【発明の詳細な説明】
VEGF−B/受容体複合体およびその利用方法 発明の背景
本発明は、血管内皮増殖因子−B(VEGF−B)とFlt−1受容体とから
なる複合体、そのような複合体を利用してVEGF−B−媒介細胞応答を誘導ま
たは拮抗させる方法、VEGF−Bおよび/またはVEGF−Bアナログを同定
するためのアッセイキット、そして、VEGF−B/Flt−1複合体に結合す
る、抗体などの単離結合パートナーに関する。
血管内皮増殖因子(VEGFまたはVEGF−A;血管透過(性)因子、即ち
VPF、と称されることもある)は、PDGFファミリーの血管形成の(angioge
nic)増殖因子である。それは、その効果を2つの内皮の受容体チロシンキナー
ゼ(RTK)、即ち、Flt−1(VEGFR−1としても知られる)[シブヤ(Shib
uya)他,Oncogene,5:519-524(1990);デ.フリース(de Vries)他,Science,2
55:989-991(1992)]およびFlk−1/KDR(VEGFR−2としても知られ
る)[マシューズ(Matthews)他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9026-30(1
991);ターマン(Terman)他,Biochem.Biopphys.Res.Comm.,187:1579-86(1992)
;ミロア(Millauer)他,Ce11,72:835-46(1993)]を介して発揮する。これらの
受容体は、内皮細胞増殖および分化の制御および成熟した内皮の機能の維持にお
いて中心的な役割を果たしていると考えられる[シャラビー(Shalaby)他,Natu
re,376:62-66(1995);フォン(Fong)他,Nature,376:66-70(1995)]。VEGF
およびその高アフィニティーの受容体であるFlt−1およびKDR/Flk−
1は、血管系の形成と維持のため、そして、生理学的および病理学的な血管新生
の両方のために必要とされる。
胎盤増殖因子(PlGF)[マリオーネ(Maglione)他,Proc.Natl.Acad.Scl.USA,8
8:9267-71(1991)]は、Flt−1 RTKに対するもう一つのリガンドである[
パーク(Park)他,J.Biol.Chem.,269:25646-54(1994)]。それもまたPDGF
ファミリーのメンバーであり、VEGFに構造的に関連しているが、その生物学
的機能は、現在はよく理解されていない。
VEGF−Bは、オロフソン(Olofsson)他,"Vascular endothelial growth fa
ctor
B,a novel growth factor for endothelial cells",Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,93:2576-81(1996)において記載されている、明確な内皮細胞に対する増殖
因子である。それは、VEGFおよびPIGFと同様にPDGFファミリーの増
殖因子のメンバーであり、それは、それらと、分子のホモ−およびヘテロ−二量
体化にかかわるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基のパター
ンを含む、相当な構造類似性を共有している。にもかかわらず、VEGF−Bは
、VEGFとはおよそ40から45パーセントの配列類似度しか示さず、PIG
Fとはおよそ30パーセントの配列類似度しか示さない。VEGF−Bは、様々
な組織においてVEGFと共発現(co-express)していることが判明しており、特
に心臓および骨格筋組織において豊富である。それは、内皮細胞の有糸分裂と増
殖を促進し、そして内皮組織増殖および血管新生における役割を果たしていると
考えられる。
VEGF−Bは、イン・ヴィトロとイン・ヴィヴォとの両方で、低濃度のVEG
Fの分裂促進活性を増強している可能性がある。
本発明は、VEGF−Bは、Flt−1受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメ
インに結合する能力を有し、有用な細胞応答を媒介する、および/または、望ま
しくない生物学的活性を拮抗する(アンタゴナイズする)、生理活性複合体を形
成することができるという発見に基づくものである。
本明細書中、VEGF−Bのアミノ酸配列と称するものは、エリクソン(Eriks
son)他,の公表されたPCT出願第WO96/26736において記載されたヒ
トVEGF−B186の配列(Genbankデータベース登録番号U52819)のこと
を指す。Flt−1のアミノ酸またはヌクレオチド配列と称するものは、シブヤ
(Shibuya)他,Oncogene,5:519(1990)によって記載された配列(EMBLデータベ
ース登録番号X51602)を指す。Flt−1受容体またはそのアナログに対
する、VEGF−Bおよび/またはVEGF−Bアナログの結合アフィニティー
は、リー(Lee)他,Proc.Natl.Acad.Sci.,93:1988(1996)に記載の手法に従
ってテストしている。内皮細胞増殖をアッセイするための有用な方法は、オロフ
ソン(Olofsson)他,Proc.Natl.Acad.Scl.USA,93:2576-81(1996)において
記載されている。
本発明の1つの好適な側面によると、本発明は、細胞表面受容体に対して
VEGF−Bと実質的に同じ結合アフィニティーを有するVEGF−Bアナログ
を同定する方法であって、前記方法は以下の工程:
(a)(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、ま
たは、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;および、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択される受容体タンパク質を含有するサンプルを提供す
る工程;
(b)工程(a)の前記サンプルを、候補VEGF−Bアナログと接触させる工
程;
および
(c)前記候補VEGF−Bアナログと、工程(a)の受容体タンパク質との間
の特異的な結合を検出する工程:
を有するVEGF−Bアナログを同定する方法に関する。
VEGF−Bの細胞表面受容体への結合は、受容体へのVEGF−Bダイマー
の結合が関与しており、それによって受容体の二量体化およびその受容体の自己
リン酸化が引き起こされ、その後細胞内シグナル伝達および、適当な環境におい
ては血管新生などの細胞応答が引き起こされると考えられている。
受容体タンパク質を含有するサンプルは、例えば、自然に受容体を発現する細
胞の培養上清(条件培養液conditioned-medium)において自然に産生された可溶性
のFlt受容体とすることができる。組織サンプルまたはタンパク分解性の現象
によって細胞から自然に流れ出た組織液も、受容体サンプルとして使用すること
ができる。
本発明のこの側面によって同定されたVEGF−Bアナログは、例えばタンパ
ク質またはペプチドまたはDNAやRNAなどの非−タンパク性の化合物などの
、小
分子であってよい。アナログには、毒素または薬物または放射性同位体をタグ付
加され、腫瘍における内皮細胞上に発現されアップレギュレートされたFlt−
1を標的化することができるような、VEGF−Bまたは誘導体(限定されるも
のではないが、VEGF−Bモノマーまたはダイマーのフラグメントを含む)も
含まれうる。そのような分子は、腫瘍-誘導性の血管新生または乾癬または網膜
症などの、望ましくないVEGF−B誘導性の細胞応答を拮抗または阻害するの
に有用である可能性がある。これはKim et al.,Nature,362(6243):841-44(199
3)またはアイエロ(Aieilo)他,New England Journal of Medicine,331(22):1
480-87(1994)によって記載されているような技術と類似の技術によって行われる
。
VEGF−B/Flt−1複合体を単離する1つの手法には、Flt−1受容
体と免疫グロブリンG(IgG)との融合タンパク質を用い、それに続いてセフ
ァロースAへの結合を使用することが含まれる。セファロースAを使用する代わ
りとして、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、またはアフィニティーク
ロマトグラフィーの使用が含まれる。受容体/IgG融合タンパク質を含む培養
上清は、VEGF−BリガンドまたはそのアナログのいずれかをコードするDN
Aでトランスフェクトされた細胞からか、または、自然にリガンドを発現する細
胞からの培養上清と、あるいは、候補リガンドアナログを含有する溶液と、相互
作用させることができる。
本発明の他の好適な側面によると、本発明は、細胞表面受容体に対して、VE
GF−Bと実質的に同じ結合アフィニティーを有するVEGF−Bアナログを同
定する方法であって、前記方法は以下の工程:
(a)(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、ま
たは、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;および、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択される、VEGF−Bに対して結合アフィニティーを
有する表面受容体タンパク質を発現する細胞を含有するサンプルを提供する工程
;
(b)前記細胞を、候補VEGF−Bアナログと接触させる工程、および
(c)VEGF−B−媒介細胞応答の誘導を検出する工程:
を有するVEGF−Bアナログを同定する方法に関する。そのような検出可能な
細胞応答の例としては、内皮細胞増殖、血管新生、受容体のチロシンリン酸化、
および細胞の遊走が含まれる。
細胞表面受容体タンパク質を発現する細胞は、受容体を自然に発現する細胞で
もよく、あるいは受容体が発現するように受容体をトランスフェクトされた細胞
でもよい。そのような細胞の培養からの培養上清を、セファロースAカラムまた
はマトリックスに通して受容体を固定化することができ、または、それらをEL
ISAテストの形態で、セルロースディスクに固定化するか、プラスチック上に
吸収させることができる。そして、リガンドを発現する細胞からの培養上清を含
む第2の溶液を、そのように固定化された受容体上に通す。所望の場合には、ラ
ジオアッセイ技術による結合したリガンドの量の測定を容易にするためにリガン
ドを放射性標識することができる。そのようなアッセイは、Flt−1受容体の
過剰発現に関わる条件についてスクリーニングするために利用可能である。それ
は即ち、コントロールと比較して結合した放射能の増加を検出することによって
行われる。この方法は、競合するVEGF−Bアナログの存在をスクリーニング
するためにも利用可能である。それは即ち、コントロールと比較して結合した放
射能の減少を検出することによって行われ、結合した放射能の減少は、テストに
おいて用いられた放射性標識されたVEGF−Bリガンドと、非−放射性の推定
アナログとの間の競合を示すものである。
別法として、前述のアッセイを逆にして、VEGF−Bリガンドまたは候補ア
ナログを固定化し、そして固定化したリガンドと、受容体を発現する細胞からの
培養上清を接触させてもよい。
本発明の更に別の側面によると、本発明は、サンプル中のVEGF−Bまたは
候補VEGF−Bアナログを同定するためのキットであって、前記キットが、
(a)サンプルを受け入れるのに適しており、そして、以下の(i)(ii)(
iii)からなるグループから選択される受容体タンパク質を含有する、容器:
(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、また
は、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;および、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖;
および、
(b)VEGF−Bまたは候補VEGF−Bアナログと、前記容器に含有される
前記受容体タンパク質との相互作用を検出するための手段:
を有し、ここで前記VEGF−Bまたは候補VEGF−Bアナログは前記容器に
受け入れられるサンプルの部分を構成するものである、サンプル中のVEGF−
Bまたは候補VEGF−Bアナログを同定するためのキットに関する。検出手段
は例えば、VEGF−BまたはVEGF−Bアナログと、前記受容体タンパク質
との特異的結合相互作用を検出するための手段、または、VEGF−B誘導性細
胞応答の誘導を検出するための手段からなるものとすることができる。
本発明の更に別の側面は、2つの分子からなる単離リガンド−受容体複合体で
あって、1つは、前記リガンドを規定し、VEGF−Bの少なくともアミノ酸1
−115またはその受容体−結合アナログを含むものであり、そして、第2は、
前記受容体を規定し、
(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、また
は、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択されるものである、単離リガンド−受容体複合体に関
する。
好ましくは前記リガンドはVEGF−Bであり、前記受容体はVEGF−Aおよ
びPIGFに対しても結合アフィニティーを有するFlt−1受容体である。
リガンドまたは複合体の単離および精製は、ハーロウ(Harlow)他,Antibodie
s,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)および/
またはマーシャック(Marshak)他,Strategies for Protein Purification and
Characterization,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)などの標準的
な参考文献において記載されている技術に従って、モノクローナル抗体を使用し
た免疫親和性精製などの通常の手法によって行うことができる。個々のリガンド
または複合体に対する好適な抗体は、通常の技術によって作成することができる
。
無細胞の(cell-free)複合体は、イン・ヴィヴォまたはイン・ヴィトロにおい
て、細胞表面受容体へのVEGF−Bの結合を競合するために、または、リガン
ド結合後の細胞−結合受容体の二量体化を妨げるために、利用することができる
。そのような無細胞の複合体は、例えば可溶性FLT(sFLT)などの少なく
とも1つの受容体分子、および、VEGF−Bダイマー分子、VEGF−Bアナ
ログダイマー分子、または混合VEGF−B/VEGF−Bアナログダイマー分
子を含むものとする。それは、ダイマーのうち1分子は複合体内の受容体分子に
結合することができるように、ダイマーの第2の分子は、細胞表面受容体への結
合に利用可能な遊離の結合部位を有するようにするためである。
リガンド−受容体複合体上のエピトープに対して特異的結合アフィニティーを
有する単離結合パートナーであって、前記複合体は、
(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、また
は、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−
1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有する
ポリペプチド鎖;または、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
によって規定される細胞表面受容体のリガンド結合ドメインと特異的結合相互作
用にある、VEGF−Bタンパク質またはそのアナログを有するものであり、こ
こで、前記結合パートナーは、複合体を形成していないVEGF−BまたはVE
GF−Bアナログに対しては実質的に結合アフィニティーを有さないものである
、単離結合パートナーを提供することも本発明の1つの側面である。好ましくは
、前記結合パートナーは、前記細胞表面受容体タンパク質またはその受容体アナ
ログの複合体を形成していない形態に対しても実質的に結合アフィニティーを有
さないものである。前記結合パートナーは、そのような増殖因子/受容体複合体
と反応するか、またはそれを認識する抗体とすることができる。ポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体のいずれも使用することができるが、モノクロー
ナル抗体が好適である。そのような抗体は、受容体またはリガンドのいずれかの
単独に結合するものをスクリ−ニングして除くというような、標準的技術によっ
て作成することができる。
本発明の更なる側面は、上述の方法によって得られた、VEGF−Bアナログ
の、
(i)細胞表面受容体へのVEGF−Bの結合を拮抗すること、または
(ii)VEGF−B-媒介細胞応答の誘導を拮抗すること、
のための使用に関する。
好適なVEGF−Bアナログは、
(i)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有する細胞表面受容体の、
リガンド結合ドメイン、または、
(ii)VEGF−Bまたはその受容体−結合アナログの、受容体結合ドメイ
ン、に対して結合特異性を有する抗体からなる。
VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有する細胞表面受容体のリガンド
結
合ドメインは、望ましくは、Flt−1の残基1−347と少なくとも30%、
好ましくは少なくとも35%のアミノ酸アイデンティティを示すものであり、特
に好ましくはそれに対応するものである。VEGF−Bアナログの、受容体結合
ドメインは、望ましくはVEGF−Bのアミノ酸残基1−115と少なくとも5
0%、好ましくは少なくとも65%の配列アイデンティティを示すものであり、
特に好ましくはそれに対応するものである。
本発明の更に別の側面は、
(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、また
は、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;または、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択される受容体タンパク質の、
(a)細胞表面受容体へのVEGF−B結合、または、
(b)VEGF−B−媒介細胞応答の誘導、
を拮抗するための方法における使用に関する。
前記ボリペプチド鎖は、VEGF−Bについて細胞表面受容体と競合し、有効
なVEGF−Bを拘束し、それによって、効果的にそれ(VEGF−B)が細胞
表面受容体と相互作用し、VEGF−B−媒介細胞応答を誘導するのを妨げる。
好適なペプチド鎖は、ケンダル(Kendall)他,Proc.Natl.Acad.Scl.,90:10705-709
(1993)に記載されている、前記受容体の可溶性形態のもの(sFLT)とするこ
とができる。
さらに、細胞表面受容体へのVEGF−B結合を拮抗するための方法を提供す
ることも本発明の1つの側面である。この方法は、Flt−1の残基1−347
によって規定されるアミノ酸配列またはそのVEGF−B受容体結合配列バリア
ントに
対して結合特異性を有するタンパク質を提供する工程を有し、ここで、前記タン
パク質はVEGF−Bの残基1−115と少なくとも50%、好ましくは少なく
とも65%のアミノ酸配列アイデンティティを有し、したがって前記タンパク質
は、前記細胞表面受容体を発現する細胞を与えられた場合、前記受容体と特異的
に相互作用する能力を有し、それによって前記受容体へのVEGF−B結合を実
質的に阻害するものである。前記タンパク質は、望ましくは前述の方法のいずれ
かによって得られたVEGF−Bアナログとするとよい。
本発明の更なる側面によると、そのような増殖因子/受容体複合体を含む医薬
調製物が提供される。
本発明の更に別の側面において、Flt−1細胞表面受容体の過剰発現によっ
て特徴づけられる疾病状態を治療するための方法が提供され、前記方法は、前記
疾病状態を患う患者に、受容体−結合に有効な量の、VEGF−Bまたは前述の
方法のいずれかによって得られたVEGF−Bアナログを投与することからなる
。
前記の受容体タンパク質が、Flt−1の残基1−347以外のボリペプチド
鎖からなるにもかかわらず、VEGF−Bに対して結合アフィニティーを示すよ
うな場合、それは、Flt−1の残基1−347と、少なくとも30%、望まし
くは少なくとも35%、好ましくは少なくとも65%、特に好ましくは少なくと
も90%、そしてさらに好ましくは少なくとも95%のアミノ酸アイデンティテ
ィを示すべきである。有用なVEGF−Bアナログは、VEGF−Bと、少なく
とも50%、好ましくは少なくとも65%、特に好ましくは少なくとも90%、
そしてさらに好ましくは少なくとも95%の配列アイデンティティを示すべきで
ある。図面の簡単な説明
本発明を例示的な実施例を参照して以下に更に詳細に記載する。その結果は以
下の添付の図面に図示される:
図1は、ヒトVEGFおよびVEGF−Bに対する発現ベクターでそれぞれト
ランスフェクトされた293EBNA細胞からの培養上清で刺激された、Flt
−1を発現するNIH3T3細胞からの、Flt−1免疫沈殿(immunoprecipita
tes)の、抗−PTyrでプローブされたウェスタンブロットである;
図2(a)および(b)はそれぞれ、35S−メチオニン標識されたマウスVE
GF−B186の、Flt−1−IgFc融合タンパク質への結合を示す、SDS
−PAGE電気泳動ゲルを、長時間および短時間露光したものである;
図3は、VEGF165、VEGF−B167、VEGF−B186および、VEGF
−Cの、可溶性VEGFR−1、VEGFR−2およびVEGFR−3への結合
の、SDS−PAGE分析である;
図4は、NIH3T3 Flt−1 細胞を用いた、mVEGF−B186によ
るVEGFR−1/Flt−1からの、[125I]−hVEGF165の置換のグラフ
である;
図5は、mVEGF164による、NIH−VEGFR−1/Flt−1上での
競合のグラフである;
図6は、過剰のVEGF165による、可溶性のVEGFR−1からのVEGF
−B167およびVEGF−B186の置換を示す;
図7は、VEGF−B186のタンパク分解性プロセシングを示すSDS−PA
GE分析である;
図8は、VEGF−B186のプラスミン消化を示すSDS−PAGE分析であ
る;
図9は、突然変異(mutational)分析および可溶性VEGFR−1への受容体結
合エピトープ突然変異体(mutant)の結合について用いたVEGF−B167の突然
変異(mutation)を示す模式図である;
図10aから10cは、VEGF−Bのシステイン突然変異のSDS−PAG
E分析を示す;
図11は、10μg/mlのヘパリンの存在下で標識したVEGF−B167の
突然変異体のSDS−PAGE分析を示す;
図12は、50ng/mlのhVEGF−B186の存在下でインキュベートし
たウシ微小血管内皮(BME)細胞からのRNAのノザンブロット分析を示す;
そして、
図13aおよび13bは、hVEGF−B186の存在下でインキュベートした
BME細胞から調製した細胞抽出液の酵素電気泳動(ザイモグラフzymographic
)分析および逆酵素電気泳動分析を示す。一般的方法
細胞培養および材料:
Sf−9細胞は、懸濁増殖のために0.1% pluronic f−68を
追加したSf−900 II SFM(Gibco BRL,Life Technologies)中に維持
した。
High Flve細胞(Invitrogen)は、Ex−cell 400培地(JHR B
ioscience UK)中に維持した。
293−EBNA、COS−7、293−T、およびNIH3T3−Flt−
1細胞[サワノ(Sawano)他,Cell Growth & Differentiation 7,213-21(1996
)]は、10%ウシ胎児血清(FCS)を追加したダルベッコ最少基本培地(DM
EM)中で培養した。NIH3T3−Flt−1は、200μg/mlのネオマ
イシンを用いて継続的な選抜下に保った。
ウシ副腎皮質−由来微小血管内皮(BME)細胞は、1.5%のゼラチンでコ
ーティングした組織培養フラスコ上で、15%ドナーウシ血清を追加した、ME
M,アルファ修飾(Gibco AG,Basel,Switzerland)中で培養した。
PAE−KDR細胞[ウォルテンベーガー(Waltenberger)他,J.Biol.Chem.,269
:26988-95(1994)]は、10%FCSを含むHam’s F12培地で培養した。
受容体Ig−融合(fusions)および発現ベクターの構築:
a)pIg−VEGFR−1
ヒトIgG1 Fcに融合したVEGFR−1の最初の5つのIg−様ドメイ
ンをコードする発現プラスミドpIg−VEGFR−1を、pLTR Flt1
からのHindIIIフラグメント(VEGFR−1のアミノ酸1−549をコ
ードするもの)を、plgplusベクター(Ingenius)に結合することによって
構築した。クローニングに先だって、pIgplusベクターをXhoIおよび
XbaIで消化し、平滑末端化し、融合タンパク質産生のために正しい読み枠と
するために、再結合した。
b)spIg−VEGFR−2
spIg−VEGFR−2コンストラクトのために、VEGFR−2の最初の
4つのIg−様ドメインをコードするcDNAを、ヒト胎児肺cDNAライブラ
リー(Clontech)をテンプレートとして用いてボリメラーゼ連鎖反応(PCR)に
よって増幅した。プライマーは、
5’−atggtacccccaggctcagcatacaaaaagac−
3’(配列番号1)
および
5’−gcgtctagagggtgggacatacacaaccag−3’
(配列番号2)
を用い、そして増幅されたフラグメントはKpn−1およびXba−1で切断し
てsignal pIgベクター(Ingenius)の対応する部位にクローニングした
。
c)mVEGF−B186pFASTBAC1
mVEGF−B186cDNA[オロフソン(Olofsson)他,J.Biol.Chem.271
:19310-19317(1996)]をEcoRIによって切断し、pFASTBAC1(Gibco
BRL Life TechnoLogies)にサブクローニングした。(His)6タグ(およびエ
ンテロキナーゼ部位)を、シグナル配列を欠いたN−末端に導入した。これは、
テンプレートとしてmVEGF−B186pSG5を用い、プライマーとして、
5’−atcgagatcttcatcaccatcaccatcacggag
atgacgatgacaaacctgtgtcccagttt−3’(配列番
号3)および
5’−caagggcggggcttagagatctagct−3’(配列番
号4)
(両者ともBglII部位を含む)を用いた、PCRを使用して行った。増幅さ
れたフラグメントはBglIIで切断してpAcGP67A(Pharmingen,U.S.A
.)の、GP−67のシグナル配列とインフレームとなるようにBamHI部位に
クローニングした。
d)hVEGF−B186pPIC−9
hVEGF−B186をフォワードプライマー、
5’−ggaattccccgcccaggcccctgtc−3’(配列番号
5)およびリバースプライマー、
5’−ggaattcaatgatgatgatgatgatgagccccg
cccttggc−3’(配列番号6)
を用いたPCRにより増幅した。C−末端に(His)6タグを含む増幅産物を
pPIC−9(Invitrogen)のEcoRI部位にα接合因子シグナル配列とインフ
レームになるようにクローニングした。
すべての配列の確実性をシークエンシングによって立証した。
タンパク質発現および精製:
Sf9およびHigh Five細胞を用いたバキュロウイルスでの産生のた
めに、mVEGF−B組換えプラークを精製および増幅し[サマーズ(Summers)他
,Tex.Agric.Exp.Stn.Bull.1555:1-57(1988)]、そして対応する発現したタ
ンパク質、およびピチア属パストリス(Pichia pastoris)(GS115系統)に
よって発現したhVEGF−B186とをNi−NTA Superflow樹脂(
Qiagen)を用いて精製した。
定量的なイムノブロットのために、感染した昆虫細胞からの培地を、スタンダ
ードとして1−30ngの精製されたm(His)6VEGF−B186とともに、
還元12%SDS−PAGEで泳動し、m(His)6VEGF−B186に対する
アフィニティー精製した抗体でブロットした。
トランスフェクション、免疫沈降および可溶性受容体結合:
293−T細胞またはCOS−7細胞を、リン酸カルシウム沈殿を用いて、h
VEGF165pSG5、mVEGF−B167pSG5、mVEGF−BkEx1-5pS
G5、mVEGF−B186pSG5、VEGFR−1 pIgおよびVEGFR
−2 pIgでトランスフェクトした。VEGFR−3 EC−IgpREP7
(ドオクター・カトリ・パジュソーラ(Dr.Katri Pajusola)から入手)および
hVEGF−C△N△C(His)6pREP7[ヨウコフ(Joukov)他,EMBO
J.16:3898-911(1997)]を同様に293−EBNA細胞で発現させた。トランス
フェクションの48時間後、増殖因子を発現する細胞を、100μCi/mlの
Promix TM L−35 S(Amersham)で、5−6時間代謝的に標識し(
別に指定されていない場合)、そして培地を収集した。指示されている場合は、
ヘパリン(10または50μg/ml)を標識培地に添加した。代謝的に標識さ
れた培地を(VEGFトランスフェクションからの場合以外)、2μg/mlのV
EGF抗体MAB293(R&D Systems)を用いて、内因性に発現しているVEG
Fおよびヘテロダイマーを2時間免疫除去(immuno-depleted)した。可溶性の受
容体については、トランスフェクションの48時間後、培地を、0.1%のBS
Aを含むDMEMによって交換し、そしてさらに12時間インキュベートした。
受容体−Ig融合(場合によっては量を、Colloidal Comassi
e(Novex,San Diego)で染色した10% SDS−PAGEで定量した)および
偽(mock)トランスフェクトした細胞からの等量の培地を、プロテイン−A−セフ
ァロースに吸収させた。代謝的に標識した増殖因子は、受容体Ig融合とともに
+4℃で3時間インキュベートし、氷冷結合バッファー(PBS 0.5% B
SA)0.02% Tween20および1mM PMSF)で3回、そして1
mM PMSFを含むPBSで2回洗浄した。
抗体の作成:
ウサギを、標準的手法により、精製したm(His)6VEGF−B186で免疫
し、その結果得られた抗血清を収集した。mVEGF−B N−末端ペプチドに
対する抗血清を[オロフソン(Olofsson)他,J.Biol.Chem.271:19310-19317
(1996)]に記載されているようにして作成した。抗血清を、CNBr−活性化セ
ファロースCL−4B(Pharmacia)に共有結合したm(His)6VEGF−B18 6
に対してアフィニティー精製した。
例1
手法:
ヒトFlt−1受容体タンパク質を発現するNIH3T3細胞の培養物を、ま
ず
DMEM中の0.5%ウシ胎児血清(FCS)にて24時間飢餓させた。細胞を
次にpREP7−hVEGF−AまたはpREP7−hVEGF−B167でそれ
ぞれトランスフェクトしておいた293EBNA細胞の培養からの培養上清中に
て37℃で5分間刺激した。pREP7単独でトランスフェクトされた293E
BNA細胞からの培養上清をネガティブコントロール(偽;Mock)として用いた
。すべての培養上清は、1μg/mlのヘパリンを含有していた。刺激後、細胞
を0.1mMのオルトバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBS中ですすぎ
、そして2mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mg/mlのアプロチニン
、および1mMのPMSFを含有するRIPAバッファー中で溶解した。可溶化
液を超音波処理し、遠心分離によって不純物を取り除き、そして抗−flt−1
抗体である、SC316(Santa Cruz)とともに氷上で2時間インキュベートした
。その結果得られた免疫性の複合体を、プロテインA−セファロースビーズでの
沈降によって収集した。免疫沈殿物(immunoprecipitates)を溶解バッファーで3
回洗浄し、6%SDS PAGEでの電気泳動によって分離し、そしてニトロセ
ルロースフィルターにトランスファーした。フィルターを西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ(HRP)−結合(conjugated)抗−ホスホチロシン抗体RC2OH(Trans
duction Labs)でプローブし、免疫反応性をECL(Amersham)によって検出した
。抗-ホスホチロシン抗体は、Flt−1上のリン酸化されたチロシンを認識し
、そしてFlt−1受容体の自己リン酸化の観察を可能とするものであった。
結果:
VEGFベクター、空の(empty)ベクターまたはヒトVEGF−B167pREP
7ベクターでトランスフェクトされた293EBNA細胞からのヘパリンを追加
した培養上清で刺激された、Flt−1を発現するNIH3T3細胞から免疫沈
降されたFlt−1の、抗−PTyrでプローブしたウェスタンブロットである
、添付の図1から理解されるように、幾分弱いがしかし陽性であるチロシンリン
酸化されたバンドが、VEGF−AとVEGF−Bとの両方について観察され、
これはこれらリガンドが両方ともF1t−1の自己リン酸化を引き起こすことを
示している。対照的に、図の真ん中の偽(−)レーンでは自己リン酸化はみられな
い。
このデータは、ヒトVEGF−BがFlt−1受容体に結合し、その自己リン
酸化を誘導するということを示している。これは、Flt−1が、ヒトVEGF
−B167に対する受容体でもあるということを示すものである。
例2
手法:
受容体IgG融合タンパク質:
Flt−1の最初の3つの免疫グロブリン(Ig)ループをコードするcDN
AをヒトIgG重鎖のFc領域へとスプライスしてつなぎ、そしてベクターpR
EP7(Invitrogen)にクローニングし、プラスミドpREP7 Flt−1−I
gFcを作成した。同様にしてpREP7 KDR−IgFcを構築した。この
実験で用いたFlt−1−IgFcおよびKDR−IgFc cDNAは、pB
JFltKT3と称されるプラスミドコンストラクトからのRT−PCR産物で
あった。結果として得られたプラスミドを用いてリン酸カルシウム法によって、
293EBNA細胞をトランスフェクトし、その結果得られる培養上清をトラン
スフェクションの48時間後に収集した。35
S−標識したmVEGF−B186の受容体IgG沈降:
マウスVEGF−B186をコードするプラスミドpSJ5(Stratagene)(pS
J5VEGF−B186)をエレクトロポレーションによりCOS細胞にトランス
フェクトし、そして細胞を35S−メチオニンおよび35S−システインで10時間
標識した。35S−標識されたhVEGF−A16Sを受容体結合についてのポジ
ティブコントロールとして用い、これはpREP7 VEGF−Aでトランスフ
ェクトした293EBNA細胞で産生され、上述のようにして標識されたもので
ある。Flt−1−IgFcまたはKDR−IgFcを含有する培養上清約1m
lを、プロテイン−Aセファロースの50%のスラリー40μlとともに連続的
に撹拌しながら4℃で1時間インキュベートした。偽(mock)−トランスフェクト
した細胞からの培養上清をネガティブコントロールとして用いた。プロテイン−
Aセファロースビーズを遠心分離によって収集し、結合バッファー(PBS、0
.5% BSA、
0.02% Tween20、1μg/mlヘパリン)中で、35S−標識された
mVEGF−B186またはVEGF(−A)を含有する1mlの培養上清ととも
におだやかに撹拌しながら室温で3時間インキュベートした。プロテイン−Aセ
ファロースビーズを遠心分離によって収集し、氷冷結合バッファーで2回、20
mM tris pH7.5で1回洗浄し、SDSサンプルバッファー中でボイ
ルし、10% PAGEで電気泳動した。
結果:
結果を図2(a)および(b)に示す。これはそれぞれ、SDS−PAGEゲ
ルを、長時間および短時間露光したものである。図において、レーン1は免疫沈
降されたマウスVEGF−B186を示す;レーン2はFlt−1−Ig、mVE
GF−B186を示す;レーン3はFlt−1−Ig、偽(mock)を示す;レーン4
は偽、mVEGF−B186を示す;レーン5はKDR−Ig、mVEGF−B186
を示す;レーン6はKDR−Ig、偽を示す。VEGF−B186がFlt−1に
対するリガンドであるか否かを判定するために、この因子に対するcDNAを含
有するプラスミド、およびVEGF(−A)をコードするプラスミド、または発
現ベクターのみを哺乳類の細胞にトランスフェクトし、タンパク質を35Sアミノ
酸で標識した。これらの細胞からの培養上清を、プロテイン−Aセファロースビ
ーズに結合したFlt−1−IgFcまたはKDR−IgFcで沈降させた。3
2kDaのバンド[図2(a)の上の矢印によって示される]が、Flt−1−I
gFcによってVEGF−B186培養上清から沈降した。免疫沈降されたVEG
F−B186と共−移動するこのバンドは、偽トランスフェクトされた細胞のFl
t−1−IgFc沈降においては見られず、VEGF−B186のプロテイン−A
セファロースのみによる沈降でも見られなかった。この32kDaのバンドのわ
ずかな沈降がKDR−IgFcによっても見られた。
これらのデータは明らかにマウスVEGF−B186と、ヒトFlt−1受容体
の間で複合体が形成されることを示すものである。
また、図2(a)および(b)から理解されるように、Flt−1−IgFc
およびKDR−IgFcの両方によってさらなるより低分子量の種が沈降してい
るが、
これら3つのバンドは偽トランスフェクトされた細胞の培養上清においても見ら
れ、COS細胞によって産生された内在性の因子、おそらくはVEGF(−A)
を表すものであると考えられる。これらの中で、括線(brackets)の矢印によって
示すバンドも、VEGF−B関連物質を部分的に表すものである可能性がある。
例3
VEGFR−1,−2および/または−3へのVEGF−Bの結合のテスト:
VEGF−BがVEGFR−1,−2または−3に対するリガンドであるかど
うかを判定するために、VEGF165、mVEGF−B167、mVEGF−B186
、またはVEGF−Cに対する発現プラスミドで293−T細胞をトランスフェ
クトし、タンパク質をVEGF165とmVEGF−B167については50μg/m
lのヘパリンの存在下で代謝的に標識し、培地を収集した。
VEGFトランスフェクション以外のすべてからの培養上清から、内在性のV
EGFおよびVEGF/VEGF−Bヘテロダイマーを事前に除き(preclear)、
そしてそれぞれのタンパク質を、特異的抗体によって免疫沈降するか、またはプ
ロテインA−セファロース(PAS)に結合した、Flt−1の最初の5つのI
g−様ドメインを含む可溶性受容体Ig融合タンパク質に結合させた。沈降した
リガンドを還元条件下でのSDS−PAGEによって分析した。およそ50ng
の可溶性受容体をそれぞれのリガンドの沈降のために用いた。図3に示すように
、両方のVEGF−BスプライスアイソフォームがVEGFR−1に特異的に結
合したが、VEGFR−2または-3には結合しなかった。VEGFR−2およ
びVEGFR−3受容体の機能性をそれぞれVEGFおよびVEGF−Cとの結
合テストによって確認した。このテストは、VEGF−BはVEGFR−1/F
lt−1に特異的に結合することを示し、それがVEGFおよびPlGFに続い
て第3番目に同定されたVEGFR−1に対するリガンドであることを示してい
る。
32kDと16kDの2つのバンドが、特異的抗体およびVEGFR−1によ
ってmVEGF−B186の培養上清から沈降した。32kDのバンドはmVEG
F−B186の糖修飾(グリコシル化)された分泌形態に対応する[オロフソン(Ol
ofsson)他,J.Biol.Chem.271:19310-19317(1996)]。16kDの形態はおそ
らく後で詳
細に記載する、タンパク分解性プロセシングの産物である。
例4
VEGF−B/VEGFR−1結合のさらなる調査:
細胞表面上に発現するVEGFR−1に対するVEGF−Bの結合能力につい
て、NIH3T3−Flt1細胞を使用して調査した。可溶性受容体から得られ
たデータと一致して、mVEGF−B186−感染High Five細胞からの
培養上清は、図4に示すようにNIH3T3−Flt1に対する125I−VEG
Fの結合について競合したが、偽(mock)感染High Five細胞は競合しな
かった。定量的なイムノブロットを用いて評価したmVEGF−B186について
の最大半減(half-maximum)阻害濃度は3ng/mlであり、それに比べて組換
えmVEGF164は、1.5ng/mlの最大半減阻害濃度で、ヨウ素化された
hVEGF165と競合した(図4および図5)。PAE−KDR細胞については
競合は観察されなかったので、この効果はVEGFR−1に特異的なものであっ
た。したがって、VEGF121と同様に、VEGF−B186は、VEGF165にお
いてみられるC−末端の塩基性残基を有さないが、それにもかかわらずそれはN
IH3T3−Flt1細胞上のVEGFR−1と結合することが明らかである。
VEGF−Bはまた、5つのIg−様ドメインを含むVEGFR−1 Ig−融
合と同様に、VEGFR−1の3つのN−末端Ig-様ドメインを含むVEGF
R−1 Ig−融合(残基1−347)にも良好に結合することが判明した。
凝集およびタンパク質の安定性の問題により、精製されたHis−タグ付加さ
れたVEGF−B(ヒトおよびマウス(His)6VEGF−B186、そしてマウ
スおよびヒト(His)6VEGF−Bのエキソン1−5を含むC−末端欠失(de
letion)突然変異体)は、高濃度においてしかヨウ素化されたVEGFと、VE
GFR−1結合について競合しなかった。
例5
VEGF競合研究:
トランスフェクトされた293−T細胞において発現したmVEGF−B167
お
よびmVEGF−B186を標識培地中においてmVEGF−B167について10μ
g/mlのヘパリンを用いたという違い以外は、結合テストにおいて記載したよ
うに、標識および事前に除去(preclear)した。指示された場合は、2μgの組換
えhVEGF165を非放射性のコンペティターとして結合反応に添加した。等量
の、代謝的に標識された因子を、可溶性VEGFR−1に結合させるか、または
、アフィニティー精製したN−末端ペプチドVEGF−B抗体で2時間免疫沈降
し、そして氷冷10mM Tris−HCl pH8.0、1% Triton
X−100、25mM EDTA、1mM PMSFで2回、1mM PMSF
を含有するPBSで2回洗浄した。沈殿物(沈降物)を、15% SDS−PA
GEによって分析した。図6に示すように、これら2つの形態のVEGFR−1
に対する結合およびmVEGF−B167のVEGFR−1に対する結合は、過剰
のrhVEGFによって消失し、これによって、VEGF−BのVEGFR−1
に対する結合が過剰のVEGFによって競合されうるということが示された。こ
のテストの結果は、相互作用の特異性を確認するとともに、VEGFとVEGF
−Bに対する受容体の相互作用部位はオーバーラップしているか、部分的にオー
バーラップしているか、または少なくとも近接しているはずであるということを
示唆するものであった。
例6
細胞表面受容体に対する結合についての競合:
競合アッセイのために、High Five細胞を自然の(native)mVEG
F−B186に対する組換えウイルス(mVEGF−B186pFASTBAC1)お
よび偽(mock)ウイルスで感染し、培地を感染の48時間後に回収し、すぐに使用
するかまたは−70℃で凍結した。
組換えmVEGF164(ドクター・ハーバート・ウェイク(Dr.Herbert Weich
)から入手)またはhVEGF165(R&D systems or Peprotech)を、Iodo−
Gen試薬(Pierce)を用いて125Iで標識し、PD−10カラム(Pharmacia)での
ゲル濾過によって精製した。mVEGFおよびhVEGFについての比放射能は
、それぞれ2.2x105cpm/ngおよび1.0x105cpm/ngであっ
た。
結合分析のためにPAE−KDRおよびNIH3T3−Flt1細胞を、0.2
%ゼラチンでコーティングした24穴プレートに播き、集密するまで培養し、氷
冷結合バッファー(PAE−KDRについては、Ham’s F12、0.5m
g/ml BSA、10mM Hepes pH7.4、そしてNIH3T3
Flt1については、DMEM、0.5mg/ml BSA、10mM Hep
es pH7.4)で2回洗浄し、そして増加量の標識されていないVEGFま
たはVEGF−Bまたは偽(mock)感染された昆虫細胞からの培地を含有する結合
バッファー中で、0.5ng/mlの[125I]−VEGFとともに三通り(tripli
cate)でインキュベートした。+4℃での2時間のインキュベーション後、細胞
を氷冷結合バッファーで3回、そして0.5mg/ml BSAを含有するPB
Sで2回、洗浄し、そして0.5M NaOH中で溶解した。可溶化した放射能
をガンマカウンターを用いて測定した。図4は、NIH3T3 Flt−1細胞
を用いた、mVEGF−B186による、VEGFR−1/Flt1からの[125I]
−hVEGF165の置換を示す。図5はmVEGF164による、NIH−VEGF
R−1/Flt−1上での競合を示す。
類似したテストにおいて、mVEGF−B186はPAE−KDR細胞上でVE
GFR−2について[125I]−VEGFと競合しないことが判明した。
精製した組換え(His)6VEGF−B186を用いた競合分析は、タンパク質
の小部分しか生物学的に活性ではないということを示唆するものであった。とい
うのは、自然の(native)(シグナル配列を有する)精製されていないVEGF
−B186の方が、VEGFR−1結合についてはるかに効果的にヨウ素化された
VEGFと競合したからである。
例7
VEGF−B186のタンパク分解性プロセシング:
COS細胞で発現したmVEGF−B186は、O−結合型グリコシル化によっ
て修飾され、見かけの分子量が、細胞内形態においては25kDaであるものか
ら分泌形態においては32kDaへと増加する。上述のように、293−T細胞
においてmVEGFB186を発現させた場合、32kDaの形態に加えてより速
く移動す
る形態の16kDaのバンドがみられた。このバンドはCOS細胞からの培養上
清においても、細胞が長時間標識された場合には観察された。以下のテストは、
293−T細胞において発現した、mVEGF−B186によって形成されるダイ
マーの、移動およびsVEGFR−1に結合する能力を、mVEGF−B167お
よびC−末端切断形態(truncated form)であるmVEGF−BkEx1-5のものと比
較するために行ったものである。C−末端Kemptideモチーフ[モハンラ
イ(Mohanraj)他,Protein Expression & Purification,8:175-82(1996)]を含
むmVEGF−Bエキソン1−5突然変異体(mVEGF−BkEx1-5pSG5)
は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作成した。
VEGF−BkEx1-5、VEGF−B167およびVEGF−B186は293−T細
胞において発現させた。細胞を代謝的に標識した。偽(mock)トランスフェクトし
た細胞およびVEGF−B167でトランスフェクトした細胞を、10μg/ml
のヘパリンの存在下で標識した。収集した培地からVEGFおよびヘテロダイマ
ーを事前に除き(preclear)、そしてアフィニティー精製したN−末端VEGF−
Bペプチド抗体で免疫沈降させるか、またはVEGFR−1に結合させた。結合
したリガンドを非還元条件下でのSDS−PAGEによって分析した。結果を図
7に示す。
mVEGF−B186は、最も短い34kDa、中間形態の48kDa、および
全長形態の60kDaの、3種類のダイマーポリペプチドとして移動することが
理解される。34kDaのバンドはmVEGF−BkEx1-5よりわずかに遅く移動
し、これは推定切断部位がよりC−末端側、おそらくは翻訳されるエキソン6A
[オロフソン(Olofsson)他,J.Biol.Chem.271:19310-19317(1996)]の最初の
部分にあるということを示している。
テストは明らかに、長い方のVEGF−B186アイソフォームがタンパク分解
性プロセシングを受けた結果、VEGFR−1に対する受容体結合エピトープを
含むより短い形態が生じるということを示している。VEGF−B186のこのタ
ンパク分解性プロセシングの機能的側面は、完全には理解されていない。VEG
F−B186アイソフォームは、細胞からすぐに分泌されるので、タンパク分解性
プロセシングはこのタンパク質の放出またはアベイラビリティ(有効性)を制御
するようなものではないと考えられる。
図7から理解されるように、免疫沈降された形態と受容体結合形態のVEGF
−Bシグナルを比較した相対強度は、シグナルの強度は、ダイマーにおけるプロ
セシングされたサブユニットのレベルと相関していると考えられるということを
示している。したがって、それはプロセシングによって受容体へのアフィニティ
ーが増加するということを示唆している。48kDaのバンドはプロセシングさ
れたモノマー(16kDa)および全長のモノマー(32kDa)との間で形成
されるダイマーからなると考えられる。34kDaのバンドはプロセシングされ
たそれぞれ16kDaのモノマーの間で形成されるダイマーからなる。VEGF
−Bのプロセシングによって生じた16kDaアナログを含むこれらのダイマー
はともに、2つの全長32kDaモノマーからなる〜6OkDaダイマーよりも
VEGFR−1受容体に対して良好に結合するということは重要である。
例8
プラスミン切断:
COS細胞で発現した全長形態のVEGF−B186が、プラスミンの添加によ
って切断されるのか、そしてこれがVEGFR−1結合に影響するのかを判断す
るために以下のテストを行った。これは血管新生プロセスにおいて基底膜分解の
部位における生理的メカニズムである可能性がある。
COS−7細胞をmVEGF−B186でトランスフェクトし、75分間代謝的
に標識し、そして収集した培地からVEGFおよびヘテロダイマーを事前に除去
(preclear)した。次に培地を0.1U/mlのプラスミン(Boehringer Mannheim
)とともに37℃で、0,5,15,30,および60分間、インキュベートし
た。反応を1mM PMSFと0.1カゼインユニットのアプロチニンとを添加
することによって停止させた。培地をアフィニティー精製したN−ペプチドVE
GF−B抗体で免疫沈降するとともに、VEGFR−1 Igに結合させた。沈
降したタンパク質を還元条件下でのSDS−PAGEによって分析した。結果を
図8に示す。
全長形態のものの量が減少するに伴って、15kDaのフラグメントが現れ、
続いて12kDaの第2のフラグメントが現れた。従って、プラスミン切断は実
際に起こっているが、前述のVEGF−B186の内因性タンパク分解性プロセシ
ングと
同一のフラグメントは生じていないようである。にもかかわらず、このN−末端
フラグメントはsVEGFR−1と相互作用する能力を完全に有するものであり
、これは、プラスミンのようなプロテアーゼに対して抵抗性のN−末端フラグメ
ントに、受容体結合エピトープが含まれるという点において、VEGF−BはV
EGFと類似しているということを示唆するものである。
例9
受容体エピトープの変異解析:
結晶構造決定およびVEGFについてのVEGFR−2エピトープのマッピン
グにより、多数のホットスポットアミノ酸残基が指摘された。リガンド−受容体
相互作用のために最も重要な残基は、Ile−46,Ile−83,Glu−6
4,Phe−17,Gln−79,Pro−85,Ile−43およびLys−
84である[ミュラー(Muller)他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7192-7(19
97)]。これらの残基がどの程度VEGFR−1結合に関与しているかはあまり明
らかにされていない。荷電アミノ酸からアラニンへのスキャン突然変異誘発(sca
n mutagenesis)[カイト(Keyt)他,J.Biol.Chem.,271:5638-5646(1996)]に
より、VEGFにおけるVEGFR−1結合エピトープには、酸性残基の広がり
(Asp−63,Glu−64およびGlu−67)が含まれるということが提
唱された。これらのアミノ酸残基はVEGF−Bにおいて保存されており(As
p−63,Asp−64およびGlu−67)、PIGFではより低い程度で保
存されている。
VEGFとVEGF−Bとの間で保存されており、VEGF/VEGFR−1
結合に関係しているこれら酸性アミノ酸残基が、VEGF−B/VEGFR−1
結合についても主要な決定要因であるかを分析するために、Asp63,Asp
64およびGlu67をアラニンへと突然変異させた。突然変異の模式図を図9
に図示する。これは、野生型VEGF−B形態と、種々の突然変異体を説明する
概略図である。
VEGF−B167の推定受容体エピトープ突然変異体を、トランスフェクトし
た293−T細胞において発現させ、50μg/mlのヘパリンの存在下で代謝
的に
標識した。VEGF−Bホモダイマーについて研究するために、内在性のVEG
Fおよび、VEGFと過剰発現したVEGF−Bによって形成されたVEGFヘ
テロダイマーを、VEGF抗体(R&D Systemsから入手したMAB 293)で
免疫除去した。VEGF−B突然変異体をアフィニティー精製したN−末端ペプ
チド抗体で免疫沈降させるか、または可溶性VEGFR−1 Igに結合させた
。沈殿物(沈降物)を還元条件下でのSDS−PAGEによって分析した。結果
によると、最初の2つの酸性残基の突然変異も、3つのすべての酸性アミノ酸残
基の突然変異も、VEGFR−1に対するVEGF−Bの結合を阻止しなかった
ということが明らかとなった。したがって、3つのすべての荷電したアミノ酸の
アラニンへの突然変異、または最初の2つだけの荷電したアミノ酸残基のアラニ
ンへの突然変異のいずれかに基づくこのデータは、保存された酸性残基は、VE
GFR−1に対するVEGF−Bの結合に主要な寄与を与えるものではないとい
うことを示すものである。
例10
VEGF−B167における保存されたシステインの変異解析:
VEGF−Bのダイマー形成に対する保存されたシステインの寄与を調べるた
め、そして非−対応(anti-parallel)共有結合性VEGFダイマーモデルに基づ
く構造予測をテストするために、システイン−51(Cys2)およびシステイ
ン−60(Cys4)をセリン残基へと突然変異させた。mVEGF−B167p
SG5におけるシステインからセリンへの突然変異体は、M13に基づく、ヘル
パーファージM13KO7[ヴィエラ(Viera)他,Methods Enzymol.,153:3-11
(1987)]およびdut- ung- 大腸菌株RZ1032[クンケル(Kunkel)他,
Methods Enzymol.,154:367-382(1987)]を用いたインヴィトロ−本鎖突然変異誘
発によって作成した。突然変異は、単一(single)突然変異体(C2SおよびC4
S)および二重(double)突然変異体(C2S,C4S)の両方について行った。
突然変異の模式図は、図9に示す。
突然変異体および野生型VEGF−B167を293−T細胞において、単独で
、または、共−トランスフェクション(co-transfection)として異なる組合せに
おいて
発現させ、代謝的に標識し、そして培地からVEGFおよびヘテロダイマーを事
前に除去(preclear)した。結果を図10a−cに示す。培地をアフィニティー精
製したN−末端VEGF−B抗体で免疫沈降させ、非還元条件下(図10a)お
よび還元条件下(図10b)の両方で分析したか、あるいは、可溶性VEGFR
−1Igに結合させた(図10c)。図10bから理解されるように、すべての突
然変異体はほぼ同じ量発現していた。
VEGF−B186は、おそらく2つのスプライスバリアントにおいて同一のC
−末端領域において、切断されるということが判明し、それはエキソン1−5に
よってコードされ、受容体結合エピトープとともにシステインノットを含むもの
である。野生型VEGF−B167は非還元条件下で42kDaと46kDaの2
本のバンドとして移動するが、46kDaの形態のみがVEGFR−1に結合す
る能力があった(図2Aおよび3Cを比較されたい)。42kDaのバンドは異常
なジスルフィド架橋によって結合したダイマーに対応すると考えられる。という
のはこれらの2重のバンドは、VEGF−B167のC−末端部分においてみられ
るさらなる8つのシステインを欠いている、VEGF−B186、またはVEGF
−BkEX1-5においては見られないからである。単一突然変異体C4Sからは、モ
ノマーが生じた。
VEGFR−1に結合することができない、42kDaのバンドとして移動する
ダイマーもいくらか観察された。驚くべきことに、C2S突然変異体は、部分的
にモノマーを生じたが、受容体結合能力のあるダイマーを形成することができた
。単一突然変異体の共トランスフェクション(C2S+C4S)により、46k
Daのバンドの量が増加して受容体結合を回復し、これは二量体化の欠損が、V
EGFの場合と同様に突然変異していないシステイン間のジスルフィド結合の確
立によって補完されうるということを示している[ポトジェンス(Potgens)他,
J.Biol.Chem.269:32879-85(1994)]。単一突然変異体と二重突然変異体との共
トランスフェクションによっては補完は起こらなかった。
VEGF−B167突然変異体のうちいくつかを上述のようにして発現させ、細
胞を10μg/mlのヘパリンの存在下で標識した。収集した培地をVEGFR
−1Igとともにインキュベートし、結合したリガンドを非還元条件下でのSD
S−PAGEにかけた。結果を図11に示す。C4S突然変異体と二重突然変異
体
C2SC4Sは、可溶性受容体とモノマーとの相互作用によって説明可能な、残
された(residual)受容体結合を示したということが理解される。
従って、VEGF−Bダイマーの形成に寄与する保存されたシステインの変異
解析は、VEGFとPDGFとの構造的保存を示すものである。
例11
VEGF−Bに対する生物学的応答:
ウシVEGFR−1配列に基づく特異的プライマーを用いたRT−PCR分析
は、VEGFR−1 mRNAはウシ副腎皮質由来微小血管内皮(BME)およ
びウシ大動脈内皮(BAE)細胞によって発現しているということを示している
。内皮細胞上でのVEGF−Bに対する生物学的応答を調べるために、50ng
/mlのhVEGF−B186の存在下でインキュベートしたBME細胞のコンフ
ルエントな単層から調製したトータル細胞RNAを5μg/レーン含む、複製フ
ィルターを、[32P]−標識したcRNAプローブとハイブリダイズさせた。BM
E細胞[フリエ(Furie)他,J.Ce11Biol.,98:1033-41(1984)]を、15%ドナ
ー子ウシ血清を追加したMEMアルファ修飾(Gibco AG,Basal,Switzer1and)中
で、1.5%のゼラチンでコーティングした組織培養フラスコにて培養した。2
4時間前に新鮮な完全培地を添加しておいたBME細胞のコンフルエントな単層
にサイトカインを添加した。トータル細胞RNAをTrizol試薬(Life Tech
nologies AG,Basal,Switzerland)を用いて0,1,3,9,24および48時
間後に調製した。ノーザンブロット、uv−クロスリンクおよびフィルターのメ
チレンブルー染色、インヴィトロ転写、ハイブリダイゼーション、およびハイブ
リダイゼーション後の洗浄を[ペッパー(Pepper)他,J.Cell Biol.,111:743-
55(1990)]に記載されているようにして行った。32P-標識したcRNAプローブ
は、ウシu−PA[クラッツシュマール(Kratzschmar)他,Gene,125:177-83(1
993)]、ヒトt−pA[フィッシャー(Fisher)他,J.Biol.Chem.,260:11223-
30(1985)]およびウシPAI−1[ペッパー(Pepper)他,J.Cell Biol.,111:7
43-55(1990)]のcDNAから[ポエパー(Pepper)他,J.CellBiol.,111:743-55
(1990);ペッパー(Pepper)他,J.Cell Biol.,122:673-84(1993)]に記載されて
いるようにして調製した。結果を図
12に示す。ローディングしたRNAの整合性(integrity)および均一性をトラ
ンスファーとクロスリンクの後、メチレンブルーでフィルターを染色することに
より判定した(図の下方のパネル);28Sおよび18SリボゾームRNAが示
されている。
ノーザンブロット分析は、VEGF−B186(50ng/ml)が、BME細
胞におけるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(u−PA)およびプラ
スミノーゲン活性化因子阻害剤1(PAI−1)のmRNAの定常状態レベルを
増加させるということを示すものであった。すなわち、このテストは、内皮細胞
がPAI−1 mRNAおよびu−PA mRNAを誘導することによって、V
EGF−Bに応答するということを示すものであった。したがって、VEGF−
Bの内皮細胞上のその受容体への結合は、u−PAおよびPAI−1の活性を刺
激し、それは細胞外基質分解および細胞接着および遊走の重要なモジュレーター
である。
例12
酵素電気泳動法(ザイモグラフィzymography)および逆酵素電気泳動法:
濃度0,1,3,10,30および100ng/mlのhVEGF−B186、
濃度30ng/mlのVEGF、または濃度30ng/mlの組換えヒトbFG
F(ドクター・ピー・サルミエントス(Dr.P.Sarmientos)から入手した155
アミノ酸形態)の存在下でインキュベートしたBME細胞から調製した細胞抽出
物を以下のように酵素電気泳動法(ザイモグラフィ)および逆酵素電気泳動法(
リバースザイモグラフィ)にかけた。35mmのゼラチンコーティングした組織
培養シャーレ中のBME細胞のコンフルエントな単層を、無血清培地で2回洗浄
し、そしてトラジロール(200KIU/ml)を含有する無血清培地にサイト
カインを添加した。15時間のインキュベート時間の後、細胞抽出物を調製し、
ヴァッサーリ(Vassalli)他,J.Exp.Med.,159:1653-68(1984)およびペッパー(P
epper)他,J.CellBiol.,111:743-55(1990)に記載されているように酵素電気泳
動法(ザイモグラフィ)および逆酵素電気泳動法(リバースザイモグラフィ)に
よって分析した。結果は、図13a−bに示され、これは、BME細胞において
組換えhVEGF−B186が、u−PAおよびPAI−1活性を増大させること
を示す。図13aは酵素電気泳動
(ザイモグラフzymographic)分析を示し、図13bはBME細胞からの細胞抽
出液の逆酵素電気泳動(reversezy mography)分析を示す。VEGF−B186がB
ME細胞において、u−PAおよびPAI−1活性の用量依存的増大を誘導する
ことが理解される。コントロールとして用いたVEGFによるPAI−1活性の
誘導が明らかにみられないということは、VEGFに誘導されたtPAとの複合
体へとPAI−1が迅速に捕捉されることを反映している。この複合体はVEG
F−処理された細胞の培養上清の酵素電気泳動法(ザイモグラフィ)によって観
察される。VEGFとは対照的に[ペッパー(Pepper)他,Biophys.Res.CoMun
.,189:824-31(1992)]、VEGF−B186は、t−PA活性を増大させなかった。
このテストにより、内皮細胞はu−PAおよびPAI−1の合成の増加とその結
果として起こるタンパク質活性の増加によってVEGF−Bに対して応答してい
ることが示された。しかし、u−PAの誘導のカイネティクス(9時間後に誘導
され48時間まで持続する)と比べて、PAI−1の誘導のカイネティクスは、
より迅速であり(1時間以内)、そしてより一過性であった(3時間で最大効果が
観察される)。これはbFGFおよびVEGFについて観察されたこと[ペッパー
(Pepper)他,J.CellBiol.,111:743-55(1990);ペッパー(Pepper)他,Biochem
.Biophys.Res.Commun.,181,902-906(1991);マンドリオッタ(Mandriota)他,J
.Biol.Chem.,270:9709-16(1995)]と一致する。
例11および12は、組換えhVEGF−B186は、BME細胞においてu−
PAおよびPAI−1 mRNAの定常状態レベルを増加させることを示してい
る。同様のテストにおいて、BAE細胞においてもVEGF−B186はPAI−
1mRNAを誘導したが、u−PA mRNAは誘導しなかった。
有用性
Flt−1チロシンキナーゼ受容体と、VEGF−Bおよび/またはVEGF
−Bアナログとの間の複合体形成は、Flt−1受容体の過剰発現によって特徴
づけられる疾病状態の治療として利用可能であり、その治療は、そのような疾病
状態を患う患者に、Flt−1受容体に結合するのに、または受容体を拮抗する
のに有効な量のVEGF−BまたはVEGF−Bアナログを投与することによっ
て行われる。
Flt−1受容体の過剰発現によって特徴づけられるそのような疾病状態の一例
としては、血管内皮腫が挙げられる。Flt−1受容体は、種々の腫瘍によって
も過剰発現される[ウォーレン(Warren)他,J.Clin.Invest.,95(4):1789-97(1
995);ハトヴァ(Hatva)他,Amer.J.Pathology,146(2):368-78(1995)]。
VEGFR−1と、VEGF−BまたはVEGF−Bアナログとの間の複合体形
成は、Flt−1受容体の過少発現(underexpression)によって特徴づけられる
状態を治療するのにも利用可能である。そのような状態は、正常な成人の内皮ま
たは血管形成の増加を必要とする状態を含むものとすることができる。所与の場
合において投与される量は、患者の特性および疾病状態の性質に依存するであろ
うが、ルーチン的な実験によって当業者によって判定できるものであろう。
VEGF−BまたはVEGF−Bアナログは、静脈内にまたは従来VEGFま
たはFGFのターゲット送達について用いられてきたシステムと類似のターゲッ
ト送達システム手段によって投与することが適切であろう。そのようなシステム
の例としては、プラスミドの形態でのDNAの使用[アイスナー(Isner)他,La
ncet,348:370(1996)]または組換えアデノウイルスの使用[ジョルダーノ(Giordan
o)他,NatureMedicine,2:534-39(1996)]が含まれる。VEGF−BはVEGFに
ついて記載されている方法[バウタース(Bauters)他,The American Physiolog
ical Society,pp H1263-271(1994);アサハラ(Asahara)他,Circulation,91:2
793(1995)]に類似の技術によってタンパク質の形態において、または不完全へル
ペスウイルス(defectiveherpesvirus)の使用[メスリ(Mesri)他,Circulation R
esearch,76:161(1995)]によっても提供することができる。小分子のVEGF−
Bアナログは、経口的に投与することができる。皮下の、または、腹腔内の注入
等のその他の標準的な送達方法も、利用することができる。
VEGF−Bタンパク質/Flt−1受容体複合体は、抗体の生成にも利用す
ることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体で
あってもよい。一般的に、従来の抗体生成技術を用いてVEGF−B/Flt−
1複合体に対する抗体を生成することができる。例えば、組換えDNA発現によ
って得られた融合タンパク質の免疫化によって、特異的モノクローナル抗体を作
成することができる。キメラおよびヒト化抗体、およびVEGF−B/受容体複
合体に対する
抗体フラグメントはともに、明らかに本発明の枠内に含まれると考えられる。特
に、標識されたモノクローナル抗体は、Flt−1受容体の過剰発現または過少
発現によって特徴づけられる医学上の状態についてスクリ−ニングするのに有用
であろう。そのような状態の例としては、例えば血管内皮腫等の、血管またはリ
ンパ管の内皮細胞の腫瘍が挙げられる。
本発明による診断/予知手段の1つの好適な実施態様において、抗体、増殖因
子、または受容体のいずれかを標識し、そしてこれら3つの内1つを基質に結合
させ、そうすることによって、抗体−複合体相互作用を、抗体と増殖因子/受容
体複合体との間の結合後、基質に付着した標識の量を測定することによって明ら
かにすることができる。本発明の特に好適な実施態様において、診断/予知手段
を通常のELISAキットとして提供することができる。
前述の記載および諸例は、単に本発明を例示するためのものであって、限定す
る意図はない。本発明の精神および本質を組み込んだ記載された実施態様の改変
は、当業者にとってなし得るものであるから、本発明は、以下の請求の範囲およ
びその均等物の枠内に含まれるすべての変形を幅広く含有するように解釈される
べきである。
以下の参考文献は、技術的背景情報を提供するものであり、参考文献として本
出願にその内容を合体させる。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】平成11年2月1日(1999.2.1)
【補正内容】
請求の範囲
1. VEGF−B細胞表面受容体に対して結合アフィニティーを有するVEG
F−Bアナログを同定する方法であって、前記方法は以下の工程:
(a)(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、
または、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖;および、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択される受容体タンパク質を含有するサンプルを提供す
る工程;
(b)工程(a)の前記サンプルを、VEGF−Bとは異なるが、VEGF−
Bのアミノ酸1−115と少なくとも50%同一の(identical)アミノ酸配列を
有する候補VEGF−Bアナログと接触させる工程;および
(c)前記候補VEGF−Bアナログと、工程(a)の受容体タンパク質との
間の特異的な結合を検出する工程:
を有するVEGF−Bアナログを同定する方法。
2. VEGF−B細胞表面受容体に対して結合アフィニティーを有するVEG
F−Bアナログを同定する方法であって、前記方法は以下の工程:
(a)(i)F1t−1の残基1−347によつて規定されるアミノ酸配列、
または、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有す
るポリペプチド鎖:および、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Fl
t−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるボリペプ
チド鎖:
からなるグループから選択される、VEGF−Bに対して結合アフィニティーを
有する表面受容体タンパク質を発現する細胞を含有するサンプルを提供する工程
;
(b)前記細胞を、VEGF−Bとは異なるが、VEGF−Bのアミノ酸1−
115と少なくとも50%同一の(identical)アミノ酸配列を有する候補VEG
F−Bアナログと接触させる工程、および
(c)VEGF−B−媒介細胞応答の誘導を検出する工程:
を有するVEGF−Bアナログを同定する方法。
3. 前記工程(c)において検出されるVEGF−B−媒介細胞応答が、内皮
細胞増殖である、請求項2の方法。
4. 前記VEGF−B−媒介細胞応答が、血管新生である、請求項2の方法。
5. 2つの分子からなる単離リガンド−受容体複合体であって、前記分子の1
つは、前記リガンドを規定し、VEGF−Bの少なくともアミノ酸1−115、
または、VEGF−Bのアミノ酸1−115と少なくとも50%のアミノ酸配列
アイデンティティを有するVEGF−Bの受容体−結合アナログ、または、受容
体−結合アミノ酸配列バリアント、または、その異種の(xenogeneic)ホモログ
、を含むものであり、そして、前記分子の第2は、前記受容体を規定し、
(i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、または
、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるボリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt−
1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有する
ポリペプチド鎖;
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−
1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチド
鎖:
からなるグループから選択されるものである、単離リガンド−受容体複合体。
6. 前記受容体が、VEGFに対しても結合アフィニティーを有する、請求項
5の複合体。
7. (i)細胞表面受容体へのVEGF−Bの結合を拮抗すること、または
(ii)VEGF−B−媒介細胞応答の誘導を拮抗すること、
のための方法における、請求項1または2の方法によって得られた、VEGF−
Bアナログの使用。
8. 前記VEGF−Bアナログが、Flt−1のアミノ酸1−347によって
規定される細胞表面受容体、または、そのVEGF−B−特異的受容体アナログ
の、リガンド結合ドメインに対して結合特異性を有する抗体からなる、請求項7
の使用。
9. (i)Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列、ま
たは、そのVEGF−B−特異的受容体アナログからなるポリペプチド鎖;
(ii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt−
1の残基1−347と少なくとも30%のアミノ酸アイデンティティを共有する
ポリペプチド鎖;または、
(iii)VEGF−Bに対して結合アフィニティーを有し、そして、Flt
−1のヌクレオチド1−1293によって規定される配列からなる核酸とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるボリペプチ
ド鎖:
からなるグループから選択される受容体タンパク質の、
(a)細胞表面受容体へのVEGF−B結合、または、
(b)VEGF−B−媒介細胞応答の誘導、
を拮抗するための方法における使用。
10.細胞表面受容体へのVEGF−B結合を拮抗するための方法であって、前
記方法は、Flt−1の残基1−347によって規定されるアミノ酸配列または
そのVEGF−B受容体結合配列バリアントに対して結合特異性を有するタンパ
ク質を提供する工程を有し、前記タンパク質はVEGF−Bの残基1−115と
少なくとも50%のアミノ酸配列アイデンティティを有し、したがって前記タン
パク質は、前記細胞表面受容体を発現する細胞を与えられた場合、前記受容体と
特異的に相互作用する能力を有し、それによって前記受容体へのVEGF−B結
合を実質的に阻害するものである、細胞表面受容体へのVEGF−B結合を拮抗
するための方法。
11.前記タンパク質が、請求項1または2の方法によって得られたVEGF−
Bアナログである、請求項9の方法。
12.Flt−1細胞表面受容体の過剰発現によって特徴づけられる疾病状態を
治療する方法であって、前記方法は、前記疾病状態を患う患者に、受容体−結合
に有効な量のVEGF−Bアンタゴニストを投与することからなり、ここで前記
VEGF−Bアンタゴニストは、請求項1または2の方法によって得られたVE
GF−BアナログまたはVEGF−Bに対する抗体を含むものである、Flt−
1細胞表面受容体の過剰発現によって特徴づけられる疾病状態を治療する方法。
13.F1t−1細胞表面受容体の過少発現(underexpression)によって特徴づ
けられる状態を治療する方法であって、前記方法は、前記状態にある患者に、受
容体−結合に有効な量のVEGF−BまたはVEGF−Bアゴニストを投与する
ことからなり、前記VEGF−Bアゴニストは、請求項1または2の方法によっ
て得られたVEGF−Bアナログを含むものである、Flt−1細胞表面受容体
の過少発現によって特徴づけられる状態を治療する方法。
14.VEGF−Bのタンパク分解性プロセシングによって生じる受容体−結合
16kDaフラグメント、VEGF−Bのプラスミン消化によって生じる受容体
−
結合フラグメント、C−末端Kemptideモチーフを含有する受容体−結合
エキソン1−5ミュータントフラグメント、および前記受容体−結合フラグメン
トの少なくとも1っを含むダイマーからなるグループから選択される、VEGF
−Bアナログ。
15.2つのVEGF−Bのタンパク分解性プロセシングによって得られる16
kDa受容体-結合フラグメントからなるダイマーからなる、請求項14のVE
GF−Bアナログ。
16.全長VEGF−BモノマーとVEGF−Bのタンパク分解性プロセシング
によって得られる16kDa受容体−結合フラグメントからなるダイマーである
、請求項14のVEGF−Bアナログ。
17.請求項14のVEGF−Bアナログをコードするポリヌクレオチド。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 9/00 A61P 35/00
35/00 43/00 111
43/00 111 C07K 14/485
C07K 14/485 14/71
14/71 19/00
19/00 G01N 33/53 S
G01N 33/53 33/566
33/566 C12P 21/02 C
// C12P 21/02 A61K 37/02
(72)発明者 グンジ,ユウジ
フィンランド国 エフアイエヌ―00290
ヘルシンキ トペリウクセンカトゥ 32
エイチ 5
(72)発明者 アリタロ,カリ
フィンランド国 エフアイエヌ―02100
エスポー ナイイリキンティエ 4 エイ
(72)発明者 オロフソン,ビルギッタ
スウェーデン国 エス―117 ストックホ
ルム ホルンスガタン 106 3 ティア
ール
(72)発明者 エリクソン,ウルフ
スウェーデン国 エス―746 34 バルス
タ ヘーゲルヴェーゲン 27