KR101634636B1

KR101634636B1 - 개량형 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체

Info

Publication number: KR101634636B1
Application number: KR1020107017150A
Authority: KR
Inventors: 겐지 우에하라; 히로후미 히구치; 토시히로 나카시마; 다이스케 이시카와; 노부치카 야마모토; 히로타다 후지타; 후미히코 사카이
Original assignee: 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2008-01-11
Filing date: 2009-01-09
Publication date: 2016-06-29
Also published as: CA2711882A1; BRPI0905656B8; CN101918549A; HRP20141110T1; PL2243829T3; EP2243829A1; EP2243829A4; EP2239323A4; EP2239323A1; ES2519047T3; ZA201004770B; DK2243829T3; KR20100110852A; SI2243829T1; AU2009203369B2; AU2009203369A1; BRPI0905656A2; RU2503720C2; BRPI0905656A8; JP5440179B2

Abstract

본 발명은 도너 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체와 비교하여, 활성 및/또는 물성이 개선된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체, 즉 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체, 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체, 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체, 및 그 항체를 사용한, 인간 α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 각종 질병의 예방 또는 치료 수단을 제공한다.

Description

개량형 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체{IMPROVED HUMANIZED ANTI-HUMAN α9-INTEGRIN ANTIBODY}

본 발명은 개량형 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체에 관한 것이다. 상세하게는 인간 α9 인테그린 단백질에 결합해서, α9 인테그린 의존성의 세포접착을 저해하는 활성을 가지며, 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체 Y9A2와 비교해서 활성 및/또는 물성이 개선된 개량형 인간화 Y9A2 항체이다. 당해 인간화 항체는 류머티즘 관절염 등의 자기면역질병, 알러지나 이식편 거부반응 등의 면역질병, 및 기타 α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 각종 질병의 진단, 예방 또는 치료약으로서 기대된다.

인테그린(integrin)은 세포표면 당단백질의 하나로서, 주로 세포외 매트릭스(콜라겐, 라미닌 등)로의 세포접착이나 이뮤노글로불린 패밀리 멤버(ICAM-1, VCAM-1 등)의 수용체로서 기능하고, 세포외 매트릭스로부터의 정보 전달에 관여하는 접착 분자이다. 그에 의해 세포는 세포외 매트릭스로부터 신호를 받고, 분화, 증식, 세포사 등이 유도된다. 인테그린은 α쇄와 β쇄의 2개의 서브 유닛으로 이루어지는 헤테로다이머이고, 서로 다른 α쇄, β쇄가 존재하고, 다양한 조합이 있으며, 인테그린 슈퍼패밀리는 24 종류가 존재한다. 인테그린 녹아웃 마우스는 모든 서브 유닛에서 치사적 혹은 병적이고, 생명 유지에 개개의 인테그린이 필요하다는 것이 시사되고 있다. 이러한 점에서, 주변 환경을 세포에 전달하여 대응을 촉진하는 인테그린은 생명 현상의 모든 장면에서 기능하고 있으며, 여러 가지 병태에 관여하고 있다고 생각된다.

이와 같이 생존에 불가결한 인테그린은 병적 상태에서도 역할을 수행하고 있다고 생각되고, 저해가 병태 개선에 작용하는 케이스가 나타나 있다. 예를 들면, 혈소판에 특이적인 인테그린 αIIbβ3의 저해는 PCTA 재협착 치료약 Abciximab(상품명: ReoPro; Eli Lilly사)로서 인가되어 있다. 또한 α4β1(VLA4) 저해제 Natalizumab(상품명: Antegren; ELAN사)는 다발성 경화증 치료약으로서 인가되어 있다. 또한, αvβ3 저해제 Vitaxin(MEDIMMUNE사)도 그 혈관형성 저해작용, 파골세포 활성화 저해 작용 등으로부터, 현재 치료의 효력이 개선되고 있는 상황에 있다.

인테그린 α9β1은 마크로파지, NKT 세포, 수지상 세포(Dendritic Cell), 호중구에 발현하고 있고, 이들 염증세포의 침윤이나 접착, 뼈흡수 등에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 또 최근, 파골세포의 형성에 있어서 인테그린 α9β1의 관여가 보고되고 있어, 뼈 파괴 관여가 시사되고 있다(비특허문헌 1). 그 리간드로서는 절단형 오스테오폰틴(N 말단 OPN), VCAM-1, Tenascin-C 등이 알려져 있다. 임상에 있어서도, 류머티즘 관절염 환자의 활막조직에 있어서 인테그린 α9β1의 유의한 상승이 인정되고 있다(비특허문헌 2).

따라서, α9 인테그린 단백질에 특이적으로 결합하고, α9 인테그린 의존성 세포접착을 저해하는 활성을 가지는 모노클로널 항체를 개발할 수 있으면, α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 각종 질병의 진단, 예방 또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.

지금까지, 인간 α9 인테그린에 대해서 기능 저해작용을 나타내는 항체로서는, 마우스 모노클로널 항체인 Y9A2(비특허문헌 3), 1K11, 24I11, 21C5 및 25B6(특허문헌 1), 28S1(특허문헌 2)이 보고되고 있다. 이들의 항체는 인간 α9 의존의 세포접착을 억제할 수 있음이 시험관내(in vitro) 실험결과에 의해 나타나고 있지만, 그 중에서도, Y9A2는 오스테오폰틴이나 Tenascin-C 중 어느 것에 대한 세포접착도 저해하고, α9 인테그린에 대한 항체 의약의 후보로서 가장 유망시된다.

그렇다고는 하지만, Y9A2는 마우스에 항원을 면역해서 작제된 마우스 유래의 항체이기 때문에, 안전성(항원성의 야기) 및 유효성(반감기의 단축)의 관점에서, 그대로 인간에게 투여하는 것은 현실적으로 불가능하다. 그래서, Y9A2의 활성을 유지한 채, 인간 항체의 아미노산 서열을 가지는 분자로 바꾸기 위한 개변, 즉, 인간화를 실시할 필요가 있다.

현재, 인간화 항체의 작제법으로서는, 윈터(Winter)들이 고안한 상보성 결정영역(이하, ‘CDR’이라고 표기하는 경우가 있다) 아미노산의 이식을 실시하는 방법(비특허문헌 4)에 의거하는 것이 가장 일반적이다. 여기에서, CDR 아미노산의 도너가 되는 이종항체로부터 CDR의 억셉터가 되는 인간 항체에 대해서, CDR 뿐만 아니라, CDR의 구조유지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있는 CDR 외 아미노산, 소위 프레임워크 영역(이하, 'FR'이라고 표기하는 경우가 있다)도 더불어서 이식하는 것이, 도너 항체가 가지는 본래의 활성을 재현하기 위해서 중요하다는 것도 잘 알려져 있다(비특허문헌 4 및 5).

그러나, CDR 이식에 의거하는 인간화 항체의 작제에 있어서는, 몇개의 과제가 존재한다. 우선 첫째로, 가장 일반적인 과제로서는 도너 항체의 활성 재현에 필요한 FR 아미노산의 선택을 적절하게 수행하였다고 하여도, 항원에로의 친화성이나 생물활성이 도너 항체의 그것을 상회하는 인간화 항체를 얻는 것이 곤란하다는 것을 들 수 있다.

최근, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체가 모노클로널 의약품으로서 다수가 판매되고 있지만, 어느 것에 대해서도 유효 투여량은 체중 1kg당 수 mg으로 매우 다량이다. 그 때문에, 항체 의약품은 고가가 될 수 밖에 없고, 결과적으로 환자의 경제적인 부담이나 의료 비용의 증대를 초래하고 있다. 이 항체 의약의 유효 투여량을 규정하는 주된 요인으로서는 항체의 항원에 대한 친화성이나, 체내에 존재하는 항원의 양을 들 수 있다. 이러한 관점에서, 특히 항체의 항원에 대한 친화성을 향상시키는 것은, 투여량의 저감으로 이어지고, 결과적으로 환자의 경제적인 부담이나 의료 비용의 저감으로도 연결되는 매우 유익한 개량이라고 말할 수 있다.

그래서, 항체의 항원에 대한 친화성 향상을 실현시키기 위해서, 항체의 가변영역 내에 아미노산 치환을 도입하는 방법이 선택되는 것이 많다. 그러나, 항체나 항원이 다르면, CDR 아미노산의 서열이나 입체구조, 항원-항체 상호작용에 관계하는 아미노산의 위치도 변화되기 때문에, CDR과 함께 이식해야 할 FR 아미노산의 위치를 모든 항체에 적용할 수 있는 것으로 규정하는 것은 사실상 불가능하다.

또, 별도의 과제로서, CDR 이식에 의거하는 인간화 항체의 작제에 있어서는, 도너인 마우스 항체의 CDR 아미노산 전부를 주형 인간 항체에 이식하는 것이 일반적이지만, 마우스 항체 유래의 CDR 아미노산 서열은 항원과의 결합에 중요한 한편으로, 인간에 대한 항원성을 나타내는 경우가 있어, 종종 항 이디오 타입 항체를 발생하는 원인이 되는 것을 들 수 있다.

즉, 인간화 항체의 작제에 있어서, 인간에서의 항원성 발생이나 항체의 안정성 저하를 회피하면서, 도너 항체보다도 높은 활성을 부여하기 위해서는, 적절한 억셉터 항체의 선택이나, 치환해야 할 CDR 아미노산 및 FR 아미노산의 선택이 불가결하고, 이들에는 상당한 창의적 연구와 시행착오를 필요로 한다.

WO 2006/075784 WO 2008/007804.

Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21:1657-1665 The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115:1060-1067 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,1996,15:664-672 Science, 239, 1534-1536(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033(1989).

본 발명의 과제는 인간화 항체 작제에 관한 상기의 여러 가지 과제를 극복하고, 도너 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체(Y9A2)와 비교하여, 활성 및/또는 물성이 개선된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 제공하는 것에 있다.

즉, 본 발명은 의학상 또는 산업상 유용한 물질ㆍ방법으로서 하기(1) 내지 (15)의 발명을 포함하는 것이다.

(1) 이하의 어느 것으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(a) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역,

(b) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역, 또는

(c) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역.

(2) 상기 (1)에서, 상기 항체의 중쇄 불변영역이 인간 Igγ1인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(3) 상기 (1)에서, 상기 항체의 경쇄 불변영역이 인간 Igκ인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(4) 상기 (1)에서, 상기 항체의 중쇄 불변영역이 인간 Igγ1이고, 상기 항체의 경쇄 불변영역이 인간 Igκ인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(5) 상기 (1)에서, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(6) 상기 (1)에서, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(7) 상기 (1)에서, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄, 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

(8) 상기 (1)에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(9) 상기 (1)에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(10) 상기 (8)에 기재된 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 (9)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.

(11) 상기 (10)에 기재된 발현벡터가 도입된 숙주세포.

(12) 상기 (11)에 기재된 숙주세포를 배양하여 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 발현시키는 공정을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 생산하는 방법.

(13) 상기 (1) 내지 (7)중 어느 하나에 기재된의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 포함하는 류머티즘 관절염의 치료약.

(14) 상기 (1) 내지 (7)중 어느 하나에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 류머티즘 관절염을 예방 또는 치료하기 위한 방법.

(15) 류머티즘 관절염의 예방 또는 치료용 의약을 제조하는데 있어서, 상기 (1) 내지 (7)중 어느 하나에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 용도.

본 발명에 의해서, 도너 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체와 비교해서 활성 및/또는 물성이 개선된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체가 제공된다. 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 인간 α9 인테그린과 그 복수의 리간드와의 상호작용의 차단을 통해서, 강력한 항염증작용이나 뼈파괴 억제작용을 가지는 것으로, 인간 α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 각종 질병의 예방 또는 치료에 유용하다. 그리고 이러한 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 투여량의 저감, 투여간격의 확대, 투여방법의 개선(예를 들면, 피하 주사제) 등의 임상적용에서의 뛰어난 개선을 제공하여, 치료 유효성 및 환자 컴플리언스의 개선에 크게 기여하는 것이다.

도 1은 마우스 Y9A2 항체의 VH 영역의 아미노산 서열이다.
도 2는 마우스 Y9A2 항체의 VL 영역의 아미노산 서열이다.
도 3은 인간화 Y9A2 항체의 VH의 일례인 RY9A2VHv5를 코딩하는 유전자를 작제하기 위한 올리고 DNA의 구성이다.
도 4는 인간화 Y9A2 항체의 VL의 일례인 RY9A2VLv01를 코딩하는 유전자를 작제하기 위한 올리고 DNA의 구성이다.
도 5는 키메라 Y9A2 항체와 RY9A2v501 항체의 Cell ELISA의 결과이다.
도 6은 키메라 Y9A2 항체와 RY9A2v801 항체의 세포 ELISA 결과이다.

이하에, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체 Y9A2의 인간화 항체의 작제에 있어서 예의 검토를 계속한 결과, Y9A2과 비교해서 활성 및/또는 물성이 유의하게 개선된 3종의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체(이하, '인간화 Y9A2 항체 또는 RY9A2' 라고도 부른다)를 작제하는 것에 성공하였다.

구체적으로는, 본 발명자들은 우선 처음에, 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체 Y9A2(이하, '마우스 Y9A2 항체'라고도 한다)의 중쇄 가변영역(이하, 'VH'라고도 한다) 및 경쇄 가변영역(이하, 'VL'이라고도 한다)의 CDR 아미노산 서열 및 몇 개의 FR 아미노산을 주형 인간 항체에 이식하고, 마우스 Y9A2 항체와 동일 정도의 활성을 갖는 2종의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체 RY9A2v501 및 RY9A2v801을 작제하였다. CDR은 캐버트(Kabat)들에 의한 분류(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC,1987)에 따라서 결정하였다. RY9A2v501 및 RY9A2v801의 VH의 아미노산 서열은 각각, 서열번호 5 및 서열번호 7이다. 여기에서, RY9A2v801의 VH는 RY9A2v501의 VH의 마우스 Y9A2 항체 유래의 FR 아미노산 잔기 중 4개의 아미노산 잔기를 대응하는 주형 인간 항체 아미노산으로 치환한 것이다. 양쪽 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 9로 나타내는 것으로, 양쪽 항체 공통이다.

다음에, 본 발명자들은 인간화 항체에서의 항원성 발생의 위험성이나 항체의 보존 안정성의 저하를 회피하면서, 인간 α9 인테그린에 대한 오리지날인 마우스 Y9A2 항체보다도 높은 친화성을 가지는 인간화 항체를 작제하기 위해서, 상기의 2종의 인간화 항체의 VH 및 VL의 CDR 중의 아미노산 서열의 치환을 검토하였다. 그 결과, 이하에 나타내는 3종의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체가 오리지날인 마우스 Y9A2 항체와 비교해서 유의하게 개선된 활성 및/또는 물성을 가지는 것임을 확인하였다.

1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

2) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역, 및 서열번호17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

3) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함한, 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.

본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 본 원 명세서에 개시되는 그 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 서열정보에 의거해 해당분야에서 공지의 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 작제될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 인간화 항체의 중쇄 가변영역 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가지는 중쇄 가변영역 유전자 단편, 및 본 발명의 인간화 항체의 경쇄 가변영역 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가지는 경쇄 가변영역 유전자 단편을 작제한다. 그리고 이 가변영역 유전자를 인간 항체의 적당한 클래스의 불변영역 유전자와 연결시켜서 인간화 항체 유전자를 작제한다. 이어서, 이 인간화 항체 유전자를 적당한 발현벡터에 연결하고, 배양세포 중에 도입한다. 마지막으로, 이 배양세포를 배양해서 배양 상청액으로부터 인간화 항체를 얻을 수 있다.

상기 본 발명의 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산을 코딩하는 각 가변영역 유전자 단편은 예를 들면 그 중쇄 및 경쇄 가변영역의 염기서열 또는 그 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열에 의거하여 디자인된 염기서열에 의거해서, 당해 분야에서 공지의 유전자 합성방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성방법으로서는 WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성방법 등의 당업자에 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 항체의 가변영역 유전자 단편을 일단 취득하면, 이 유전자 단편의 소정부위에 돌연변이를 도입하는 것에 의해서, 본 발명의 다른 항체를 취득하는 것도 가능하다. 이러한 돌연변이 도입방법으로서는 부위 특이적 변이유발법(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 8.1-8.5) 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.

이어서, 상기 가변영역 유전자 단편과 인간 항체의 불변영역 유전자를 연결시켜 인간화 항체 유전자를 작제한다. 사용되는 인간 항체의 불변영역은 어떠한 서브클래스의 불변영역(예를 들면, 중쇄로서 γ1, γ2, γ3 또는 γ4, 경쇄로서 λ 또는 κ쇄의 불변영역)도 선택 가능하지만, 바람직하게는, 중쇄 불변영역으로서는 인간　Igγ1을, 또한 경쇄 불변영역으로서는 인간 Igκ를 사용할 수 있다.

이 인간화 항체 유전자의 작제에 계속되는 인간화 항체 유전자의 발현벡터에로의 도입, 발현벡터의 배양세포에로의 도입, 배양세포의 배양, 항체의 정제 등에 대해서는, 당해 분야에서 공지의 여러 가지의 방법을 사용하거나, 혹은, WO2007/139164 또는 WO2003/027151에 기재된 인간화 항-인간 오스테오폰틴 항체의 작제 방법을 참조해서 실시할 수 있다.

상기한 바와 같이 해서 수득된 인간화 항체 유전자와 연결되는 발현벡터로서는, 국제공개 공보 WO94/20632에 기재된 AG-γ1이나 AG-κ 등의 발현벡터를 사용할 수 있지만, 인간화 항체 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 특별하게 제한되지 않는다. 또, 발현벡터로서 AG-γ1 또는 AG-κ 등의 미리 인간 Ig 불변영역 유전자를 가지는 것을 이용하면, 이것에 인간화 항체 가변영역 유전자를 삽입하는 것 만으로 인간화 항체 유전자를 가지는 발현벡터가 되기 때문에 바람직하다. 또, 발현벡터에 있어서는 항체의 세포외로의 분비 발현을 촉진하기 위한 리더서열을 사용할 수도 있다. 이러한 리더서열로서는 Y9A2에 유래하는 리더서열이나, 다른 항체(예를 들면, WO2007/139164에 기재된 인간화 항-오스테오폰틴 항체) 유래의 리더서열을 사용할 수 있다.

상기의 발현벡터는 예를 들면, FreeStyle 293 Expression system (Invitrogen), 인산 칼슘법 등의 사용에 의해, 배양세포 중에 도입된다.

발현벡터를 도입하는 배양세포로서는 예를 들면, 293 세포, CHO-DG44 세포 등의 배양세포를 사용할 수 있고, 이것을 통상의 방법에 의해 배양할 수 있다.

상기 배양 후, 배양 상청액 중에 축적된 항체는 각종 칼럼 크로마토그래피, 예를 들면 단백질 A칼럼을 사용한 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

수득된 인간화 항체의 인간 α9 인테그린에 대한 결합활성을 측정하는 방법으로서는 ELISA나 FACS 등의 방법이 있다. 예를 들면 ELISA를 사용하는 경우, α9 인테그린을 발현시킨 세포(예를 들면, SW480 세포)를 ELISA플레이트에 고정화하고, 이것에 대해서 인간화 항체를 첨가해서 반응시킨 후, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 등의 효소로 표지한 인간 IgG 항체 등의 2차 항체를 첨가해서 반응시키고, 세정한 후, 발색기질(예를 들면, HRP 표지인 경우, TMB)을 첨가해서 흡광도를 측정한다.

수득된 인간화 항체가 인간 α9 인테그린에 대한 기능 저해활성을 가지고 있는 것인지 아닌지를 평가하는 방법으로서는, 예를 들면 문헌[J. Biol. Chem., 274: 36328-36334, 1999]에 기재된 인간 오스테오폰틴 분자에 대한 인간 α9 인테그린 분자의존성 세포접착의 저해시험에 의해 확인할 수 있다. 즉, α9의 리간드의 하나인 N-말단 OPN(오스테오폰틴이 트롬빈에 의해 절단된 후의 N-말단측 프래그먼트; 이하, 'nOPN'으로 표기하는 경우가 있다)의 RAA 변이체(다른 인테그린과의 반응을 억제하기 위해서 RGD 서열을 RAA로 개변한 것; 이하, 'nOPN-RAA'라고 표기하는 경우가 있다)를 플레이트에 고정화하고, 블록킹을 실시한다. 각종 인간화 항체를 첨가한 후, α9 발현세포를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션한다. 세포를 크리스탈 바이올렛과 메탄올을 사용해서 고정ㆍ염색하고, 세정후, 접착한 세포 중의 색소를 Triton X-100으로 추출하고, 파장 595nm에서의 흡광도를 측정한다.

또, 수득된 인간화 항체가 인간 α9 인테그린에 대한 기능 저해활성을 가지고 있는지의 여부를 더 상세하게 평가하는 방법으로서는, 예를 들면 문헌[Molecular Biology of the cell, 12:3214-3225, 2001]에 기재된 세포 유주 저해시험에 의거하는 방법을 들 수 있다. 즉, nOPN-RAA를 트랜스 웰의 상층에 고정화한 후에 플레이트에 장착하고, 그 후 10%FCS를 포함한 F15배지를 하층에 첨가한다. 상층에 α9 발현세포와 함께 인간화 항체를 첨가하고, 37℃에서 16시간 인큐베이션한다. 그 후에 트랜스 웰의 하층에 유주해 온 세포를, 예를 들면, QCM 화학주성 세포유주 24-웰 분석 키트(Millipore사)를 사용하여 정량화한다.

본 발명의 3종의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 당해 분야에서 공지의 방법을 사용하여, 서열번호 11, 13 또는 15의 VH 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 및 서열번호 17 또는 9의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 합성하고, 이들을 적당한 클래스의 인간 항체 불변영역 유전자, 바람직하게는 중쇄에 대해서는 인간 Igγ1 불변영역 유전자, 경쇄에 대해서는 인간 Igκ 불변영역 유전자와 연결해서 인간 항체 유전자를 구축하고, 당해 분야에서 공지의 여러 가지의 방법 혹은 WO02/081522 또는 WO03/027151에 기재된 방법 등을 사용하여, 그 인간화 항체 유전자를 발현벡터에 도입하고, 그 발현벡터를 배양세포에 도입해서 그 배양세포를 배양하고, 수득되는 배양물로부터 항체를 정제하는 것에 의해서, 용이하게 취득할 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 11, 13 또는 15의 VH 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 각각 서열번호 12, 14 또는 16의 염기서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 17 또는 9의 VL 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 각각 서열번호 18 또는 10의 염기서열을 포함한다.

서열번호 11의 중쇄 가변영역과 인간 Igγ1 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 중쇄는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄이다. 서열번호 17의 경쇄 가변영역과 인간 Igκ 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 경쇄는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄이다. 바람직하게는, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 중쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 20의 염기서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 경쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 26의 염기서열을 포함한다. 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄와, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 본 발명의 인간화 항 α9 인테그린 항체로서는 후기하는 실시예의 RY9A2v12 (M34L) 012 항체를 들 수 있다.

서열번호 13의 중쇄 가변영역과 인간 Igγ1 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 중쇄는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄이다. 서열번호 17의 경쇄 가변영역과 인간 Igκ 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 경쇄는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄이다. 바람직하게는, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 중쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 22의 염기서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 경쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 26의 염기서열을 포함한다. 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄와, 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 본 발명의 인간화 항 α9 인테그린 항체로서는 후기하는 실시예의 RY9A2v11 (M34L) 012 항체를 들 수 있다.

서열번호 15의 중쇄 가변영역과 인간 Igγ1 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 중쇄는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄이다. 서열번호 9의 경쇄 가변영역과 인간 Igκ 불변영역을 연결해서 수득되는 본 발명의 바람직한 인간화 항체 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄이다. 바람직하게는, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 중쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 24의 염기서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 인간화 항체 경쇄를 코딩하는 DNA는 서열번호 28의 염기서열을 포함한다. 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄와, 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 본 발명의 인간화 항 α9 인테그린 항체로서는 후기하는 실시예의 RY9A2v05 (IAW) 01 항체를 들 수 있다.

이렇게 해서 수득된 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 필요에 의해 추가로 정제된 후, 통상의 방법에 따라서 제제화되어, 류머티즘 관절염 등의 자기면역질병, 알러지, 이식편 거부반응 등의 면역질병, 골다공증, 만성폐색성 폐질환, 암 등의 α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 질병의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 바람직하게는, 류머티즘 관절염 치료제로서 사용할 수 있다. 이것들의 치료제의 제형의 예로서는 주사제, 점적용제 등의 비경구제로 할 수 있고, 정맥내 투여, 피하투여 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 또한 제제화 시에는 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.

상기 제제화 시에, 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 첨가량은 환자의 증상 정도, 연령이나 사용하는 제제의 제형 혹은 항체의 결합 역가 등에 의해 다르지만, 예를 들면 0.1mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그것을 포함하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 발현벡터는 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주세포 중에서 본 발명의 인간화 항체 혹은 그 중쇄 또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자를 발현하고, 이들 폴리펩티드를 생산할 수 있는 것이라면 특별하게 제한되지 않는다. 예를 들면 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자, 및 당해 유전자에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 세균 중에서 본 발명의 인간화 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로서는 숙주가 에쉐리키아(Escherichia) 속 균의 경우, 예를 들면 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서 인간화 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들면 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAp 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 숙주가 바실루스속 균의 경우에는, SL01 프로모터, SP02 프로모터, penp 프로모터 등을 들 수 있다. 또 숙주가 포유 동물세포 등의 진핵세포인 경우, β액틴 프로모터, CAG 프로모터(Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991), SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 열 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 본 발명의 발현벡터는 개시코돈, 중지코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 추가로 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우, 본 발명의 발현벡터는 개시코돈, 중지코돈을 포함할 수 있다. 또한 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 인간화 항체 혹은 그 중쇄 또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 스플리싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함할 수도 있다. 또, 목적에 따라서 통상 사용할 수 있는 선택 마커(예를 들면, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디하이드로 엽산 환원효소 유전자)을 포함할 수도 있다.

또, 본 발명은 본 발명의 인간화 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 제공한다. 이러한 형질전환체는 예를 들면 본 발명의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 것에 의해 작제할 수 있다. 형질전환체의 작제에 사용할 수 있는 숙주세포로서는 상기의 발현벡터에 적합하고, 형질전환될 수 있는 것이라면 특별하게 한정되지 않고, 본 발명의 기술분야에 있어서 통상 사용되는 천연세포 혹은 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들면, 세균(에쉐리키아속 균, 바실루스(Bacillus)속 균), 효모(사카로마이세스(Saccharomyces)속, 피치아속 등), 동물세포 또는 곤충세포(예를 들면, Sf9) 등)이 예시된다. 형질전환은 자체 공지방법에 의해 수행될 수 있다.

또, 본 발명은 본 발명의 인간화 항체 혹은 그 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자를 숙주세포에 발현시키는 것, 즉 이러한 형질전환체를 사용하는 것을 포함하는 본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 생산방법을 제공한다. 바람직하게는, 그 방법에서 사용되는 숙주세포는 본 발명의 발현벡터가 도입되어 있고, 그 발현벡터는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 따로 또는 동시에 포함할 수도 있다.

본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 생산에 있어서, 형질전환체는 영양배지 중에서 배양될 수 있다. 영양배지는 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 혹은 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는 예를 들면 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기질소원 혹은 유기질소원으로서는 예를 들면 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스팁 리커, 펩톤, 카세인, 고기엑스, 콩깻묵, 포테이토 추출액 등이 예시된다. 또 소망에 의해 다른 영양소(예를 들면, 무기염(예를 들면 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생물질(예를 들면 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 포함할 수도 있다.

형질전환체의 배양은 자체 공지방법에 의해 수행된다. 배양조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH 및 배양시간은 적당하게 선택된다. 예를 들면 숙주가 동물세포인 경우, 배지로서는, 약 5∼20%의 태아소혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, Vol. 122, p.501, 1952), DMEM 배지(Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199 배지(proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6∼8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼72시간 이루어지고, 필요에 따라서 통풍이나 교반을 수행할 수도 있다. 숙주가 곤충세포인 경우, 예를 들면, 태아소혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p.8404, 1985) 등을 들 수 있고, 그 pH는 약 5∼8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20∼40℃에서 15∼100시간 이루어지고, 필요에 따라서 통풍이나 교반을 수행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들면 상기 영양원을 함유하는 액체배지가 적당하다. 바람직하게는, pH가 5∼8인 배지이다. 숙주가 E.coli인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(Miller 들, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은 필요에 의해 통풍, 교반하면서, 통상 14∼43℃, 약 3∼24시간 실시할 수 있다. 숙주가 Bacillus속 균인 경우, 필요에 의해 통풍, 교반을 하면서, 통상 30∼40℃, 약 16∼96시간 실시할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들면 Burkholder 최소배지(Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980) 를 들 수 있고, pH는 5∼8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 이루어지고, 필요에 의해 통풍이나 교반을 수행할 수도 있다.

본 발명의 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 상술한 바와 같은 형질전환체를 배양하고, 그 형질전환체로부터 회수, 바람직하게는 분리, 정제할 수 있다. 분리, 정제 방법으로서는 예를 들면 염석, 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영동 등 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피나 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거해 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

시판 키트 혹은 시약을 사용한 부분에 대해서는, 특별히 기재하지 않는 한 첨부된 프로토콜에 따라서 실험을 실시하였다.

<<실시예 1: 마우스 Y9A2 항체 가변영역 서열의 결정 및 키메라 Y9A2 항체의 작제>>

마우스 Y9A2 항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 유전자를 결정하고, VH 유전자를 인간 Igγ1 유전자에, VL 유전자를 인간 Igκ 유전자에 연결해서 마우스-인간의 키메라 항체(이하, '키메라 Y9A2 항체'라고도 부른다)를 작제하였다. 순서는 하기한 바와 같다.

우선, 샌프란시스코에 위치한 캘리포니아 대학(UCSF)에서 제공된 마우스 Y9A2 항체 생산 하이브리도마로부터 TRIzol 시약(인비트로젠사)을 사용해서 RNA를 추출하였다. 이 RNA를 주형으로 하고, 랜덤 프라이머(Random Primer) 및 SuperScript III 역전사효소(모두, 인비트로젠사)를 사용해서 cDNA를 합성하였다. 다음에 이 cDNA를 주형으로 사용하고, 캐버트(Kabat)들에 의한 V 영역 및 J 영역의 서열 분류(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC,1987)를 참조해서 디자인한 리더영역에 대한 프라이머와 J 영역에 대한 프라이머를 사용하여, Ex Taq DNA 폴리머라아제(다카라바이오사)로 VH 유전자 단편을 증폭하였다. 여기에서 사용한 상기 리더영역에 대한 프라이머와 J 영역에 대한 프라이머에는, 각각 HindIII 인식서열과 BamHI 인식서열이 부가되어 있다. VL에 관해서도 VH의 경우와 마찬가지로, 리더서열에 합치하는 프라이머와 J 영역에 합치하는 프라이머를 사용하여 VL 유전자 단편을 얻었다.

이렇게 하여 얻은 VH, VL 유전자 단편을 HindIII와 BamHI(모두, 다카라바이오사)로 소화시키고, 각각을 발현벡터인 AG-γ1, AG-κ(WO94/20632)와 연결하였다. AG-γ1은 β액틴 프로모터, 인간 면역글로불린 불변영역 γ1쇄의 유전자 및 선택 마커로서의 네오마이신 내성유전자(neo)을 가지고, γ1 유전자의 상류에 있는 HindIII 인식서열과 BamHI 인식서열 사이에 마우스 Y9A2 항체 VH 유전자를 삽입하는 것에 의해, 키메라 Y9A2 항체의 중쇄를 발현하는 플라스미드가 된다. AG-κ는 β액틴 프로모터, 인간 면역글로불린 불변영역 κ쇄의 유전자 및 선택 마커로서의 디하이드로 엽산 환원효소(dhfr)유전자를 가지고, 동일하게 κ유전자의 상류에 있는 HindIII 인식서열과 BamHI 인식서열 사이에 마우스 Y9A2 항체 VL 유전자를 삽입하는 것에 의해, 키메라 Y9A2 항체의 경쇄를 발현하는 플라스미드가 된다.

이들 발현 플라스미드를 통상의 방법에 의해 대장균에 도입해서 형질전환 클론을 얻고, 그것으로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN사)을 사용해서 플라스미드 DNA를 민들었다. 수득된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여, GenomeLab DTCS-Quick Start Kit 및 CEQ2000 오토시퀀서(모두, BECKMAN COULTER사)를 사용하여, 클로닝되어 있는 VH 및 VL의 염기서열을 해독하였다. 당해 VH 및 VL의 염기서열을 각각 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타냈다. 수득된 서열을 바탕으로 결정한 VH 및 VL의 아미노산 서열을 각각, 도 1 및 도 2에 나타냈다. 또한 각각을 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타냈다.

상기 대장균 클론을 대량 배양하고, EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN사)를 사용해서 키메라 Y9A2 항체의 중쇄 발현 플라스미드 및 경쇄 발현 플라스미드를 정제하고, 그들을 혼합하고, FreeStyle 293 발현 시스템(인비트로젠사)을 사용해서 세포에 도입하는 것에 의해, 키메라 Y9A2 항체를 일과성으로 발현시켰다. 수득된 배양 상청액에 포함되는 키메라 Y9A2 항체 농도를, 염소 유래 항-인간 IgG Fc 항체(CAPPEL사)와 단백질 A-HRP(ZYMED사)를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 이때, 시판중인 인간 IgG1 항체(Biogenesis사)의 희석 계열을 작제하고, 그것을 표준시료로 하였다. 다음에, 상기 배양 상청액 중의 키메라 Y9A2 항체를 단백질A 칼럼(GEhealth kea사)을 사용해서 친화성 정제하고, 정제 키메라 Y9A2 항체를 얻었다. 정제 키메라 Y9A2 항체의 농도는 파장 280 nm에서의 흡광도가 1.4의 경우에 1mg/㎖로 산출하였다.

<<실시예 2: 키메라 Y9A2 항체의 세포접착 저해시험>>

전항에 기재된 방법에 의해 제조한 정제 키메라 Y9A2 항체에 대해서, 마우스 Y9A2 항체(CHEMICON INTERNATIONAL사)와의 활성을 비교하기 위해서, 문헌[J. Biol. Chem., 274: 36328-36334, 1999]에 기재된 세포접착 저해시험을 실시하였다. 즉, 우선 오스테오폰틴이 트롬빈에 의해 절단되어서 발생하는 N 말단측의 단편(nOPN)에 포함되는 RGD 서열을 RAA로 치환한 변이체(nOPN-RAA)를 고정화하고, 블록킹을 실시한 후, 마우스 Y9A2 항체 또는 정제 키메라 Y9A2 항체를 첨가하였다. 계속해서, 인간 α9 인테그린 분자를 발현시킨 SW480 세포(이하, 'SW480/hα9 세포' 라고 표기하는 경우가 있다)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그 후에 크리스탈 바이올렛과 메탄올을 사용해서 고정ㆍ염색하고, 세정 후, 접착한 세포 중의 색소를 Triton X-100으로 추출하고, 파장 595 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이, 마우스 Y9A2 항체 및 정제 키메라 Y9A2 항체는 거의 동일 IC50이고, nOPN-RAA에 대한 SW480/hα9 세포의 접착을 저해하는 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. IC50은 항 α9 인테그린 항체를 첨가하지 않을 경우에 발생하는 세포접착의 레벨을 기준으로 하였을 때에, 그것을 50% 억제하는 항 α9 인테그린 항체의 농도로서 정의된다.

<<실시예 3: 인간화 Y9A2 항체 유전자의 작제>>

마우스 Y9A2 항체의 VH 및 VL 중의 상보성 결정영역(CDR) 아미노산의 이식처가 되는 주형 인간 항체는, 마우스 Y9A2 항체의 VH, VL의 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열에 대해서, 그것들과 상동성이 높은 아미노산 서열을 가지는 인간 항체의 배선(germline) 중에서 선택하였다. 구체적으로는, 주형 인간 VH로서는 DP-88에 JH6을 조합시킨 것, 주형 인간 VL로서는 DPK-1에 Jκ4을 조합시킨 것을 선택하였다.

상기의 주형 인간 항체 VH 및 VL의 FR에, 마우스 Y9A2 항체의 VH 및 VL로부터 필요한 아미노산 서열을 이식해서 인간화 항체를 작제하였다. 구체적으로는, 우선 VH에 대해서는, 전술한 주형 인간 항체 VH의 CDR 아미노산 서열 및 FR 아미노산의 수개 부위를 마우스 Y9A2 항체의 VH 중이 대응하는 아미노산 서열로 치환하고, 2 종류의 인간화 Y9A2 항체의 VH, 즉, RY9A2VHv5 및 RY9A2VHv8의 아미노산 서열을 디자인(각각, 서열번호 5 및 서열번호 7)하고, 추가로 그것들의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 염기서열을 디자인(각각, 서열번호 6 및 서열번호 8)하였다. RY9A2VHv8에서는 RY9A2VHv5에서의 마우스 Y9A2 항체 유래의 FR 아미노산 잔기 중의 4개가 주형 인간 항체의 것으로 치환되어 있다.

VL에 대해서는, 전술한 주형 인간 항체 VL의 CDR 아미노산 서열을 마우스 Y9A2 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열로 치환하고, 인간화 Y9A2 항체의 VL인 RY9A2VLv01의 아미노산 서열을 디자인(서열번호 9)하고, 추가로 그 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 염기서열을 디자인(서열번호 10)하였다.

상기의 RY9A2VHv5, RY9A2VHv8 및 RY9A2VLv01을 코딩하는 DNA 단편을 작제하기 위해서, 올리고 DNA를 재료로 한 PCR에 의한 전체 합성을 실시하였다. 구체적으로는, RY9A2VHv5에 대해서는 각각 도 3에 나타내는 바와 같이, VH의 전장을 커버하도록 6 종류의 올리고 DNA(서열번호 29∼34에 기재)로 나누어서 합성하고, 그것들을 사용해서 다음 순서에서 PCR를 실시하였다. 즉, 우선 6 종류의 올리고 DNA를 각각 등량 혼합한 것을 주형으로 하고, Pyrobest DNA 폴리머라아제(다카라바이오사)를 사용하여, 96℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 3분의 스텝을 15사이클 반복하였다. 다음에, 이 PCR 산물의 1㎕을 주형으로 사용하고, 도 3의 굵은 문자표기 부분의 서열을 가지는 올리고 DNA(서열번호 35 및 36에 기재)를 프라이머로 하고, Pyrobest DNA 폴리머라아제를 사용하여, 96℃에서 20초, 72℃에서 2분의 스텝을 25사이클 반복하는 것에 의해, VH의 전장을 증폭하였다. RY9A2VHv8에 대해서도, 대체로 동일한 방법으로 작제하였다.

RY9A2VLv01의 작제의 경우에는, 도 4에 나타낸 6개의 올리고 DNA(서열번호 37∼42에 기재)를 사용하여, 상기와 동일하게 15사이클의 PCR를 실시한 후, 그 증폭 산물을 주형으로 사용하고, 도 4의 굵은문자 표기 부분의 서열을 가지는 올리고 DNA(서열번호 43 및 44에 기재)을 프라이머로 하고, 상기와 동일한 25사이클의 PCR를 실시하는 것에 의해, VL의 전장을 증폭하였다.

상기의 VH, VL 모두, 항체의 리더서열로서는 WO2007/139164에 기재된 인간화 항-오스테오폰틴 모노클로널 항체와 동일한 것을 사용하였다. 또, 수득된 DNA 단편의 양단에는 클로닝을 위한 HindIII 인식서열 및 BamHI 인식서열이 부가되어 있다.

이렇게 하여 얻은 VH 및 VL의 DNA 단편을 제한효소 HindIII 및 BamHI로 소화하고, 각각 전술한 발현벡터 AG-γ1, AG-κ와 연결해서 종래법에 의해 대장균에 도입해서 클로닝하고, 수득된 대장균 클론으로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN사)를 사용해서 플라스미드 DNA를 제조하였다. 수득된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 GenomeLab DTCS-Quick Start Kit를 및 CEQ2000 오토시퀀서(모두, BECKMAN COULTER사)를 사용하여, 클로닝되어 있는 VH 및 VL의 염기서열을 해독하는 것에 의해, 디자인한 바와 같은 염기서열을 가지는 클론을 얻었다. 이것들의 클론을 배양하고, EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN사)를 사용하여, 중쇄, 경쇄의 발현 플라스미드를 정제하였다.

정제한 중쇄 발현 플라스미드, 경쇄 발현 플라스미드를 혼합하고, FreeStyle 293 발현 시스템을 사용해서 세포에 도입하고, 항체를 일시적으로 발현시켰다. 이때, RY9A2VHv5를 삽입한 중쇄 발현 플라스미드와, RY9A2VLv01을 삽입한 경쇄 발현 플라스미드를 조합시켰을 경우에 발현하는 인간화 Y9A2 항체를 RY9A2v501 항체라고 명명하고, RY9A2VHv8을 삽입한 중쇄 발현 플라스미드와, RY9A2VLv01을 삽입한 경쇄 발현 플라스미드를 조합시켰을 경우에 발현하는 인간화 Y9A2 항체를 RY9A2v801 항체라고 명명하였다.

배양 상청액 중에 축적된 각 인간화 Y9A2 항체의 농도의 측정 및, 배양 상청액으로부터의 정제 항체의 취득은 전술한 키메라 Y9A2 항체의 경우와 동일한 방법으로 실시하였다.

<<실시예 4: 인간화 Y9A2 항체의 인간 α9 인테그린에 대한 결합성 확인>>

전술한 방법으로 발현시킨 RY9A2v501 항체, RY9A2v801 항체에 대해서, 인간 α9 인테그린 분자에 대한 결합성을 Cell ELISA법에 의해 키메라 Y9A2 항체(이하, 'cY9A2 항체'라고 표기하는 경우가 있다)와 비교하였다. 즉, 인간 α9 인테그린 분자를 발현시킨 SW480 세포를 ELISA 플레이트에 고정화하고, 그것에 대해서 상기 cY9A2항체 또는 RY9A2v501 항체 또는 RY9A2v801 항체를 반응시킨 후, 2차 항체로서 HRP 표지 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(American Qualex사)를 반응시키고, TMB를 첨가해서 발색 시킨 후, 희석 황산을 첨가해서 반응을 정지시키고, 파장 450nm에서의 흡광도를 조사하였다. 그 결과, 도 5 및 도 6에 나타내는 바와 같이 RY9A2v501 항체 및 RY9A2v801 항체는 cY9A2 항체와 동등한 인간 α9 인테그린 분자 결합성을 가지는 것을 확인하였다.

<<실시예 5: 인간화 Y9A2 항체의 세포접착 저해시험>>

상기의 정제 RY9A2v501 항체, 정제 RY9A2v801 항체 및 마우스 Y9A2 항체에 대해서, 실시예 2에 기재된 동일한 순서로 세포접착 저해시험을 실시하였다.

그 결과를 표 2에 나타냈다. IC50(㎍/㎖)은 항 α9 인테그린 항체를 첨가하지 않을 경우에 발생하는 세포접착의 레벨을 기준으로 하였을 때에, 그것을 50% 억제하는 항 α9 인테그린 항체의 농도로서 정의된다. 마우스 Y9A2 항체의 IC50값의 평균값은 0.070㎍/㎖이었다. 표 2에는 마우스 Y9A2의 IC50값을 1로 하였을 경우의 인간화 항체의 비활성을 나타낸다. 표 2에 2번의 시험의 평균값을 나타냈다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 상기 2종의 인간화 항체는 마우스 Y9A2 항체와 동등한 세포접착 저해활성을 가지는 것이 확인되었다.

<<실시예 6: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 작제>>

상기한 바와 같이, 오리지날인 마우스 Y9A2 항체와 동일 정도의 세포접착 저해활성을 가지는 2종의 인간화 Y9A2 항체(RY9A2v501 항체, RY9A2v801 항체)을 취득할 수 있었기 때문에, 다음에, 본 발명자들은 이것들의 인간화 항체를 기초로 돌연변이 도입을 수행하는 것에 의해서, 인간화 Y9A2 항체의 새로운 개량을 시도하였다.

본 발명자들에 의한 거듭된 예의 검토의 결과, 마우스 Y9A2 항체보다도 유의하게 우수한 활성을 가지는 인간화 Y9A2 항체로서, 이하의 3종의 항체, RY9A2v12 (M34L) 012 항체, RY9A2v11 (M34L) 012 항체 및 RY9A2v5(IAW)01 항체를 작제하는 것에 성공하였다.

1. RY9A2v12 (M34L) 012 항체

RY9A2v12 (M34L) 012 항체의 중쇄 가변영역(VH)은 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변영역(VL)은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는다. RY9A2v12 (M34L) 012 항체의 VH 및 VL의 염기서열은 각각 서열번호 12 및 18에 나타낸다. RY9A2v12 (M34L) 012 항체의 VH는 상기 RY9A2VHv8(서열번호 7)의, CDR1 중의 메티오닌 잔기(VH 아미노산 서열의 34번째의 아미노산 잔기)의 로이신에로의 치환, 및 CDR2 중의 리신 잔기 및 아스파라긴산 잔기(VH 아미노산 서열의 65번째 및 66번째의 아미노산 잔기)의 각각 글루타민 및 글리신에로의 치환을 가지는 것이다. RY9A2v12 (M34L) 012 항체의 VL은 상기 RY9A2VLv01(서열번호 9)의, CDR1 중의 리신 잔기(VL 아미노산 서열의 24번째의 아미노산 잔기)의 아르기닌에로의 치환을 가지는 것이다.

2. RY9A2v11 (M34L) 012 항체

RY9A2v11 (M34L) 012 항체의 VH는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지고, VL은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는다. RY9A2v11 (M34L) 012 항체의 VH 및 VL의 염기서열은 각각 서열번호 14 및 18에 나타낸다. RY9A2v11 (M34L) 012 항체의 VH는 상기 RY9A2VHv5(서열번호 5)의, CDR1 중의 메티오닌 잔기(VH 아미노산 서열의 34번째의 아미노산 잔기)의 로이신에로의 치환, 및 CDR2 중의 리신 잔기 및 아스파라긴산 잔기(VH 아미노산 서열의 65번째 및 66번째의 아미노산 잔기)의 각각 글루타민 및 글리신에로의 치환을 가지는 것이다. RY9A2v11 (M34L) 012 항체의 VL은 상기 RY9A2VLv01(서열번호 9)의, CDR1 중의 리신 잔기(VL 아미노산 서열의 24번째의 아미노산 잔기)의 아르기닌에로의 치환을 가지는 것이다.

3. RY9A2v5(IAW)01 항체

RY9A2v5(IAW)01 항체의 VH는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지고, VL은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는다. RY9A2v5(IAW)01 의 VH 및 VL의 염기서열은 각각 서열번호 16 및 10에 나타낸다. RY9A2v5(IAW)01 항체의 VH는 상기 RY9A2VHv5(서열번호 5)의, CDR1 중의 메티오닌 잔기(VH 아미노산 서열의 34번째의 아미노산 잔기)의 이소로이신에로의 치환, 및 CDR3 중의 아스파라긴산 잔기 및 페닐알라닌 잔기(VH 아미노산 서열의 104번째 및 105번째의 아미노산 잔기)의 각각 알라닌 및 트립토판에로의 치환을 가지는 것이다. RY9A2v5(IAW)01 항체의 VL은 상기 RY9A2VLv01(서열번호 9)과 같다.

상기 3종의 개량형 인간화 Y9A2 항체의 VH 및 VL의 DNA 단편을 상술한 것과 동일하게 발현벡터 AG-γ1, AG-κ와 연결해서 발현 플라스미드를 작제하고, FreeStyle 293 발현 시스템을 사용해서 발현시키고, 상술한 것과 동일하게 단백질A 칼럼을 사용해서 배양 상청액으로부터 각각의 정제 항체를 취득하였다.

<<실시예 7: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 인간 α9 인테그린에 대한 결합성 확인>>

상기한 바와 같이 작제한 3 종류의 인간화 Y9A2 항체 및 cY9A2 항체에 대해서, 실시예 4와 동일하게 하여, CELL ELISA에 의해 인간 α9 인테그린에 대한 결합성의 확인을 실시하였다. 그 결과, 개량형 인간화 Y9A2 항체는 어느 것이나 키메라 Y9A2 항체와 동일하게, 인간 α9 인테그린에 대한 결합성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

<<실시예 8: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 인간 nOPN에 대한 세포접착 저해시험>>

3 종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체에 대해서, 마우스 Y9A2 항체와의 활성을 비교하기 위해서, 실시예 2에 기재된 동일한 순서로 세포접착 저해시험을 실시하였다.

그 결과를 표 3에 나타냈다. IC50(㎍/㎖)은, 항 α9 인테그린 항체를 첨가하지 않을 경우에 발생하는 세포접착의 레벨을 기준으로 하였을 때에, 그것을 50% 억제하는 항 α9 인테그린 항체의 농도로서 정의된다. 마우스 Y9A2 항체의 IC50값의 평균체적은 0.039㎍/㎖이었다. 표 3에는 마우스 Y9A2의 IC50값을 1로 하였을 경우의 인간화 Y9A2 항체의 비활성을 나타낸다. 2∼3번의 시험의 평균값을 표 3에 나타냈다. 3종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체는 마우스 Y9A2 항체와 비교해서 4배 이상, 세포접착 저해활성이 향상하고 있음을 알 수 있었다.

<<실시예 9: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 인간 VCAM-1, 인간 테나신 C에 대한 세포접착 저해시험>>

3 종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체에 대해서, 전술한 세포접착 저해시험에 사용한 nOPN-RAA와는 다른 리간드를 사용해서 검토를 실시하였다. 구체적으로는 인간 VCAM-1/Ig(R&D사), 인간 테나신 C의 RGD서열을 RAA로 치환한 변이체 인간 테나신 C-RAA를 사용해서 동일하게 세포접착 저해작용을 검토하였다.

2번의 시험의 평균값을 표 4에 나타냈다. 마우스 Y9A2 항체의 인간 VCAM-1, 인간 테나신 C-RAA에 대한 세포접착 저해활성 IC50값의 평균값은 각각, 0.077㎍/㎖, 0.041㎍/㎖이었다. 표 4에는 마우스 Y9A2 항체의 IC50값을 1로 하였을 경우의 인간화 Y9A2 항체의 비활성을 나타낸다. 3종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체는 사용하는 리간드에 의해 차이는 있지만, 마우스 Y9A2 항체와 동등 이상의 저해활성을 나타내는 것임을 알 수 있었다.

<<실시예 10: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 세포유주 저해시험>>

3 종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체에 대해서, SW480/hα9 세포의 nOPN-RAA에 대한 유주활성에 대한 저해작용을 검토하였다. 실험은 문헌 [Molecular Biology of the cell, 12: 3214-3225, 2001]에 기재된 세포유주 저해시험을 기초로 약간의 변경을 가해서 수행하였다. 즉, nOPN-RAA를 트랜스 웰(Millipore사)의 상층에 고정화한 후에 플레이트에 장착하고, 그 후 10% FCS를 포함한 F15 배지를 하층에 첨가하였다. 상층에 마우스 Y9A2 항체 또는 인간화 Y9A2 항체를 SW480/hα9 세포와 함께 첨가하고, 37℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 그 후에 트랜스 웰의 하층에 유주해 온 세포를 QCM 화학주성 세포유주 24-웰 분석 키트(Millipore사)를 사용해서 정량화하였다. 과잉량의 100㎍/㎖의 마우스 Y9A2 항체를 첨가하는 것에 의해 저해되는 유주활성을 α9 의존성 유주활성으로 정하고(100% 저해), 각 항체의 저해율을 표 5에 나타낸다.

마우스 Y9A2 항체에서는 50㎍/㎖이 아니면 유의한 유주 저해 작용을 볼 수 없지만, 본 발명자들에 의해 작제된 개량형 인간화 Y9A2 항체에서는 5㎍/㎖과 마우스 Y9A2 항체의 1/10의 농도에서 유의한 저해활성을 볼 수 있었다. 또, 유의차 검정은 항체 미첨가의 웰에 대한 Student's t-test로 수행하였다. *: P<0.05, **: P<0.01.

상기 유의적인 세포유주 저해 작용은 임상유효 농도에 직결하고 있고, 임상유효 농도가 1/10가 되는 것은 임상에 있어서 투여간격의 확대(예를 들면, 2주에 1회 투여가 수 개월에 1회 투여가 된다 등)에 연결되고, 또한 5㎍/㎖ 정도의 혈중농도 유지라면 피하주입 제제의 개발이 가능하게 된다. 피하 주입 제제는 현재 세계에서 자기 주사가 인정되고 있고, 만성질병에 있어서는, 특히 환자, 의료기관 쌍방에 있어서 편리성이 현저하게 향상된다. 이렇게 본 발명에 의한 생물학적 활성의 개선은 그 치료 유효성뿐만 아니라 환자 컴플리언스의 개선에 크게 기여하는 것이다.

<<실시예 11: 개량형 인간화 Y9A2 항체의 열안정성 시험>>

3 종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체 및 마우스 Y9A2 항체에 대해서, 70℃에서 2시간 또는 10시간 인큐베이션한 후에, 실시예 8에 기재된 세포접착 저해시험을 사용해서 열안정성에 대해서 평가를 실시하였다.

4번의 실험의 평균값을 표 6에 나타냈다. 열처리를 하지 않을 경우의 세포접착 저해활성을 100%로 하고, 열처리한 후의 각 항체의 활성 잔존율을 나타냈다. 마우스 Y9A2 항체에서는 2시간에서 활성 저하가 인정되었지만, 3 종류의 개량형 인간화 Y9A2 항체는 10시간 인큐베이션하여도 활성이 85% 이상 남아 있었다. 이렇게, 개량형 인간화 Y9A2 항체가 열에 대하여 매우 안정적인 성질은 임상개발 제제에 있어서 실온 보존 가능한 편리성이 높은 제제의 개발에 연결된다고 말할 수 있다.

(산업상 이용 가능성)

본 발명의 개량형 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체는 도너 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체와 비교하여, 활성 및/또는 물성이 개선된 항체이고, 인간 α9 인테그린과 그 복수의 리간드와의 상호작용의 차단을 통해서, 강력한 항염증작용이나 뼈파괴 억제작용을 가지는 것으로, 인간 α9 인테그린이 병태 형성에 관여하는 각종 질병의 예방 또는 치료에 유용하다.

본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2008-004975(출원일: 2008년 01월 11일) 및 일본 특허출원 2008-282496(출원일: 2008년 10월 31일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 전부 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Astellas Pharma Inc. <120> Humanized anti - human alpha9 integrin antibody <130> 091325 <150> JP 2008-004975? <151> 2008-01-11 <150> JP 2008-282496? <151> 2008-10-31??? <160> 44 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Asn Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> mouse <400> 2 caggtccagc ttcagcagtc tggggctgaa ctggcaaatc ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattaact acctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacgttg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga ccagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aatctatggt 300 gactatgggg atttctactt tgactactgg ggccagggca ccactctcac agtctcctca 360 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> mouse <400> 3 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Phe Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> mouse <400> 4 agtattgtga tgacccagac 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humanized anti-human alpha9 integrin antibody <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Tyr Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH gene of humanized anti-human alpha9 integrin antibody <400> 12 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactggt tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180 aatcagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag 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<213> Artificial <220> <223> H gene of humanized anti - human alpha9 integrin antibody <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata caccctcacc acctactgga ttcactgggt gaaacagaga 120 cctggacaag ggcttgagtg gattggatac attaatccta gctctggtta tactgaatac 180 aatcagaagt tcaaggacag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gatttatggt 300 gactatgggg cttggtactt tgactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L chain of humanized anti - human alpha9 integrin antibody <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L gene of humanized anti - human alpha9 integrin antibody <400> 26 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc actacactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcggcag gattacagct ctccgttcac gttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L chain of humanized anti - human alpha9 integrin antibody <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn His Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 28 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> L gene of humanized anti - human alpha9 integrin antibody <400> 28 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc actacactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcggcag gattacagct ctccgttcac gttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 29 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 29 cagcaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt ctcttcctcc tgtcagtaac 60 tgcaggtgtc caatcccagg tgcagctggt gc 92 <210> 30 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 30 aggcttctgg atacaccctc accacctact ggatgcactg ggtgaaacag agacctggac 60 aagggcttga gtggattgga tacattaatc ctagct 96 <210> 31 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 31 ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc 60 cgtgtattac tgtgcgattt atggtgacta tgg 93 <210> 32 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 32 tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc cttgccccca gtagtcaaag 60 tagaaatccc catagtcacc ataaatcgca cag 93 <210> 33 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 33 ggtgagggtg tatccagaag ccttgcagga catcttcacg gaggacccag gcttcttcac 60 ctcagcccca gactgcacca gctgcacctg ggatt 95 <210> 34 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 34 gctgtgctcg tggatttgtc cgcggtaatc gtgactctgt ccttgaactt ctgattgtat 60 tcagtataac cagagctagg attaatgtat ccaatcc 97 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 35 cagcaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.3 <400> 36 tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc 40 <210> 37 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 37 cagcaagctt gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg ttggtgctga tgttctggat 60 tcctgcttcc agcagtgaca tccagatgac cca 93 <210> 38 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 38 tattcacact ctgactggcc ttgcaagtga tggtgactct gtctcctaca gatgcagaca 60 gggaggatgg agactgggtc atctggatgt cactg 95 <210> 39 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 39 aggccagtca gagtgtgaat actgatgttg cttggtatca gcagaaacca gggaaagccc 60 ctaagctcct gatctacttt gcatccaatc ac 92 <210> 40 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 40 tgctgatggt gaaagtaaaa tctgtcccag atccacttcc actgaacctt gatgggaccc 60 cagtgtagtg attggatgca aagtagatca g 91 <210> 41 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 41 cagattttac tttcaccatc agcagcctgc agcctgaaga tattgcaaca tattactgtc 60 ggcaggatta cagctctccg ttcacgtt 88 <210> 42 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 42 tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttgatc tccaccttgg 60 tccctccgcc gaacgtgaac ggagagctgt aa 92 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 43 cagcaagctt gccgccacca tgaagttgcc tgttaggctg 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA depicted in Fig.4 <400> 44 tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc 40

Claims

(a) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역,
(b) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역 및
(c) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역
으로부터 선택되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 항체의 중쇄 불변영역이 인간 Igγ1인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 항체의 경쇄 불변영역이 인간 Igκ인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 항체의 중쇄 불변영역이 인간 Igγ1이고, 항체의 경쇄 불변영역이 인간 Igκ인 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 있어서, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 8 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 및/또는 제 9 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제 10 항에 기재된 발현벡터가 도입된 숙주세포.
제 11 항에 기재된 숙주세포를 배양하여 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 발현시키는 공정을 포함하는, 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 생산하는 방법.
제 12 항에 따른 방법으로 제조된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 포함하는 류머티즘 관절염 치료약.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 사용하는 단계를 포함하는, 류머티즘 관절염의 예방 또는 치료용 의약을 제조하는 방법.
제 13 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 포함하는 류머티즘 관절염 치료약.
제 13 항에 기재된 인간화 항-인간 α9 인테그린 항체를 사용하는 단계를 포함하는, 류머티즘 관절염의 예방 또는 치료용 의약을 제조하는 방법.