MX2010007515A - Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado mejorado. - Google Patents

Abstract

Se describe un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que tiene mejor actividad y/o propiedades físicas en comparación con el anticuerpo antiintegrina a9 humana de ratón donador. Específicamente se describen: anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita, en la SEQ ID NO:11 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO:17; anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO:13 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO:17; y un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO:15 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO:9. También se describen medios para prevenir o tratar una enfermedad en la cual la integrina a9 humana está implicada en el desarrollo de la condición de la enfermedad, en la cual se utiliza el anticuerpo.

Description

ANTICUERPO ANTIINTEGRINA a9 HUMANA HUMANIZADO MEJORADO CAMPO TECNICO La presente invención se relaciona con un anticuerpo antiintegrina a9 humana, humanizado mejorado. De manera más particular, se relaciona con un anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado que tiene una actividad para unirse a una proteina integrina a9 humana para inhibir la adhesión celular dependiente de la integrina a9 y mejorar actividad y/o propiedades en comparación con el anticuerpo antiintegrina a9 humana Y9A2 de ratón. Se espera que el anticuerpo humanizado sea un fármaco para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, enfermedades inmunes como alergias, y rechazo de injertos, y otras diferentes enfermedades implicadas por la integrina a.9 en su patogénesis. TÉCNICA ANTERIOR La integrina, una glicoproteina de la superficie celular, es una molécula de adhesión que funciona principalmente como un receptor para la adhesión celular en matrices extracelulares (colágena, laminina y similares) y miembros de la familia de inmunoglobulinas (ICAM-1, VCAM-1 y similares) , y media la transducción de señales de matrices extracelulares. Por lo tanto, las células reciben señales de matrices extracelulares, y la diferenciación, proliferación, muerte celular y similares son inducidas. La integrina es un heterodimero consistente de las dos subunidades de cadena a y cadena ß; existen diferentes cadenas a y cadenas ß que se incluyan en una amplia variedad de combinaciones, y existen 24 miembros de la superfamilia de integrina. Los ratones agénicos a la integrina están muertos o enfermos sin importar de cual subunidad carezcan, sugiriendo que las integrinas individuales son necesarias para el mantenimiento de la vida. Por lo tanto, se piensa que la integrina, la cual transmite información sobre las condiciones ambientales a células para estimular sus respuestas, funciona en todas las situaciones de fenómenos biológicos y para mediar una amplia gama de condiciones patológicas. Por lo tanto, la integrina es indispensable para la sobrevivencia de organismos, y se piensa que juega papeles importantes aún en estados de enfermedad; han sido reportados algunos casos en los cuales su inhibición ayuda a mejorar condiciones patológicas. Por ejemplo, la inhibición de la integrina especifica de las plaquetas allb 3 han sido aprobadas como un fármaco terapéutico para la restenosis PCTA conocido como abciximab (nombre comercial: ReoPro; Eli Lilly) . El Natalizumab (nombre comercial: Antegren; ELAN Company) , un inhibidor de a4ß1 (VLA4) , ha sido aprobado como un fármaco terapéutico para la esclerosis múltiple. El inhibidor de a?ß3 de Vitaxin (MEDI MUNE Company) bajo desarrollo en estudios clínicos por su acción inhibidora de la neovascularización, acción inhibidora de la activación de los osteoclastos y similares . La integrina 9ß1 es expresada en macrófagos, células NKT, células dendríticas, y neutrófilos, y se reporta que juega papeles importantes en la infiltración y adhesión de esas células inflamatorias, resorción ósea y similares. Recientemente, se ha reportado que la integrina a9ß1 está implicada en la formación de osteoclastos, y su implicación en la destrucción ósea ha sido sugerida (Documento 1 no perteneciente a la literatura de patente) . Los ligandos conocidos por la misma incluyen osteopontina truncada (OPN N-terminal), VCAM-1, Tenascina C y similares. Clínicamente, han sido observados niveles significativamente elevados de integrina alta a9ß1 en los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (Documento 2 no perteneciente a la literatura de patente) . Por lo tanto, si es desarrollado un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína integrina a.9 para actuar para inhibir la adhesión celular dependiente de la integrina a9, sería útil en el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de varias enfermedades implicadas por la integrina ot9 en su patogénesis . Los anticuerpos que se han reportado exhiben acción inhibidora de la función sobre la integrina oc9 humana, son el anticuerpo monoclonal de ratón Y9A2 (Documento 3 no perteneciente a la literatura de patente), y 1K11, 24111, 21C5 y 25B6 (Documento de Patente 1) y 28S1 (Documento de Patente 2) . Los resultados experimentados in vitro han mostrado que esos anticuerpos son capaces de suprimir la adhesión celular dependiente de la integrina a9 humana. Entre aquéllos, puesto que el Y9A2 inhibe la adhesión celular a la osteopontina y Tenascina-C, se considera como el candidato más prometedor para un fármaco de anticuerpo contra la integrina a.9. Deberá notarse sin embargo, que Y9A2 es un anticuerpo derivado de ratón preparado inmunizando un ratón con un antigeno, y por lo tanto, la administración directa del mismo a humanos es prácticamente imposible desde los aspectos de seguridad (inducción de antigenicidad) y efectividad (vida media acortada) . Por lo tanto, una modificación para convertir el anticuerpo en una molécula que tenga una secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano manteniendo a la vez la actividad de Y9A2, es decir, humanización, necesita ser efectuada. Actualmente, como un método de producción del anticuerpo humanizado, el método basado en el método que incluye injertar aminoácidos de la región determinadora de la complementariedad (aquí algunas veces indicada posteriormente como CDR) de acuerdo a lo designado por Winter et el. (Documento 4 no perteneciente a la literatura de patente) es más general. También se sabe aquí que el injerto simultáneo no únicamente de CDR sino también de aminoácidos no pertenientes a CDR implicados en el mantenimiento estructural de CDR o unión con un antigeno, es decir, una región estructural (aquí posteriormente algunas veces indicado como FR) , de un anticuerpo ajeno ai donador de aminoácido de CDR a un anticuerpo humano para ser receptor de CDR es importante para la reproducción de la actividad inherente del anticuerpo donador (Documentos 4 y 5 no perteneciente a la literatura de patente.) .. Sin embargo, la producción de un anticuerpo humanizado basado en un injerto de CDR incluye varios problemas. Primero, los problemas más generales que aún una selección apropiada del aminoácido de FR necesario para la reproducción de la actividad de un anticuerpo donador no puede eliminar la dificultad de obtener el anticuerpo humanizado que tenga afinidad a un antigeno y actividad biológica que exceda a aquélla del anticuerpo donador. En años recientes, se han colocado un gran número de anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos humanos en el mercado como productos farmacéuticos monoclonales . La dosis efectiva de cualquiera de ellos es extremadamente alta y es variable mg por 1 kg de peso corporal. Por lo tanto, los fármacos con anticuerpos son inevitablemente caros, lo cual a su vez incrementa la carga económica sobre los pacientes y costos médicos. Los factores principales que definen la dosis efectiva de un fármaco de anticuerpo incluyen la afinidad del anticuerpo por un antigeno y la cantidad del antigeno presente en el cuerpo. De esos aspectos, particularmente, una mejora en la afinidad de un anticuerpo por un antigeno conduce a una reducción en la dosis, y también da como resultado una mejora extremadamente útil en la reducción de la carga económica de los pacientes y los costos médicos. Para hacer realidad una afinidad mejorada de un anticuerpo por un antigeno, con frecuencia se adopta un método que incluye la introducción de la sustitución de amioácidos a una región variable del anticuerpo. Sin embargo, cuando el anticuerpo y antigeno son diferentes, la secuencia y estructura esférica del aminoácido de CDR, -asi como la posición del aminoácido implicada en las interacciones antigeno - anticuerpo también varia. Por lo tanto, es particularmente imposible definir la posición del aminoácido de FR a ser injertado junto con la CDR según sea aplicable para un anticuerpo. Otro problema es que, aunque todo el aminoácido de CDR de anticuerpo de ratón donador sea injertado, generalmente como el anticuerpo humano patrón en la preparación de un anticuerpo humanizado sobre la base del injerto de CDR, y una secuencia de aminoácidos de CDR derivada de un anticuerpo de ratón, la cual es importante para la unión con un antigeno, algunas veces muestra antigenicidad contra el humano, con frecuencia causando la generación de un anticuerpo antiidiotipo . Es decir que, para la producción de un anticuerpo humanizado, la selección de un anticuerpo receptor apropiado y la selección del aminoácido de CDR y aminoácido de FR a ser sustituido sean indispensables para proporcionar una actividad mayor que la de anticuerpo donador, evitando la generación de antigenicidad en humano y menor estabilidad del anticuerpo. Eso requiere ingenuidad considerable y ensayos y error. documento de patente 1: O 2006/075784 documento de patente 2: WO 2008/007804 documento 1 no perteneciente a la literatura de patente: Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665 documento 2 no perteneciente a la literatura de patente: The Journal of Clinical Investigation , 2005, 115: 1060-1067 documento 3 no perteneciente a la literatura de patente: Am, J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15: 664-672 documento 4 no perteneciente a la literatura de patente: Science, 239, 1534-1536 (1988) documento 5 no perteneciente a la literatura de patente: Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989) DESCRIPCION DE LA INVENCION Problemas a ser Resueltos por la Invención Un objetivo de la presente invención es resolver los diferentes problemas mencionados anteriormente relacionados con anticuerpos humanizados, y proporcionar un anticuerpo an iintegrina ot9 humana humanizado que tiene mejor actividad y/o propiedades en comparación con un anticuerpo antiintegrina oc9 humana de ratón donador (Y9A2).

Medios para Resolver los Problemas En consecuencia, la presente invención comprende las siguientes invenciones (1) - (15) como sustancias y métodos médicamente e industrialmente útiles. (1) Un anticuerpo antiintegrina a9 humana que comprende una región' variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada de las siguientes: (a) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17 (b) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID N0:17, y (c) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:9. (2) El anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es la Igyl humana. (3) El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la región constante de cadena ligera del anticuerpo es Igtc humana. (4) El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igyl humana en la región constante de cadena ligera del anticuerpo es Igx humana . (5) El anticuerpo antiintegrina a.9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 19 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25. (6) El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 21 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25. (7) El anticuerpo antiintegrina ot9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:23 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 27. (8) Un polinucleótico que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo antiintegrina a.9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente. (9) Un polinucleótico que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en (1) anteriormente. (10) Un vector de expresión que comprende un polinucleótido descrito en (8) y/o el polinucleótido descrito en (9) anteriormente. (11) Una célula anfitriona que incorpora el vector de expresión descrito en (10) anteriormente. (12) Un método para producir un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado, que comprende el paso de cultivar la célula anfitriona descrita en (11) anteriormente para permitir la expresión del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado. (13) ün fármaco terapéutico para la artritis reumatoide, que comprende el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en cualquiera de (1) a (7) anteriores . (14) Un método para prevenir o tratar la artritis reumatoide, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en cualquiera de (1) a (7) anteriores. (15) Un uso del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado descrito en cualquiera de (1) a (7) anteriormente en la elaboración de un fármaco para prevenir o tratar la artritis reumatoide.

Efecto de la Invención De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que tiene una actividad y/o propiedad mejorada en comparación con el anticuerpo antiintegrina a9 humana de ratón donador. El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención tiene la fuerte acción antiinflamatoria y una fuerte acción de supresión de la destrucción ósea bloqueando las interacciones entre la integrina a9 humana y una pluralidad de ligandos de la misma, y es útil para la profilaxis o tratamiento de varias enfermedades que implican la integrina a9 humana en la patogénesis. Además, el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención proporciona mejoras superiores en aplicaciones clínicas como la reducción de la dosis, extensión del intervalo de administración, mejora del método de administración (por ejemplo, inyección subcutánea) y similares, y contribuye generalmente a la efectividad terapéutica y mejor cumplimiento de los pacientes.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la región VH de un anticuerpo Y9A2 de ratón. La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la región VL de un anticuerpo Y9A2 de ratón. La Figura 3 muestra la constitución de oligoADN para producir el gen que codifica para RY9A2VHv5, el cual es un ejemplo de VH de un anticuerpo Y9A2 humanizado. La Figura 4 muestra la constitución de oligoADN para producir el gen que codifica para RY9A2VLv01, el cual es un ejemplo de VL de un anticuerpo Y9A2 humanizado. La Figura 5 muestra el resultado del ELISA Celular de un anticuerpo Y9A2 quimérico y un anticuerpo RY9A2v501. La Figura 6 muestra el resultado del ELISA Celular de un anticuerpo Y9A2 quimérico o un anticuerpo RY9A2v801.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION La presente invención es descrita con detalle en lo siguiente. La presente invención ha demostrado considerable ingenuidad y consideración para la producción de un anticuerpo humanizado de anticuerpo antiintegrina a9 humana de ratón Y9A2, y ha tenido éxito en la producción de tres tipos de anticuerpos antiintegrina a.9 humana humanizados (aquí posteriormente también referidos como anticuerpo Y9A2 humanizado o RY9A2) que tienen actividades y/o propiedades significativamente mejoradas en comparación con Y9A2. Para ser específicos, los inventores de la presente injertaron primero una secuencia de aminoácidos de CDR y varios aminoácidos de FR de una región variable de cadena pesada (aquí posteriormente también referidas como VH) y una región variable de cadena ligera (aquí posteriormente también referidas como VL) de anticuerpo antiintegrina a9 humana de ratón Y9A2 (aquí posteriormente también referidas como anticuerpo Y9A2 de ratón) en el anticuerpo humano patrón para preparar dos tipos de anticuerpos antiintegrina a.9 humana humanizados RY9A2v501 y RY9A2v801, cada uno de los cuales tiene una actividad equivalente a la de un anticuerpo y9A2 de ratón. La CDR fue determinada de acuerdo a la clasificación de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest 4a ed. , Public Health Services, NIH, Washington DC, 1987) . Las secuencias de aminoácidos de las VH de RY9A2v501 y RY9A2v801 son las SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO : 7 , respectivamente. Aquí, la VH de RY9A2v801 es VH de RY9A2v501 donde 4 aminoácidos residuales de los aminoácidos residuales de FR derivados del anticuerpo Y9A2 de ratón son sustituidos por los aminoácidos del anticuerpo humano patrón correspondiente. La secuencia de aminoácidos de la VL de ambos anticuerpos humanizados se muestran en la SEQ ID NO: 9 y es común a ambos anticuerpos. A continuación, con el propósito de producir un anticuerpo humanizado que tiene mayor afinidad por la integrina a9 humana que la del anticuerpo Y9A2 de ratón original, evitando a la vez el riesgo de producción de antigenicidad del anticuerpo humanizado y menor estabilidad a la preservación del anticuerpo, los inventores de la presente consideraron la sustitución de las secuencias de aminoácidos en las CDR de VH y VL de los dos tipos de anticuerpos humanizados mencionados anteriormente. Como resultado, se confirmaron los siguientes 3 tipos de anticuerpos antiintegrina 9 humana humanizados que tenían actividades y/o propiedades significativamente mejoradas en comparación con aquéllos del anticuerpo Y9A2 de ratón original . (1) Un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 11 y la región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:17. (2) Un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17. (3) Un anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 9. El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención puede ser fácilmente preparado por aquellos expertos en la técnica sobre la base de la información de la secuencia sobre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del mismo descritas aquí, usando un método comúnmente conocido en la técnica. Específicamente, el segmento de gen de la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de bases que codifica para los aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado de la presente invención, y un segmento de gen de la región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de bases que codifica para los aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de la presente invención son preparadas. Entonces, los genes de la región variable son unidos a un gen de la región constante en una clase apropiada de anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo humanizado. A continuación, este gen de anticuerpo humanizado es unido a un vector de expresión apropiado, e introducido en una célula cultivada. Finalmente, esta célula cultivada es cultivada, por lo que el anticuerpo humanizado puede ser obtenido del sobrenadante del cultivo. Cada uno de los segmentos de gen de la región variable descritos anteriormente que codifica para los aminoácidos de la región variable de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo humanizado de la presente invención puede ser sintetizado, por ejemplo, sobre la base de la secuencia de bases de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera o las secuencias de bases diseñadas sobre la base de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera y por el método de síntesis de genes conocido en la técnica. Con el método de síntesis de genes, pueden ser usados varios métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica como el método de síntesis de genes de anticuerpo descrito en la WO90/07861 y similares. Además, una vez que un segmento de gen de la región variable del anticuerpo de la presente invención es adquirido, los anticuerpos de la presente invención también pueden ser adquiridos introduciendo una mutación en un sitio dado del segmento del gen. Como el método de introducción de la mutación, pueden ser usados varios métodos obvios a aquellos expertos, como la mutagénesis dirigida al sitio (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John iley & Sons section 8.1-8.5). A continuación, los segmentos de gen de la región variable descritos anteriormente y el gen de la región constante del anticuerpo humano son unidos para preparar un gen de anticuerpo humanizado. Aunque cualquier subclase de región constante (por ejemplo ??, ?2, ? y ?4 como cadenas pesadas, y ? y ? como regiones constantes de la cadena como cadenas ligeras) pueden ser elegidas como la región constante del anticuerpo humano usado, Igyl humana como la región constante de cadena pesada e IgK humana como la región constante de cadena ligera, pueden ser preferiblemente usadas. Después de la preparación de este gen de anticuerpo humanizado, puede ser efectuada la introducción del gen de anticuerpo humanizado a un vector de expresión, introducción del vector de expresión a células cultivadas, cultivo de las células cultivadas, purificación del anticuerpo y similares, usando varios métodos comúnmente conocidos en una técnica, con referencia al método para preparar un anticuerpo antiosteopontina humana humanizado descrito en la O2007/139 64 o O2003/027151. Como un vector de expresión a ser unido al gen de anticuerpo humanizado asi obtenido, pueden ser usados los vectores de expresión descritos en la Gaceta Oficial de Publicación de Patente Internacional WO94/20632, como AG-?? y AG- , pero el vector de expresión no es objeto de limitaciones, en tanto sea capaz de expresar el gen del anticuerpo humanizado. Es preferible utilizar un vector de expresión que ya tenga una región constante de Ig humana como AG-?? y AG-?, debido a que se convertiría en un vector de expresión que tiene el gen de anticuerpo humanizado simplemente cuando el gen de la región variable del anticuerpo humanizado es insertado en éste. En un vector de expresión, puede ser usada una secuencia líder para promover la secreción extracelular y expresión de un anticuerpo. Como esa secuencia líder, puede ser usada una secuencia líder derivada de Y9A2 o una secuencia líder derivada de otro anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo antiosteopontina humanizado descrito en O2007/139164) . El vector de expresión descrito anteriormente es introducido en las células cultivadas, por ejemplo, usando un sistema de Expresión FreeStyle 293 ( Invitrogen) , un método de fosfato de calcio y similares. Como ejemplos de las células cultivadas a las cuales el vector de expresión es introducido, pueden ser usadas células cultivadas como células 293, CHO-DG44, y ellas pueden ser cultivadas por un método convencional. Después del cultivo descrito anteriormente, el anticuerpo acumulado en el sobrenadante del cultivo puede ser purificado por varios tipos de cromatografías en columna, por ejemplo cromatografías usando una columna de Proteína A. Como un método para medir la actividad de unión del anticuerpo humanizado obtenido a la integrina a.9 humana, pueden ser usados ELISA, FACS y similares. Cuando es usado el ELISA, por ejemplo, las células (por ejemplo células SW480) que expresan integrina a9 son inmovilizadas sobre una placa de ELISA, se agrega un anticuerpo humanizado a ésta para producir una reacción, y un anticuerpo secundario como un anticuerpo IgG humana marcado con una enzima como la peroxidasa de rábano (HRP) es agregado a éste para producir una reacción. Las células son lavadas, se agrega un sustrato desarrollador de color (por ejemplo, TMB cuando se marca con KRP) , y se mide la absorbancia . Como un método para evaluar si el anticuerpo humanizado obtenido tiene una actividad inhibidora de la función contra la integrina a.9 humana, éste puede ser confirmado con una prueba de inhibición (descrito en J. Biol. Chem., 274: 36328-36334, 1999) de la adhesión de la célula dependiente de la molécula de integrina <x9 humana a la molécula de osteopontina humana. Es decir, la variante RAA (la secuencia de RGD es alterada a RAA para suprimir la reacción con otra integrina; aquí posteriormente algunas veces indicada como nOPN-RAA) del OPN N terminal (fragmento N terminal después de la escisión de la osteopontina por trombina; aquí posteriormente algunas veces indicada como nOPN) , la cual es uno de los ligandos a.9, se inmoviliza sobre una placa y somete a bloqueo. Después de la adición de varios anticuerpos humanizados, se agregan células que expresan una ot9 y se incuban a 37 °C durante 1 hora. Las células son fijadas y teñidas con violeta de cristal y metanol, y lavadas. El tinte en las células adheridas es extraído con Tritón X-100, y la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm es medida. Además, como un método para la evaluación detallada de sí el anticuerpo humanizado obtenido tiene una actividad inhibidora de la función contra la integrina oc9 humana, puede ser mencionado un método basado en la prueba de inhibición de migración celular descrita en Molecular Biology of the Cell, 12:3214-3225, 2001. Es decir, que nOPN-RAA se inmoviliza sobre la capa superior de un transpozo y un conjunto sobre una placa, y entonces se agrega un medio F15 que contiene 10% de FCS a la capa inferior. La célula que expresa a9 y el anticuerpo humanizado son agregados simultáneamente a la capa superior, e incubados a 37 °C durante 16 horas. Posteriormente, las células que migran en la capa inferior del transpozo son cuantificadas por ejemplo, por el equipo de Ensayo de 24 pozos de Migración Celular por Quimiotaxis QCM (Millipore) . Los tres tipos de anticuerpos antiintegrina a9 humana humanizados de la presente invención pueden ser fácilmente adquiridos sintetizando un ADN que codifique para la secuencia de aminoácidos de la VH mostrada por las SEQ ID NO: 11, 13 o 15 y un ADN que codifique para la secuencia de aminoácidos de la VL mostrada por la SEQ ID NO: 17 o 9 usando un método comúnmente conocido en la técnica, uniéndolas a una clase apropiada de gen de la región constante del anticuerpo humano, preferiblemente el gen de la región constante Igyl humana para la cadena pesada y el gen de la región constante IgK humana para la cadena ligera, para construir un gen de anticuerpo humanizado, introducir el gen de anticuerpo humanizado a un vector de expresión usando varios métodos comúnmente conocidos en la técnica o el método descrito en la O02/081522 o WO03/027151 y similares, introducir el vector de expresión en células cultivadas, cultivar las células cultivadas, y purificar el anticuerpo del cultivo obtenido.

Preferiblemente, los ADN gue codifican para las secuencias de aminoácidos de VH mostradas por las SEQ ID NO: 11, 13 y 15 contienen las secuencias de bases mostradas por las SEQ ID NO: 12, 14 y 16, respectivamente, preferiblemente, los ADN que codifican para las secuencias de aminoácidos de la VL mostradas por las SEQ ID NO: 17 y 9 contienen secuencias de bases mostradas por las SEQ ID NO: 18 y 10, respectivamente . La cadena pesada del anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, que se obtiene uniendo la región variable de la cadena pesada mostrada por la SEQ ID NO: 11 y la región constante Igyl humana, es una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 19. La cadena ligera del anticuerpo humanizado preferido de la presente invención, la cual se obtiene uniendo la región variable de la cadena ligera mostrada por la SEQ ID NO: 17 y la región constante Ig humana, es una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25. Preferiblemente, un ADN que codifica para la cadena pesada del anticuerpo humanizado consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 19 contiene una secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 20. Preferiblemente, un ADN que codifica para la cadena ligera del anticuerpo humanizado consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25 contiene la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 26. Como un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención que contiene una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 19 y una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:25, un anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012 mostrada en los Ejemplos descritos más adelante puede ser mencionada. La cadena pesada del anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, la cual se obtiene uniendo la región variable de la cadena pesada mostrada por la SEQ ID NO: 13 y la región constante Igyl humana, es una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostradas a la SEQ ID NO: 21. La cadena ligera del anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, la cual se obtiene uniendo la región variable de cadena ligera mostrada por la SEQ ID NO: 17 y la región constante IgK humana, es una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25. Preferiblemente, el ADN que codifica para la cadena pesada del anticuerpo humanizado consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 21 contiene la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 22. Preferiblemente, un ADN que codifica para una cadena ligera de anticuerpo humanizado consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25 contiene la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 26. Como el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención que contiene una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:21, y una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25, un anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 mostrada en los Ejemplos descritos más adelante puede ser mencionada. La cadena pesada del anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, la cual es obtenida uniendo la región variable de la cadena pesada mostrada por la SEQ ID NO: 15 y la región constante de Igyl humana es una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 23. La cadena ligera del anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, la cual es obtenida uniendo la región variable de cadena ligera mostrada por la SEQ ID NO: 9 y la región constante de IgK humana es una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 27. Preferiblemente, un ADN que codifica para la cadena pesada del anticuerpo humanizado consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 23 contiene la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO: 24. Preferiblemente, un ADN que codifica para la cadena ligera del anticuerpo humanizado consistente de la secuencia de aminoácidos mostrado por la SEQ ID NO: 27 contiene la secuencia de bases mostrada por la SEQ ID NO:28. Puesto que el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención contiene una cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO:27, pueden mencionarse un anticuerpo RY9A2v05 (IAW) 01 mostrado en los Ejemplos descritos más adelante.

El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención asi obtenido después de ser purificado adicionalmente de acuerdo a lo requerido puede ser preparado como una preparación farmacéutica de acuerdo con un método convencional, y usado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y similares, enfermedades inmunes como alergias, rechazo de trasplantes y similares, y enfermedades donde este implicada la integrina a9 en la patogénesis como la osteoporosis , o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y similares. El anticuerpo antiintegrina a.9 humana humanizado de la presente invención puede ser usado preferiblemente como un agente terapéutico para artritis reumatoide. Como ejemplos de formas de dosificación para estos agentes terapéuticos, puede ser preparada una preparación parenteral, una inyección o infusión por goteo, y preferiblemente se administra por administración intravenosa, administración subcutánea y similares. En la preparación una preparación farmacéutica, pueden ser usados soportes y aditivos que se ajusten a su forma de dosificación dentro del intervalo farmacéuticamente aceptable . La cantidad de anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención agregada en la preparación descrita anteriormente varia dependiendo de la severidad de los síntomas y edad del paciente, la forma de dosificación de la preparación usada o el título de unión del anticuerpo y similares; por ejemplo puede usarse de aproximadamente 0.1 mg/kg hasta 100 mg/kg. La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica para el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención o las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera del misino, y un vector de expresión que contiene ai mismo. El vector de expresión de la presente invención no es objeto de limitaciones, en tanto sea capaz de expresar un gen que codifique para el anticuerpo humanizado de la presente invención o una región variable de cadena pesada o cadena ligera del mismo en varias células anfitrionas de células procarióticas y/o células eucarióticas , y producir esos polipéptidos . Por ejemplo, pueden ser mencionados vectores plasmídicos, vectores virales (por ejemplo adenovirus, retrovirus) y similares. El vector de expresión de la presente invención puede comprender un gen que codifique para el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención o una región variable de cadena presada y/o cadena ligera del mismo, y un promotor unido funcionalraente a un gen. Como promotor para la expresión de un gen que codifica para el anticuerpo humanizado de la presente invención o una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera del mismo en una bacteria, cuando el anfitrión es una bacteria del género Escherichia, el promotor Trp, promotor lac, promotor recA, promotor APL, promotor lpp, promotor tac y similares pueden ser mencionados. Como promotor para expresar el gen que codifica para el anticuerpo humanizado o una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera del mismo en levadura, por ejemplo, el promotor PH05, promotor PGK, promotor GAP, y promotor ADH pueden ser mencionados; cuando el anfitrión es una bacteria del género Bacillus, el promotor SL01, promotor SP02, promotor penP y similares pueden ser mencionados. Cuando el anfitrión es una célula eucariótica como una célula de un mamífero, promotor de actina ß, promotor CAG (Niwa H et al., Gene, 108, 193-200, 1991), el promotor dérivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico y similares pueden ser mencionados. Cuando una bacteria, particularmente Escherichia coli, es usada como la célula anfitriona, el vector de expresión de la presente invención puede comprender además un codón de inicio, un codón de alto, una región terminadora y una unidad replicable. Cuando sea usada una levadura, célula de animal o célula de insecto, el anfitrión como el vector de expresión de la invención puede comprender una codon de inicio y un codón de alto. En este caso, una secuencia mejoradora, región no codificadora sobre el lado 5' y el lado 3' de un gen que codifica para el anticuerpo humanizado de la presente invención o una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera del mismo, un sitio de poliadenilación, o una unidad replicable y similares pueden estar contenidos. Además, un marcador de selección (por ejemplo, gen de resistencia a la tetraciclina, gen de resistencia a la ampicilina, gen de resistencia a la kanamicina, gen de resistencia a la neomicina, gen de dihidrofolato reductasa) convencionalmente usado de acuerdo al objetivo también pueden estar contenidos. La presente invención también proporciona un transformante que incorpora un gen que codifica para un anticuerpo humanizado de la presente invención o una región variable de cadena pesada y/o cadena ligera del mismo. Ese transformante puede ser preparado por ejemplo, transformando una célula anfitriona con un vector de expresión de la presente invención. La célula anfitriona usada para preparar un transformante no es objeto de limitación, en tanto se ajuste al vector de expresión naturalmente mencionado, y sea transformable; varias células, células naturales o lineas de células establecidas artificialmente en uso común en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacteria, bacteria del género Escherichia, bacteria del género Bacillus) , levaduras (el género Saccharo yces , el género Pichia y similares), células de animales o células de insectos (por ejemplo, Sf9) y similares pueden ser mencionadas como ejemplos. La transformación puede ser efectuada por el método conocido per se. La presente invención también proporciona un método de producción del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención que comprende la expresión de un gen que codifica para el anticuerpo humanizado o regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera de la presente invención de una célula anfitriona, es decir, usando ese transformante. Preferiblemente, la célula anfitriona usada para el método incorpora el vector de expresión de la presente invención, y el vector de expresión puede contener por separado o simultáneamente polinucleótidos que codifiquen para las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado. En la producción del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención, el transformante puede ser cultivado en medio nutriente. El medio nutriente preferiblemente contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno inorgánico o fuente de nitrógeno orgánico requerido para el crecimiento del transformante. Como ejemplos de las fuentes de carbono, glucosa, dextrano, almidón soluble, sucrosa y similares pueden ser mencionados; como ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico o fuente de nitrógeno orgánico, sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de destilado de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soya, extracto de papa y similares pueden ser mencionados. Si se desea, otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, fosfato diácido de sodio, cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina , neomicina, ampicilina, kanamicina y similares) y similares) pueden estar contenidos. El cultivo del transformante puede ser efectuado por el método conocido per se. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, temperatura, pH del medio y tiempo de cultivo son seleccionados como apropiados. Por ejemplo, cuando el anfitrión sea una célula animal, puede ser usado medio MEM (Science, Vol. 122, p. 501, 1952), medio DMEM (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc, Vol. 199, p. 519, 1967), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol . Med., Vol. 73, p. 1, 1950) que contiene de aproximadamente 5 hasta 20% de suero bovino fetal y similares como el medio. El pH del medio es de manera preferible de aproximadamente 6 a 8, el cultivo es normalmente efectuado de aproximadamente 30 a 40°C durante aproximadamente 15 a 72 horas, y el cultivo puede ser aireado o agitado según sea necesario. Cuando el anfitrión es una célula de insecto, por ejemplo, puede ser mencionado en medio de Grace que comprende suero bovino fetal (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Vol. 82, p. 8404, 1985) y el pH del mismo es, de manera preferible, de aproximadamente 5 a 8. El cultivo es normalmente efectuado de 20 a 40°C durante 15 a 100 horas, y el cultivo puede ser aireado o agitado según sea necesario. Cuando el anfitrión sea una bacteria, un actinomyces, levadura u hongo filamentoso, por ejemplo un medio liquido que comprenda la fuente de nutrientes descrita anteriormente es apropiado. Un medio que tenga un pH de 5 a 8 es el preferible. Cuando el anfitrión sea £. coli, el medio LB, medio M9 (Miller et al., Exp. Mol.

Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431, 1972) y similares pueden ser mencionados como los medios preferibles. En este caso, el cultivo puede ser normalmente efectuado de 14 a 43°C durante aproximadamente 3 a 24 horas, aireando o agitando una vez el cultivo según sea necesario. Cuando el anfitrión sea una bacteria del gen Bacillus, el cultivo puede ser efectuado normalmente de 30 a 40°C durante aproximadamente 16 a 96 horas, aireando y agitando a la vez el cultivo según sea necesario. Cuando el anfitrión sea una levadura, el medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980) puede ser mencionado como agente de medio, y el pH es, de manera deseable de 5 a 8. Los cultivos se efectuaron normalmente de aproximadamente 20 a 35 °C durante aproximadamente 14 a 144 horas, y el cultivo puede ser aireado o agitado según sea necesario. El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado de la presente invención puede ser recuperado, preferiblemente aislado y purificado, del transformante cultivado como se describió anteriormente. Como ejemplos del método de aislamiento y purificación, métodos basados en las diferencias de solubilidad, como desalado y precipitación con solvente; y métodos basados en la diferencia del peso molecular; como la diálisis; ultrafiltración, filtración en gel, y electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida; métodos basados en las diferencias en la carga eléctrica, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de hidroxilo apatita; métodos basados en la afinidad específica, como la cromatografía de afinidad; métodos basados en diferencias en la hidrofobicidad, como la cromatografía líquida de alto desempeño en fase inversa; métodos basados en diferencias en el punto isoeléctrico; como electroforesis de enfoque isoeléctrico; y similares pueden ser mencionados.

La presente invención es explicada con detalle en lo siguiente refiriéndose a los Ejemplos, los cuales no deben constituirse en limitantes.

Ejemplos Como parte donde fueron usados equipos o reactivos comercialmente disponibles, a menos que se especifique otra cosa, los experimentos fueron efectuados de acuerdo con el protocolo anexo. Ejemplo 1: Determinación de la secuencia de la región variable del anticuerpo Y9A2 de ratón y producción del anticuerpo Y9A2 quimérico. El gen de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo Y9A2 de ratón fueron determinados, y el gen de VH fue ligado al gen de Igyl humano y el gen VL fue ligado al gen Igx humano para dar un anticuerpo quimérico humano al ratón (aquí posteriormente también referido como anticuerpo Y9A2 quimérico) . Los procedimientos son los siguientes . Primero, el ARN fue extraído del hibridoma productor de anticuerpo Y9A2 de ratón, el cual fue proporcionado por la Universidad de California en San Francisco (UCSF) , con un reactivo TRIzol ( Invitrogen) . Usando el ARN como molde o patrón, se sintetizó ADNc usando cebador Random y Transcriptasa Inversa SuperScript III (ambos de Invitrogen) . Entonces, usando este ADNc como patrón o molde, y un cebador para una región líder y un cebador para la región J designado con referencia a la clasificación de las secuencias de la región V y la región J por Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987), se amplificó un segmento de gen de VH con ADN polimerasa Ex Tag (TAKARA BIO INC.). El cebador para la región líder mencionada anteriormente y el cebador para la región J usados aquí se agregaron con la secuencia de reconocimiento HindIII y una secuencia de reconocimiento BamHI, respecti amente. En cuanto a VL, se obtuvo un segmento del gen de VL de la misma manera que con la VH usando un cebador que se conforme en la secuencia líder y un cebador que se conforme en la región J. Los segmentos de gen VH y VL así obtenidos fueron digeridos con HindIII y BamHI (ambos de TAKARA BIO INC.), y se ligaron a AG-yL y AG-? (W09 /20632 ) , respectivamente, los cuales son vectores de expresión. AG-?? tiene un promotor de actina ß, un gen de la cadena ?? de la región constante de inmunoglobulina humana, y un gen de resistencia a la neomicina (neo) como un marcador de selección, y se convierte en un plásmido que exprese una cadena pesada del anticuerpo Y9A2 quimérico insertando un gen de VH de anticuerpo Y9A2 de ratón y una secuencia de reconocimiento HindIII y una secuencia de reconocimiento BamHI localizada en el lado hacia arriba del gen ?? . AG-? tiene un promotor de actina ß, un gen de la cadena ? de la región constante de inmunoglobulina humana, y un gen de dihidrofolato redactasa (dhfr) como un marcador de selección, o igualmente se convierte en un plásmido que expresa una cadena ligera de anticuerpo Y9A2 quimérico insertando un gen de VL de anticuerpo Y9A2 de ratón entre la secuencia de reconocimiento HindIII y una secuencia de reconocimiento BamHI localizada corriente arriba del gen ? . Esos plásmidos de expresión fueron introducidos en Escherichia coli de acuerdo con un método convencional para dar un clon transformado, del cual fue preparado el ADN plasmidico usando un equipo QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) . Usando el ADN plasmidico obtenido como el molde, y el equipo GenomeLab DTCS-Quick Start y un secuenciador automático CEQ2000 (ambos de BECKMAN COULTER) , se analizaron secuencias de bases de VH y VL clonadas. Las secuencias de bases de VH y VL se muestran en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de VH y VL, que fueron determinadas sobre la base de las secuencias obtenidas, se muestran en la Fig. 1 y la Fig. 2, respectivamente. Además, ellas también muestran la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. El clon de Escherichia coli mencionado anteriormente fue cultivado en grandes cantidades, y el plásmido de expresión de la cadena pesada y el plásmido de expresión de la cadena ligera del anticuerpo Y9A2 quimérico fueron purificados usando un equipo EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN) . Ellos fueron mezclados, e introducidos en la célula usando el sistema de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) , por lo que el anticuerpo Y9A2 quimérico fue expresado de manera transitoria. La concentración del anticuerpo Y9A2 quimérico contenido en el sobrenadante de cultivo obtenido fue medido por ELISA de emparedado usando un anticuerpo anti-Fc de IgG humana derivado de cabra (CAPPEL) y proteina A-HRP (ZYMED) . En este caso, se preparó una serie de diluciones de anticuerpo IgGl humana comercialmente disponible (Biogénesis) y se usó como una muestra estándar. Entonces, el anticuerpo Y9A2 quimérico en el sobrenadante de cultivo mencionado anteriormente fue purificado por afinidad usando una columna de proteina A (GE Healthcare) para dar un anticuerpo Y9A2 quimérico purificado. La concentración del anticuerpo Y9A2 quimérico purificado fue calculado, donde la concentración fue de 1 mg/mL cuando la absorbancia a la longitud de onda de 280 nm fue de 1.4. Ejemplo 2: Prueba de inhibición de adhesión celular del anticuerpo quimérico Y9A2 Para comparar la actividad del anticuerpo Y9A2 quimérico purificado, el cual fue preparado por el método descrito en la sección mencionada anteriormente, con una del anticuerpo Y9A2 de ratón (CHEMICON INTERNATIONAL) , se efectuó la prueba de inhibición de adhesión celular descrita en J. Biol. Chem., 274: 36328-36334, 1999. Para ser específicos, una variante (nOPN-RAA) donde la secuencia de RGD fue contenida en un fragmento N terminal (nOPN) resultante de la inhibición de la osteopontina con trombina fue sustituida por RAA fue primero inmovilizada y bloqueada, y se agregó un anticuerpo Y9A2 de ratón o un anticuerpo Y9A2 quimérico purificado. Sucesivamente, se agregó la célula SW480 que expresa una molécula de integrina cc9 humana (aquí posteriormente algunas veces indicada como célula SW480/ha9) , y la mezcla fue incubada a 37°C durante 1 hora. Posteriormente, la célula fue fijada y teñida con violeta de cristal y metanol y lavada. El tinte en la célula adherida fue extraído con Tritón X-100, y la absorbancia de longitud de onda 595 nm fue medida. Como un resultado, como se muestra en la Tabla 1, se ha encontrado que la CI50 del anticuerpo Y9A2 de ratón y el anticuerpo Y9A2 quimérico purificado son casi los mismos, y que tienen una actividad para inhibir la adhesión de la célula SW480/ha9 a nOPN-RAA. La CI50 se definió como una concentración del anticuerpo antiintegrina a9 necesaria para suprimir el 50% de nivel de adhesión celular que ocurre sin adición del anticuerpo antiintegrina a9.

Tabla 1 Resultado de la prueba de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 de ratón y anticuerpo Y9A2 quimérico .

Ejemplo 3: Producción de gen de anticuerpo Y9A2 humanizado . El anticuerpo humano patrón a ser injertado con un aminoácido de la región determinante de la complementariedad (CDR) en VH y VL del anticuerpo Y9A2 de ratón se seleccionó de líneas de anticuerpo humano que tienen una secuencia de aminoácidos con una alta homología, secuencia de aminoácidos de la región estructural (FR) en VH, VL del anticuerpo Y9A2 de ratón. Para ser específicos, la VH humana patrón o molde seleccionada como una combinación de DP-88 y JH6 y la VL humana patrón seleccionada fue una combinación de DPK-1 y JK4.

Las FR de VH y VL del anticuerpo humano patrón mencionadas anteriormente fueron injertadas con las secuencias de aminoácido necesarias de VH y VL del anticuerpo Y9A2 de ratón para dar un anticuerpo humanizado. Para ser específicos, como para VH, la secuencia de aminoácidos de CDR y varios sitios de aminoácidos de FR de la VH del anticuerpo humano patrón mencionado anteriormente fueron sustituidos primero por las secuencias de aminoácidos correspondientes en VH de anticuerpo Y9A2 de ratón. Las secuencias de aminoácidos de VH de dos tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados, es decir, RY9A2VHv5 y RY9A2VHv8, fueron designadas (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7, respectivamente) , y además, las secuencias de bases del ADN que codifica para las secuencias de aminoácido fueron designadas como (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, respectivamente). En RY9A2VHv8, 4 de los aminoácidos residuales de FR derivado del anticuerpo Y9A2 de ratón en RY9A2VHv5 están sustituidas por aquéllos del anticuerpo humano patrón. Como para VL, la secuencia de aminoácidos de CDR de la VL del anticuerpo humano patrón mencionada anteriormente fue sustituida por la secuencia de aminoácidos de CDR en VL del anticuerpo Y9A2 de ratón, la secuencia de aminoácidos de RY9A2VLv01, la cual es VL del anticuerpo Y9A2 humanizado, fue designada (SEQ ID NO: 9) , y además, la secuencia de bases de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos fue designada (SEQ ID NO: 10) . Para producir fragmentos de ADN que codifican para RY9A2VHv5, RY9A2VHv8 y RY9A2VLv01, mencionadas anteriormente, la síntesis total fue efectuada por PCR usando oligo ADN como un material. Para ser específicos, el RY9A2VHv5 fue sintetizado dividiendo éste en seis tipos de oligo ADN (descritos . en la SEQ ID NO: 29 - 34) para cubrir toda la longitud de la VH, como se muestra respectivamente en la Fig. 3 y, usándolos, se efectúa la PCR por el siguiente procedimiento. Es decir, cantidades equivalentes de 6 tipos de oligo ADN. Usando la mezcla con patrón y ADN polimerasa Pyrobest (TAKARA BIO) , se repitió un paso de 96°C, 30 segundos, 50°C, 30 segundos y 72°C, 3 min 15 ciclos. Entonces, usando este producto de la PCR (1 µ?,) como un patrón, el oligo ADN que tiene la secuencia indicada en la Figura 3 (mostrado por la SEQ ID NOs : 35 y 36) como cebador, y ADN polimerasa Pyrobest, se repitió el paso de 96°C, 20 segundos y 72°C, 2 min 25 ciclos para amplificar la VH de longitud completa. También se produjo RY9A2VHv8 generalmente de la misma manera. Para la producción de RY9A2VLv01, se efectuaron 15 ciclos de PCR de la misma manera que anteriormente usando seis oligo ADN (mostrados por las SEQ ID NOs: 37 -42) mostrados en la Fig. 4 y se efectuaron 25 ciclos de PCR de la misma manera que anteriormente usando el producto de amplificación como un patrón, y el mismo ADN que tiene la secuencia indicada en los grupos en la Figura 4 (mostrado por las SEQ ID NOs : 43 y 44) como cebador, por lo que se amplificó la VL de longitud completa. En ambas de la VH y VL, mencionadas anteriormente, como una secuencia líder del anticuerpo, se usó la misma secuencia que el anticuerpo monoclonal antiosteopontina humanizado descrita en la WO2007/139164. Además, ambos extremos del fragmento de ADN obtenidos fueron agregados en una secuencia de reconocimiento HindIII y secuencia de reconocimiento BamHI para la clonación. De este modo, los fragmentos de ADN así obtenidos de VH y VL fueron digeridos con las enzimas de restricción HindIII y BamHI, ligados en los vectores de expresión anteriormente mencionados AG-?? y AG-?, respectivamente, e introducidos en Escherichia coli de acuerdo con el método convencional para la clonación. El ADN plasmídico fue preparado a partir del clon de Escherichia coli obtenido usando un equipo QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) . Usando el ADN plasmídico obtenido como patrón, las secuencias de bases VH y VL clonadas fueron analizadas usando en equipo GenomeLab DTCS-Quick Start y secuenciador automático CEQ2000 (ambos de BECK AN COULTER) , por lo que los clones que tenían las secuencias de bases designadas fueron obtenidos. Esos clones fueron cultivados, y los plásmidos de expresión de la cadena pesada y la cadena ligera fueron purificados usando el equipo EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN) . El plásmido de expresión de cadena pesada y el plásmido de expresión de cadena ligera purificados fueron mezclados, y la mezcla fue introducida en la célula para expresar de manera transitoria el anticuerpo usando un Sistema de Expresión FreeStyle 293. En este caso, el anticuerpo Y9A2 humanizado expresado por la combinación de un plásmido de expresión de cadena pesada insertado con RY9A2VHv5 y un plásmido de expresión de cadena ligera insertado con RY9A2VLv01 fue nombrado anticuerpo RY9A2v501, y un anticuerpo Y9A2 humanizado expresado por la combinación del plásmido de expresión de cadena pesada insertado con RY9A2VHv8 y un plásmido de expresión de cadena ligera insertado con RY9A2VLv01 fue nombrado anticuerpo RY9A2v801. La medición de la concentración de cada anticuerpo Y9A2 humanizado acumulado en un sobrenadante de cultivo y adquisición de un anticuerpo purificado del sobrenadante de cultivo se efectuaron por el mismo método del anticuerpo Y9A2 mencionado anteriormente. Ejemplo 4: Confirmación de la actividad de unión del anticuerpo Y9A2 humanizado a la integrina a9 humana El anticuerpo RY9A2v501 y el anticuerpo RY9A2v801 expresados por un método mencionado anteriormente fueron comparados con un anticuerpo quimérico Y9A2 (aquí algunas veces indicado posteriormente como anticuerpo cY9A2) para la actividad de unión a la molécula de la integrina a9 humana de acuerdo con un método ELISA celular. Para ser específicos, las células SW480 que expresan moléculas de integrina a9 humana son inmovilizadas sobre una placa de ELISA, se hacen reaccionar con el anticuerpo cY9A2 o el anticuerpo RY9A2v501 o el anticuerpo RY9A2v801, mencionados anteriormente, y se hacen reaccionar con anticuerpo antiIgG(Fc) humana de cabra marcada con HRP (American Qualex) como un anticuerpo secundario. Se agregó TMB para permitir el desarrollo de color, se agregó ácido sulfúrico diluido para extinguir la reacción y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm. Como resultado, como se muestra en la Figura 5 y en la Figura 6, se ha confirmado que el anticuerpo RY9A2v501 y el anticuerpo RY9A2v801 tienen actividad de unión a la molécula de integrina a9 humana equivalente a la del anticuerpo cY9A2. Ejemplo 5: Prueba de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 humanizado El anticuerpo RY9A2v501 purificado mencionado anteriormente, el anticuerpo RY9A2v801 purificado y el anticuerpo Y9A2 de ratón fueron sometidos a una prueba de inhibición de adhesión celular de la misma manera que en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La CI50 (µ?/t??,) se define como una concentración del anticuerpo antiintegrina a9 necesaria para suprimir el 50% del nivel de adhesión celular que ocurre sin adición del anticuerpo antiintegrina ot9. El promedio del valor de CI50 del anticuerpo Y9A2 de ratón fue de 0.070 g/mL. La Tabla 2 muestra la actividad específica del anticuerpo humanizado donde el valor de la CI50 del Y9A2 de ratón es 1. La Tabla 2 muestra un valor promedio de dos ensayos de prueba. Como se muestra en la Tabla 2, se confirmaron ha confirmado que los dos tipos de anticuerpos humanizados mencionados anteriormente tienen actividad inhibidora de la adhesión celular o equivalente a la de un anticuerpo Y9A2 de ratón. Tabla 2 Resultados de las pruebas de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 de ratón, anticuerpo RY9A2v501 y anticuerpo RY9A2v801 Anticuerpo Actividad específica Y9A2 1.0 RY9A2v501 0.77 RY9A2v801 0.82 Ejemplo 6: Producción de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado Como se mencionó anteriormente, puesto que dos tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados (anticuerpo RY9A2v501 y anticuerpo RY9A2v801) que tienen una actividad inhibidora de la adhesión celular del mismo nivel que el anticuerpo Y9A2 de ratón original podrán ser adquiridos, los inventores de la presente ahora intentaron mejorar aún más el anticuerpo Y9A2 humanizado mediante la introducción de una mutación basada en esos anticuerpos humanizados. Como resultado de ingenuidad considerable y consideración de los inventores de la presente, han tenido éxito en la producción, como un anticuerpo Y9A2 humanizado que tiene una actividad significativamente superior a la de un anticuerpo Y9A2 de ratón, los siguientes tres tipos de anticuerpo: anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012, anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 y anticuerpo RY9A2v5 ( IAW) 01. 1. anticuerpo RY9A2vl2 ( 34L) 012 La región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 11, y la región variable de cadena ligera (VL) tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17. Las secuencias de bases de VH y VL del anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012 son mostradas por las SEQ ID NOs: 12 y 18, respectivamente. La VH del anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012 es RY9A2VHv8 mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 7) donde un residuo de metionina (34 aminoácido residual de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDR1 está sustituido por leucina, asi como un residuo de lisina y un residuo de ácido aspártico (65vo y 66to aminoácido residuales de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDR2 están sustituidos por glutamina y glicina, respectivamente. LA VL del anticuerpo RY9A2vl2 (M34L) 012 es RY9A2VLv01 mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 9) donde el residuo de lisina (24 0 aminoácido residual de la secuencia de aminoácidos de VL) en CDR1 está sustituido por arginina. 2. Anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 La VH del anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 13, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17. La secuencia de bases de VH y VL del anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 son mostradas por las SEQ ID NOs: 14 y 18, respectivamente. La VH del anticuerpo RY9A2vll (M34L) 012 es RY9A2VHv5 (SEQ ID NO: 5) mencionada anteriormente, donde un residuo de metionina (el 34t0 aminoácido residual de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDR1 fue sustituido por leucina, asi como un residuo de lisina y un residuo de ácido aspártico (65to y 66to aminoácidos residuales de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDR2 están sustituidos por glutamina o glicina, respectivamente. La VL del anticuerpo RY9A2vll ( 34L) 012 es RY9A2VLv01 mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 9) donde un residuo de lisina (24to aminoácido residual de la secuencia de aminoácidos de VL) en CDRl está sustituido por arginina. 3. anticuerpo RY9A2v5 ( IAW) 01 La VH del anticuerpo RY9A2v5 ( IAW) 01 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 15, y la VL tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 9. Esas secuencias de bases de VH y VL de RY9A2v5 (IAW) 01 son mostradas por las SEQ ID NOs : 16 y 10, respectivamente. La VH del anticuerpo RY9A2v5 ( IAW) 01 es RY9A2VHv5 mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 5) donde el residuo de metionina (34to aminoácido residual de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDRl está sustituido por isoleucina, asi como un residuo de ácido aspártico y un residuo de fenilalanina (104Co y 105to aminoácidos residuales de la secuencia de aminoácidos de VH) en CDR3 son sustituidos por alanina y triptófano, respectivamente. La VL del anticuerpo RY9A2v5 ( IAW) 01 es la misma que RY9A2VLv01 mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 9) . Los fragmentos de ADN de VH y VL de los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados mencionados anteriormente fueron ligados con los vectores de expresión AG-?? y AG-K para dar un plásmido de expresión de la misma forma anterior. El plásmido fue expresado usando un Sistema de Expresión FreeStyle 293, y varios anticuerpos purificados fueron obtenidos del sobrenadante del cultivo usando una columna de proteina A como se mencionó anteriormente . Ejemplo 7: Confirmación de la actividad de unión del anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado a la integrina a9 humana Los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados y anticuerpos cY9A2 producidos como se mencionó anteriormente fueron confirmados por la actividad de unión a la integrina oc9 humana por ELISA celular de la misma manera gue en el Ejemplo 4. Como resultado, pudo confirmarse gue todos los anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados tienen actividad de unión para la integrina oc9 humana, como el anticuerpo Y9A2 quimérico . Ejemplo 8: Prueba de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado a nOPN humano Para comparar la actividad de los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados con la de un anticuerpo Y9A2 de ratón, se efectúa la prueba de inhibición de adhesión celular de la misma manera que en el Ejemplo 2. El resultado se muestra en la Tabla 3. La CI50 (µq/m ) se definió como una concentración del anticuerpo antiintegrina oc9 necesario para suprimir el 50% del nivel de adhesión celular que ocurre sin la adición del anticuerpo antiintegrina a.9. El promedio de los valores de CI50 del anticuerpo ?9?2 de ratón fue de 0.039 µg/mL. En la Tabla 3 se muestra la actividad especifica del anticuerpo Y9A2 humanizado cuando el valor de CI50 de Y9A2 de ratón es 1. Los valores promedio de 2 ó 3 ensayos de las pruebas se ilustran en la Tabla 3. Se ha encontrado que los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados muestran una actividad inhibidora de la adhesión celular de 4 veces mejorada en comparación con el anticuerpo Y9A2 de ratón.

Tabla 3 Resultados de la prueba de inhibición de la adhesión celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado Anticuerpo Actividad especifica Y9A2 1.0 RY9A2v5 (IAW) 01 0.29 RY9A2vll (M34L) 012 0.23 RY9A2vl2 (M34L) 012 0.23 Ejemplo 9: Prueba de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado para VCAM-1 humano y Tenascin C humano. Los tres tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados fueron examinados usando un ligando diferente de nOPN-RAA usado para la pruebas de inhibición de adhesión celular mencionadas anteriormente. Para ser específicos, una acción inhibidora de la adhesión celular a VCAM-1 /Ig humano (R y D) y una variante de Tenascina C-RAA humana, donde la ia de RGD de la Tenascin C humana fue sustituida por RAA, se examinó de la misma manera. Los valores promedio de dos ensayos de las pruebas se muestran en la Tabla 4. Los valores promedio de los valores de CI50 de la actividad inhibidora de la adhesión celular del anticuerpo Y9A2 de ratón a VCAM-1 humana y Tenascina C-RAA fueron de 0.077 µg/mL y 0.041 µg/mL, respectivamente. La Tabla 4 muestra la actividad específica del anticuerpo Y9A2 humanizado cuando el valor de CI50 del anticuerpo de ratón Y9A2 es 1. Se ha encontrado que los 3 tipos de anticuerpo Y9A2 humanizados mejorados muestran una actividad inhibidora al menos equivalente a la del anticuerpo Y9A2 de ratón, aunque sujeta a variación dependiendo del ligando usado. Tabla 4 Resultados de la prueba de inhibición de adhesión celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado a VCA -1 y Tenascina C Ejemplo 10: Prueba de inhibición de migración celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado Los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados fueron examinados por una acción inhibidora de la actividad de migración de la célula SW480/ha9 contra nOPN-RAA. El experimento se basó en la prueba de migración de inhibición celular descrita en Molecular Biology of the cell, 12: 3214-3225, 2001, con los mismos cambios hechos a ella. Para ser precisos, el nOPN-RAA fue inmovilizado sobre la capa superior de un transpozo (Millipore) , fijado sobre una placa, y entonces se agregó medio F15 que contenia 10% de FCS a la capa inferior. El anticuerpo Y9A2 de ratón o anticuerpo Y9A2 humanizado fue agregado junto con la célula SW480/hcc9 a la capa superior, y la mezcla fue incubada a 37°C durante 16 horas. Posteriormente, las células que emigraron hacia la capa inferior del transpozo fueron cuantificadas usando un equipo de ensayo de 24 pozos de migración celular por Quimiotaxis QCM (Millipore) . La actividad de la migración fue medida por la adición de una cantidad en exceso (100 µg/mL) del anticuerpo de ratón Y9A2 se define como una actividad de migración dependiente de a9 (inhibición del 100%) , y el porcentaje de inhibición de cada anticuerpo se muestra en la Tabla 5. Se encontró una acción inhibidora de la migración significativa únicamente cuando el anticuerpo Y9A2 de ratón fue agregado a 50 µ?/?t?; sin embargo, el anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado producido por los inventores de la presente mostró una acción inhibidora significativa a una concentración de 5 g/mL, la cual es 1/10 del anticuerpo Y9A2 de ratón. La prueba de diferencia significativa fue efectuada por la prueba t de Student con relación a un pozo sin anticuerpo. * : P<0.05, **: P<0.01.

Tabla 5 Resultados de la prueba de inhibición de migración celular de anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado anticuerpo Concentración de Porcentaje de anticuerpo inhibición (%) [µq/mL) Y9A2 5 28 20 24 50 99* RY9A2v5 (IAW) 01 5 109** RY9A2vll (M34L) 012 5 84* RY9A2vl2 (M34L) 012 5 86* La acción inhibidora de la migración celular significativa está ligada directamente a una concentración clínicamente efectiva, donde una concentración clínicamente efectiva de 1/10 conduce a intervalos de administración prolongados (por ejemplo, la administración de una vez en dos semanas se convierte en una vez en varios meses, etc.) en la práctica clínica, y una concentración en sangre mantenida en aproximadamente 5 µg/mL permite el desarrollo de una preparación inyectable subcutánea. Puesto que la autoinyección de preparaciones inyectables subcutáneas es ahora permitida en todo el mundo, la conveniencia en enfermedades crónicas es sorprendentemente mejor en particular tanto para pacientes como instituciones médicas. En consecuencia, la mejora de la actividad biológica por la presente invención contribuye en gran medida únicamente a la efectividad terapéutica de la misma sino también a un mejor cumplimiento del paciente. Ejemplo 11: Prueba de estabilidad térmica del anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado Los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados y el anticuerpo Y9A2 de ratón fueron incubados a 70°C durante 2 horas o 10 horas, y evaluados por su estabilidad térmica usando la prueba de inhibición de adhesión celular descrita en el Ejemplo 8. Los valores promedio de 4 experimentos se muestran en la Tabla 6. Con la actividad inhibidora de la adhesión celular sin un tratamiento térmico como el 100%, se muestra un porcentaje residual de actividad de cada anticuerpo después del tratamiento térmico. Aunque el anticuerpo Y9A2 de ratón mostró una disminución de la actividad en dos horas, los 3 tipos de anticuerpos Y9A2 humanizados mejorados retuvieron el 85% o más de la actividad aún después de la incubación durante 10 hr. En consecuencia, la propiedad de ser extremadamente estable al calor del anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado conduce al desarrollo de una preparación altamente conveniente que permite la preservación a temperatura ambiente, entre preparaciones para desarrollo clínico. Tabla 6 Resultados de la prueba de estabilidad térmica del anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado Aplicabilidad Industrial El anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado mejorado de la presente invención tiene mejor actividad y/o propiedades en comparación con un anticuerpo antiintegrina a9 humana de ratón donador, y una fuerte acción antiinflamatoria y una fuerte acción supresora de una destrucción ósea bloqueando interacciones entre la integrina a9 humana y una pluralidad de ligandos de la misma, y es útil para la profilaxis o tratamiento de varias enfermedades que implican a la integrina <x9 en la patogénesis. Esta solicitud se basa en las Solicitudes de Patente Nos. 2008-004975 presentada en Japón (fecha de presentación: Enero 11, 2008) y 2008-282496 (fecha de presentación: Octubre 31, 2008), el contenido de las cuales se incorpora aquí completamente.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionados de las siguientes: (a) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17; (b) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 17, y; (c) una región variable de cadena pesada consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena ligera consistente de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: .
2. 2. Anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igyl humana.
3. 3. Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la región constante de cadena ligera del anticuerpo es Ig humana.
4. 4. Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igyl humana y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK humana.
5. 5. Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 19 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25.
6. 6. Anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 21 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 25.
7. 7. Anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según la reivindicación 1, donde la cadena pesada consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 23 y la cadena ligera consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 27.
8. 8. Polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado según la reivindicación 1.
9. 9. Polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según la reivindicación 1.
10. 10. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 8 y/o polinucleótido según la reivindicación 9.
11. 11. Célula anfitriona que incorpora el vector de expresión según la reivindicación 10.
12. 12. Método para producir un anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado, que comprende un paso de cultivar las células anfitrionas de acuerdo con la reivindicación 11 para permitir la expresión del anticuerpo antiintegrina cc9 humana humanizado.
13. 13. Fármaco terapéutico para la artritis reumatoide, que comprende el anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
14. 14. Método para prevenir o tratar la artritis reumatoide, que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo antiintegrina oc9 humana humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
15. 15. Uso del anticuerpo antiintegrina a9 humana humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la elaboración de un fármaco para prevenir o tratar la artritis reumatoide.