DE102005033474A1

DE102005033474A1 - Verfahren zur Untersuchung von Gewebeproben, Vorrichtung dafür und neue Verwendung von Fluoreszenzmarkern

Info

Publication number: DE102005033474A1
Application number: DE102005033474A
Authority: DE
Inventors: Sylvia Heywang-Koebrunner; Walter Heywang
Original assignee: Heywang-Kobrunner Sylvia Prof Dr
Current assignee: Heywang-Kobrunner Sylvia Prof Dr
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2007-01-25
Also published as: WO2007028450A3; US7758601B2; US20080132805A1; WO2007028450A2

Abstract

Zur Untersuchung von Gewebeproben, die aus einem Gewebeareal mit Tumorverdacht entnommen wurden, wird vorgeschlagen, nach einer systematisch applizierten Fluoreszenzmarkierung die Gewebeproben auf Fluoreszenz zu untersuchen. Mit räumlich systematisch entnommenen Gewebeproben kann eine Fluoreszenzverteilung am Entnahmeort ermittelt und dargestellt werden. Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst eine Entnahmevorrichtung (PU), eine Zuführungseinrichtung (TU), einen Detektor (Det), eine Auswerteeinheit (CPU), eine Speichereinheit (SU) und eine Ausgabevorrichtung (AV), die eine Onlineuntersuchung entommener Gewebeproben (Pr) ermöglicht und mit der ein dreidimensionales Bild der Fluoreszenzverteilung am Entnahmeort dargestellt werden kann.

Description

Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen und die häufigste Todesursache der Frau zwischen 35 und 55 Jahren. Untersuchungen zur Früherkennung von Mammakarzinomen werden daher Frauen alle 1–2 Jahre empfohlen. Zur primären Brustkrebsdiagnostik werden Mammographie, klinische Untersuchung (einschl. Tastbefund) und Ultraschalluntersuchungen eingesetzt

Als weiteres Diagnoseinstrument bietet sich die Kernspintomographie an, die eine hohe Sensitivität aber eine nur geringe Spezifität und Auflösung aufweist. Nachteilig ist außerdem, dass es sich um ein teures Verfahren handelt, welches nicht für Reihenuntersuchungen geeignet ist.

Werden mit diesen Methoden auffällige aber noch nicht eindeutige Befunde festgestellt, können mittels einer sog. Stanzbiopsie oder der Vakuumbiopsie Gewebeproben entnommen werden, die anschließend histologisch untersucht werden. Obwohl mit der Vakuumbiopsie inzwischen ein Gewebsvolumen von bis zu 20mm Durchmesser entnommen werden kann, wird auch sie bislang nur zu diagnostischen Zwecken und zur Entfernung eindeutig gutartiger Befunde eingesetzt, da mit dem beschriebenen Verfahren eine ausreichend sichere Kontrolle bezüglich einer vollständigen Entfernung des Tumors nicht möglich ist.

Eine Weiterentwicklung von minimal-invasiven Biopsieverfahren wie insbesondere der Vakuumbiopsie im Hinblick auf einfachere und sichere Kontrolle der mit ihr gewonnenen Erkenntnisse ist aber wünschenswert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben mit der Gewebeproben einfach und schnell auf Karzinome untersucht werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist weiteren Ansprüchen zu entnehmen.

Es wird vorgeschlagen, mittels eines Biopsieverfahrens entnommene Gewebeproben, die mit einem systemisch applizierten spezifischen Fluoreszenzmarker behandelt sind, mit einer elektromagnetischen Strahlung zu bestrahlen und die Intensität des Fluoreszenzlichts zu bestimmen. So gelingt es auf einfache Weise, markiertes und damit tumorverdächtiges Gewebe schnell zu identifizieren. Die Fluoreszenzmarker lagern ausschließlich oder überwiegend an Tumoren an und machen sie so dem neuen Verfahren zugänglich. Fluoreszenzmarker wurden bereits bisher zur Markierung oberflächennaher Tumore eingesetzt, wobei die Diagnose anschließend durch in Augenscheinnahme von außen erfolgte. Insbesondere konnten auf diese Weise Blasenkarzinome optisch markiert und endoskopisch (mittels Zystoskopie) an der Oberfläche der Blasenwand sichtbar gemacht und abgetragen werden. Mit dem neu vorgeschlagenen Verfahren ist es darüber hinaus erstmals möglich, an beliebiger Stelle gewonnene Gewebsproben schnell auf Karzinomverdacht zu untersuchen. Das Verfahren kann auch maschinengebunden und automatisiert durchgeführt werden.

Wird den Gewebeproben ein Entnahmeort zugeordnet, so gelingt es, mit dem Verfahren ein zwei- oder dreidimensionales Abbild der Fluoreszenzaktivität am Entnahmeort zu erstellen.

Es werden vorzugsweise solche Gewebeproben eingesetzt, die minimal-invasiv entnommen wurden. Ein dazu geeignetes bekanntes Verfahren ist die Vakuumbiopsie, bei der eine Hohlnadel an den Entnahmeort geführt wird. Die Hohlnadel hat seitlich ca. 5–10 cm von ihrer Spitze entfernt eine breite Öffnung, durch die benachbartes Gewebe mittels Unterdruck in die Hohlnadel eingesaugt werden kann. Die Öffnung wird dann durch ein scharfes an der Nadelinnenwand anliegendes Messer verschlossen, so dass das eingesaugte Gewebe abgeschnitten wird. Der abgeschnittene Gewebszylinder wird dann durch ein zweites Vakuum durch die Hohlnadel an deren Ende aus dem Körper heraustransportiert und dort entnommen. Durch Drehen der Hohlnadel um die eigene Achse können analog Gewebezylinder aus allen Richtungen um die Hohlnadel entnommen werden. Durch kontinuierliche Entnahmen kann so ein Gewebsvolumen von bis zu 2 cm Durchmesser entnommen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren setzt erst nach diesem Schritt, also bei den so gewonnenen Gewebeproben ein.

Beim Untersuchungsverfahren werden insbesondere folgende Schritte hintereinander durchgeführt:

– Bestrahlen der Gewebeproben mit elektromagnetischer Strahlung, so dass mit dem Fluoreszenzmarker markierte Gewebeproben eine Fluoreszenzstrahlung aufzeigen,
– Messen der Intensität des Fluoreszenzlichts,
– Zuordnen der gemessenen Intensitätswerte zu den Koordinaten des Entnahmeorts, die jeweils einer Gewebeprobe zugeordnet sind und dabei
– Erzeugen eines Datensatzes für die Verteilung der Intensität des Fluoreszenzlichts am Entnahmeort.

Der Entnahmeort ist dabei folgendermaßen festgelegt: Die Hohlnadel selbst wurde zuvor mittels Steuerung durch ein Bildgebungsverfahren vorzugsweise zentral in ein verdächtiges Areal eingeführt und verbleibt dort liegen, bis alle Gewebeproben entnommen sind. Sie dient damit als fixes Zentrum. Sie wird nun (bevorzugt im Uhrzeigersinn) schrittweise gedreht, so dass das Entnahme-Fenster jeweils in eine andere Richtung weist. Neben der Lage der Hohlnadel als Zentrum bestimmt somit die „Uhrzeiger-Angabe" in Form eines Drehwinkels die weitere Koordinate der Gewebeprobe und damit den Entnahmeort. Aus der Messung der Fluoreszenzintensität längs einer entnommenen (lang gestreckten) Probe mit der Längsachse als z-Koordinate wird zusammen mit der Angabe des Drehwinkels ein zweidimensionales Bild der Fluoreszenz-Intensität erhalten. Dabei ist es möglich die Fluoreszenzintensität durch eine Farbabstufung kenntlich zu machen und mittels eines Ausgabegeräts darzustellen. Ist die Probeentnahme systematisch in jeweils gleicher Dicke z.B. durch schrittweises Drehen längs einer um die Hohlnadel verlaufenden Spirale erfolgt, so lässt sich aus der angegebenen 2-dimensionalen Darstellung auch ein dem ursprünglichen Gewebe entsprechender 3-dimensionaler Datensatz gewinnen. Die durch die Spirale definierte Ebene ergibt die fehlenden xy Koordinaten. Der 3-dimensionale Datensatz gibt die dreidimensionale Fluoreszenzverteilung an und entspricht somit einer räumlichen Darstellung des ursprünglichen Tumors. Insbesondere lassen sich aus einem solchen Datensatz auch beliebig orientierte diagnostisch relevante Schnittbilder gewinnen.

In einer Weiterbildung des Verfahrens werden die Gewebeproben extrakorporal auch normal optisch erfasst, daraus optische Bildinformationen gewonnen und mit den Koordinaten des Entnahmeorts verbunden. Auf diese Weise kann zusätzlich eine zwei- oder dreidimensionale Darstellung der normaloptischen Bildinformationen an einem Ausgabegerät erfolgen.

In einer weiteren Ausgestaltung werden die normal optischen räumlich zugeordneten Bildinformationen mit der räumlichen Verteilung der Fluoreszenzaktivität verknüpft und insbesondere Überlagerungsbilder aus beiden Datenquellen erzeugt. Aus den so automatisiert gewonnenen Bildinformationen können weitere für die Diagnose wichtige ärztliche Erkenntnisse gewonnen werden.

Die zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzten Marker werden systemisch appliziert, also oral eingenommen oder intravenös eingespritzt. Sie reichern sich vor allem in physiologisch aktivem Gewebe und insbesondere in schnell wachsenden Tumoren an. In gesundem Gewebe kann (je nach eingesetztem Marker) ggf. auch eine Fluoreszenzaktivität gemessen werden, die jedoch deutlich unter derjenigen von Tumor-Gewebe liegt. Zur Verbesserung der Darstellung kann daher ein Grenzwert für die Fluoreszenzaktivität eingegeben werden, unterhalb dem die Darstellung der Intensität an der Ausgabevorrichtung unterdrückt wird. Unter der Annahme, dass ein scharf abgegrenzter Tumor zu einem sprunghaften Anstieg der Fluoreszenzaktivität des dort entnommenen Gewebes führt, gelingt auf diese Weise eine plastische Darstellung des Tumors in seinen räumlichen Abmessungen. Auch auf diese Weise können weitere diagnostische Informationen über Art und Ausbreitung des Tumors gewonnen werden.

Die Erstellung eines Datensatzes über die räumliche Verteilung der Fluoreszenzaktivität gelingt bei einer mittels Vakuumbiopsie gewonnen Serie von Gewebeproben in einfacher Weise, wenn die Gewebeproben am Entnahmeort spiralartig herausgeschnitten wurden. Die zugeordneten Koordinaten jeder Gewebeprobe umfassen dabei eine fortlaufende Probennummer N_P und einen in vorgegebenen vorzugsweise konstanten Schritten Δα zunehmenden Drehwinkel α_n, aus denen sich alle weiteren Koordinaten entwickeln lassen. Zwischen der Entnahme zweier Gewebeproben mit einander nachfolgenden Probennummern wird die Nadel bzw. deren Innenzylinder um diesen Winkel Δα gedreht. Alle Drehungen erfolgen dabei vorzugsweise gleichsinnig.

So wird für jede Gewebeprobe eine Spurnummer n berechnet, die sich beginnend mit n = 1 nach jeder vollen Umdrehung, also wenn der Drehwinkel α_n ein ganzzahliges Vielfaches von 360 Grad überschreitet, um eins erhöht. Dabei wird angenommen, dass die jeweiligen Gewebeproben, die einer einzelnen Spurnummer n zugeordnet sind, den gleichen Abstand vom Ursprung, also vom Entnahmeort beziehungsweise von der Hohlnadel aufweisen. Aus dem Drehwinkel α_n und der Spur wird anschließend jeder Gewebeprobe ein Sektor am Entnahmeort zugeordnet. Der Drehwinkel zweier aufeinander folgender Gewebeproben unterscheidet sich um den genannten Winkel Δα, der einer Drehung des Entnahmeinstruments, also des drehbaren Innenzylinders mit dem Messer entspricht. Vorzugsweise erfolgt die Drehung zwischen zwei Probenentnahmen um den Winkel, der dem Öffnungswinkel des Innenzylinders entspricht. Dieser liegt beispielsweise bei 30 bis 60 Grad.

In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens ist es möglich, die Anzahl der pro Spur entnommenen Gewebeproben mit zunehmender Spurnummer n zu steigern. Innerhalb einer einzelnen Spur werden jeweils zwischen zwei Probenentnahmen Drehung en um den gleichen Winkel durchgeführt.

Zur Fluoreszenzmarkierung werden systemisch applizierbare Mittel eingesetzt. Möglich ist es zum Beispiel, metallorganische Komplexe mit unterschiedlichsten Zentralatomen wie z.B. das Gadolinium zu verwenden, die eine geeignete Fluoreszenz aufweisen.

Für den Einsatz als Kontrastmittel für die Kernspintomographie bereits zugelassen sind beispielsweise Gadoliniumchelatkomplexe und insbesondere das Gd (DTPA), welches als Chelatbildner Diethylentriaminopentaacetat aufweist. Kommerziell ist diese Gd-DTPA als Megluminsalz in wässriger Lösung mit einer Konzentration von 500 mmol/l erhältlich. Es lässt sich intravenös applizieren und verteilt sich zunächst im intravasalen Raum, tritt aber rasch in den extrazellulären Raum über. Das hohe magnetische Moment des Gd⁺⁺⁺-Ions erlaubt die Beobachtung über Kernspintomographie. Durch das Chelat ist das Gd⁺⁺⁺ abgeschirmt und nicht toxisch. Gleichzeitig verfügt Gd(DTPA) über Fluoreszenzeigenschaften, die bei diesem medizinischen Kontrastmittel bislang nicht genutzt werden. Vergleichbare Fluoreszenz kann auch mit anderen (bereits zugelassenen) MR-Kontrastmitteln (andere Gd-Komplexe oder Komplexe mit anderen seltenen Erden) erwartet werden. Außerdem sind als Fluoreszenzmarker Metalloporphyrine geeignet, die oral applizierbar sind. Weiterhin geeignet als Fluoreszenzmarker sind auch fluoreszenzmarkierte Bakterien, Viren oder Proteine, sofern sie sich bevorzugt in Gewebe mit Tumoraktivität einlagern. Die Fluoreszenzmarkierung gelingt über gentechnisch veränderte Organellen oder Proteine.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und dementsprechend zur Gewinnung von dreidimensionalen Daten aus Gewebeproben umfasst:

a) Eine Probeentnahmevorrichtung mit einer Hohlnadel, die an einem Entnahmeort innerhalb eines biologischen Gewebes zylinderförmige Gewebeproben entnehmen, nach jeder Probenentnahme um einen vorgegebenen Winkel Δα rotieren und im Gewebe spiralförmig voranschreiten und dabei quasi kontinuierlich Gewebeproben mit zweidimensionaler Ortszuordnung liefern kann,
b) eine Strahlungsquelle, insbesondere für kurzwelliges Licht, die einen gegebenen Fluoreszenzmarker innerhalb einer Gewebeprobe zur Fluoreszenz anregen kann,
c) einen Detektor, der eine eindimensionale Bestimmung der Intensität des Fluoreszenzlichts ermöglicht, das von der den Fluoreszenzmarker angereichert enthaltenden Gewebeprobe ausgestrahlt wird, und
d) eine Auswerteeinheit, die die zweidimensionale Ortszuordnung der Gewebeproben mit der bestimmten Intensität des Fluoreszenzlichts verknüpft und einen dreidimensionalen Datensatz mit der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts am Entnahmeort liefert.

Die Probenentnahmevorrichtung ist insbesondere die bereits genannte Vakuumbiopsieeinrichtung. Das biologische Gewebe kann menschlichen oder tierischen Ursprungs sein und dem lebenden oder toten Organismus entnommen werden. Die Strahlungsquelle kann vorzugsweise ein kurzwelliges monochromatisches Licht erzeugen und ist beispielsweise eine Leuchtdiode oder eine Entladungslampe. Der Detektor ist zur eindimensionalen Bestimmung der Intensitätsverteilung ausgelegt und umfasst dabei einen punkt-, zeilen- oder flächenförmigen Detektor, der gegebenenfalls relativ zur Probe beweglich ist, um die genannte eindimensionale Intensitätsverteilung zu detektieren.

Die Auswerteeinheit umfasst einen Speicher, in dem die zweidimensionale Ortszuordnung der Gewebeproben abgespeichert ist. Bei systematischer Probenentnahme mit vorgegebenem Entnahmeschema ist es auch möglich, die zweidimensionale Ortszuordnung allein über die Probennummer und das vorgegebene Entnahmeschema vorzunehmen. Die dritte Dimension zur bereits bekannten zweidimensionalen Ortszuordnung wird über die eindimensionale Intensitätsverteilung gewonnen. Als „vierte Dimension" enthält der Datensatz dann die Intensität des gemessenen Fluoreszenzlichts.

Zur Darstellung der errechneten beziehungsweise bestimmten räumlichen Intensitätsverteilung ist eine Ausgabeeinheit vorgesehen, die einen Monitor zur bildlichen Darstellung des Datensatzes und/oder einen Drucker umfasst. Des weiteren ist eine Eingabevorrichtung vorgesehen, mittels derer Standardwerte, Entnahmeschemen oder zweidimensionale Koordinatensätze von Gewebeproben eingegeben werden können. Über die Eingabevorrichtung können auch Parameter der bildlichen Darstellung variiert oder eine gewünschte zweidimensionale Darstellung anhand einer Schnittebene ausgewählt werden.

Die Vorrichtung kann weiterhin eine Zuführungseinrichtung umfassen, mit der quasi kontinuierlich Gewebeproben von der Entnahmevorrichtung zur aus Lichtquelle und Detektor bestehenden Detektoreinrichtung transportiert werden. Die Zuführung kann dabei in konstanten Zeitabständen vorgenommen werden, wobei die Messung der Fluoreszenzaktivität beziehungsweise Fluoreszenzverteilung ebenfalls quasi kontinuierlich erfolgt und beispielsweise online in Verbindung mit der Gewebeentnahme durchgeführt wird. Hierbei können auch Daten bezüglich der Position des Entnahmefensters bei Gewinnung jeder Probe mit übertragen werden. Das Verfahren ist schnell und kann mit der Vorrichtung quasi online mit der Untersuchung eines Patienten durchgeführt werden, ohne diesen durch eine überlange Untersuchung zu stark zu belasten.

In einer einfachen Ausführung umfasst der Detektor einen lichtempfindlichen Sensor und einen Antrieb, der eine Relativbewegung zwischen Gewebeprobe und Sensor durchführen kann, um eine Reihe von Messpunkten entlang der Z-Koordinate, die der Längsachse der zylinderförmigen Gewebeprobe entspricht, zu gewinnen. Vorteilhaft werden jedoch Detektoren eingesetzt, die die eindimensionale Intensitätsverteilung über eine Vielzahl entlang der Z-Koordinate verteilte Sensorpunkte in einem Schritt vornehmen können.

In weiterer Ausgestaltung umfasst die Vorrichtung eine durch die Hohlnadel einführbare Lichtquelle für kurzwelliges Licht zum Erzeugen einer Fluoreszenz am Entnahmeort und eine Lichtleitfaser zur Detektion der vor Ort erzeugten Fluoreszenz, die somit der direkten Beobachtung durch den Arzt zugänglich ist. Er kann damit eine nachträgliche Kontrolle am Entnahmeort durchführen. Diese kann einer optischen Prüfung durch Augenschein auf Tumorgewebe bezüglich erhöhter Fluoreszenzaktivität entsprechen.

Mit der Vorrichtung gelingt es, eine auffällige Gewebeveränderung am Entnahmeort auf Fluoreszenzaktivität und damit auf Tumoraktivität zu untersuchen und das Ergebnis der Untersuchung gleichzeitig dazu zu verwenden, die Gewebeprobenentnahme auf die fluoreszierende und damit tumoraktive Region zu begrenzen. Da der Nachweis der Fluoreszenzaktivität automatisiert und zeitlich unmittelbar erfolgen kann, kann die synchron verlaufende Probenentnahme voll automatisiert so durchgeführt werden, dass weitere Probenentnahmen nur in den Raumrichtungen durchgeführt werden, in denen eine erhöhte Fluoreszenzaktivität festgestellt wurde. Dabei kann die automatische Steuerung so eingerichtet werden, dass um fluoreszenzaktives Gewebe herum ein Sicherheitssaum mit herausgeschält wird, der je nach Anforderungen oder Aggressivität des Tumors eine Breite von zum Beispiel 0,5 bis 1 cm aufweist. Die automatische Unterscheidung zwischen Tumorgewebe und normalem Gewebe kann mit dem bereits genannten Intensitätsschwellwert erfolgen, wobei eine Fluoreszenzaktivität über dem Schwellwert als tumorbehaftet, und eine darunter liegende als nicht tumorbehaftet betrachtet wird.

Die automatische Steuerung kann so eingerichtet sein, dass den Gewebeproben bei der Entnahme ein Drehwinkel α_n, der sich aus der Summe der Einzeldrehungen um Δα zusammensetzt, und eine fortlaufende Spurnummer n zugewiesen wird, wobei n einer ganzen Zahl größer Null entspricht. Eine Gewebeprobe wird bei zunehmendem Drehwinkel nur dann entnommen, wenn die Spurnummer n = 1 ist oder wenn bei einer vorangehenden Gewebeprobe mit übereinstimmenden Drehwinkel α_n und einer Spurnummer n – x eine Fluoreszenzintensität erfasst wurde, wobei x und damit die Anzahl der herauszuschälenden Sicherheitsspuren ohne Fluoreszenz und damit vermutlich ohne Tumoraktivität frei gewählt werden kann. Es kann zum Beispiel ein Sicherheitssaum von 1 cm eingestellt und x entsprechend vorgegeben werden. Im Ergebnis bedeutet dies, dass ausgehend von einer zentralen Achse am Entnahmeort, die die Z-Achse umfasst, ausschließlich in den Raumrichtungen, definiert durch die entsprechende XY-Koordinate Proben entnommen werden, in denen fluoreszenzaktives Gewebe festgestellt wird.

In einer weiteren Ausgestaltung umfasst die Vorrichtung eine durch die Hohlnadel einführbare Wärmequelle. Mit dieser gelingt es, nach der Entnahme fluoreszenzaktiven Gewebes eine lokale Applikation von Wärme am Entnahmeort vorzunehmen, um gegebenenfalls einzelne überlebende Tumorzellen mittels dieser thermischen Behandlung abzutöten. Die Wärme kann dabei so appliziert werden, dass es zu einer Hyperthermie kommt, also zu einer lokalen Erwärmung über die Temperatur, bei der Tumorzellen absterben.

Im Rahmen der Erfindung liegt es auch, Gadoliniumchelatkomplexe zur Herstellung eines systemischen Mittels zu verwenden, mit dessen Hilfe eine Fluoreszenzmarkierung von Tumoren und deren Nachweis mittels Fluoreszenz an entnommenen Gewebeproben gelingt. Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegt es, Metalloporphyrine zur Herstellung eines systemischen Mittels zur Anreicherung in Tumoren und zum Nachweis derer mittels Fluoreszenz an entnommenen Gewebeproben zu verwenden. Auch eine Verwendung von fluoreszenzmarkierten Bakterien, Viren oder Proteinen dient erfindungsgemäß zur Herstellung eines systemisch applizierbaren Mittels zur Anreicherung in Tumoren und zum Nachweis von tumorhaltigem Gewebe in entnommenen Proben.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der dazugehörigen Figuren näher erläutert. Die Figuren dienen allein der Veranschaulichung der Erfindung und sind daher nur schematisch und nicht maßstabsgetreu ausgeführt. Gleiche oder gleich wirkende Teile sind mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
1 zeigt ein Ablaufdiagramm des Verfahrens,
2 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens,
3 zeigt einen Detektor im schematischen Querschnitt, der Teil der Vorrichtung ist.
1 zeigt ein schematisches Ablaufdiagramm des Verfahrens zur Untersuchung von Gewebeproben. Ausgangspunkt des Verfahrens sind Gewebeproben Pr, die beispielsweise mittels eines Vakuumbiopsieverfahrens gewonnen wurden, beispielsweise Gewebeproben aus der weiblichen Brust. Die Gewebeproben sind entweder systematisch nach einem bestimmten Schema entnommen, das eine Zuordnung von XY-Koordinaten rund um die Ursprungslage der am Entnahmeort drehbar gelagerte Biopsievorrichtung erlaubt oder sind als Einzelproben mit spezifischen Ortskoordinaten des Entnahmeorts versehen. Diese Proben werden vorzugsweise einzeln und nacheinander mittels einer Zuführungseinrichtung TU einem Detektor Det zugeführt. Die in Form langgestreckter Zylinder vorliegenden Proben werden dort jeweils mit einer Strahlungsquelle mit insbesondere kurzwelligem Licht bestrahlt. Gewebeproben, die den Fluoreszenzmarker enthalten, zeigen dabei eine Fluoreszenz, deren Intensität abhängig von der vorliegenden Fluoreszenzmarkerkonzentration innerhalb der Gewebeprobe ist.
Der Sensor bestimmt die Intensitätsverteilung entlang der Längsachse der zylinderförmigen Probe Pr. Diese Daten werden einer Auswerteeinheit CPU zugeführt, beispielsweise einem Rechner oder einem Mikroprozessor. Als weitere Daten werden der Auswerteeinheit z.B. über eine Eingabevorrichtung oder eine Datenschnittstelle die bekannten Ortskoordinaten XY der Gewebeproben in der XY-Ebene am Entnahmeort zugeführt und dort mit der Intensitätsverteilung entlang der Z-Koordinate, entsprechend der Längsachse des Zylinders, verknüpft. So wird eine Intensitätsverteilung in einem der Größe der Probe entsprechenden Raumvolumen am Entnahmeort erhalten und in einer Speichereinheit SU abgelegt. Anschließend wird die Probe aus dem Detektor in einen Probenspeicher PS überführt und die nächste Probe mittels der Zuführeinrichtung TU in den Detektor eingebracht und dort vermessen.
Dabei ist es möglich, einzeln den Proben zugeordnete Ortskoordinaten zu verwenden oder die XY-Koordinaten automatisch über das Entnahmeschema zu errechnen, mit dem die Proben entnommen worden sind. Bei der Entnahme kann beispielsweise ein spiralförmiger Bereich am Entnahmeort herausgeschält werden, wobei die erste Probe im Zentrum der Spirale angeordnet ist, während die darauffolgenden Proben sich entlang der Spirale nach außen hin aneinander reihen. Die Anzahl und das Volumen der pro Umdrehung der Hohlnadel entnommenen Proben erlaubt dann eine Rekonstruktion des Entnahmeorts beziehungsweise eine genaue Zuordnung der Probennummer zu einer XY-Koordinate, die einem Ort auf einer Spirale entspricht, entsprechend der spiralförmig fortschreitenden Gewebeentnahme.
Sobald eine gewünschte Anzahl von Proben Pr untersucht und deren Intensitätsverteilung den Koordinaten zugeordnet ist, können diese Daten an einer Ausgabevorrichtung AV ausgegeben werden. Dazu ist insbesondere ein Monitor geeignet, an dem der Fortschritt des Verfahrens beziehungsweise die Darstellung der Fluoreszenzverteilung kontinuierlich verfolgt werden kann. Alternative oder als weitere Ausgabevorrichtung kann auch ein Drucker angeschlossen sein.
2 zeigt eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung. Diese umfasst die an sich bekannte Probenentnahmevorrichtung PU, beispielsweise die Vakuumbiopsievorrichtung, wie sie etwa unter dem Namen Mammotome^® von der Firma Ethicon vertrieben wird. Diese besteht im wesentlichen aus der Hohlnadel Nd und einem darin geführten drehbaren Innenzylinder Cy. Die Hohlnadel weist eine Spitze auf, die das Einführen in das Gewebe am Entnahmeort erleichtert. Das Gewebe bzw. der Körper K und speziell die weibliche Brust, in die die Hohlnadel Nd eindringt, ist symbolisch durch einen Kreis dargestellt. Seitlich an der Hohlnadel ist eine Öffnung Oe vorgesehen, die beispielsweise einen Öffnungswinkel von ca. 90 Grad bezogen auf den rotationssymmetrischen Innenzylinder aufweist. An einer Seitenkante dieser Öffnung ist der drehbare Innenzylinder Cy als rotierendes Messer ausgebildet. Weiterhin weist die Entnahmevorrichtung PU Mittel zum Erzeugen eines Unterdrucks auf, um ein dem Innenvolumen der Öffnung OE entsprechende Menge an Gewebe in die Hohlnadel Nd hineinzuziehen. Die eingesaugte Gewebeprobe Pr wird anschließend durch Drehen des Innenzylinders Cy abgeschnitten und anschließend durch die Hohlnadel Nd hindurch aus der Entnahmevorrichtung PU herausbefördert. Der Weg einer gestrichelt angedeuteten Probe Pr' durch die Hohlnadel ist mit Pfeilen verdeutlicht. Die Entnahme mittels der Probenentnahmevorrichtung PU erfolgt z.B. mechanisch oder über ein zweites Vakuum.
Direkt mit der Entnahmevorrichtung kann eine Zuführungseinrichtung TU verbunden sein, die die Probe einem angeschlossenen Detektor Det zuführt. An den Detektor schließt sich eine Auswerteeinrichtung CPU und eine Speichereinheit SU und an diese eine Ausgabevorrichtung AV an.
3 zeigt ausschnittsweise eine mögliche Ausführung eines Detektors Det. Dieser umfasst eine Strahlenquelle SQ, die vorzugsweise kurzwelliges monochromatisches oder scharfe Emissionsbanden aufweisendes Lichts erzeugt. Es kann ein Reflektor Ref vorgesehen, der das Licht in Richtung der Gewebeprobe Pr bündelt. Nahe der Gewebeprobe ist ein Sensor SN angeordnet, beispielsweise eine Sensorzeile, die gleichzeitig und ortsaufgelöst eine der gewünschten Auflösung entsprechende Anzahl von Sensorpunkten beziehungsweise Pixeln Px detektieren kann. Der Sensor ist so ausgelegt, dass er ausschließlich das der Fluoreszenz des Fluoreszenzmarkers zugeordnete Licht detektiert. Da dieses langwelliger als dasjenige der Strahlungsquelle SQ ist, kann das Licht der Strahlungsquelle durch Verwendung eines Kantenfilters ausgeblendet werden. Die vom Sensor ermittelten Daten entsprechend der Intensitätsverteilung über die Länge der Probe Pr werden anschließend in die Auswerteeinrichtung CPU überführt.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelingt es, eine Gewebeprobe an einer tumorverdächtigen Stelle innerhalb eines Organismus und insbesondere der weiblichen Brust zu entnehmen und quasi online mit dem angeschlossenen Detektor auf das Vorliegen einer Fluoreszenz zu überprüfen. Bei Vorliegen einer Fluoreszenz und damit bei Vorliegen eines Tumorverdachts können so weitere Gewebeproben entnommen und ebenfalls kontinuierlich auf Fluoreszenz untersucht werden. Die Entnahme von Proben kann anschließend entweder systematisch oder auch ergebnisorientiert fortgesetzt werden. Während bei systematischer Gewebeentnahme ein um die Hohlnadel zentrierter Gewebebereich am Entnahmeort entnommen wird, kann bei ergebnisorientierter Gewebeentnahme das Herausschälen weiterer Gewebeproben nur in Richtung derjenigen Raumkoordinaten fortgesetzt werden, in denen bei vorherigen Proben eine auf Tumor hinweisende Fluoreszenz festgestellt wurde. Durch Vorgabe gewünschter Grenzwerte mittels einer Eingabevorrichtung kann eine Tumorerkennung über einen Grenz- oder Schwellwert der Fluoreszenzintensität festgelegt werden. Weiterhin kann festgelegt werden, welcher Sicherheitssaum um einen als Tumor erkannten oder unter Tumorverdacht stehenden Gewebebereich mit der Entnahmevorrichtung herausgeschält wird.
Als Ergebnis der Untersuchung der mit Raumkoordinaten versehenen Gewebeproben wird ein dreidimensionales Bild der tumorverdächtigen beziehungsweise Fluoreszenz aufweisenden Gewebeareale erhalten. Auch die gleichzeitige Verwendung verschiedner Marker ist möglich, um komplementäre dreidimensionale Informationen zu liefern.
Wird innerhalb des Detektors zusätzlich zur Intensität des Fluoreszenzlichts eine Aufnahme im normal optischen Bereich durchgeführt, so können auch diese Daten mithilfe des Verfahrens und der Vorrichtung räumlich dargestellt und mit den Fluoreszenzdaten kombiniert werden.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass es softwaregesteuert quasi voll automatisiert durchgeführt werden kann. Das Verfahren selbst kann unabhängig von der Entnahmevorrichtung allein mit Gewebeproben durchgeführt werden, kann aber auch mit der Entnahmevorrichtung gekoppelt werden. Das Verfahren kann parallel zu herkömmlichen zytologischen Untersuchungen durchgeführt werden, da die Proben durch das Verfahren weder verändert noch zerstört werden. Ein zytologischer Befund kann also das mit dem Verfahren gewonnene Bild ergänzen und so zusätzliche diagnostische Aussagen bei der Beurteilung der Gesamtdaten ermöglichen.

Pr: Gewebeprobe
Nd: Hohlnadel
Cy: Drehbarer Innenzylinder
Oe: Öffnung
PU: Entnahmevorrichtung
TU: Zuführungsvorrichtung
Det: Detektor
Ref: Reflektor
SQ: Strahlungsquelle
SN: Sensor
Px: Sensorelement
CPU: Auswerteeinrichtung
SU: Speichereinheit
AV: Ausgabevorrichtung
IN: Eingabevorrichtung
PS: Probenspeicher
Ref: Reflektor
K: Körper

Claims

Verfahren zur Untersuchung von Gewebeproben bei dem, ausgehend von einer Vielzahl von Gewebeproben (Pr), die mit einem systemisch applizierten Fluoreszenzmarker behandelt und den Koordinaten (XY) eines jeweiligen Entnahmeorts zugeordnet sind, die Gewebeproben mit einer elektromagnetischen Strahlung bestrahlt und die Intensität des Fluoreszenzlichts bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden: – Bestrahlen der Gewebeproben (Pr) mit der elektromagnetischen Strahlung, so dass Gewebeproben, die mit dem Fluoreszenzmarker markiert sind, eine Fluoreszenzstrahlung aufzeigen, – Messen der Intensität des Fluoreszenzlichts, – Zuordnung der gemessenen Intensitätswerte zu den Koordinaten (XY), die den Gewebeproben zugeordnet sind und dabei – Erzeugen eines Datensatzes für die Verteilung der Intensität des Fluoreszenzlichts am Entnahmeort.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem aus dem Datensatz ein farblich abgestuftes dreidimensionales Bild über die Verteilung der Fluoreszenzaktivität am Entnahmeort erzeugt und an einer Ausgabevorrichtung (AV) dargestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem aus dem Datensatz ein farblich abgestuftes zweidimensionales Schnittbild in einer einstellbaren Schnittebene erzeugt und an einer Ausgabevorrichtung (AV) dargestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Gewebeproben (Pr) als entlang einer Z-Koordinate langgestreckte Zylinder vorliegen, denen als Koordinaten eine zweidimensionale Ortsinformation in der xy Ebene zugeordnet ist, bei dem die Intensität des Fluoreszenzlichts jeder Gewebeprobe in Abhängigkeit vom Ort ihres Auftretens entlang der Z-Koordinate bestimmt wird, bei dem diese Verteilung der Intensität als dritte Dimension des dreidimensionalen Datensatzes herangezogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Gewebeproben (Pr) auch normaloptisch erfasst, die so gewonnenen normaloptischen Bildinformationen mit den Koordinaten des Entnahmeorts verbunden und in einer 2- oder 3-dimensionalen Darstellung an einer Ausgabevorrichtung (AV) dargestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem Überlagerungsbilder aus den normaloptischen Bildinformationen und der Verteilung der Fluoreszenzaktivität erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei dem bei der Darstellung der Fluoreszenzaktivität alle gemessenen Intensitätswerte unterhalb eines gegebenen Grenzwertes unterdrückt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Grenzwert einstellbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, – bei dem die Gewebeproben (Pr) einer am Entnahmeort gewonnenen abgewickelten Spirale zugeordnet sind, – bei dem jeder Gewebeprobe als Koordinaten eine fortlaufende Probennummer N_P und ein in vorgegebenen Schritten Δα zunehmender Drehwinkel an der Entnahmevorrichtung zugeordnet ist, – bei dem für jede Gewebeprobe eine fortlaufende Spurnummer n berechnet wird, die sich beginnend mit n = 1 nach jeder vollen Umdrehung, wenn der Drehwinkel α_n den Wert von 360° überschreitet, um 1 erhöht, – bei dem aus der Spurnummer n ein Abstand vom Ursprung, – bei dem aus dem Drehwinkel an und der Anzahl der entnommenen Proben pro Spur ein Sektor am Entnahmeort berechnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem zur Fluoreszenzmarkierung zumindest eines der folgenden Mittel eingesetzt werden: – metallorganische Komplexe wie Gadoliniumchelatkomplex und insbesondere Gd(DTPA) – Metalloporphyrine, die oral applizierbar sind – fluoreszenzmarkierte Bakterien, Viren oder Proteine.
Vorrichtung zur Bestimmung von dreidimensionalen Daten aus Gewebeproben (Pr), umfassend – eine Probenentnahmevorrichtung (PU) mit einer Hohlnadel (Nd), die an einem Entnahmeort innerhalb eines biologischen Gewebes zylinderförmige Gewebeproben entnehmen, nach jeder Probenentnahme um einen vorgegebenen Winkel Δα rotieren, im Gewebes spiralförmig voranschreiten kann und so quasikontinuierlich Gewebeproben mit zweidimensionaler Ortszuordnung (XY) liefern kann – eine Strahlungsquelle (SQ), die einen gegebenen Fluoreszenzmarker innerhalb einer Gewebeprobe zur Fluoreszenz anregen kann – einen Detektor (Det), der eine eindimensionale Bestimmung der Intensität des Fluoreszenzlichts, das von der den Fluoreszenzmarker angereichert enthaltenden Gewebeprobe (Pr) ausgestrahlt wird, ermöglicht – eine Auswerteeinheit (CPU), die die zweidimensionale Ortszuordnung der Gewebeproben mit der bestimmten Intensität des Fluoreszenzlichts verknüpft und einen dreidimensionalen Datensatz mit der Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts am Entnahmeort liefert.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der die Probenentnahmevorrichtung (PU) eine Vakuumbiopsieeinrichtung ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, weiterhin umfassend – eine Speichereinheit (SU), – eine Ausgabevorrichtung (AV), umfassend einen Monitor zur bildlichen Darstellung des Datensatzes oder einen Drucker, und/oder – eine Eingabevorrichtung (IN) zur Veränderung von Standardwerten, die bei der Berechnung des Datensatzes verwendet werden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, weiterhin umfassend eine Zuführungseinrichtung (TU) zum quasikontinuierlichen Zuführen der Gewebeproben (Pr) von der Entnahmevorrichtung (PU) zur aus Strahlungsquelle (SQ) und Detektor (Det) bestehenden Detektoreinrichtung.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, bei der der Detektor (Det) ein lichtempfindlicher Punkt-, Zeilen oder Flächensensor (Sn) ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, bei der der Detektor (Det) einen lichtempfindlichen Sensor (Sn) und einen Antrieb umfasst, der eine Relativbewegung zwischen Gewebeprobe (Pr) und Sensor durchführen kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, weiter umfassend eine durch die Hohlnadel (Nd) einführbare Strahlenquelle (SQ) für kurzwelliges Licht zum Erzeugen einer Fluoreszenz am Entnahmeort.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, umfassend eine automatische Steuerung der Gewebeprobenentnahme in Abhängigkeit von der am Entnahmeort gemessenen Fluoreszenzintensität.
Vorrichtung nach Anspruch 19, bei dem die automatische Steuerung so eingerichtet ist, dass Gewebeproben (Pr) ein Drehwinkel α_n und eine mit eins beginnende fortlaufende Spurnummer n zugewiesen wird, und bei dem nur dann eine Gewebeprobe entnommen wird, wenn die Spurnummer n = 1 oder 2 ist oder wenn bei einer vorangehenden Gewebeprobe mit übereinstimmendem Drehwinkel α_n und einer Spurnummer n – x eine Fluoreszenzintensität erfasst wurde, wobei x eine vorgebbare einem Sicherheitssaum entsprechende ganze Zahl ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 20, weiter enthaltend eine durch die Hohlnadel (Nd) einführbare Wärmequelle zur lokalen Applikation von Wärme am Entnahmeort.
Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 20 zur dreidimensionalen Darstellung aller abgetragenen Gewebeteile einschließlich ihrer Fluoreszenzintensität.
Verwendung eines Gadoliniumchelatkomplexes zur Herstellung eines systemischen Mittels zur Fluoreszenzamrkierung von Tumoren und zum Nachweis mittels Fluoreszenz an entnommenen Gewebeproben.
Verwendung von Metalloporphyrinen zur Herstellung eines systemischen Mittels zur Anreicherung in Tumoren und zum Nachweis mittels Fluoreszenz an entnommenen Gewebeproben.
Verwendung von fluoreszenzmarkierten Bakterien, Viren oder Proteinen zur Herstellung eines systemisch applizierbaren Mittels zur Anreicherung in Tumoren und zum Nachweis mittels Fluoreszenz an entnommenen Gewebeproben.