JP2009516170A - タンパク質性結合ペア、心血管状態および子癇前症に関する診断方法 - Google Patents

Abstract

標識された第２タンパク質性特異的結合パートナー（ｓｂｐ）への第１タンパク質性ｓｂｐの結合を検出することを含む、生物学的サンプル中の第１タンパク質性特異的結合パートナーの量を測定する方法。ここで、第１または第２ ｓｂｐはいずれも、抗体またはそのフラグメントではない。該方法は、好ましくは、サンプル中のｓＦｌｔ−１、特に遊離ｓＦｌｔ−１の量、およびＰｌＧＦ、特に遊離ＰｌＧＦの量を決定する方法であり、好ましくは、遊離ＰｌＧＦを遊離ｓＦｌｔ−１と比較することを含む子癇前症のリスクを予測する方法において用いられる。

Description

本発明の分野は、好ましくは患者から得られる生物学的サンプル中の胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ−１）および関連分子の検出に関する。

免疫診断は、ヒトを含む動物を苦しめる又は冒す疾患、機能不全および他の状態の検出、診断、予後を可能にする。研究者がサンプルおよびデータを扱う時間を最短にする自動試験装置の助けにより免疫診断試験を行うことが非常に望ましくなっている。１９８０年以降の免疫診断の急速な商業的成長は１つには、生物学的サンプル中で見出されるマーカーに、該マーカーが認識されうるよう十分な特異性で結合する抗体および／または抗体フラグメントの迅速かつ効率的な単離を可能にする技術により可能となった。いくつかの診断試験に、より一層望ましいのは、モノクローナル抗体の使用であり、これは、多くの場合、アッセイの性能、特異性および感度を当業者が個々の必要性に合うよう注意深く適応させるのを可能にする。また、抗体は、遺伝的再操作による改良に或る程度なじみ易い予測可能な分子である傾向にある。したがって、それらは現代の免疫診断剤の必須要素になっている。

生物学的サンプル中のマーカーの検出のためには他の試薬も利用可能であるが、これらの物質を注意深く特徴づけイムノアッセイにおけるそれらの使用のための特有の技術を開発する必要性が現代の免疫診断におけるそれらの使用を幾分妨げている。これは、非抗体試薬がポリペプチドまたはタンパク質である場合に特に言えることである。

ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦは、血管形成および血管透過性を制御しうる調節ペプチドのファミリーに属する。これらのタンパク質は、この機能を達成するためにＦｌｔ−１およびＫＤＲ／ＦＬＫ１と相互作用すると考えられている（Ｍａｔｔｅｉら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３２，１６８−１６９，（１９９６））。現在、ＰｌＧＦの３つの推定アイソフォーム、すなわち、ＰｌＧＦ１、ＰｌＧＦ２およびＰｌＧＦ３が特定されている。ＰｌＧＦ２はヘパリンと結合しうる。ＰｌＧＦ２はヒト臍静脈内皮細胞内のニューロピリン−１にヘパリン依存的に結合しうると考えられている。ニューロピリン−１は、より低いアフィニティーでＰｌＧＦ１にも結合しうると考えられている（Ｍｉｇｄａｌら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３，２２２７２−２２２７８（１９９８））。

ＰｌＧＦは虚血性心臓および四肢の血管新生および側枝成長を良好な効率で刺激しうると考えられている（Ｌｕｔｔｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ８，８３１−８４０（２００２））。ＰｌＧＦによるＦｌｔ−１の活性化は血管新生を引き起こしうる。ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦは共にＦｌｔ−１に結合するが、Ｆｌｔ−１へのＰｌＧＦの結合は、Ｆｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合とは異なる生物学的効果をもたらすと考えられている。

子癇前症に罹患した妊娠女性においては、可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）の増加は遊離ＶＥＧＦ、および特にＰｌＧＦの循環レベルの減少を引き起こして、外因性ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦにより軽減されうる内皮細胞機能不全を引き起こしうる（Ｍａｙｎａｒｄら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１１，６４９−６５８（２００３））。Ｌｅｖｉｎｅら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ，３５０，６７２−６８３（２００４））により報告されている研究においては、後に子癇前症に罹患した女性では、後に子癇前症を発症しなかった女性の場合よりＰｌＧＦの血清レベルが有意に低かった。該研究は、該差異が約１３から約１６週の妊娠により感知可能でありうること、およびＰｌＧＦレベルにおける最大の差が、子癇前症の発症に近くなるほど明らかとなることを示唆した。Ｌｅｖｉｎｅはまた、子癇前症の女性において、血中の全ｓＦｌｔ−１レベルの上昇もより顕著であることを示唆した。したがって、Ｌｅｖｉｎｅらは、全ｓＦｌｔ−１のレベルの上昇およびＰｌＧＦのレベルの低下が子癇前症のその後の発生を予測しうることを示唆した。

ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１タンパク質の可溶性変異体を与えるＦｌｔ−１の選択的スプライシング形態であると考えられており、高いアフィニティーで血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｋｅｎｄａｌｌら，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２２６，３２４−３２８（１９９６））およびＰｌＧＦの両方に結合しうる。ｓＦｌｔ−１のドメイン欠失研究は、（ｓ）Ｆｌｔ−１ドメイン２および３が、ｓＦｌｔ−１と同じアフィニティーでのＶＥＧＦへの結合を可能にすること、およびドメイン２の単体が完全長ｓＦｌｔ−１より６０倍も低い強度でしか結合しないことを示している。

発明の概要
本発明は、生物学的サンプル中の、抗体の部分以外の第２の結合パートナーの量または濃度を検出するために使用される、抗体の部分以外のタンパク質性結合パートナーの使用を含む。本発明においては、好ましくは、ただ１つの抗体またはその部分が使用される。本発明の好ましい結合パートナーには、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ−１）（これは、Ｆｌｔ−１遺伝子産物の選択的スプライシングにより産生される、Ｆｌｔ−１の部分であり、ＰｌＧＦに結合しうる）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

ある好ましい実施形態においては、本発明はまた、ＰｌＧＦに結合していないｓＦｌｔ−１（「遊離ｓＦｌｔ−１」）の量を決定する方法、およびｓＦｌｔ−１に結合していないＰｌＧＦ（「遊離ＰｌＧＦ」）の量を決定する方法を提供する。

さらに、本発明は、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比を決定する方法を提供する。

もう１つの好ましい実施形態においては、子癇前症を診断し、予測し、モニターし、またはその療法をモニターするために、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比を用いる。

本発明における検出または定量に適した他のタンパク質性結合ペアには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳ナトリウム利尿ペプチド（ａｋａ、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）（ＢＮＰ）およびナトリウム利尿ペプチド受容体ａ／グアニル酸シクラーゼａ（ＮＰＲ１）（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体ａ型（ＡＮＰＲＡまたはＮＰＲＡ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ型およびＧＵＣ２Ａとしても公知であり、これは遺伝子座１ｑ２１−ｑ２２に位置すると考えられている）；ならびにインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１）およびその受容体（ＩＧＦＲ１）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

発明の詳細な説明
本発明の説明においては、以下の用語および略語を用いる。

本発明を説明するために用いる略語
「ｓｂｐ」なる略語は「特異的結合パートナー」を意味する。すべての生物学的物質は互いに或る程度のアフィニティーを有するが、特異的結合パートナーは、生物学的機能をもたらすよう互いに特異的に結合するものである。例えば、ｓＦｌｔ−１は、生物学的に有意なアフィニティーでＰｌＧＦに結合し、そうすることにより、ＰｌＧＦの生物活性をモジュレーションしうる。したがって、ｓＦｌｔ−１とＰｌＧＦとは特異的結合パートナーである。同様に、ｓＦｌｔ−１の膜結合対応物、すなわち、Ｆｌｔ−１も、ＰｌＧＦのｓｂｐである。さらに、ＶＥＧＦもＦｌｔ−１とのｓｂｐである。本発明の場合に有用なもう１つのタイプのｓｂｐは、抗体と、それが結合するエピトープを含む分子とである。このタイプのｓｂｐは本発明の実施形態のいくつかの機能に必須であるが、本発明のほとんどの実施形態は、第１ ｓｂｐも第２ ｓｂｐも抗体や抗体の部分ではない、その他のｓｂｐへの結合をアッセイ条件下で検出することによる１つの特異的結合パートナーの存在または量の決定（測定）に向けられている。

本明細書においては、「タンパク質性」なる語は、少なくとも１つのヘリックス、シートまたは他の重要な（ポリペプチジル）二次構造を形成するのに十分な程度に大きいポリペプチド、タンパク質断片およびタンパク質を示すために用いられる。タンパク質性なる語は、未修飾ポリペプチドと、グリコシル化、タンパク質分解された、プレニル化および二量体化ポリペプチドおよびタンパク質のような修飾ポリペプチドとの両方を含む。各タンパク質性結合性パートナーは、好ましくは、少なくとも１つの二次構造要素、例えばヘリックス構造またはシート構造（例えば、αヘリックスまたはβシート）を含む。したがって、各タンパク質性結合パートナーは、好ましくは少なくとも８アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１００アミノ酸残基を含む。タンパク質性結合パートナーは、複雑なタンパク質を形成するよう一緒に折り畳まれた複数のポリペプチド鎖をも含みうる。

「生物学的試料」または「生物学的サンプル」なる語は（特に明示されていない限り）互換的に用いられ、タンパク質性分子を含有するヒトまたは他の動物に由来する任意の物質を意味する。本発明の方法は、限定的なものではないが下水、衣類、敷物類、呼吸凝縮物および組織生検を含む任意の適切なサンプルに対して有用に行われうる。本発明の好ましい「生物学的サンプル」には、血液、血漿、血清、尿、糞便、リンパ液および唾液が含まれる。実質的に固体の生物学的サンプルを使用する場合、本発明の方法を行う又は継続する前に該サンプルの一部を抽出または可溶化するのが最も一般に好ましいであろう。

「ＰｌＧＦ」なる語は胎盤成長因子を意味し、ＰＧＦと称されることもある。ＰｌＧＦをコードする遺伝子は遺伝子座１４ｑ２４−ｑ３１に位置すると現在考えられている。ＰｌＧＦは、当技術分野で現在公知の全３種のアイソフォーム、および本発明のいずれかの特定の実施形態において使用されるＰｌＧＦ ｓｂｐとそれらが結合するというほどまでには現在十分には特徴づけられていないいずれかの他のものを含む。

「標識」または「検出可能な標識」なる語は、それが結合している分子の直接的または間接的な定量的または相対的な測定を可能にする任意の適切な分子を意味する。本発明の場合に有用な適切な標識には、固体、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光基質、色素、化学発光化合物、発光基質、発色物質、磁性物質、金属粒子、例えば金コロイド、放射性物質などが含まれる。有用な酵素マーカーには、デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、例えばレダクターゼおよびオキシダーゼ；官能基、例えばアミノ、カルボキシル、メチル、アシルおよびリン酸基の転移を触媒するトランスフェラーゼ；エステル、グリコシド、エーテルおよびペプチド結合のような結合を加水分解するヒドロラーゼ；リアーゼ；リガーゼなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。検出のためのコンジュゲート化（共役）形態において、複数の酵素も使用されうる。

有用な固体標識には、マイクロタイタープレート、粒子、微粒子および顕微鏡スライドが含まれるが、これらに限定されるものではない。

検出可能なマーカーが酵素である場合、標識分子の検出は酵素サイクリングによっても促進されうる。例えば、検出可能な標識がアルカリホスファターゼである場合、測定は、ウンベリフェロン誘導体のような適切な基質から生じた蛍光または発光を観察することにより行われうる。有用なウンベリフェロン誘導体には、４−メチル−ウンベリフェリルホスファートが含まれるが、これに限定されるものではない。

他の有用な標識には、リン酸化フェノール誘導体、例えばニトロフェニルホスファート、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体が含まれる。

本発明の場合に有用な好ましい蛍光標識および化学発光標識には、フルオレセインイソチオシアナート；ローダミン誘導体、例えばローダミンＢイソチオシアナートおよびテトラメチルローダミンイソチオシアナート；ダンシルクロリド（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロリド）、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン（４−フェニルスピロ［フラン−２（３Ｈ），１’−（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３，３’−ジオン）；フィコビリンタンパク質、例えばフィコシアニンおよびフィソエリトリン；アクリジニウム塩；ルミノール化合物、例えばルミフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリン；イミダゾール；シュウ酸エステル；ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）およびサマリウム（Ｓｍ）のような希土類元素のキレート化合物；ならびにクマリン誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリンが含まれる。

したがって、本発明の場合に有用な多種多様な検出可能なマーカーが利用可能であると理解されるであろう。検出可能な標識に結合した分子の量を定量するための任意の適切な検出手段（限定的なものではないが例えば、電極の使用、色、光または吸光度の分光光度測定および目視検査）も用いられうると理解されるであろう。

本発明の特定の実施形態
本発明は、生物学的試料中に存在するタンパク質性特異的結合ペアの濃度または量を決定する方法を提供する。該結合ペアは、好ましくは互いに直接結合する２つのタンパク質性部分（すなわち、第１タンパク質性部分および第２タンパク質性部分）を含み、いずれのタンパク質性結合パートナーも抗体（または抗体のフラグメント）ではない。ポリペプチドおよびタンパク質を含む任意の適切なタンパク質性結合パートナーが本発明の方法において使用されうる。抗体および抗体の部分が本発明の方法において使用されうるが、好ましくは、２未満の抗体またはその部分が使用される。

あるいは、２つを超える抗体を使用する場合には、該方法の２つのタンパク質性特異的結合パートナーの１つは、該方法において観察される検出可能なマーカーで標識される。例えば、特定の波長における吸光度を用いる場合には、抗体またはその部分の使用以外の方法で、第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐのいずれかに発色団が連結される。同様に、放射能標識（例えば、^１２５Ｉ）を検出するためにシンチレーションまたはガイガーカウンターを使用する場合には、該ｓｂｐは、間接的に、またはより好ましくは直接的に、第２ ｓｂｐに直接結合される。第１または第２ ｓｂｐを第１もしくは第２抗体または抗体の部分以外の手段で間接的に標識する場合には、直接標識部分は、好ましくは、第１または第２ ｓｂｐに対する生物特異的アフィニティーを有するもの（すなわち、第３ ｓｂｐ）、あるいは第１または第２ ｓｂｐの成分に対するストリンジェントな（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）なアフィニティーを有するものである。ストリンジェントなアフィニティーを有する間接標識系の一例には、ビオチンおよびアビジンが含まれる。この非限定的な例においては、第２ ｓｂｐはビオチンで標識されることが可能であり、アビジン様部分（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、エクストラビジン）は（例えばアクリジニウムエステルまたは他の化学発光アクリジニウム誘導体で）直接的に標識されることが可能である。

本発明の方法の第１の実施形態においては、第１タンパク質性特異的結合パートナーは、検出可能な標識で標識され、したがって、それは標識部分を形成する。該標識部分は生物学的試料との接触に付され、該標識部分と、第２結合パートナーである該生物学的試料の成分との結合の度合が決定される。結合の度合は、第１結合パートナー、または該試料中に存在する第２結合パートナーの濃度または量の指標となる。結合の度合の決定は相対値によるものでありうるが、好ましくは定性的なものである。結合のこの度合は、任意の適切な手段により、例えば、結合ペアを凝集させ、固体支持体に結合させ、または液体媒体中を異なる速度で泳動させることにより、決定されうる。好ましくは、結合の度合は、結合ペアを固体支持体に付着させ、未結合標識部分を結合標識部分から分離し、該標識部分の結合または未結合（または両方の）画分を決定することにより決定される。

本発明において使用される結合ペアは、好ましくは、Ｔ細胞受容体および主要組織適合性複合体、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌならびに抗体およびその標的のような、哺乳動物の免疫系において相互作用するタンパク質のペアではない。

該方法は、場合によっては、カートリッジ、試験細片または一体型パッケージ（半自動または全自動免疫分析装置により使用されるよう適合化されたもの）で行われうる。本発明の場合の自動診断アッセイは、好ましくは、サンプルおよび試薬が系内に挿入されたら、使用者の介入を伴うことなく該サンプルおよび試薬を反応容器に運搬しインキュベーションを行い場合によっては未結合標識部分を結合標識部分から洗浄除去する該系において行われる。そのような系は、場合によっては、該系内に該サンプルおよび試薬を挿入した後には使用者の介入を伴うことなく該系が少なくとも８つのアッセイ、好ましくは少なくとも１６のアッセイ、より好ましくは少なくとも６４のアッセイ、最も好ましくは少なくとも１２８のアッセイを４８時間のうちに行いうることにより、手動または非自動系から区別されうる。該系はまた、好ましくは、自動的に、すなわち、サンプルが系内に装填されたら人による計算または投入の必要性を伴うことなく、結合ペアの標的タンパク質の濃度または量を計算しうる。

該方法はまた、カートリッジ形態または試験細片アッセイで行われうる。そのようなアッセイにおいては、該アッセイ試薬は、好ましくは、使い捨て装置内に装填可能な単位用量として提供され、該単位用量は、該方法を行うためにアッセイすることが必要な全ての試薬を含有する。そのような単位用量装置は、例えば、ナイロン、ニトロセルロースまたは他の適切な材料の使い捨て膜状構造体を含むプラスチックハウジングを含みうる。該サンプルは予備加工され、または直接的に装填領域上に装填されうる。ついで該サンプルは、場合によっては、該膜状構造体を通過して、該膜上に含有される複数の領域を経由して流動しうる。該膜状構造体は、場合によっては更に、界面活性剤または側方流動補助物質を含有し、また、場合によっては、過剰の流体を集め及び／又は該膜を通る側方流動を促進するための吸収剤を含有する。また、本発明の方法は多パック系で行われることが可能であり、この場合、各パックは、２、４、８、１０もしくは１２のアッセイまたは好ましくは１つのアッセイを行うのに十分な試薬を含む。

該方法はまた、マイクロリットル範囲（例えば、５０μＬ未満、好ましくは１２μＬ未満、場合によっては４μＬ未満の流体）のサンプルを分析するよう設計されたマイクロフルイディック（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）装置内で行われうる。そのようなマイクロフルイディック装置は、場合によっては、生物学的流体またはアッセイ試薬またはそれらの両方がマイクロフルイディック装置内で輸送されるのを補助するための流動補助剤、推進装置（限定的なものではないが、膨張性ゲル、ワックスおよび気体が含まれる）、ナノバルビング（ｎａｎｏｖａｌｖｉｎｇ）などを含有しうる。

該方法は、場合によっては、サンドイッチアッセイとして設計されうる。サンドイッチアッセイは、標識部分を、結合ペアのもう一方の特異的結合パートナーおよびもう１つの特異的標識試薬に結合させることを含む。多重サンドイッチアッセイは本発明の範囲内である。限定的なものとしてではなく主として例示および理解の促進のために、第１結合パートナーとしてのＰｌＧＦおよび第２結合パートナーとしてのｓＦｌｔ−１の使用により、以下のサンドイッチアッセイが例示される。しかし、以下の例示におけるＰｌＧＦおよび／またはｓＦｌｔ−１の代わりに、タンパク質性特異的結合パートナーの任意の適切なペアが使用されうる。

本発明の範囲内の第１のサンドイッチアッセイにおいては、ＰｌＧＦ（α−ＰｌＧＦ）に対する抗体はマイクロタイタープレートに結合され、該抗体は、予め又は後に、ＰｌＧＦまたはそのｓＦｌｔ結合性断片に結合される。本発明の場合、ＰｌＧＦはこのように固体基体で標識され、標識部分である。遊離ＰｌＧＦがマイクロタイタープレート上に実質的に存在しないことを保証するために、場合によっては、該マイクロタイタープレートを洗浄することが可能である。ｓＦｌｔ−１を含有することが判明している又はｓＦｌｔ−１を含有する疑いのあるサンプルを該プレートと接触させる。したがって、該アッセイにおいてはＰｌＧＦ：ｓＦｌｔ−１結合が用いられる。洗浄後、該プレートを標識抗体と接触させることにより、該サンプル中のｓＦｌｔ−１の量が検出されうる。該抗体は任意の適切な検出可能な標識で標識されうる。

本発明の範囲内の第２のサンドイッチアッセイにおいては、第１のサンドイッチアッセイのマイクロタイタープレートの代わりに微粒子を使用する。好ましい微粒子には、磁性微粒子、特に０．２から７．０ミクロンの平均サイズの磁性微粒子、ハプテン化微粒子、１つ又は好ましくは少なくとも２つの蛍光色素（特に、フローセル内での個々の単離およびレーザーによる励起の後に同定されうるもの）により含浸された微粒子、フェロ流体（ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）（すなわち、約０．１μｍ未満のサイズの磁性粒子）、および収集により取り出されうる又は濾過により取り出されうる他の微粒子が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の範囲内の第３および第４のサンドイッチアッセイにおいては、ＰｌＧＦを、それぞれ、直接的にマイクロタイタープレートに又は微粒子に結合させる。

第５および第６のサンドイッチアッセイにおいては、ＰｌＧＦをビオチン化し、または適切なハプテン、例えばアダマンチン、フルオレセインイソチオシアナートまたはカルバゾールで標識する。これは、多価抗体または（ストレプト）アビジン含有部分と接触した際の凝集物の形成を可能にし、あるいはマイクロタイタープレート、顕微鏡スライドまたは微粒子のような固体基体へのＰｌＧＦの容易な結合を可能にする。凝集を用いる実施形態においては、凝集物の沈殿もしくは濾過または凝集物の液体クロマトグラフィーのような任意の適切な分離または検出手段が用いられうる。

同様に、本発明の方法は競合阻害アッセイを含む。競合阻害アッセイは、単一の特異的結合パートナーを使用するよう、あるいはまた、サンドイッチアッセイとして設計されうる。有用な競合阻害アッセイには、標識された第２特異的結合パートナー（またはその断片）（「標識第２ ｓｂｐ」）を合成し、またはアッセイすべき生物学的サンプル以外の起源から単離し直接もしくは間接標識で標識する競合阻害アッセイが含まれる。ついで、標識第２ ｓｂｐが第１ ｓｂｐに結合するのが妨げられる度合を測定することにより、被検生物学的サンプル中の第２ ｓｂｐの量を決定する。限定的なものではないが例えば、前記で用いた例示的な取り決めを用いて、ｓＦｌｔ−１またはそのＰｌＧＦ結合性断片を任意の適切な検出可能な標識（限定的なものではないが前記のものが含まれる）で標識することが可能である。固定化ＰｌＧＦを生物学的サンプルと接触させた場合、該生物学的サンプル中のｓＦｌｔ−１はＰｌＧＦへの結合に関して標識ｓＦｌｔ−１と競合することになる。したがって、該固定化ＰｌＧＦに結合する標識の減少は、ｓ−Ｆｌｔ−１を含有することが判明している又はそれを含有する疑いのある生物学的サンプル中のｓＦｌｔ−１の量を示す。

したがって、本発明は、第１ポリペプチドまたはタンパク質と第２ポリペプチドまたはタンパク質との結合相互作用を用いて第２ポリペプチドまたはタンパク質の量または濃度を測定する多数の実施形態を提供する、と当業者は理解するであろう。本発明の実施形態を例示するために前記で用いた特異的結合パートナー、すなわち、ＰｌＧＦおよびｓＦｌｔ−１は、もちろん、本発明で使用するのに適した好ましい特異的結合パートナーに含まれる。追加的な好ましい実施形態は、他の血管新生成長因子およびそれらの受容体、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＰＦなど（これらに限定されるものではない）を含む。同様に、該成長因子の生物学的に重要な変異体、例えばＶＥＧＦ−Ａ_２０６、ＶＥＧＦ−Ａ_１８９、ＶＥＧＦ−Ａ_１６５、ＶＥＧＦ−Ａ_１４５およびＶＥＧＦ−Ａ_１２１（これらに限定されるものではない）は、本発明の好ましい特異的結合パートナーである。同様に、これらの分子の受容体、例えばＫＤＲまたはＦｌｋ−１（ｆｍｓチロシン様キナーゼ１）（ＶＥＧＦＲまたはＶＥＧＦＲ２とも称される）も、本発明の好ましい第１または第２結合パートナーである。

本発明の他の好ましい特異的結合パートナーには、ナトリウム利尿因子、ナトリウム利尿因子受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）またはＩＧＦ様受容体が含まれる。ナトリウム利尿因子の具体例には、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、Ｂ型または脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、およびｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）が含まれる。ＩＧＦ、ＩＧＦＲおよびＩＧＦＢＰファミリーの任意の適切なメンバーが第１特異的結合メンバーまたは第２特異的結合メンバーまたはそれらの両方として使用されうる。

第１特異的結合パートナーまたは第２特異的結合パートナーは、他のポリペプチドからのアミノ酸残基を含むキメラまたは融合体でありうる、と容易に理解されるであろう。同様に、特異的結合パートナーは完全長またはトランケート化体でありうる。該方法は、膜結合型または結合可能な結合パートナーを使用して行うことも可能であるが、本発明の場合に有用な特に好ましいトランケート化として、該タンパク質の可溶性細胞外ドメインから膜貫通領域を切断するトランケート化が挙げられる。特異的結合パートナーが膜結合型である場合、該膜は、場合によっては、合成された又は細胞コンテクストから取り出された細胞構造体の部分（例えば、小胞、リポソームまたはエマルションにおけるもの）でありうる。この細胞外ドメイン自体は「完全長」であるか、またはＮ末端もしくはＣ末端もしくはそれらの両方においてトランケート化されていることが可能であり、外因性ポリペプチドに融合されていることが可能である。

本発明はまた、ｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合した特異的結合パートナーを有さないｓＦｌｔ−１の濃度を決定する方法を提供する。該方法は、ｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合した特異的結合パートナーを有さないｓＦｌｔ−１を含有することが判明している又はそれを含有する疑いのあるサンプルを、ｓｂｐ：ｓｆｌｔ−１複合体を形成しうるｓＦｌｔ−１の第１特異的結合パートナー（ｓｂｐ）と、および検出可能な標識または固体構造体で特異的に標識された第２ ｓｂｐと接触させることを含む。第１または第２ ｓｂｐはＰｌＧＦまたはＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片である。第１ ｓｂｐ、第２ ｓｂｐおよびｓＦｌｔ−１は、それが存在する場合には、三者複合体を形成し、これは該サンプル中のｓＦｌｔ−１の量の指標として検出される。

１つの好ましい実施形態においては、生物学的サンプル中の全ｓＦｌｔ−１はＦｌｔ−１結合性抗体で捕捉され、ＰｌＧＦに結合しない該サンプル中のｓＦｌｔ−１の部分またはｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合する同様の結合パートナーは、上皮成長因子（ＥＧＦ）スーパーファミリーの標識断片で検出される。ＥＧＦスーパーファミリーの適切なメンバーには、ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦの任意の適切な部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに好ましい実施形態においては、そのＥＧＦスーパーファミリーメンバーは、検出可能な産物を産生しうる発光団または酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレセインまたはアクリジニウム（これらに限定されるものではない）で標識される。

もう１つの好ましい実施形態は、ＰｌＧＦを固体表面、例えば微粒子（これに限定されるものではない）上に固定することを含む。この試薬は遊離ｓＦｌｔ−１のみを捕捉する。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、被検生物学的サンプル中のｓＦｌｔ−１は固体結合ＰｌＧＦには結合しないと考えられる。なぜなら、ＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１との間の結合部位には既に非遊離ｓＦｌｔ−１が結合しているからである。ついで該複合体は任意の適切な方法で検出されうる。適切な直接的または間接的検出試薬には、ｓＦｌｔ−１に対する抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーが含まれる。

前記実施形態における試薬はいずれも、先行技術方法により容易にビオチン化されうる。したがって、ＰｌＧＦはビオチン化されることが可能であり、これにより、固相または別の検出可能な分子へのその固定が促進され、該検出試薬は、ビオチンに対する特異的結合パートナーで検出可能となるようビオチン化されうる。本発明におけるビオチンに対する好ましい特異的結合パートナーには、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンに対する抗体およびアプタマーが含まれる。

ｓＦｌｔ−１の構造は当技術分野でよく知られている（Ｗｉｅｓｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，９１，６９５−７０４（１９９７）；Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら，ＥＭＢＯ Ｊ，１５，４９１９−４９２７（１９９６）；Ｂａｒｌｅｏｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２，１０３８２−１０３８８（１９９７）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２３１，５９６−５９９（１９９７）；Ｆｕｈら（Ｗｉｅｓｍａｎｎらにおいて引用されている）を参照されたい）。好ましいｓＦｌｔ−１特異的結合パートナーはＰｌＧＦに対する任意の適切なｓＦｌｔ−１結合断片である。ｓＦｌｔ−１の第２および第３ドメインの少なくとも約９０％を含むポリペプチドの好ましいｓＦｌｔ−１結合断片。ＰｌＧＦのトランケート化ポリペプチド（例えば、ＰｌＧＦの第２１アミノ酸からＰｌＧＦのドメイン３まで）も好ましい。ＰｌＧＦおよびＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片の一方または両方は、本明細書に開示されているとおりに標識されうる。

ＰｌＧＦ捕捉または検出試薬と、被検生物学的サンプル中で遊離状態であったｓＦｌｔ−１との相互作用の検出を促進するために、固体表面または検出可能な試薬への結合により標識された追加的な試薬を加えることが可能である。標識抗体は、好ましい追加的試薬のうちの１つである。

本発明はまた、ｓＦｌｔ−１に結合したＰｌＧＦを有さない、被検生物学的サンプル中のｓＦｌｔ−１（「遊離ｓＦｌｔ−１」）の量による、標識ｓＦｌｔ−１部分の競合阻害に基づくイムノアッセイを提供する。該方法は、遊離ｓＦｌｔ−１を含有するサンプルを、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片を含む第１ ｓｂｐと接触させ、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片に結合しうるｓＦｌｔ−１の断片を含有する第２ ｓｂｐと接触させることを含み、ここで、少なくとも第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐは標識されている。ついで、該サンプルにより引き起こされた第１ ｓｂｐと第２ ｓｂｐとの結合における減少を測定することにより、該サンプル中に存在するｓＦｌｔ−１の濃度を決定する。

本発明はまた、サンプル中の全ｓＦｌｔ−１に対する遊離ｓＦｌｔ−１の比を決定する方法を提供する。該方法は、（ｉ）前記実施形態のいずれかによりｓＦｌｔ−１の量を決定し、（ｉｉ）該サンプル中のｓＦｌｔ−１の全量を決定し、（ｉ）部と（ｉｉ）部との結果を比較することを含む。サンプル中のｓＦｌｔ−１の全量を決定するためには、任意の適切な方法が用いられうる。この工程を行うための適切な方法には、サンドイッチイムノアッセイおよび競合阻害アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。該アッセイにおいて存在する全ｓＦｌｔ−１を測定するためにイムノアッセイにおいて使用する少なくとも１つの抗体は、該生物学的サンプル中に存在する又は恐らく存在するＰｌＧＦまたは別の因子（例えば、第１または第２ ｓｂｐの活性部位に特異的な抗イディオタイプ抗体）の結合部位に結合する。ついで、場合によっては、該生物学的サンプル中の他のタンパク質へのｓＦｌｔ−１の結合を妨げるために、該サンプルの部分を変性させることが可能である。この場合、ｓＦｌｔ−１の活性部位への抗体結合を遮断するタンパク質が遊離されるようｓＦｌｔ−１を変性させるためには、任意の適切な技術が用いられうる。適切な技術には、酸、塩基、塩、洗剤もしくは界面活性剤、有機塩基、または前記のものの組合せが含まれ、これらは当業者の技量の範囲内である。診断試薬として使用する抗体またはもう１つのｓｂｐの結合を促進するためには、サンプル中のｓｂｐへのｓＦｌｔ−１の結合を妨げるために使用する変性剤は、好ましくは、容易に中和され、または該サンプルから除去される。しかし、好ましくは、全ｓＦｌｔ−１を測定するためにイムノアッセイにおいて使用する１以上の抗体はｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合しない。サンプル中の全ｓＦｌｔ−１を測定するための更に他の方法が容易に利用可能であり本発明の範囲内である、と当業者は理解するであろう。したがって、本発明は、（ｉ）遊離ｓＦｌｔ−１、（ｉｉ）結合ｓＦｌｔ−１、および（ｉｉｉ）全ｓＦｌｔ−１のそれぞれの直接的測定および間接的測定の両方を可能にする。場合によっては、これらのｓＦｌｔ−１値のいずれかを、ＶＥＧＦおよび好ましくはＰｌＧＦを含む（これらに限定されるものではない）ＥＧＦスーパーファミリーメンバーの濃度と更に比較することが可能である。

特に好ましい実施形態においては、抗ｓＦｌｔ免疫試薬を磁性微粒子に結合させ、生物学的試料を、該抗ｓｆｌｔ−１結合微粒子と接触させて、サンプル中のｓＦｌｔ−１を該磁性微粒子に結合させる。ついで該複合体を、場合によっては、適切な溶液またはバッファー中で１回以上洗浄して、該アッセイを妨げうる未結合分子を除去することが可能である。ついで標識ＰｌＧＦを微粒子含有複合体と接触させ、未結合標識ＰｌＧＦを該磁性微粒子から除去し、または洗い落とす。ついで、該磁性微粒子に結合した標識ＰｌＧＦの量が該生物学的試料中の遊離ｓＦｌｔ−１の量の指標となる。なぜなら、ｓｂｐ（このｓｂｐはｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合する）に結合したｓＦｌｔ−１は該標識ＰｌＧＦに効率的に結合できないからである。

本発明のもう１つの実施形態においては、ＰｌＧＦに結合した全ｓＦｌｔ−１およびｓＦｌｔ−１の部分を測定する。サンプル中に存在する全およびＰｌＧＦ結合ｓＦｌｔ−１（「結合ｓＦｌｔ−１」）の量を決定するためには、任意の適切な方法が用いられうる。サンプル中の結合ｓＦｌｔ−１の量を決定するための１つの適切な方法は、抗ＰｌＧＦ抗体、結合ｓＦｌｔ−１（これ自体は少なくともｓＦｌｔ−１およびＰｌＧＦを含む）および抗ｓＦｌｔ−１抗体を含む少なくとも３つの成分を有する複合体の形成を検出すること、すなわち、１つの抗体がＰｌＧＦに特異的であり少なくとも１つの抗体がｓＦｌｔ−１に特異的である２抗体サンドイッチアッセイを用いることである。本発明の他の好ましい実施形態においては、該抗体をそれぞれ、好ましくは、検出可能な標識で標識する。この実施形態の、より一層好ましい実施形態においては、１つの抗体を固体基体への結合により標識し、少なくとも１つの抗体を本明細書中に記載の別の標識への結合により標識する。

もう１つの実施形態においては、遊離ｓＦｌｔ−１の検出は、ＰｌＧＦがｓＦｌｔ−１に結合している場合には接近不可能な（すなわち、隠れている）エピトープに結合する抗体を使用して行う。この点においては、本発明のアッセイは、それが遊離ｓＦｌｔ−１のみを測定すること以外は、任意の伝統的なサンドイッチ、競合阻害または他の通常のイムノアッセイ（ｓＦｌｔ−１に関するもの）である。これは、遊離ｓＦｌｔ−１の量を、全ＰｌＧＦの量と、あるいはより好ましくは遊離ＰｌＧＦの量と比較することを可能にする。この実施形態の他の態様においては、本発明の他の実施形態において使用するｓＦｌｔ−１の部分の代わりに、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合部位に対する抗体を使用することが可能である。

ＰｌＧＦおよびｓＦｌｔ−１の測定（限定的なものではないが、結合状態および遊離状態のこれらの分子の測定が含まれる）は任意の適切な目的に用いられうる。例えば、これらのマーカーの測定は、非致死性心筋梗塞のような主要心血管事象の後の抗原の経過を予測するために用いられうる。同様に、これらのマーカーが測定可能であることを利用して、心臓薬の作用様式を、より深く理解することが可能である。さらに、これらのマーカーの正確な測定は再狭窄および新血管形成のメカニズムのより詳細な研究を可能にする。ＰｌＧＦおよびｓＦｌｔ−１の測定は、妊娠女性における子癇前症の、より低いリスクを実証することにおいて、最大の重要性を見出しうるであろう。

子癇前症は全妊娠女性の約５％を冒し、いくつかの民族集団においては全妊娠女性の約１０％をも冒す。子癇前症の影響は重篤となることがあり、時には死亡を含みうる。したがって、子癇前症に関して高いリスクの妊娠から正常妊娠をより良く区別する必要がある。

本発明者らは、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比が、遊離ＰｌＧＦに対する全ｓＦｌｔ−１の比より良好な、子癇前症のリスクの予測因子であることを見出した。遊離ｓＦｌｔ−１の量は全ｓＦｌｔ−１および結合ｓＦｌｔ−１の量に数学的に関連づけられるため、本発明の範囲において、これらの値を遊離ｓＦｌｔ−１の量の代用物として用いることが可能であり、生物学的サンプル中のＰｌＧＦの量と比較することが可能である。

医学的診断のために関心が持たれる多数のタンパク質は、低濃度、例えば１ｐｇ／ｍＬ未満から０．１ｍｇ／ｍＬで存在する。これらのタンパク質のいくつかは、抗体−抗原相互作用で観察されるものに類似したアフィニティーでタンパク質受容体に結合する。酵素活性と同様の方法で、遊離タンパク質の量、またはその天然受容体に結合した量を測定することが可能である。

子癇前症は、現在は高血圧およびタンパク尿の臨床症状に基づいて診断されている妊娠後期の疾患である。最近の文献は、該疾患の誘発事象が、血管新生タンパク質である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）の循環レベルの低下であることを提示している。そして、それにより生じる胎盤内の血管形成の低下が、子癇前症として臨床的に判断される血圧上昇およびタンパク尿を招くと示唆されている。これらの２つのタンパク質の減少は受容体可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）の可溶性形態の濃度の増加によるものであるらしい。本発明は、遊離しているか又はＰｌＧＦに結合しているｓＦｌｔ−１の測定へのアプローチを含み、ＰｌＧＦの遊離形態および結合形態を測定するためのアッセイ成分としてのその使用を含む。子癇前症の検出のための最も適切な情報は、ＰｌＧＦに結合していないｓＦｌｔ−１のレベルに関連しているＰｌＧＦのレベルである。高濃度の遊離ｓＦｌｔ−１は、大過剰の遊離受容体の存在によりＰｌＧＦ濃度が低い可能性があることを示している。

好ましい実施形態においては、すべての循環ｓＦｌｔ−１（ＰｌＧＦに結合しているもの又は結合していないもの）に結合させるために抗体を使用する。したがって、シグナル生成分子およびＰｌＧＦのコンジュゲートが、固相に結合したｓＦｌｔ−１と相互作用するのが可能となる。この例においては、ＰｌＧＦから遊離しているｓＦｌｔ−１のみがコンジュゲート化ＰｌＧＦに結合するであろう。ついで未結合ＰｌＧＦを洗い落とし、ＰｌＧＦ−コンジュゲートの濃度を表示するための必要な工程を行う。

前記の形態は、コンジュゲートとしてＰｌＧＦと同様にしてＶＥＧＦを使用する場合にも構築されうるであろう。さらに、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦのヘテロ二量体を使用することも可能であろう。

該アッセイのもう１つの形態としては、固相に結合したＰｌＧＦを使用し、ついで、ｓＦｌｔ−１に結合するコンジュゲート化抗体で後に検出されうるいずれかの遊離ＰｌＧＦを捕捉することが挙げられるであろう。その同じ形態は固相上のＶＥＧＦを使用することが可能である。

該アッセイのもう１つの形態は、ｓＦｌｔ−１を固相に結合させ次いで可溶性受容体に結合していないいずれかの遊離成長因子を捕捉することにより遊離ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦを測定するものであろう。この場合も、検出は、該成長因子に結合するコンジュゲート化抗体で行われうる。該アッセイのこの形態は該成長因子の生物学的に活性な形態に特異的であろう。この形態においては、分解した成長因子は検出されず、したがって、子癇前症を引き起こす生物学的事象に対する該アッセイの特異性が改善される。

関心のある生物学的問題が、受容体に結合したＰｌＧＦの量である場合には、最初の例と同様にｓＦｌｔ−１を捕捉する固相を使用し、ついでＰｌＧＦまたはＶＥＧＦに対するコンジュゲート化抗体を使用して、結合成長因子の量を測定することも可能である。該アプローチの利用は、測定される種と病態との相関の成否に左右されるであろう。

該アッセイのもう１つの形態は、サンプル中の遊離リガンドが標識リガンドと競合する競合形態で固定化受容体を使用することである。例えば、標識ＰｌＧＦとの競合形態でサンプル中のＰｌＧＦを捕捉するために、固相上のｓＦｌｔ−１が使用されうる。該アッセイのこの形態は、該アッセイにおける抗体の必要性を無くすであろう。

前記の例の逆は、ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦを固定化し、サンプルおよびコンジュゲート化ｓＦｌｔ−１を加えることであろう。この形態においては、遊離ｓＦｌｔ−１が固相上の部位に関して競合するであろう。

該アッセイにおいて使用するタンパク質は患者のサンプルから誘導されうるが、細胞培養または細菌において発現された組換えタンパク質の使用がより実用的なアプローチであろう。

本明細書に記載のアプローチは、受容体または会合リガンドの活性に関してサンプルを試験するために用いられうる。ただし、該リガンドと該受容体との間のアフィニティーは、該アッセイプロトコールのシグナル生成において結合物質が検出できない程度の該結合物質の喪失を伴うことなく洗浄工程の利用を可能にするのに十分な程度に高いものでなければならない。

標的タンパク質の固有の生物学的結合活性に基づくアッセイは、患者の臨床状態を知るための優れた情報をもたらしうる。疾患または医学的状態にタンパク質受容体が関わっている場合には、その生物活性の相対量を測定するアッセイは、該タンパク質の質量のみを知ることに比べて正確な臨床像をもたらすと予想されうる。

前記方法により、本発明はまた、少なくとも１つのｓｂｐが検出可能な様態で標識されている２つのタンパク質性特異的結合パートナーを含むイムノアッセイを提供する。

また、前記に従い、本発明は、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比を決定するための組成物、ならびに（ｉ）全ｓＦｌｔ−１および結合ｓＦｌｔ−１、または（ｉｉ）全ＰｌＧＦおよび結合ＰｌＧＦ、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定するための組成物を提供する。

実施例
本発明は、全ＰｌＧＦ、遊離ＰｌＧＦ、全ｓＦｌｔ−１および遊離ｓＦｌｔ−１に関する種々のイムノアッセイから得たデータにより例示される。選ばれているこれらのデータは本発明の最も例示的なものであるとみなされ、本発明の概念は添付図面に示されており、図面の簡単な説明において簡潔に説明されている。本発明の説明の全体から明らかなとおり、これらの実施例は、特許請求されている本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではない。

他の実施例
以下の追加的な実施例は、本発明の２つの好ましい実施形態に関する更なる詳細を示す。

この実施例は、ｓＦｌｔ−１に対するｓｂｐとしてＰｌＧＦの部分を使用して生物学的サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１を検出するために用いるアッセイにおける本発明の方法例示する。

ｓＦｌｔ−１に対するモノクローナル抗体を、ｐＨ６．０の５０ｍＭ ナトリウムＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）中の１重量％の濃度の微粒子１ｍＬ当たり０．１ｍｇのタンパク質濃度で、磁性カルボキシル−ラテックス微粒子（４．７ミクロン）上にコーティングした。１０分後、ＥＤＡＣ（エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を加え、１時間反応させた後、該粒子をリン酸緩衝食塩水で洗浄した。ついで、該粒子を、自動免疫化学分析装置において使用するために、バッファー中で０．１％に希釈した。

ＰｌＧＦをリン酸緩衝食塩水に溶解し、アクリジニウムに対するＰｌＧＦの質量比１５０，００／１でアクリジニウム−エステルと共にインキュベートすることにより、アクリジニル化ＰｌＧＦを調製した。ついで該コンジュゲートをＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、約７５ｎｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。

ついで以下の一連の工程を行う。サンプルの０．０５ｍＬアリコートを反応容器に加え、それに０．０５ｍＬの該０．１％ 標識微粒子を加える。該反応混合物を３７℃で１８分間インキュベートする。磁石で該微粒子を保持しながら、該反応溶液を除去する。該粒子を洗浄した後、コンジュゲート溶液の０．０５ｍＬアリコートを加える。４分間のインキュベーションの後、もう一度、該粒子を磁石および微粒子のペレットで保持し、該コンジュゲート溶液を除去し、ついで、もう一度、該粒子を洗浄する。水酸化ナトリウムおよび過酸化水素の添加の後、残ったアクリジニウム標識に発光させる。放出された光子を測定し、同じ方法で得られた基準体に線形的に関連づける。

試験サンプルに関するデータを集め、通常のイムノアッセイで得られた結果と比較した。該データは、遊離ＰｌＧＦ濃度に対する遊離ｓＦｌｔ−１濃度の比を観察した場合に特に、本発明の方法が、非子癇前症サンプルを子癇前症サンプルから、より良好に識別することを示唆した。

この実施例は、ＰｌＧＦに対するｓｂｐとしてｓＦｌｔ−１の部分を使用して生物学的サンプル中の遊離ＰｌＧＦを検出するために用いるアッセイにおける本発明の方法を例示する。

５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中の、微粒子の表面に吸収されるタンパク質の量を最大にするのに十分であることが示されたタンパク質濃度（２重量％の固体）にて、カルボキシル官能基で誘導体化された常磁性ラテックス微粒子（４．７ミクロン）を抗ｓＦｌｔ−１抗体（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１のドメイン１から３を含有する）でコーティングした。もう１つの実施形態においては、ｓＦｌｔ−１は固体基体に直接結合されうるであろう。１０分後、該粒子をＭＥＳバッファーで複数回洗浄することにより、未吸収ｓＦｌｔ−１を除去した。該粒子の洗浄後、ＥＤＡＣを加え、反応させて、該粒子へのｓＦｌｔ−１分子の共有結合を形成させた。ついで該粒子をリン酸緩衝食塩水で洗浄して反応を停止させ、未反応のＥＤＡＣを除去した。ついで該粒子を、自動免疫化学分析装置において使用するために、バッファー中で０．１％まで希釈した。

ポリクローナル抗体（あるいはモノクローナル抗体が使用可能であろう）をアクリジニウム−エステルと共に、抗体に対するアクリジニウムの１から１００の範囲のモル比でインキュベートすることにより、アクリジニウム標識抗ＰｌＧＦ抗体を調製した。ついで未コンジュゲート化アクリジニウムをサイズクロマトグラフィーによりアクリジニウム標識抗体コンジュゲートから分離した。ついで、該アッセイにおける最大のシグナル対ノイズ比を与える濃度にまで、該精製コンジュゲートをバッファー中で希釈した。

ついで以下の一連の工程を行った。サンプルの０．１ｍＬアリコートを反応容器に加え、それに０．０５ｍＬの該０．１％ 標識微粒子を加えた。該反応混合物を３７℃で１８分間インキュベートした。該粒子の常磁性特性を利用して、該反応容器の側面に対して該粒子を磁石で引き付け保持しながら、該反応溶液を除去した。該粒子を洗浄した後、バッファーを分注する。コンジュゲート溶液の０．０５ｍＬアリコートを加え、該磁石を取り除き、該混合物をボルテックスする。４分間のインキュベーションの後、磁石で粒子を引き付け、洗浄し、再懸濁させることにより、過剰のコンジュゲートを除去した。ついで、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ／抗ＰｌＧＦ抗体（アクリジニウム標識）サンドイッチを今や含有する該粒子を反応物にさらして、アクリジニウムに発光させる。該装置により測定される化学発光は該サンプル中のＰｌＧＦ（遊離）の量に正比例する。

試験サンプルに関するデータを集め、通常のイムノアッセイで得られた結果と比較した。該データは、本発明の方法が、予防または原因生物因子に対する抗体（これは該タンパク質の活性形態と不活性形態とを必ずしも識別しない）を使用する代わりに該予防または原因生物因子の生物活性を測定することにより、子癇前症状態を非子癇前症状態から、より良好に識別することを示唆した。

本明細書に記載されている全ての特許、特許出願および刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。

本発明は多数の変更に適合し、当業者により本明細書中の記載から誘導されうる修飾を包含する。すべてのそのような変更および修飾は、特許請求の範囲により定められる本発明の範囲および精神の範囲内であるとみなされる。

図１は、ｓＦｌｔ−１がＰｌＧＦと相互作用しうることを示す。ｓＦｌｔ−１の２つの分子とＰｌＧＦのホモ二量体との結合が実験系の観察により示唆されているが、本発明者らは、この状態は、インビボでは存在し得ないか又は微々たるレベルでしか存在し得ないと認識している。しかし、本発明方法は、そのような複合体が存在する場合の該複合体の検出に有用であるため、それを図１に示す。 図２は、倫理的に適切な条件下で集められ調べられた少数のヒトサンプルにおける、遊離ＰｌＧＦを捕捉するために使用されるモノクローナル抗体およびＰｌＧＦを検出するために使用されるポリクローナル抗体を使用するイムノアッセイにより観察されたＰｌＧＦレベルのヒストグラムを示す。図２は、低レベルのＰｌＧＦが子癇前症妊娠（ＰＥ）に関連していること、およびまた、ＰＬＧＦに対する２つの抗体を使用する子癇前症妊娠からの非子癇前症（正常）妊娠の識別のための能力が改善される必要があることを示している。 図３は、ｓＦｌｔ−１に対する第１ ｓｂｐとしてのモノクローナル抗体およびｓＦｌｔ−１に対する第２ ｓｂｐとしてのポリクローナル抗体を使用して集めたデータをヒストグラムを示す。これらのデータは、非子癇前症女性（正常）に関する全ｓＦｌｔ−１値の範囲と子癇前症女性（ＰＥ）に関する全ｓＦｌｔ−１値の範囲とにおける有意な重複が存在することを示している。該データによれば、妊娠女性から得られた診断サンプルにおけるｓＦｌｔ−１に対する２つの抗体を使用するイムノアッセイにより観察されるｓＦｌｔ−１レベルの精査に基づいて、正常妊娠と子癇前症妊娠とを識別する能力を改善する必要があるであろう。 図４は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との組合せの代わりにｓＦｌｔ−１に対する２つのモノクローナル抗体を使用する以外は図３に示したデータの場合に類似した方法で得られたデータを示す。図３および４に示すデータは、ｓＦｌｔ−１に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むｓＦｌｔ−１に関するイムノアッセイが、２つのモノクローナル抗体を含む同様のイムノアッセイを凌ぐことを示している。一般原理に基づけば、このアッセイは、図３のアッセイより良好な定量をもたらすと予想されるであろうが、それは、驚くべきことに、非子癇前症試料を子癇前症試料から識別する、より低い能力しかもたらさない。 図５は、本発明の１つの好ましい実施形態を用いて集めたデータのヒストグラムを示す。これらのデータは、ｓＦｌｔ−１に対する微粒子標識モノクローナル抗体を含むイムノアッセイを用いて集めたものであり、この場合、サンプル中の全ｓＦｌｔ−１は該微粒子に結合するようにされている。結合したｓＦｌｔ−１は、アクリジニウムで標識されたＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性部分により検出された。このアッセイは試料中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を決定する。これらのデータは、非子癇前症妊娠女性（正常）に関する遊離ｓＦｌｔ−１値と子癇前症妊娠女性（ＰＥ）に関する遊離ｓＦｌｔ−１の値の範囲との重複における有意な減少が認められることを示している。これらのデータによれば、遊離ｓＦｌｔ−１に対するｓｂｐとしてのＰｌＧＦの部分の使用は、妊娠女性から得た診断サンプルにおけるｓＦｌｔ−１レベルの精査に基づいて正常妊娠と子癇前症妊娠とを識別する能力を改善する。 図６は、前記のデータをまとめたものであり、それを１つのグラフ表示で示している。 図７は、単一の非子癇前症サンプルに対して、図６に示すデータを正規化したものである。 図８は、該研究における「最も正常」な子癇前症女性（「ｍＰ−２０」）から集めたデータを、非子癇前症女性のサンプルから集めたデータと比較している。ｓＦｌｔ−１の測定値は、このアッセイのモノクローナル＋ポリクローナル抗体方式に関する、およびこのアッセイのモノクローナル＋モノクローナル方式に関する全ｓＦｌｔ−１の測定値であり、一方、「遊離受容体」に関しては、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性部分がサンドイッチイムノアッセイにおける１つのｓｂｐとして使用され、したがって、遊離ｓＦｌｔ−１のみに結合した。これらのデータは、本発明の態様に合致して、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比（約０から約１．０の範囲）が、該サンプルにおける全ｓＦｌｔ−１に対するＰｌＧＦの比より良好な、より低いリスク（すなわち、正常妊娠）の予測因子であることを示している。 図９は、非子癇前症サンプルを子癇前症サンプルから識別する本発明の能力の向上を表形態で示す。これらのデータは、２つの抗体に基づくイムノアッセイで測定した非子癇前症試料に関しては、遊離ＰｌＧＦに対する遊離ｓＦｌｔ−１の比が、本発明の実施形態を用いた場合より高いと認められることを示している。したがって、これらのデータは、本発明が、子癇前症サンプルからの非子癇前症試料の優れた識別をもたらすことを示している。

Claims (39)

1. 生物学的試料中に存在する結合ペアのタンパク質の濃度または量を決定する方法であって、
   該結合ペアが、第１タンパク質性結合パートナーおよび第２タンパク質性結合パートナーを有し、
   第１タンパク質性結合パートナーも第２タンパク質性結合パートナーも抗体またはそのフラグメントではなく、
   該方法が、
   （ａ）第１結合パートナーを、検出可能な標識で標識して、標識部分を形成させ、
   （ｂ）該標識部分を該生物学的試料と接触させ、
   （ｃ）該試料中に存在する第１結合パートナーまたは第２結合パートナーの濃度または量の指標として、該標識部分と該生物学的試料の成分との結合の度合を決定することを含み、
   該方法が２未満の抗体または抗体の部分を使用する、方法。
2. 該方法が、カートリッジ形態で、または試験細片として行われ、または
   該アッセイ試薬が、単位用量の使い捨て装置として提供され、および
   該単位用量が、該方法を行うのに必要な全ての試薬を含有する、請求項１記載の方法。
3. 該方法が自動診断アッセイであり、該アッセイが、サンプルおよび試薬を反応容器へ運搬しインキュベーション（および場合によっては洗浄）を行う系において、該サンプルおよび試薬が該系内に挿入されたら使用者の介入を伴うことなく行われる、請求項１または２記載の方法。
4. 該サンプルおよび該試薬を該系内に挿入した後は使用者の介入を伴うことなく、該系が少なくとも８つのアッセイを４８時間のうちに行いうる、請求項３記載の方法。
5. 該系が該結合ペアのタンパク質の濃度または量を計算する、請求項３または４記載の方法。
6. 該方法がサンドイッチアッセイである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 該方法が競合阻害アッセイである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
8. 第１結合パートナーが血管新生成長因子である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 第１結合パートナーがナトリウム利尿因子、ナトリウム利尿因子受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）またはＩＧＦ様受容体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
10. 第１結合パートナーがＰｌＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーである、請求項８に記載の方法。
11. 第１結合パートナーがＰｌＧＦである、請求項１０に記載の方法。
12. 第１結合パートナーが膜結合ｆｌｔ−１である、請求項１０に記載の方法。
13. 第１結合パートナーがＫＤＲまたはＦｌｋ−１（ｆｍｓチロシン様キナーゼ１）である、請求項１０に記載の方法。
14. 第１結合パートナーがＶＥＧＦである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
15. 第１結合パートナーがｓＦｌｔ−１である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
16. 第１結合パートナーまたは第２結合パートナーが細胞結合型である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 生物学的サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を決定する方法であって、ここで、遊離ｓＦｌｔ−１が、ｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合した特異的結合パートナーを有さないｓＦｌｔ−１であり、該方法が、
    （ａ）遊離ｓＦｌｔ−１を含有する又はそれを含有する疑いのあるサンプルを準備し、
    （ｂ）該サンプルを、特異的結合パートナー（ｓｂｐ）：ｓＦｌｔ−１複合体を形成しうるｓＦｌｔ−１の第１特異的結合パートナーと接触させ、
    （ｃ）該サンプルを第２ ｓｂｐと接触させ（ここで、
    第２ ｓｂｐは、検出可能な様態で標識されており、
    第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐのいずれかは、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ、またはＰｌＧＦもしくはＶＥＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片であり、
    第１ ｓｂｐ、第２ ｓｂｐおよび該ｓＦｌｔ−１は三者複合体を形成しうる）、
    （ｄ）該サンプル中のｓＦｌｔ−１の量の尺度として、形成された三者複合体の量を決定することを含み、
    ２未満の抗体または抗体の部分が該方法において使用される、方法。
18. 該生物学的サンプル中のｓＦｌｔ−１の全てを、ｓＦｌｔ−１に特異的に結合する抗体で固体に捕捉し、ＰｌＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーの、検出可能な様態で標識された部分で、該サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を検出する、請求項１７に記載の方法。
19. ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦの部分を固体表面上に固定化し、捕捉された遊離ｓＦｌｔ−１を標識ｓｂｐで検出する、請求項１７または１８に記載の方法。
20. ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦの部分がＰｌＧＦの部分であり、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性部分がＰｌＧＦの最初の２１アミノ酸を欠く、請求項１９に記載の方法。
21. ＰｌＧＦの部分がドメイン１の最初の約２０アミノ酸残基以外のドメイン１の全てを更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. ＰｌＧＦまたはＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片が、固体表面以外の標識により、検出可能な様態で標識されている、請求項１７に記載の方法。
23. 該標識がアクリジニウム誘導体である、請求項２２に記載の方法。
24. 第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐのいずれかがｓＦｌｔ−１に対する抗体である、請求項１７に記載の方法。
25. 生物学的サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を決定する方法であって、ここで、遊離ｓＦｌｔ−１が、ｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合部位に結合した特異的結合パートナーを有さないｓＦｌｔ−１であり、該方法が、
    （ａ）ｓＦｌｔ−１に結合したＰｌＧＦを有さない遊離ｓＦｌｔ−１を含有する又はそれを含有する疑いのあるサンプルを準備し、
    （ｂ）該サンプルを、
    ｓＦｌｔ−１結合性部分を含む第１ ｓｂｐおよび
    ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合性断片に結合しうるｓＦｌｔ−１の部分を含む第２ ｓｂｐと接触させ（ここで、少なくとも第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐは標識されている）、
    （ｃ）遊離ｓＦｌｔ−１を欠くサンプルと接触させた場合の第１ ｓｂｐと第２ ｓｂｐとの結合のレベルと対比させて、
    該サンプルにより引き起こされた、第１ ｓｂｐと第２ ｓｂｐとの結合における減少または結合の阻害を決定することにより、該サンプル中に存在するｓＦｌｔ−１の濃度を決定することを含む、方法。
26. （ａ）請求項１７記載の方法または請求項２５記載の方法によりサンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を決定し、
    （ｂ）該サンプル中のｓＦｌｔ−１の全量を決定し、
    （ｃ）（ｉｉ）該サンプル中のｓＦｌｔ−１の全量に対する
    （ｉ）該サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量
    の比を計算することを含む方法。
27. 抗ｓＦｌｔ−１を磁性微粒子に結合させ、
    該生物学的試料を該ｓＦｌｔ−１結合微粒子と接触させ、
    場合によっては、該磁性微粒子を洗浄して、該生物学的サンプルの未結合部分を該微粒子から分離し、
    検出可能な様態で標識されたＰｌＧＦを該混合物に加え、
    未結合標識ＰｌＧＦを該磁性微粒子から洗い落とし、
    該磁性微粒子に結合した標識ＰｌＧＦの量を、該生物学的試料中の遊離ｓＦｌｔ−１の量の指標として検出することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
28. 妊娠女性から得た生物学的サンプル中の遊離ｓＦｌｔ−１の量を測定し、該生物学的サンプル中の遊離ＰｌＧＦの量を測定し、観察された比を、予め決められた値または値の範囲と比較することを含む、子癇前症の、より低いリスクを予測する方法。
29. 妊娠女性から得た生物学的サンプル中の全ｓＦｌｔ−１および結合ｓＦｌｔ−１の量を測定し、該生物学的サンプル中の遊離ＰｌＧＦの量を測定し、観察された比を、予め決められた値または値の範囲と比較することを含む、子癇前症の、より低いリスクを予測する方法。
30. （ａ）サンプル中の遊離Ｆｌｔ−１の量を決定し、
    （ｂ）サンプル中の遊離ＰｌＧＦの量を決定し、
    （ｃ）工程（ａ）の結果を工程（ｂ）の結果と比較することを含む方法。
31. 工程（ａ）の値を工程（ｂ）の値で割り算することにより工程（ａ）と工程（ｂ）との比較を行う、請求項３０に記載の方法。
32. 工程（ｃ）の結果が、予め決められた値を超える場合、それが子癇前症の診断となる、請求項３１に記載の方法。
33. 生物学的試料中に存在するＰｌＧＦの濃度または量を決定する方法であって、
    （ａ）ＰｌＧＦの部分を準備し、
    （ｂ）ｓＦｌｔ−１の部分を準備し、
    （ｃ）少なくともＰｌＧＦの断片またはｓＦｌｔ−１の断片を、検出可能な標識で標識して、標識部分を形成させ、
    （ｄ）該標識部分を該生物学的試料と接触させ、
    （ｅ）該標識部分がＰｌＧＦを含む場合には、該標識部分とｓＦｌｔ−１との結合の度合を決定し、または
    （ｅ’）該標識部分がｓＦｌｔ−１を含む場合には、該標識部分とＰｌＧＦとの結合の度合を決定し、
    （ｆ）該サンプル中に存在するＰｌＧＦの濃度または量を決定することを含む方法。
34. 該方法が自動診断アッセイであり、該自動アッセイが、サンプルおよび試薬を反応容器へ運搬しインキュベーション（および場合によっては洗浄）を行う系において、該サンプルおよび試薬が該系内に挿入されたら使用者の介入を伴うことなく行われる、請求項３３に記載の方法。
35. 該サンプルおよび該試薬を該系内に挿入した後は使用者の介入を伴うことなく、該系が少なくとも８つのアッセイを４８時間のうちに行いうる、請求項３４に記載の方法。
36. 該系が該結合ペアのタンパク質の濃度または量を計算し、使用者は該系の部分とはみなされない、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 該方法がサンドイッチアッセイである、請求項３０に記載の方法。
38. 該方法が競合阻害アッセイである、請求項３０に記載の方法。
39. 生物学的サンプル中の遊離ＰｌＧＦの量を決定する方法であって、ここで、遊離ＰｌＧＦが、ＰｌＧＦのＦｌｔ−１結合部位に結合した特異的結合パートナーを有さず、該方法が、
    （ａ）遊離ＰｌＧＦを含有する又はそれを含有する疑いのあるサンプルを準備し、
    （ｂ）該サンプルを、特異的結合パートナー（ｓｂｐ）：ＰｌＧＦ複合体を形成しうるＰｌＧＦの第１特異的結合パートナーと接触させ、
    （ｃ）該サンプルを第２ ｓｂｐと接触させ（ここで、
    第２ ｓｂｐは特異的に標識されており、
    第１ ｓｂｐまたは第２ ｓｂｐのいずれかは、Ｆｌｔ−１もしくはｓＦｌｔ−１またはｓＦｌｔ−１のＰｌＧＦ結合性断片であり、
    第１ ｓｂｐ、第２ ｓｂｐおよび該遊離ＰｌＧＦは三者複合体を形成しうる）、
    （ｄ）該サンプル中の遊離ＰｌＧＦの量の尺度として、形成された三者複合体の量を決定することを含む方法。

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