero. Específicamente, las secuencias de ácido nudeico que codifican VEGF-B son humanas y de otros primates.

Puede consegu irse síntesis química de una molécula de ácido nucleico de VEGF-B usando métodos bien conocidos en la técnica , tales como los expuestos por Engels, el al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 (1989). Estos 45 métodos incluyen, entre otros, los métodos de síntesis de ácido nucleico de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato. Típicamente, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de VEGF-B de longitud completa será de varios cientos de pares de bases (pb) o nucleótidos de longitud. los ácidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nuaeótidos de longítud pueden sintetízarse como varíos fragmentos, síendo cada fragmento de hasta aproximadamente 100 nucle6tidos de longitud. El fragmento puede después ligarse, como se describe

50 posteriormente, para formar un ácido nucleico de longitud completa que codifique el polipéptido de VEGF-B. Un método es la síntesis apoyada por polímeros usando química de fosforamidita convencional.

Como alternativa, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de VEGF-B puede obtenerse explorando una biblioteca de AoNc apropiada preparada de una o más fuentes tisulares que expresen el polipéptido, o una

55 biblioteca genómica de cualquier subespecie. La fuente de la biblioteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie que se cree que alberga un gen que codifica VEGF-B o un homólogo de VEGF-B.

la biblioteca puede explorarse con respecto a la presencia del genfAoNc de VEGF-B usando una o más sondas de

60 ácido nucleico (0Iigonucle6IidOS, ADNc o fragmentos de ADN gen6mico que poseen un nivel aceptable de homología con el ADNc de VEGF-B u homólogo de VEGF-B o el gen para clonar) que hibridarán selectivamente con AoNc de VEGF-B u hom610go de VEGF-B o gen o genes que están presentes en la biblioteca. las sondas son preferentemente complementarias de o codifican una regi6n pequeña de la secuencia de AON de VEGF-B de la misma o una especie similar a la especie de la que se preparó la biblioleca. Como alternativa, las sondas pueden

65 degenerar, como se analiza posteríormente.

Cuando se usan fragmentos de ADN (tales como ADNc) como sondas, son condiciones de hibridación tipicas las expuestas por ejemplo en Ausubel, et ar. , eds., mencionado anteriormente. Después de la hibridación, la mancha de transferencia que contiene la biblioteca se lava a una rigurosidad adecuada, dependiendo de varios factores tales como tamaño de la sonda, homologia esperada de la sonda con el clon, tipo de biblioteca que se explora, número de

5 clones que se exploran y similares. Son ejemplos de soluciones de lavado rigurosas (que son habitualmente de fuerza iónica baja y se usan a temperaturas relativamente altas) las siguientes. Uno de dichos lavados rigurosos es NaCI 0,015 M, Na Citrato 0,005 M Y SDS 0,1 por ciento a 55-65 oC. Otro de dichos tampones rigurosos es Na2 EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM, pH 7,2 Y SDS 1% a aproximadamente 40-50 oC. Otro lavado riguroso es SSC 0,2 x y SOS 0,1% a aproximadamente 50-65 OC. Dichas condiciones de hibridación son aplicables a cualquier polinucleótido que codifique uno o más de los factores de crecimiento de la presente invención.

Otro método adecuado para obtener un ácido nucleico que codifica un polipéptido de VEGF-B es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, se extrae ARN poli(A)+ o ARN total de un tejido que expresa VEGF-B. Se prepara después ADNc a partir del ARN usando la enzima transcriptasa inversa. Después se añaden

15 dos cebadores típicamente complementarios de dos regiones separadas del ADNc de VEGF-B (oligonucleótidos) al ADNc junto con una polimerasa tal como Taq polimerasa, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.

B. Preparación de un vector para la expresión de VEGF-B

Después de clonar, se ha aislado el AONc o gen que codifica un polipéptido de VEGF-B o fragmento del mismo, se inserta preferentemente en un vector de amplificación y/o expresión para aumentar el número de copias del gen y/o para expresar el polipéptido en una célula hospedadora adecuada y/o para transformar las células en un organismo diana (para expresar VEGF-B in vivo). Son adecuados numerosos vectores disponibles en el mercado, aunque

25 también pueden usarse vectores "hechos a petición". El vector se selecciona para ser funcional en una célula hospedadora o tejido hospedador particular (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de modo que pueda producirse amplificación del gen de VEGF-B y/o expresión del gen). El polipéptido de VEGF-B o fragmento del mismo puede amplificarsefexpresarse en células hospedadoras procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula hospedadora dependerá al menos en parte de si el polipéptido de VEGF-B o fragmento del mismo debe glicosilarse. De ser asi, son preferibles células hospedadoras de levadura, insecto o mamífero; las células de levadura glicosilarán el polipéptido si está presente un sitio de glicosilación en la secuencia de aminoácidos de VEGF-B.

Tipicamente, los vectores usados en cualquiera de las células hospedadoras contendrán una secuencia f1anqueante

35 5' Y otros elementos reguladores asi como potenciador o potenciadores, un elemento de origen de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de corte y empalme donador y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido para expresar, y un elemento marcador seleccionable. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "marcadora", es decir, una secuencia oligonudeotidica localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificadora de VEGF-B que codifica poliHis (tal como hexaHis) u otra secuencia inmunogénica pequeña. Este marcador puede expresarse junto con la proteina, y puede actuar como un marcador de afinidad para purificación del polipéptido de VEGF-B de la célula hospedadora. Opcionalmente, el marcador puede retirarse posteriormente del pOlipéptido de VEGF-B purificado por diversos medios tales como, por ejemplo, usando una peptidasa seleccionada.

45 El vectorlconstrucción de expresión puede contener opcionalmente elementos tales como una secuencia f1anqueante 5', un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de marcador seleccionable, un sitio de unión a ribosoma, una secuencia señal y una o más secuencias intrÓnicas. La secuencia flanqueante 5' puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora), heteróloga (es decir, de especies distintas de la especie o cepa de células hospedadoras), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes pS' de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante 5' de VEGF-B nativa. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante 5' puede ser cualquier organismo unicelular procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante 5' sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la célula hospedadora.

Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procariotas comerciales, y ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedadora. La amplificación del vector a un cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima del polipéptido de VEGF-B. Si el vector elegido no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse quimicamente uno basándose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector.

Un elemento de terminación de la transcripción se localiza lipicamente 3' del extremo de la secuencia codificante del polipéptido VEGF-B y actúa para terminar la transcripción del polipéptido de VEGF-B. Habitualmente, el elemento de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguidO de una secuencia de poli

65 T. Dichos elementos pueden clonarse de una biblioteca, obtenerse comercialmente como parte de un vector, y sintetizarse fácilmente.

Los genes marcadores seleccionables codifican proteinas necesarias para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección tipicos codifican proteinas que (a) confieren una resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o

5 kanamicina para células hospedadoras procariotas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles de medios complejos.

Es necesario un elemento de unión a ribosoma, habitualmente llamado la secuencia Shine-Dalgamo (procariotas) o la secuencia Kozak (eucariotas), para el inicio de la traducción de ARNm. El elemento está localizado tipicamente 3' del promotor y 5' de la secuencia codificante del polipéptido para sintetizar. La secuencia Shine-Dalgamo varia pero es tipicamente una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G). Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgamo, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente usando métodos expuestos anteriormente.

Todos los elementos expuestos anteriormente, asi como otros útiles en la presente invención, se conocen bien por

15 los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook, et al., ~Molecular Clon ing: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) YBerger, et al. , eds., ~Guide To Molecular Cloning Techniques: Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987).

Cuando debe secretarse el VEGF-B recombinante, se incluye preferentemente una secuencia señal para dirigir la secreción de la célula en la que se sintetiza. Tipicamente, la secuencia señal se posiciona en la región codificante del transgén hacia o en el extremo 5' de la región codificante. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en el tejido transgénico puede usarse junto con el transgén. Por lo tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga, del transgén, y puede ser homóloga o heteróloga del mamifero transgénico. Adicionalmente, la secuencia señal puede sintetizarse quimicamente usando métodos expuestos

25 anteriormente. Sin embargo, para fines del presente documento, las secuencias señal preferidas son las que aparecen de forma natural con el transgén (es decir, son homólogas del transgén).

En muchos casos, la tranSCripción génica aumenta por la presencia de uno o más intrones en el vector. El intrón puede ser de origen natural dentro de la secuencia transgénica, especialmente cuando el transgén es de longitud completa o un fragmento de una secuencia de ADN genómico. Cuando el intrón no es de origen natural dentro de la secuencia de AON (como para la mayoría de los ADNc), el intrón o los intrones pueden obtenerse de otra fuente. El intrón puede ser homólogo o heterólogo del transgén y/o del mamifero transgénico. La posición del intrón con respecto al promotor y el transgén es importante, ya que el intrón debe transcribirse para ser eficaz. Como tal, cuando el transgén es una secuencia de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' del sitio de inicio de la

35 transcripción, y 5' de la secuencia de terminación de la transcripción paliA. Preferentemente para transgenes de AONc, el intrón se localizará en un lateral o el otro (es decir, 5' o 3') de la secuencia transgénica de modo que no interrumpa la secuencia transgénica. Puede usarse cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariota y eucariota (planta o animal), para expresar VEGF-B, siempre que sea compatible con la célula o las células hospedadoras en las que se inserta. También se incluyen en el presente documento intrones sintéticos. Opcionalmente, puede usarse más de un intrón en el vector.

Son vectores preferidos para la expresión recombinante de proteina de VEGF-B los que son compatibles con células hospedadoras bacterianas, de insectos y de mamiferos. Dichos vectores incluyen, entre otros, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), y pETL (BlueBacll; Invitrogen).

45 Después de que se haya construido el vector y se haya insertado un ácido nucleico de VEGF-B en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede insertarse en una célula hospedadora adecuada para amplificación y/o expresión del polipéptido de VEGF-B. Las células hospedadoras típicamente usadas incluyen, sin limitación: células procariotas tales como células gram negativas o gram positivas, es decir, cualquier cepa de E. eoli, Bacil/us, Streptomyces, Saceharomyces, Safmonel/a, y similares; células eucariotas tales como células CHO (ovario de hámster Chino), células 293 de riñón humano, células COS-7; células de insecto tales como Sf4, Sf5, Sf9 Y Sf21 Y High 5 (todas de Invitrogen Company, San Diego, Calif.); y diversas células de levadura tales como Saccharomyces y Pichia.

55 La inserción (también denominada como la "transformación" o "transfección") del vector en la célula hospedadora seleccionada puede conseguirse usando métodos tales como el método de cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte en función del tipo de célula hospedadora para usar. Estos métodos y otros métodos adecuados se conocen bien por el experto en la materia, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook, et al., mencionado anteriormente.

Las células hospedadoras que contienen el vector (es decir, transformadas o transfectadas) pueden cultivarse usando medios convencionales bien conocidos por los expertos en la materia. Los medios contendrán habitualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son, por ejemplo, Caldo de Luria (LB) y/o Caldo Terrific (TB). Son medios adecuados para 65 cultivar células eucariotas RPM11640, MEM, OMEM, todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según se requiera por la linea celular particular que se cultive. Un medio adecuado para

cultivos de insecto es medio de Grace complementado con yeastolate, hidrolizado de lactalbúmina y/o suero de ternero fetal según sea necesario.

Tipicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas

5 solamente se añade como un complemento al medio. El compuesto para usar se dictaminará por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se transformó la célula hospedadora. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable sea resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.

La cantidad de polipéptido de VEGF-B producido en la célula hospedadora puede evaluarse usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia de Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad tales como ensayos de unión a VEGFR-1 o ensayos de estimulación de células.

C. Purificación de polipeptidos de VEGF-B

Los polipéptidos de VEGF-B se expresan y pUrifican preferentemente como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.331 .301.

Si el polipéptido de VEGF-B se diseña para que se secrete de las células hospedadoras, la mayor parte del polipéptido probablemente se encuentre en el medio de cultivo celular. Si, sin embargo, el polipéptido de VEGF-B no se secreta de las células hospedadoras, estará presente en el citoplasma (para eucariotas, bacterias gram positivas y célula hospedadoras de insectos) o en el periplasma (para células hospedadoras bacterianas gram negativas).

25 Para VEGF-B intracelular, las células hospedadoras se alteran en primer lugar de forma mecánica u osmótica para liberar los contenidos del citoplasma en una solución tamponada. El polipéptido se aisla después de esta solución.

La pUrificación de polipéptido de VEGF-B de la solución puede consegu irse usando una diversidad de técnicas. Si el polipéptido se ha sintetizado de modo que contenga un marcador tal como Hexahistidina (VEGF-B/ hexaHis) u otro péptido pequeño en su extremo carboxilo o amino terminal, puede purificarse esencialmente en un procedimiento de una etapa pasando la solución a través de una columna de afinidad en la que la matriz de columna tiene una alta afinidad por el marcador o por el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monodonal que reconoce especificamente VEGF-B). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al niquel, por lo

35 tanto puede usarse una columna de afinidad de niquel (tal como las columnas de niquel Qiagen) para purificación de VEGF-B/poliHis. (Véase, por ejemplo, Ausubel, el al., eds., ~Current Protocols In Molecular Biology," Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York (1993».

La fuerte afinidad de VEGF-B por su receptor VEGFR-1 permite la purificación de afinidad de VEGF-B usando una matriz de afinidad que comprende dominio extracelular de VEGFR-1. Además, cuando el pOlipéptido de VEGF-B no tiene marcador y no están disponibles anticuerpos, pueden usarse otros procedimientos bien conocidos para purificación. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, Cfomatografia de intercambio iónico, cromatografia de tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución en gel, e isoelectroenfoque preparatorio (máquina/técnica ~tsoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de

45 estas técnicas para conseguir pureza aumentada. Los métodos preferidos para purificación incluyen marcaje con poliHistidina y cromatografia de intercambio iónico en combinación con isoelectroenfoque preparatorio.

El polipéptido de VEGF-B hallado en el espacio periplásmico de las bacterias o el citoplasma de células eucariotas, los contenidos del periplasma o citoplasma, incluyendo cuerpos de inclusión (bacterias) si el polipéptido procesado ha formado dichos complejos, pueden extraerse de la célula hospedadora usando cualquier técnica convencional conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden lisarse para liberar los contenidos del periplasma por prensa francesa, homogeneización y/o sonicaciÓn. El homogeneizado puede después centrifugarse.

55 Si el polipéptido de VEGF-B ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, los cuerpos de indusión pueden con frecuencia unirse a las membranas celulares intema y/o externa y por lo tanto se encontrarán principalmente en el material de sedimento después de centrifugación. El material de sedimento puede después tratarse con un agente caotrópico tal como guanidina o urea para liberar, descomponer y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido de VEGF-B en su forma ahora soluble puede después analizarse usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación

o similares. Si se desea aislar el polipéptidO de VEGF-B, puede conseguirse aislamiento usando métodos convencionales tales como los expuestos posteriormente y en Marston, el al., Meth. Enz., 182: 264-275 (1990).

Si no se forman cuerpos de inclusión de polipéptido de VEGF-B en un grado significativo en el periplasma de la célula hospedadora, el pOlipéptido de VEGF-B se encontrará principalmente en el sobrenadante después de 65 centrifugación del homogeneizado celular, y el polipéptido de VEGF-B puede aislarse del sobrenadante usando métodos tales como los expuestos posteriormente.

En las situaciones en las que sea preferible aislar parcial o completamente el polipéptido de VEGF-B , puede conseguirse purificación usando métodos convencionales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos métodos incluyen, sin limitación, separación por electroforesis seguida de electroelución, diversos tipos de

5 cromatografia (inmunoafinidad, tamiz molecular y/o intercambio iónico) y/o cromatografia liquida de alta presión. En algunos casos, puede ser preferible usar más de uno de estos métodos para purificación completa.

D. Anticuerpos anti-VEGF-B terapéuticos

Se contemplan anticuerpos anti VEGF-B como se describen en la Patente de Estados Unidos N° 6.331.301 para su uso en la práctica de la presente invención. Dichos anticuerpos pueden usarse para purificación de VEGF-B, o terapéuticamente cuando se desee inhibición de VEGF-B. Véase también los documentos WO 2005/087812, WO 2005/087808, Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2005-0282233 y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006-0030000.

Pueden prepararse anticuerpos anti VEGF-B policlonales o monoclonales terapéuticos útiles en la práctica de la invención en animales de laboratorio o por técnicas de ADN recombinante usando los siguientes métodos. Los anticuerpos policlonales para la molécula de VEGF-B o un fragmento de la misma que contienen la secuencia de aminoácidos diana generalmente se inducen en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de la molécula de VEGF-B en combinación con un adyuvante tal como adyuvante de Freund (completo o incompleto). Para potenciar la inmunogenicidad, puede ser útil conjugar en primer lugar la molécula de VEGF-B o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana con una proteina que es inmunogénica en la especie para inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoil

25 sulfosuccinimida éster (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehido, anhid rido succiniCO, SOC1, o R1 N=C=NR, en la que R y R1 son grupos alquilo diferentes. Como altemativa, pueden producirse conjugados inmunogénicos de VEGF-B de forma recombinante como proteínas de fusión .

Los animales se inmunizan contra los conjugados de VEGF-B inmunogénicos o derivados (tales como un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana) combinando aproximadamente 1 mg o aproximadamente 1 microgramo de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con aproximadamente 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por via intradérmica en múltiples sitios. Aproximadamente de 7 a 14 dias después, se extrae sangre de los animales y el suero se ensaya con respecto a titulo anti VEGF-B.

35 Los animales se refuerzan con antígeno repetidas veces hasta que el título alcanza una meseta. Preferentemente, el animal se refuerza con la misma molécula de VEGF-B o fragmento de la misma que se usó para la inmunización inicial, pero conjugada con una proteina diferente y/o a través de un agente de entrecruzamiento diferente. Además, se usan agentes agregantes tales como alumbre en las inyecciones para potenciar la respuesta inmunitaria.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales recuperando células del bazo de animales inmunizados e inmortalizando las células de manera convencional, por ejemplo mediante fusión con células de mieloma. Los clones después se exploran con respecto a los que expresan el anticuerpo deseado. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es especifico para VEGF-B. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal reacciona de forma cruzada con otros miembros de la familia de VEGF/PDGF.

45 Puede consegu irse preparación de anticuerpos usando métodos de ADN recombinante, tales como el método de presentación de fagémidos, usando kits disponibles en el mercado, como por ejemplo, el Sistema de Anticuerpo de Fagémido Recombinante disponible de Pharmaaa (Uppsala, Suecia), o el sistema de presentación de fagos SUrfZAPTM (Stratagene Inc., La Jolia, Galif.).

Preferentemente, los anticuerpos para administración a seres humanos, aunque estén preparados en un animal de laboratorio tal como un ratón, serán "humanizados', o quiméricos, es decir hechos para ser compatibles con el sistema inmunitario humano de modo que un paciente humano no desarrolle una respuesta inmunitaria al anticuerpo. Aún más preferentemente, los anticuerpos humanos que pueden prepararse ahora usando métodos

55 tales como los descritos por ejemplo en l onberg, et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) se prefieren para administración terapéutica a pacientes.

1. Humanizacíón de anticuerpos monoclonales anti VEGF-B

Los anticuerpos neutralizantes de VEGF-B comprenden una Clase de compuestos terapéutiCOS útiles como antagonistas de VEGF-B. A continuación hay protocolos para mejorar la utilidad de anticuerpos monoclonales anti VEGF-B como compuestos terapéuticos en seres humanos, "humanizando" los anticuerpos monoclonales para mejorar su semivida en suero y hacerlos menos inmunogénicos en hospedadores humanos (es decir, para evitar la respuesta de anticuerpos humanos a anticuerpos anti VEGF-B no humanos).

Los principios de humanización se han descrito en la bibliografía y se facilitan por la disposición modular de proteínas de antícuerpo. Para minimizar la posibilidad de unión del complemento, se prefiere un anticuerpo humanizado del isotipo IgG4.

Por ejemplo, se consigue un nivel de humanización generando anticuerpos quiméricos que comprenden los

5 dominios variables de proteínas de anticuerpo no humano de interés, tales como los anticuerpos monoclonales anti VEGF-B descritos en el presente documento, con los dominios constantes de moléculas de anticuerpo humanas. (Véase, por ejemplo, Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1989» . Los dominios variables de anticuerpos anti VEGF-B neutralizadores de VEGF-B se clonan a partir del AON genómico de un hibridoma de linfocitos B o de ADNc generado a partir de ARNm aislado del hibridoma de interés. los fragmentos génicos de región V se ligan a exones

10 que codifican dominios constantes de anticuerpo humano, y la construcción resultante se expresa en células hospedadoras de mamifero adecuadas (por ejemplo, células de mieloma oCHO).

Para conseguir un nivel aún mayor de humanización, solamente se clonan en secuencias de anticuerpos humanos las partes de los fragmentos del gen de región variable que codifican regiones determinantes de complementariedad 15 rCDR") de unión a antígeno de los genes de anticuerpo monoclonal no humano (véase, por ejemplo, Jones, el al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann, el al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen , el al., Science, 239: 153436 (1988); Y Tempest, el al., BiolTechnology, 9: 266-71 (1991». Si es necesario, el armazón de lámina beta del anticuerpo humano que rodea las regiones CDR3 también se modifica para reflejar más estrechamente la estructura tridimensional del dominio de unión a anligeno del anticuerpo monoclonal original (véase, Kettleborough, el al. ,

20 Protein Engin., 4: 773-783 (1991); Y Foote, el al. , J. Mol. Biol., 224: 487-499 (1992».

En un enfoque alternativo, la superficie de un anticuerpo monoclonal no humano de interés se humaniza alterando restos de superficie seleccionados del anticuerpo no humano, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida, conservando a la vez todos los restos intemos y en contacto del anticuerpo no humano. Véase Padlan, Molecular

25 Immunol., 28 (4/5): 489-98 (1991 ).

los enfoques anteriores se emplean usando anticuerpos monoclonales anti VEGF-B neutralizantes de VEGF-B y los hibridomas que los producen para generar anticuerpos neutralizantes de VEGF-B humanizados útiles como compuestos terapéuticos para tratar o aliviar afecciones en las que la expresión de VEGF-B es pe~udicial.

2. Anticuerpos neutralizantes de VEGF-B humanos de presentación de fagos

Se generan anticuerpos neutralizantes de VEGF-B humanos mediante técnicas de presentación de fagos tales como las descritas en Aujame, el al., Human Antibodies, 8(4): 155-168(1997); Hoogenboom, TIBTECH, 15: 62-70(1997); y

35 Rader, et al., Curro Opino Biotechnol., 8: 503-508 (1997). Por ejemplo, las regiones variables de anticuerpo en forma de fragmentos Fab o fragmentos Fv monocatenarios ligados se fusionan con el extremo amino terminal o proteina de recubrimiento menor de fago filamentoso plll. la expresión de la proteína de fusión e incorporación de la misma en el recubrimiento de fago maduro da como resultado partículas de fago que presentan un anticuerpo en su superficie y contienen el material genético que

40 codifica el anticuerpo. Una biblioteca de fagos que comprende dichas construcciones se expresa en bacterias, y la biblioteca se selecciona (se explora) con respecto a anticuerpos de fago específicos de VEGF-B usando VEGF-B marcado o inmovilizado respectivamente como sonda antigénica.

3. Anticuerpos neutralizantes de VEGF-B humanos de ratones transgénicos

45 Se generan anticuerpos neutralizantes de VEGF-B humanos en ratones transgénicos esencialmente como se describe en Bruggemannand y Neuberger, Immunol. Today, 17(8): 391-97(1996) y Bruggemannand Taussig, Curro Opín. Bíotechnol., 8: 455-58(1997). los ratones transgénicos que portan segmentos génicos V humanos en configuración de línea germinal y que expresan estos transgenes en sus tejidos linfoides se inmunizan con

50 composición de VEGF -B usando protocolos de inmunización convencionales. Se generan hibridomas usando linfocitos B de los ratones inmunizados usando protocolos convencionales y se exploran para identificar hibridomas que secretan anticuerpos humanos anti VEGF-B (por ejemplo, como se han descrito anteriormente).

4. Anticuerpos biespecificos

los Anticuerpos biespecificos que se unen específicamente con una proteina (por ejemplo, VEGF-B) y que se unen específicamente con otros antígenos relevantes para la patologia y/o tratamiento se producen, aislan y ensayan usando procedimientos convencionales que se han descrito en la bibliografia. Véase, por ejemplo, Pluckthun & Pack, Immunotechnology, 3: 83-105 (1997); Carter, el al., J. Hematotherapy, 4: 463-470 (1995); Renner &

60 Pfreundschuh, Immunological Reviews, 1995, N° 145, pp. 179-209; Pfreundschuh Patente de Estados Unídos N° 5.643.759; Segal, el al., J. Hematotherapy, 4: 377-382 (1995); Segal, el al., Immunobiology, 185: 390-402 (1992); Y Bolhuis, el al. , Cancer Immunol. Immunother., 34: 1-8 (1991); Por ejemplo, en una realización, se contemplan anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a VEGF-B y se unen específicamente a VEGF-A o P1GF.

65 E. Moléculas antisentido y terapia

Otra clase de inhibidores de VEGF-B útiles en la presente invención son moléculas de ácido nucleico antisentido aislado que hibridan con, o son complementarias a, la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de VEGF-B, o fragmentos, análogos o derivados del mismo. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "con sentido" que codifica una proteina 5 (por ejemplo, complementario a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de ARNm). (Véase, por ejemplo, Uhlmann, et al. Antisense oligonucleotides: A new therapeutic principie. Chemical Reviews 1990, 90: 543-584; Crooke, el al. "Antisense Research and Applications", CRC Press (1993); Mesmaekar, et al. "Antisense Oligonucleotides", Acc. Chem. Res. 1995, 28: 366-374; Stein. ¡he experimental use of antisense oligonucleotides: a guide for the perplexed". J. Clin. Invest. 2001, 108, 641-644, Y las Patentes de los Estados Unidos N°: 6.117.992, 6.127.121, 6.235.887, 6.232.463, 6.579.704, 5.596.091, 6.031.086 Y 6.117.992). En aspectos especificos, se proporcionan moléculas de ácido nucleico antisentido que comprenden una complementariedad de secuencia de al menos 10, 25, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos o una hebra codificante de VEGF-B completa, o solo a una porción de la misma. También se proporcionan fragmentos codificantes de moléculas de ácido nucleico, homólogos, derivados y análogos de ácidos nucleicos antisentido de VEGF-B

15 complementarios a una secuencia de ácido nucleico de VEGF-B.

En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con una "región codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina VEGF-B. La expresión "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de ácidos nucleicos. En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con una "región flanco" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteina VEGF-B. La expresión "región flanco" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean a la región codificante y que no se traducen en aminoácidos (es decir, también citadas como regiones 5' y 3' no traducidas).

25 Dadas las secuencias de hebra codificante que codifican la proteina VEGF-B divulgada en el presente documento, los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden designarse de acuerdo con las reglas de Watson y Crick o de emparejamiento de bases de Hoogsteen. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante completa del ARNm de VEGF-B, pero más preferentemente es un oligonucleótido que es antisentido solo a una porción de la región codificante o no codificante de ARNm de VEGF-B. Por ejemplo, el oligonucle6tido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de VEGF-B. Un oIigonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse usando reacciones de sintesis quimica o de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un o ligonucleótido antisentido) puede sintetizarse quimicamente

35 usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos moclificados de maneras diversas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del doblete formado entre los ácidos nucleicos con sentido y antisentido (por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y de acridina sustituidos).

Los ejemplos de nucle6tidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen: 5ftuorouracilo, S-bromouradlo, 5-clorouradlo, S-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetildtosina, 5(carboxihidroxilmetil) uracilo, S-carboximelilaminometil-2-liouridina, 5-carboximetilaminomeliluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, S-metilaminometiluracilo, 5-meto.xiaminometil-2-tiouracílo, beta-D-manosilqueosina, S'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo,2-metiltio-N

45 6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, S-metiluracilo, metiléster de ácido uraciI0-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés, descrito en detalle en la sección siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido para su uso de acuerdo con la invención se administran tipicamente a un sujeto o se generan in situ de tal forma que hibridan con o se unen al ARNm celu lar y{o ADN gen6mico que 55 codifica VEGF-B para de este modo inhibir la expresión de la proteina (por ejemplo, inhibiendo la transcripción y{o la traducción). La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un doblete estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se una a dobletes de ADN, mediante interacciones especificas en el surco mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluye la inyecci6n directa en un sitio de tejido. Como altemativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para dirigirse a células seleccionadas y a continuación administrarse de manera sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las moléculas antisentido pueden modificarse de tal forma que se unan específicamente a receptores o antigenos expresados en la superficie de una célula seleccionada (por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores celulares de superficie o antigenos). Las moléculas 65 de ácido nucleico antisentido también pueden suministrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr suficientes moléculas de ácido nucleico, se prefieren construcciones de vector en las que la

molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte poi II o poi 111.

Una molécula de ácido nucleico antisentido para su uso de acuerdo con la invención puede ser una molécula de ácido nucleico alfa-anomérico. Una molécula de ácido nucleico alfa-anomérico forma híbridos bicatenarios

5 especificos con ARN complementario en los que, al contrario de las unidades alfa usuales, las hebras son paralelas entre sI. Véase, por ejemplo, Gaultier, et al., Nucl. Acids Res., 15:6625-6641 (1987). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (véase, por ejemplo, Inoue, et al., Nucl. Acids Res., 15:6131-6148 (1987» o un análogo de ADN de ARN quimérico (véase, por ejemplo, Inoue, el al., FEBS let!., 215:327-330 (1987».

La producción y suministro de moléculas antisentido se facilitan proporcionando un vector que comprende una secuencia de nucleótido antisentido complementaria a al menos una parte de la secuencia de ADN de VEGF-B. De acuerdo con otro aspecto adicional de la invención, dicho vector que comprende una secuencia antisentido puede usarse para inhibir, o al menos mitigar, la expresión de VEGF-B. El uso de un vector de este tipo para inhibir la

15 expresión de VEGF-B se favorece en casos en los que la expresión de VEGF-B se asocia con un estado de enfermedad concreta.

Tratamiento de dislípidemias

La categoria de sujetos a tratar de acuerdo con la invención reivindicada en el presente documento son sujetos con dislipidemias. Como se usa en el presente documento, dislipidemia es un perfillipidico anormal en suero, plasma o sangre en un sujeto. Un perfil lipidico anormal puede caracterizarse por niveles de colesterol total, colesterol de lipoproteinas de baja densidad (lDl), triglicéridos, apolipoproteina (apo)-B o lp(a) por endma del percentil 90° para la pobladón generala niveles de colesterol de lipoproteinas de alta densidad (HDL) o apo A-1 por debajo del

25 percentil100 para la población general. la dislipidemia puede incluir hipercolesterolemia y/o hipertrigliceridemia. los sujetos humanos hipercolesterolémicos y sujetos humanos hipertrig liceridémicos se asocian con una incidencia aumentada de trastornos cardiovasculares. Un sujeto hipercolesterolémico tiene un nivel de colesterol de lDl de > 160 mg/dl, o >130 mg/dl y al menos dos factores de riesgo seleccionados del grupo que consiste en género masculino, historial fam iliar de enfermedad coronaria prematura, fumador, hipertensión, bajo HDL « 35 mg/dl), diabetes melitus, hiperinsu linemia, obesidad abdominal, lipoproteínas elevadas, e historial personal de un evento cardiovascular. Un sujeto humano hipertrigliceridémico tiene un nivel de triglicéridos (TG) de ,. 200 mg/dl.

Las dislipidemias a tratar de acuerdo con la invención induyen dislipidemias causadas por defectos génicos simples, dislipidemias que son multifactoriales o poligénicas en origen, asi como dislipidemias que son secundarias a otros

35 estados de enfermedad o secundarias a agentes farmacológicos. los ejemplos de dislipidemias genéticas incluyen hipercolesterolemia familiar, deficiencia familiar de apoproteina Gil, deficiencia de lipasa hepática, hiperlipidemia familiar combinada, disbetalipoproteinemia, y deficiencia familiar de lipoproteina lipasa.

los compuestos anti VEGF-B para uso de acuerdo con la invención pueden administrarse solos o en combinación con una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales que tienen, por ejemplo, efectos favorables en perturbaciones o trastomos metabólicos frecuentemente asociados con las mismas. Son ejemplos de dichos medicamentos los medicamentos que reducen la glucosa en sangre, antidiabeticos, principios activos para el tratamiento de dislipidemias, medicamentos antiateroscleróticos, agentes antiobesidad, principios activos antiinflamatorios, principios activos para el tratamiento de tumores malignos, principios activos antitrombóticos,

45 principios activos para el tratamiento de presión sanguinea alta, principios activos para el tratamiento de insuficiencia cardiaca y principios activos para el tratamiento ylo prevención de complicaciones provocadas por diabetes o asociadas con diabetes.

Además, los compuestos anti VEGF-B pueden administrarse en combinación con uno o más agentes antihipertensivos. Son ejemplos de agentes antihipertensivos los ¡l-bloqueantes tales como alprenolol, atenolol, timolol pindolol, propranolol y metoprolol, inhibidores de AGE (enzima conversora de angiotensina) tales como benazeprilo, captoprilo, alatrioprilo, enalaprilo, fosinoprilo, lisinoprilo, quinaprilo y ramiprilo, bloqueadores de canales de calcio tales como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem y verapamilo, y bloqueadores

o: tales como doxazosina, urapidilo, prazosina y terazosina. 55

Una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales pueden combinarse con compuestos anti VEGF-B para su uso de acuerdo con la invención, en particular para una mejora sinérgica en el efecto. la administración de la combinación de principios activos puede tener lugar por administración separada de los principios activos al paciente o en forma de productos de combinación.

Ejemplos

Ejemplo 1 Materiales y métodos

65 A. Expresión de proteínas de transporte de ácidos grasos en corazones de ratones deficientes en VEGF-B Se aisló ARN celular total de corazones de ratones normales y VEGF-B -1-(Aase el al., Circ, 104: 358-364, 2001) usando el kit RNeasy (Oiagen). La integridad de los ARN totales se analizó en geles de formaldehido desnaturalizantes. Se preparó AON complementario a partir de 3 JIg de ARN tratado con ONasa y Transcriptasa Inversa SuperScript 11 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó PCR en transcritos

5 inversos usando pares de cebadores enumerados en a Tabla 1. Todas las secuencias se comprobaron con respecto a especificidad usando análisis de BLAST.

Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa por duplicado usando muestras de 5 JII de AONc y 12,5 JI! de Supennezcla Verde SYBR Platinum 2 x (Invitrogen) en una reacción total de 2S JI! que contenía 200 nM de cebador 10 directo e inverso. Las reacciones se procesaron y se analizaron usando Rotor-Gene RG-3000A (Corbett Research). Se procesaron curvas de fusión en todas las reacciones para asegurar la amplificación de un único producto (datos no mostrados). Las muestras se normalizaron a reacciones paralelas usando cebadores específicos para actina (Tabla 1). La proporción de aumento/reducción de proteínas de trans~rte de ácidos grasos en VEGF-B -1-en relación con corazones normales se determinó usando el método de 2·&\ t (Livak el al., Methods, 2S: 402-406,2001).

15 Los valores medios y las desviaciones típicas se basaron en tres experimentos independientes.

B. Expresión proteica de proteínas de manipulación de ácidos grasos en ratones deficientes en VEGF-B

Se homogeneizaron corazones de ratones VEGF-B +1+ y -1-en tampón de lisis que contenia Tris-HCI SO mM pH 8,0,

20 NaCI 150 mM, Tritón X-100 1%, desoxicolato O,S%, SOS 0,1%, 0,5 mmolfl e inhibidores de proteasa (Complete; Roche). Los lisados de corazón se incubaron a 4 oC durante 30 minutos y los sobrenadantes se recogieron en dos etapas de centrifugación a 10.000 x 9 durante 20 minutos a 4 oC. Las alicuotas se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (S08-PAGE) (15%) en condiciones reductoras. Se realizó inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal de conejo inducido contra los aminoácidos 41-140 de FATP4

25 de origen humano (Santa Cruz Biotedmology Inc., 1 JIg Ig/ml) o un anticuerpo policlonal de conejo inducido contra los aminoácidos 19-32 de lipasa Endotelial humana (Cayman Chemical, 1,S JIg Ig/ml) seguido de detección con un anticuerpo secundario acoplado a HRP (Amersham Biosciences). Los anticuerpos unidos se visualizaron usando ECL+ (Amersham Biosciences). Como control de carga, se visualizó la proteína del RE calnexina usando un antisuero de conejo contra calnexina humana.

c. Expresión de FATP4 y LPL en corazones de cerdos que sobreexpresan VEGF-B-1 86

Se recibieron corazones de cerdos transducidos con un LacZ o hVEGF-BI86 codificado en adenovirus de Seppo Hertluala. Se aisló ARN celular total de los corazones de cerdos transducidos y se realizó PCR en tiempo real 35 cuantitativa como se ha descrito anteriormente. Los pares de cebadores usados se enumeran a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1

Nombre

Oligonucleótidos Identificador de secuencia

mFATPI

Sentido: S'tcaatglaccaggaallacagaagg-3' An tisentido: 5'-tctccaggctcagagtcagaag-3' 10 11

mFATP2

Sentido: 5' -ttcctgaggatacaag ataccattg-3' An tisentido: 5' -ttctttctQQaaatQtcatQaQc-3' 12 13

mFATP3

Sentido: 5'-ctctgaacctggtgcagctcta-3' An tisentido: 5'-tcgaaggtctcagacaggag-3' 14 15

mFATP4

Sentido: 5'-gcaaglcccalcagcaaclg-3' An tisentido: 5'-gggggaaatcacagcttctc-3' 16 17

mFATP5

Sentido: 5'-gctataccagcatgtccgctc-3' An tisentido: 5' -atQotcaQaQattccaoQttcc-3' 18 19

mFATP6

Sentido: 5'-tacaaccaagtggtgacatctctg-3' An tisentido: 5' -aatctcttCQqtcaatQqqac-3' 20 21

rnLPL

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Se prepararon muestras proteicas de corazones de cerdo transducidos con lacZ o hVEGF-Bl 86 como se ha descrito anteriormente y se analizaron en SDS-PAGE al 15% seguido de análisis de transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti-F ATP4 o lPl.

D. Expresión de proteínas de transporte de ácidos grasos en células endoteliales

las células endoteliales de isloles pancreáticos MllE SVEN 1 (MS1) (Arbiser et al., Am. J. Palhol., 156: 1469-1476, 2000) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía FCS al 10%, glutamina y 10 antibióticos. El medio de cultivo se cambió cada segundo dia y las células se cultivaron hasta la confluencia. Se aisló ARN total de las células MS1 usando el kit RNeasy (Qiagen). la integridad del ARN total se analizó en geles de formaldehido desnaturalizantes. Se preparó ADN complementario a partir de 3 ~g de ARN tratado con DNasa y Transcriptasa Inversa SuperScriptll (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó Q-PCR en transcritos inversos usando pares de cebadores enumerados en la Tabla 1. Todas las secuencias se 15 comprobaron con respecto a especificidad usando análisis de BLAST. Para estimulación con VEGF-B, los cultivos se lavaron con PBS y las células MS1 se privaron de alimento en DMBM Que contenía FCS al 0,5% durante 24 horas. Después de la privación de alimento, el medio se reemplazó con DMEM Que contenia FCS al 0,5% Que conten ía 50 ng/ml, o 100 ng/ml de VEGF-B167 recombinante humano y las células se incubaron adicionalmente durante seis o veinticuatro horas adicionales. Se aisló ARN total y se analizó la integridad del ARN como se ha

20 descrito anteriormente. Se preparó ADN complementario a partir de 3 ~g de ARN tratado con DNasa y Transcriptasa Inversa SuperScriptll de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa por duplicado usando muestras de 5 ~I de ADNc y 12,5 JI! de Supermezcla Verde SYBR Platinum 2 x (Invitrogen) en una reacción total de 25 JI! Que contenia 200 nM de cebadores directos e inversos. Se procesaron y analizaron reacciones usando Rotor-Gene RG-3000A (Corbett Research). Se procesaron curvas de fusión en todas

25 las reacciones para asegurar la amplificación de un único producto (datos no mostrados). las muestras se normalizaron a reacciones paralelas usando cebadores especificos para actina (Tabla 1). La proporción de aumentofreducción de ARNm de FATP4 en células tratadas con VEGF-B en relación con no tratadas se determinó usando el método de 2~Ct (Arbiser, mencionado anteriormente).

E. Tinción con Di! red D en corazones de ratones VEGF-B +f+ y -/

5 Se diseccionaron cuidadosamente corazones de ratones VEGF-B .,. y -1-, sin ninguna grasa y sangre visibles, se lavaron en PBS y se incluyeron en Tek Tisular (Sakura Finetek). Se montaron secciones en serie (de 8-12 ,1m) en portaobjetos de vid rio Superfros(. Se disolvió Oil red O (Sigma Ald rich) en una solución de reserva añadiendo 2,5 g de Oil red O a 400 mi de 2-isopropanol. Antes de la tinción, se preparó una solución de trabajo que contenia 18 mi de solución de reserva de Oil red O y 12 mi de agua desionizada. Esta solución se pasó a través de un filtro de 0,45

10 Ilm (Sarstedt) para retirar Oil red O cristalizado. Las secciones del corazón se incubaron en solución de trabajo de Oil red O durante 5 minutos a TA y se lavaron en 10 minutos con agua corriente del grifo. Para visualizar núcleos los portaobjetos de vid rio se contratiñeron en solución de Hematoxilina de Mayer durante 15 segundos seguido de un aclarado rápido en solución de carbonato de litio saturada. los portaobjetos se aclararon cuidadosamente en agua del grifo y las secciones teñidas se incluyeron en medio de montaje soluble en agua y se analizaron usando

15 microscopia de campo claro.

F. Expresión de proteínas de transporte de ácidos grasos en tumores que sobreexpresan VEGF-B

La linea celular de fibrosarcoma T241 se transfectó con un vector de expresión de mamiferos que codificaba VEGF

20 B167 o VEGF-B l86 , o vector vacio (simulación) usando reactivo de lipidos catiónicos. Se seleccionaron diversos clones estables, se expandieron y se analizaron con respecto a la expresión de VEGF-B exógeno. Se seleccionaron dos clones de cada vector de expresión para los experimentos posteriores. Se inyectaron 106 células de los diversos clones por via subcutánea en la espalda de ratones singénicos. Después de 15 dias los tumores crecidos se escindieron e inmediatamente se congelaron de forma instantánea (Publicación de Patente de Estados Unidos N°

25 2005-0214280, la divulgación de la cual se incorpora en el presente documento por referencia). Se aisló ARN total de los tumores usando reactivo TRlzol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. la integridad de las preparaciones de ARN totales se analizó en geles de formaldehido desnaturalizantes. Se preparó AON complementario a partir de 3 ,Ig de ARN tratado con DNasa y Transcriptasa Inversa SuperScriptU (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. l a integ ridad de las preparaciones de ARN totales se analizó en geles de

30 formaldehido desnaturalizantes. Se preparó ADN complementario a partir de 3 Ilg de ARN tratado con DNasa y Transcriptasa Inversa SuperScriptll (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se analizó PCR en tiempo real cuantitativa por duplicado usando muestras de 5 ,ti de ADNc y 12,5 ~I de Supermezcla Vede SYBR Platinum 2 x (Invitrogen) en una reacción total de 25 ~J que contenia 200 nM de cebador 35 directo e inverso. Las reacciones se procesaron y se analizaron usando Rotor-Gene RG-3000A (Corbett Research). Se procesaron curvas de fusión en todas las reacciones para asegurar la amplificación de un ún ico producto. Las muestras se normalizaron a reacciones paralelas usando cebadores especificos para actina (véase Tabla 1). la proporción de aumento/reducción de proteínas de manipulación de ácidos grasos en los tumores que sobreexpresan VEGF-B en relación con la simulación se determinó usando el método de 2-MC1 (Arbiser, mencionado anteriormente).

40 los valores medios y desviaciones típicas se basaron cada uno en un grupo de cuatro tumores diferentes.

Ejemplo 2 -Expresión de componentes de la maquinaria de trasporte de ácidos grasos en ratones normales y transgénicos

45 Para investigar si los genes que están implicados en captación de ácidos grasos y transporte son dianas corriente abajo potenciales para VEGF-B, su expresión se analizó en corazones de ratones normales, deficientes en VEGF-B y transgénicos con sobreexpresión específica de corazón de VEGF-B.

Se usó PCR convencional para establecer los patrones de expresión géníca de diversos miembros de FATP y CD36

50 en corazón de ratón normal. Se detectaron transcritos para FATP1, 2, 3, 4 Y 6, así como CD36, el correceptor de FATP (Greenwalt el al., J. Clin. Inves!., 96: 1382-1388,1995) en el corazón murino. No se encontró transcrito para FATP5 en el corazón murino. Sin embargo, se ha indicado que FATP5 se expresa exclusivamente en el higado (Hirsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8625-8629,1998). Se usó RT-PCR en tiempo real cuantitativa (Q-PCR) para comparar la abundancia de transcrito absoluto de FATP, CD36 y LPl en corazones de ratones normales y

55 VEGF-B-/-. En corazones sin VEGF-B, el ARNm de FATP4 se redujo a aproximadamente el 50%. FATP1, 3 y 6 también estaban regulados negativamente, sin embargo, en un menor grado (expresión reducida a aproximadamente 70-80%). Por el contrario, no se detectaron cambios significativos en los niveles de expresión de FATP2 y CD36. El análisis de ARNm de lPl demostró que este transcrito también está regulado negativamente en corazones deficientes en VEGF-B (expresión reducida a aproximadamente el 60%)

Para analizar si la sobreexpresión de VEGF-B en corazón de ratón dio como resultado aumento de la expresión de las FATP y en CD36, los inventores analizaron la abundancia de transcrito de FATP4 en ratones transgEmicos espeCíficos de corazón de VEGF-B por Q-PCR. Estos animales expresan VEGF-B humano bajo el promotor de cadena pesada de o.-miosina (referencia para añadir) que proporciona una expresión específica de corazón del 65 transgén. Los análisis de corazones de hembras y machos con una (heterocigotos) o dos copias del transgén

(homocigotos), demostraron que la expresión de FATP4 se controla de una manera especifica de dosis génica en ambos sexos con regulación positiva 3x en los animales homocigotos, y de regulación positiva 1,5x en los animales heterocigotos.

5 Para analizar si los niveles de expresión proteica de FATF, ejemplificados por FATP4 y LPL se regulaban de acuerdo con los niveles de transcrito correspondientes como se mide por los análisis de QPCR, se sometieron alicuotas de proteinas de corazones normales y deficientes en VEGF-B a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos especificos para FATP4 y LPL, respectivamente. Como un control de carga las manchas de transferencia se volvieron a explorar con anticuerpos para calnexina.

Los resultados demuestran que tanto la proteina FATP4 como la proteina LPL estaban reguladas negativamente en animales deficientes en VEGF-B.

Ejemplo 3 -Expresión de FATP4 y lPl en corazones de cerdos transducidos con adenovirus que codifican 15 VEGF-B

La proteina de VEGF-B o VEGF-B generada de adenovirus tiene una capacidad notable para estimular la neovascularización en corazón de ratón (véase Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2005-0214280) Y en corazón de cerdo. El corazón de cerdo recibe varias inyecciones de adenovirus (en total 1 x 1012 particulas) usando un sistema basado en catéter. Siete dias después de la inyección los cerdos se sacrifican y los corazones se retiran para análisis. El análisis de miocardio transducido por Q-PCR reveló que el ARNm de FATP4 está regulado positivamente aproximadamente 30 veces en corazones transducidos con VEGF-B en comparación con corazones que recibieron una inyección idéntica de adenovirus que expresaban solamente lacZ. A medida que las células endoteliales se hacen más abundantes en los corazones transducidos con VEGF-B debido a la neovascularización,

25 los análisis de control por Q-PCR de la expresión de PECAM, un marcador celular endotelial, mostraron una regulación positiva de aproximadamente 3x. Por lo tanto, si toda la regulación positiva de ARNm de FATP4 se produce en las células endoteliales del corazón, la regulación positiva especifica en este compartimento celular es en consecuencia 9-10 veces.

Análisis similares de expresión de LPL por análisis de Q-PCR mostraron que el ARNm de LPL está regulado positivamente. El análisis de los niveles de proteina FATP4 y LPL por inmunotransferencia demostró que ambas proteinas estaban notablemente reguladas positivamente en miocardio Iransducido con VEGF-B 186. En conclusión, estos análisis confirman y amplian los datos previos que muestran que las FATP y LPL están ambos regulados por VEGF-B.

Ejemplo 4 -Expresión de Iransportadores de ácidos grasos y lPl en células endoleliales.

Para que se capten por las células parenquimales que requieren energia del corazón, musculo esquelético, cerebro, estómago e intestinos, los ácidos grasos derivados de plasma deben en primer lugar atravesar la capa celular endotelial, y este transporte transcelular está mediado por transportadores de ácidos grasos especificos (Van der Vusse et al., Adv. Exp. Med. Biol., 4441: 181-191, 1998). La linea celular endotelial MS1 se usó para investigar la expresión de FATP, C036 y LPL en el endotelio capilar. La presencia de los receptores de VEGF, VEGFR-1 y VEGFR-2, en células MS1 se confirmó por PCR convencional de ADNc generado a partir de células MS1. Se descubrió que ambos receptores se expresaban en células MS1 . De los diversos transportadores de ácidos grasos

45 que se analizaron, FATP1, 3 y 4 se detectaron fácilmente en células MS1 y por lo tanto pueden ser una diana corriente abajo potencial para VEGF-B. CD36 no se expresaba en células MS1 . Se ha indicado que la aparición de CD36 en el endotelio es especifica de tejido con la expresión restringida a los capilares de tejido adiposo y musculo cardiaco y esquelético (Greenwall, mencionado anteriormente).

Ejemplo 5 -Eslimulación de la expresión de FATP y lPl en células endoleliales con VEGF-B

Para investigar si la expresión de FATP1, 3 y 4 en células Endoteliales MS1 está regulada directamente por VEGF B, se incubaron células MS1 con VEGF-B recombinante humano durante 20 horas. Mediante análisis de Q-PCR se comparó la expresión relativa de ARNm de FATP en células MS1 tratadas y no tratadas con VEGF-B (Figura 9, 10). 55 La expresión del ARNm de FATP4 aumentó 3,3 veces en células MS1 tratadas con VEGF-B, en comparación con el control no tratado, lo que sugiere que VEGF-B puede de hecho estimular la expresión de FATP4 en células endoteliales. Análisis similares de ARNm de FATP1 y 3 revelaron una inducción de 5,0 y 2.5 veces, respectivamente. Por lo tanto, todas las FATP expresadas en las células MS1 se inducen por tratamiento con VEGF

B.

El análisis de la expresión de LPL por Q-PCR mostró de forma similar una inducción de 2,5 veces en las células MS1 tras tratamiento con VEGF-B. Para analizar la especificidad de la inducción mediada por VEGF-B de ARNm de FATP4, se aplicaron varias VEGF incluyendo VEGF-B, PIGF, VEGF-A Y VEGF-E, a células MS1 y se midió la inducción de ARNm de FATP4 como anteriormente. Los resultados demuestran que VEGF-B ejerce un efecto 65 especifico en la inducción de ARNm de FATP4 ya que los otros ligandos de VEGFR-1, PIGF y VEGF-A, no indujeron ARNm de FATP4. VEGF-E, que es un ligando especifico de VGFR-2 , tampoco indujo ARNm de FATP4. En resumen

estos datos demuestran que VEGF-B ejerce un efecto específico en la inducción de las FATP y que su función es distinta de los otros ligandos de VEGFR-1 .

Ejemplo 6 -Expresión de transportadores de ácídos grasos en tumores que sobreexpresan VEGF-B

Para establecer adicionalmente una relación entre las FATP y VEGF-B, se investigó la expresión de proteinas de transporte de ácidos grasos en tumores que sobreexpresan dos isoformas biológicas de VEGF-B; VEGF-B16T y VEGF-Bl86. Los tumores que sobreexpresan VEGF-Bl86 crecen de forma significativamente más rápida que los tumores transfectados con VEGF-B16 T, o transfectados con simulación.

Por análisis de Q-PCR se comparó la expresión relativa de diversas FATP y CD36 en los tumores que sobreexpresaban VEGF-B. La expresión de FATP1 aumentó 2-2,5 veces en tumores que sobreexpresaban VEGFBl86. No se encontró regulación positiva significativa para FATP2, 3, 4 o 6 o para CD36 en los tumores que sobreexpresaban VEGF-B. Esto sugiere que VEGF-B puede dirigirse a diversos miembros de la fami lia de FATP y

15 esto puede depender del tejido.

Ejemplo 7 -Pruebas de un papel directo de VEGF-B en la acumulación tisular de lípidos

Todas las pruebas presentadas hasta la fecha sugieren un papel importante de VEGF-B en la captación tisular de ácidos grasos controlando la expresión de FATP y LPL en células endoteliales. Para demostrar directamente que esto es asi, se tiñeron secciones tisulares de animales normales y deficientes en VEGF-B con Oil Red 0, un colorante que se incorpora en gotas lipídicas y tiñe con color rojo intenso.

El número de gotas lipidicas teñidas con Oil red O en tejidos cardiacos de ratones normales y deficientes en VEGF

25 B se cuantificó mediante recuento manual del número de gotas teñidas en campos representativos del microscopio. Los resultados demuestran que los animales deficientes en VEGF-B han perdido más del 60% del número de gotas lipidicas en tejido cardiaco en oomparación con ratones normales. También se observa que el diámetro medio de las gotas en los ratones deficientes en VEGF-B es mucho más pequeno. En resumen, esto muestra que VEGF-B controla la acumulación de lipidos en el tejido cardiaco regulando las FATP y otros componentes en la maquinaria que controla la captación de lipidos del torrente sanguineo.

Ejemplo 8 -Expresión de FATP en hígado de ratones normales y deficientes en VEGF-B

Puesto que el higado es el principal órgano metabolizador de lipidos en el cuerpo, tenia interés comparar los niveles

35 de expresión de las FATP en ratones normales y deficientes en VEGF-B. Los análisis por QPCR mostraron que la expresión relativa de la mayoría de las FATP estaba regu lada negativamente en los ratones deficientes en VEGF-B. La excepción fue FATP1 que no tenia cambios. La expresión de CD36 estaba ligeramente regu lada positivamente en ratones deficientes en VEGF-B.

Como muchas de las FATP estaban reguladas negativamente en hígados de ratones deficientes en VEGF-B, la acumulación de lipidos en el higado se exam inó mediante tinción con Oil Red O de criosecciones. Los resultados muestran que la acumulación de lipidos se reduce drásticamente en hígados de animales deficientes en VEGF-B. La cuantificación de los pixeles rojos en varias miCfofotografias representativas usando el software gráfico Photoshop (Adobe Inc.) demostró que los hígados de ratones deficientes en VEGF-B tienen 70-80% menos de lípidos.

45 Ejemplo 9 -Expresión de un transportador de glucosa, Glut4, en el corazón de ratones normales y deficientes en VEGF-B

Se conoce bien en la bibliografía que la privación de lípidos en tejidos metabólicamente muy activos, como el corazón, obligará a estos tejidos a cambiar su metabolismo energético de estar basado principalmente en lipidos a un metabolismo basado en carbohidratos/glucosa. Por el contrario, la privación de carbohidratos/glucosa obliga al tejido a cambiar el metabolismo energétioo para basarse en lipidos. Puesto que la pérdida de VEGF-B conduce aparentemente a acumulación tisular de lipidos drásticamente reducida se contempla que los genes implicados en el metabolismo de carbohidratosfgluoosa deberian estar regulados positivamente. Para ensayar esta hipótesis, se

55 analizó la expresión de un transporte de glucosa principal en oorazoo, transportador de glucosa 4 (Glut4). El análisis de la expresión de Glut4 en corazones normales y deficientes en VEGF-B por QPCR reveló una regulación positiva significativa de transcritos de Glut4 en animales deficientes en VEGF-B. Los cebadores usados en el análisis fueron: directo 5' CTGTCGCTGGTTICTCCAAC-'3 (SEC ID N°: 40) e inverso 5' AAGGGAAGGTGTCCGTCG 3' (SEC ID N°: 41). En conclusión, los resultados demuestran que se produjo un cambio metabólico predicho en los animales deficientes en VEGF-B porque oonvierten su metabolismo para ser más dependientes de carbohidratoslglucosa que sus homólogos normales. La razón para esto es la aparente incapacidad de los animales deficientes en VEGF-B para acumular cantidades suficientes de lípidos de la circulación para apoyar la producción de energía eficaz.

Ejemplo 10 -FATP en el cerebro

VEGF-B se expresa abundantemente en el cerebro y es de interés investigar la expresión de las FATP en este

tejido. Los análisis por PCR convencional han mostrado que todas las FATP, excepto FATP6, se expresan en el cerebro. Dado que muchas de las FATP están reguladas por VEGF-B en otro tejido es raz.onable creer que al menos algunas de ellas están reguladas por VEGF-B también en el cerebro.

Lista de secuencias LISTA DE SECUENCIAS

Identificador de secuencias

Descripción Secuencia

,.

ADN de VEGF-B (humano) N° de referencia de Genbank: NM_003377 gcgalgcgggcgcc:cocggcgggcggccccggcgggcaccalg agccctctgctccgccgcctgctcctcC"gcactc:ctgcagctggc ccccgeocaggcccctgtObK:cagcctgatgcccctggccacoag agaaagtggtgtcatggatagatgtgtlltactcgcgctacctgccag ccccgggaggtggtggtgcectlgactgtggagctcatgggcaccS tgaccaoaoagotggtgc::ccagctgcgtgactgtgcagOgctgtggt ggctgctgecctgacgatggcctggogtgtgtgcccactgggcago acoaagtccsgatgcagatcc~tgab;c,:ggtacccgagcagtca ¡;ctgggggagatgtccc.tggaagaacacagcc:agtgtgaatgcag llOotaaaaanaaggacagtgctgtgaagccagacagggctgCC&l:t cccoaccacogtoccc.agocccgttctgttccgggetgggactctgc ccccggagcaccctccceagctgacatcacccatcccactccagcc ccaggcccctctgccoacgctgcacccagcaccaccagcgccctg acccccggacctgoogctgccgctgcogacgc<;gcagcttcctccg ttgccaagggcggggcttagagctcaaccoagacaoctgcautgc cggaagctgcgaagglgacacntggcttttcagactcagcagsgtg acttgcctcagaggctatatcccagtCSS8gaac::a.aagaggagcct ggtaaaaaacagccaagcccccllagacctcagcccaggcagaag ctgctcraggacctgggcctctcagagggclcttctgecatcccttgtc tcectgaggccat.catcaaacaggacagagttggaagaggagactg g88¡gC8scaagaggggtcacataccagetcaggggagaatega gtactgtctcagtttctaaccactctgtacaagl:aagcatcttacctg gctottactc<:cctcactaagaagacccaaacctctgcataBtgJgatt tgggctttggtacaagaactgtgacccccaaccclgataaaapgat gsaaS8aaaaaoaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa a8081aaaaaaaaaaaa

2.

AA de VEGF-B (hu mano) N° de referencia de Genbank: NM_003377 MSPLLRRLU.AALLQLAPAQAPVSQPDAPG HQRKWSWIDVYl'RATCQPREVVVPLTVBL MOTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDOLBC VPTGQHQVRMQ1LMIR\'PSSQLGEMSLIlIlH SQCBCRPKKKDSA VKl'DRAATPIIHRPQPRS VPGWDSAPGAPSPAD~APGP~~ S'lTSALTPGPAAAAAD SSVAKG A

3.

AA de VEGF-B167 (humano) N° de referencia de Genbank: AAL79000 MSPLLRRLU.AALLQLAPAQAPVSQPDAPO HQRI<WSWIDVYTRATCQPREVVVPLTVBL MGTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLBC VPfGQHQVRMQILMIR\'PSSQLGEMSLBBH SQCECRPKKKDsAVKl'DSPRPLCPRCTQHH QRPDPRTCRRRCRRRSFLRCQORGLBLNPDT

4.

AA de VEGF-Bl 86 (humano) N° de referencia de Genbank: AAL79001 MSPLLRRLILAALLQLAPAQAPVSQPDAPO HQRI<VVSWlDVYTRATCQPIU!VVVPLTVBL MOTVAKQLVPSCVTVQRCGGCCPDDGLBC VPTGQHQVRMQ1LMIR\'PSSQLOBMSLEEH SQCECRPKKKDSA VKPDRAATPHHl\PQPRS VPGWDSAPGAPSPADITHPTPAPGPSAHAAP S'lTSALTPOP" AAASSVAKGGA

5.

ADN de VEGF-B (ratón) ."","".¡¡jCgctllC&I__~"'''''''''''" ~..8IItIPgeggaggaacc~RCrccc~

Identificador de secuencias

Descripción Secuencia

N° de referencia de oggg<ccocgg¡cccgagcoatggggC!ctWtgcq¡cc&<OCC Genbank: NM_01 1697 C08Dgocgccgggctagggocatgegggcgclcccggcgclcgc cccccgcuggcaccatgegccccctgctocgtegcctgctgcttgtt gca~tgctgc.agctggctcgcaccceggoccclgtgtc:cC8gtUga Iggccccagccaccagaagaaagtggtgccatggata¡acgUtatg caogtgcc:acatgccagcccagggaggtggtggtgcctctgagcat 88Bactcatgsw=aatglggtcaaacaactagtgccoagctgtgtga ctgtgcagegctgtggtggctgctgccctgacgatggcclggaalgt gtgccoactgggcaacaccaagtccgaatgcagatcctcatgatc.ca gtncccgagcagtcagotgggggagatgtocctgp:o.gaacacag ccaatgtgaatgcagaccaaaaaaaaaggagagtgctgtgaagoca g&cagggttgccataccccaccaccgtccccagccccgclClgltcc gggetgggaatctacc ccgggagcatcotccccagctgacatcatccatccc8Ctcoagcccc 8ggalcclctgcccgccttgcacccagcgccgtcaaogGCCtgaco cccggacctgccgaF,gctpgacgCC&ccgcttcc~ttg coaagggcggggcttagagcl08aoccagacacctgtaggtgccg gaagccgcgaaagtgacugctgctttccagactccacgggcccg gctgcttttalggcccIScUcacu888Bgaagag1ggagcacaggo . pacctcctcagtctggga.sgtcaclgccccaggacotggaccttUa gagagctctctcgccatcttttatctcccagagctgc~8acaattg tcaaggaaoctoatgtctoacctcaggggceagggtactctctcactt aaccaccctgstcaagtgagcatcttctggctggclgtctcccctcact algaaaaccccaaactb::tacca.ataacgggatttgggttclgttatga wctgtgacacacacacaoactoacactatgataaaagagatggaa1...,.;"'.

6.

AA de VEGF-B (ratón) N° de referencia de Genbank: NM_01 1697 MSPLLRRLLLVALLQLARTQAPVSQFDOPS HQKKVVPWlDVYARATCQPREVVVPLSMB LMONVVKQLVPSCVTVQRCOGCCPDDOLB CVPTGQHQVRMQILMIQYPSSQLOEMSLEB HSQCECRP1CKKESAVKPDRVAIPRHRPQPRS VPGWDSTPOA.'lSPADllHPTPAPGSSARLAPS AVNALTPOPAAAAADAAASSIAKOOA

7.

AA de VEGF-B167 (ratón) MSPLLRRLLLVALLQLARTQAPVSQFDOPS HQKKVVPWlDvYARATCQPREVVVPLSMB LM~QLVPSCVTVQRCGGCCPDDOLB CVPTOQHQVRMQlLMIQYPSSQLGEMSLBII HSQCECRPKKKBSAVKPDSPRlLCPPCTQRR QRPDPRTCRCRCRRRRFU!CQORGI.BLNPD TCRC1UCPRK

8.

AA de VEGF-Bl66 (ratón) N° de referencia de Genbank: U52820 MSl'll.RRLLLVALLQLARTQAPVSQFDOPS HQKKVVPWlDvYARATCQPRBVVVPLSMB LMO~QLVPSCVTVQRCGGCCPDDOLB CVPTOQHQVRMQILMIQYPSSQLOEMSUlB HSQCBCRPKKXESAVKPDRVAIPHBRPQPRS VPGWDSTPOASSPADIIIIPTPAPOSSARLAPS f,VNALTPOPAAAAADAAASSIAKGOA

<110> INSTITUTO LUDWIG PARA LA INVESTIGACiÓN DEL CÁNCER

<120> DIRECCiÓN A LA REGULACiÓN DE VEGF-B DE TRANSPORTADORES DE ÁCIDOS GRASOS PARA MODULAR ENFERMEDADES HUMANAS

<130> 029065.58991 WO

<140>

<141>

<150> 60/801 .549

<151>

<160> 42

<170> Palenlln Ver. 3.3

<210> 1

<21 1> 1172 10 <212> ADN

<213> Horno sapiens

<400> 1

geg¡Itg¡C999 egeeeeC4iJ9C cctqct;ctc Qccc;¡cactcc tQcccctqc;¡c c.cc.;.;c;¡. cC~9cccc99 c;¡.qc;l"tqQtQ9 Qct99t QCCC ac;lct.c;¡cc;¡tQa qqa9t.9t.c¡t9 CCc.Ct.;9QC Q~9ca9t~9 ctlj\lft9qa9i1 aaaaaa99ac agtgctqt9a ccqt.tctqtt. ccQQ9ctq9Q t.eccaeteca qccCC&Q9CC cccc9qacct 9ccqctqccq tt.q.qctca .ooo&qaoo«; C4lq.ctC..qc a99qtqactt ct.qqt.aaa. aeaqccaaqc 999cct.ctca CjI·99qctctt c:aq.qtt.qqa a9aqqaQ"act BtIJ98qtac:t. 9tcecagee~ tcctcecctc acta.q••q. ••ctCjltgacc cec.acect;

•••aa..... ••••••••••

<210> 2

<211> 207

<212> PRT 20 <213> Horno sapiens

<400> 2

099cQljJCCCC 99c990caee atQ8QCcctc t9caQct9"9C ccceg-cccaq c;¡cccctc;¡tct .aqtqqtqt.c atoqatac;¡at qt9tat.actc tgeccttqac tqt:Qgaqetc at.99Qcaceg c;tqtqcaqcIJ ctc;¡t.CJ;tQ9c tgct;ccct.;ac¡cacca&qt ccV9atqcag atcc::tcatq. t9tccctoqa &Oaacacavc cavtqtq••t egccaqacag q;ctqccact ccce.ceacc act.ct:qoec:c cQ(J4ocacec tccceaqct9 ectctqccca cqct:.CiJcaccc agcaee_eca ctqccqaeqc cqcaqettcc tecc¡t.tqcca ctqc.qqt:qc cq9aaqctqc qaaqQtQaca g-cctcac;Ji!q9 ctatatecea 9t 9999Qa.c cccc:a.~cc tca9CCeaQCjl C6CjleaCjlctQc ctqccatccc tt.Qtoteeet q8QCJceatea IjjJCjlCjla9Cj1CAIjIC aa9aCjl991j1t.c ac:atacca'iJc etaat::cKt.c tgeqcaaqt.. aCJCAtct.tac ccea.accee t9c.t.aat99 qatttq99ct

at····9·9· t.99a·!il9···

a......... aa••a••••a

toctcc;ccq cccaQcctga Qcqctacct.q tC;¡9ccaaaca acqat.qqcct: tccqqtaccc gcaq.cctaa qtccCC&qcc acatc:aecea Qcqc:cctCiJec: aq99C9QQ;c cat.g9ctttt .a&qa99a9c tct·99·c:ct

tca.a~g9a

t.ca9999iJ.qa ••c.t.qq«c:t ttqqt.ca.CjI

...........

.0 120

18.

2'.

300 360 4"

...

540 600

78.

84. 900 960 1020 1080 lUO

Met Ser Pro Leu Leu Arq Arq Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15

Ala Pro Al.a Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 25 30

Arq Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arq Ala Thr Cys Gln 35 40 45

Pro Arg Glu Val Val val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr val

50 55 R

Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg eys Gly Gly 65 10 75 80

Cys eye Pro Asp Asp Gly Leu Glu eye Val Pro Thr Gly Gln His Gln

85 % e

Val Arq Met Gln na Leu Het Ile ArQ Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 UO

Glu Met Ser LeU Glu Glu Bis Ser Gln eye Glu eys ArQ Pro Lys Lys 115 120 125

Lys Asp Ser Ala val Lys Pro Asp Arq Ala Ala Thr Pro His His Arq 130 135 140

Pro Gln Pro Arq Ser Val Pro Gly t'rp Asp Ser Ala Pro Gly Ala pro 145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Ile Thr Ris Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala 165 170 175

Ris Ala Ala Pro Ser Thr Thr Sar Al. Lau Thr Pro Gly Pro Ala Ala 180 185 190

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala 195 200 205

<210> 3

<211 > 188

<212>PRT

<213> Horno sapiens

<400> 3

Me, Ser Pro Le\1 Leu Arq Arg Leu Le\1 Leu Ala Ala Leu Le\1 Gln Leu 1 5 10 15

Ala Pro Ala G1n Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln 20 2' 30

Arq Lys Val Val Ser Trp Ile ASp Val 'l'yr Thr Arq Ala Thr eye Gln 35 40 45

Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

50 55 ~

~a Lys Gln Leu Val Pro Ser Cye Val Thr Val Gln Arq Cys Gly Gly 65 70 75 80

Cye Cys Pro ASp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln 85 90 95

Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arq Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly 100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 115 120 125

Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arq Pro Leu Cys Pro Arq 130 135 140

eys 'hr G1n Bis Bis Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr eyo Arq Arq Arq 145 150 155 160

Cys Arq Arq Arq Ser phe Leu Arq Cye G1n G1y Are¡ Gly Leu Glu Leu 165 170 175

Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arq Lys Leu Arq Arq 180 185

<210> 4

<211> 207

<212>PRT

<213> Horno sapiens

<400> 4

Met Ser pro Leu Leu Arq Argi Leu Lau Leu Ala Ala Leu Leu Gln Le. 1 , 10 l~

"lo P.o Ala Oln Ala '.0 Val Ser Gln Pro AO. Ala Pro Oly Mis Gln

20 2. 30 At. Lyo val Val Ser Tr. Ilo Asp Val Tyt Thr "". Al. Thr Cyo Gln

.,

JO

'0

Pto Ar. Gl. Val Val V., Pro Lo. Tht val Gl. Lou Mot Gly Th. val

6.

.. '0 " Ah ¡,y.s Gln Lou Val Pro Ser Cyo Val Tht Val Gln Ar. Cya Gly Gly

,.

70 00

Cyo eVO Pro Asp Asp Gly Lau Glu Cy. Val Pto Tht Gly Gln R1I Gln .~ 90 9'

Val Arg ...t Gln Il. Lau Mét ne Ar. Tyr Pro Ser Ser Oln Lau Gly '00 110

'O,

Glu Ket Ser Lou Glu Glu His Sor Gln Cy. Glu ey. Ar. Pro Ly. Ly. 1" 120 12.

Lys Asp Ser Al. Val Lys Pro ASp Arq Ala Ala Thr Pro Mis Mis Ar9 130 135

,..

Pro Gln Pro Ar. Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Al. Pro Gly Ala Pro

,..

14' ". '60

Ser Pro Ala As. :[1. Thr Hia Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala

110 11.

".

His Ala Ala PtO Ser Thr Thr Ser Al. Le. Thr Pro Gly pro Al. Al. 190 19.

,.5

Ala AlA Ala As. Ala Ala Ala Ser ser Val Ala Ly~ Oly Gly Al..

19. 200 20'

<210> 5 5 <211> 1236

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 5

eteaq<Jecgt cqctoc99c9 cegeQt't.qcQ ct;Cc:t9C9C cc:aQoqctcq 90899999CC 60

9C4gaqqaqc cqeeccct:oc qec::ccqeccc 99Qt.CCCC90 geccgcgcca tgg(Jqctet(J 120

gc:toccqccc¡ ccceccacQc CQCC09Qcta 999ccat9c; 99cqctcCCC)' gcqctcqccc 180

cccqCC)'ogca c::catoaqccc cctqctccqt cgcct9ctqc ttottqcact gCtqC8qCtq 2.0

9Ctcqcaccc a9Qcccctgt qtcccaqttt. go.tqC¡CCCCD qCCOCCGO·· g···Ot.q9t c¡ 300

ccatqqataq-aC9t:t:tatgc acqtqcceca tqcc::aqccea gq9a9gt~qt 99t:g'cctct:C) 360

a9catoqaac tcatooqcaa tgtqqtcaaa caactaqtqc cea9ctgt:9t qactqtocaq '20

cqctqtqqto qctqctqccc ttol8<::0_t09<:: <:t.99··t9t9 tgcccactQ9 qca.caceaa ••0

gtccqaatoc 89&tcctcat qateca9ta.C c::c;&qcagtc 8;ct999998 gatgtceetq >40

9a8qaacaca gccaatgtOa. at9caqacc8 aaaaaaa8q9 a08gtqctQ'1: gaaqccagolc 600

agoqtttjlcea teccccecca cc;tcccceq ceecqctcto ttcc900ct O 99actct.acc 660

e09QQaqeat. cctccccaoc t.gacateetc eatoceacte caqceceaqt¡ atcctetgce 720

cQCcttQcac CC40Cqccot caa~c:cctq accc:ccQQac ctQccQctQC cQct.9caoac 190

OcovccQctt ectccett.9c ca8099c999 octtaoaoct eaaceeaqee acctotaoot 9.0

OCC90aa9cC ;c94aaqeOa eaagct9ctt tcc·o·otcc aC999ccc;Q ctgcttttat 900

99CCc:tqctt. caC&oqgaqa aqaqt.Ogagc acaooeOaac c:tcctcagte t990a09tea 960

ctqcccca9'q BcctOqBcCt tttaqaqaVc tctc:tcoeca tcttttatet ccca9aQcto 1020

ccatctaiica att9tcilaq9 aaccteatqt ctcaceteao 999cca99gt actctctcac lOBO

ttaaceaccc tgqtC88qtg agcatcttct 9gct99ctOt cteccctcac tatq.aaacc n40

ccaaac:ttct aceaat.ecO 90atttqQ9t tetQttatqa t ••ctqtgac .cae.cacae 1200

aetcacacte tgataaaaQ8 vatvoaagac actaae 123&

<210> 6

<211> 207 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Me< Sor Pro "". .... Or9 Ar9 "". Lo. .... Val Leu Gln .....

Al~ ~u

1 10 1S

•

Ala "r9 Thr Gln Al. Pro Val Ser Gln Oho A3p Gly Pro SOr H15 Gln 20 2S 30

Lys Lys Val Val Pro Trp l1e .sp Val Tyr Ala Arg "a \'hr eys Gln JO '0 es

Pro Arq Gl\l Val Val Val Pro Lau Ser Het Glu lAu Ho' Gly Aan Val SO 60

10 val Lys Gln t.e\l Val Pro Ser cys ViiI Thr Vd Gln Arq cys Gly Gly

6. 10 90

ey. ey. Pro Asp Asp Gly Lau GIu Cys Val Pro TOr Gly -Gln H'. Gln

.. "

90 .5

Val Arq He' Gln Uo Lau Me' lle Gln "yr Pro Se.r Ser Gln Lau Gly 100 lOS 110

Glu Met Ser Lau Glu Glu His Sor Gln Cys GIu eVa .A.rq Pro Ly. Lyo 115 120 12S

Lya Glu Ser Ala Vill Lya Pro As. Ar9 Val Ala llo Pro His Mis Arq 130 13. 140

Pro Gin Oro Ar9 Sor vol Pro Gly Trp Asp Ser Thr Pro Gly Alo s. r

14' ,"O l SS 160

Sor Pro Ala .s. U. Uo a.. Pro Tl>r Pro Ala Pro Gly Sor Sor ,'a

16. 170 17S

Aeq Leu Ala Pro Ser Al·a Val Mft ',a .... The-Pro Gly Pro Ala Ala 180 18. LOO

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser na .\.la Ly. Gly Gly Ala 200 20S

'"

<210> 7

<211> 188

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 7

Het S<or Pro Le . Leu. Arq Arq Le. Leu Leu Val Ala 1 5 10

Ala Arl) Thr Gl. Ala Pro Val Ser Gl. Pho A.sp Gly 20 25

Ly. Ly. Val Val Pro Trp n. Aa. Val Tyr Ala A.t9 35 40

'ro ArO Glu Val Val Val 'ro Leu 3er . et Gl. Leu .0 55 60

Val Ly. Gl. Leu Val 'ro Ser Cy. val Thr V. l Gln 65 10 15

Cy. Cyo Pro As. AlJp Gly Leu Glu Cy. Val Pro Thr

8. 90

Val Arg Me' 01. ne l.. y M.t Ile Gln Tyr 'ro Ser 100 lO.

Gl u ..., Ser Leu Gl. C1. H1$ Ser Gl. Cy. Gl • Cy.

11' 120

Lyo el. Sor Ala Val Ly. 'ro "". Ser Pro Ar9 no 13' 135 14'

eyo Thr Gln MI) Aro G1. Aro Pro As. Pro Ar. Thr 145 150 155

Cy. ArO Aro Ar. Aro • ho Lo • Mis ey. Gl. Gly ArO 165 170

A3n Pro Asp Thr ey. Ar9 Cy5 ~rg Lya Pro Are) Lys 180 185

<210> 8

<211> 207

<212> PRT 15 <213> Mus musculus

<400> 8

Le. Leu Gln Leu 15

Pro Sor H<- G1.

.. 30 Ma Thr eyo Gl.

Val.

."' Gly Asn Ar. Cys Gly Gly

Gly Gl. Hi s Gln '5

Ser Gl. LOu Gl y 110

Ar. Pro Ly. Ly.

125 Lo. Cy. pro Pro

ey. Ar. Cys Ar9 160

Gly Leu G'. Lo. 115

Mot s.x Pro LeI1 Leu Ar. Ar. LQuLeu Lou Val Alil Leu Leu Gln Leu 1 10 15

•

Ala ArQ Thr Gln Ala 'ro Val Ser Gln Oh. Asp Gly Pro Ser Hi. Gln

20 2.

3.

Ly.s Lys Val Val Pro Trp no "'P Vol Tyr Al. Ar. Al. Thr Cys Gln 40

3' ..

p¡:o Acq Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val '0 55 60

Val Lys Gln l.e\! Val 'ro Ser Cy. Val Thr Val Gln Arg ey. Gly Gly

6' 7. 75 BO

Cy. Cy. Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cy. Val 'ro Thr Gly Gl. Hl. Gln .5 90 95

Val Ar. Hot Gl. Ile Lou Het n. Gln Tyr 'ro Ser S.r Gl. Leu Gly 100 105 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu Rh Ser Gln Cys Glu Cyo Ar. Pro Ly. Lyo 115 120 125

Ly. Glu Ser Ala Val Ly. Pro ","p ArQ Val Ala Ue Pro Hl. Hl. Ar. 130 135 140

Pro .,. Pro Arq '.r Val Pro Gly Trp ASp S•• Thr P.o Gly ..a Se. lSO 155 16.

14'

So. Pro Ala Asp Uo n. Mio Pro Thr P.o Al. Pro .'y Sor So, A"

'.5 170 175

Arg Leu Ala Pro S.r Ala Val Asn .,. Lou Thr Pxo Gly Pro Al. Ala lB. 185 ,.0

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ala Lys Gly Gly Ala U5 200 205

<210> 9

<211> 13 5 <212>PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

<220>

<221> MOD RES

<222> (2)

<223> aminoácido variable

<220>

<221> MOD RES

<222> (5) .. (7)

<223> aminoácido variable

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)

<223> aminoácido variable

<400> 9

Pro xaa Cys Val xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys 1 5 10

<210> 10

<211> 25

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

10 <400> 10 tcaatgtacc aggaattaca gaagg 25

<210>11

<211> 22 15 <212>ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 11 tctccaggct cagagtcaga ag 22

<210> 12 25 <211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 12 ttcctgagga tacaagatac catlg 25

35 <210> 13

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 13

ttctttctgg aaatgtcatg age 23 45 <210> 14

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 14 ctctgaacct ggtgcagctc ta 22

<210> 15

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 15 65 tcgaaggtct ccagacagga 9 21 <210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 16 10 gcaagtccca tcagcaactg 20

<210> 17

<211> 20

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

20 <400> 17 gggggaaatc acagcttctc 20

<210> 18

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 18 gctataccag catgtccgct c 21

<210> 19 35 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 19 gtggtcagag attccaggtt cc 22

45 <210>20

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 20 tacaaccaag tggtgacatc tctg 24

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 21 65 aatctcttcg gtcaatggga c 21

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 22 10 gcgagaacat tcccttcacc 20

<210> 23

<211> 21

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

20 <400> 23 aacactgctg agtcctttcc c 21

<210> 24

<211> 27 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 24 gatgagcata ggacatactt agatgtg 27

<210> 25 35 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 25 caccactcca atcccaagta ag 22

45 <210>26

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 26 actcttccag ccttccttc 19

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400>

27 65 atclccttcl gcatcctgtc 20

<210> 28

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400>

28 10 ttgaggagct ttcaccgaac 20

<210> 29

<211> 20

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

20 <400> 29 ggaggagtac aacaccacgg 20

<210> 30

<211> 22 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 30 agtaaaagca gggagtctgt gg 22

<210> 31 35 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 31 agcacctctc tcgtgatttc c 21

45 <210>32

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 32 tggtccgtgt caacgagg 18

<210> 33

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 33 65 ggtggacacg ttctcgcc 18

<210> 34

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 34 atggaatcct gcggcatc 18

<210> 35

<211> 20

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonudeótido sintético

<400> 35 gcttgctgst ccacatctgc 20

<210> 36

<211> 18 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 36 catccctttc accctgcc 18

<210> 37 35 <211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 37 tgtcgtggca tttcacaaac 20

45 <210> 38

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonude6tido sintético

<400> 38

agcaccacll ctgaactcca ac 22 55

<210> 39

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Oligonucleótido sintético

<400>

39 65 ctgctctgcg gtcctaagtc 20

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400>

40 10 ctgtcgctgg tttctccaac 20

<210> 41

<211> 18

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

20 <400> 41 aagggaaggt gtccgtcg 18

<210> 42

<211> 6 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Marcador His 6x sintético

<400> 42

Mi s Hls Bis Hls 81s 81_

1 5

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de VEGF-B para su uso en el tratamiento de una dislipidemia en un sujeto humano, en donde dicho agente se selecciona de entre:

   (a)

   un anticuerpo anti VEGF-B o un fragmento de unión a antigeno del mismo; y

   (b)

   un oligonucleótido antisentido que inhibe la transcripción o la traducción de VEGF-B, expresado opcionalmente a partir de un vector de expresión.

   10 2. Un inhibidor de VEGF-B de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo el cual se une a VEFG-B167 yJo VEGF-B l86 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. 3. Un inhibidor de VEGF-B de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso de acuerdo con la 15 reivindicación 1 en donde dicha dislipidemia es hipercolesterolemia yfo hipertrigliceridemia.
3. 4. Un inhibidor de VEGF-B de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde la dislipidemia es una dislipidemia genética tal como hipercolesterolemia fami liar, Apo 100 defectuosa familiar, hipertrigliceridemia familiar, deficiencia en apoproteina Gil

   20 familiar, deficiencia de lipasa hepática, hiperlipidemia fami liar combinada, disbetalipoproteinemia y deficiencia de lipoproteina lipasa familiar.
4. 5. Un inhibidor de VEGF-B de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso de acuerdo con una

   cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 Y 4, en donde el inhibidor de VEGF-B se administra en combinación con una o 25 más sustancias farmacológicamente activas adicionales por separado o en forma de un producto combinado.