KR101824512B1

KR101824512B1 - 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자에 대한 항체

Info

Publication number: KR101824512B1
Application number: KR1020107026423A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 알. 베빙턴; 케네스 루어센; 제프리 티. 야란톤
Original assignee: 휴머니건, 아이엔씨.
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2018-02-02
Also published as: EP2280732A4; EP2280732A2; MX2010011761A; CA2722137C; EP2280732B1; KR101852915B1; CN102037016B; CN102037016A; IL208980A; US20150344565A1; WO2009134805A3; WO2009134805A2; AU2009243184A1; US9017674B2; ES2704835T3; IL208980A0; KR20170126458A; BRPI0911902A2; JP5688363B2; CA2722137A1

Abstract

본 발명은 질환을 치료하기 위해 인간에게 투여할 때 면역원성이 감소된 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자에 대한 고친화도 항체 및 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자에 대한 항체{ANTIBODIES TO GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING FACTOR}

[관련 출원에 대한 상호 참조]

본원은 2008년 4월 28일자 출원된 미국 가출원 제61/048,522호의 이익을 주장하고, 이 출원은 본원에 참조문헌으로 포함된다.

"과립구 대식세포 콜로니 자극 인자"(GM-CSF)는 조혈 환경에서 및 염증의 말초 부위에서 존재하는 세포에 의해 다수의 염증 매개체에 대해 반응하여 생성되는 소형 당단백질이다. GM-CSF는 골수 세포로부터의 호중구성 과립구, 대식세포 및 혼합 과립구-대식세포 콜로니의 생성을 자극할 수 있고, 태아 간 전구 세포로부터의 호산구 콜로니의 형성을 자극할 수 있다. 또한, GM-CSF는 성숙 과립구 및 대식세포에서 여러 기능적 활성을 자극할 수 있고, 과립구 및 대식세포의 아폽토시스를 억제할 수 있다.

GM-CSF는 다수의 질환의 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 제시되어 왔다. 따라서, GM-CSF를 표적으로 하는 추가 치료에 대한 수요가 존재한다. 본 발명은 예를 들면 GM-CSF가 병원성 메커니즘의 일부인 질환의 치료를 취해 개선된 항GM-CSF 항체를 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 항GM-CSF 항체, 예를 들면 인간화 조작 및 GM-CSF 리셉터 신호 전달을 억제하는 것이 바람직한 질환의 치료를 위해 상기 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 CDR3 결합 특이성 결정인자 RQRFPY(서열 번호 12) 또는 RDRFPY(서열 번호 13), 인간 JH4(YFDYWGQGTLVTVSS; 서열 번호 14)에 95% 이상의 동일성을 포함하는 J 분절, 및 인간 생식선 VH1 1-02 또는 VH1 1-03 서열에 90% 이상의 동일성을 포함하는 V 분절을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 RQRFPY(서열 번호 12)를 포함하는 CDR3 결합 특이성 결정인자를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항GM-CSF 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, J 분절은 YFDYWGQGTLVTVSS(서열 번호 14)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, CDR3은 RQRFPYYFDY(서열 번호 15) 또는 RDRFPYYFDY(서열 번호 16)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 또는 CDR2는 인간 생식선 VH1 서열일 수 있거나; 또는 CDR1 및 CDR2 둘 다 인간 생식선 VH1일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 도 1에 제시된 V_H 영역에 도시된 바와 같이 중쇄 가변 영역 CDR1 또는 CDR2, 또는 CDR1 및 CDR2 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, V 분절로서의 본 발명의 항체는 도 1에 도시된 V_H V 분절 서열을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 도 1에 제시된 VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 또는 VH#5의 서열을 갖는 V_H를 포함한다.

또한, 본 발명은 예를 들면 상기 문단에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 갖는 항GM-CSF 항체로서, CDR3 결합 특이성 결정인자 FNK 또는 FNR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 인간 생식선 JK4 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체 V_L 영역 CDR3은 QQFN(K/R)SPLT(서열 번호 17), 예를 들면 QQFNKSPLT(서열 번호 18)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 도 1에 도시된 V_L 영역의 CDR1 또는 CDR2, 또는 CDR1 및 CDR2 둘 다를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, V_L 영역은 도 1에 도시된 바와 같은 VKⅢA27 V 분절 서열에 95% 이상의 동일성을 갖는 V 분절을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, V_L 영역은 도 1에 제시된 VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4의 서열을 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 예를 들면 도 1에서의 V_H 영역 서열로부터 선택되는 V_H 영역 서열 및 도 1에서의 V_L 영역 서열로부터 선택되는 V_L 영역을 갖는 본 발명의 항체는 1가 친화도가, 37℃에서 수행된 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때, 약 10 nM보다 우수하고, 종종 약 500 pM보다 우수하거나(작거나), 약 50 pM보다 우수하다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 친화도가 (표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정할 때) 50 pM 미만, 통상적으로 약 25 pM 미만, 또는 심지어 10 pM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항GM-CSF는 GM-CSF와의 1가 상호작용에 대해 37℃에서 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때 대략 10^-4 s^-1 미만, 바람직하게는 5×10^-5 s^-1 미만, 가장 바람직하게는 10^-5 s^-1 미만의 해리 속도 상수(kd)로 해리 속도가 느리다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 동일 조건 하에 분석한 기준 키메라 cl9/2 단일 클론 항체보다 해리 속도가 2배 내지 3배 이상 느리지만, GM-CSF 활성을 측정하는 세포 기반 분석에서 GM-CSF 활성을 중화하는 데 있어서 기준 항체의 효능보다 효능이 6배 내지 10배 이상 크다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 본 발명의 항체는 IgG이다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 불변 영역을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 10에 제시된 서열을 갖는 카파 경쇄이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역, 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 경쇄 카파 불변 영역 및 도 1에 도시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖고, 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 도 1에 제시된 서열로부터 다음의 조합: (a) VH#2, VK#3; (b) VH#1, VK#3; (c) VH#3, VK#1; (d) VH#4, VK#3; (e) VH#4, VK#4; (f) VH#4, VK#2; (g) VH#5, VK#1; (h) VH#5, VK#2; (i) VH#3, VK#4; 또는 (j) VH#3, VL#3 중 하나를 포함한다. 당업자는 본 발명의 항체가 본원의 교시내용에 따라 도 1에 제시된 V_H 및 V_L 영역의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

몇몇 실시양태에서, V_H 영역 서열 또는 V_L 영역 서열, 또는 V_H 및 V_L 영역 둘 다의 아미노산 서열은 N 말단에 메티오닌을 포함한다.

추가 양태에서, 본 발명은 GM-CSF을 억제하는 것이 바람직한 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 상기 항체를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 환자는 골감소증, 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 알츠하이머병, 심부전, 허혈로 인한 심장 손상 또는 당뇨병을 앓는다.

도 1은 항GM-CSF 항체의 예시적인 V_H 서열(서열 번호 2-5) 및 V_L 서열(서열 번호 6-9)을 제공한다. VH1 1-02 = 서열 번호 19; VH1 1-03 = 서열 번호 20; VKⅢ A27 = 서열 번호 21.
도 2. 37℃에서 표면 플라스몬 공명 분석(Biacore 3000)에 의해 측정되는 Ab1(A) 또는 Ab2(B)에 대한 GM-CSF의 결합. Ab1 및 Ab2는 Biacore 칩 위에 고정된 항Fab 다클론 항체에 포획되었다. 기재된 바대로 여러 농도의 GM-CSF를 표면에 주입하였다. Scrubber 2 소프트웨어를 이용하여 1:1 상호작용을 가정하여 구형 피트(Global fit) 분석을 수행하였다.
도 3. 글리코실화 GM-CSF 및 비글리코실화 GM-CSF에 대한 Ab1 및 Ab2의 결합. 인간 293 세포로부터 발현된 글리코실화 GM-CSF 또는 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 비글리코실화 GM-CSF에 대한 결합을 ELISA에 의해 측정하였다. 단일 실험으로부터 얻은 대표적인 결과를 기재하였다(실험 1). Ab1 및 Ab2를 1,500 ng/ml로부터 시작하여 2배 희석하여 GM-CSF 코팅 웰에 도포하였다. 각 점은 3회 측정에 대한 평균 + 표준 오차를 나타낸다. Prism 5.0 소프트웨어(Graphpad)를 이용하여 S자형 곡선 피트(fit)를 수행하였다.
도 4. 공유 에피토프에 대한 Ab1 및 Ab2의 결합을 나타내는 경쟁 ELISA. 웰당 재조합 GM-CSF 50 ng로 코팅된 ELISA 플레이트를 5O nM 바이오티닐화 Ab2와 함께 여러 농도의 항체(Ab2, Ab1 또는 이소타입 조절 항체)와 항온처리하였다. 뉴트라비딘-HRP 결합체를 사용하여 바이오티닐화 항체 결합을 분석하였다. GM-CSF에 대한 결합에 대한 경쟁은 1 시간 동안(A) 또는 18 시간 동안(B)이었다. 각 점은 3회 측정에 대한 평균 + 표준 오차를 나타낸다. Prism 5.0 소프트웨어(Graphpad)를 이용하여 S자형 곡선 피트(fit)를 수행하였다.
도 5. GM-CSF 유도 IL-8 발현의 억제. 여러 양의 각 항체를 16 시간 동안 0.5 ng/ml GM-CSF와 항온처리하고 U937 세포와 항온처리하였다. 배양 상청액으로 분비된 IL-8을 ELISA에 의해 측정하였다.

본원에서 사용되는 "항체"는 기능적으로는 결합 단백질로 정의되고 구조적으로는 항체를 생산하는 동물의 면역글로불린 코딩 유전자의 골격구조(framework) 영역으로부터 유래하는 것으로 당업자가 인정하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 정의되는 단백질을 의미한다. 항체는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 인정되는 면역글로불린 유전자로는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 들 수 있다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 다시 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 면역글로불린 클래스로 정의된다.

전형적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 이루어지고, 각 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25 kD) 및 1개의 "중쇄"(약 50~70 kD)를 갖는다. 각 쇄의 N 말단은 항원 인식에 주로 관여하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄(V_L) 및 가변 중쇄(V_H)는 각각 이러한 경쇄 및 중쇄를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 결합 특이성을 보유하는 항체 단편을 포함한다. 예를 들면, 다수의 잘 규명된 항체 단편이 존재한다. 따라서, 예를 들면 펩신은 경첩 영역에서 디설파이드 결합에 대한 항체 C 말단을 분해하여 Fab(그 자체는 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄임)의 이량체인 F(ab)'₂를 생성시킨다. F(ab)'₂는 온화한 조건 하에 환원되어 경첩 부위에서 이황화 결합을 절단하고, 이로써 (Fab')₂ 이량체가 Fab' 단량체로 전환될 수 있다. Fab' 단량체는 실질적으로 경첩 부위의 일부를 갖는 Fab이다(다른 항체 단편의 보다 상세한 설명을 위해 문헌[Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)] 참조). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해와 관련하여 정의되어 있지만, 당업자라면 화학적으로 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여 단편을 신생(de novo) 합성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 항체는 또한 완전한 항체의 변형에 의해 생성되거나, 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여 합성되는 항체 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 항체는 단일쇄 항체(단일 폴리펩티드 쇄로 존재하는 항체), 예컨대 단일쇄 Fv 항체(sFv 또는 scFv)[여기서, 가변 중쇄 영역과 가변 경쇄 영역은 (직접 또는 펩티드 링커를 통해) 함께 연결되어 연속 폴리펩티드를 형성함]를 비롯하여 다양한 V_H-V_L 쌍 포맷을 포함한다. 단일쇄 Fv 항체는 직접 연결되거나 펩티드 코딩 링커에 의해 연결되는 V_H 및 V_L 코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유 결합 V_H-V_L이다(예를 들면, 문헌[Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988]). V_H 및 V_L이 단일 폴리펩티드 쇄로 서로에 연결되지만, V_H 도메인과 V_L 도메인은 비공유로 회합한다. 또한, 항체는 이황화 안정화 Fv(dsFv)와 같은 다른 단편 형태일 수 있다. 가용성 단백질 또는 디스플레이 방법으로부터 얻은 단편으로서 예를 들면 재조합 기술을 이용하여 다른 단편을 생성할 수 있다. 또한, 항체는 이중 항체(diantibody) 및 미니 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 카멜리드 유래의 항체와 같은 중쇄 이량체를 포함한다. 카멜리드에서 중쇄 이량체 IgG의 V_H 영역이 경쇄와 소수성 상호작용을 할 필요가 없으므로, 일반적으로 경쇄와 접촉하는 중쇄 내 영역은 카멜리드에서 소수성 아미노산 잔기로 변경된다. 중쇄 이량체 IgG의 V_H 도메인은 VHH 도메인이라 칭한다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 추가로 단일 도메인 항체(dAb) 및 나노바디를 포함한다(예를 들면, 문헌[Cortez-Retamozo, et al., Cancer Res. 64: 2853-2857, 2004] 참조).

본원에서 사용되는 "V 영역"은 골격구조 1, CDR1, 골격구조 2, CDR2 및 골격구조 3(CDR3 포함) 및 골격구조 4의 분절들(이 분절들은 B 세포 분화 동안 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자의 재배열의 결과로 V 분절에 추가됨)을 포함하는 항체 가변 영역 도메인을 의미한다. 본원에 사용되는 "V 분절"은 V 유전자에 의해 코딩되는 V 영역의 영역(중쇄 또는 경쇄)을 의미한다. 중쇄 가변 영역의 V 분절은 FR1-CDR1-FR2-CDR2 및 FR3을 코딩한다. 본 발명에 있어서, 경쇄 가변 영역의 V 분절은 FR3을 통해 CDR3까지 확장되는 것으로 정의된다.

본원에서 사용되는 용어 "J 분절"은 FR4 및 CDR3의 C 말단 일부분을 포함하는 코딩된 가변 영역의 부분 서열을 의미한다. 외인성 J 분절은 면역글로불린 J 유전자에 의해 코딩된다.

본원에서 사용되는 "상보성 결정 영역(CDR)"은 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 의해 확립되는 4개의 "골격구조" 영역에 개재하는 각 쇄 내의 3개의 초가변 영역을 의미한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 관여한다. 각 쇄의 CDR은 통상적으로 N 말단으로부터 순차적으로 순번을 매겨 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 칭하고, 또한 통상적으로 특정 CDR이 위치하는 쇄에 의해 확인된다. 따라서, 예를 들면 V_H CDR3은 V_H CDR3이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치하지만, V_L CDR1은 V_L CDR1이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인 유래의 CDR1이다.

상이한 경쇄 또는 중쇄의 골격구조 영역의 서열은 종 내에 비교적 보존되어 있다. 구성 경쇄 및 중쇄의 통합된 골격구조 영역인 항체의 골격구조 영역은 CDR을 3차원 공간으로 배열하여 정렬시키는 역할을 한다.

CDR 및 골격구조 영역의 아미노산 서열은 카밧(Kabat), 코티아(Chothia), 국제 면역유전학(international ImMunoGeneTics; IMGT) 데이터베이스 및 AbM과 같은 당해 분야에 다양한 널리 공지된 정의를 이용하여 결정할 수 있다(예를 들면, 문헌[Johnson et al., supra; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hyPcrVariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulins hyPcrVariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)] 참조). 또한, 항원 결합 부위의 정의는 다음의 문헌에 기재되어 있다[Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); Lefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1; 29(1): 207-9 (2001); MacCallum et al., Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol, 262(5), 732-745 (1996); Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al., Methods Enzymol, 203, 121-153, (1991); Pedersen et al., Immunomethods, 1, 126, (1992); and Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172, 1996].

"에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 항원 상의 항체가 결합하는 부위를 의미한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성되는 에피토프는 변성 용매에 노출되어도 통상적으로 유지되지만, 3차 폴딩에 의해 형성되는 에피토프는 변성 용매에 의해 처리되면 통상적으로 상실된다. 에피토프는 통상적으로 독특한 공간 입체구조로 3개 이상, 더 일반적으로 5개 이상 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체구조를 결정하는 방법으로는 예를 들면 X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 들 수 있다. 예를 들면, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)]을 참조한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결합 특이성 결정인자" 또는 "BSD"는 항체의 결합 특이성을 결정하는 데 필요한 CDR 영역 내에 최소 인접 또는 비인접 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서, 최소 결합 특이성 결정인자는 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 서열의 일부분 또는 전체 길이 내에 존재한다.

본원에서 사용되는 "항GM-CSF 항체" 또는 "GM-CSF 항체"는 GM-CSF에 결합하여 GM-CSF 리셉터 활성을 억제하는 항체를 의미하기 위해 상호교환되어 사용된다. GM-CSF 결합 및/또는 기능을 평가하는 임의의 수의 기술 인정 분석을 이용하여 이러한 항체를 확인할 수 있다. 예를 들면, 알파 리셉터 서브유닛에 대한 GM-CSF 결합의 억제를 측정하는 ELISA 분석과 같은 결합 분석을 이용할 수 있다. 제한된 양의 GM-CSF에 대한 반응에서의 GM-CSF 의존 세포주의 증식률을 측정하는 분석(GM-CSF 노출에 대한 반응에서의 사이토카인 생성, 예를 들면, IL-8 생성의 양을 측정)과 같은 GM-CSF 리셉터 신호 전달에 대한 세포 기반 분석이 또한 편리하게 이용된다.

본원에서 사용되는 "중화 항체"는 GM-CSF에 결합하여 GM-CSF 리셉터에 의한 신호 전달을 억제하거나, 또는 리셉터에 대한 GM-CSF의 결합을 억제하는 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는 "과립구 대식세포-콜로니 자극 인자"(GM-CSF)는 분자량이 대략 23 kDa인 내부 이황화 결합을 갖는 소형 천연 당단백질을 의미한다. 인간에서, 이는 인간 5번 염색체 위의 사이토카인 클러스터 내에 위치한 유전자에 의해 코딩된다. 인간 유전자 및 단백질의 서열이 공지되어 있다. 단백질은 N 말단 신호 서열 및 C 말단 리셉터 결합 도메인을 갖는다(Rasko and Gough In: The Cytokine Handbook, A. Thomson, et al, Academic Press, New York (1994) page 349-369). 이의 3차원 구조는 인터류킨의 3차원 구조와 유사하지만, 아미노산 서열은 유사하지 않다. GM-CSF는 조혈 환경에서 및 염증의 말초 부위에서 존재하는 다수의 염증 매개체에 대해 반응하여 생성된다. GM-CSF는 골수 세포로부터의 호중구성 과립구, 대식세포 및 혼합 과립구-대식세포 콜로니의 생성을 자극할 수 있고, 태아 간 전구 세포로부터의 호산구 콜로니의 형성을 자극할 수 있다. 또한, GM-CSF는 성숙 과립구 및 대식세포에서 여러 기능적 활성을 자극할 수 있고, 과립구 및 대식세포의 아폽토시스를 억제할 수 있다.

용어 "평형 해리 상수" 또는 "친화도"는 결합 속도 상수(k_a, 시간^-1, M^-1)로 나눈 해리 속도 상수(k_d, 시간^-1)를 의미한다. 평행 해리 상수는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 고친화도 항체이다. 이러한 항체는 1가 친화도가, 37℃에서 수행된 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때, 약 10 nM보다 우수하고(작고), 종종 약 500 pM보다 우수하거나, 약 50 pM보다 우수하다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 친화도가 (표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정할 때) 50 pM 미만, 통상적으로 약 25 pM 미만, 또는 심지어 10 pM 미만이다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항GM-CSF는 GM-CSF와의 1가 상호작용에 대해 37℃에서 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정할 때 대략 10^-4 s^-1 미만, 바람직하게는 5×10^-5 s^-1 미만, 가장 바람직하게는 10^-5 s^-1 미만의 해리 속도 상수(kd)로 해리 속도가 느리다.

본원에서 사용되는 "인간화 항체"는 인간 골격구조 서열에 이식된 공여자 항체 유래의 CDR 내 면역글로불린 분자를 의미한다. 또한, 인간화 항체는 골격구조 서열에서 공여자 유래의 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 골격구조 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. "초인간화(superhumanizing)" 항체(문헌[Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002]) 및 "리서페이싱(resurfacing)"(예를 들면, 문헌[Staelens et al., Mol. Immunol. 43: 1243, 2006; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 969, 1994])과 같은 기술을 비롯하여 당해 분야에 공지된 방법(예를 들면, 문헌[Jones et al., Nature 321: 522-525; 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992]; 미국 특허 4,816,567)을 이용하여 인간화를 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서 "인간화 조작(humaneered)" 항체는 기준 항체의 결합 특이성을 갖는 조작된 인간 항체를 의미한다. 본 발명에서 사용하기 위한 "인간화 조작" 항체는 공여자 면역글로불린 유래의 최소 서열을 함유하는 면역글로불린 분자를 갖는다. 통상적으로, 기준 항체의 중쇄의 CDR3 영역 유래의 결합 특이성 결정인자(BSD)를 코딩하는 DNA 서열을 인간 V_H 분절 서열에 연결하고 기준 항체 유래의 경쇄 CDR3 BSD를 인간 V_L 분절 서열에 연결하여 항체를 "인간화 조작"한다. "BSD"는 CDR3-FR4 영역 또는 결합 특이성을 매개하는 이 영역의 일부분을 의미한다. 따라서, 결합 특이성 결정인자는 CDR3-FR4, CDR3, CDR3의 최소 필수 결합 특이성 결정인자(이는 항체의 V 영역에 존재할 때 결합 특이성을 부여하는 CDR3보다 작은 임의의 영역을 의미함), (중쇄 영역과 관련하여) D 분절 또는 기준 항체의 결합 특이성을 부여하는 CDR3-FR4의 다른 영역일 수 있다. 인간화 조작 방법은 미국 특허 공보 제20050255552호 및 미국 특허 공보 제20060134098호에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 "인간" 항체는 인간화 항체 및 인간화 조작 항체, 및 공지된 기술을 이용하여 얻은 인간 단일 클론 항체를 포함한다.

용어 "이종성"은, 핵산 또는 단백질의 일부분과 관련하여 사용될 때, 핵산 또는 단백질이 일반적으로 자연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 부분 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 새로운 기능성 핵산을 제조하기 위해 배열되는 비연관 유전자 유래의 2개 이상의 서열을 갖는 핵산을 통상적으로 재조합으로 생산한다. 유사하게, 이종성 단백질은 일반적으로 자연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 부분 서열을 의미한다.

용어 "재조합"은, 예를 들면, 세포 또는 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형된다는 것, 또는 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들면 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합) 형태에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나, 저발현되거나, 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다. 본원에서 용어 "재조합 핵산"이란 정상적으로는 자연에서 발견되지 않는 형태의, 일반적으로 예를 들면 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 사용하는 핵산의 조작에 의해 처음에 시험관내에서 형성되는 핵산을 의미한다. 이러한 방식으로, 상이한 서열의 작동가능한 연결을 성취한다. 따라서, 선형 형태의 단리된 핵산 또는 정상적으로는 연결되지 않은 DNA 분자를 결찰하여 시험관내에서 형성되는 발현 벡터는 둘 다 본 발명에 있어서 재조합으로 간주한다. 일단 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 유기체로 재도입되면, 이것은 비재조합으로, 즉 시험관내 조작보다 오히려 숙주 세포의 생체내 세포 기계를 사용하여 복제되는 것으로 이해된다. 그러나, 이러한 핵산은, 일단 재조합으로 생성되면, 비록 나중에 비재조합으로 복제되더라도, 여전히 본 발명에 있어서 재조합으로 간주한다. 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 즉 상기 기재된 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.

단백질 또는 펩티드를 언급할 때, 항체에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다" 또는 ~과 "특이적으로(또는 선택적으로) 면역반응성이다"란 어구는, 이 항체가 관심 있는 단백질에 결합하는 결합 반응을 의미한다. 본 발명에 있어서, 항체는 다른 항원에 대해 친화도보다 100배 이상 우수한 친화도로 관심 있는 항원, 예를 들면, GM-CSF에 결합한다.

2개 이상의 폴리펩티드(또는 핵산) 서열과의 관계에 있어서 용어 "동일한" 또는 "동일성"(%)은, 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정할 때, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기(또는 뉴클레오티드)를 특정 비율(즉, 비교창 또는 지정 영역에 결쳐 최대 상응성으로 비교 및 정렬할 때, 특정 영역에 결쳐 약 60%의 동일성, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성)로 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 의미한다(예를 들면, NCBI 웹사이트 참조). 이후, 이러한 서열은 "실질적으로 동일하다"라고 말한다. 또한, "실질적으로 동일한" 서열은 결실 및/또는 부가를 갖는 서열 및 치환을 갖는 서열 및 천연의, 예를 들면 다형성 또는 대리유전자 변이체 및 인공 변이체를 포함한다. 하기 기재된 바대로, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 서열 동일성은 아미노산 길이가 적어도 약 25개인 영역에 걸쳐, 더 바람직하게는 아미노산 길이가 50개~100개인 영역에 걸쳐 또는 단백질의 길이에 걸쳐 존재한다.

본원에서 사용되는 "비교창"은 통상적으로 20개 내지 600개, 일반적으로 약 50개 내지 약 200개, 더 일반적으로 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 연속 위치의 수 중 한 부분을 지칭하는 것을 포함하고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후 서열을 동일한 수의 연속 위치의 기준 서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 스미스 앤드 워터맨(Smith & Waterman)의 국부 상동성 알고리즘[Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]에 의해, 니들맨 앤드 운쉬(Needleman & Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]에 의해, 피어슨 앤드 립맨(Pearson & Lipman)의 유사성 조사 방법[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]에 의해, 이러한 알고리즘[Genetics Computer Group(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA]의 컴퓨터화 실행에 의해 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조)에 의해 비교를 위한 서열의 최적 정렬을 수행할 수 있다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 바람직한 예로는 문헌[Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 들 수 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성(%)을 결정하기 위해 본원에 기재된 파라미터와 함께 BLAST 및 BLAST 2.0를 사용한다. (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 스트랜드 둘 다의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이 및 10의 기대치(E)를 이용하고, BLOSUM62 점수 행렬(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)] 참조)은 50의 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 스트랜드 둘 다의 비교를 이용한다.

용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 발견될 때에 일반적으로 동반하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 물질을 의미한다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 이용하여 통상적으로 순도 및 동종성을 측정한다. 제제에 존재하는 주된 종인 단백질은 실질적으로 정제된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 용어 "정제된"은 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성한다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 이는 단백질이 순도가 85% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이라는 것을 의미한다.

용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환되어 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체, 및 천연 아미노산 중합체, 변형 잔기를 함유하는 아미노산 중합체 및 비천연 아미노산 중합체에 적용된다.

용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산 및 후에 변형된 아미노산, 예를 들면 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 염기 화학 구조, 예를 들면 수소에 결합되는 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 상기 유사체는 변형된 R 기(예, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가질 수 있지만, 천연 아미노산과 동일한 염기 화학 구조를 보유할 수 있다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 아미노산과 유사하게 기능하는 화학 화합물을 의미한다.

일반적으로 알려진 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 권장하는 1문자 기호로 본원에서 아미노산을 언급할 수 있다. 마찬가지로, 일반적으로 인정되는 1문자 코드로 뉴클레오티드를 언급할 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 실질적으로 동일한 또는 연관된, 예를 들면 자연적으로 인접한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 기능상 동일한 많은 수의 핵산이 대부분의 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈으로 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하는 일 없이 지정된 해당 코돈의 다른 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이가 보존적으로 변형된 변이의 한 종류인 "침묵 변이"이다. 또한, 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 핵산의 침묵 변이를 표현한다. 당업자라면, 특정 문맥에 있어서 핵산에서 각각의 코돈(AUG 및 TGG 제외, AUG는 통상 메티오닌에 대한 유일한 코돈이고, TGG는 통상 트리토판에 대한 유일한 코돈임)은 기능상 동일한 분자를 생성하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 대개 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 침묵 변이는 기재된 서열에서 발현 제품과 관련해서는 함축적이지만, 실제 프로브 서열과 관련해서는 함축적이지 않다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자라면 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가는 "보존적으로 변형된 변이체"(여기서, 변경에 의해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환됨)라는 것을 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 BLOSUM과 같은 보존적 치환 표 및 치환 행렬이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체가 추가로 존재하고 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지 않는다. 서로에 대한 통상적인 보존적 치환으로는 (1) 알라닌(A), 글리신(G); (2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); (3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); (4) 아르기닌(R), 리신(K); (5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); (6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트리토판(W); (7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 (8) 시스테인(C), 메티오닌(M)을 들 수 있다(예를 들면, 문헌[Creighton, Proteins (1984)] 참조).

Ⅰ. 서론

본 발명은 GM-CSF에 고친화도로 결합하고 GM-CSF의 길항제인 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 인간 생식선 V_H 및 V_L 서열에 고도의 동일성을 갖는 가변 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 CDRH3에서의 BSD 서열은 아미노산 서열 RQRFPY(서열 번호 12) 또는 RDRFPY(서열 번호 13)를 포함한다. CDR13에서의 BSD는 FNK 또는 FNR을 포함한다.

BSD가 CDR3의 일부를 형성하고, CDR3를 완성시키고 FR4 서열을 추가시키기 위해 추가 서열이 사용되는 완전한 V 영역이 생성된다. 통상적으로, BSD를 배제한 CDR3의 일부분 및 완전한 FR4는 인간 생식선 서열로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, BSD를 배제한 CDR3-FR4 서열은 각 쇄에서 인간 생식선 서열과 2개 이하의 아미노산이 상이하다. 몇몇 실시양태에서, J 분절은 인간 생식선 J 분절을 포함한다. 예를 들면 공개적으로 이용 가능한 국제 ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스 및 (홈페이지 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk에서의) V-베이스를 통해 인간 생식선 서열을 결정할 수 있다.

인간 생식선 V 분절 목록은 51개의 중쇄 V 분절, 40개의 κ 경쇄 V 분절 및 31개의 λ 경쇄 V 분절로 이루어져, 총 3,621개의 생식선 V 영역 쌍을 만든다. 또한, 이러한 V 분절 대부분에 대해 안정한 대립유전자 변이체가 존재하지만, 생식선 목록의 구조적 다양성에 대한 이러한 변이체의 기여는 제한된다. 인간 생식선 V 분절 유전자 모두의 서열이 공지되어 있고 MRC Centre for Protein Engineering(영국 캠브리지)에 의해 제공되는 V-base 데이터베이스(또한, 문헌[Chothia et al., 1992, JMol Biol 227: 776-798; Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14: 4628-4638; Williams et al., 1996, J Mol Biol 264: 220-232] 참조)에서 접근할 수 있다.

본원에 기재된 항체 또는 항체 단편은 원핵 또는 진핵 미생물 시스템에서 또는 포유동물 세포와 같은 더 고등의 진핵생물의 세포에서 발현될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 임의의 포맷일 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 인간 불변 영역과 같은 불변 영역을 포함하는 완전한 항체일 수 있거나, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, Fv와 같은 완전한 항체의 단편 또는 유도체 또는 단일 도메인 항체, 예컨대 나노바디 또는 카멜리드 항체일 수 있다.

Ⅱ. 중쇄

본 발명의 항GM-CSF 항체의 중쇄는 다음의 구성성분을 포함하는 중쇄 V 영역을 포함한다:

(1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하는 인간 중쇄 V 분절 서열,

(2) 아미노산 서열 R(Q/D)RFPY(서열 번호 22)를 포함하는 CDRH3 영역,

(3) 인간 생식선 J 유전자 분절이 기여하는 FR4.

상보적 V_L 영역과 함께 상기 기재된 CDR3-FR4 분절과 조합되어 GM-CSF에 대한 결합을 보조하는 V 분절 서열의 예가 도 1에 도시되어 있다. V 분절은 예를 들면 인간 VH1 또는 VH3 서브클래스 유래일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, V 분절은 생식선 분절 VH1 1-02 또는 VH1 1-03에 고도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들면, 80%, 85%, 또는 90% 이상의 동일성을 갖는 인간 V_H1 서브클래스 분절이다. 몇몇 실시양태에서, V 분절은 VH1 1-02 또는 VH1 1-03과 15개 이하의 잔기, 바람직하게는 7개 이하의 잔기가 상이하다.

본 발명의 항체의 FR4 서열은 인간 JH1, JH3, JH4, JH5 또는 JH6 유전자 생식선 분절, 또는 인간 생식선 JH 분절에 고도의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 제공된다. 몇몇 실시양태에서, J 분절은 인간 생식선 JH4 서열이다.

또한, CDRH3은 인간 J 분절 유래의 서열을 포함한다. 통상적으로, BSD를 배제한 CDRH3-FR4 서열은 인간 생식선 J 분절과 2개 이하의 아미노산이 상이하다. 통상의 실시양태에서, CDRH3 내 J 분절 서열은 FR4 서열에 사용되는 동일한 J 분절로부터 유래한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, CDRH3-FR4 영역은 BSD 및 완전한 인간 JH3 생식선 유전자 분절을 포함한다. CDRH3 및 FR4 서열의 예시적인 조합이 하기 기재되어 있고(서열 번호 23), 여기서 BSD는 볼드체이고 인간 생식선 J 분절 잔기는 밑줄쳤다:

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 생식선 분절 VH 1-02 또는 VH 1-03; 또는 도 1에 도시된 V_H 영역의 V 분절 중 하나, 예컨대 VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 또는 VH#5의 V 분절 부분에 적어도 90%의 동일성 또는 적어도 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 965, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 V 분절을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, V_H 영역의 V 분절은 도 1에 도시된 바와 같은 CDR1 및/또는 CDR2를 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 서열 GYYMH(서열 번호 24) 또는 NYYIH(서열 번호 25)를 갖는 CDR1; 또는 서열 WINPNSGGTNYAQKFQG(서열 번호 26) 또는 WINAGNGNTKYSQKFQG(서열 번호 27)를 갖는 CDR2를 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, 항체는 도 1에 도시된 V_H 영역 V 분절 중 하나로부터 유래한 CDR1 및 CDR2 둘 다 및 R(Q/D)RFPY(서열 번호 22)를 포함하는 CDR3, 예를 들면, RDRFPYYFDY(서열 번호 16) 또는 RQRFPYYFDY(서열 번호 15)를 갖는다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항GM-CSF 항체는 예를 들면 서열 R(Q/D)RFPYYFDYWGQGTLVTVSS(서열 번호 23)를 갖는 CDR3-FR4 및 도 1에 도시된 바와 같은 CDR1 및/또는 CDR2를 가질 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체의 V_H 영역은 결합 특이성 결정인자 R(Q/D)RFPY(서열 번호 22)를 갖는 CDR3, 인간 생식선 VH1 분절 유래의 CDR2 또는 인간 생식선 VH1 유래의 CDR1을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, CDR1 및 CDR2 둘 다는 인간 생식선 VH1 분절로부터 유래한다.

Ⅲ. 경쇄

본 발명의 항GM-CSF 항체의 경쇄는 다음의 구성성분을 포함하는 경쇄 V 영역을 포함한다:

(1) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하는 인간 경쇄 V 분절 서열,

(2) 서열 FNK 또는 FNR을 포함하는 CDRL3 영역, 예를 들면, QQFNRSPLT(서열 번호 28) 또는 QQFNKSPLT(서열 번호 18),

(3) 인간 생식선 J 유전자 분절이 기여하는 FR4.

V_L 영역은 V람다 또는 V카파 V 분절 중 어느 하나를 포함한다. 상보적 V_H 영역과 조합되어 결합을 보조하는 V카파 서열의 예가 도 1에 기재되어 있다.

V_L 영역 CDR3 서열은 J 분절 유래 서열을 포함한다. 통상적인 실시양태에서, CDRL3 내 J 분절 서열은 FR4에 사용되는 동일한 J 분절로부터 유래한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서 서열은 인간 카파 생식선 V 분절 및 J 분절 서열과 2개 이하의 아미노산이 상이할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CDRL3-FR4 영역은 BSD 및 완전한 인간 JK2 생식선 유전자 분절을 포함한다. 카파 쇄에 대한 예시적인 CDRL3-FR4 조합이 하기 기재되어 있고, 여기서 BSD는 볼드체이고 JK2 서열은 밑줄쳤다:

V카파 분절은 통상적으로 VKⅢ 서브클래스를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 분절은 인간 생식선 VKⅢ 서브클래스에 80% 이상의 서열 동일성, 예를 들면 인간 생식선 VKⅢA27 서열에 80% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, V카파 분절은 VKⅢA27와 18개 이하의 잔기가 상이하다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 V_L 영역 V 분절은 도 1에 도시된 V_L 영역의 인간 카파 V 분절 서열, 예를 들면, VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4의 V 분절 서열에 적어도 85%의 동일성 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.

몇몇 실시양태에서, V_L 영역의 V 분절은 도 1에 도시된 바와 같은 CDR1 및/또는 CDR2를 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 RASQSVGTNVA(서열 번호 31) 또는 RASQSIGSNLA(서열 번호 32)의 CDR1 서열; 또는 STSSRAT(서열 번호 33)의 CDR2 서열을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항GM-CSF 항체는 (도 1에 제시된 V_L 영역의 V 분절의 하나로 도시된 바와 같이 조합으로) CDR1 및 CDR2 및 FNK 또는 FNR를 포함하는 CDR3 서열을 가질 수 있고, 예를 들면, CDR3은 QQFNKSPLT(서열 번호 18) 또는 QQFNRSPLT(서열 번호 28)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 GM-CSF 항체는 FGGGTKVEIK(서열 번호 34)인 FR4 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항GM-CSF 항체는 예를 들면 도 1에 도시된 V_L 영역 중 하나로부터의 CDR1 및 CDR2 둘 다 및 FGGGTKVEIK(서열 번호 34)인 CDR3-FR4 영역을 포함할 수 있다.

Ⅳ. GM - CSF 항체의 제법

본 발명의 항체는 도 1에 도시된 바와 같은 V_H 영역 VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 또는 VH#5 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 도 1에 도시된 바와 같은 V_L 영역 VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4 중 하나를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 도 1에 도시된 바와 같은 V_H 영역 VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 또는 VH#5; 및 도 1에 도시된 바와 같은 V_L 영역 VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4를 갖는다.

항체가 GM-CSF 활성을 길항하는 활성을 보유하는지를 확인하기 위해 항체를 시험할 수 있다. 증식 분석을 비롯한 임의의 수의 종점을 사용하여 길항제 활성을 측정할 수 있다. 기능을 평가하는 임의의 수의 분석을 이용하여 항GM-CSF 항체를 평가할 수 있다. 예를 들면, 제한된 양의 GM-CSF에 대한 반응에서의 GM-CSF 의존 세포주의 증식률을 측정하는 분석과 같은 GM-CSF 리셉터 신호 전달에 대한 세포 기반 분석이 또한 편리하게 이용된다. 이러한 분석에 사용하기에 인간 TF-1 세포주가 적합하다. 문헌[Krinner et al, (2007) Mol. Immunol] 참조. GM-CSF를 억제하는 것이 바람직한 질환을 치료하기 위해 투여되는 항체는 바람직하게는, Kabat에 의해 정의된 바대로, 마우스 단일 클론 항체 LMM 102의 가변 영역 및 CDR을 갖는, 항체 키메라 c19/2의 길항제 활성의 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유한다(예를 들면, WO 제03/068920호):

결합 활성 및 친화도를 결정하기 위해 널리 공지된 분석을 이용하여 고친화도 항체를 확인할 수 있다. 이러한 기술로는 표면 플라스몬 공명 또는 간섭법을 이용하는 ELISA 분석 및 결합 분석을 들 수 있다. 예를 들면, ForteBio(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰) Octet 바이오센서를 사용하여 생체층 간섭법에 의해 친화도를 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 통상적으로 GM-CSF의 글리코실화 형태 및 비글리코실화 형태 둘 다에 유사한 친화도로 결합한다.

본 발명의 항체는 GM-CSF에 대한 결합에 대해 c19/2과 경쟁한다. GM-CSF에 대한 결합에 대해 c19/2를 차단 또는 경쟁하는 본원에 기재된 항체의 능력은 항체가 동일한 에피토프 c19/2에 또는 c19/2에 의해 결합된 에피토프에 가까운, 예를 들면 이와 중첩되는 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 다른 실시양태에서, GM-CSF에 대한 결합에 대해 다른 항체가 경쟁하는지를 평가하기 위해 기준 항체로서 본원에 기재된 항체, 예를 들면, 도 1에 제시된 표에 도시된 V_H 및 V_L 영역 조합을 포함하는 항체를 사용할 수 있다. 항원에 대한 기준 항체의 결합이 시험 항체의 존재 하에 적어도 30%, 일반적으로 적어도 약 40%, 50%, 60% 또는 75%, 및 종종 적어도 약 90% 감소하는 경우, 시험 항체가 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 생각된다. 결합을 평가하기 위해 ELISA, 및 면역블롯과 같은 다른 분석을 비롯한 많은 분석을 이용할 수 있다.

인간 생식선 서열에 가까운 V 영역 서열을 갖는 항체의 분리 방법은 이미 기재되어 있다(US 특허 출원 공보 제20050255552호 및 제20060134098호). 항체 라이브러리는 포유동물 세포, 효모 세포 또는 원핵 세포를 비롯한 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 세포 시스템에서의 발현의 경우, 신호 펩티드가 세포외 배지로 분비를 지시하기 위해 N 말단에 도입될 수 있다. 항체는 신호 펩티드의 존재 또는 부재 하에 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포로부터 분비될 수 있다. 이. 콜라이로부터 항체 단편의 신호 부재 분비 방법은 미국 특허 출원 제20070020685호에 기재되어 있다.

GM-CSF 결합 항체를 생성시키기 위해, 예를 들면 도 1에 도시된 본 발명의 V_H 영역 중 하나는 예를 들면 도 1에 도시된 본 발명의 V_L 영역 중 하나와 조합되고, 적합한 발현 시스템에서 다수의 포맷 중 임의의 포맷으로 발현된다. 따라서, 상기 항체는 숙주 세포 내부에 또는 분비에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 scFv, Fab, Fab'(면역글로불린 경첩부 서열 포함), F(ab')₂(2개의 Fab' 분자의 경첩부 서열 사이의 이황화 결합 형성에 의해 형성됨), 전체 면역글로불린 또는 절두형 면역글로불린 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 메티오닌 잔기는 임의로 예를 들면 신호 부재 발현 시스템에서 생성되는 폴리펩티드에서 N 말단에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 V_H 영역의 각각은 항GM-CSF 항체를 생성시키는 V_L 영역의 각각과 쌍을 이룰 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 예시적인 조합이 표 1에 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 예를 들면 리셉터에 대한 GM-CSF 결합을 억제하여 GM-CSF 리셉터 활성화를 억제하고, GM-CSF에 대해 500 pM와 같은 높은 친화도 결합을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 약 10^-4/sec 이하의 해리 상수를 갖는다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 해리 상수가 느린 항체는 개선된 치료 이익을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 c19/2보다 3배 더 느린 오프-속도(off-rate)를 갖고, 예를 들면, IL-8 생성과 같은 세포 기반 분석에서 10배 더 강력한 GM-CSF 중화 활성을 생성한다(예를 들면, 실시예 2 참조).

원핵 및 진핵 발현 시스템 둘 다를 포함하는 임의의 수의 발현 시스템을 이용하여 항체를 생성할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 발현 시스템은 CHO 세포 발현 시스템과 같은 포유동물 세포 발현 시스템이다. 이러한 많은 시스템이 상업용 공급업자로부터 광범위하게 구입 가능하다. 항체가 V_H 영역 및 V_L 영역 둘 다를 포함하는 실시양태에서, V_H 영역 및 V_L 영역은, 예를 들면 바이시스트로닉(bicistronic) 발현 단위에서 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 단일 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 다른 실시양태에서, V_H 영역 및 V_L 영역은 별도의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 본원에 기재된 V_H 영역 또는 V_L 영역은 임의로 N 말단에 메티오닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv 또는 dAB를 비롯한 임의의 수의 포맷으로 생성될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 대개 감마 쇄 불변 영역, 예를 들면 감마-1, 감마-2, 감마-3 또는 감마-4 불변 영역이다. 다른 실시양태에서, 상기 항체는 IgA일 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항체 V_L 영역, 예를 들면, 도 1의 VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4가 인간 카파 불변 영역(예를 들면, 서열 번호 10)과 조합되어 온전한 경쇄를 형성한다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, V_H 영역은 인간 감마-1 불변 영역과 조합된다. f-동종이인자형과 같은 임의의 적합한 감마-1 f-동종이인자형을 선택할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 VH#1, VH#2, VH#3, VH#4 또는 VH#5로부터 선택되는 V_H(도 1)를 갖는 f-동종이인자형 불변 영역, 예를 들면, 서열 번호 11을 갖는 IgG이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는 VK#1, VK#2, VK#3 또는 VK#4로부터 선택되는 V_L(도 1)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 서열 번호 10에 제시된 바와 같은 카파 불변 영역, 및 서열 번호 11에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역을 갖고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 도 1에 제시된 서열로부터 다음의 조합: (a) VH#2, VK#3; (b) VH#1, VK#3; (c) VH#3, VK#1; (d) VH#3, VL#3; (e) VH#4, VK#4; (f) VH#4, VK#2; (g) VH#5, VK#1; (h) VH#5, VK#2; (i) VH#3, VK#4; 또는 (j) VH#3, VL#3 중 하나를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 예를 들면 항체가 단편일 때, 그 항체는 또 다른 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG화) 또는 혈청 알부민과 접합되어 생체내 확장된 반감기를 제공할 수 있다. 항체 단편의 PEG화의 예는 문헌[(압식시맙(abciximab)의 경우) Knight et al. Platelets 15: 409, 2004; (항CEA 항체의 경우) Pedley et al., Br. J. Cancer 70: 1126, 1994; Chapman et al., Nature Biotech. 17: 780, 1999; Humphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227,2007)]에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fab' 단편의 형태이다. 전장 경쇄는 V_L 영역의 인간 카파 또는 람다 불변 영역에 대한 융합에 의해 생성된다. 불변 영역 중 어느 하나가 임의의 경쇄에 사용될 수 있지만, 통상의 실시양태에서, 카파 불변 영역은 V카파 가변 영역과 조합되어 사용되고, 람다 불변 영역은 V람다 가변 영역과 함께 사용된다.

Fab'의 중쇄는 인간 중쇄 불변 영역 서열, 제1 불변(CH1) 도메인 및 경첩 부위에 대한 본 발명의 V_H 영역의 융합에 의해 생성된 Fd' 단편이다. 중쇄 불변 영역 서열은 면역글로불린 클래스 중 어느 하나로부터 유래할 수 있지만, 대개 IgG 유래이고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래일 수 있다. 또한, 본 발명의 Fab' 항체는 이종성 서열일 수 있고, 예를 들면 경첩부 서열은 하나의 면역글로불린 서브클래스로부터 유래할 수 있고, CH1 도메인은 상이한 서브클래스로부터 유래할 수 있다.

Ⅴ. GM - CSF 가 표적인 질환의 치료를 위한 항 GM - CSF 항체의 투여.

또한, 본 발명은 GM-CSF 활성을 억제하는 것이 바람직한, 즉 GM-CSF가 치료 표적인 GM-CSF와 관련된 질환을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 환자는 만성 염증성 질환, 예를 들면, 관절염, 예를 들면, 류마티스성 관절염, 건선형 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 및 관절의 다른 염증성 질환; 염증성 장 질환, 예를 들면, 궤양성 대장염, 크론씨병, 바렛 증후군, 회장염, 장염 및 글루텐 과민성 장병; 호흡계의 염증성 질환, 예컨대 천식, 성인 호흡 곤란증, 알레르기성 비염, 규폐증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 과민성 폐 질환, 기관지확장증; 피부의 염증성 질환, 예컨대 건선, 경피증, 및 염증성 피부병, 예컨대 습진, 아토피성 피부염, 두드러기 및 소양증; 중추 신경계 및 말초 신경계의 염증을 포함하는 질병, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증, 갈랑 발레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 및 신경 퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병을 앓는다. 본 발명의 방법을 이용하여 다양한 다른 염증성 질환을 치료할 수 있다. 이것으로 전신 홍반성 낭창, 면역 매개 신 질환, 예를 들면 사구체신염 및 척추관절증; 및 바람직하지 않은 만성 염증 성분을 갖는 질환, 예컨대 전신 경화증, 특발성 염증 근육병, 쇼그렌 증후군, 혈관염, 유육종증, 갑상선염, 통풍, 이염, 결막염, 부비강염, 유육종증, 베체트 증후군, 간담즙성 질환, 예컨대 간염, 원발성 담증성 경화, 육아종성 간염 및 경화성 담관염을 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 심혈관계에 대한 손상 이후 염증을 않는다. 다양한 다른 염증성 질환으로 결핵 및 만성 담낭염을 들 수 있다. 추가 만성 염증성 질환은 예를 들면 문헌[Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th Edition, Wilson, et al., eds., McGraw-Hill, Inc.]에 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체에 의해 치료된 환자는 종양 또는 암 세포 성장에 GM-CSF가 기여하는 암, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병을 앓는다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들면 허혈성 심장 질환, 뇌졸중 및 죽상경화증과 같은 심혈관계에 대한 허혈성 손상으로 인해 본 발명의 항체에 의해 치료된 환자는 심부전을 않거나 이의 위험에 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료된 환자는 천식을 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료된 환자는 알츠하이머병을 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료된 환자는 골감소증, 예를 들면 골다공증을 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체에 의해 치료된 환자는 혈소판 감소성 자반증을 않는다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 Ⅰ형 또는 Ⅱ형 당뇨병을 않는다. 몇몇 실시양태에서, 환자는 GM-CSF가 치료 표적인 하나 이상의 질환을 않을 수 있고, 예를 들면, 환자는 류마티스성 관절염 및 심부전, 또는 골다공증 및 류마티스성 관절염 등을 앓을 수 있다.

본 발명의 방법은 질환의 치료에 적합한 용량 요법을 이용하여 환자에게 약학 조성물로서 치료학적 유효량의 항GM-CSF 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 각종의 약물 전달 시스템에 사용하기 위해 조성물을 제제화할 수 있다. 또한, 적절한 제제의 경우 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체가 조성물에 존재할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 제제는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott William & Wilkins, 2005]에서 확인할 수 있다.

항GM-CSF 항체는 환자에 주입하기에 적합한 용액으로 예컨대 무균 등장성 수성 주사용수로 제공된다. 항체는 허용되는 담체 중에 적합한 농도로 용해 또는 현탁된다. 몇몇 실시양태에서, 담체는 수성, 예를 들면 물, 식염수, 인산염 완충 식염수 등이다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 등장화제 등과 같은 생리학적 상태에 근접하는 데 필요한 보조 약학 물질을 포함할 수 있다.

예를 들면, 골감소증, 천식, 류마티스성 관절염, 건선형 관절염, 강직성 척추염, 소아 특발성 관절염, 다발성 근염, 전신 홍반성 루푸스, 심부전, 예를 들면 심장 마비 이후 심장 손상, 혈소판 감소성 자반증, 또는 당뇨병을 앓는 환자와 같은 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 질환 또는 질환의 증상 및 이의 합병증을 치료 또는 저지하는 데 충분한 양으로 투여한다. 이를 성취하기에 적절한 양을 "치료학적 유효 용량"으로 정의한다. 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링함으로써 치료학적 유효 용량을 결정한다. 치료학적 유효 용량을 나타내는 통상의 기준으로는 환자에 있어서의 질환의 증상의 완화를 들 수 있다. 이에 효과적인 양은 질병의 중증도 및 연령, 체중, 성별, 투여 경로 등과 같은 다른 인자를 비롯한 환자의 전신적인 건강 상태에 따라 달라진다. 환자가 필요로 하고 내약성을 나타내는 용량 및 빈도에 따라 항체를 단일 또는 복수 투여할 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 방법은 PcrV 항체의 충분한 분량을 제공하여 환자를 효과적으로 치료한다.

관심 있는 질환을 치료하기 위해 항체를 단독으로 또는 다른 요법과 병용하여 투여할 수 있다.

정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 경로(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 임의의 적합한 경로를 통해 항체를 주사 또는 주입에 의해 투여할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체를 주입법(insufflation)에 의해 투여할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 항체를 4℃에서 무균 등장성 수성 식염 주사용수 중에 10 ㎎/ml로 저장할 수 있고 환자에게 투여하기 전에 주사를 위해 100 ml 또는 200 ml 0.9% 염화나트륨 중에 희석할 수 있다. 항체를 1 시간 동안 0.2 내지 10 ㎎/kg 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여한다. 다른 실시양태에서, 항체를 15 분 내지 2 시간의 기간 동안 정맥내 주입에 의해 투여한다. 또 다른 실시양태에서, 투여 절차를 피하 볼루스 주사를 통해 행한다.

환자에 대해 효과적인 요법을 제공하기 위해 항체의 용량을 선택하고, 신체 체중 kg당 0.1 ㎎ 미만 내지 약 25 ㎎/kg 범위 또는 환자당 1 ㎎~2 g 범위이다. 바람직하게는, 용량은 kg당 1~10 ㎎ 또는 환자당 대략 50 ㎎~1,000 ㎎ 범위이다. 상기 항체의 약동학(예, 순환시 항체의 반감기) 및 약물동태 반응(예, 항체의 치료 효과의 기간)에 따라 1일 1회 내지 3달마다 1회 범위일 수 있는 적절한 빈도로 용량 투여를 반복할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 약 7 내지 약 25 일의 생체내 반감기 및 항체 용량 투여를 1일 1회 내지 3달마다 1회 반복한다. 다른 실시양태에서, 항체를 대략 1달마다 1회 투여한다.

또한, 본 발명의 V_H 영역 및/또는 V_L 영역을 진단 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 환자에서 GM-CSF 수치의 검출과 같은 임상 분석을 위해 V_H 또는 V_L 영역을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면 항Id 항체를 생성하기 위해 본 발명의 V_H 또는 V_L 영역을 사용할 수 있다.

[실시예]

실시예 1. 조작된 인간 항 GM - CSF V 영역의 확인.

미국 특허 출원 제20050255552호에 기재된 바대로 인간화 조작을 수행하였다. 인간 생식선 J 분절 서열과 함께 CDRH3 및 CDR13에서 BSD 서열을 포함하는 CDR3-FR4 영역에 연결된 인간 V 분절 라이브러리 서열로부터 에피토프 중점 라이브러리를 구축하였다. 중쇄의 경우 인간 생식선 JH4 서열을 사용하고, 경쇄의 경우 인간 생식선 JK4 서열을 사용하였다.

재조합 인간 GM-CSF에 대한 결합을 보조하는 Vh1 제한 라이브러리 유래의 전장 인간화 조작 V 영역을 선택하였다. US 특허 출원 공보 제20060134098호(여기서, 쥐과 c19/2 V 분절의 일부분만이 초기에 인간 서열의 라이브러리로 대체됨)에 기재된 "카세트(카세트)" 라이브러리의 구축에 대한 기초로서 "전장" V-카파 라이브러리를 사용하였다. 2가지 유형의 카세트를 구축하였다. 골격구조 2 영역 내에 중첩하는 공통 서열을 갖는 브릿지 PCR에 의해 V-카파 쇄에 대한 카세트를 제조하였다. 이러한 방식으로, 인간 V-카파 Ⅲ 이소타입에 대해 "전단(front-end)" 및 "중간(middle)" 인간 카세트 라이브러리를 구축하였다. GM-CSF에 대한 결합을 보조하는 인간 V-카파 Ⅲ 카세트를 콜로니-리프트(colony-lift) 결합 분석에 의해 확인하고, ELISA에서 친화도에 따라 순번 매겼다. V-카파 인간 "전단" 및 "중간" 카세트를 브릿지 PCR에 의해 함께 융합하여 GM-CSF 결합 활성을 보조하는 전장 인간 V-카파 영역을 재구축하였다. 따라서, 인간화 조작 Fab는 인간 GM-CSF에 대한 결합을 보조하는 V-카파 영역 및 인간화 조작 V-중쇄로 이루어진다.

표면 플라스몬 공명 (spr) 분석에 의해 결합 활성을 결정하였다. 스트렙타비딘 코팅 CM5 바이오센서 칩 위에서 바이오티닐화 GM-CSF를 포획하였다. 이. 콜라이로부터 발현된 인간화 조작 Fab 단편을 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA 및 0.005% P20(pH 7.4) 중의 30 nM의 시작 농도로 희석하였다. 각각의 Fab를 3배 희석 시리즈를 사용하여 4회 희석하고 각각의 농도를 37℃에서 2회 시험하여 여러 밀도 항원 표면에 의해 결합 동역학을 측정하였다. 모든 3개의 표면으로부터의 데이터를 구형으로 피팅하여 해리 상수를 산출하였다.

예시적인 인간화 조작 항GM-CSF V 영역이 도 1에 도시되어 있다.

실시예 2. 인간화 조작 GM - CSF 항체의 평가

본 실시예는 마우스 항체 LMM 102 유래의 가변 영역을 갖는 키메라 IgGIk 항체와 비교하여 세포 기반 분석에서 인간화 조작 항GM-CSF 항체(Ab2)의 결합 활성 및 생물학적 효능을 평가하는 것이다(Nice et al., Growth Factors 3: 159, 1990). Ab1은 Ab2와 동일한 불변 영역을 갖는 GM-CSF에 대한 인간화 조작 IgG1k 항체이다.

Ab1 및 Ab2 에 대한 인간 GM - CSF 의 결합의 표면 플라스몬 공명 분석

Biacore 3000 장치를 사용하여 Ab1 및 Ab2와 글리코실화 인간 GM-CSF의 상호작용에 대해 결합 동역학 및 1가 친화도를 비교하기 위해 표면 플라스몬 공명 분석을 이용하였다. 다클론 항인간 F(ab')₂를 사용하여 Biacore 칩 표면 위에 Ab1 또는 Ab2를 포획하였다. 인간 293 세포로부터 발현된 글리코실화 재조합 인간 GM-CSF를 분석물로서 사용하였다. 2개의 독립 실험에서 동력학적 상수를 결정하였다(도 2 및 표 1 참조). 결과는 이 실험에서 GM-CSF가 상당한 1가 친화도로 Ab2 및 Ab1에 결합한다는 것을 나타낸다. 그러나, Ab1은 Ab2보다 2배 느린 "온-속도(on-rate)"를 갖지만, 대략 3배 느린 "오프-속도"를 가졌다.

표 1. 도 2에서 표면 플라스몬 공명 분석으로부터 37℃에서 결정된 동력학적 상수; 결합 상수(ka), 해리 상수(kd) 및 계산된 친화도(KD)가 표시되어 있다.

GM-CSF는 N 연결 및 0 연결 글리코실화 부위 둘 다에서 자연적으로 글리코실화되지만, 글리코실화는 생물학적 활성에 필요하지 않다. GM-CSF 글리코실화가 Ab1 또는 Ab2의 결합에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 2개의 다른 공급원: 이. 콜라이에서 발현된 GM-CSF(비글리코실화) 및 인간 293 세포로부터 발현된 GM-CSF(글리코실화)로부터 얻은 재조합 GM-CSF를 사용하여 ELISA에서 항체를 비교하였다. 도 3 및 표 2에서의 결과는 항체 둘 다가 동등한 활성으로 글리코실화 및 비 글리코실화 GM-CSF에 결합한다는 것을 나타낸다. 또한, 2개의 항체는 이러한 분석에서 상당한 EC₅₀ 값을 나타냈다.

표 2. ELISA에 의해 결정된 2개의 다른 공급원으로부터 얻은 인간 GM-CSF에 대한 Ab2 및 Ab1의 결합에 대한 EC₅₀의 요약. 인간 293 세포(글리코실화) 또는 이. 콜라이(비글리코실화)로부터 얻은 재조합 GM-CSF에 대한 결합을 2개의 독립 실험으로부터 결정하였다. 실험 1이 도 5에 도시되어 있다.

Ab1은 Ab2에 존재하는 마우스 가변 영역으로부터 유래하는 인간화 조작 항체이다. 경쟁 ELISA에 의해 중첩 에피토프 특이성(Ab2)에 대해 Ab1을 시험하였다.

공지된 기술을 이용하여 바이오티닐화 Ab2를 제조하였다. 바이오티닐화는 ELISA에 의해 결정되는 바대로 GM-CSF에 대한 Ab2의 결합에 영향을 미치지 않았다. 이 분석에서, 바이오티닐화 Ab2의 양을 고정시키고 Ab2 또는 Ab1을 다양한 농도로 첨가하였다. 비표지 Ab 또는 Ab1 경쟁자의 존재 하에 바이오티닐화 Ab2의 검출을 분석하였다(도 4). Ab1 및 Ab2 둘 다 GM-CSF에 대한 결합에 대해 바이오티닐화 Ab2와 경쟁하여 동일한 에피토프에 대해 결합을 나타냈다. Ab1은, 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 Ab2와 비교할 때 Ab1에 대한 더 느린 해리 동역학과 일치하게, Ab2보다 GM-CSF에 대한 결합에 더 효과적으로 경쟁하였다.

Ab1 및 Ab2 에 의한 GM - CSF 활성의 중화

GM-CSF 활성의 중화에 대한 세포 기반 분석을 이용하여 생물학적 효능을 평가하였다. 이 분석은 GM-CSF에 의해 유도된 U937 세포로부터의 IL-8 분비를 측정하는 것이다. 0.5 ng/ml 이. 콜라이 유도 GM-CSF에 의한 16 시간 유도 후 ELISA에 의해 배양 상청액으로 분비된 IL-8을 측정하였다.

이러한 검정에서 Ab1 및 Ab2의 중화 활성의 비교는 도 5에서의 대표적인 분석에서 도시되어 있다. 3개의 독립 실험에서, Ab1은 IC₅₀을 비교할 때 Ab2보다 더 효과적으로 GM-CSF 활성을 억제하였다(표 3).

표 3. GM-CSF 유도 IL-8 발현의 억제에 대한 IC₅₀의 비교. 도 5에 도시된 3개의 독립 실험으로부터의 데이터 및 평균 IC₅₀을 ng/ml 및 nM 단위로 기재하였다.

요약

인간화 Ab1은 25 pM의 산출된 평형 결합 상수(KD)로 GM-CSF에 결합하였다. Ab2는 30.5 pM의 KD로 GM-CSF에 결합하였다. Ab2는 GM-CSF에 대해 Ab1보다 2배 높은 결합 상수(k_a)를 나타냈지만, Ab1은 Ab2보다 3배 느린 해리 동역학(k_d)을 나타냈다. Ab2 및 Ab1은 항원 결합 ELISA에서 글리코실화 및 비글리코실화 GM-CSF에 대해 유사한 결합 활성을 나타냈다. 경쟁 ELISA는 항체 둘 다 동일한 에피토프에 대해 경쟁한다는 것을 확인시켜 준다; Ab1은 Ab2보다 더 높은 경쟁적 결합 활성을 나타냈다. 또한, Ab1은 GM-CSF 유도 IL-8 유도 분석에서 Ab2보다 더 높은 GM-CSF 중화 활성을 나타냈다.

상기 발명이 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예의 방식으로 약간 자세히 기재되어 있더라도, 본 발명의 교시내용의 견지에서 당업자는 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범위로부터 벗어남이 없이 이에 약간 변경 및 변형을 할 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.

본원에 인용된 모든 간행물, 수탁 번호, 특허 및 특허 출원은 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 포함된 것으로 표시된 정도로 참조문헌으로 본원에 포함된다.

본 발명의 항GM-CSF 항체의 예시적인 V_H 영역 서열:

본 발명의 항GM-CSF 항체의 예시적인 V_L 영역 서열:

SEQUENCE LISTING <110> Bebbington, Christopher R. Luehrsen, Kenneth Yarranton, Geoffrey T. KaloBios Pharmaceuticals, Inc. <120> Antibodies to Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor <130> 021167-003210PC <140> WO PCT/US09/41981 <141> 2009-04-28 <150> US 61/048,522 <151> 2008-04-28 <160> 39 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic anti-granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) antibody heavy chain variable region (VH) VH#1 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 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variable region (VH) complementarity-determining region 3 (CDR3) <400> 16 Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic light chain variable region (VL) complementarity-determining region 3 (CDR3) <220> <221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> Xaa = Lys or Arg <400> 17 Gln Gln Phe Asn Xaa Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic light chain variable region (VL) complementarity-determining region 3 (CDR3) <400> 18 Gln Gln Phe Asn Lys Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 19 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human germline heavy chain variable region VH1 1-02 <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 20 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human germline heavy chain variable region VH1 1-03 <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 21 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human germline kappa light chain variable region VKIII A27 <400> 21 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr 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Claims

(a) CDR3 서열 RQRFPYYFDY 또는 RDRFPYYFDY, CDR1 서열 NYYIH 및 CDR2 서열 WINAGNGNTKYSQKFQG를 포함하는 V_H 영역; 및
CDR3 서열 QQFN(K/R)SPLT, CDR1 서열 RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A 및 CDR2 서열 STSSRAT를 포함하는 V_L 영역; 또는
(b) CDR3 서열 RDRFPYYFDY, CDR1 서열 GYYMH 및 CDR2 서열 WINPNSGGTNYAQKFQG를 포함하는 V_H 영역; 및
CDR3 서열 QQFN(K/R)SPLT, CDR1 서열 RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A, CDR2 서열 STSSRAT를 포함하는 V_L 영역
을 포함하는 항GM-CSF 항체.
제1항에 있어서, V_H 영역은 CDR3 서열 RQRFPYYFDY, CDR1 서열 NYYIH 및 CDR2 서열 WINAGNGNTKYSQKFQG를 포함하고, V_L 영역은 CDR3 서열 QQFN(K/R)SPLT, CDR1 서열 RASQSVGTNVA 및 CDR2 서열 STSSRAT를 포함하는 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, V_L 영역이 CDR3 서열 QQFNKSPLT를 포함하는 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, V_H 영역 FR4 서열은 WGQGTLVTVSS인 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, V_L 영역 FR4 서열은 FGGGTKVEIK인 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, V_H 영역 V 분절 서열이 서열 번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 V 영역의 V_H V 분절 서열인 것인 항체.
제6항에 있어서, V_H 영역 서열이 서열 번호 1, 2, 3, 4 또는 5의 서열인 것인 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, V_L 영역 V 분절 서열이 서열 번호 6, 7, 8 또는 9의 V 영역의 V 분절 서열인 것인 항체.
제8항에 있어서, V_L 영역 서열이 서열 번호 6, 7, 8 또는 9의 서열인 것인 항체.
제1항에 있어서, 항체가
a) 서열 번호 2 및 서열 번호 8,
b) 서열 번호 1 및 서열 번호 8;
c) 서열 번호 3 및 서열 번호 6,
d) 서열 번호 4 및 서열 번호 9;
e) 서열 번호 4 및 서열 번호 7;
f) 서열 번호 5 및 서열 번호 6; 및
g) 서열 번호 5 및 서열 번호 7
로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
제10항에 있어서, 항체가 서열 번호 5 및 서열 번호 7의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
제10항에 있어서, 항체가 서열 번호 3 및 서열 번호 6, 또는 서열 번호 1 및 서열 번호 8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체.
제10항에 있어서, IgG인 항체.
제13항에 있어서, 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
제10항에 있어서, 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열의 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
제11항에 있어서, 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역 및 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열의 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
제12항에 있어서, 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열의 중쇄 불변 영역 및 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열의 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
제1항 또는 제2항의 항체를 포함하는, GM-CSF가 치료 표적인 질환을 앓는 환자를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질환은 골감소증, 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 심부전, 허혈로 인한 심장 손상, 또는 당뇨병인 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 질환은 골감소증, 류마티스성 관절염, 천식, 건선, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 심부전, 또는 허혈로 인한 심장 손상인 약학 조성물.
제11항의 항체를 포함하는, GM-CSF가 치료 표적인 질환을 앓는 환자를 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 질환은 골감소증, 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 심부전, 허혈로 인한 심장 손상, 또는 당뇨병인 약학 조성물.
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