KR20080068004A - 뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체 - Google Patents

뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체 Download PDF

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아담 월리엄 클라크
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Abstract

본 발명은 적어도 2 개의 상보성결정영역 (complementarity determining regions) (CDRs) 및 적어도 3 개의 구조형성영역 (framework regions)을 포함하는 가변영역 (variable region)을 가진 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 제공한다. 구조형성영역은 뉴 월드 영장류 구조형성영역이거나 그로부터 유래하며, 적어도 하나의 CDR은 비-뉴 월드 영장류 CDR (non-New World primate CDR)이다.

Description

뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체 {ENGINEERED ANTIBODIES WITH NEW WORLD PRIMATE FRAMEWORK REGIONS}
본 발명은 적어도 2 개의 상보성결정영역 (complementarity determining regions) (CDRs) 및 적어도 3 개의 구조형성영역 (framework regions)을 포함하는 가변영역 (variable region)을 가진 항체 또는 그의 항원-결합 부위에 관한 것이다. 구조형성영역은 뉴 월드 영장류 구조형성영역이거나 그로부터 유래하며, 적어도 하나의 CDR이 개질된 뉴 월드 영장류 CDR 또는 비-뉴 월드 영장류 CDR (non-New World primate CDR)이다.
항체 (면역글로불린)은 포유류의 면역 시스템에서 중요한 역할을 수행한다. 그들은 전구체 B 세포로부터 발생한 플라스마 세포로부터 생산된다. 항체는 디설파이드 가교로 연결된 2 개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2 개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 구성된다. 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄라 지칭하고 중쇄는 감마, 뮤, 델타, 알파 또는 입실론이라 지칭한다. 각각의 쇄는 불변 및 가변 영역으로 구성된다. 가변영역은 항체에 특이성을 부여한다. 각 가변영역 내에는 과변이 (hypervariability) 영역 또는 상보성결정영역 (CDRs)이 존재하고, 이들의 측면에는 구조형성영역이라 지칭하는 보다 더 보존된 영역이 있다. 각 가변영역 내에는 3 개의 CDR 및 4 개의 구조형성영역이 존재한다.
항체는 두 가지 기능의 분자로서, 중쇄 및 경쇄의 N-말단 가변 분절 (segment)이 특이적 방법으로 함께 연합하여 항원 표면 상의 특정 에티토프 (epitope)에 대한 친화성을 가진 3-차원 구조를 생성한다. 불변 영역 분절은 혈청 반감기의 연장 및 항체의 효과기능 (effector function)의 역할을 담당하며 상보적 결합, 식세포작용 (phagocytosis)의 자극, 항체 의존 세포 독성 및 과립구 미립 (granulocyte granule) 방출의 촉발에 관여한다.
하이브리도마 (hybridoma) 기술의 발전으로 특정한 특이성의 모노클로날 항체의 생산이 용이해졌다. 통상적으로 이러한 하이브리도마는 쥐과의 하이브리도마이다.
마우스 게놈의 항체 가변영역 서열을 인간 게놈의 항체 불변영역 서열과 조합한 인간/마우스 키메릭 항체 (chimeric antibody)가 창안되었다. 키메릭 항체는 마우스 모항체 (parental mouse antibody)의 결합 특성 및 인간 불변영역과 연계된 효과 기능을 나타낸다. 키메릭 항체는 숙주세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포에서 발현시켜 생산한다.
이러한 키메릭 항체가 인간 요법에 사용되어 왔으나, 상기 키메릭 항체에 대한 항체가 인간 수용자에서 생성되었다. 이러한 항-키메릭 항체는 키메릭 항체를 이용한 지속적 요법에 있어서 불리하다.
생체내 인간 요법에 있어서 마우스 모노클로날 항체에 비하여 인간 모노클로날 항체가 개선책이 되리라는 기대가 제시되어 왔다. 올드 월드 영장류 (레수스 원숭이 및 침팬지)로부터의 항체 연구로부터, 이러한 비-인간 영장류 항체는 그들이 인간 항체와 구조적으로 유사하기 때문에 인간에게 용인될 것이라는 주장이 제기되어 왔다 (Ehrlich PH et al., Clin Chem., 1988, 34:9 1681-1688). 추가로, 인간 항체가 레수스 원숭이에서 비-면역원성 (non-immunogenic)이기 때문에 (Ehrich PH et al., Hybridoma, 1987, 6:151-60), 그 역 또한 성립하여 영장류 항체가 인간에게 비-면역원성일 가능성이 있다. 상기 모노클로날 항체들은 림프구를 인간 × 마우스 헤테로골수종 (heteromyeloma)에 융합시켜 작제한 하이브리도마에 의해 분비된다.
EP 0 605 442는 인간 항원에 결합하는 키메릭 항체를 개시한다. 이러한 항체는 올드 월드 원숭이의 가변영역 전체 및 인간 또는 침팬지 항체의 불변영역을 포함한다. 이러한 작제물에 대하여 상기 문헌에서 제시하는 장점은, 마우스 숙주에서 유도된 항체에 비하여 인간에서의 면역원성이 낮은 인간 항원에 대한 항체를 올드 월드 원숭이에서 유도하는 능력이다.
뉴 월드 영장류 (infraorder- Platyrrhini)는 통상 2 개 계열, 즉 칼리트리 시다에 (Callithricidae ) 및 세비다에 (Cebidae )로 나누어지는 적어도 53 종을 포함한다. 칼리트리시다에는 마모셋 (marmoset) 및 타마린 (tamarin)으로 구성된다. 세비다에는 다람쥐 원숭이 (squirrel monkey), 티티 원숭이 (titi monkey), 거미 원숭이 (spider monkey), 양털 원숭이 (woolly monkey), 흰목꼬리감기 원숭이 (capuchin), 우아카리스 (uakaris), 사키스 (sakis), 밤 또는 올빼미 원숭이 (night or owl monkey) 및 고함 원숭이 (howler monkey)를 포함한다.
진화적으로 먼 영장류, 예를 들어 뉴 월드 영장류는, 인간 항원에 대한 항체 생성을 허용할 만큼 인간과 충분히 다를 뿐 아니라, 인간 항체와 유사한 항체를 가질 만큼 인간과 충분히 유사하기 때문에, 이러한 영장류-유래 항체가 인간에게 도입되었을 때 숙주는 항-항체 면역반응을 일으키지 않는다.
선행 연구는 칼리트릭스 자크후스 (Callithrix jacchus) 마모셋의 발현된 면역글로불린 중쇄 레퍼토리의 특성을 조사하였다 (von Budingen H-C et al., Immunogenetics, 2001, 53:557-563). 인간 IGHV 대응물에 대하여 고도의 서열 유사성을 나타내는 6 개 IGHV 서브그룹이 동정되었다. 구조형성영역은 상보성결정영역 (CDR)에 비교할 때 더 보존되어 있었다. 씨. 자크후스 및 인간 IGHV 서열 사이의 유사도는 비-인간 올드 월드 영장류 및 인간 사이에서보다 낮았다.
도메인 항체 ( domain antibodies )
도메인 항체 (dAb)는 항체 골격 (antibody framework)을 이용하여 생성시킬 수 있는 기능성 결합 단위 (functional binding unit)로서 항체의 중쇄 가변영역 (VH) 또는 경쇄 가변영역 (VL)에 해당한다. 도메인 항체는 약 13 kDa 또는 전체 항체 크기의 십분의 일 미만의 분자량을 가지고 있다.
면역글로불린 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄라고 지칭되고 중쇄는 감마, 뮤, 델타, 알파 또는 입실론이라고 지칭된다. 가변영역은 항체에 특이성을 부여한다. 각 가변영역 내에는 과변이 영역, 다른 명칭으로는 상보성결정영역 (CDR)이 존재하 고, 이들의 측면에는 구조형성영역이라 지칭하는 보다 더 보존된 영역이 있다. 각각의 경쇄 및 중쇄 가변영역 내에는 3 개의 CDR 및 4 개의 구조형성영역이 존재한다.
전통적 항체와는 대조적으로, 도메인 항체는 박테리아, 효모 및 포유류 시스템에서 잘 발현된다. 그들의 작은 크기로 인해 산물 그람 당 몰 양이 커지므로, 효력이 유의적으로 증가한다. 추가로, 도메인 항체는 2 개 이상의 가변 도메인을 포함하는 작제물이 2 개 이상의 치료적 표적에 결합하는 다중 표적화 dAb, 또는 폐 또는 경구투여에 표적화된 dAb와 같은 치료적 산물을 창안하기 위한 기초요소로 이용될 수 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 뉴 월드 영장류가 인간에서의 면역원성이 낮을 것으로 예상되는 항체 서열의 제공원이라는 것을 발견하였다.
뉴 월드 영장류는 뉴 월드 및 올드 월드 영장류의 분기점에 존재하는 면역글루불린 서열의 저장소로서 선택되었다. 핵심 착상은 이 저장소가 올드 월드 영장류에서 발견되는 면역글루불린 서열의 이후 분기보다 원시적인 면역글루불린 서열을 생산할 수 있으리라는 것이었다. 이러한 원시 서열은 T 세포 레퍼토리와 공존해왔을 것이며, 이는 올드 및 뉴 월드 영장류의 분기점으로 추산되는 35 백만년 전 (MYA)부터 인간에 이르는 경로 상에서 그가 후속의 진화를 하였기 때문이다 (Schneider H et al, Mol Phylogenet Evol., 1993 Sep;2(3):225-42.). 이는 면역학적 용인성을 위한 장기간의 선택을 의미하며, 따라서 본 발명자들은, 상기 원시 서열에는 보다 최근에 진화한 어떤 헬퍼 T 세포 (helper T cell) 에피토프가 없을 것이라고 예상하였다.
따라서 본 발명은 첫 번째 태양에서 적어도 2 개의 상보성결정영역 (CDRs) 및 적어도 3 개의 구조형성영역을 포함하고, 여기에서 구조형성영역은 뉴월드 영장류 구조형성영역이거나 그로부터 유래된 것이며, 여기에서 적어도 하나의 CDR은 비-뉴 월드 영장류 CDR인 가변영역을 가진, 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 제공한다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 특정 질환 또는 장애와 관련된 항원의 검출을 위한 진단적 적용에 있어서 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 용도를 제공한다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체 또는 그의 항원 결합 부위 (또는 그의 약제학적 조성물)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 TNF-α와 결합함을 특징으로 하여, 인간 대상에서 인간 TNF-α 활성의 특성을 가진 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 명세서에 기술된 항체 및 그의 항원 결합 부위 및 그의 약제학적 조성물의 의약 제조에 있어서의 용도가 제공된다. 특히, 본 명세서에 기술된 질환 또는 장애의 치료 또는 진단에 사용되는 의약의 제조.
추가의 태양에서 본 발명은, 세포 표면 항원 또는 사이토카인 (cytokine)과 결합하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합이 적어도 2 개의 상보성결정영역 (CDRs) 및 적어도 3 개의 구조형성영역을 포함하는 가변영역을 포함하며, 여기에서 CDR은 항체 또는 항원-결합 부위가 세포 표면 항원 또는 사이토카인에 결합하도록 선택된, 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 제공한다.
별도로 표시하거나 문맥상 명확히 지시되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 항체 및 그의 항원 결합 부위는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물에 제한 없이 사용될 수 있으며 본 명세서에 기술된 키트에 혼입될 수 있도록 의도된다. 또한 추가로, 별도로 표시하거나 문맥상 명확히 지시되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 항체 및 그의 항원 결합 부위는 약제학적 조성물 및 키트와 마찬가지로 본 명세서에 개시된 진단 및 치료 방법에 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
첫 번째 태양에서 본 발명은 적어도 2 개의 상보성결정영역 (CDRs) 및 적어도 3 개의 구조형성영역을 포함하고, 여기에서 구조형성영역은 뉴월드 영장류 구조형성영역이거나 그로부터 유래된 것이며, 여기에서 적어도 하나의 CDR은 비-뉴 월드 영장류 CDR인 가변영역을 가진, 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 제공한다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 특정 질환 또는 장애와 관련된 항원의 검출을 위한 진단적 적용에 있어서 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 용도를 제공한다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체 또는 그의 항원 결합 부위 (또는 그의 약제학적 조성물)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 TNF-α와 결합함을 특징으로 하여, 인간 대상에서 인간 TNF-α 활성의 특성을 가진 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 가변영역은 3 개의 CDR 및 4 개의 구조형성영역을 포함한다. 항체가 인간에서 낮은 예상 면역원성을 가짐이 또한 바람직하다.
항체 또는 그의 항원-결합 부위의 가변영역은 상이한 제공원으로부터의 CDR의 조합을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서 가변영역은, 적어도 하나의 쥐과 CDR 서열 (바람직하게는 마우스 또는 랫트), 적어도 하나의 인간 CDR 서열, 적어도 하나의 합성 CDR 서열, 적어도 하나의 토끼 CDR 서열, 적어도 하나의 개질된 뉴 월드 영장류 CDR 서열 및 상기 중 2 개 이상의 배합, 적어도 하나의 인간 CDR 및 적어도 하나의 쥐과 CDR, 적어도 하나의 인간 CDR 및 적어도 하나의 합성 CDR, 적어도 하나의 인간 CDR 및 적어도 하나의 토끼 CDR, 적어도 하나의 인간 CDR 및 적어도 하나의 뉴 월드 영장류 CDR, 적어도 하나의 쥐과 CDR 및 적어도 하나의 합성 CDR, 적어도 하나의 쥐과 CDR 및 적어도 하나의 토끼 CDR, 적어도 하나의 쥐과 CDR 및 적어도 하나의 뉴 월드 영장류 CDR, 적어도 하나의 합성 CDR 및 적어도 하나의 토끼 CDR, 적어도 하나의 합성 CDR 및 적어도 하나의 뉴 월드 영장류 CDR, 적어도 하나의 토끼 CDR 및 적어도 하나의 뉴 월드 영장류 CDR로 구성된 그룹으로부터 선택된 CDR을 포함한다.
바람직한 형태에서 가변영역은 3 개의 쥐과 CDR 서열, 특히 3 개의 마우스 CDR 서열을 포함한다.
다른 한 구체예에서 가변영역은 3 개의 인간 CDR 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서 가변영역은 4 개의 뉴 월드 영장류 구조형성영역 또는 뉴 월드 영장류 구조형성영역으로부터 유래된 4 개의 구조형성영역을 포함한다.
일부 구체예에서 항원-결합 부위는 도메인 항체이다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 부위는 인간 또는 비-인간 올드 월드 영장류 불변영역 서열 또는 그의 조합을 추가로 포함한다.
비-인간 올드 월드 영장류의 예는 침팬지, 개코 원숭이 (baboons), 오랑우탄, 짧은꼬리 원숭이 (macaques) 및 고릴라를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 추가의 구체예에서, dAb는 다량체화될 (multimerised) 수 있으며, 예를 들어, 헤테로- 또는 호모이량체 (예를 들어, VH/VH, VL/VL 또는 VH/VL), 헤테로- 또는 호모삼량체 (예를 들어, VH/VH/VH, VL/VL/VL, VH/VH/VL 또는 VH/VL/VL), 헤테로- 또는 호모사량체 (예를 들어, VH/VH/VH/VH, VL/VL/VL/VL, VH/VH/VH,VL, VH/VH/VL/VL 또는 VH/VL/VL/VL) 또는 더 고도의 헤테로- 또는 호모다량체일 수 있다. 다량체화는 항원 결합 강도를 증가시킬 수 있으며, 여기에서 결합 강도는 다중 결합 부위의 결합 친화성의 합과 관련된다.
예를 들어, 본 발명은 도메인 항체를 제공하며, 여기에서 도메인 항체는 적어도 하나의 추가 도메인 항체에 연결된다. 각 dAb는 동일한 항원 또는 상이한 항원에 결합할 수 있다.
dAb 다량체는, 각 dAb가 상이한 항원과 결합하는 연결된 하나 이상의 dAb, 즉 소위 "이중-특이적 리간드"를 포함하는 다중-특이적 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이중 특이적 리간드는 한 쌍의 VH 도메인 또는 한 쌍의 VL 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 이중-특이적 리간드는 본 명세서에 원용으로서 그 전체가 포함되어 있는 WO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804)에 도만티스 리미티드 (Domantis Ltd)의 이름으로 기재되어 있다.
뉴 월드 영장류 구조형성영역 서열은 바람직하게는 마모셋, 타마린, 다람쥐 원숭이, 티티 원숭이, 거미 원숭이, 양털 원숭이, 흰목꼬리감기 원숭이, 우아카리스, 사키스, 밤 또는 올빼미 원숭이 및 고함 원숭이로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴 월드 영장류, 가장 바람직하게는 마모셋으로부터 유래한다.
바람직하게는, 키메릭 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 결합하는 항원은 본질적으로 펩티드, 단백질, 탄수화물, 당단백질, 지질 또는 당지질로서, 암태아 항원 (carcinoembryonic antigen), EpCAM, 루이스-Y (Lewis-Y), 루이스-Y/b (Lewis-Y/b), PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL 및 VEGF 수용체를 포함하는 종양-관련 항원, CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC 클라스 I, MHC 클라스 II, GM-CSF, 인터페론-γ, IL-1, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, 및 IgE를 포함하는 면역 또는 염증성 질환 또는 장애에 관련된 항원, 당단백질 IIb/IIIa, P-당단백질을 포함하는 숙주세포에서 발현되는 항원, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD56, CD58, CD62 또는 CD144를 포함하는 퓨린성 수용체 및 유착 수용체, 사이토카인, 케모카인을 포함하는 항원, 에오탁신 (eotaxin), IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF 및 그들의 수용체를 포함하는 성장인자 또는 다른 가용성 생리학적 조절자 또는 그의 수용체, β-아밀로이드 및 프리온을 포함하는 중추신경계 질환 또는 장애에 관련된 항원, 호흡기 신시셜 바이러스 (respiratory syncitial virus) 단백질 F, 탄저균 (anthrax) 독소, 방울뱀 독액 및 디곡신을 포함하는 미생물성 (microbial), 미소생물성 (nanobial) 또는 바이러스성 항원 또는 독소와 같은 비-인간 기원의 항원으로부터 선택되며; 여기에서 키메릭 항체는 작용제 또는 길항제로서 작용하거나 보체 (complement) 또는 살해 세포 (killer cells) (예를 들어 NK 세포)와 함께 작용하여 바람직하지 않은 세포 (예를 들어 항-CD4)를 고갈 (살해 또는 제거)시키는 활성을 가지거나 세포독성 약제 활성을 가지거나 식세포 (phagocyte)에 의한 Fc-수용체 결합을 유발하거나 그 표적의 생물학적 활성을 중화 (neutralize)시킨다.
적어도 하나의 구조형성영역 서열을 개질하여 결합 또는 유효성을 증가시키거나 인간에서의 예상 면역원성을 감소시킴도 또한 바람직하다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위의 결합 또는 유효성의 증가 또는 인간에서의 예상 면역원성 감소는 구조형성영역이 개질되지 않은 항체 또는 항원 결합 부위에 대해 상대적이다.
다른 구체예에서 결합 또는 유효성을 증가시키거나 인간에서의 예상 면역원성을 감소시키기 위하여 하나 이상의 CDR 서열을 개질한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위의 결합 또는 유효성의 증가 또는 인간에서의 예상 면역원성 감소는 구조형성영역이 개질되지 않은 항체 또는 항원 결합 부위에 대해 상대적이다.
결합의 증가는 항체 또는 그의 항원 결합 부위에 대한 KD (K off /K on )의 감소에 의해 입증된다. 유효성의 증가는 생물학적 활성조사에 의해 입증된다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 유효성을 측정하기 위해 이용될 수 있는 활성조사는, TNFα-유도된 L929 세포독성 중화 활성조사, IL-12-유도된 인간 PHA-활성화된 말초혈액 단핵구 (peripheral blood mononuclear cell) (PBMC) 증식 활성조사, 및 마우스 비장림프구 (splenocytes)의 RANKL 매개된 파골세포 (osteoclast) 분화를 포함한다 (Stern, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6808 - 6812 (1990); Kong, Y-Y. et al. Nature 397:315 - 323 (1990); Matthews, N. and M.L. Neale in Lymphokines and Interferons , a Practical Approach , 1987, M.J. Clemens, A.G. Morris and A.J.H. Gearing, eds., IRL Press, p. 221).
본 명세서에서 용어 "항체"는 2 개의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L)가 디설파이드 결합으로 서로 연결된 4 개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변영역 (HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변영역을 포함한다. 중쇄 불변영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3 개 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변영역 (LCVR 또는 VL) 및 경쇄 불변영역을 포함한다. 경쇄 불변영역은 하나의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 구조형성영역 (FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성결정영역 (CDR)이라고 지칭되는 과변이 영역으로 추가 세분할 수 있다. 각 VH 및 VL 는 아미노-말단에서 카복시-말단까지 하기의 순서로 배열되는 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본 명세서에서 사용하는 용어, 항체의 "항원-결합 부위"는 항원에 결합능을 나타내는 면역글로불린의 하나 이상의 구성요소 또는 유도체를 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 입증 되어 있다. 용어, 항체의 "항원-결합 부위"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1 가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 경첩 (hinge) 영역에서 디설파이드 가교로 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2 가 단편; (iii) VH 및 CH1 영역으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 영역으로 구성되는 Fv 단편; (v) 단일 VH 도메인 또는 VL 도메인 (van den Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310, 591)으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al, 1989, Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성결정영역 (CDR). 또한, Fv 단편의 2 개 도메인, VL 및 VH가 독립적인 유전자에 의해 암호화 되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 단일 쇄 Fv (scFv)로 알려진 1 가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄를 만들 수 있도록 하는 합성 연결부 (linker)에 의한 재조합 방법을 이용하여 그들을 연결할 수 있다; (예를 들어 참조: Bird et al ., 1988, Science 242:423-426 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). 이러한 단일 쇄 Fvs도 용어, 항체의 "항원-결합 부위"에 포함된다. 단일 쇄 Fvs의 다른 형태 및 다이아바디 (diabody) 또는 트리아바디 (triabody)와 같은 관련 분자들도 또한 포함된다. 다이아바디는 2 가 항체로서, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2 개 도메인이 쌍을 이루기에는 너무 짧은 연결부를 사용함으로써, 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2 개의 항원 결합 부위를 생성하도록 한다 (예를 들어 참조: Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al., 1994, Structure, 2:1121-1123).
본 발명에 따른 항체의 생산 방법은 당업자에게 익숙할 것이며, 예를 들어 본 명세서에 원용에 의해 그 전체 내용이 포함된 미국특허 제 4,816,567 호, 제 5,585,089 호 및 미국특허공개 제 20030039649 호를 참조할 수 있다. 이러한 방법들은 표준 재조합 기술의 이용을 요구한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 인간 숙주에 대해 낮은 면역원성을 가질 것으로 예상된다.
"낮은 면역원성"은, 충분한 크기의 항체를 투여받은 개체의 적어도 대부분에 있어서, 치료적 효능을 달성하기에 충분한 시간 동안, 항체가 계속되는 항체 투여의 유효성을 감소시키는 항체 반응을 일으키지 않음을 의미한다.
인간에서의 면역원성 수준은 모든 대립유전자 (allele)의 1% 경계값 (threshold value) 분석을 사용하는 MHC 클라스 II 결합 예상 프로그램 프로프레드 (Propred) (http://www.imtech.res.in/raghava/propred)를 이용하여 예상할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 프로그램은 하기와 같은 것들을 포함한다.:
Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)
Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com)
면역원성이 낮은 분자는 출발 공여자 분자에 비하여 표적집단 (target population)에서 고발현되는 MHC 클라스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예상되는 펩티드를 함유하지 않거나 감소된 수로 함유한다 (Flower DR, Doytchinova IA. (2004) Immunoinformatics and the prediction of immunogenicity, Drug Discov Today, 9(2): 82-90).
MHC 클라스 II 결합의 기능적 분석은 관심 대상 단백질에 상응하는 중첩 펩티드 (overlapping peptide)를 생성시켜 이들이 T 세포 활성화를 이끌어내는 능력 (T 세포 증식 활성조사) 또는 리포터 펩티드 (reporter peptide), 즉 공지된 MHC 클라스 II-결합 펩티드를 치환 (displace)하는 능력을 시험함으로써 수행된다 (Hammer J et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2353).
본 명세서에서 뉴 월드 영장류 구조형성영역과 관련하여 사용되는 용어 "(으)로부터 유래된"은 뉴 월드 영장류 구조형성영역의 서열이 천연 서열로부터 변경됨을 의미한다. 통상 그 변화는 미국특허 제 5,585,089 호 및 미국특허공개 제 20030039649 호에 기재된 바와 같이 결합을 증가시키기 위한 것이거나 인간에 대한 예상 면역원성을 감소시키기 위한 것이다: 용어 "(으)로부터 유래된"은 인간 구조형성 서열과 동일한 가변영역 내에 존재하는 구조형성영역의 전체 서열로 귀착되는 변화를 포함하지 않는다. 비교를 위하여 이용될 수 있는 데이터베이스는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/이다.
본 발명의 추가의 태양은 세포 표면 항원 또는 사이토카인과 결합하도록 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 제공하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합은 적어도 2 개의 상보성결정영역 (CDR) 및 적어도 3 개의 구조형성영역을 포함하고, 여기에서 CDR은 항체 또는 항원-결합 부위가 세포 표면 항원 또는 사이토카인에 결합하도록 선택된다.
본 명세서에서 용어 "설계된"은 뉴 월드 영장류 CDR이 본 명세서에 그 전체 내용이 원용에 의해 포함된 문헌 (Hoogenboom et al., PCT Publication No. WO 93/06213 및 Jespers et al, BIO/TECHNOLOGY Vol 12 1994, pp 899-903)에 기술된 에피토프 임프린팅 방법 (epitope imprinting method)을 이용하여 선택되었음을 의미한다. 상기 방법에서 사용되는 항체 라이브러리는, 바람직하게는 본 명세서에 그 전체 내용이 원용으로서 포함된 문헌 (McCafferty et al., PCT Publication No. WO 92/01047, McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; 및 Griffiths et al., 1993, EMBO J, 12:725-734)에 기술된 바와 같이 제작하여 스크리닝한 scFv 라이브러리이다.
예를 들어, 일단 초기 인간 VL 및 VH 분절 (segment)이 선택되면, 초기 선택된 VL 및 VH 분절들의 상이한 쌍들을 hTNF-α 결합에 대해 스크리닝하는 "혼합 및 맞춤 (mix and match)" 실험을 수행하여 바람직한 VL/VH 쌍의 조합을 선택한다. 추가로 친화성을 더욱 개선하고/하거나 hTNF-α 결합에 대한 오프 속도 상수 (off rate constant)를 낮추기 위하여, 바람직한 VL/VH 쌍의 VL 및 VH 분절들을, 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서, 자연적인 면역반응 중에 항체의 친화성을 숙성시키는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 과정으로 무작위 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 시험관내 친화성 숙성은 VH CDR3 또는 VL CDR3에 각각 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭함으로써 달성될 수 있으며, 여기에서 프라이머는 임의의 위치에 4 가지 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합으로 "스파이크"되어 (spiked), PCR 결과 산물이 VH 및/또는 VL CDR3 영역에 무작위 돌연변이가 도입된 VH 및 VL 분절을 암호화하도록 한다. 상기 무작위 돌연변이 VH 및 VL 분절들을 항원 결합에 대해 다시 스크리닝하여 항원 결합에 대한 높은 친화성 및 낮은 오프 속도를 나타내는 서열을 선택할 수 있다.
관심 대상 항원과 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리 (display library)로부터 스크리닝 및 분리한 후에, 선택된 항체를 암호화하는 핵산을 디스플레이 패키지 (display package) (예를 들어, 파아지 게놈)로부터 회수하여 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 다른 발현 벡터에 서브클로닝할 수 있다. 필요한 경우에는, 핵산을 추가로 조작하여 본 발명의 다른 항체를 만들 수 있다 (예를 들어, 추가의 불변영역과 같은 추가의 면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산에 연결). 조합 라이브러리 (combinatorial library)의 스크리닝에 의해 분리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해서, 항체를 암호화하는 DNA를 재조합 발현 벡터에 클로닝하여 포유류 숙주 세포에 도입한다.
표적화할 수 있는 세포 표면 항원 및 임프린팅에 사용할 수 있는 항체의 예는 하기와 같은 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
항원 항체 (참고문헌)
CD3 OKT3 (Van Wauwe-JP et al (1980) Journal of Immunology 124:2708-13)
CD20 1F5 (Press-OW et al (1987) Blood 69:584 Y2B8 (White-CA et al (1991) Pharm. Sci. Technol. Today 2: 95-101
CD33 P67.6 (Koller-U & Peschel-CH, In Knapp-W et al Eds Leukocyte Typin IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press 1989: 812-813
CD52 CAMPHATH 1 (Hale-G et al (1983) Blood 62:873-82)
EGF-R mAb225 (Bruell-D et al (2005) Int J Mol Med 15:303-313)
당단백질 IIb/IIIa 10E5 & 7E3 (Coller-BS (1985) Journal of Clinical Investigation 76: 101-108)
Her-2 4D5 (Kumar-R et al (1991) Mol. Cell Biol 11: 979-86)
CD25 Mab: RFT5 (Engert-A et al (1991) Int J Cancer 49: 450-456)
표적화할 수 있는 사이토카인 및 임프린팅에 사용할 수 있는 항체의 예는 하기와 같은 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
항원 항체 (참고문헌)
TNF-α mAb195 (Moller-A et al (1990) Cytokine 2: 162-169) mAb1, 11, 12, 20, 21, 25, 31, 32, 37, 42, 47, 53, 54 (Rathjen DA et al (1991) Molecular Immunology 28: 79-86)
VEGF mAbs A3.13.1, A4.6.1, B4.3.1, & B2.6.2 (Kim-KJ (1992) Growth Factors 7: 53-64)
본 발명은, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변영역 유전자 패밀리에 특이적인 프라이머를 사용하여 뉴 월드 영장류 림프구에서 추출된 핵산으로부터의 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의한, 뉴 월드 영장류 면역글로불린 유전자의 증폭 방법에 추가로 기초한다. 뉴 월드 영장류 재조합 키메릭 항체를 생산하기 위하여, 증폭된 가변영역을 인간 또는 영장류 불변영역 유전자를 포함하는 발현 벡터에 클로닝한다. 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 항체 중쇄 및 경쇄의 유전자를 얻고, 이러한 유전자를 재조합 발현 벡터에 혼입한 후, 벡터를 숙주 세포에 도입한다 (참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)).
적당한 발현 벡터는 당업자에게 주지되어 있다. 면역글로불린을 생산하는 뉴 월드 영장류 림프구는 통상 골수종 세포주와의 융합에 의해 불멸화 (immortalised) 되어 하이브리도마를 생성한다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하는 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다.
포유류 발현 시스템 외에도, 본 발명은 또한 식물 또는 원핵생물 (박테리아)에서 유래된 것과 같은 비-포유류 발현 시스템의 사용도 고찰한다. 이러한 발현 시스템은 당업자에게 주지되어 있다.
VH, VL 및 불변영역 도메인의 레퍼토리는 자연계에 나타나는 면역글로불린 서열의 레퍼토리 또는 합성 레퍼토리일 수 있다. 자연계에 나타나는 레퍼토리는, 예를 들어 하나 이상의 영장류에서 획득한 면역글로불린 발현 세포로부터 얻어진다. 상기 레퍼토리는 미경험 (naive), 즉 신생 면역글로불린 발현 세포로부터 얻어진 것이거나, 재배열, 즉 예를 들어 성체 영장류 B 세포로부터 얻어진 것일 수 있다. 필요한 경우, 개선된 결합 특성을 가진 변이체를 생산하여 선택하기 위하여, 자연적 레퍼토리로부터 동정된 클론 또는 표적 항원에 결합하는 임의의 레퍼토리를 돌연변이 및 추가 스크리닝한다.
면역글로불린 가변 도메인의 합성 레퍼토리는 클로닝된 가변 도메인에 인공적으로 다양성을 도입함으로써 얻어진다. 이러한 친화성 숙성 기술은 문헌 (R.A. Irving et al ., 2001, Journal of Immunological Methods, 248, 31-45)에 기술된 바와 같이 당업자에게 주지되어 있다.
핵산, 예를 들어 cDNA를 제공하고, 항체 유전자의 5'리더 서열 (5'leader sequence)을 암호화하는 cDNA 서열에 상보적인 프라이머를 제공하고, 상기 cDNA 및 프라이머를 접촉시켜 하이브리드 복합체를 형성하도록 한 후 cDNA를 증폭시켜 뉴 월드 영장류 항체 유전자의 가변영역 (또는 CDR 영역)을 암호화하는 핵산을 생산함으로써 뉴 월드 영장류 항체 유전자의 가변영역 또는 그의 CDR을 클로닝할 수 있다.
본 명세서의 교시로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는, 비-뉴 월드 영장류 서열, 특히 CDR 서열을 표준 재조합 기술로 접목 (grafting)함에 있어서 뉴 월드 영장류 가변영역 서열이 수용자 (acceptor)로서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어 미국특허 제 5,585,089 호는, 비-인간 모항체 (parent antibody)의 높은 친화성을 유지하고 공여자 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린으로부터의 구조형성영역을 포함하는 낮은 면역원성의 키메릭 항체를 창안하는 방법을 기술한다. 미국특허 공개 제 20030039649 호는, 비-인간 항체로부터의 CDR 서열 및 인간 항체의 생식계열 (germline) 정규 CDR 구조 타입과 비교하여 비-인간 항체의 정규 CDR 구조 타입을 인간화 항체를 위한 적절한 인간 구조형성 서열을 선택하는 기준으로 사용함에 기초하는 인간 항체의 구조형성 서열을 포함하는 낮은 면역원성의 키메릭 항체를 창안하는 인간화 방법을 기술한다. 따라서, 하나 이상의 비-뉴 월드 영장류 CDR을 뉴 월드 영장류 수용자 가변영역에 접목시킴에 있어서 상기 원리를 적용할 수 있다.
CDR 서열은 항체로부터 분리된 게노믹 DNA로부터 얻을 수 있거나, 예를 들어 국립 생물공학 정보 센터 단백질 및 핵산 데이터베이스 (The National Centre for Biotechnology Information protein and nucleotide databases), 면역학적 관심 단백질 서열의 카바트 데이터베이스 (Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest)와 같은 데이터베이스에 존재하는 서열로부터 얻을 수 있다. CDR 서열은 게노믹 DNA이거나 cDNA일 수 있다.
수용자 가변 서열 내에 치환 CDR(들)을 접목시키는 방법은 본 발명이 속하는기술 분야의 당업자에게 주지되어 있다. 통상적으로, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 각각에 또는 도메인 항체의 경우 단일쇄에 대해 CDR이 수용자 가변영역 서열 내에 접목될 것이다. 본 발명의 바람직한 방법은 가변영역 서열 내에서 프라이머 지향된 (directed) 돌연변이에 의한 CDR1 또는, 더욱 바람직하게는, CDR2의 치환을 포함한다. 상기 방법은, 목적하는 돌연변이를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 그것이 시험관내 DNA 합성의 개시를 위한 프라이머로 작용할 표적 부위에 어닐링 (annealing)시키고, DNA 폴리머라제에 의해 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 목적하는 돌연변이를 가진 이중-가닥 DNA를 생성시키며, 적당한 발현 벡터에 서열을 결찰 (ligated) 및 클로닝함으로 구성된다 (Sambrook, Joseph; and David W. Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
추가로, 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 항체 또는 항체 부위와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드가 공유적 또는 비공유적으로 결합하여 형성된 더 큰 면역접착 (immunoadhesion) 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역접착 분자의 예는 사량체 scFv (tetrameric scFv) 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘 중심영역의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al., 1995 Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101), 및 2 가이며 바이오틴화된 (biotinylated) scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 표지자 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov, S. M., et al., 1994 Mol. Immunol., 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부위는 전체 항체의 파파인 또는 펩신 각각에 의한 분해와 같은 전통적 기술을 이용하여 전체 항체로부터 만들 수 있다. 또한, 항체, 항체 부위 및 면역접착 분자는 본 명세서에 기술되고 당업자에게 주지된 바와 같이 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 얻을 수 있다.
불변영역 서열 (Fc 부위)는 바람직하게는 인간 또는 영장류 면역글로불린 서열로부터 얻어진다. 영장류 서열은 뉴 월드 영장류 또는 올드 월드 영장류 서열이다. 적당한 올드 월드 영장류는 침팬지, 또는 예를 들어 골릴라 또는 오랑우탄과 같은 사람과 유인원 (hominid ape)을 포함하며, 이들은 인간에 대한 밀접한 계통발생학적 근접성 (proximity)으로 인해 인간 불변영역 서열과 고도의 상동성 (homology)을 공유한다. 인간 또는 영장류 불변영역을 암호화하는 서열은, 예를 들어 국립 생물공학 정보 센터 단백질 및 핵산 데이터베이스 (The National Centre for Biotechnology Information protein and nucleotide databases), 면역학적 관심 단백질 서열의 카바트 데이터베이스 (Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest)를 포함하는 데이터베이스로부터 이용 가능하다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 부위는 인간 또는 비-인간 항원에 결합할 수 있다.
바람직하게는, 키메릭 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 결합하는 항원은 본질적으로 펩티드, 단백질, 탄수화물, 당단백질, 지질 또는 당지질로서, 암태아 항원 (carcinoembryonic antigen), EpCAM, 루이스-Y (Lewis-Y), 루이스-Y/b (Lewis-Y/b), PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL 및 VEGF 수용체를 포함하는 종양-관련 항원, CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC 클라스 I, MHC 클라스 II, GM-CSF, 인터페론-γ, IL-1, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, 및 IgE를 포함하는 면역 또는 염증성 질환 또는 장애에 관련된 항원, 당단백질 IIb/IIIa, P-당단백질을 포함하는 숙주세포에서 발현되는 항원, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD56, CD58, CD62 또는 CD144를 포함하는 퓨린성 수용체 및 유착 수용체, 사이토카인, 케모카인을 포함하는 항원, 에오탁신 (eotaxin), IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF 및 그들의 수용체를 포함하는 성장인자 또는 다른 가용성 생리학적 조절자 또는 그의 수용체, β-아밀로이드 및 프리온을 포함하는 중추신경계 질환 또는 장애에 관련된 항원, 호흡기 신시셜 바이러스 (respiratory syncitial virus) 단백질 F, 탄저균 (anthrax) 독소, 방울뱀 독액 및 디곡신을 포함하는 미생물성 (microbial), 미소생물성 (nanobial) 또는 바이러스성 항원 또는 독소와 같은 비-인간 기원의 항원으로부터 선택되며; 여기에서 키메릭 항체는 작용제 또는 길항제로서 작용하거나 보체 (complement) 또는 살해 세포 (killer cells) (예를 들어 NK 세포)와 함께 작용하여 바람직하지 않은 세포 (예를 들어 항-CD4)를 고갈 (살해 또는 제거)시키는 활성을 가지거나 세포독성 약제 활성을 가지거나 식세포 (phagocyte)에 의한 Fc-수용체 결합을 유발하거나 그 표적의 생물학적 활성을 중화 (neutralize)시킨다.
더욱 바람직하게는, 항원은 TNFα이고, 가장 바람직하게는, 인간 TNFα이다.
다른 방법으로서 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 비-인간 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게는 비-인간 항원은 호흡기 신시셜 바이러스 F 단백질, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 뱀 독액 및 디곡신으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "에 결합함"은, 예를 들어 BIAcore™ 표면 플라스몬 공명 시스템 (surface plasmon resonance system) 및 BIAcore™ 동력학 평가 소프트웨어 (kinetic evaluation software) (예를 들어 버전 2.1)을 이용하여 측정되는 1 μM 이하의 해리상수 (Kd)로 항체의 면역글로불린 가변영역에 항원이 결합함을 의미한다. 특이적 결합 상호작용의 친화성 또는 해리상수 (Kd)는 바람직하게는 약 500 nM 내지 약 50 pM이고, 더욱 바람직하게는 약 500 nM 이하이며, 더욱 바람직하게는 약 300 nM 이하이고, 바람직하게는 적어도 약 300 nM 내지 약 50 pM, 약 200 nM 내지 약 50 pM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 nM 내지 약 50 pM, 약 75 nM 내지 약 50 pM, 약 10 nM 내지 약 50 pM이다.
본 발명의 항체는 인간 항-항체 반응의 유발 가능성이 감소될 것이므로 인간 치료에 있어서 유리하다.
본 발명에 따라 생산되는, 표적 항원에 결합하는 재조합 항체는, 바람직한 결합 특이성 및 기능적 행동을 나타내는 라이브러리 구성원을 분리하기 위한 조합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 동정 및 분리할 수 있다 (예를 들어 TNFα의 중화는 L929 세포를 이용하여 측정할 수 있음). 항원-결합 부위 또는 항체의 유도체, 예를 들어 Fabs, scFv 및 도메인 V 또는 도메인 항체가 사용되는 모든 시도가 본 발명의 범위 내에 포함됨이 이해될 것이다. 파아지 디스플레이 기술은 당업계에 광범위하게 기술되어 있으며 상기 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하며 그 산물의 친화성 숙성을 위한 방법 및 화합물의 예는 문헌 (예를 들어, Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982; Clarkson et al., 1991, Nature, 352:624:628; Dower et al., PCT 공개 제 WO 91/17271 호, 미국특허 제 5,427,908 호, 미국특허 제 5,580,717 호 및 유럽특허 제 EP 527,839 호; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology, 9:1370-1372; Garrad et al., 1991 Bio/Technology, 9:1373:1377; Garrard et al., PCT 공개 제 WO 92/09690 호; Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Griffiths et al., 1993 EMBO J, 12:725:734; Griffiths et al., 미국특허 제 5,885,793 호 및 유럽특허 제 EP 589,877 호; Hawkins et al., 1992, J Mol Biol, 226:889-896; Hay et al., 1992, Hum Antibod Hybridomas, 3:81-85; Hoogenboom et al., 1991 Nuc Acid Res, 19:4133-4137; Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281; Knappik et al., 2000, J Mol Biol, 296:57-86; Knappik et al. PCT 제 WO 97/08320 호; Ladner et al. 미국특허 제 5,223,409 호, 제 5,403,484 호, 제 5,571,698 호, 제 5,837,500 호 및 유럽특허 제 EP 436,597 호; McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; McCafferty et al., PCT 공개 제 WO 92/01047 호, 미국특허 제 5,969,108 호 및 유럽특허 제 EP 589,877 호; Salfeld et al., PCT WO 97/29131, 미국특허 가출원 제 60/126,603 호; 및 Winter et al. PCT 제 WO 92/20791 호 및 유럽특허 제 EP 368,684 호)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 재조합 라이브러리는 예를 들어 효모 또는 박테리아와 같은 미생물의 표면에서 발현시킬 수 있다 (PCT 공개 제 WO99/36569 호 및 제 98/49286 호).
선택된 림프구 항체 방법 (Selected Lymphocyte Antibody Method) 또는 당업계에서 지칭하는 SLAM은 고친화성 항체를 신속하게 생성시킬 수 있는 또 다른 수단이다. 파아지 디스플레이 시도와는 달리 모든 항체가 완전히 2 가이다. 뉴 월드 영장류 항체를 생성시키기 위해서, 뉴 월드 영장류를 인간 항원, 예를 들어 TNFα 폴리펩티드로 면역화시킨다. 면역화 후에 세포를 제거하여 개별적인 마이크로 웰 (micro well)에서 선택적으로 증식시킨다. 웰에서 상등액을 제거하여 결합 및 기능 모두에 대해 시험한다. 후속의 조작, 예를 들어 인간화, Fab 단편, scFv 또는 dAb 생성을 위해 유전자 서열을 회수할 수 있다. 따라서 또 다른 예는 SLAM 및 그의 유도체에 의한 본 발명의 리간드의 유도 (derivation)이다 (Babcook, J.S. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93; 7843-7848, 미국특허 제 5,627,052 호 및 PCT 공개 제 WO92/02551 호). 패닝 (panning)과 같이 상등액의 시험에 대안 (alternative)를 이용하는 것과 같은 SLAM의 개조 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
한 발현 시스템에서 재조합 펩티드/단백질 라이브러리는 리보솜 상에 디스플레이 (display)된다 (예를 들어, Roberts, RW and Szostak, J.W.1997. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94:12297 - 123202 및 PCT 공개 제 WO98/31700 호). 따라서 또 다른 예는, 바람직하게는 면역화된 세포로부터 얻어진 DNA 라이브러리 (예를 들어 항체 또는 유도체의)의 생성 및 시험관내 전사, 단백질 및 "면역화된" mRNA가 리보솜 상에 머물도록 하는 라이브러리의 번역 (translation), 친화성 선택 (예를 들어 RSP에의 결합에 의한), mRNA 분리, 역번역 (reverse traslation) 및 후속의 증폭 (예를 들어 폴리머라제 연쇄반응 또는 관련기술에 의한)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 친화성 숙성을 위한 필요에 따라, 본 시스템에 체세포 돌연변이를 도입하거나 당업계에 공지된 다른 친화성 숙성 방법에 의해 추가의 선택 및 증폭 과정을 연계할 수 있다 (R.A. Irving et al . Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)).
또 다른 예는 본 발명의 항체 생산에 에멀젼 구획화 기술 (emulsion compartmentalisation technology)의 적용을 고찰한다. 에멀젼 구획화에서, 시험관내 및 광학적 분류 (optical sorting) 방법을 에멀젼 내 오일 방울 안의 수성상 (aqueous phase) 내에서 번역된 단백질 및 그의 서열 암호화 뉴클레오티드의 공-구획화 (co-compartmentalisation)와 조합한다 (PCT 공개 제 WO99026711 호 및 제 WO0040712 호). 항체의 생성 및 선택을 위한 주요 요소는 리보솜 디스플레이의 시험관내 방법과 본질적으로 유사하다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 다른 기능성 분자에 연결되거나 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 부위는 화학적 연결, 유전자 융합, 비공유적 연합 등에 의해 하나 이상의 다른 분자적 실체, 예를 들어 또 다른 항체, 검출 가능한 약제, 세포독성 약제, 약제학적 약제 및/또는 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 다른 분자의 연합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어 스트렙타비딘 중심영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 기능적으로 연결될 수 있다.
면역독소 (immunotoxin)를 생성시키기 위해 일반적으로 사용되는 세포독성 약제는 111In 또는 90Y과 같은 방사성 동위원소, 셀레늄, 리보뉴클리아제, 슈도모나스 엑소톡신 (Pseudomonas exotoxin) 또는 디프테리아 톡신 (Diphtheria toxin)과 같은 결합 도메인-결실 (deleted) 생략 (truncated) 미생물 독소, 칼리케아마이신 (ozagamicin), 메이탄시노이드 (DM-1 포함), 아우리스타틴 및 탁소이드와 같은 투불린 저해제, 라이신 (ricin), 에불린 I, 사포린 및 겔로닌과 같은 리보솜 불활화 단백질, 및 멜팔란과 같은 프로드럭 (prodrug)을 포함한다.
항체 또는 그의 항원-결합 부위를 유도체화할 수 있는 유용한 검출 가능 약제는 형광성 화합물을 포함한다. 형광성 검출 가능 약제의 예는, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 파이코에리스린 등을 포함한다. 알칼라인 포스파타제, 호스라디쉬 퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 등과 같은 검출 가능 효소들로도 항체를 유도체화할 수 있다. 검출 가능 효소로 유도체화한 항체는, 검출 가능한 반응 산물을 생산하기 위해 효소가 사용하는 추가의 시약을 첨가함으로써 검출된다. 항체는 바이오틴으로 유도체화할 수도 있으며, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적 측정을 통해 검출된다.
비-PEG화된 항체 폴리펩티드에 비하여 활성 손실 (예를 들어 결합 친화성의 감소)이 없으면서 분해에 대한 저항성 및 반감기의 증가를 제공하는 PEG화된 항체 또는 항체-결합 부위도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에 기술된 항체 또는 항원-결합 부위는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 반감기 증가 및 분해 저항성을 달성하기에 유용한 중합체 분자 (바람직하게는 PEG)에 연결될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 중합체 부분은 합성물 또는 천연물일 수 있으며, 직쇄 또는 측쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 호모- 또는 헤테로폴리사카라이드와 같은 측쇄 또는 비측쇄 폴리사카라이드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 합성 중합체의 바람직한 예는 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜), 또는 폴리(비닐 알콜) 및 그의 유도체 또는 치환 형태를 포함한다. 본 명세서에 기술된 항체에 연결하기 위한 특히 바람직한 치환 중합체는 메톡시(폴리에틸렌 글리콜)을 포함하는 치환된 PEG를 포함한다. PEG에 추가하여 또는 그 대신에 사용될 수 있는 천연 중합체 부분은 락토즈, 아밀로즈, 덱스트란 또는 글리코겐과 함께 당업자에게 인식되는 그의 유도체를 포함한다.
중합체 분자의 유도체화 형태는, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 항체 폴리펩티드의 아미노산 잔기와의 상호작용을 허용하기 위해 존재하는 추가의 부분 또는 반응성 그룹을 가진 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 N-하이드록실숙신이미드 (NHS) 활성 에스테르, 숙신이미딜 프로피오네이트 중합체, 및 설프하이드릴-선택적 반응성 약제, 예를 들어, 말레이미드, 비닐 술폰, 및 티올을 포함한다. 특히 바람직한 유도체화 중합체는 하기 화학식의 PEG 중합체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다: PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; 및 PEG-O-CH2-CO2-NHS; 상기 화학식에서 R은 (CH2)4)NHCO2(mPEG)를 나타낸다. PEG 중합체는 선형 분자일 수도 있고, 단일 중합체 내에 다수의 PEG 부분이 존재하는 측쇄일 수도 있다.
반응성 그룹 (예를 들어, MAL, NHS, SPA, VS, 또는 티올)은 PEG에 직접 부착될 수도 있고 연결부 분자를 통해 PEG에 부착될 수도 있다.
본 발명에 유용한 중합체의 크기는 500 Da 내지 60 kDa 범위일 있고, 예를 들어 1000 Da 내지 60 kDa, 10 kDa 내지 60 kDa, 20 kDa 내지 60 kDa, 30 kDa 내지 60 kDa, 40 kDa 내지 60 kDa, 및 50 kDa 내지 60 kDa에 달할 수 있다. 본 발명에 사용되는 중합체는, 특히 PEG의 경우, 직쇄 중합체일 수도 있고, 측쇄 입체구조를 가질 수도 있다.
본 발명에 유용한 중합체 (PEG) 분자는 당업계에 주지된 방법을 이용하여 항체 또는 그의 항원-결합 부위에 부착될 수 있다. 본 발명의 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다량체에 PEG 또는 다른 중합체 부분을 부착하는 첫 번째 단계는 PEG 중합체의 하이드록실 말단-그룹을 친전자성-함유 기능성 그룹으로 치환하는 것이다. 특히, PEG 중합체는 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다량체 내에 존재하는 시스테인 또는 라이신 잔기에 부착된다. 시스테인 및 라이신 잔기는 천연적일 수도 있고 항체 폴리펩티드 분자에 조작 (engineered)을 통해 도입할 수도 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 항체 폴리펩티드의 C-말단에 재조합적으로 조작할 수도 있고, 항체 폴리펩티드 내의 특이적인 용매 접근 가능 위치에 있는 잔기를 시스테인 또는 라이신으로 치환할 수도 있다.
항체는 생체내 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 연결될 수 있다. 이러한 분자는 항원-결합부에 대한 간섭/입체적 방해를 하지 않도록, 항체 상에서 항원 결합부가 아닌 다른 부위에서 항체에 연결된다. 통상적으로, 상기 분자는 생체내에 자연적으로 나타나며 내인성 메카니즘에 의한 분해 또는 제거에 대해 저항성이 있는 폴리펩티드이다. 이러한 천연 분자의 단편 또는 유도체도 사용될 수 있으며 일부는 폴리펩티드가 아닐 수 있음은, 당업자에게 자명할 것이다. 반감기를 증가시키는 분자는 하기 그룹으로부터 선택된다:
(a) 세포외 기질 (extracellular matrix)로부터의 단백질, 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴;
(b) 혈액에서 발견되는 단백질, 예를 들어, 피브린 α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 단백질, 유비퀴틴, 유테로글로불린, β-2 마이크로글로불린, 플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 카입신 저해제;
(c) 면역 혈청 단백질, 예를 들어 IgE, IgG, IgM;
(d) 수송 단백질, 예를 들어 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린;
(e) 디펜신, 예를 들어 베타-디펜신 1, 호중구 디펜신 1, 2 및 3;
(f) 혈액 뇌 장벽 (blood brain barrier) 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 예를 들어, 멜라노코르틴 수용체, 마이엘린, 아스코르베이트 수송체 (transporter);
(g) 트란스페린 수용체 특이적 리간드-신경 약제학적 약제 융합 단백질 (참조: 미국특허 제 5977307 호); 뇌 모세혈관 내피 세포 수용체, 트란스페린, 트란스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체;
(h) 신장에 국소적으로 존재하는 (localized) 단백질, 예를 들어, 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만 항체 (Heymann's antigen);
(i) 간에 국소적으로 존재하는 단백질, 예를 들어, 알콜 데하이드로게나제, G250;
(j) 혈액 응고 인자 X;
(k) α-1 항트립신;
(l) HNF 1α;
(m) 폐에 국소적으로 존재하는 단백질, 예를 들어, 분비성 성분 (secretory component) (IgA에 결합);
(n) 심장에 국소적으로 존재하는 단백질, 예를 들어, HSP 27;
(o) 피부에 국소적으로 존재하는 단백질, 예를 들어, 케라틴;
(p) 골형성단백질 (bone morphogenic proteins) (BMPs)과 같이 뼈에 특이적인 단백질, 예를 들어, BMP-2, -4, -5, -6, -7 (골원성단백질 (osteogenic protein) (OP-1)이라고도 지칭함 및 -8 (OP-2);
(q) 종양 특이적 단백질, 예를 들어, 인간 영양포 (trophoblast) 항원, 허셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신, 예를 들어, 카텝신 B (간 및 비장에서 발견됨);
(r) 질환-특이적 단백질, 예를 들어, 활성화된 T-세포에서만 발현되는 항원: 예를 들어, LAG-3 (림프구 활성화 유전자); 골 재흡수 억제인자 (osteoprotegerin) 리간드 (OPGL) (참조: Nature 402, 304-309, 1999); OX40 (TNF 수용체 패밀리의 일원으로서, 활성화된 T-세포에서 발현되며 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I (HTLV-I)-생산 세포에서 특이적으로 상향 조절되는 (up-regulated) 것으로 알려진 유일한 공동자극 (costimulatory) T 세포 분자 (참조: J. Immunol. 2000 Jul 1;16561):263-70)); 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련), 예를 들어 CG6512 초파리, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐과 ftsH; 혈관생성 성장인자 (angiogenic growth factor), 예를 들어 산성 섬유모세포 성장인자 (acidic fibroblast growth factor) (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor) (FGF-2), 혈관내피 성장인자/혈관 투과성 인자 (vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor) (VEGF/VPF), 변형성 성장인자-α (transforming growth factor-α) (TGF-α), 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-alpha) (TNF-α), 안지오제닌, 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-8 (IL-8), 혈소판 유래 혈관내피 성장인자 (platelet derived endothelial growth factor) (PD- ECGF), 태반 성장인자 (placental growth factor) (PlGF), 미드카인 혈소판-유래 성장인자-BB (midkine platelet-derived growth factor-BB) (PDGF), 프렉탈카인;
(s) 스트레스 단백질 (열 충격 단백질);
(t) Fc 수송 관련 단백질; 및
(u) 비타민, 예를 들어 B12, 바이오틴.
또 다른 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제"는 생리학적 친화성의 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 물, 식염수, 포스페이트 완충된 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등과 그들의 배합물 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 등장성 약제, 예를 들어 당류, 다가 알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 소듐 클로라이드를 조성물 내에 포함함이 바람직할 것이다.
용어 "유효량"은 특정 질환 또는 장애 또는 하나 이상의 그의 증상의 치료 또는 개선 및/또는 질환 또는 장애의 발병의 감소 또는 예방에 있어서 충분한 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (항체 또는 그의 항원 결합 부위를 함유하는 약제학적 조성물을 포함함)의 양을 의미한다.
용어 "진단적 유효량" 또는 "진단을 위해 효과적인 양" 및 그의 유사어는, 특정 질환 또는 장애 및/또는 하나 이상의 그의 징후의 진단에 있어서 충분한 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (항체 또는 그의 항원 결합 부위를 함유하는 약제학적 조성물을 포함함)의 양을 의미하며, 여기에서 진단은 질환 또는 장애의 존재 확인 및/또는 질환 또는 장애의 범위 또는 중증도의 탐지를 포함한다. 진단은 종종 질환 또는 장애가 없는 개체에서 관찰되는 기준선 (baseline) 또는 배경 탐지 수준 (background detection level)을 참조하여 실행될 것이다. 배경 또는 기준선 수준을 상회하는 탐지 수준 (탐지 수준의 상승)은 질병의 존재 및, 어떤 경우에는 질병의 중증도를 나타낸다.
항체 또는 그의 항원 결합 부위 (항체 또는 그의 항원 결합 부위를 함유하는 약제학적 조성물을 포함함)의 사용 및 치료 방법에 관련하여 사용할 경우에, "그를 필요로 하는" 개체는 치료할 질환 또는 장애로 진단을 받았거나 이전에 치료를 받았던 개체일 수 있다. 진단 방법에 관련하여 "그를 필요로 하는" 개체는 질환 또는 장애를 가진 것으로 의심되거나, 질환 또는 장애의 위험이 있거나, 이전에 질환 또는 장애로 진단을 받았던 개체일 수 있다 (예를 들어, 진단은 시간에 따른 및/또는 요법과 관련하여 질환 또는 장애의 중증도 관찰 (예를 들어 진행/퇴행)을 포함할 수 있다).
항체 또는 그의 항원-결합 부위가 수용체 기능을 차단 또는 자극하거나 인터류킨, TNF 또는 C5a 중의 하나 이상과 같은 활성 가용성 산물을 중화시킴이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 활성 가용성 산물은 인간 TNF-α이다.
조성물은 액체, 반-고체 또는 고체 투여형, 예를 들어 액체 용액 (예를 들어 주사용 또는 주입용 용액), 분산 (dispersion) 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 또는 좌제를 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 면역화를 위한 주사용 용액 형태일 수 있다. 투여는 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 경피, 초내 및 동맥내일 수 있다. 바람직하게는 투여형을 약 0.001 mg 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위에서 매일, 매주, 격주 또는 매 3 주 또는 매월 투여하며, 더욱 바람직하게는 약 0.05 mg 내지 약 5 mg/kg 체중으로 매주 투여한다.
조성물은 또한 멸균 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 산제로서 제형화될 수도 있다.
어떤 구체예에서, 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형과 같이, 화합물을 급속한 방출로부터 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 또는 폴리락트산과 같은 친화성 중합체가 사용될 수 있다.
조성물은 또한 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 구체예에서는, 항체를 경질 또는 연질 껍질 젤라틴 캡슐에 넣거나, 압축하여 정제로 만들거나, 대상의 음식물에 직접 혼입한다.
조성물은 또한 직장 투여를 위해 제형화할 수 있다.
항체는 생체내 및 시험관내에서 선택된 세포에 결합하여 동정하거나, 생체내에서 선택된 세포에 결합하여 파괴하거나, 생체내에서 선택된 세포에 침투하여 파괴하기 위하여 투여될 수 있다. 또는, 항체는 세포독성 약제, 예를 들어 독소 또는 화학요법 약제를 종양 세포와 같은 특정 세포 타입에 전달하기 위한 면역독소로서 사용될 수 있다. 면역독소의 생산은 당업자에게 주지되어 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 인간에게 투여된다.
본 발명은 또한 특정 질환 또는 장애와 관련된 항원을 검출하기 위한 진단적 적용에 있어서 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 용도를 제공한다.
더욱 특징적으로는, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 세 번째 태양에 따른 항체, 그의 항원-결합 부위 또는 약제학적 조성물의 진단적 유효량을 대상에게 투여함을 특징으로 하여, 특정 질환 또는 장애와 관련된 항원을 가진 대상을 진단하기 위한 방법에 있어서 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 대상은 인간이다.
바람직하게는 표지된, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 혈청 또는 플라스마와 같은 생물학적 시료에서 효소면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay) (ELISA), 방사면역측정법 (radioimmunoassay) (RIA) 또는 조직 면역조직화학 (immunohistochemistry)과 같은 전통적 면역측정법을 이용하여 항원의 존재 또는 항원 (예를 들어 TNF-α)의 수준 상승을 탐지하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 키메릭 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 결합하는 항원은 본질적으로 펩티드, 단백질, 탄수화물, 당단백질, 지질 또는 당지질로서, 암태아 항원 (carcinoembryonic antigen), EpCAM, 루이스-Y (Lewis-Y), 루이스-Y/b (Lewis-Y/b), PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL 및 VEGF 수용체를 포함하는 종양-관련 항원, CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC 클라스 I, MHC 클라스 II, GM-CSF, 인터페론-γ, IL-1, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, 및 IgE를 포함하는 면역 또는 염증성 질환 또는 장애에 관련된 항원, 당단백질 IIb/IIIa, P-당단백질을 포함하는 숙주세포에서 발현되는 항원, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD56, CD58, CD62 또는 CD144를 포함하는 퓨린성 수용체 및 유착 수용체, 사이토카인, 케모카인을 포함하는 항원, 에오탁신 (eotaxin), IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF 및 그들의 수용체를 포함하는 성장인자 또는 다른 가용성 생리학적 조절자 또는 그의 수용체, β-아밀로이드 및 프리온을 포함하는 중추신경계 질환 또는 장애에 관련된 항원, 호흡기 신시셜 바이러스 (respiratory syncitial virus) 단백질 F, 탄저균 (anthrax) 독소, 방울뱀 독액 및 디곡신을 포함하는 미생물성 (microbial), 미소생물성 (nanobial) 또는 바이러스성 항원 또는 독소와 같은 비-인간 기원의 항원으로부터 선택되며; 여기에서 키메릭 항체는 작용제 또는 길항제로서 작용하거나 보체 (complement) 또는 살해 세포 (killer cells) (예를 들어 NK 세포)와 함께 작용하여 바람직하지 않은 세포 (예를 들어 항-CD4)를 고갈 (살해 또는 제거)시키는 활성을 가지거나 세포독성 약제 활성을 가지거나 식세포 (phagocyte)에 의한 Fc-수용체 결합을 유발하거나 그 표적의 생물학적 활성을 중화 (neutralize)시킨다.
본 발명에 따른 항-인간 TNF-α 항체 또는 그의 항원 결합 부위는 TNF-α 활성을 저해할 필요가 있는 세포 배양 적용에도 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 TNF-α에 결합하는 본 발명에 따른 항체, 그의 항원-결합 부위 또는 약제학적 조성물을 그를 필요로 하는 대상에게 투여함을 특징으로 하여, 인간 TNF-α 활성의 특징을 가진 질환 또는 장애를 인간 대상에서 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "인간 TNF-α 활성의 특징을 가진 질환 또는 장애"는, 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상 내의 TNF-α의 존재가 질환 또는 장애의 병리생리학의 원인이거나 그에 관련되거나 질환 또는 장애의 악화에 기여하는 인자임이 입증되거나 의심되는 질환 또는 장애를 포함한다. 따라서, TNF-α 활성이 유해한 질환 또는 장애는 TNF-α 활성의 저해가 질환 또는 장애의 증상 및/또는 진행을 완화할 것으로 기대되는 질환 또는 장애이다. 상기 질환 또는 장애는 예를 들어 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상의 생물학적 체액 내에서의, 예를 들어 TNF-α에 특이적인 본 발명의 항체를 이용하여 검출할 수 있는 TNF-α 농도의 증가 (예를 들어 대상의 혈청, 플라스마, 활액 내의 TNF-α 농도의 증가)에 의해 증명된다.
인간 TNF-α 활성의 특징을 가진 질환 또는 장애는, 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상 내의 TNF-α의 존재가 질환 또는 장애의 병리생리학의 원인이거나 질환 또는 장애의 악화에 기여하는 인자임이 입증되거나 의심되는 질환 또는 장애를 포함한다. 바람직하게는, 인간 TNF-α 활성의 특징을 가진 질환 또는 장애는, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증 및 독성 쇼크 증후군을 포함하는 패혈증; 류머디즘성 관절염, 류머디즘성 척추염, 골관절염, 건선 및 통풍성 관절염, 알러지, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 자가면역성 포도막염 및 신장 증후군을 포함하는 자가면역질환; 감염에 부수적인 악액질 (cachexia) 및 감염에 의한 근육통 및 발열을 포함하는 감염성 질환; 이식편 대 숙주 질환 (graft versus host disease); 종양 성장 또는 전이; 성인 호흡장애 증후군, 쇼크 허파 (shock lung), 만성 폐 염증성 질환, 폐 유육종증, 폐 섬유증 및 규폐증을 포함하는 폐 질환; 크론씨병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장 질환; 심장 질환; 염증성 골 질환, 간염, 응고 장애 (coagulation disturbances), 화상, 재관류 손상 (reperfusion injury), 켈로이드 형성 (keloid formation) 및 반흔조직 형성으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
보충적인 활성 화합물도 조성물에 혼입될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 하나 이상의 추가의 치료 약제, 예를 들어 사이토카인 또는 세포 표면 분자와 같은 다른 표적에 결합하는 항체 또는 인간 TNF-α의 생산 또는 활성을 저해하는 하나 이상의 화학적 약제와 함께 공-제형화 (co-formulated) 되고/되거나 동시에, 독립적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 용기 및 사용설명서와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위, 또는 치료적 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 함유하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 어떤 구체예에서, 사용설명서는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부위의 치료적 유효량을 효과적으로 투여하기 위한 지침을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서 단어 "포함하다", 또는 그의 변형 "포함하여" 또는 "포함하는"은 제시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함함을 암시하는 것으로 이해될 것이며, 어떠한 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 원용으로서 포함된다. 본 명세서에 포함된 문서, 법령, 재료, 장치, 논문 등에 관한 모든 논의는 단지 본 발명에 대한 정황을 제공하는 목적을 위한 것이다. 임의의 또는 모든 상기 내용이 선행 기술 기반의 일부를 이루거나 오스트레일리아 또는 다른 장소에서 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 본 발명과 관련된 분야에서 일반적인 공유 기술이었음을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 발명의 특징을 더욱 명확히 이해할 수 있도록, 그의 바람직한 형태를 하기의 한정되지 않는 실시예에 참고문헌과 함께 기술하고자 한다.
도 1은 AB138이 랫트 척수 용해물 내에 존재하는 랫트 MOG와 결합하고 (레인 2) CHOK1SV 용해물에는 결합하지 않음 (레인 3)을 나타낸다. 레인 1은 분자량 표지자를 포함한다.
도 2는 랫트 척수 용해물 내에 존재하는 랫트 MOG (레인 2) 및 CHOK1SV 용해물 (레인 3)의 동일 시료에 대한 항-TNFα 모노클로날 항체의 비-특이적 결합이 없음을 나타낸다. 레인 1은 분자량 표지자를 포함한다.
도 3은 VH 아미노산 서열의 공여자 및 수용자의 배열이다.
도 4는 VL 아미노산 서열의 공여자 및 수용자의 배열이다.
도 5는 ELISA에 의한 항체 AB164, AB103 및 AB197의 TNF-α에 대한 결합이다.
도 6는 AB164, AB197, AB103에 의한 TNF-α 유도된 L-929 세포의 세포독성의 중화이다.
실시예 1
인간 불변영역에의 마모셋 가변영역의 융합
재료 및 방법
유전자 합성 및 클로닝
MOG 특이적 마모셋 유래 항체의 VH 쇄(Accession Number: AAM54057, SEQ ID NO: 1)를 인간 불변영역 (인간 IgG1 중쇄 CH1, 경첩, CH2 & CH3 도메인 (예를 들어 NCBI accession number P01857) (SEQ ID NO: 2))과 함께 발현시켰다. 이는 아미노산 서열을 DNA 서열로 역번역 (back translation)함으로써 달성되었으며, 이 DNA 서열은 유전자최적화 기술 (GeneOptimizer technology)을 이용하여 포유류 세포 발현에 최적화되고 합성 올리고뉴클레오티드의 조립에 의해 데 노보 (de novo) 합성되었다 (GeneArt, Germany). 향후 VH 영역의 조작이 가능하도록, DNA 서열 최적화 과정 중에 특이적 제한효소 부위 Asc I 및 Tth 111I가 포함되었다. 유전자 합성 후에 코자크 서열 (Kozak sequence)을 포함하는 전체 서열을 pEE6.4 GS 부속 벡터 (accessory vector) (Lonza Biologics)의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. MOG 특이적 마모셋 유래 항체의 VL 쇄 (Accession Number: AAM54058, SEQ ID NO: 3)를 인간 카파 경쇄 불변영역 (예를 들어 NCBI accession number AAA58989) (SEQ ID NO: 4)과 함께 발현시켰다. 경쇄 (VL-카파) 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 중쇄에 대하여 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 향후 VL 영역의 조작이 가능하도록, DNA 서열 최적화 및 합성 과정 중에 특이적 제한효소 부위 Bsi WI / Rsr II가 포함되었다. 유전자 합성 후에 코자크 서열 (Kozak sequence)을 포함하는 전체 서열을 pEE12.4 GS 발현 벡터 (Lonza Biologics)의 다중 클로닝 부위에 클로닝하였다. 안정적 발현을 위하여 2 개의 단일 유전자 벡터 (pEE6.4-VH --IgG1 및 pEE12.4-VL-Kappa)를 이중 유전자 벡터로 조합하였다. 이는 Not I and BamH I을 사용하여 pEE6.4 골격으로부터 중쇄 발현 카세트 (hCMV-MIE 프로모터, 코자크 서열, 마모셋 VH, 인간 불변영역 및 SV40 폴리A 부위)를 절단해냄으로써 수행되었다. 얻어진 단편을 Not I 및 BamH I 부위를 이용하여 pEE12.4-VL-카파 벡터의 경쇄 발현 카세트 (hCMV-MIE 프로모터, 코자크 서열, 마모셋 VL, 인간 카파 불변영역 및 SV40 폴리A 부위)의 하류 (downstream)에 서브클로닝하여 AB138 (SEQ ID NOs: 5 및 6)의 중쇄 및 경쇄를 모두 발현하는 벡터를 창안하였다.
트란스펙션 ( Transfection )
각각의 트란스펙션을 위하여 175 ㎕의 리포펙타민 2000을 6 웰 플레이트의 한 웰 안에서 5 mL의 옵티멤 I 배지 (Optimem I media) (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 및 31985-062)에 가하였다. 두 번째 웰에는 70 ㎕의 발현 벡터 (70㎍)를 5 mL의 옵티멤 I 배지에 가하였다. 실온에서 5 분간 배양한 후, 2 웰의 내용물을 서로 혼합하여 추가의 20 분간 배양하였다. 상기 2 차 배양 후에 전체 트란스펙션 혼합물을 CHOK1SV세포가 들어있는 T175 조직 배양 플라스크에 가하였다. 세 포를 72 내지 96 시간 동안 배양하여 상등액을 수거하였다. 상등액을 4,000 x g에서 5 분간 원심분리하여 세포 잔해를 침강시키고, 0.22 ㎛ 카트리지 필터를 통과시켜 여과 멸균하였다.
항체 정제
상등액을 하이트랩 (HiTrap) 단백질 A 컬럼 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0402-01)에 1 mL/min의 유속으로 3 회 통과시켰다. 컬럼을 1 mL/min으로 40 분간 20 mM 소듐 포스페이트로 세척하였다. 항체를 pH 3.5의 0.1 M 시트르산으로 용출시켜 분획을 수집하고 pH 9.0의 1M Tris-HCl로 즉시 중화시켰다. 항체 시료를 PD-10 컬럼 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0851-01)에서 탈염하였다. SDS-PAGE 및 크기-배제 (size-exclusion) HPLC에 의한 항체 분석을 통해 정확한 분자량, 조립된 항체의 존재 및 항체 농도가 확인되었다.
웨스턴 블로팅 분석
AB138이 M26의 항원, 랫트 MOG (마이엘린-올리고덴드로사이트 당단백질)에 결합을 유지하는 능력을 웨스턴 블로팅으로 조사하였다. 130 mg의 랫트 척수 (IMVS, Australia)를 1.8 ml의 셀라이틱 M (CelLytic M) 세포 용해 시약 (SIGMA, C2978) 내에서 균질화 (homogenized)하여 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 용해물을 27g1/2 바늘을 통해 수 차례 흡인하여 추가의 균질화를 실시하고 4 ℃에서 13000g로 30 분간 원심분리하였다. 펠렛 및 상등액을 SDS-PAGE 시료 완충액 (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% SDS, 0.25% 브로모페놀 블루, 25% 글리세롤)으로 희석하였다. 이와 함께 200 ㎕의 CHOK1SV 세포를 ml 당 1 X 106 생존가능 세포로 4 ℃, 13000 x g에서 1 분간 원심 침강시켜 200 ㎕ 셀라이틱 M 세포 용해 시약 (SIGMA) 내에 재현탁시켰다. 4 ℃에서 13000 x g로 30 분간 원심분리한 후에 상등액을 적당량의 SDS-PAGE 시료 완충액과 혼합하였다. 분자량 표지자 시료와 함께 모든 시료를 4-20% 노벡스 프리-캐스트 젤 (Novex pre-cast gel) (Invitrogen, Australia) 상에서 120 V로 2 시간동안 주행시켰다. 웨스턴 블로팅 기구를 사용하여 20% 메탄올이 있는 1 X 트리스-글리신 완충액 (BioRad, Cat 161+-0771) 내에서 2 시간 동안 4 ℃에서 250 mA로 단백질을 PVDF (BioRad, Australia)에 이전시켰다. 실온에서 1 시간 동안 PBS 내의 5% 분말 탈지유와 함께 배양함으로써 막을 블로킹하였다. 막을 1 X PBS로 3 회 세척한 후 PBS 내의 10 ㎍/mL AB138과 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 1 X PBS로 1:5000 희석한 염소 항-인간 IgG (H+L) HRP 접합체 (Sigma, Australia)와 함께 막을 실온에서 1 시간 배양하였다. 세척한 후에, ECL 웨스턴 블로팅 분석 시스템 (Amersham Biosciences Cat: RPN2109)을 이용하여 결합된 항체를 검출하였다. 비-특이적 결합을 확인하기 위하여, AB138을 이소타입-부합 무관 특이성 (isotype-matched irrelevant specificity)의 음성 대조군 항체 (항-TNFα 모노클로날 항체)로 대체시킨 실험을 병행하였다.
결과
성공적인 단백질 발현 및 정제 후에, AB138에 웨스턴 블로팅 분석을 실시하여 랫트 MOG에 대한 결합 친화성을 유지하는지 여부를 결정하였다. AB138은, 크기가 약 25 kDa이며 랫트 척수 용해물의 상등액 시료에 존재하고 CHOK1SV 용해물의 상등액 시료에는 존재하지 않는 단백질과 결합한다 (도 1). 음성 대조군 항체는 두 용해물 중 어느 쪽의 단백질에도 결합하지 않음으로써 AB138과 25 kDa 단백질 사이의 상호작용은 인위결과 (artifact) 또는 인간 불변영역 (도 2)과 관련된 비-특이적 결합에 기인한 것이 아님을 보여주었다. 상기 단백질은 MOG에서 시그널 서열을 제외한 예상 크기 (24.9 kDa)와 일치한다. 이러한 결과는 AB138이 랫트 척수 용해물에 존재하는 랫트 MOG에 대한 친화성을 유지함을 나타내며 마모셋 인간 융합 항체가 항원 결합능을 유지할 수 있음을 입증한다.
랫트 MOG가 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있고 AB138의 랫트 MOG 결합능은 ELISA 또는 바이아코어 (Biacore) 분석과 같은 결합 활성 조사에서 결정될 수 있음을, 당업자는 이해할 수 있다.
실시예 2
모노클로날 항체의 조작
1.용어
공여자 서열은 뉴 월드 영장류가 아닌 다른 종으로부터 유래된 임의의 면역 글로불린 서열로 정의된다.
수용자 서열은 뉴 월드 영장류로부터 유래된 면역글로불린 서열로 정의된다.
공통 잔기는 종에 대해 이용가능한 면역글로불린 서열들과의 비교에 의해 결정할 때 주어진 아미노산 위치에서 공통적인 (예를 들어 >30%) 잔기이다.
비공통 잔기는 종에 대해 이용가능한 면역글로불린 서열들과의 비교에 의해 결정할 때 주어진 아미노산 위치에서 비공통적인 (예를 들어 ≤30%) 잔기이다.
조작은 구조적 결합 특징이 그의 결합능을 유지하는 가운데 공여자 서열의 구조적 결합 특징을 수용자 서열에 이전하는 과정이다.
구조형성 아미노산은 항체 가변영역에 위치하며 CDR에는 위치하지 않는 아미노산으로 정의된다.
2. 약어
CDR 상보성결정영역 (complementarity determining region), MOG, 마이엘린/올리고덴드로사이트 당단백질 (myelin/oligodendrocyte glycoprotein) TNF-α, 종양괴사인자-알파 (tumour necrosis factor-alpha); VH, 가변 중쇄 (variable heavy chain); VL, 가변 경쇄 (variable light chain); BSA, 소혈청 알부민 (bovine serum albumin).
3. 조작 과정
A. 모노클로날 항체 (뉴 월드 영장류 모노클로날 항체가 아닌 다른)의 생산.
B. 고도의 아미노산 서열 상동성 (homology) 및 예상 저면역원성 (low immunogenicity)를 기초로 하는, 뉴 월드 영장류 유래 수용체 면역글로불린 서열의 선택.
C. 카바트 번호 시스템에 따른 공여자 및 수용자 면역글로불린 서열 양자 모두의 CDR 동정 (참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest" E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983).
D. 공여자 및 수용자 서열의 배열에 의한 구조형성 서열의 차이의 결정
E. 3 차원 모델화에 의한 공여자 면역글로불린 구조의 예측 및 CDR에 상대적인 구조형성 서열 차이의 근접성 (proximity) 결정. 치환 기준 1 및 2 (하기)에 따라 수용자 잔기를 공여자 잔기로 임의 치환.
F. 전체 수용자 CDR 서열을 전체 공여자 CDR 서열로 치환.
G. 공여자/수용자 구조형성 아미노산 서열을 생식계열 및 이용가능한 수용자 면역글로불린 구조형성 서열과 비교함에 의한 공통 잔기의 결정. 치환 기준 3 및 4 (하기)에 따라 수용자 잔기를 공여자 잔기로 임의 치환.
H. 수용자 가변영역 및 인간 불변영역을 가진 키메릭 항체의 생산
I. 조작 면역글로불린 단백질의 발현
J. 조작 면역글로불린 단백질의 활성조사 분석
치환 기준:
구조형성 서열 내의 차이에 기초한 조작 항체를 생성시킴에 있어서, 하기의 기준에 들어가는 위치에서 수용자 아미노산을 상응하는 공여자 아미노산으로 치환할 수 있다.
(i) 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 항원과 상호작용 능력을 가질 것으로 예상되는 경우;
(ii) 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 공여자 CDR의 3.2Å 이내에 위치하는 것으로 결정되는 경우;
(iii) 공여자 잔기가 수용자 종 면역글로불린 서열에서 공통적일 경우;
(iv) 공여자 잔기가 공여자 생식계열에서 비공통일 경우.
균등한 인간 서열과의 아미노산 서열 상동성 및 예상 저면역원성에 기초한 적절한 수용자 서열을 선택함으로써, 조작 항체는 인간에서 비-면역원성이거나 낮은 면역원성을 나타낼 것으로 예상된다. 조작 항체는 공여자 면역글로불린과 유사한 결합 친화성으로 공여자 면역글로불린의 항원에 결합할 것이다. 조작 항체의 결합 친화성은 친화성 숙성 방법에 의해 추가로 증가시킬 수 있다 (R.A. Irving et al. Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)).
항체 AB197 을 생산하기 위한 쥐과 항체 AB164 의 조작
4. 공여자 면역글로불린 서열
인간 TNF-α에 대한 모노클로날 항체 AB164를 분비하는 쥐과 하이브리도마를 하이브리도마 기술을 이용하여 생산하고 공여자 면역글로불린 서열(SEQ ID NOs: 7 및 8)로서 이용하였다.
5. 수용자 면역글로불린 서열의 선택
랫트 MOG (마이엘린/올리고덴드로사이트 당단백질)에 대한 모노클로날 항체의 서열을 펍메드 (PubMed) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수하여 수용자 서열로 사용하였다. 이러한 모노클로날 항체는 뉴 월드 영장류인 비단 원숭이 (common marmoset) (흰귀마개 마모셋) (white-tuffed-ear marmoset) (Callithrix jacchus)로부터 유래되었다. VH 쇄 (Accession Number: AAM54057, SEQ ID NO: 1) 및 VL 쇄 (Accession Number: AAM54058, SEQ ID No: 3)의 구조형성영역에 대하여, 모든 대립유전자의 1% 경계값 분석을 사용하는 MHC 클라스 II 결합 예측 프로그램 프로프레드 (Propred) (http://www.imtech.res.in/raghava/propred)에 의한 인간에서의 예상 면역원성을 시험하였다. MOG 특이적 항체의 VH 쇄 (Accession Number: AAM54057, SEQ ID NO: 1) 및 VL 쇄 (Accession Number: AAM54058, SEQ ID No: 3)의, CDR을 제외한 서열의 BLAST 분석에 의해 가장 유사한 인간 동족체 (human homologue) 중쇄 서열 (Accession Number AAH19337.1 ; SEQ ID NO: 9) 및 경쇄 서열 (Accession Number: BAC53922.1 ; SEQ ID NO: 10)이 동정되었다.
특히, 이러한 예상 분석은 선택된 수용자 중쇄 가변 구조형성영역이 그의 인간 균등물에 비해 면역원성이 더 낮을 가능성을 제시한다. 수용자 중쇄 가변영역은 구조 (framework) 내에 하나의 펩티드, LRPEDTAVY를 가졌으며, 이는 대립유전자 DRB1_0101, DRB1_0102, DRB1_0309에 의해 암호화되는 MHC 클라스 II에 결합할 것으로 예상된다. 반면에 가장 유사한 인간 동족체 중쇄는 구조 내에 3 개의 펩티드를 가졌으며, 이는 MHC 클라스 II에 결합할 것으로 예상되었다. 이는 대립유전자 DRB1_0101, DRB1_0102 및 DRB1_0309에 의해 암호화되는 MHC 클라스 II에 결합할 것으로 예상되는 펩티드 WVRQAPGQGL; 대립유전자 DRB1_0401, DRB1_0408, DRB1_0421, DRB1_0426, DRB1_1101, DRB1_1128, DRB1_1305 에 의해 암호화되는 MHC 클라스 II에 결합할 것으로 예상되는 펩티드 VYMELTS; 및 대립유전자 DRB1_0401, DRB1_0421, DRB1_0426에 의해 암호화되는 MHC 클라스 II에 결합할 것으로 예상되는 펩티드 LRSEDTAVY를 포함하였다.
MOG 특이적 경쇄 가변 구조형성영역 및 가장 유사한 인간 동족체는 비-면역원성일 것으로 예상되었다.
6. 공여자/수용자 가변영역 내의 CDR의 동정
카바트 법칙 (참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest" E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983)을 이용하여 AB164의 VH 및 VL 쇄(각각 SEQ ID NOs: 7 및 8) 및 마모셋 MOG 특이적 면역글로불린의 VH 및 VL 쇄 (각각 SEQ ID No: 1 및 3)에 대하여 CDR을 결정하였다 (표 1).
AB164 (SEQ ID NOs: 7 및 8) 및 MOG-특이적 면역글로불린 (SEQ ID NOs: 1 및 3)의 VH 및 VL 쇄의 CDR에 대한 아미노산 위치
쇄 SEQ ID NO: CDR-1 CDR-2 CDR-3
VH 1 26-35 50-66 99-107
VH 7 26-35 50-66 99-108
VL 3 24-38 54-60 93-101
VL 8 24-34 50-56 89-97
7. 공여자 및 수용자 서열의 배열
VH 쇄 배열
AB164 및 MOG 특이적 면역글로불린의 VH 쇄 (SEQ ID NOs: 7 및 1)에 대한 아미노산 서열을 배열하였다 (도 3). MOG 특이적 면역글로불린 VH 쇄의 CDR3에 위치하는 추가의 아미노산 때문에 잔기의 수에는 1의 차이가 있다. 두 서열 간의 서열 동일성 (sequence identity)은 63.6%이다. 공여자 및 수용자 항체의 상이한 항원 특이성으로부터 예상되었듯이, CDR들의 아미노산 서열은 상이하였다. 구조형성영역 내의 서열 간에는 22 개 아미노산이 상이하였다.
VL 쇄 배열
AB164 및 MOG 특이적 면역글로불린의 VL 쇄 (SEQ ID NOs: 8 및 3)에 대한 아미노산을 배열하였다 (도 4). 잔기의 수에는 AB164의 CDR1에 위치하는 추가의 4 개 아미노산의 차이가 있다. 두 서열 간의 서열 동일성은 62.3%이다. 공여자 및 수용자 항체의 상이한 항원 특이성으로부터 예상되었듯이, CDR들의 아미노산 서열은 상이하였다. 구조형성영역 내의 서열 간에는 23 개 아미노산이 상이하였다.
8. AB164의 VH 및 VL 쇄의 예상 3-차원 모델화
스위스-프롯(SWISS-PROT) 3-차원 예상 모델화 소프트웨어 및 딥뷰(DeepView) (http://swissmodel.expasy.org/)를 사용하여 AB164의 VH 및 VL 쇄의 3-차원 모델을 결정하였다. CDR이 동정되었다. 상기 배열에 의해 결정되었듯이, 구조형성영역 내에서의 공여자 및 수용자 서열 간의 아미노산 상이성을 동정하고 CDR에의 근접성을 예측하였다 (표 3 및 4).
9. 공여자 CDR에 의한 수용자 CDR의 치환
MOG 특이적 면역글로불린의 VH 및 VL 쇄의 CDR을 AB164의 VH 및 VL 쇄의 CDR로 교체하였다 (표 2).
공여자 서열 (AB164)의 CDR에 의한 수용자 서열 (MOG 특이적 면역글로불린)의 CDR의 교체
쇄 CDR 수용자 서열 MOG 특이적 IgG AB164 서열로 치환
VH 1 GYTFTSYAIS GYAFTNYLIE
VH 2 AFDPEYGSTTYAQKFQG VINPGSGSTNYNEKFKD
VH 3 DVNFGNYFDY DYGYDGMDY
VL 1 RAGQSVSYYLA RASKSVSTSGYSYMH
VL 2 GASTRAT LASNLES
VL 3 QQYSSWPPT QHSRELPLT
10. 쥐과 생식계열 및 마모셋 Ig 서열 내의 공통 잔기 결정 및 조작 구조형성 서열의 선택
VH 쇄
VH 영역의 쥐과 생식계열 배열은
http://www.ibt.unam.mx/vir/vh_mice_directory.html#GL에서 찾을 수 있다.
마모셋 VH 서열은
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar
에서 칼리트릭스 자크후스 (Callithrix jacchus )의 모든 VH 아미노산 서열을 검색하여 그 서열들을 배열함으로써 얻을 수 있다. 배열 도구를 사용하여, 공여자 및 수용자 서열 간의 구조형성 서열 내의 아미노산 상이성이 나타나는 각 아미노산 위치에서 쥐과 생식계열 및 이용 가능한 칼리트릭스 자크후스 서열 양자 모두에서 공통 잔기를 결정하였다 (표 3).
공여자/수용자 서열에서의 VH 구조 상이성, 그들의 CDR 근접성 및 공여자/수용자 종에서 그들의 상대적 공통 잔기.
AB164 (AA 위치) CDR/들의 3.2 Å 이내 VH 내의 공통 잔기/들 쥐과 생식계열 MOG 특이적 Ig (AA 위치) VH 내의 공통 잔기/들 마모셋 서열 적용된 임의의 기준 선택된 아미노산
Q (5) 없음 Q V (5) V 없음 V
L (11) 없음 L V (11) V/L 3 L
V (12) 없음 V K(12) K 없음 K
R (13) 없음 K/R K (13) K 없음 K
T (16) 없음 A/Q A (16) A 없음 A
V (37) 없음 V A (37) V 3 V
K (38) 없음 K R (38) R 없음 R
R (40) 없음 R P (40) A 없음 P
I (48) 있음 ( CDR2 ) I M (48) M 2 I
K (67) 있음 ( CDR2 ) K R (67) R 2 K
A (68) 있음 ( CDR2 ) A V (68) V 2 A
L (70) 있음 ( CDR2 ) L M (70) M/I 2 L
K (74) 없음 K/T T (74) T/N 1 K
S (76) 없음 S T (76) T/K 1 S
Q (82) 없음 Q/E E (82) E 없음 E
T (87) 없음 T/Q/R R (87) R 없음 R
S (88) 없음 S P (88) P 없음 P
D (89) 없음 E E (89) E 없음 E
S (91) 없음 S T (91) T 없음 T
F (95) 없음 F/Y Y (95) Y 없음 Y
V (97) 있음 (CDR1 및 CDR3) A A (97) A 없음 A
S (113) 없음 * L (114) L 없음 L
각각의 쥐과 생식계열 및 이용 가능한 마모셋 VH 서열 내의 각 위치에서 공동 잔기 결정을 수행하였다. 특정한 기준을 만족하는 선택 위치에서 수용자 아미노산이 공여자 아미노산으로 교체되었으며 그 기준의 번호를 기재하였다.;
1. 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 항원과 상호작용 능력을 가질 것으로 예상되는 경우;
2. 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 공여자 CDR의 3.2 Å 이내에 위치하는 것으로 결정되는 경우;
3. 공여자 잔기가 수용자 종 면역글로불린 서열에서 공통 잔기일 경우;
4. 공여자 잔기가 공여자 생식계열에서 비공통일 경우.
기준을 만족하지 않는 위치에서는 수용자 서열이 사용되었으며 기준은 없음으로 기재하였다.
비고: 비공통적 잔기는 회색 음영으로 처리하고 치환은 굵은 글씨체로 표시하였다. *쥐과 생식계열은 113 위치의 서열 데이터를 포함하지 않으므로 여기에서는 마모셋 서열을 사용하였다.
요컨대, 수용자 서열이 공여자 서열로 교체된 8 개의 구조형성 아미노산 치환이 있었다. 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 공여자 CDR의 3.2 Å 이내에 위치하는 것으로 결정되었기 때문에 수용자 서열을 공여자 서열로 치환한 아미노산은 4 개가 있었다. 2 개 아미노산의 치환은, 공여자 잔기가 CDR-2와 근접한 (3.2 Å 미만은 아닐지라도) 루프의 회전 상에 위치하여 항원과 상호작용 능력을 가질 것으로 예상되었기 때문에 실행되었다. 추가로, 2 개 아미노산의 치환은 공여자 잔기가 이용 가능한 수용자 종 면역글로불린 서열에서 공통임이 발견되었기 때문에 실행되었다. 97 위치에서도 추가의 변경을 실행할 수 있다.
VL 쇄
VL 영역의 쥐과 생식계열 배열은
http://www.ibt.unam.mx/vir/vk_mice_directory.html#GLvk에서 찾을 수 있다.
마모셋 VL 서열은
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar
에서 칼리트릭스 자크후스 (Callithrix jacchus )의 모든 아미노산 서열을 검색하여 그 서열들을 배열함으로써 얻을 수 있다. 배열 도구를 사용하여, 공여자 및 수용자 서열 간의 구조형성 서열 내의 아미노산 상이성에 관련된 각 아미노산 위치에서 쥐과 생식계열 및 이용 가능한 마모셋 면역글로불린 서열에서 공통 잔기를 결정하였다 (표 4).
공여자/수용자 서열에서의 VL 구조 상이성, 그들의 CDR 근접성 및 공여자/수용자 종에서 그들의 상대적 공통 잔기.
AB164 (AA 위치) CDR/들의 3.2 Å 이내 VL 내의 공통 잔기/들 쥐과 생식계열 MOG 특이적 Ig (AA 위치) VL 내의 공통 잔기/들 마모셋 서열 적용된 임의의 기준 선택된 아미노산
D (1) 없음 D E (1) E 없음 E
I (2) 없음 I L (2) L 없음 L
L (4) 없음 L/M M (4) L/M 없음 M
S (10) 없음 S T (10) T 없음 T
A (12) 없음 A/S S (12) S 없음 S
V (13) 없음 V/A L (13) L 없음 L
L (15) 없음 L P (15) P 없음 P
Q (17) 없음 Q/E/D E (17) E 없음 E
I (21) 없음 I V (21) I/L/V 없음 V
P (47) 없음 S A (43) A 없음 A
K (49) 없음 K R (45) R 없음 R
V (62) Yes ( CDR2 ) V I (58) I 2 V
G (70) 없음 G R (66) G/R 없음 R
N (78) 없음 T T (74) T 없음 T
H (80) 없음 S S (76) S 없음 S
P (81) 없음 S S (77) S 없음 S
V (82) 없음 V L (78) L 없음 L
E (84) 없음 A P (80) P 없음 P
A (87) 없음 A F (83) F 없음 F
T (89) 없음 T V (85) V 없음 V
A (104) 없음 * Q (100) Q 없음 Q
L (110) 없음 * I (106) I 없음 I
T (113) 없음 * A (109) A 없음 A
각각의 쥐과 생식계열 서열 및 이용 가능한 마모셋 VL 서열 내의 각 위치에서 공동 잔기 결정을 수행하였다. 각 위치에서 상기 주어진 구조형성 서열 내 상이성 선택의 기준이 적용되었다. 특정한 기준을 만족하는 위치에서 수용자 아미노산이 공여자 아미노산으로 교체되었으며 그 기준의 번호를 기재하였다.;
1. 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 항원과 상호작용 능력을 가질 것으로 예상되는 경우;
2. 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 공여자 CDR의 3.2 Å 이내에 위치하는 것으로 결정되는 경우;
3. 공여자 잔기가 수용자 종 면역글로불린 서열에서 공통 잔기일 경우;
4. 공여자 잔기가 공여자 생식계열에서 비공통일 경우.
기준을 만족하지 않는 위치에서는 수용자 서열이 사용되었으며 기준은 없음으로 기재하였다.
비고: 비공통적 잔기는 회색 음영으로 처리하고 치환은 굵은 글씨체로 표시하였다. *쥐과 생식계열은 104 위치 및 그 이후의 서열 데이터를 포함하지 않으므로 여기에서는 마모셋 서열을 사용하였다.
요컨대, 수용자 서열이 공여자 서열로 교체된 1 개의 구조형성 아미노산 치환이 있었으며, 이는 3 차원 모델화에 기초하여 공여자 잔기가 공여자 CDR의 3.2 Å 이내에 위치하는 것으로 결정되었기 때문이다.
재료 및 방법
AB164 하이브리도마는 인간 TNF-α로 면역화된 마우스의 비장 림프구 (splenocyte)를 골수종 세포주 SP2/0-Ag14와 표준 방법으로 융합시켜 만들어졌다 (Fazekas de St. Groth, S., et al. Journal of Immunological Methods 35: 1-21 (1980); Sugasawara, R., Journal of Tissue Culture Methods 12: 93-95 (1989)).
11. 모노클로날 항체 AB164의 서열분석
알엔이지 미니 (RNeasy Mini) 또는 미디 (Midi) 컬럼 (QIAgen)을 사용하여 제조자 사용설명서에 따라 1 x 107 내지 1 x 108 생존가능 세포로부터 총 RNA (tRNA)를 추출하였다. 정량분석한 후에, tRNA는 올리고(dT) 프라이머 및 수퍼스크립트 II 리버스 트란스크립타제 (Superscript II Reverse Transcriptase) (Invitrogen)를 사용하여 제조자 사용설명서에 따라 실시하는 첫 번째 가닥 cDNA 합성에 주형 (template)으로 사용되었다. 최종적으로 tRNA를 알엔아제 H (RNase H)로 분해하고 말단 트란스페라제 및 dGTP (Roche)를 사용하여 남은 단일 가닥 cDNA를 폴리-G 테일로 태그하였다(tagged).
고충실도 폴리머라제 블렌드 (high fidelity polymerase blend), 허큘라제 (Herculase) (Stratagene)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각각의 경우에 IgG1 중쇄 특이적 또는 카파 경쇄 특이적 역방향 프라이머와 함께 올리고(dC)를 순방향 프라이머로 사용하였다. 이후에 30 주기의 PCR 반응은 돌출 A 염기들을 부가하기 위하여 Taq 폴리머라제의 존재 하에 배양하였다. 얻어진 PCR 산물을 pGemT-Easy (Promega)에 클로닝하고 컴피턴트 톱 10 이. 콜라이 세포 (competent Top 10 E. coli cells) (Invitrogen)에 형질변환시켰다. QIA퀵 미니프렙 컬럼 (QIAquick Miniprep columns) (QIAgen)을 사용하여 단일 콜로니의 밤샘 배양으로부터 플라스미드를 추출하여 정량분석하였다. 100 내지 500 ng을 6.4 pmol의 pUC3 순방향 또는 pUC3 역방향 프라이머와 이중 실험으로 혼합하고, 빅다이 v3.1 케미스트리 ( BigDye v3.1 chemistry) (AppliedBiosystems)를 사용하여 주기 서열 분석을 실시하였다. 전기영동도 (electrophoretograms)를 ABI PRISM 3700 DNA 분석기 상에서 분석하고, 얻어진 서열을 배열한 후, 비정상적 염기 신호 (aberrant base calling)의 수동 보정을 수행하였다. 일단 4 개의 일치 서열 (2 개의 정방향 및 2 개의 순방향)이 얻어지면 항체 가변영역의 서열이 확인되었다. 이러한 서열들은 AB164 의 중쇄 및 경쇄 (SEQ ID NOS: 7 및 8)에 대한 아미노산 서열로 번역되었다.
12. AB138 (MOG 특이적 마모셋 유래 가변영역-인간 불변영역 키메라) 및 AB103 (항-TNFα 쥐과 가변영역-인간 불변영역 키메라)의 창안
수용자 서열의 VH 영역 (Accession Number: AAM54057, SEQ ID No: 1)을 인간 불변영역 (인간 IgG1 중쇄 CH1, 경첩, CH2 & CH3 도메인 (예를 들어 NCBI accession number P01857) (SEQ ID No:2)과 함께 발현시켰다. 수용자 서열의 VL 영역 (Accession Number: AAM54058, SEQ ID No: 3)을 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (예를 들어 NCBI accession number AAA58989) (SEQ ID No:4)와 함께 발현시켰다. 얻어진 키메릭 항체를 AB138 (SEQ ID NOs: 5 및 6)이라고 명명하였다. 이 항체는 VH 및 VL 쇄 내에 변화를 주는 주형 (template)으로 사용되었다.
완전한 쥐과 AB164 (SEQ ID No: 7 및 8)로부터의 VH 및 VL 영역을 상기 언급된 동일한 인간 불변 영역과 함께 발현시켰다. 이 키메릭 항체를 AB103으로 명명하였다.
AB103 의 클로닝
완전한 쥐과 AB164 (SEQ ID No: 7 및 8)로부터의 VH 및 VL 영역을 진옵티마이저 (GeneOptimizer) 기술을 이용하여 포유류 세포 발현에 최적화된 DNA 서열로 역번역하고 합성 올리고뉴클레오티드 (GeneArt, Germany)의 조립에 의해 데 노보 합성하였다. VH 유전자의 경우 각 서열의 5' 말단 측면에 Asc I 부위, 코자크 서열 (GCCACC) 및 인간 IgG 감마 리더 서열 (아미노산 서열 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS)이 있다. 3' 말단에는 필요한 아미노산 서열을 손상시키지 않으면서 Tth 111I 제한효소 부위가 도입되도록 DNA 서열을 조작하였다. VL 유전자의 경우 각 서열의 5' 말단 측면에 Bsi WI 부위, 코자크 서열 (GCCACC) 및 인간 카파 리더 서열 (아미노산 서열 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC)이 있다. 3' 말단에는 필요한 아미노산 서열을 손상시키지 않으면서 Rsr II 제한효소 부위가 도입되도록 DNA 서열을 조작하였다. 데 노보 유전자 합성 후에, 가변 영역을 pCRScript 벡터 (Stratagene)에 클로닝하고 VH 및 VL 서열을 각각 Asc I / Tth 111I 및 Bsi WI / Rsr II로 절단하여 방출시켰다. pEE6.4-VH-IgG1에 대해서는 Asc I / Tth 111I에 의해, pEE12.4-VL-카파 절단에 대해서는 Bsi WI / Rsr II에 의해 제조되는 AB138을 발현시키기 위해 창안된 벡터로부터 유래된 단일 유전자 벡터 골격에 방출된 서열을 결찰하였다.
프로메가 (Promega)사의 리가패스트 래피드 DNA 결찰 시스템 (LigaFast Rapid DNA Ligation System) (Cat No. M8221)을 사용하여 제조된 골격에 각 유전자를 결찰시켰다. 원 샷 톱 10 화학적 컴피턴트 세포 (One Shot Top 10 chemically competent cells) (Invtrogen Cat No. C4040-03)에 결찰물을 형질변환시키고 양성 콜로니를 표준 기술로 동정하였다. 안정적 발현을 위한 이중 유전자 벡터는 상기 약술한 바와 같이 제조되었다 (실시예 1). QIA필터 미디프렙 컬럼 (QIAfilter midiprep columns) (QIAgen Cat No. 12243)을 이용하는 밤샘 배양의 미디프렙에 의해 많은 양의 벡터를 제조하였다. 100% 에탄올에서 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (pH 5.2) (각각 Sigma Cat Nos. E7023-500ML 및 S2889)로 20 ㎍을 침전시켜 트란스펙션을 위한 벡터를 제조하였다. 70% 에탄올에서 세척한 후에 벡터를 40 ㎕의 T.E. pH 8.0 (Sigma Cat No. T9285-100ML)에 활동농도 0.5 ㎍/㎕로 재현탁시켰다.
13. 조작 모노클로날 항체 AB197의 창안
MOG 특이적 면역글로불린을 수용자 서열로 사용하고 구조 내의 지정된 잔기들 및 CDR을 공여자 서열 (AB164)의 것들로 교체함으로써, 조작된 VH 및 VL 항체 서열을 결정하였다. 이러한 가변영역 단백질 서열은 인간 불변영역 (SEQ ID NOs: 2 및 4)과 함께 발현되었다. 얻어진 조작 항체를 AB197 (SEQ ID NOs: 11 and 12)이라고 명명하였다.
표 5는 각 항체의 CDR, VH/VL 구조형성영역 및 불변영역의 종 기원을 기술한다.
AB138, AB164, AB197, AB103에 대한 CDR, VH/VL 구조형성영역 및 불변영역의 종 기원
작제물 CDR VH/VL 구조형성영역 불변영역 항원
AB138 마모셋 마모셋 인간 랫트 MOG
AB164 쥐과 쥐과 쥐과 인간 TNFα
AB197 쥐과 마모셋 인간 인간 TNFα
AB103 쥐과 쥐과 인간 인간 TNFα
AB197 의 클로닝
수용자 서열의 구조 내의 지정된 잔기들 및 CDR을 공여자 서열의 것들로 교체함으로써, 조작된 VH 및 VL 항체 서열을 결정하였다 (SEQ ID No:11 and 12). 항체 서열을 DNA 서열로 역번역하고 합성 올리고뉴클레오티드 (GeneArt, Germany)의 조립에 의해 데 노보 합성하였다. 상기한 바와 같이 (실시예 1) 클로닝 및 AB197을 발현하는 이중 유전자 벡터의 생산이 가능하도록 하기 위하여 합성 중에 관련 제한효소 부위들을 서열 내에 혼입시켰다.
14. AB103, AB197 및 AB164의 발현
AB103 및 AB197의 트란스펙션
각각의 트란스펙션을 위하여 175 ㎕의 리포펙타민 2000을 6 웰 플레이트의 한 웰 안에서 5 mL의 옵티멤 I 배지 (Optimem I media) (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 및 31985-062)에 가하였다. 두 번째 웰 안에서는 70 ㎕의 발현 벡터 (70 ㎍)를 5 mL의 옵티멤 I 배지에 가하였다. 5 분간의 실온 배양 후에, 두 웰의 내용물을 서로 섞어 20 분간 추가 배양하였다. 두 번째 배양 후에 전체 트란스펙션 혼합물을 CHOK1SV 세포가 들어 있는 T175 조직 배양 플라스크에 가하였다. 세포를 72 내지 96 시간 동안 배양하고 상등액을 수거하였다. 상등액을 4,000 x g에서 5 분간 원심분리하여 세포 잔해를 침강시키고, 0.22 ㎛ 카트리지 필터를 통과시켜 여과 멸균하였다.
쥐과 모노클로날 항체 AB164의 생산
AB164를 발현하는 하이브리도마 세포를 표준 조직 배양 방법을 이용하여 배양하고 상등액을 수거하여 4,000 x g에서 5 분간 원심분리하여 세포 잔해를 침강시키고, 0.22 ㎛ 카트리지 필터를 통과시켜 여과 멸균하였다.
AB103, AB197 및 AB164의 항체 정제
상등액을 하이트랩 단백질 A 컬럼 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0402-01)에 1 mL/min의 유속으로 3 회 통과시켰다. 컬럼을 20 mM 소듐 포스페이트로 40 분간 1 mL/min로 세척하였다. 항체를 0.1 M 시트르산 pH 3.5로 용출시켜 분획을 수집하고 pH 9.0의 1M Tris-HCl로 즉시 중화시켰다. 항체 시료를 PD-10 컬럼 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0851-01)에서 탈염하였다. SDS-PAGE 및 크기-배제 (size-exclusion) HPLC에 의한 항체 분석을 통해 분자량, 조립된 항체의 존재 및 항체 농도가 확인되었다.
15. 친화성 결합 활성조사
방법
ELISA 방법
TNF-α (Peprotech Cat No: 300-01A)을 카보네이트 코팅 완충액 (10 mM 디소듐 포스페이트, 20 mM 소듐 하이드로젠 포스페이트 pH 9.6)에서 1 ㎍/mL로 희석하였다. 이 용액 100 ㎕를 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하고 습윤 용기 내에서 4℃로 밤새 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액 (0.01 M PBS pH 7.2, 0.05% Tween-20)으로 3회 세척한 후에 0.01 M PBS pH 7.2로 3회 세척하였다. 각 웰에 200 ㎕의 블로킹 완충액 (0.01M PBS pH 7.2 내의 1% w/v BSA)을 가하고 플레이트를 25 ℃에서 1 시간 동안 습윤 용기 안에 배양함으로써 웰을 블로킹하였다. 항체를 항체 희석제 (1% w/v BSA, 0.01 M PBS pH 7.2 내의 0.05% Tween-20)로 희석하여 6.00 ㎍/mL 내지 0.0578 ng/mL 범위에 걸친 적정 곡선 (titration curve)을 산출하기에 충분하도록 하였다. 웰을 항체와 함께 25 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하였다. 결합된 AB197 및 AB103을 검출하기 위하여 100 ㎕의 항-IgG H + L 항체 HRP 접합체 (Zymed, Cat No: 81-71200)를 항체 희석제 내 1:2000으로 사용하였다. 결합된 AB164의 검출을 위해서는 100 ㎕의 항-쥐과 면역글로불린 항체 HRP 접합체 (Dako, Cat No: P0260)을 항체 희석제 내 1:2000으로 사용하였다. 항체 희석제만 들어 있는 웰을 배경 흡광 측정에 사용하였다. 25 ℃에서 1 시간 동안 습윤 용기 안에 배양한 후에 플레이트를 상기한 바와 같이 다시 세척하였다. 100 ㎕의 TMB 기질 용액 (Zymed, Cat No: 00-2023)을 각 웰에 가하고 4 분 동안 발색 시켰다. 100 ㎕의 1 M HCl을 가하여 발색반응을 종결하고 450 nm에서 흡광도를 결정하였다 (ref. 620 nm).
ELISA 결과
고체상에 코팅되어 있는 TNF-α와 AB164, AB197 및 AB103의 결합을 비교하기 위하여 ELISA를 사용하였다. 그 결과에서, 모든 항체들이 0.68 ㎍/mL 이하의 EC50 값을 가지며 TNF-α에 강력하게 결합하는 것으로 나타났다 (도 5, 표 6). 항체 AB164 및 AB103의 결합 프로파일 비교에서 알 수 있듯이, 쥐과 불변영역 (AB164)을 인간 IgG1 불변영역 (AB103)으로 교체함이 결합 친화성을 유의적으로 감소시키지 않았다. 항체 AB164 및 AB197의 결합 프로파일 비교에서 알 수 있듯이, AB197을 생산하기 위한 AB164의 조작은 TNF-α 결합의 유의적 손실을 유발하지 않았다 (도 5).
작제물 EC-50 (㎍/ml)
AB164 0.45
AB197 0.68
AB103 0.19
생존 세포를 이용한 TNF-α 세포독성 중화 활성조사 (L-929 중화 활성조사) 방법
L929 세포 (ATCC No: CCL-1)를 10% 우태아 혈청 (foetal bovine serum), 50 ㎍/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Sigma Cat No: P0781), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen Cat No: 25030-081) 및 10 μM 2-머캅토에탄올 (Invitrogen Cat No: 21985-023)을 함유하는 RPMI 1640 (Invitrogen Cat No: 21870-076)에서 세포가 콘풀루언스 (confluence)의 70% 수준에 달할 때까지 배양하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 배지를 가하였다.
L929 세포에 대한 TNF-α의 세포독성을 조사하기 위하여, 웰당 50 ㎕의 TNF-α 활동용액 (30 ng/mL)을 삼중 반복으로 플레이트의 첫 번째 컬럼에 가하고 최종 농도 9 fg/mL에 달하도록 연속적 반 로그 희석 (serial half log dilution)을 플레이트를 가로질러 수행하였다. TNF-α가 없는 50 ㎕의 배지가 들어 있는 대조군 웰 또한 준비하였다 (V=100%). 모든 웰에 50 ㎕의 L929 세포를 5 X 10-5 cells/mL로 가하였다. 추가의 세포 또는 TNF-α가 없는 100 ㎕의 배지가 들어 있는 추가 대조군 (배경)도 준비하였다. 모든 웰에 악티노마이신 D (Sigma Cat No: A1410)를 40 ㎍/mL로 가하였다.
조작 항체에 의한 TNF-α의 중화를 조사하기 위하여 중화 활성조사를 수행하였다. 독립적인 플레이트의 첫 번째 컬럼에 23 ㎕의 항체를 10 ㎍/mL로 삼중 반복하여 가하고 최종 농도 30.4 pg/mL에 달하도록 플레이트를 가로질러 연속적 로그 희석을 수행하였다. 상기 웰에 50 ㎕의 L-929 세포를 5 X 10-5 cells/mL 로 가하였다. 추가로 25 ㎕의 악티노마이신-D를 모든 웰에 가하였다.
모든 플레이트를 37 ℃에서 5% CO2 존재 하에 20 시간 동안 배양하였다. 배양 후에 25 ㎕의 MTS/PES 셀타이터 96 AQueous 단일 용액 시약 (MTS/PES CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent) (Promega Cat No: G358B)을 모든 웰에 가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 492 nm (ref. 630 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 모든 반복 처리의 평균 흡광도는 무세포 및 무TNF 대조군 웰의 평균 흡광도 (배경)에서 감산하였다. 이로부터 L-929 세포의 % 생존력 (% Viability)이 하기 수학식에 의해 계산되었다:
% 생존력 = (A492 실험 웰)/(A492 V=100% 생존) × 100
생존 세포를 이용한 TNF-α 세포독성 중화 활성조사 (L-929 중화 활성조사) 결과, AB164, AB197 및 AB103은 TNF-α-유도된 세포독성을 중화시킬 수 있음이 확인되었다 (도 6, 표 7).
작제물 EC-50 (㎍/ml)
AB164 0.10
AB197 0.41
AB103 0.10
특이적 구체예에서 입증되듯이 명백하게 기술된 본 발명의 정신 또는 범위를 이탈하지 않으면서 본 발명에 대한 다수의 변형 및/또는 개질이 이루어질 수 있음을 당업자는 인식할 것이다. 따라서 본 구체예들은 어떠한 경우에도 한정적이 아닌 설명적인 것으로 간주되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Peptech Limited <120> ENGINEERED ANTIBODIES WITH NEW WORLD PRIMATE FRAMEWORK REGIONS <130> WJP 03 1403 8979 <150> AU 2005904406 <151> 2005-08-15 <150> US 60/709,333 <151> 2005-08-17 <160> 12 <170> KoPatentIn 1.71 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Callithrix jacchus <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Phe Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Asn Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 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Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Asn Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Asn Pro Asp Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB138 light chain sequence <400> 6 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Val 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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB197 heavy chain sequence <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB197 light chain sequence 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Claims (33)

  1. 2 개 이상의 상보성결정영역 (CDRs) 및 3 개 이상의 구조형성영역을 포함하고, 상기 구조형성영역은 뉴 월드 영장류 구조형성영역 (New World primate framework region)이거나 그로부터 유래된 것이며, 상기 하나 이상의 CDR은 비-뉴 월드 영장류 CDR (non-New World primate CDR)인 가변영역을 가진, 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  2. 제1항에 있어서, 가변영역이 3 개의 CDR 및 4 개의 구조형성영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 쥐과 CDR 서열 (murine CDR sequence)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 마우스 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 랫트 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 인간 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 합성 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 하나 이상의 토끼 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 상이한 제공원 (differing source)으로부터의 CDR의 조합을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 3 개의 쥐과 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  11. 제10항에 있어서, 3 개의 쥐과 CDR 서열이 마우스 CDR 서열인 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 3 개의 인간 CDR 서 열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 4 개의 뉴 월드 영장류 구조형성 서열 (framework sequence)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 가변영역이 4 개의 구조형성영역을 포함하며, 상기 구조형성영역이 뉴 월드 영장류 구조형성영역으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 도메인 항체 (domain antibody)인 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 부위가 인간 또는 비-인간 올드 월드 영장류 불변영역 서열을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴 월드 영장류 구조형성영역이 마모셋 (marmoset), 타마린 (tamarin), 다람쥐 원숭이 (squirrel monkey), 티티 원숭이 (titi monkey), 거미 원숭이 (spider monkey), 양털 원숭이 (woolly monkey), 흰목꼬리감기 원숭이 (capuchin), 우아카리스 (uakaris), 사키스 (sakis), 밤 또는 올빼미 원숭이 (night or owl monkey) 및 고함 원숭이 (howler monkey)로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴 월드 영장류로부터 유래된 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  18. 제17항에 있어서, 뉴 월드 영장류가 마모셋인 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 부위가 결합하는 항원이 본질적으로 펩티드, 단백질, 탄수화물, 당단백질, 지질 또는 당지질로서, 암태아 항원 (carcinoembryonic antigen), EpCAM, 루이스-Y (Lewis-Y), 루이스-Y/b (Lewis-Y/b), PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL 및 VEGF 수용체를 포함하는 종양-관련 항원, CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC 클라스 I, MHC 클라스 II, GM-CSF, 인터페론-γ, IL-1, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α 및 IgE를 포함하는 면역 또는 염증성 질환 또는 장애에 관련된 항원, 당단백질 IIb/IIIa, P-당단백질을 포함하는 숙주세포에서 발현되는 항원, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD56, CD58, CD62 또는 CD144를 포함하는 퓨린성 수용체 및 유착 수용체, 사이토카인, 케모카인을 포함하는 항원, 에오탁신 (eotaxin), IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF 및 그들의 수용체를 포함하는 성장인자 또는 다른 가용성 생리학적 조절자 또는 그의 수용체, β-아밀로이드 및 프리온을 포함 하는 중추신경계 질환 또는 장애에 관련된 항원, 호흡기 신시셜 바이러스 (respiratory syncitial virus) 단백질 F, 탄저균 (anthrax) 독소, 방울뱀 독액 및 디곡신을 포함하는 미생물성 (microbial), 미소생물성 (nanobial) 또는 바이러스성 항원 또는 독소와 같은 비-인간 기원의 항원으로부터 선택되며; 여기에서 키메릭 항체가 작용제 또는 길항제로서 작용하거나 보체 (complement) 또는 살해 세포 (killer cell) (예를 들어 NK 세포)와 함께 작용하여 바람직하지 않은 세포 (예를 들어 항-CD4)를 고갈 (살해 또는 제거)시키는 활성을 가지거나 세포독성 약제 활성을 가지거나 식세포 (phagocyte)에 의한 Fc-수용체 결합을 유발하거나 그 표적의 생물학적 활성을 중화 (neutralize)시키는, 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  20. 제19항에 있어서, 항원이 인간 TNFα인 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 구조형성영역의 서열이 결합을 증가시키기 위해 개질된 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 구조형성영역의 서열이 인간에서의 예상 면역원성을 감소시키기 위해 개질된 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 부위, 또는 그의 약제학적 조성물, 용기 및 사용설명서를 포함하는 키트.
  24. 세포 표면 항원 또는 사이토카인과 결합하는 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위로서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 2 개 이상의 상보성결정영역 (CDR) 및 3 개 이상의 구조형성영역을 포함하는 가변영역을 포함하고, 상기 CDR은 상기 항체 또는 항원-결합 부위가 세포 표면 항원 또는 사이토카인에 결합하도록 선택되는 것을 특징으로 하는, 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  25. 제24항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 CD3, CD20, CD33, EGF-R, Her-2 및 CD25로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 표면 항원에 결합하는, 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  26. 제24항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 부위가 TNFα 또는 VEGF에 결합하는, 설계된 뉴 월드 영장류 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위가 도메인 항체인, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 부위가 인간 또는 비-인간 올드 월드 영장류 불변영역 서열을 추가로 포함하는, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴 월드 영장류가 마모셋, 타마린, 다람쥐 원숭이, 티티 원숭이, 거미 원숭이, 양털 원숭이, 흰목꼬리감기 원숭이, 우아카리스, 사키스, 밤 또는 올빼미 원숭이 및 고함 원숭이로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  30. 제29항에 있어서, 뉴 월드 영장류가 마모셋인, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 구조형성영역의 서열이 결합을 증가시키기 위해 개질된, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 구조형성영역의 서열이 인간에서의 예상 면역원성을 감소시키기 위해 개질된, 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 설계된 뉴 월드 항체 또는 그의 항원-결합 부위, 또는 그의 약제학적 조성물, 용기 및 사용설명서를 포함하는 키트.
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