MX2008008029A - Dab antiinflamatorio - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo de dominio recombinante (dAb) que enlaza a TNF-a humano, el dAb que comprende un dominio variable de cadena pasada o ligera de inmunoglobulina, en donde el dominio variable comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tienen una secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo, en donde la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAATKLQS (SEQ ID No:1), YEASSLQS (SEQ ID No. 2), YEASKLQS (SEQ ID No:3) y YSASNLET (SEQ ID No:4). El anticuerpo de dominio recombinante se usa para detectar TNF-a humano en una muestra y para tratar un desorden caracterizado por actividad de TNF-a humano.

Description

DAB ANTIINFLAMATORIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención . se relaci.ona a anticuerpos de dominio recombinante (dAbs) útiles para terapia humana. ¦ Más particularmente, la presente invención se relaciona a un anticuerpo de dominio (dAb) que enlaza a TNF-a humano y su uso en el tratamiento de desórdenes caracterizados : por actividad de TNF-a humano. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) es una citoquina producida por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos, que se ha implicado en mediar el choque y la patofisiologia de una variedad de enfermedades y desórdenes humanos incluyendo sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunes, rechazo de transplante y enfermedad de injerto contra hospedero. En un esfuerzo para combatir los efectos per udiciales mediados por TNF-a humano, anticuerpos; que enlazan y neutralizan TNF-a humano se han buscado como un medio para inhibir la actividad de TNF- . Algunos de' los anticuerpos más anteriores dirigidos contra TNF-a humano fueron anticuerpos monoclonales de ratón secretados de lineas de células de hibridoma preparados de linfocitos recolectados de ratones inmunizados con TNF-a humano. Aunque tales anticuerpos fueron efectivos en enlazar y neutralizar TNF- humano, su uso en la terapia in vivo se ha limitado por problemas asociados con la administración de anticuerpos de ratón a humanos, en particular, la inducción de una respuesta inmune indeseada contra el anticuerpo de ratón en un humano, referido como reacciones de anticuerpo anti-ratón humano ( HAMA) . En un intento para superar estos problemas, los anticuerpos de TNF-a anti-humano de murino se han diseñado genéticamente para ser más similares al humano. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos de humanos/ratón se han creado en los cuales las secuencias de región variable de anticuerpo del genoma del ratón se combinan con secuencias de región constante de anticuerpo del genoma humano. Los anticuerpos quiméricos exhiben las características de enlace del anticuerpo de ratón parental, y las funciones efectoras asociadas con la región constante humana. Auque estos anticuerpos quiméricos se han utilizado en la terapia humana, ellos todavía retienen algunas secuencias de murino y por lo tanto todavía pueden inducir reacciones de anticuerpo antiquiméricas en recipientes humanos, particularmente cuando se administran durante períodos prolongados de esta manera limitando su aplicación terapéutica. Los anticuerpos monoclonales humanos contra TNF-a humanos se han desarrollado utilizando técnicas de hibridoma de humano. Este procedimiento, sin embargo, sufre de limitaciones éticas, clínicas e inmunológicas sobre la inmunización de sujetos humanos. . Se ha postulado que los anticuerpos de primate no de humano serán tolerados en humanos debido a que son estructuralmente similares a los anticuerpos de humano (Ehrlich PH y colaboradores, Human and primate monoclonal antibodies for in vivo therapy. Clin Chem. 34:9 pg 1681-1688 (1988)) . Además, debido a que los anticuerpos de humano son no inmunogénicos en monos Rhesus (Ehrich PH y colaboradores, Rhesus monkeys responses to múltiple injections of human monoclonal antibodies. Hybridoma 1987; 6:151-60), es probable que lo contrario también es aplicable y los anticuerpos de primate serán no inmunogénicos en humanos. Los primates evolucionariamente distantes, tales como primates del Nuevo Mundo, no son solo suficientemente diferentes de los humanos para permitir a los anticuerpos contra los antígenos humanos que sean generados, pero son suficientemente similares a los humanos que tienen anticuerpos similares a los anticuerpos humanos de modo que el hospedero no genera una respuesta inmune de anti-ant icuerpo cuando tales anticuerpos derivados de primate se introducen un humano. Los primates del Nuevo Mundo ( infraorden- Platyrrhini ) comprenden por lo menos 53 especies comúnmente divididas en dos familias, la Callithricidae y Cebidae. La Callithricidae consiste de titís y tamarinos. La Cebidae incluye el mono ardilla, mono titi, mono araña, mono lanudo, capuchino, mono nocturno o trasnochador y el mono aullador . Estudios previos han caracterizado el repertorio de cadena pesada de inmunoglobulina expresado del :tití Callithrix jacchus (von Budingen H-C y colaboradores, Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus. Immunogenetics 2001; 53:557-563) . Seis subgrupos de IGHV se identificaron los cuales mostraron un alto grado de similitud de secuencia a sus contrapartes de IGHV humanas. Las regiones de estructura fueron más conservadas cuando se comparan con las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) . El grado de similitud entre C. jacchus y las secuencias IGHV humanas fueron menores que entre los primates del Viejo Mundo y los humanos . Anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio (dAb) son las unidades de enlace de funcionamiento más pequeñas de anticuerpos y corresponden a las regiones variables de ya sea las cadenas pesadas (VH) o ligeras (VL) de anticuerpo. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menor que un décimo el tamaño de un anticuerpo completo. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina son referidas ya sea como cadenas ligeras kappa o lambda y las cadenas pesadas como gamma, mu delta, alfa o epsilon. La región variable da al anticuerpo su especificidad. Dentro de cada región variable están regiones de hipervariabilidad, de otra manera conocidas como regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que están flanqueadas por regiones más conservadas referidas como regiones de estructura. Dentro de cada región variable están tres CDRs y cuatro regiones de estructura . En contraste a los anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio son bien expresados en sistemas bacterianos, de levadura y mamíferos. Su tamaño pequeño permite cantidades molares más altas por gramo de producto, proporcionando de esta manera un incremento significante en la potencia por dosis. Además, los anticuerpos de dominio pueden ser utilizados como un bloque de construcción para crear productos terapéuticos tales como múltiples dAbs de dirección en los cuales una construcción que contiene dos o más dominios variables enlaza a dos o más objetivos terapéuticos, o dAbs dirigidos para administración pulmonar u oral . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo de dominio recombinante (dAb) que enlaza a TNF-a humano, el dAb que comprende un dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina , en donde el dominio variable comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene: una secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo en donde la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAATKLQS (SEQ ID No: 1) , YEASSLQS (SEQ ID No: 2), YEASKLQS (SEQ ID No:' 3) , YSASNLET (SEQ ID No: 4) . En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del dAb de acuerdo con el primer aspecto de la invención, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable . En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un dAb de acuerdo con el primer aspecto de la invención en una aplicación de diagnóstico ¡para detectar TNF-a humano. En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para tratar un desorden caracterizado por actividad de TNF-a humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. En un quinto aspecto la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica el dAb del primer aspecto de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No: 6) y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 5) del dAb aceptor. La Figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de segmentos de gen Vk de once (11) titis y seis (6) monos trasnochadores. La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de dAb aceptor (ambas hebras) . Los sitios de digestión de restricción para Kpn I y San DI que extirpa una región que incluye la CDR2 son indicados en la Figura. Los residuos CDR2 removidos se indican en subrayado. La Figura 4 muestra alineaciones de secuencia que muestran oligonucleótidos usados durante la clonación y la confirmación de secuencia final de las secuencias de nucleótidos (A) y de aminoácidos (B) mostradas en la Figura 2. La Figura 5 demuestra la habilidad de los dAbs injertados en CDR2 para inhibir el enlace de TNF al receptor de TNF recombinante . Los dAbs probados fueron como sigue: Owl Trasnochador 1 (CDR=YAATKLQS ; SEQ ID No: 1), Mono Trasnochador 2 (CDR=YEASSLQS ; SEQ ID No: 2), Titi 1 (CDR=YEASKLQS; SEQ ID No: 3), Titi 2 (CDR=YSASNLET ; SEQ ID No: 4) y dAb Aceptor (CDR=YSASELQS; SEQ ID No: 49) . La Figura 6 demuestra la habilidad mejorada de los Compuestos 100 y 123 para neutralizar la actividad citotóxica de TNF sobre fibroblastos L929 de ratón con relación al dAb aceptor (Compuesto 145) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo de dominio recombinante (dAb) que enlaza a TNF-a humano, el dAb que comprende un dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina , en donde el dominio variable comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene una secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo en donde la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAAT LQS (SEQ ID No: 1), YEASSLQS (SEQ ID No: 2), YEASKLQS (SEQ ID No: 3), YSASNLET (SEQ ID No: 4) . De preferencia, la CDR es CDR2. En una modalidad preferida, el dAb tiene una secuencia seleccionada de: DIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 145; SEQ ID No: 7] DIQMTQS PSSLSASVGDRVT ITCRASQAI DSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 123; SEQ ID No : 8] DIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 100; SEQ ID No: 9] DIQMTQS PSSLSASVGDRVTITCRASQAI DSYLHWYQQKPGKAPKLLI YSASNLET 1 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 196; SEQ ID No: 10] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV RPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 134; SEQ ID No: 50] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG VPSRFSGRGSGTDFTLT I SSLQPEDFA YYCQQVVWRPFT FGQGT VEI KR [Compuesto 137; SEQ ID No: 51] ' DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR [Compuesto 121; SEQ ID No: 52]. En un aspecto adicional la inspección proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica el dAb del primer aspecto de la invención. ' El término "enlaza a" como se utiliza eri la presente, se propone para referirse al enlace de un antigeno mediante una región variable de inmunoglobulina con una constante de disociación (Kd) de ?µ? o inferior como es medido mediante el análisis de resonancia de plasmón de superficie usando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie BIAcore™ y el software de valuación cinética BIAcore™ (por ejemplo versión 2.1) . La constante de afinidad o disociación (Kd) para una interacción de enlace especifica es de preferencia aproximadamente 500 nM o inferior, más de preferencia aproximadamente 300 nM o inferior y de preferencia por lo menos 300 nM a 50 pM, 200 nM a 50 pM, y más de preferencia por lo menos 100 nM a 50 pM, 75 nM a 50 pM, 10 nM a 50 pM. El término "dominio variable" como se utiliza en la presente se propone para un dominio de polipéptido plegado que comprende características de secuencias de dominios variables de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina y que específicamente enlaza un antígeno. Un anticuerpo de dominio o dAb es equivalente a un solo polipéptido de dominio variable. Será apreciado por personas expertas en la técnica que el resto de la secuencia del dominio variable puede ser derivada de ya sea una secuencia de dominio variable humana, de primate de Nuevo Mundo o' primate del Viejo Mundo que, debido a sus asociación evolucionaría con humanos, comparte un alto grado de homología con la secuencia humana. Así, por ejemplo, un CDR seleccionada de las secuencias anteriores se puede injertar en la secuencia de región variable humana o de primate para remplazar la CDR de tipo silvestre. Por consiguiente, la invención además está basada sobre un método para la amplificación de genes de dominio variable de inmunoglobulina de primate del Nuevo Mundo, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ácido nucleico extraído de linfocitos de primate del Nuevo Mundo utilizando cebadores específicos para las familias de genes de dominio variable de cadena pesada y ligera. Por ejemplo, la información que considera los limites de los dominio variables de los genes de cadena pesada y ligera (VH y VL respectivamente) se pueden utilizar para diseñar cebadores de PCR que amplifican el dominio variable de una secuencia de codificación de cadena pesada o ligera clonada que codifica un anticuerpo conocido que enlaza un antigeno dado. El dominio variable amplificado luego se inserta ya sea solo o como una fusión con otra secuencia de polipéptido en un vector de expresión adecuado. El dominio variable es expresado luego se clasifica para el enlace de alta afinidad al antigeno deseado. El repertorio de los dominios de VH y VL puede ser un repertorio que ocurre naturalmente de secuencias de inmunoglobulina o un repertorio sintético. Un repertorio que ocurre naturalmente es uno preparado, por ejemplo, de células que expresan inmunoglobulina, recolectadas de uno o más primates. Tales repertorios pueden ser naive, es decir preparados de células que expresan inmunoglobulinas recién nacidas, o rearreglados , es decir, preparados de, por ejemplo, células B de primate adulto. Si se desea, los clones identificados de un repertorio natural, o cualquier repertorio que enlaza el antigeno objetivo luego se someten a mutagénesis y clasificación adicional con el fin de producir y seleccionar variantes con características de enlace mejoradas. Los repertorios sintéticos de dominios variables de inmunoglobulina individuales se preparan el introducir artificialmente diversidad en un dominio variable clonado. Un repertorio de dominios de VH y VL se puede clasificar para la especificidad de enlace deseada y el comportamiento funcional mediante, por ejemplo la exhibición de fago. Los' métodos para la construcción de librerías de exhibición de bacteriófago' y librerías de expresión de fago lambda son bien conocidos en la técnica. La técnica de exhibición de fago se ha descrito extensivamente en el arte y ejemplos de métodos y compuestos para generar y clasificar tales librerías y la maduración de afinidad de los productos de estos se puede encontrar en, por ejemplo, Barbas y colaboradores, (1991) PNAS 88:7978-7982; Clarkson y colaboradores, (1991) Nature 352:62 :628; Dower y colaboradores, PCT . 91/17271, patente norteamericana No. 5,427,908, patente norteamericana No. 5,580,717 y EP 527,839; Fuchs y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Garrad y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1373:1377; Garrad y colaboradores, PCT WO 92/09690; Gram y colaboradores, (1992) PNAS 89:3576-3580; Griffiths y colaboradores, (1993) EMBO J 12:725:734; Griffiths y colaboradores, patente norteamericana No. 5,885,793 y EP 589, 877 ; Hawkins y colaboradores, (1992) J Mol Biol Í226: 889-896; Hay y colaboradores, (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Hoogenboom y colaboradores, (1991) Nuc Acid, Res 19:4133-4137; Husc y colaboradores, (1989) Science 246: 1275-1281; Knappik y colaboradores, (2000) J Mol Biol 296: 57-86; Knappik y colaboradores, PCT WO 97/08320; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,571,698, No. 5,837,500 y EP 436,597; McCafferty y colaboradores, (1990) Nature 348:552-554; McCafferty y colaboradores, PCT. WO 92/01047, patente norteamericana No. 5,969,108 y EP 589,877; Salfeld y colaboradores, PCT WO 97/29131, Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/126,603; y Winter y colaboradores^ PCT WO 92/20791 y EP 368,684. Las librerías recombinantes que expresan el repertorio de dominios VH y VL, se pueden expresar sobre la superficie de microorganismos, por ejemplo, levadura o bacteria (ver las publicaciones de PCT W099/36569 y 98/49286) . El método de anticuerpo de linfocito selectivo o SLAM como es referido en el estado de la técnica, es otro medio para generar anticuerpos de alta afinidad rápidamente. Distinto a los procedimientos de exhibición de fago todos los anticuerpos son completamente divalentes. Con el fin' de generar anticuerpos de primate del Nuevo Mundo, los primates del Nuevo Mundo se inmunizan con un antígeno humano, por ejemplo, un polipéptido de TNF-a. Después de la inmunización las células se remueven y selectivamente se proliferan en micro cavidades individuales. Los sobrenadantes se remueven de las cavidades y se prueban para tanto el enlace como la función. Las' secuencias de gen se pueden recuperar para manipulaciones subsecuentes, por ejemplo, humanización, fragmento Fab, scFv o generación de dAb. Asi otro ejemplo es la derivación del anticuerpo o especies de anticuerpo de la invención mediante SLAM y sus derivados (Babcock, J. S. y colaboradores, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 93; 7843-7848, patente norteamericana 5,627,052 y publicación de PCT WO92/02551) . Las adaptaciones de este SLAM, tal como el uso de alternativas para probar sobrenadantes tal como lavado en charola, también se encuentran dentro del alcance de esta invención. En un sistema de expresión la librería de péptido/proteina recombinante se exhibe sobre ribosomas (para ejemplos ver Roberts, RW y Szostak, J. W. 1997. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 94:12297-123202 y publicación de PCT No. O98/31700) . Asi otro ejemplo involucra la generación y transcripción ín vitro de una librería de DNA (por ejemplo de anticuerpos o derivados de preferencia preparados de células inmunizadas, pero no así limitados) , la traducción de la librería tal que la proteína y los mRNAs "inmunizados" se establecen sobre el ribosoma, selección de afinidad (por ejemplo al enlazar a RSP) , aislamiento de mRNA, traducción inversa y amplificación subsecuente (por ejemplo mediante en reacción en cadena de polimerasa o tecnología relacionada). Rondas adicionales de selección y amplificación se pueden acoplar como sea necesario a la maduración de afinidad a través de la introducción de mutación somática en este sistema o por otros métodos de maduración de afinidad como es conocido en el estado de la técnica . Otro ejemplo observa la aplicación de la tecnología de compartimentalización de emulsión a la generación de los anticuerpos de domino de la invención. En la compartimentalización de emulsión, los métodos de clasificación in vitro y ópticos se combinan con la co-compartimentalización de la proteína traducida y su secuencia de codificación de nucleótidos en fase acuosa dentro de una gotita de aceite en una emulsión (ver las publicaciones de PCT Nos. WO99026711 y WO0040712). Los elementos principales para la generación y selección de anticuerpos son esencialmente similares al método in vitro de exhibición de ribosoma. Las secuencias de CDR se pueden obtener de varias fuentes, por ejemplo, las bases de datos por ejemplo las bases de datos de proteína y de nucleótidos del Centro Nacional para Información de Biotecnología, La Base de Datos Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico .

Alternativamente, las regiones de CDR pueden ser predichas del repertorio de dominios de VH y VL (ver por ejemplo Kabat EA y Wu T . Attempts to' lócate complementarity determining residues in the variable positions of light y heavy chains. nn. NY Acad. Sci . 190:382-93 (1971)). La secuencia de CDR puede ser un DNA geonómico o un cDNA. Hay un número de maneras en la cual un CDR de reemplazo puede ser injertado en una secuencia de dominio variable y tales métodos serán familiares para aquellos expertos en la técnica. El método preferido de la presente invención involucra en reemplazo del CDR2 en el dominio de región variable por la vía de la mutagénesis dirigida por cebador. Este método consiste de recocer un oligonucleótido sintético que codifica mutaciones deseadas a una región objetivo donde sirve como un cebador para la iniciación de la síntesis de DNA in vitro, que extiende el oligonucleótido por una DNA polimerasa para generar un DNA de doble hebra que lleva las mutaciones deseadas, y ligar y clonar la secuencia en un vector de expresión apropiado. De preferencia, el anticuerpo de dominio de acuerdo con la invención tiene baja inmunogenicidad en humanos. Por referencia al término "baja inmunogenicidad" se propone que el anticuerpo de dominio no eleva una respuesta de anticuerpo en un humano de magnitud suficiente para reducir la efectividad de la administración continua del anticuerpo durante un tiempo suficiente para lograr la eficacia terapéutica. De preferencia, la secuencia de región variable en la cual la CDR es injertada es 'la "secuencia aceptora :dAb" (designado Compuesto 128) proporcionada en la Figura 1. La secuencia aceptora de dAb consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No: 5: 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAP LLIYSASELQSG, VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEI R (SEQ ID No: 6) . \ Esta secuencia es codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID No: 5: ! GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT CAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG ??? GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG CAA ATC AAA CGG En una modalidad preferida de la presente invención, una secuencia de CDR de titi YSASNLET (SEQ ID No: 4) se injerta en la secuencia aceptora de dAb para remplazar la secuencia de CDR2 (YSASELQS; SEQ ID No: 49) dé la secuencia aceptora del dAb para producir el siguiente dAb (designado Compuesto 145): Compuesto 145 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No: 7) Así, en una modalidad preferida, el dAb que enlaza a TNF-a humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 7. Esta dentro del alcance de la presente invención, que la secuencia de dAb puede ser además sujeta a maduración de afinidad con el fin de mejorar sus características de enlace de antígeno. Esto puede necesitar la modificación de ciertos residuos de aminoácidos dentro de CDR1 y CDR3. Por ejemplo, el dAb injertado con CDR de tití expuesto en la SEQ ID No: 7 fue madurado por afinidad como se expone en los Materiales y Métodos y probado para el enlace TNF. En una modalidad preferida adicional, el dAb que enlaza a TNF-OÍ humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 8 o SEQ ID No: 9. Estos se han designado Compuesto 123 y Compuesto 100 respectivamente y sus secuencias se muestran enseguida: Compuestos 123 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAI DSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET ' GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV RPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No: 8) Compuesto 100 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG: VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No: 9) En una modalidad particularmente preferida, el dAb que enlaza a TNF-a humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 10. Este se ha designado Compuesto 196 y la secuencia se proporciona enseguida: Compuesto 1 6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEI R (SEQ ID No: 10) El dAb de acuerdo con la invención puede además comprender una región constante de inmunoglobulina (región Fe) conectada al mismo. La secuencia de región constante puede ser derivada de secuencias de humano o de primate. La secuencia de primate puede ser un primate del Nuevo Mundo o una secuencia de primate del Viejo Mundo. Los primates del Viejo Mundo adecuados incluyen chimpancé, u otros simios homínidos por ejemplo gorila u orangután, que debido a su estrecha proximidad filogenética a los humanos, comparten un alto grado de homología con la secuencia de región constante humana . El dAb (con o sin la región constante conectada al mismo) se puede derivar o enlazar a otra molécula funcional.

Por ejemplo, el dAb puede ser funcionalmente enlazado mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera, a una o más de otras identidades moleculares, tal como otro anticuerpos, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo ¦ de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina ) . Los agentes detectables útiles con los cuales el dAb se puede derivar incluyen compuestos fluorescentes.' Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína , isotiocianato de fluoresceína , rodam'ina, cloruro de 5-dimetilamina-l-naftalensulfonilo, ficoeritrina y los similares. El dAb también se puede derivar con enzimas detectables tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y los similares. Cuando un dAb se deriva con la enzima detectable, este se detecta al adicionar reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción detectable. Un dAb también puede ser un derivado con biotina, y detectado a través dé la medición indirecta del enlace de avidina o estrepta idina.; La presente invención también se extiende a dAbs PEGilados (con o sin la región constante conectada a los mismos) que proporciona vida media incrementada y resistencia a la degradación sin una pérdida en la actividad (por ejemplo, afinidad de enlace) con relación a polipéptidos de anticuerpo no PEGilados. El dAb puede ser acoplado, utilizando métodos conocidos en la técnica, a moléculas de polímeros (de preferencia PEG) útiles para lograr la vida media incrementada y las propiedades de resistencia a la degradación. Las porciones de polímero que pueden ¦ ser utilizadas en la invención pueden ser sintéticas u ocurrir naturalmente e incluyen, pero no limitadas a polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena recta o ramificada, o un polisacárido ramificado o no ramificado tal como homo- o heteropolisacárido . Ejemplos preferidos de polímeros sintéticos que pueden ser utilizados en la invención incluyen poli (etilenglicol ) (PEG) de cadena recta o ramificada, poli (propilenglicol ) , o poli (alcohol vinílico) y derivados o formas sustituidas de los mismos. Los polímeros sustituidos particularmente preferidos para el enlace a dAbs incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi (polietilenglicol ) . Las porciones de polímero : que ocurre naturalmente que pueden ser utilizadas además de ó en lugar de PEG incluyen lactosa, amilosa, dextrano, o glicógeno, así como derivados de los mismos que serían reconocidos por personas expertas en la técnica. Las formas derivadas de moléculas de polímero incluyen, por ejemplo, derivados que tienen porciones adicionales o grupos reactivos presentes en los mismos para permitir la interacción con residuos de aminoácido de los polipéptidos de anticuerpo de dominio descritos en la presente. Tales derivados incluyen ásteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS) , polímeros de propionato de succinimidilo y agentes reactivos selectivos de sulfhidrilo tal como maleimida, vinil sulfona y tiol. Los polímeros de PEG útiles en la invención pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificadas en donde múltiples porciones de PEG están presentes en un solo polímero. El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS, SPA, VS, o Tiol) se pueden unir directamente al polímero PEG o se puede unir a PEG por las vía de una molécula enlazadora. El tamaño de los polímeros útiles en la invención puede esta en el intervalo de entre 500 Da a 60 kDa, por ejemplo, entre 1000 Da y 60 kDa, 10 kDa y 60 kDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, 40 kDa y 60 kDa, y hasta entre 50 kDa y 60 kDa. Los polímeros utilizados en la invención, particularmente PEG, puede ser polímeros de cadena recta o pueden poseer una conformación ramificada. Las moléculas de polímero (PEG) útiles en la invención pueden ser unidas a un anticuerpo de dominio utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. La primera etapa de la unión de PEG u otras porciones de polímero a un monómero o multímero de polipéptido de anticuerpo de la invención es la sustitución de los grupos de extremo de hidroxilo del polímero PEG mediante grupos funcionales que contienen electrófilos . Particularmente, los polímeros PEG se unen a ya sea los residuos de cisteína o lisina presentes en el anticuerpo de dominio. Los residuos de cisteína y lisina pueden estar ocurriendo naturalmente, o se pueden diseñar en la molécula de polipéptidos de anticuerpo. Por ejemplo, los residuos de cisterna se pueden diseñar recombinantemente en el C-terminal de un polipéptido dAb, o residuos en localizaciones accesibles a solvente específicas en un dAb u otro polipéptido de anticuerpo puede ser sustituido con cisteína o lisina . El dAb de acuerdo con la invención se puede enlazar a una o más moléculas que puede incrementar su vida media in vivo. Estas moléculas pueden ser enlazadas al dAb por la vía de un enlazador de modo que no interfieren/impiden estéricamente el sitio de enlace de antígeno. Alternativamente, pueden ser enlazados a la región constante. Típicamente, tales moléculas son polipéptidos que ocurren naturalmente in vivo y que resiste la degradación o remoción mediante mecanismos endógenos. Las moléculas que incrementan la vida media se pueden seleccionar de las siguientes: (a) proteínas . de la matriz extracelular , por ejemplo, colágeno, laminina, integrina y fibronectina ; (b) proteínas encontradas en la sangre, por ejemplo, macroglobulina a-2 de fibrina, albúmina de suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteina A, amiloide de suero, heptaglobina , proteina, ubicuitina, uteroglobulina, microglobulina ß-2, plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitripsina e inhibidor de kipcina pancreática; (c) proteina de suero inmune, por ejemplo IgE, IgG, IgM; (d) proteínas de transporte, por ejemplo proteína de enlace de retinol, microglobulina a-1; (e) defensinas, por ejemplo, beta-defensina 1, defensinas 1,2 y 3 de Neutrófilo; (f) proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejidos neurales, por ejemplo receptor de melanocortina , mielina, transportador de ascorbato; (g) ligando específico de receptor de transferrina-proteínas de fusión de agente neurofarmacéutico (ver US5977307); receptor de célula endotelial capilar de cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor de factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF 1), receptor de factor 2 de crecimiento similar a insulina (IGF 2), receptor de insulina; (h) proteínas localizadas al riñon, por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador aniónico orgánico Kl, antígeno de Heymann; : (i) proteínas localizadas al hígado, por ejemplo alcohol deshidrogenasa , G250; (j) factor de coagulación de sangre X; (k) OÍ-1 antitripsina; (1) HNF la; (m) proteínas localizadas al pulmón, por ejemplo componente secretorio (enlaza IgA) ; (n) proteínas localizadas al Hcart, por ejemplo HSP 27; (o) proteínas localizadas a la piel, por ejemplo queratina; (p) proteínas específicas del hueso, tal como proteínas morfogénicas de hueso (BMPs) por ejemplo, BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también referida como proteína osteogénica (OP-1) y -8 (OP-2) ; (q) proteínas específicas de tumor, por ejemplo, antígeno de trofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas por ejemplos catepsina B (encontrada en el hígado y el bazo) ; (r) proteínas específicas de enfermedad, por ejemplo antígenos expresados solamente sobre células T activadas: incluyendo LAG-3 (ges de activación de linfocito) ; ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309, 1999; OX40 (un miembro de la familia de receptores de TNF, expresada sobre células T activadas y la molécula de célula T coestimuladora solamente conocida que es específicamente regulada hacia arriba en células que producen virus de leucemia de célula T tipo 1 (HTLV-1) humana - ver J. Immunol. 2000 julio 1 ; 16561 ): 263-70 ; metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres), incluyendo CG6512 Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; factores de crecimiento angiogénicos , incluyendo factor de crecimiento de fibroblasto acidico (FGF-l), factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/ factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF) , factor-a de crecimiento de transformación (TGF-a) , factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-a) , angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placental (P1GF), factor de crecimiento derivado de plaquetas de midquina-BB (PDGF), fractalquina ; (s) proteínas de estrés (proteínas de choque térmico) ; (t) proteínas involucradas en el trasporte de Fe; y (u) anticuerpos, fragmentos o derivados dirigidos contra proteínas endógenas, por ejemplo, albúmina de suero. En una modalidad adicional de la presente invención, el dAb de acuerdo con el primer aspecto puede ser multimerizado, como por ejemplo, hetero- u homodimeros, hetero- u homotrimeros , hetero- u homotetrameros , o hetero- u homomultímeros de orden más alto. La multimerisación puede incrementar la resistencia de enlace de antígeno, en donde la resistencia de enlace está relacionada con la suma de las afinidades de enlace de los múltiples sitios de enlace. Así, la invención proporciona un anticuerpo de dominio de acuerdo con el primer aspecto, en donde: el anticuerpo de dominio está enlazado a por lo menos, un anticuerpo de dominio adicional. Cada dAb puede enlazar al mismo o diferentes antigenos. Los multimeros de dAb pueden además comprender: uno o más de dAbs que están enlazados y en donde cada dAb en.laza a un diferente antigeno, ligandos multi-especificos que incluyen los llamados "ligandos específicos dobles". Por ejemplo, los ligandos específicos dobles pueden comprender un par de dominios VH o un par de dominios VL. Tales ligandos específicos dobles son descritos en O 2004/003019 (PCT/GB2003/002804) a nombre de Domantis Ltd. En un segundo aspecto, la invención proporciona! una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del dAb de acuerdo con el primer aspecto de la invención, junto. con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. : Un "portador farmacéuticamente aceptable" .incluye cualquier y todos, los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales , agente isotónico y que retardan la absorción, y los similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y los similares así como combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , conservadores o soluciones reguladoras. La composición puede estar en una variedad1 de formas, incluyendo formas de dosificación liquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. De preferencia, la composición está en la forma de una solución inyectable para inmunización. La administración puede ser intravenosa, subcutáneos, intraperitoneal , intramuscular, transdérmica , intratecal, e intra-arterial . Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura de almacenamiento. Las composiciones pueden ser formuladas como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo (es decir, dAb) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingrediente listados en lo anterior, seguido por la esterilización filtrada. La composición también se puede formular como un polvo estéril para la preparación de soluciones inyectables estériles. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener mediante, por ejemplo, el uso de un recubrimiento tal como lecitina y/o surfactantes . En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y. sistemas de suministro microencapsulado . Los polímeros compatibles se pueden utilizar ales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. La composición también se puede formular para- la administración oral. En esta modalidad, el dAb puede ' ser encerrado en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimido en tabletas o incorporado directamente en la dieta del sujeto. La composición también se puede formular para la administración rectal. Los compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en la composición. El anticuerpo de dominio puede ser co-formulado con y/o co-administrado uno o más agentes terapéuticos adicionales por ejemplo compuestos antiinflamatorios, receptor de TNF- soluble o un agente químico que inhibe la producción de TNF-a humano, o anticuerpos que enlazan otros objetivos tales como citoquinas o moléculas de superficie celular. Alternativamente, este puede ser co-administ ado con un reactivo inmunoquímico soluble tal como la proteína A, C, G, o L. Una cantidad efectiva puede incluir una cantidad terapéuticamente efectiva o cantidad profilácticamente efectiva del dAb de la invención. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere una cantidad efectiva en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad profilácticamente efectiva se refiere una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. En una modalidad preferida, la composición, se administra a mamíferos, de preferencia humanos o primates. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un dAb de acuerdo con el primer aspecto de la invención en una aplicación de diagnóstico para detectar TNF-a humano. Por ejemplo, el dAb de TNF-a anti-humano de acuerdo con la invención se puede utilizar para detectar TNF-a humano por ejemplo en una muestra biológica, tal como suero o plasma usando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo i.nmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquimica de tejido. El dAb de TN F-a anti-humano de acuerdo con la invención se puede analizar en fluido biológicos mediante un inmunoensayo de competición utilizando estándares de TNF- humano recombinantes marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo TN F-a anti-humano no marcado. El dAb de TNF-a anti-humano de acuerdo con la invención también se puede utilizar para detectar TN F-a de especies diferentes de humanos, por ejemplo, chimpancé, titi, rhesus, ratón, cerdo. El dAb de TNF-a anti-humano de acuerdo con la invención también se puede utilizar en aplicaciones de cultivo de células donde se desea inhibir la actividad de TN F- OÍ . En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para tratar un desorden caracterizado por actividad de TNF-a humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de acuerdo con: el segundo aspecto de la invención. Un desorden caracterizado por la actividad de TN F-a humano se propone para incluir enfermedades y otros desórdenes en los cuales la presencia de TNF-a en un sujeto que sufre del desorden se ha mostrado que es o se sospecha de ser ya sea responsable para la patofisiologia del desorden o un factor que contribuye a un empeoramiento del desorden. De preferencia, el desorden caracterizado por la activada de TNF-a humano se selecciona del grupo que consiste de inflamación, enfermedades inflamatorias, sepsis, incluyendo choque séptico, choque endotóxico, sepsis gram negativa y síndrome de choque tóxico; enfermedad autoinmune, incluyendo artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico; enfermedad infecciosa, incluyendo fiebre y mialgias debido a la infección y caquexia secundaria a la infección; enfermedad de injerto contra hospedero; crecimiento de tumor o metástasis; desórdenes pulmonares incluyendo el síndrome de estrés respiratorio de adulto, pulmón de choque, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis pulmonar y silicosis; desórdenes de intestino inflamatorio incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa; desórdenes cardiacos; desórdenes de hueso inflamatorio, hepatitis, alteraciones de coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, formación queloide y formación de tejido de cicatri zación . Por toda esta especificación la palabra "comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende" será entendido que implica la inclusión de un elemento, JJ número entero o etapa establecida, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia. Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o los similares que ' se han incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se va a tomar como una admisión de que cualquiera o todas de estas materias forman parte de la base de la técnica previa o fueron el conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención como existió en Australia o en otra parte antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. Con el fin de que la naturaleza de la presente invención pueda ser más claramente entendida, formas preferidas de la misma ahora serán descritas con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Materiales y Métodos EJEMPLO 1 Aislamiento de genes VL de primate del Nuevo Mundo El DNA genómico de tití (género Callithrix, especie desconocida) y el mono trasnochador (Aotus trivirgatus) se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos de Células (ECACC), números de catálogo 85011419 y 90110510 respectivamente. El DNA de titi se derivó de la linea de células B95-8 mientras que el DNA del mono trasnochador provino de la linea de células OMK 637-69. Los cebadores degenerados basados en la secuencia guia VK humanas y las secuencias de señal de recombinación (RSS) se derivaron de Walter y Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Los cebadores utilizados para la amplificación del DNA de VK de linea germinal fueron como sigue: ' Cebador VK1BL AATCKCAGGTKCCAGATG ( SEQ ID No: 11) Cebador VKlBL35a GTTYRGGTKKGTAACACT (SEQ ID No: 12) Cebador VKlBL35b ATGMCTTGTWACACTGTG (SEQ ID NO: 13) El PCR genómico (30 ciclos) se realizó utilizando Taq polimerasa con cualquiera de los pares de cebadores VKIBLx VKlBL35a o VKIBLx VKlBL35b. Hubo sobreposición entre las secuencias clonadas y los dos conjuntos de cebadores utilizados. Los productos de PCR se clonaron en el equipo de clonación TOPO TA de Invitrogen (Cat No K4500-01) y se secuenciaron con los cebadores, delantero M13 y trasero pUC.

La secuencia se confirmó en las direcciones delantera y trasera. Con el fin de confirmar adicionalmente las secuencias claves no se sometieron a errores de PCR, el proceso de PCR y de clonación se repitió dos veces para secuencias de titi. Las secuencias de nucleótidos (SEQ ID Nos: 14-24 y SEQ ID Nos: 36-41) y de aminoácidos (SEQ ID Nos: 25-35 y SEQ ID Nos: 42-47) se dan en la Figura 2. Las secuencias de titi 1, 2 y 3 se confirmaron. Las secuencias 4, 5, 6, 7 y 8 se observaron solamente en el PCR inicial. ' Las secuencias 9, 10 y 11 se observaron solamente en la PCR de repetición (es decir segunda) y la clonación. Oligo Síntesis y Clonación en la Secuencia Aceptora Cuatro secuencias CDR, específicamente YAATKLQS (SEQ ID No: 1) de la secuencia 1 de mono trasnochador (SEQ ID No: 42), YEASSLQS (SEQ ID No: 2) de la secuencia 2 del mono trasnochador (SEQ ID No: 43) YEASKLQS (SEQ ID No: 3) de la secuencia 1 de titi (SEQ ID No: 25), YSASNLET (SEQ ID NO: 4) y secuencia 2 de Titi (SEQ ID No: 25), se seleccionaron de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 2 como es indicado. La secuencia 5 del mono trasnochador YYASSLQS (SEQ ID No: 48) se encontró que es idéntica a GI6176295 una secuencia de cDNA de Aotus nancymaae (mono nocturno de Ma) todas las otras secuencia fueron únicas. Una secuencia de región variable aceptora (anticuerpo de dominio anti-TNF) en el vector de expresión (vector patentado de Domantis) se digirió (25yg) secuencialmente con Kpnl y SanDI que extirpa la mayoría de FR2 así como CDR2 como es indicado en el mapa de digestión de restricción. El vector se purificó en gel para remover la secuencia FR2 y CDR2 de tipo silvestre extirpada. El oligo recocido se realizó al incubar oligo pares (500 pmol de cada uno como se muestra en la Figura 4A y 4B) a 95°C durante 5 minutos seguido por 65°C durante 5 minutos y luego se dejó alcanzar a temperatura ambiente lentamente sobre un bloque térmico. Las sobreposiciones se rellenaron durante una reacción de Klenow en la presencia de dNTPs. Maduración por Afinidad El dAb injertado con CDR de tití Compuesto 145 (SEQ ID No: 7) se maduró por afinidad al construir 14 librerías separadas, cada una de una diversificación de la secuencia de la SEQ ID No: 7 en un solo residuo de aminoácido. Los residuos seleccionados se muestran sombreados enseguida.

La selección se basó sobre los residuos en CDR1 y CDR3 que se conocen que son diversificados en el repertorio Ig humano maduro, y los residuos de estructura que se han observado que producen proteínas funcionales después de la mutagénesis en dAbs relacionados. Para cada uno de los residuos seleccionados, los pares de cebadores de , PCR delantero y trasero complementarios se diseñaron con degeneración de NKK, y dos reacciones de PCR iniciales se realizaron cada una con un solo cebador mutagénico y el cebador flanqueante. Después de la limpieza, los dos productos de PCR se recocieron y luego se amplificaron utilizando cebadores flanqueantes solamente (empalme por la extensión sobre puesta de PCR; Lowman II. L. & Clackson T. (eds), Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK) . Los clones se clasificaron inicialmente por ELISA utilizando TNF en fase sólida, y los clones positivos se secuenciaron . La proteina dAb se purificó de los mejores clones y se evaluó para la potencia en los ensayos de enlace de receptor y los ensayos de citotoxicidad L929.. Los compuestos 100 (SEQ ID No: 9) y 123 (SEQ ID No: 8) se encontraron que tienen neutralización de TNF mejorada . con relación al dAb de origen, Compuesto 145 (SEQ ED No: 7). La combinación de las sustituciones aumentadas por afinidad de los Compuestos 100 (SEQ ID No: 9) y 123 (SEQ ID No: 8), produjo un dAb anti-TNF con potencia mejorada adicional en el ensayo de citotoxicidad L929 (Compuesto 196; SEQ ID No: 10) . Resultados Potencia de los clones de dAb anti-TNF en el ensayo de enlace de receptor (RBA) y el ensayo de citotoxicidad La habilidad de los dAbs anti-TNF para inhibir el enlace de TNF a su receptor y para neutralizar la citotoxicidad mediada por TNF de las células L929 se condujo como sigue: Ensayo de enlace de receptor Los dAbs diversificado en las 14 posiciones seleccionadas se probaron para la habilidad para inhibir el enlace de TNF al receptor 1 de TNF recombinante (p55) . Brevemente, placas Maxisorp se incubaron durante la noche con 30 mg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón Fe anti-humano (Zymed, San Francisco, USA) . Las cavidades se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) que contiene Twcen-20 al 0.05% y luego se bloquearon con BSA al 1% en PBS antes de ser incubada con 100 ng/ml de la proteína de fusión Fe del receptor 1 de TNF (R&D Systems, Minneapolis, USA) . Cada dAb se mezcló con TNF que se adicionó a las cavidades lavadas a una concentración final de 10 ng/ml. El enlace de TNF se detectó con 0.2 mg/ml de anticuerpo anti-TNF biotinilado (HyCull biotechnology, Uben, Netherlands) seguido por 1 en dilución de 500 de estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, UK) y luego la incubación con sustrato de TMB (KPL, Gaithersburg , USA) . La reacción se detuvo mediante la adición de HC1 y la absorbencia se leyó a 450nm. La actividad de dAb anti-TNF condujo a una disminución en el enlace de TNF y por lo tanto una disminución en la absorbencia comparada con el TNF solamente de control (Figura 5) .

Ensayo de Citotoxicidad de L929 Los dAbs anti-TNF identificados por el procedimiento de diversificación de mini librería, que incluye los Compuestos 100 ( SEQ ID No: 9) y 123 (SEQ ID No: 8), también se probaron para la habilidad para neutralizar la actividad citotóxica de TNF sobre fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). Brevemente, las células L929 colocadas en placas ; de microtítulo se incubaron durante la noche con dAb anti-TNF, 100 pg/ml de TNF y 1 mg/ml de actinomicina D (Sigma, Poole, UK) . La viabilidad celular se midió al leer la absorbencia a 490nm después de una incubación con [ 3- ( 4 , 5-dimetiltia zol-2-il) -5- ( 3-carboximetoxifenil ) -2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, Madison, USA) . La actividad de dAb Anti-TNF condujo a una disminución en la citotoxicidad de TNF y por lo tanto un' incremento en la absorbencia comparada con el TNF solo de control. Los resultados, en comparación con el dAb de origen el Compuesto 145 ( SEQ ID No: 7) se presentan en la. Figura 6. Será apreciado por personas expertas en la técnica que numerosas variaciones y/o modificaciones se pueden hacer a la invención como se muestra en las modalidades específicas sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como es descrito ampliamente. Las presentes modalidades, por. lo tanto, se van a considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo de dominio recombinante (dAb) que enlaza a TNF-a humano, el dAb caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina , en donde el dominio variable comprende por lo menos una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene una secuencia derivada de un primate del Nuevo Mundo en donde la CDR se selecciona del grupo que consiste de YAATKLQS. (SEQ ID No: 1), YEASSLQS (SEQ ID No: 2), YEASKLQS (SEQ ID No: 3) y YSASNLET (SEQ ID No: 4). 2. Un dAb recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la CDR es CDR2. 3. Un dAb recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el dAb tiene una secuencia seleccionada de las secuencias que consisten de: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 7) ; DIQMTQSPSSLSASVGDRV ITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVV RPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 8); DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVV RPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 9);
2. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 10) ; DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 50) ; DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI DSYLH YQQKPGKAPKLLIYSAS
3. NLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTK VEIKR (SEQ ID No: 51) ; y DIQ TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 52) .
4. 4. Un dAb recombinante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dAb tiene la secuencia: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV EIKR (SEQ ID No: 10) .
5. 5. Un dAb recombinante de conformidad ' con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque CDR1 y/o CDR3 se modifica para mejorar el enlace de antigeno .
6. 6. Un dAb recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el dAb tiene baja inmunogenicidad en humanos.
7. 7. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica el dAb de cualquiera de' las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva, de un anticuerpo de dominio recombinante (dAb) de conformidad con la reivindicación 1 a 6, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
9. 9. Un método para detectar TNF-a humano en 1 una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con una cantidad efectiva de un dAb recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y detectar la cantidad de dAb enlazado.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica.
11. 11. Un método para tratar un desorden representado por actividad de TNF-a humano en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8.
12. 12. Un método de conformidad con la reivindicación .11, caracterizado porque el desorden representado por actividad de TNF-OÍ humano se selecciona del grupo que consiste de inflamación, enfermedades inflamatorias, sepsis, incluyendo choque séptico, choque endotóxico, sepsis gram negativa y síndrome de choque tóxico; enfermedad autoinmune, incluyendo artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico; enfermedad infecciosa, incluyendo fiebre y mialgias debido a la infección y caquexia secundaria a la infección; enfermedad de injerto contra hospedero; crecimiento de tumor o metástasis; desórdenes pulmonares incluyendo síndrome de estrés respiratorio de adulto, pulmón de choque, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis pulmonar y silicosis; desórdenes de intestino inflamatorio incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa; desórdenes cardiacos; desórdenes de hueso inflamatorio, hepatitis, alteraciones de coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, formación de queloide y formación de tejido de cicatrización.