JP2000512491A

JP2000512491A - 細胞の腫瘍抑制因子の状態を決定するための方法および構成物

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Publication number: JP2000512491A
Application number: JP09542366A
Authority: JP
Inventors: ファタエイ，アリ
Original assignee: オニックスファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 2000-09-26
Also published as: AU2462797A; EP0910663A1; US5876711A; AU712816B2; CA2247995A1; US6391630B1; WO1997045556A1

Abstract

(57)【要約】細胞の腫瘍抑制因子の状態を決定するための方法および構成物を記載する。好ましくは、腫瘍細胞のp53の状態を決定することに関係する。好ましくは、リポーター分子をコードしている１番目のポリヌクレオチド配列、およびその１番目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された２番目のp53結合性ポリヌクレオチド配列から成る組換え構成体をインビボで用いて、p53が２番目のポリヌクレオチド配列に結合することによって、検出または定量可能なリポーター分子が発現誘導される様にする。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の腫瘍抑制因子の状態を決定するための方法および構成物発明の分野本発明は、癌、特に癌細胞の腫瘍抑制因子の状態を前提にして腫瘍を診断し、治療することに関する。本発明は、癌の診断および治療のために有意に用いられるだろう。発明の背景種々の癌は、少なくとも部分的にはプロトオンコジーンというある正常遺伝子の変異によって誘引されることが、ここ最近知られている。プロトオンコジーンは、正常な細胞増殖を制御することに関係しており、現在その制御が分子レベルで解明され始めている。変異したプロトオンコジーン、すなわちオンコジーンという癌原因遺伝子は、正常な細胞増殖を破壊して、もし癌が発見されず治療が間に合わなかった場合、最終的には個体の死をもたらす。正常細胞または癌細胞の増殖において、各々プロトオンコジーンまたはオンコジーンは、正常細胞または癌細胞の増殖を制御する、または制御しようとする増殖制御タンパク質と平衡を取っている。この様なタンパク質は、腫瘍抑制因子タンパク質と呼ばれている。この様なタンパク質がいくつか知られている。いくつかのヒト癌においては、p53という腫瘍抑制因子タンパク質をコードしている遺伝子に突然変異が頻繁に発生している。そしてp53の不活性化が、ある種の癌の発生および進行の原因であると考えられている(Nigro et al.,1989,Nat ure342,705-708)。この例には、ヒト結腸癌(Barker et al.,1989,Science 244,2 17-221)、ヒト肺癌(Takahashi et al.,1989,Science 246,491-494;Iggo et al.,1990,Lancet 335,675-679)、慢性骨髄性白血病(Kelman et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.US A 86,6738-6787)および骨肉腫(Madusda et al.,1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7716-7719)がある。p53を発現している腫瘍細胞は、ほとんどまたは全くp53 を発現していない腫瘍細胞に比べると、放射線治療に対して感受性が高い。よって腫瘍におけるp53の状態の情報は、内科医にとって、最適な治療法を選択する場合に、実際上有意に助けとなる。腫瘍発生におけるp53の役割を支持する強い実験的証拠があるにもかかわらず、現在、哺乳類細胞において野生型または変異型p53の存在を決定するために用いる方法は、少しあるだけである。広く用いられているひとつの方法は、時間がかかるが、p53遺伝子のDNA配列を決定することである。この方法の限界は、p53 の正常なDNA配列が存在することが、必ずしも正確に、測定した細胞に機能的なp 53タンパク質が存在することを意味しないことである。なぜなら、p53タンパク質が、内在する細胞性またはウイルス性タンパク質に結合することによって、p5 3の機能が抑制されることがあるからである(Momand,J.et al.1992,Cell 69,1237 -1245;Oliner,J.D.et al.1992,Nature358,80-83)。さらにこの方法は、実行の費用が高く、そして時間がかかる。野生型または変異型p53の存在を決定するための別の方法は、この２つの型のp 53を区別する抗体を用いることである。しかし、この方法にもいくつかの制限がある。１番目には、p53タンパク質に発生する突然変異の多くは、点突然変異であり、これらの全ての変異を限られた数の抗体を用いて区別することはできない。２番目には、p53は、ヒト癌において最も普通に変異が起きるタンパク質として同定されているので、異なる全ての変異型p53を検出するために必要な抗体の数は、非常に多くなるだろう。すなわちこの方法は、実際的ではなく費用が高い。３番目には、前記のDNA配列決定による方法と同様に、その特性から、p53抗体は細胞ライセートに用いられる。これを生細胞に用いることはできない。細胞内のp53を決定する他の方法は、次の特許出願に示されている。EPA 51865 0（発明者Vogelstein,B.et al）には、p53が結合する特異的DNA配列を用いて、細胞抽出液内のp53を検出する方法が記載されている。 WO 94/l1533には、GADD45という遺伝子がコードするmRNAまたはタンパク質を測定することによって、細胞内の機能的なp53の存在を決定することが記載されている。GADD45とは、増殖停止およびDNA損傷誘発性遺伝子(growth-arrest and DNA-damage inducible gene)の頭文字を取ったものである。現在用いられている全てのp53の測定方法は、完了するのに数日を要すること、そしてインビボで行うことができないこと、に注意することは重要である。すなわち、これらの方法を、外科的な生検および腫瘍細胞の溶解なしに実行することはできない。腫瘍抑制因子タンパク質が細胞増殖を制御する働きをしているという研究の重要性、そしてこの欠失が悪性の表現型を確立することに関係していることを示す研究が考慮されて、腫瘍抑制因子を欠失している癌細胞にこれを戻す方法が開発された。最も研究されている方法は、ウイルスベクターを用いて、癌細胞に適当な腫瘍抑制因子遺伝子を分配することに集中している。おそらく、最も研究されているベクターは、アデノウイルスのものである。部分的にはこの研究から、アデノウイルスの遺伝的特性、およびこのウイルスの組換え体を作成する方法に関してかなり多くの情報が集まっている。例えば、Horwitz,M.S.,Adenovirus and their Replication,In:Fi eld,B.N.and Knipe,D.M.eds.,Fundamental Virology,2nd ed.New York,N.Y.,Rav en Press.Ltd.771-813(1991);Jolly,D.,Cancer Gene Therapy,vol.l,51-64(1994 )を参照すること。 Mittal et al.,Virus Research,vol.28,67-90(1993)には、アデノウイルスタイプ５−ルシフェラーゼ組換え体が示されている。これは、アデノウイルス５のゲノムの初期領域３内に、サルウイルス40(simian virus 40,SV40)の制御配列が連結されたホタルのルシフェラーゼ遺伝子を挿入したものである。 Quantin et al.,Proc.Natk.Acad.Sci.USA 89,2581-2584(1992)には、筋特異的制御配列の制御下にリポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを含んでいるアデノウイルスの組換え体が開示されている。この組換え体は、筋管においてインビボで、βガラクトシダーゼの発現を指令する。 Akrigg,A.,et al.,PCT/GB92/01195には、標的の真核細胞においてトランス作用性の遺伝子機能を検出する際に用いる、アデノウイルスの組換え体が開示されている。前記の通り、最近、腫瘍抑制因子タンパク質p53が、放射線またはある種の化学療法剤によって誘導される腫瘍細胞死すなわちアポトーシスの原因として、中心的な役割を果たしていることが示唆されている。Low et al.,Cell 74,957-967 (1993)を参照すること。従って、現在使われている測定法の限界を有さないp53 の測定法が望まれている。特に、腫瘍細胞のp53の状態をインビボで診断する方法、または腫瘍生検試料においてp53をより迅速に測定する方法があれば、内科医にとって、患者の腫瘍を除去するために最も効果的な方法を選択する場合、大いに助けになるであろう。発明の要約本発明の第１の目的は、患者の腫瘍細胞において腫瘍抑制因子タンパク質の状態を、迅速に、好ましくはインビボで決定する方法を記載することである。この方法は、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞と接触させ、腫瘍細胞に取り込ませることを含んでいる。１番目のポリヌクレオチド配列は、リポーター分子をコードしており、腫瘍抑制因子と結合する配列である２番目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。腫瘍抑制因子の結合は、リポーター遺伝子の発現を誘導し、それが検出または定量される。本発明の２番目の目的は、患者の腫瘍細胞において腫瘍抑制因子タンパク質p5 3の状態をインビボで決定する方法を記載することである。この方法は、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞と接触させ、腫瘍細胞に取り込ませることを含んでいる。１番目のポリヌクレオチド配列は、リポーター分子をコードしており、p53と結合する２番目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。p53が２番目のポリヌクレオチド配列に結合することによって、リポーター遺伝子の発現が誘導され、それが検出または定量される。本発明の３番目の目的は、複製能を欠失したビリオンを用いて、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞と接触させる、上記の最初の段落に記載した方法を記載することである。本発明の４番目の目的は、患者の腫瘍において腫瘍抑制因子タンパク質、好ましくは腫瘍抑制因子p53の状態を決定する、上記の２番目の段落に記載した方法において使用する構成物で、複製能を欠失したアデノウイルスを含んでいる構成物を記載することである。本発明の５番目の目的は、脂質複合体を用いて、ポリヌクレオチド配列を脂質内に封入するか、または脂質に結合させるか、好ましくはリポソーム内に封入することによって１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞と接触させる、上記の最初の段落に記載した方法において用いる構成物を記載することである。本発明の６番目の目的は、他の診断方法、例えば磁気共鳴画像診断、組織学、および癌専門医が通常用いる既存の他の方法と併用して、患者の腫瘍の腫瘍抑制因子の状態、好ましくは腫瘍抑制因子p53の状態を決定するための方法および構成物を記載することである。本発明の７番目の目的は、患者の腫瘍の腫瘍抑制因子の状態、好ましくは頭部および頚部腫瘍の腫瘍抑制因子p53の状態を決定するための方法および構成物で、上記の段落で示した１番目のヌクレオチド配列が、リポーター遺伝子としてグリーン蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein,GFP)をコードする、方法および構成物を記載することである。本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の開示を十分に考慮することで明白になると思われる。図の簡単な説明図１は、ベクターpGFP-1を示す。このベクターには、グリーン蛍光タンパク質をコードする配列の上流に、マルチクローニングサイト(multiple cloning site ，MCS)があり、下流に、哺乳類細胞において効率的にポリアデニル化してGFPの発現を促進するSV40のポリアデニル化（Poly A）シグナルがある。図２は、ベクターpGFP-1のマルチクローニングサイトの制限部位を示す。図３は、ベクターp53-GFP1-TATAを示す。このベクターは、pGFP1-TATAベクターに、前記のp53結合性DNA配列を挿入して得られる。この配列のコンカテマー（鎖状態）は、p53依存的なGFP発現を促進する。図４は、ベクターpΔE1sp1AまたはpΔE1sp1Bを示す。図５は、ベクターp53-GFPΔE1を示す。本発明の詳細な記載ここに記載した参考、例えば科学文献、および特許または特許出願を、引用によって本明細書に完全に組み込む。定義特に定義していない場合、ここで用いた全ての技術用語および科学用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を持つ。一般に、ここで用いた命名法および以下で用いる実験手法は、当業界に周知であり、普通に使われるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、並びに微生物培養および形質転換（エレクトロポレーション、リポフェクションなど）においては、標準の技法が使われる。一般に、酵素反応および精製過程は取扱説明書に従って行われる。ここでは一般に、技法および手法は、当業界の従来法および種々の一般参考書に従って行われる（一般的にSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Man ual,2nd.ed.1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor,N .Y．を参照する。これを引用により本明細書に組み込む）。ここで用いた命名法、並びに、以下に記した分析化学、有機合成化学および薬学的処方における実験手法は、当業界に周知であり、普通に使われるものである。化学合成、化学分析、薬剤処方および薬剤分配、並びに患者の治療においては標準の方法が使われる。本発明の選択した特定の具体例を表す化学式において、アミノ末端基およびカルボキシ末端基は、あまり明示されないが、他に明示していない場合は、生理学的なpH値において呈する形であるとする。よって、具体例または一般化学式のどちらにおいても、必ずしも明示されないが、生理学的なpH値においては、Ｎ末端はＨ₂ ⁺およびＣ末端はＯ^-である。ここで用いたポリペプチド表記において、標準で従来の通りに、分子の左端はアミノ末端で、右端はカルボキシ末端である。本発明の化合物には、もちろんまた、非生理学的pH値において形成される、この塩基添加塩および酸添加塩が含まれる。ここに記載したアミノ酸残基は、好ましくはL-異性体である。通常の20個のアミノ酸の立体異性体(例えばD-アミノ酸)、天然にないアミノ酸、例えばα，α分配(distributed )アミノ酸、Ｎアルキルアミノ酸、乳酸、および他の一般的でないアミノ酸もまた、そのポリペプチドが所望の機能特性を保持する限り、本発明のポリペプチドの成分として適するだろう。ペプチドを明示する場合、ポリペプチドの標準命名法(J.Biol.Chem.243,3552-59,1969;and 37CFR,sec1,822(b)(2)参照）に従って、各コード残基を通常のアミノ酸名に応じて適切に３文字命名法で表す。ここに記載した用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはそのどちらかのタイプのヌクレオチド修飾体のいずれかで、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチド多量体を意味する。この用語は、DN Aの一本鎖および二本鎖を含んで意味する。ここに記載した用語「オリゴヌクレオチド」には、天然のオリゴヌクレオチド連結によって互いに連結された天然のヌクレオチド、および非天然のオリゴヌクレオチド連結によって互いに連結された修飾ヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、長さが200塩基以下のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが10から60塩基であり、そして最も好ましくは長さが12 ，13，14，15，16，17，18，19，または20から40塩基である。オリゴヌクレオチドは、普通一本鎖であり、例えばプローブに使われる。しかし、オリゴヌクレオチドは、二本鎖でもよく、例えば遺伝子変異の作成に使われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドのどちらでもよい。ここに記載した用語「天然のヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。ここに記載した用語「修飾ヌクレオチド」には、糖の基を修飾または置換したヌクレオチド、およびその類似体が含まれる。ここに記載した用語「オリゴヌクレオチド連結」には、ホスホロチオエート(phosphorothioate)，ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)，ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)，ホスホロジセレノエート(phosphorodisele noate)，ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)，ホスホロアニラデート(phosphoraniladate)，ホスホロアミデート(phosphoroamidate)、およびその類似体のオリゴヌクレオチド連結が含まれる。希望する場合、オリゴヌクレオチドには、検出用の標識を含ませることができる。適切な宿主細胞には、原核生物、酵母細胞、またはより高等な真核生物細胞がある。原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば大腸菌またはバチルス属の菌(Bacilli)がある。より高等な真核生物細胞には、以下に記載している哺乳類由来の確立した細胞株がある。宿主細胞の具体例として、DH5α，E.c oliW3110(ATCC27325)，E.coliB，E.coliX 1776(ATCC31537)およびE.coli294(ATC C31446)がある。多様な適当な微生物ベクターが利用可能である。一般に、微生物ベクターは、目的の宿主によって認識される複製起点、その宿主で機能するプロモーター、および表現型選択遺伝子、例えば抗生物質耐性または栄養要求性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。他の宿主に対しても、同様の構成体を作成することができるだろう。典型的には pBR322によって、大腸菌を形質転換する。Bolivar et al.,Gene 2,95(1977)を参照すること。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいるので、形質転換体を容易に同定することができる。発現ベクターは宿主生物によって認識されるプロモーターを含んでいる必要がある。これは、一般的に目的の宿主から得られるプロモーターを意味する。微生物の組換え体発現ベクターにおいて最も一般的に使われるプロモーターには、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクトースとのプロモーター系(Chang et al.,Nature 275,615(1 978);Goeddel et al.,Nucleic Acids Res.8,4057(1980),EPO Application Publi cation No36776）、および tacプロモーター(H.De Boer et al.,Proc.Natl.Acad .Sci.USA 80,21(1983))がある。これらは一般的に使われるが、他の微生物プロモーターも適している。多くのプロモーターのヌクレオチド配列に関する詳細は、公開されており、当業者は、それらをプラスミドまたはウイルスベクターのDN Aに作用可能に連結することができる(Siebenlist et al.Cell 20,269,1980)。弱いリボソーム結合部位を用いて、真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させるためには、Sambrook et al.(1989)"Expression of cloned genes in Escher ichia coli"Molecular Cloning:A Laboratory Manualを参照する。さらに細菌用のプロモーターには、細菌由来ではないが、細菌のRNAポリメラーゼと結合することができ、転写を開始させることができる天然のプロモーターがある。原核生物においてある遺伝子を高いレベルで生産させるために、細菌由来でない天然プロモーターと、適合性のあるRNAポリメラーゼとを共役させることもできる。共役プロモーター系の例には、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼ／プロモーター系がある(Studier et al.(1986) J.Mol.Biol.189,113;Tabor et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82,1074)。さらに、バクテリオファージプロモーターと大腸菌オペレータ領域とから、ハイブリッドプロモーターを作ることもできる(EPO Pub.No.267851)。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入させるための既知の方法、例えばウイルス内にポリヌクレオチドをパッケージングし、このウイルスによって宿主細胞に形質導入する方法、または当業界に既知のトランスフェクション法によって形質転換を行うことができる。米国特許Nos.4399216，4912040，4740461および4959455 に、その例が示されている。形質転換する宿主に応じた形質転換法を用いる。異種性ポリヌクレオチドを、哺乳類細胞に導入する方法は当業界に周知であり、これにはデキストランによるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレンによるトランスフェクション、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ポリヌクレオチドのリポソーム封入法、および核への直接DNAマイクロインジェクションがある。本発明の好ましい具体例ここに記載した本発明は、患者の腫瘍細胞において腫瘍抑制因子タンパク質の状態を、好ましくはインビボで、迅速に決定する方法であり、この方法は、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞に接触させて、腫瘍細胞に取り込ませることを含んでいる。１番目のポリヌクレオチド配列は、リポーター分子をコードしており、２番目の腫瘍抑制因子結合性のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。腫瘍抑制因子の結合は、リポーター遺伝子の発現を誘導し、それが検出または定量される。腫瘍抑制因子の存在を検出するか、またはその量を定量する従来技術の方法に対して、本発明の主要な利点は、患者の腫瘍を生検することなくインビボで実行できること、または腫瘍を生検する場合、腫瘍細胞を溶解することなくp53の状態を迅速に決定できることである。どちらの場合でも、最も現実的には、グリーン蛍光タンパク質をコードする１番目のポリヌクレオチドを用いて、腫瘍に１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を適当な時間取り込ませた後に、腫瘍にインビボで、または腫瘍の生検試料に適当な波長の光を照射することによって、本発明を実行する。しかし、内科医は、特定の治療法を薦める前にその腫瘍についてできるだけ多くの情報を得るために、本発明の方法と併用して、他の方法、例えば生検試料の通常の組織化学検査、磁気共鳴画像診断、およびその類似法を行うことを希望するだろう。以下でさらに検討するが、いくつかの状況では、本診断法を行うことで、内科医は、癌患者に対する最良の治療法をより容易に決定することができる。腫瘍抑制因子自身またはそれをコードする遺伝子のどちらかを検出するために、生検および付随する生化学的または分子生物学的手順を行う必要がないので、本発明の方法は迅速に実行される。腫瘍において腫瘍抑制因子状態が陰性を示した場合には、確認のために生検が特に望まれる場合もある。なぜなら、腫瘍抑制因子に結合して、これを不活性化する細胞内因子が存在するからで、これによって腫瘍抑制因子が２番目の腫瘍抑制因子結合性ヌクレオチド配列に結合できないことがある。１つの例は、ヒトパピローマウイルス、特にこのウイルスのE6タンパク質である。E6は、腫瘍抑制因子p53に強固に結合することが知られている(Werness et al.,Science248,76(199 0))。「腫瘍抑制因子」とは、悪性形質転換した、すなわち表現型が悪性の癌細胞を減少させるかまたは除去する効果のある、構造タンパク質またはそれに匹敵する、その断片もしくは変異体を意味する。本発明の具体例として、腫瘍抑制因子タンパク質には、限定はしないが、p53 、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)タンパク質(Rb)、腺腫様結腸ポリープ症タンパク質(adenomatous polyposis coli protein)(APC)、大腸癌変異型タンパク質(mu tated in colorectal caricinoma protein)(MCC)、ウイルム腫瘍１タンパク質(W ilm'stumor l protein)(WT1)、１型神経線維腫症タンパク質(neurofibromatosis type1 protein)(NF1)、または２型神経線維腫症タンパク質(neurofibromatosis type2 protein)(NF2)がある。よって、注意するべきことには、本発明は、腫瘍抑制因子p53に関して記載されているが、これに限定して解釈されるべきではない。各腫瘍抑制因子タンパク質に対して、適当な２番目のポリヌクレオチドを選択してリポーター遺伝子を発現させることができるだろう。別の具体例として、本発明は、p53の状態を決定しようとする患者の標的腫瘍細胞群に、２番目のp53結合性ポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されていて、リポーター分子をコードしている１番目のポリヌクレオチド配列を組み込むことによって実行される。p53が、２番目のp53結合性ポリヌクレオチド配列に結合することによって、リポーター分子の発現が誘導され、これを、選択した特定のリポーター分子に適する方法で検出または定量する。さらに当業界で周知のように、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列の発現に影響する他のポリヌクレオチド配列が存在してもよい。それには例えば、適当なポリアデニル化配列、例えばSV40初期ポリアデニル化配列がある。 p53に結合するポリヌクレオチド配列が当業界に知られていて、これを、リポーター分子をコードしている１番目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結することができる。例えば、米国特許5362623およびEPA 518650(inventor Vogelstein,B.et al.)を参照すると、p53結合性の特異的なDNA 配列を用いて、細胞抽出液中のp53を検出する方法が記載されている。本発明においては、これらのp53結合性ポリヌクレオチド配列を、リポーター分子をコードしている１番目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結して用いることができる。１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を保持する適当なウイルス性発現ベクターを用いて、それらの配列を標的の腫瘍細胞群に組み込むことができる。腫瘍によるその取り込みを促進する試薬を加えても加えなくてもよい。当業界において、種々のウイルス性ベクターおよびその作成方法が知られている。例えば、Jolly,D.Cancer Gene Therapy,vol.1,51-64(1994)を参照すること。好ましいウイルス性ベクターには、アデノウイルスおよびパピローマウイルスがある。例えば、、Horwitz,M.S.Adenoviridae and thier Replication,In:Fields,B.N.and Knipe,D.M.eds.,Fundamental Virology,2nd ed.New York,N.Y.,Raven Press,Lt d.,771-813(1991);and Howley,P.M.,Papilomavirinae and thier Replication,I n:Fields,B.N.and Knipe,D.M.eds.,Fundamental Virology,2nd ed.New York,N.Y .Raven Press,Ltd.,743-767(1991)を参照すること。本発明において、その他多くの適当なビリオンを使うことができるだろう。その材料およびその作成方法は、当業界で周知である。好ましいアデノウイルスは、複製能を欠いている。例えば、PCT/US94/14502"Adenovirus Gene Expression System"(inventor Galck-Pedersen,E.);and PCT/US94/12401"Recombinant p53 A denovirus Methods and Compositions"(inventors Zhang,W.W.,et al.)を参照すること。アデノウイルスのE1AおよびE1B領域を欠損した複製能欠失アデノウイルスがより好ましい。複製能欠失アデノウイルスを調製する技法は、当業界に周知である。例えば、 Ghosh-Choudhury and Graham F.,Biochem.Biophys.Res.Comm.147,964-973(1987) ;McGrory et al.,Virology163,614-6179(1988);PCT/US94/12401さらにまたGraha m,F.and Prevec,L.Manipulation of Adenovirus Vectors,In:Methods in Molecu lar Biology,vol.7;and Gene Transfer and Expression Protocols.Murray E.J. (ed)The Human Press Inc.,Clifton N.J.,vol7,109-128を参照すること。当業者に周知な技法を用いて、希望するウイルス性ベクターを分離することができる。分離方法としては、浮揚性密度勾配、特に塩化セシウム勾配遠心を用いることが好ましい。本発明の複製能欠失ビリオンを作成するために、適当な発現カセットを用いることができる。「発現カセット」とは、転写プロモーター／エンハンサー、外来遺伝子、場合によってはポリアデニル化シグナルを有するDNA分子を意味する。本発明においては、このプロモーターは、p53反応性のもので、すなわちここに記載している２番目のポリヌクレオチド配列である。外来遺伝子、すなわち１番目のポリヌクレオチド配列は、適当なリポーター分子をコードする遺伝子であり、p53反応性プロモーターに作用可能に連結される。また周知の通り、組換えアデノウイルスを増殖させるために、種々の細胞株を用いることができ、複製能の欠失がある場合、これを補完する細胞株に限る。好ましい細胞株として、ヒト293細胞株がある。しかし複製を許容する他の全ての細胞株、好ましくは、E1AおよびE1Bを発現する細胞株を用いることができる。さらに、ウイルス保存液を得るために、プラスティックディッシュ上かまたは縣濁培養液中のどちらかで増殖することができる細胞を用いる。293細胞株、およびある種のアデノウイルスベクターは、Microbix Bio systems,Inc.,341Bering Avenue,Toronto,Ontario,Canada M8Z3A8から得ることができる。Graham,F.et al.,J.Gen.Virol.,vol.36,59-74(1977)を参照すること。本発明は、E1欠失ウイルスおよびE1発現細胞に限定されない。本発明に関連して、実際、その他のウイルスおよび宿主細胞の補完的組み合わせを用いてもよい。機能的E2欠失ウイルスおよびE2発現細胞、機能的E4欠失ウイルスおよびE4発現細胞、並びに類似の組み合わせを用いてよい。複製に必要でない遺伝子、例えば E3遺伝子が欠失および置換されている場合に、宿主細胞はこの欠失を特に補完する必要はない。複製能欠失アデノウイルスは、既知の42の異なる抗原型またはサブグループA- Fのいずれのものでもよい。本発明の方法で用いる条件付き複製能欠失アデノウイルスベクターを得るためには、出発材料としてサブグループＣのアデノウイルスタイプ５が好ましい。なぜなら、アデノウイルスタイプ５は、これに関する有意に多くの生化学的および遺伝的情報があるヒトのアデノウイルスであり、そして歴史的にベクターとしてアデノウイルスを用いる構成体の大部分に使われてきたからである。ウイルス性ベクターに加えて、適当なプラスミド発現ベクターを用いて、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を、患者の標的腫瘍細胞塊に分配することもできる。この様なベクターおよび方法は当業界に周知である。１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を、患者の腫瘍に分配する別の方法は、それらを脂質内に封入するか、または脂質に結合させるか、好ましくはリポソーム内に封入することによる方法である。リポソームトランスフェクションは、例えばホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、コレステロール(Chol)、 N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、および／または3-β[N-(N,N-ジメチルアミノエタン)-カルバモイルコレステロール(DC-Chol )、並びに当業者に周知な他の脂質から作られたリポソームを介して行う。本発明において有用な、種々のリポソームトランスフェクション技法が当業者に知られている。それらの方法には、Nicolau et al.,Method in Enzymology,vol.149, 157-176(1987)およびGao et al.,Biochemical and Biophysical Research Commu nications,vol.179,280-285に記載されている方法がある。DOTMAを含んでいるリポソーム、例えば、Vical Inc.(San Diego,CA)から販売されている商標名Lipofe ctin^TMを用いてもよい。種々の方法によって、トランスフェクションしようとする細胞に、リポソームを加えて接触させることができる。細胞培養の場合は、リポソームを単に細胞培養液に分散させる。しかしインビボで適用する場合は、典型的にはリポソームを注射する。リポソームを静脈内注射することによって、本ポリヌクレオチド配列を肝臓および脾臓に運ぶことができる。注射では接近させることができない腫瘍細胞に本ポリヌクレオチド配列をトランスフェクションするために、ポリヌクレオチド配列含有リポソームを患者の身体内の特定の位置に直接注入することができる。以下で詳しく述べる。本発明ではまた、リポソーム複合体並びに前記の１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含んでいる構成物も考慮する。リポソーム複合体を作るために用いる脂質は、前記の脂質のいずれでもよい。特にDOTMA、DOPEおよび／またはD C-Cholによって、リポソーム複合体の全部または部分を形成することができる。好ましい例では、DC-Chol:DOPEの比率を1:20と20:1との間にして、DC-CholおよびDOPEからリポソームを作ることができる。さらに好ましくは、DC-Chol:DOPE の比率を約1:10から約1:5までにしてリポソームを調製する。１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を分配するために、リポソームを静脈内に投与するか、腫瘍に直接注入するか、または当業界に周知の他の経路を用いることができる。前述したとおり、静脈内に注射されたリポソームは、本質的には、肝臓および脾臓の網状内皮系のマクロファージによって取り込まれる。注射されたリポソームの特異的な取り込み部位は、主に脾臓のマクロファージおよび肝臓のクッパー細胞であるらしい。リポソーム/DNA複合体が静脈内に注射されると、これらの細胞がDNAを取り込み、その結果DNA内にコードされている遺伝子産物が発現される (Nicolau,Biol.Cell47,121-130(1983))。よって、肝臓および／または脾臓における原発性の腫瘍、または他の発生部位からの転移性の腫瘍を標的にして、本発明のポリヌクレオチド配列を有するリポソームを効率よく運ぶことができる。静脈内注射は、リポソーム／ポリヌクレオチド配列複合体を部位特異的に実際に分配するひとつの方法である。他の方法によっても、それらを適当な標的腫瘍細胞に選択的に分配することができる。好ましい方法は、カテーテルを用いるものであり、Nabel et al.,Science249,1285-1288(1990)に記載されている。例えば、上記のNabel et al.から、カテーテルによる動脈壁への注入を学ぶことができる。重要なことには、これらの方法によって、リポソーム／ポリヌクレオチド配列複合体を、静脈内注射によって分配することができる肝臓および脾臓だけではなく、他の特異的な部位にインビボで分配することができる。本発明は、p53の状態を決定しようとする標的細胞群に、２番目のp53結合性ポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されていて、リポーター分子をコードしている１番目のポリヌクレオチド配列を導入することによって実行される。本発明においては、多数のリポーター分子を用いることができ、p53が２番目のp53結合性ポリヌクレオチド配列と結合することによって発現させることができる。リポーター分子としては、グリーン蛍光タンパク質が好ましい。Chalfie,M.et al.,Science263,802-805を参照すること。このタンパク質は、395nmの青色光を吸収して、509nmの緑色光を放射する。この蛍光は安定で、ほとんどまたは全く退色しない。これは、検出するために基質、補因子またはその他いかなるタンパク質も必要としないので、他のリポーター分子、特に酵素に比べて有利である。よってこれは、患者において単に腫瘍塊に青色光を照射し、緑色光の放射を観察することによって容易に検出される。グリーン蛍光タンパク質をコードするcDNAはクローン化されており、異なる組織系において発現させられている。Prasher,D.C.,et al.(1992)Gene111,229-233 ;Inoue,S.and Tsuji,F.I.(1994)FEBS Letters341,277-280を参照すること。また WO9507463(inventors Chalfie,M．and Prasher,D.)を参照すること。このクローンは、Clontech Laboratories社からいくつかのプラスミドとして入手でき、そしてこれには種々の制限部位があるので、このクローンをリポーター分子として用いるウイルス性またはプラスミド性の発現ベクターを容易に作成することができる。リポーター分子には他に、p53の存在を検出する手段として機能する酵素がある。これらは、好ましくは、腫瘍の生検試料においてp53の状態を決定するために用いられる。この酵素としては、腫瘍塊において容易に測定または検出することができる酵素が好ましい。この様な利便性を備えている酵素は、一般にヒドロラーゼまたはオキシドレダクターゼであり、この例にはβグルクロニダーゼ、βヘキソサミニダーゼ、ルシフェラーゼ、ホスホリパーゼおよびホスファターゼがある。注目すべきことに、Quantin et al.,Porc.Natl.Acad.Sci.89,2581-2584において、筋肉特異的調節配列の調節下にリポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼを含んでいる組換えアデノウイルスが開示されている。この組換えウイルスは、筋管においてインビボでβガラクトシダーゼの発現を指令する。使用と投与適当なベクター（すなわちウイルス性、プラスミド性など）を用いるか、または前記の脂質（すなわちリポソーム）に結合させるかして、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を腫瘍に分配するいずれの場合においても、本発明の構成物の投与形を調製する方法が知られている。Remington's Pharmaceutical Sci ences,Mack Publishing Company,Easton Pennsylvania,17th edition,1985を参照すること。いずれの場合においても、投与される構成物または配合物は、治療対象において希望する量のリポーター分子を発現させるために十分な量の１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含んでいる。本発明の種々の構成物を、好ましくは、医薬に適合する賦型剤物質と組み合わせて用いる。医薬に適合する賦型剤としては、リン酸塩、乳酸塩、トリスおよび当業界に周知な適当な他の緩衝剤を含んでいる中性緩衝生理食塩水が好ましい。癌患者の腫瘍において腫瘍抑制因子の状態を決定する典型的な手法は、１番目および２番目のポリヌクレオチド配列の構成物を患者に投与すること、そしてその構成物が腫瘍に分配され取り込まれるまで、経験的に決定した時間待つことからなる。次に、測定するリポーターの特性に基づいて、標準法によって腫瘍を生検した後適当な測定法を行い、腫瘍抑制因子の存在を決定する。１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を、ウイルス性ベクターを用いて患者の静脈内に投与する場合、ウイルスの力価は10⁶-10¹²プラーク形成単位(pfu )/mlの範囲内とする。リポーター分子としてグリーン蛍光タンパク質を用いて、侵襲性の手法を行うことなく容易に検出することができる腫瘍において、本発明を用いてp53腫瘍抑制因子の状態を決定することが好ましい。頭部および頚部の癌を診断することが最も好ましい。例えば、これらの型のある癌に、グリーン蛍光タンパク質をコードする１番目のポリヌクレオチド配列および２番目のポリヌクレオチド配列を保持するアデノウイルスを、外部から注入することができる。ウイルスを腫瘍細胞に感染させた後に、好ましくは単に適当な波長の光を腫瘍に直接照射し、グリーン蛍光タンパク質に起因する適当な波長の光が放射されるかを観察することによって、p53の存在を決定することができる。グリーン蛍光タンパク質は、395nmの青色光を吸収して、509nmの緑色光を放射する。あるいはその腫瘍を生検し、ウイルスに感染させる前または感染させた後に、緑色光の放射を測定してもよい。次の実施例によって本発明を説明する。しかし、本実施例は、本発明を代表するものであり、当業者に明らかなように、本発明の意図および範囲から逸脱することなく修正改変することができる。実施例１１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を有する複製能欠失アデノウイルスの組換え体の作成１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を有する複製能欠失アデノウイルスの組換え体を作成するひとつの方策は、p53結合性のDNA配列、TATAボックス、GFPのコード配列、およびポリアデニル化配列、好ましくはSV40由来のポリアデニル化配列から成るGFPカセットを作成することから成る。このカセットを作成する方法としては、Clontechから入手でき、GFPコード配列およびSV40アデニル化配列が組み込まれている既存のpGFP-1プロモーターリポーターベクターを修飾することが好ましい(Clontechniquesll,no.2,April 1 996）。p53結合性DNA配列およびTATAボックスの両方を、このベクターのGFPコード領域およびSV40アデニル化配列の上流にクローン化する。このpGFP-1プロモーターリポーターベクターからカセットを切り出し、ウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスゲノム部分を有するアデノウイルス転移ベクターにクローン化する。この転移ベクターに存在するアデノウイルスゲノム領域は、ヒト293細胞株に同時トランスフェクションすると、残りのアデノウイルスゲノム部分を有するプラスミドベクターと相同組換えを起こすように設計されている。GFPカセットおよびアデノウイルスゲノムの一部分を有するプラスミドと、残りのアデノウイルスゲノムの大部分を有するプラスミドとのプラスミドの組を、ヒト293細胞株に同時にトランスフェクションすると、２つの構成体の間で相同組換えが起こり、診断検査で使用するのに適するアデノウイルスベクター内に GFPカセットを有する子孫ウイルスが生じるだろう。このウイルスを集め、そして標準的な方法で精製することができる。さらに詳細に記載する。噛乳類細胞においてGFPを効率的に発現させるために、TATAボックスエレメントをベクター構成体に組み込む。この配列をオリゴヌクレオチドとして合成し、二本鎖化し、その後ClonetechベクターpGFP-1内のp53結合性DNA部位とGFPコード配列との間にクローン化する。図１は、ベクターpGFP-1 を示し、図２は、このベクターのマルチクローニングサイト内(MCS)の制限部位を示している。 TATAボックスエレメントとしては、アデノウイルスE1B遺伝子自身に由来するT ATAボックスが好ましい。このエレメントの配列は、Lillie and Green,Nature 3 38,39-44(1989)に記載されている。pGFP-1プロモーターベクターのマルチクローニングサイトにあるKpn1およびApa1の制限部位に組み込むために、これらの制限部位を有する二本鎖配列を作成する。この配列を以下に示す。配列番号１： 5'-CAGGGTATATAATGGGCC-3' 配列番号２：3'-CATGGTCCCATATATTAC-5' 上記の二本鎖TATAボックスエレメントを、制限酵素Kpn1およびApa1で切断した pGFP-1プロモーターベクターにクーロン化する。この二本鎖配列を連結してできたベクターをpGFP-1TATAとする。次に、p53結合性DNA部位の共通配列を二本鎖化した後、pGFP-1TATA内にクローン化するために、両末端に適当な制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドとして合成する。 p53結合性DNA共通配列を以下に示す：配列番号３：5'-RRRCATGYYYRRRCATGYYY-3' ここでRはAまたはG、そしてYはCまたはTである。好ましいp53結合性DNA部位配列を以下に示す：配列番号４：5'-AACATGTCCCAACATGTTG-3' GFPの発現を促進するためには、p53結合性DNA部位配列が多重であることが望ましい。よって配列の多重化を促進するために、p53結合性DNA配列を、両端にHi ndIII制限部位を有する二本鎖にする。この二本鎖配列をpGFP-1TATAベクター内にクローン化する。好ましいp53結合部位の二本鎖オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。配列番号５：5'-AGCTTGAACATGTCCCAACATGTTGA-3' 配列番号６： 3'-ACTTGTACAGGGTTGTACAACTTCGA-5' この二本鎖配列をpGFP-1TATA内にクローン化すると、p53結合性DNA部位のコンカテマーが形成されたベクターp53-GFP1-TATAが生じる（図３）。適当な制限酵素によって、ベクターp53-GFP1-TATAに存在するGFPカセットを切り出すことができる。このカセットには、p53結合部位、、TATAエレメント、GFPコード領域およびSV40ポリアデニル化領域が含まれている。図３に示すように、制限酵素BgIII およびMluIによって、p53-GFP1-TATAからこのカセットを切り出し、適当なアデノウイルス転移ベクター、好ましくはpΔE1sp1AまたはpΔE1sp1Bにクローン化することができる。これらのベクターpΔE1sp1AまたはpΔE1sp1Bは、図４に示されており、そしてBett,PNAS91,8802,1994に記載されている。生じたプラスミドをp 53-GFPΔE1sp1AまたはBとする（図５）。これらのプラスミドベクターは、大腸菌シャトルプラスミドベクター内に、ウイルスのパッケージングおよび複製に必要なアデノウイルスゲノムの適当な左端、すなわちアデノウイルスゲノムのマップ単位(map unit,mu)0-0.9、続いてGFPカセットがクローン化されているマルチクローニングサイト、続いてマップ単位9.8-15.8に対応するアデノウイルスゲノム領域を含んでいる。このプラスミドp53-GFPΔE1sp1AまたはB内に存在するアデノウイルスゲノム領域は、ヒト293細胞株に同時トランスフェクションすると、残りのアデノウイルスゲノム部分を有するプラスミドベクターと相同組換えを起こすように設計されている。選択したアデノウイルスゲノムプラスミドは、pBHG10またはpBHG11であり、前記Bett et alにも記載されている。これらのプラスミドは、大腸菌シャトルプラスミドベクター内に、アデノウイルスゲノムのマップ単位 0-0.5を含み、続くマップ単位0.5-3.7を欠失しており、続いてアデノウイルスゲノムの残りのマップ単位3.7-100を含んでいる(アデノゲノム全域は0-100マップ単位から成る。各マップ単位は約360bpであり、従ってアデノゲノムの長さは約3 6000bpである)。さらに、これらのプラスミドにおいて、pBHG10は、マップ単位7 8.3-85.8に対応するアデノウイルスE3遺伝子領域を欠失しており、pBHG11は、さらにアデノウイルスゲノム塩基27865から30995までの配列が除かれた拡大したE3 遺伝子領域を欠失している。ひとつのプラスミドをp53-GFPΔE1sp1AまたはBとして、もう一つのプラスミドをpBHG10またはpBHG11とするプラスミドの２組の組み合わせの各組を、ともにヒト293細胞株にトランスフェクションすると、２つの構成体の間で相同組換えが起こり、分配用のアデノウイルスベクター内にGFPカセットを有する子孫ウイルスが生じる。このウイルスを集め、そして標準の方法で精製することができる。実施例２１番目および２番目のポリヌクレオチド配列のリポソームへの組み込み１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を、患者の腫瘍に分配する別の方法は、それらを脂質内に封入するか、または脂質に結合させるか、好ましくはリポソーム内に封入することによる方法である。リポソームトランスフェクションは、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、コレステロール(C hol)、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、および／または3-β[N-(N,N-ジメチルアミノエタン)−カルバモイルコレステロール( DC-Chol)、並びに当業者に周知な他の脂質から作られたリポソームを介して行う。本発明において有用な、種々のリポソームトランスフェクション技法が当業者に知られている。それらの方法には、Ni colau et al.,Method in Enzymology,vol.149,157-176(1987)およびGao et al., Biochemical and Biophysical Research Communications,vol.179,280-285に記載されている方法がある。DOTMAを含んでいるリポソーム、例えば、Vical Inc.( San Diego,CA)から販売されている商標名Lipofectin^TMを用いてもよい。陽イオン性リポソームは、適当なウイルスDNAを腫瘍形成細胞に効率よくトランスフェクションするために用いられ、そして本発明において好ましく用いられる。この様な陽イオン性リポソームを、Gao et al.,Biochemica and Biophysica l Research Communications179,280-285(1991)に記載されている方法によって調製することができ、それはDC-CholおよびDOPEの混合物である。このリポソームを作成する工程は以下のとおりである。 DC-Cholは、コレステロールクロロギ酸エステル(cholesteryl chloroformate) およびN,N-ジメチルエチレンジアミンから単一反応によって合成される。０℃にて、コレステロールクロロギ酸エステル溶液(無水(dry)クロロホルム5ml中、2.2 5g,5mmol)を、過剰のN,N-ジメチルエチレンジアミン溶液（無水(dry)クロロホルム3ml中、2ml,18.2mmol）に滴下して加える。溶媒を蒸発させて取り除いた後に、４℃にて、無水エタノール中で残留物を再結晶化して分離し、そして真空(in vacuo)乾燥する。生成物がDC-Cholの白色粉末である。クロロホルム中で1.2μｍｏｌDC-Cholと8.0μｍｏｌDOPEとを混合することによって、陽イオン性リポソームを調整する。この混合物を乾燥させ、さらに真空乾燥した後、試験管内でステロール/20mMHEP ES緩衝剤(pH7.8)1ml中に再縣濁する。４℃で24時間水和した後、その分散物をソニケーターで5-10分間超音波処理して、平均直径150-200nmのリポソームを形成させる。リポソーム/DNA複合体を調製するために次の工程を行う。最初に、実施例１に記載したようにして作成したアデノウイルスから、ウイルスDNAを分離精製する。適当な制限酵素を用いて、p53結合性の共通配列、TATAエレメント、GFPコード配列、およびSV40のポリアデニル化領域を有するGFPカセットを取り出す。アデノウイルスおよびウイルスDNAを分離する材料および方法は、当業界に周知である。例えばHitt,M.,Bett,A.J.,Prevec,L.and Graham,F.L.,Construction and propagation of human adenovirus vectors,In:Cell Biology,Laboratory H andbook;J.Celis(Ed),Academic Press,N.Y.In press;Graham,F.L.and Prevec,L. ,Manipulation of adenovirus vector,In:Methods in Molecular Biology7,Gene Transfer and Expressionを参照すること。簡単に述べると、実施例１に記載したようにして作成したGFPカセットを有するアデノウイルスを、ヒト胎児性腎臓細胞株HEK293内で増殖させる。1-10の感染多重度(MOI)でウイルスに感染させた細胞を、細胞変性効果が視認できるまで培養する。293細胞株は、American Type Cultlure Collection,#CRL1573,Rockvill e,MDから入手できる。Graham et al.(1977)J.Gen.Virol.36,59も参照すること。細胞を集め、低速遠心によって沈殿させる。細胞ペレットを３回連続して凍結溶解繰り返すことによって、そこからウイルスを抽出し、10000ｇ、30分間遠心して上清を集める。この細胞の粗抽出液から、塩化セシウムの２段階濃度勾配を用いる超遠心を行い、続いて500倍量の緩衝液に対して透析して、ウイルスを精製する。精製したウイルス溶液を分注して、-70℃で凍結保存する。プラークアッセイを行い、精製したウイルスの力価を決定する。このプラークアッセイでは、 HEK293細胞に連続的に希釈したウイルスを感染させ、アガロースを含む増殖培地を加えて重層し、その単層中に定量できるプラークが現れるまで培養する。次に、ウイルスDNAを分離精製して、適当な制限酵素を用いてGFPカセットを取り出す。このようにして、当業界に周知な方法によってカセットを精製する。最後に、アデノクイルスのGFPカセットのDNAを、DMEM/F12培地50μｌに対して DNA 15μｇの割合で、DMEM/F12培地に加える。DC-Chol/DOPEリポソーム混合液を、リポソーム100μｌに対してDMEM/F12培地50μｌの割合で、DMEM/F12培地によって希釈する。DNAの希釈液とリポソームの希釈液とを穏やかに混合し、37℃で1 0分間放置する。放置後、ウイルスDNA/リポソーム複合体は使用可能となる。実施例３ GFP カセットを有するアデノウイルスを用いた、腫瘍のp53状態の決定 GFP カセットを有するアデノウイルスは、腫瘍細胞のp53状態を決定するために有効であることを示すために、実験を行う。本発明のこの側面を証明するために、２つの細胞株を選択する。１番目のC33Aは、ヒト頚部上皮癌(human cervica l carcinoma)の細胞株である。これは、American Type Cultre Collection,Rock ville,MDから入手可能である。この細胞株を選択する理由は、まず、この細胞は腫瘍抑制因子タンパク質p53を実質上欠失していること、次に、この細胞は固形腫瘍として増殖することである。よって、この細胞株をネガティブコントロールとして用いて、p53が存在しない場合にはGFPが発現されないことを示すことができる。２番目の細胞株U-87はp53陽性であり、そして腫瘍を形成する。よって、この細胞株においてはp53が存在するのでGFPが発現されるだろう。U-87も、 American Type Cultre Collectionから入手可能である（ATCC HTB-14）。両方の細胞株を、ウシ胎児血清、アミノ酸および抗生物質を補充したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)中で、標準的な細胞培養条件下にて増殖させ、細胞が全面密集 (confluent)状態になればトリプシンを用いて継代する。次のようにして実験を行う。雌の無胸腺nu/nuヌードマウス（7-10週齢）の両横腹に、リン酸塩緩衝生理食塩水0.2ml中5X 10⁶個のC33AまたはU-87細胞のどちらかを皮下注射する。容量が0.15と0.40mlとの間になるまで腫瘍を増殖させる。一般に、それには約１ヶ月かかる。腫瘍の容量は、腫瘍の最大直径（長さ）とそれに直交する径（幅）の二乗を掛け合わせ、２で割って計算する。次に、どちらかの腫瘍を有するマウスに、GFPカセットを有するアデノウイルスを注射する。注射は、皮下を通して腫瘍内にする。ウイルスを腫瘍内に注射してから24から48時間後に腫瘍を切り出して、重量および寸法を測定する。そして腫瘍壊死および免疫エフェクター細胞(immune effe ctor cell)の腫瘍への浸潤について組織学的に調べる。組織学的検査をするために、腫瘍の一部分から凍結切片か、またはホルムアルデヒド固定した切片を調製する。ホルムアルデヒドで固定した後でもGFPの蛍光はあまり減衰しないので、後者の方が特に便利である。スライドに450-490nmの光を照射して検査すると、C33A腫瘍ではGFPの蛍光はほとんどまたは全く見られないだろうし、一方、U-87腫瘍の切片は明るい緑色蛍光を放射するだろう。実施例４リポソームによるアデノウイルスのGFPカセットDNAの、p53+およびp53-ヒト腫瘍細胞への分配アデノウイルスのGFPカセットDNAを封入したリポソームを用いて腫瘍細胞のp5 3の状態を決定できることを示すために、ウイルスを用いた場合と同様な実験を行う。アデノウイルスのDNAを単離して、実施例２で示した陽イオン性リポソーム物質内に封入する。この物質を、ヌードマウスのC33AまたはU-87のどちらかの腫瘍内に皮下注射する。細胞株の増殖方法、並びに腫瘍作成および採取の方法は、実施例３の記載の通りである。その結果、C33AおよびU-87腫瘍の組織学的なホルムアルデヒド固定切片の各々に、450-490nmの光を照射すると、C33Aの切片からは、蛍光はほとんどまたは全く放射されないが、U-87の切片からは明るい緑色蛍光が放射されることが示されるだろう。これらの結果から、ウイルスを用いた場合と同様な方法によって、リポソームを用いてアデノウイルスのGFPカセットDNAを分配して、腫瘍細胞のp53 状態を決定できることが結論されるだろう。本発明の好ましい具体例をここまで示してきた。当業者に明らかなように、本発明の意図から逸脱しないように本発明を改変および改修することができ、そして発明者はその様な全ての改変改修を意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．動物の腫瘍において、腫瘍抑制因子の状態を決定する方法で、前記決定を行うために有効な量の構成物を前記動物に投与するステップ、ここで、前記構成物は、作用可能に連結された１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含み、前記１番目のポリヌクレオチド配列がリポーター分子をコードし、前記２番目のポリヌクレオチド配列が前記腫瘍抑制因子と結合することができ、前記腫瘍抑制因子が結合することによって、前記リポーター分子の発現が誘導されるものであり；および前記腫瘍に存在するリポーター分子を検出するステップ、を含んでいる方法。２．前記腫瘍抑制因子がp53である、請求項１の方法。３．前記構成物が、前記１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含んでいるビリオンからなる、請求項１の方法。４．前記ビリオンが複製能を欠失している、請求項３の方法。５．前記複製能欠失ビリオンがアデノウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルスである、請求項４の方法。６．前記１番目のポリヌクレオチド配列が、ヒドロラーゼまたはオキシドレダクターゼからなる群から選択されるリポーター分子をコードする、請求項５の方法。７．前記リポーター分子が、グリーン蛍光タンパク質（Green Fluorescent Pr otein）からなる、請求項５の方法。８．癌患者の腫瘍を放射線治療するべきかどうか決める方法で、有効な量の構成物を腫瘍に接触させることによって、患者の腫瘍において腫瘍抑制因子p53の状態を決定するステップ、ここで、前記構成物は、作用可能に連結された１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含み、前記番目のポリヌクレオチド配列がリポーター分子をコードし、前記２番目のポリヌクレオチド配列が前記腫瘍抑制因子p53と結合することができ、前記腫瘍抑制因子p53が結合することによって、前記リポーター分子の発現が誘導されるものであり；前記腫瘍において、リポーター分子が発現しているかどうか決定するステップ；およびリポーター分子が発現している場合、前記腫瘍に放射線を照射しないステップ、を含んでいる方法。９．前記リポーター分子が、ヒドロラーゼまたはオキシドレダクターゼから成る群から選択される、請求項８の方法。 10．前記リポーター分子が、グリーン蛍光タンパク質である、請求項８の方法。 11．作用可能に連結された１番目および２番目のポリヌクレオチド配列を含み、前記１番目のポリヌクレオチド配列がリポーター分子をコードし、前記２番目のポリヌクレオチド配列が前記腫瘍抑制因子と結合することができ、前記腫瘍抑制因子が結合することによって、前記リポーター分子の発現が誘導される、構成物。 12．前記１番目および２番目のポリヌクレオチド配列がリポソーム内にあり、前記１番目のポリヌクレオチド配列がリポーター分子グリーン蛍光タンパク質をコードし、２番目のポリヌクレオチド配列が腫瘍抑制因子p53と結合する、請求項11の構成物。 13．前記１番目および２番目のポリヌクレオチド配列がウイルス内に組み込まれており、前記１番目のポリヌクレオチド配列がリポーター分子グリーン蛍光タンパク質をコードし、２番目のポリヌクレオチド配列が腫瘍抑制因子p53と結合する、請求項11の構成物。 14．前記ウイルスが、アデノウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルスから成る群から選択される、請求項13の構成物。 15．前記ウイルスが複製能を欠失している、請求項14の構成物。 16．前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項15の構成物。 17．頭部または頚部の腫瘍において腫瘍抑制因子の状態を決定する方法で、請求項１６のウイルスを前記腫瘍に感染させること、および前記腫瘍を395nmの青色光に露光して、509nmの緑色光が放射されるかどうか観察すること、を含んでいる方法。 18．前記の感染した腫瘍の生検試料を395nmの青色光に露光し、509nmの緑色光の放射を測定する、請求項17の方法。