MX2008002162A - Anticuerpos diseñados con regiones de estructura de primate del nuevo mundo - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que tiene una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura. Las tres regiones de estructura son, o son derivadas de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo, y por lo menos una de las CDRs es una CDR de primate no del Nuevo Mundo.

Description

ANTICUERPOS DISEÑADOS CON REGIONES DE ESTRUCTURA DE PRIMATE DEL NUEVO MUNDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que tiene una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura. Las regiones de estructura son, o se derivan de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo, y por lo menos una de las CDRs es ya sea una CDR de primate del Nuevo Mundo modificada o una CDR de primate no del Nuevo Mundo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos (inmunoglobulinas) desempeñan una función importante en el sistema inmune de un mamífero. Ellos se producen mediante células de plasma que se han desarrollado de células B precursoras. Los anticuerpos consisten de dos cadenas de polipéptido ligeras idénticas y dos cadenas de polipéptido pesadas idénticas que son unidas por puentes de disulfuro. Las cadenas ligeras son referidas ya sea como cadenas ligeras kappa o lambda y las cadenas pesadas como gamma, mu, delta, alfa o épsilon. Cada cadena consiste de una región constante y variable. La región variable da al anticuerpo su especificidad. Dentro de cada región variable están regiones de regiones de determinación de hipervariabilidad o complementariedad (CDRs) que son flanqueadas por regiones más conservadas referidas como regiones de estructura. Dentro de cada región variable están tres CDRs y cuatro regiones de estructura. Los anticuerpos son moléculas bifuncionales, los segmentos variables N-terminales de las cadenas pesadas y ligeras asociadas conjuntamente de una manera específica para generar una estructura tridimensional con afinidad para un epítope particular sobre la superficie de un antígeno. Los segmentos de región constante son responsables para la vida media del suero prolongada y las funciones efectoras del anticuerpo y se relacionan al enlace e complemento, estimulación de fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y activación de la liberación de granulos de granulocito. El desarrollo de la tecnología de hibridoma ha facilitado la producción de anticuerpos monoclonales de una especificidad particular. Típicamente, tales hibridomas son hibridomas de murino. Los anticuerpos quiméricos huma?os/de ratón se han creado en los cuales las secuencias de región variable de anticuerpo de genoma de ratón se combinan con secuencias de región constante de anticuerpo del genoma humano. Los anticuerpos quiméricos exhiben las características de enlace del anticuerpo de ratón parental, y las funciones efectoras asociadas con la región constante humana. Los anticuerpos se producen mediante la expresión de una célula hospedera, incluyendo por ejemplo Ovario de Hámster Chino (CHO) , células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Tales anticuerpos quiméricos se han utilizado en la terapia humana, sin embargo los anticuerpos a estos anticuerpos quiméricos se han producido por el recibidor humano. Tales anticuerpos antiquiméricos son perjudiciales para la terapia continua con anticuerpos quiméricos. Se ha sugerido que los anticuerpos monoclonales humanos se esperan que sean una mejora sobre los anticuerpos monoclonales de ratón para la terapia humana in vivo. A partir del trabajo hecho con anticuerpos de primates del Viejo Mundo (monos Rhesus y chimpancés) se ha postulado que estos anticuerpos de primate no humano serán tolerados en humanos debido a que son estructuralmente similares a los anticuerpos humanos (Ehrlich PH y colaboradores, Clin Chetn., 1988, 34:9 1681-1688) . Además, debido a que los anticuerpos humanos son no inmunogénicos en monos Rhesus (Ehrich PH y colaboradores, Hybridoma, 1987, 6:151-60), es probable que lo inverso también es aplicable y los anticuerpos de primate serán no inmunogénicos en humanos. Los anticuerpos monoclonales son secretados por hibridomas al fusionar linfocitos a un heteromieloma de ratón X humano. El documento EP 0 605 442 divulga anticuerpos quiméricos que enlazan antígenos humanos. Estos anticuerpos comprenden la región variable completa de un mono del Viejo Mundo y la región constante de un anticuerpo humano o de chimpancé. Una de las ventajas sugeridas en esta referencia para estas construcciones es la habilidad para crear anticuerpos en ratones del Viejo Mundo a antígenos humanos que son menos inmunogénicos en humanos comparados con anticuerpos creados en un hospedero de ratón. Los primates del Nuevo Mundo (infraorden-Platyrrhini) comprende por lo menos 53 especies comúnmente divididas en dos familias, la Calli thricidae y Cebidae . La Callithricidae consiste de titís y tamarindos. La Cebidae incluye el mono ardilla, el mono tití, el mono araña, el mono lanudo, capuchino, uakaris, sakis, mono nocturno o trasnochador y el mono aullador. Los primates evolucionariamente distintos, tales como los primates del Nuevo Mundo, no son solo suficientemente diferentes de los humanos para permitir a los anticuerpos contra antígenos humanos que se han generado, pero son suficientemente similares a los humanos para tener anticuerpos similares a los anticuerpos humanos primero que el hospedero no genera una respuesta inmune anti-anticuerpo cuando tales anticuerpos derivados de primate son introducidos en un humano. Estudios previos han caracterizado el repertorio de cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas de Calli thrix jacchus (von Budingen H-C y colaboradores, Inmunogenetics, 2001, 53:557-563). Seis subgrupos de IGHV se identificaron los cuales mostraron un alto grado de similitud de secuencia a sus contrapartes IGHV humano. Las regiones de estructura fueron más conservadas cuando se compararon con las regiones de determinación de complementariedad (CDRs). El grado de similitud entre C. ja cchus y las secuencias IGHV humanas fue menos que entre los primates del Viejo Mundo no humanos y humanos. Anticuerpos de dominio Los anticuerpos de dominio (dAb) son unidades de enlace funcionales que se pueden crear utilizando estructuras de anticuerpo y corresponden a las regiones variables de ya sea las cadenas pesadas (VH) o ligeras (VL) de los anticuerpos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menos de un décimo del tamaño de un anticuerpo completo. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina son referidas ya sea como cadenas ligeras kappa o lambda y las cadenas pesadas como gamma, mu, delta, alfa o épsilon. La región variable da al anticuerpo esta especificidad. Dentro de cada región variable están regiones de hipervariabilidad de otra manera conocidas como regiones de determinación de complementariedad (CDRs) que están flanqueadas por regiones conservadas referidas como regiones de estructura. Dentro de cada región variable de cadena ligera y pesada están tres CDRs y cuatro regiones de estructura. En contraste a los anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio son bien expresados en sistemas bacterianos, de levadura y de mamífero. Su tamaño pequeño permite cantidades molares más altas por gramo de producto, proporcionando de esta manera un incremento significante de la potencia: Además, los anticuerpos de dominio se pueden utilizar en un bloque de construcción para crear productos terapéuticos tales como múltiples dAbs de dirección en los cuales una construcción que contiene dos o más dominios variables enlazan a dos o más objetivos terapéuticos, o dAbs dirigidos para administración pulmonar u oral. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han encontrado que los primates del Nuevo Mundo proporcionan una fuente de secuencias de anticuerpo que se predicen que tienen baja inmunogenicidad en humanos. Los primates del Nuevo Mundo se seleccionaron como un depositario de secuencias de inmunoglobulina que existieron en el punto de ramificación de los primates del Nuevo Mundo y del Viejo Mundo. La idea clave fue que este depositario podría de esta manera producir secuencias de inmunoglobulina primordiales para las divergencias posteriores en secuencias de inmunoglobulina como es encontrada en los primates del Viejo Mundo. Tales secuencias primordiales habrían co-existido con el repertorio de células T, ya que subsecuentemente evolucionaron sobre la ruta al hombre, durante los 35 millones de años aproximadamente (MYA) estimados que son el punto de ramificación de los primates del Viejo y del Nuevo Mundo (Schneider H y colaboradores, Mol Phylogenet Evol. 1993 Sep; 2 (3) : 225-42 ) . Esto representa un periodo prolongado de selección para la tolerancia inmunológica y así tales secuencias primordiales se predijeron, por los inventores, que están libres de ciertos epítopes de células T ayudantes que habían evolucionado más recientemente . Por consiguiente en un primer aspecto la presente invención proporciona un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que tiene una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura, en donde las regiones de estructura son, o son derivadas de regiones de estructura de primates del Nuevo Mundo, y en donde por lo menos una de las CDRs es una CDR de primate no de Nuevo Mundo. En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, junto con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptable. En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de la presente invención en una aplicación de diagnóstico para detectar un antígeno de una enfermedad o desorden particular. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o desorden caracterizado por actividad TNF-a humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo como es descrito en la presente (o una composición farmacéutica del mismo) en la cual el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza a TNF-a. En un aspecto adicional de la invención se proporciona el uso de los anticuerpos y porciones que enlazan antígenos de los mismos, y composiciones farmacéuticas de los mismos como es descrito en la presente en la manufactura del medicamento. Particularmente, la manufactura de un medicamento para el uso en el tratamiento o diagnóstico de enfermedades o desórdenes como es descrito en la presente. En un aspecto adicional la presente invención proporciona un anticuerpo de primate del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo que enlaza un antígeno de superficie celular o una citoquina en donde el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo comprende una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura, en donde las CDRs se seleccionan tal que el anticuerpo o porción que enlaza antígeno enlaza al antígeno de superficie celular o a la citoquina. A menos que se mencione o claramente se indique de otra manera en el contexto, se propone que los anticuerpos y porciones que enlazan antígeno de los mismos como es descrito en la presente se pueden utilizar sin limitación en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente e incorporar en los equipos descritos en la presente, Y, además los anticuerpos y porciones que enlazan antígeno de los mismos, así como las composiciones farmacéuticas y equipos, como es descrito en la presente se pueden utilizar en los métodos de tratamiento y diagnosis divulgados en la presente, a menos que se mencione o claramente se indique de otra manera por el contexto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 demuestra el enlace de AB138 a MOG de rata presente en el lisado de médula espinal de rata (franja 2) y no al lisado de CHOK1SV (franja 3) . La franja 1 contiene marcadores de peso molecular. La Figura 2 demuestra la carencia de enlace no específico de un anticuerpo monoclonal anti-TNFa a la misma muestra de MOG de rata presente en el lisado de médula espinal de rata (franja 2), y el lisado de CHOK1SV (franja 3). La franja 1 contiene marcadores de peso molecular. La Figura 3 es una alineación de las secuencias de aminoácido VH donadoras y aceptoras. La Figura 4 es una alineación de las secuencias de aminoácido VL donadoras y aceptoras. La Figura 5: Enlace de anticuerpos AB164, AB103 y AB197 a TNF-a mediante ELISA. La Figura 6: Neutralización mediante AB164, AB197, AB103 de la citotoxicidad de célula L-929 inducida por TNF-a. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto la presente invención proporciona un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que tiene región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y 'por lo menos tres regiones de estructura, en donde las regiones de estructura son, o son derivadas de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo y en donde por lo menos una de las CDRs es una CDR de primate no del Nuevo Mundo. En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, junto con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de la presente invención en aplicación de diagnóstico para detectar un antígeno asociado con una enfermedad o desorden particular. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o desorden caracterizado por actividades de TNF-a humano o de un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo como es descrito en la presente (o una composición farmacéutica del mismo) en la cual un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza a TNF-a. En ciertas modalidades de la invención, la región variable comprende tres CDRs y cuatro regiones de estructura.

También se prefiere que el anticuerpo tenga baja inmunogenicidad predicha en humanos. La región variable del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo puede comprender una combinación de CDRs de diferentes fuentes. En ciertas modalidades, la región variable comprende CDRs seleccionado del grupo que consiste de por lo menos una secuencia de CDR de murino (de preferencia ya sea de ratón o rata) , por lo menos una secuencia de CDR humana, por lo menos una secuencia de CDR sintética, por lo menos una secuencia de CDR de conejo, por lo menos una secuencia de CDR de primate del Nuevo Mundo modificada y combinaciones de dos o más de los anteriores, por lo menos una CDR humano y por lo menos una CDR de murino, por lo menos una CDR de humano y por lo menos una CDR sintético, por lo menos una CDR de humano y por lo menos una CDR de conejo, por lo menos una CDR de humano, por lo menos una CDR de primate del Nuevo Mundo, por lo menos una CDR de murino, por lo menos una CDR sintético, por lo menos una CDR de murino y por lo menos una CDR de conejo, por lo menos una CDR de murino y por lo menos una CDR de primate del Nuevo Mundo, por lo menos una CDR sintética y por lo menos una CDR de conejo, por lo menos una CDR sintética y por lo menos una CDR de primate del Nuevo Mundo y por lo menos una CDR de conejo y por lo menos una CDR de primate del Nuevo Mundo. En una forma preferida la región variable comprende 3 secuencias de CDR de murino, en particular 3 secuencias de CDR de ratón. En una modalidad alternativa, la región variable comprende 3 secuencias de CDR humano. En una modalidad preferida adicional la región variable comprende 4 regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo o 4 regiones de estructura en la cual las regiones se derivan de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo . En algunas modalidades, la porción que enlaza antígeno es un anticuerpo de dominio. En modalidades particulares, el anticuerpo o porción que enlaza antígeno además comprende una secuencia de región constante de primate del Viejo Mundo no de primate humana o una combinación de las mismas . Ejemplos de primates del Viejo Mundo no de humano incluyen, pero no están limitados a, chimpancés, babuinos, orangutanes, macacos y gorilas. En una modalidad adicional de la presente invención, el dAb puede ser multimerizado, como por' ejemplo, hetero- u ho odímeros (por ejemplo, VH/VH, VL/VL o VH/VL) , hetero- u homotrímeros (por ejemplo, VH/VH/VH, VL/VL/VL, VH/VH/VL o VH/VL/VL) , hetero- u homotetrámeros (por ejemplo, VH/VH/VH/VH, VL/VL/VL/VL, VH/VH/VH/VL, VH/VL/VL O VH/VL/VL/VL) , o hetero- u homomultímeros de orden más alto. La multimerización puede incrementar la resistencia del enlace de antígenos, en donde la resistencia de enlace se relaciona a la suma de las afinidades de enlace de los múltiples sitios de enlace. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo donde el dominio del anticuerpo es enlazado a por lo menos un anticuerpo de dominio adicional. Cada dAb puede enlazar al mismo o diferentes antígenos. Los multímeros dAb puede además comprender uno más dAbs que son enlazados en donde cada dAb enlaza un antígeno diferente, ligandos multi específicos que incluyen los llamados "ligandos específicos dobles". Por ejemplo, los ligandos específicos dobles pueden comprender _ un par de dominio de VH o par de dominios de VL. Tales ligandos específicos dobles son descritos en WO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804) en el nombre de Domantis Ltd, incorporado por referencia en la presente en su totalidad. La secuencia de región de estructura de un primate del Nuevo Mundo es de preferencia de un primate del Nuevo Mundo seleccionado del grupo que consiste de titís, tamarinos, monos ardilla, mono tití, mono araña, mono lanudo, capuchino, uakaris, sakis, mono nocturno o trasnochador y el mono aullador, mucho más de preferencia tití. De preferencia, el antígeno al cual el anticuerpo quimérico o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza, es péptido, proteína, carbohidrato, glicoproteína, lípido o glucolípido en naturaleza, seleccionado de un antígeno asociado a un tumor que incluye antígeno carcinoembriónico, EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL y receptores VEGF, un antígeno involucrado en una enfermedad o desorden inmune o inflamatorio que incluye CD3, CD4 , CD25, CD40, CD49d, MHC clase I, MMC clase II, GM-CSF, interferona-?, IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-a, e IgE, uno antígeno expresado sobre una célula hospedera que incluye glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos y receptores de adhesión que incluyen CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD56, CD58, CD62 o CD144, un antígeno que comprende una citoquina, quimioquina, factor de crecimiento u otro modulador fisiológico soluble o un receptor del mismo que incluye eotaxina, IL-6, IL-8, TGF-ß, C3a, C5a, VEGF, NGF y sus receptores, un antígeno involucrado en las enfermedades o desórdenes del sistema nervioso central incluyendo ß-amieloide y priones, un antígeno de origen no humano tal como antígeno o toxinas microbiales, nanobiales o virales incluyen proteína F de virus sincitial respiratoria, toxina de ántrax, veneno de serpiente y digoxina; en donde el anticuerpo quimérico actúa como un agonista o antagonista o su activo ya sea para agotarse, exterminar o eliminar células indeseadas (por ejemplo, anti-CD4) al actuar con células de complemento exterminadora (por ejemplo, células NK) o es activo como un agente citotóxico para causar el enlace de receptor Fc mediante una actividad biológica de fagocito o neutralizante de su objetivo. También se prefiere que la secuencia de por lo menos una región de estructura sea modificada para incrementar el enlace o potencia o para disminuir la inmunogenicidad en un ser humano. Un incremento en el enlace o potencia o una disminución en la inmunogenicidad predicha en humanos del anticuerpo o porción que enlaza antígeno de la invención es relativo a un anticuerpo o porción que enlaza antígeno en la cual la región de estructura no es modificada. En otras modalidades la secuencia de una o más de las CDRs son modificados para incrementar el enlace o potencia o para disminuir la inmunogenicidad predicha en humanos. Un incremento en el enlace o potencia o una disminución en la inmunogenicidad predicha en humanos de un anticuerpo o porción de enlace de antígeno de la invención es relativo a un anticuerpo o porción que enlaza antígeno en la cual la región de estructura no es modificada. Un incremento en el enlace se demuestra por una disminución en KD (Koff/Kon) para el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo. Un incremento en la potencia de una muestra de ensayos biológicos. Por ejemplo, los ensayos que pueden ser utilizados para medir la potencia del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo incluyen el ensayo de neutralización de citotoxicidad de L929 inducida por TNF-a, ensayo de proliferación de célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) activada por PHA inducida por IL-12 y diferenciación de osteoclasto mediado por RANKL de esplenocitos de ratón (Stern, Proc. Nati. Acad. Sci USA 87:6808 - 6812 (1990); Kong, Y-Y. y colaboradores, Nature 397:315 - 323 (1990); Matthews, N. y M. L. Neale in Lymphokines y Interferons , a Practical Approach, 1987, MJ. Clemens, A.C, Morris y AJ. H, Gearing, cds . , IRL Press, p. 221) El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, se propone para referirse e moléculas de inmunoglobulina comprendida de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlace de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (HCVR o YH) y la región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CHI, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden además ser subdivididas en regiones de hipervariabilidad, llamada regiones de determinación de complementariedad (CDR) , interdispersadas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arreglado de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR . El término "porción que enlaza antígeno" de un anticuerpo, como se utiliza en la presente se refiere a uno o más componentes o derivados de una inmunoglobulina que exhibe la habilidad para enlazar un antígeno. Se ha mostrado que la porción que enlaza antígeno de un anticuerpo puede ser realizada de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace comprendidos dentro del término "porción que enlaza antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, 1989, Nature 341:544-540) que consiste de un solo dominio de VH, un dominio VL (van den BeukenT y colaboradores, 2001, J. Mol. Biol, 310, 591) ; y (vi) una región de determinación de complementariedad aislado (CDR) . Además, aunque los dos dominios de del fragmento Fv, VL y Vn, están codificados por genes separados, ellos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite que sean hechos por una sola cadena de proteína en la cual el par de regiones VL y YH forman regiones monovalentes (conocidas como Fv de cadena individual (scFv) ; (ver, por ejemplo, Bird y colaboradores,, 1988, Science 242:423-426 y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad, Sci USA 85:5879-5883). Tales Fvs de cadena individual también se proponen con el término "porción que enlaza antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de Fvs de cadena individual y moléculas relacionadas tales como diacuerpos o triacuerpos también son comprendidos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes en los cuales los dominios de VH y VL son expresados sobre una sola cadena de polipéptido, pero la utilización de un enlazador que es demasiado fuerte para permitir en emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, para de esta manera forzar los dominios para emparejar con los dominios complementarios de esta cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno (ver por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448; Poljak, R.J., y colaboradores, 1994, Structure, 2:1121-1123). Métodos para producir anticuerpos de acuerdo con la invención serán familiares para personas expertas en la técnica, ver por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,816,567, patente norteamericana No. 5,585,089 y US 20030039649 que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Tales métodos requieren el uso de técnicas recombinantes estándares. Se prefiere que el anticuerpo o porción que enlaza anticuerpo o antígeno de acuerdo con la presente invención tenga baja inmunogenicidad predicha en un hospedero humano.

Por "baja inmunogenicidad" se propone que el anticuerpo no crea una respuesta de anticuerpo en por lo menos la mayoría de los individuos que reciben anticuerpo de magnitud suficiente para reducir la efectividad de la administración continua del anticuerpo durante un tiempo suficiente para lograr eficacia terapéutica. El nivel de inmunogenicidad en humanos puede predecirse utilizando el programa de predicción de enlace MHC clase II Proped (http: //www. imlech. res . in/raghava/propred) utilizando un análisis de valor de de análisis al 1% de todos los alelos. Otros programas que pueden ser utilizados incluyen: Rankpep (http: //bio.dfci .harvard. edu/Tools/rankpep.html) Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com) Las moléculas de inmunogenicidad reducida contendrán un número reducido de péptidos predichos para enlazar alelos de MHC de clase II que son altamente expresados en la población objetivo, con relación a la molécula donadora de partida (Flower DR, Doytchinova IA. (2004) Immunoinformatics and the prediction of immunogenicity, Drug Discov Today, 9(2): 82-90). El análisis funcional del enlace MHC clase II se puede realizar al generar péptidos sobrepuestos correspondientes a la proteína de interés y al probar este por su habilidad para evocar la activación de célula T (ensayo de proliferación de célula T) o desplazar un péptido reportador, un péptido que enlaza MHC clase II conocido (Hammer J y colaboradores, 1994, J. Exp. Med., 180:2353). El término "derivado de" como se utiliza en la presente en relación a regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo significa que la secuencia de la región de estructura de primate del Nuevo Mundo es alterada de la secuencia nativa. Típicamente los cambios serán hechos para incrementar el enlace tal como es descrito en la patente norteamericana No. 5,585,089 y US 20030039649 o para reducir la inmunogenicidad predicha en humanos. El término "derivado de" no incluye cambios que resultan en la secuencia total de las regiones de estructura presente en la región variable que son idénticos a una secuencia de estructura humana. Una base de datos que puede ser utilizada para comparación es http: //www, nc i . nlm. nih. gov/ . En un aspecto adicional la presente invención proporciona un anticuerpo de primate de Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo que enlaza un antígeno de superficie de célula o una citoquina en donde el anticuerpo o porción que enlaza al antígeno del mismo comprende una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura, en donde las CDRs se seleccionan tal que el anticuerpo o porción que enlaza antígeno se enlaza al antígeno de superficie de célula o a la citoquina . Como se utiliza en la presente el término "diseñado" significa que las CDRs de primate del Nuevo Mundo se han seleccionado utilizando los métodos de impresión de epítope descritos en Hoogenboom y colaboradores, publicación de PCT No. WO 93/06213 y Jespers y colaboradores, BIO/TECHNOLOGY Vol 12 1994, pp 899-903 que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Las librerías de anticuerpo utilizadas en este método son de preferencia librerías de scFv preparadas y clasificadas como es descrito en McCafferty y colaboradores,, publicación de PCT No. WO 92/01047, McCafferty y colaboradores, 1990, Nature, 348:552-554; y Griffiths y colaboradores, 1993, EMBO J, 12:725-734 que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Por ejemplo, una vez que los segmentos VL y VH humanos iniciales son seleccionados, experimentos de "mezclado e igualación", en los cuales diferentes pares de los segmentos VL y VH inicialmente seleccionados son clasificados para el enlace de hTNF-a, se realizan para seleccionar combinaciones de pares de VL/VH preferidas. Adicionalmente, para mejorar además la afinidad y/o disminuir la constante proporción para el enlace de hTNF-a, los segmentos VL y VH del (los) par (es) VL/VH preferidos pueden ser aleatoriamente mutados, de preferencia dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somático in vivo responsable para la maduración para afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Así la maduración de afinidad in vi tro se puede realizar al amplificar las regiones VH y VL son de los cebadores de PCR complementarios al VH CDR3 o VL CDR3, respectivamente, los cebadores han sido "salpicados" de una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones tal que los productos de PCR resultantes codifican los segmentos VH y VL en los cuales las mutaciones aleatorias se han introducido en las regiones CDR3 VH y/o VL. Estos segmentos VH y VL aleatoriamente mutados pueden ser reclasificados para el enlace al antígeno de las secuencias que exhiben alta actividad y una baja proporción para el enlace de antígeno puede ser seleccionada. Después de la clasificación y aislamiento de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que enlaza el antígeno a través de una librería de exhibición de inmunoglobulina recombinante, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado puede ser recuperado de un paquete de exhibición (por ejemplo, del genoma de fago) y subclonado en otros vectores de expresión mediante técnicas de DNA recombinantes estándares. Si es deseado, el ácido nucleico puede ser además manipulado para crear otras formas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, enlazado a dominios de inmunoglobulina adicionales que codifican ácido nucleico, tales como regiones constantes adicionales). Al expresar un anticuerpo humano recombinante aislado al clasificar una librería combinatoria, el DNA que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospederas mamíferas. Ejemplos de antígenos de superficie de célula que pueden ser dirigidos y anticuerpos que pueden ser utilizados en la expresión incluyen pero no están limitados a Ejemplos de citoquinas que pueden ser dirigidas y anticuerpos que pueden ser utilizados en la impresión incluyen pero no están limitados a La presente invención además está basada en un método para amplificación de genes de inmunoglobulina de primate del Nuevo Mundo, por ejemplo mediante la reacción en cadena de po.limerasa (PCR) del ácido nucleico extraído de linfocitos de primate del Nuevo Mundo utilizando cebadores específicos para familias de gen de región variable de cadena pesada y ligera. La región variable amplificada luego se clona y un vector que contiene un gen de región constante humano o de primate para la producción del anticuerpo recombinante quimérico de primate del Nuevo Mundo. Las metodologías del DNA de recombinantes estándares se utilizan para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinante e introducir los vectores en células hospederas, tales como aquellos descritos en Sambrook, Fritsch y Maniatis (cds), Molecular Cloning; a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor, N.Y (1989) . Los vectores de expresión adecuados serán familiares para aquellos expertos en la técnica. Los linfocitos de primate del Nuevo Mundo que producen las inmunoglobulinas típicamente son inmortalizadas mediante fusión con una línea de célula de mieloma para generar un hibridoma. Las células hospederas mamíferas preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (CHO) , células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Además de los sistemas de expresión mamíferos, la presente invención también contempla el uso de sistemas de expresión no mamíferos tales como aquellos que son derivados de plantas o procarióticos (bacterianos) . Tales sistemas de expresión serán familiares para personas expertas en la técnica. Los repertorios del dominio de VH, V y la región constante puede ser un repertorio qué ocurre naturalmente de secuencias de inmunoglobulina o un repertorio sintético. Un repertorio que ocurre naturalmente es uno preparado, por ejemplo, de células que expresan inmunoglobulina cosechadas de uno o más primates. Tales repertorios pueden ser na?ve, es decir, preparado de células que expresan inmunoglobulina recién nacidas, o rearreglado es decir preparado de, por ejemplo, células B de primate adulto. Si es deseado, los clones identificados del repertorio natural o cualquier repertorio que enlaza el antígeno objetivo luego se someten a mutagénesis y además clasificación con el fin de producir y seleccionar variantes con características de enlace mejoradas. Los repertorios sintéticos de dominios variables de inmunoglobulina se preparan al introducir artificialmente diversidad en un dominio variable clonado. Tales técnicas de maduración de afinidad serán familiares para personas expertas en la técnica tales como aquellas descritas por R.A. Irving y colaboradores, 2001, Journal of Immunological Methods, 248, 31-45. La región variable, o una CDR del mismo, de un gen de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo se puede clonar al proporcionar ácido nucleico, por ejemplo, cDNA, al proporcionar un cebador complementario a la secuencia de cDNA que codifica una secuencia guía 5' de un gen de anticuerpo, al poner en contacto ese cDNA y el cebador para formar un complejo híbrido y al amplificar el cDNA para producir ácido nucleico que codifica la región variable (o región CDR) del gen de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo. En vista de la enseñanza de la presente especificación, será apreciado por personas expertas en la técnica de la presente invención, que la secuencia de la región variable de primate del Nuevo Mundo se puede utilizar como aceptores para el injerto de secuencias de primate no de Nuevo Mundo, en particular, secuencias de CDR utilizando técnicas recombinantes estándares. Por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,585,089 describe métodos para crear anticuerpos quiméricos de baja inmunogenicidad que retiene alta afinidad del anticuerpo parental no humano ' y contiene uno o más CDRs de una inmunoglobulina donadora y una región de estructura de inmunoglobulina de humano. La publicación norteamericana No. 20030039649 describe un método de humanización para crear anticuerpos quiméricos de baja inmunogenicidad que contiene secuencias CDR de un anticuerpo no humano y secuencias de estructura de anticuerpos humanos basado en la utilización de tipos de estructura de CDR canónicos del anticuerpo no humano en comparación a los tipos de estructura de CDR canónico de la línea germinal de anticuerpos humanos como la base para seleccionar las secuencias de estructura humanas apropiadas para un anticuerpo humanizado. Por consiguiente, estos principios se pueden aplicar al injerto de uno o más CDRs de primate no de Nuevo Mundo en una región variable de aceptor de primate del Nuevo Mundo. Las secuencias de CDR se pueden obtener del DNA genómico aislado de un anticuerpo, o de secuencias presentes en una base de datos, por ejemplo, las bases de datos de proteínas y nucleótidos del Centro Nacional para Información de Biotecnología, la Base de Datos Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológicas . La secuencia CDR puede ser el DNA genómico o un cDNA. Los métodos para injertar una CDR(s) de reemplazo en una secuencia variable aceptora será familiar para personas expertas enla técnica de la presente invención. Típicamente, los CDRs serán injertados en secuencias de región variable aceptoras para cada una cadena ligera variable y una cadena pesada variable o una cadena individual en el caso de un anticuerpo de dominio. El método preferido de la presente invención involucra el reemplazo de ya sea CDRl o, más de preferencia, CDR2 en una secuencia de región variable por la vía de la mutagénesis dirigida al cebador. El método consiste de recocer un oligonucleótido sintético que codifica una mutación deseada a una región objetivo donde sirve como un cebador para la iniciación de la síntesis de DNA in vi tro, extender el oligonucleótido mediante una DNA polimerasa para generar una DNA de doble hebra que lleva la mutación deseada, y ligar y clonar la secuencia en un vector de expresión apropiado (Sambrook, Joseph; y David W. Russell (2001). Molecular Cloning: A Labora tory Manual , 3rd ed. , Cold Spring Harbor, N. Y.; Cold Spring Harbor Laboratory Press). Todavía adicionalmente, un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada mediante la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M. , y colaboradores,, 1995 Human Antibodies y Hybridomas, 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido amrcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M, , y colaboradores, 1994 Mol. Immunol, 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de anticuerpos completes utilizando técnicas convencionales, tal como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Por otra parte, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener utilizando técnicas de DNA recombinantes estándares, como es descrita en la presente y conocida para la persona experta. La secuencia de región constante (porción Fc) de preferencia se obtiene de una secuencia de inmunoglobulina humana o de primate. La secuencia de primate puede ser un primate del Nuevo Mundo o una secuencia de primate del Viejo Mundo. Los primates del Viejo Mundo adecuados incluyen chimpancés, u otros simios homenudos por ejemplo gorila u orangután, que debido a su estrecha proximidad filogenética a los humanos, comparten un algo grado de homología con la secuencia de la región constante humana. Las secuencias que codifican para regiones constantes humanas o de primates están disponibles de bases de datos, incluyendo, por ejemplo, las bases de datos de proteína y de nucleótidos del Centro Nacional para Información de Biotecnología, la Base de Datos Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico. El anticuerpo o porción que enlaza antígeno de acuerdo con la invención es capaz de enlazar un antígeno humano o no humano. De preferencia, el antígeno al cual el anticuerpo quimérico o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza, es péptido, proteína, carbohidrato, glucoproteínas, lípido o glucolípido en la naturaleza, seleccionado de un antígeno asociado con tumor incluye antígeno carbinoembriónico, EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Hcr-2, TRAIL y receptores VEGF, un antígeno involucrado con una enfermedad de desorden inmune o inflamatorio que incluye CD3, CD4, CD25, CEHO, CD49d, MHC clase I, MHC clase II, GM-CSF, interferona-?, IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-a, y IgE, y un antígeno expresado por una célula hospedera que incluye glucoproteína Ilb/IIIa, P-glucoproteína, receptores purinérgicos y receptores de adhesión que incluyen CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD56, CD58, CD62 o CD144, un antígeno que comprende una citoquina, una quimioquina, factor de crecimiento u otro modulador fisiológico soluble o un receptor del mismo que incluye eotaxina, IL-6, 1L-8, TGF-ß, C3a, C5a, VEGF, NGF y sus receptores, un antígeno involucrado en enfermedades o desórdenes del sistema nervioso central que incluye ß-amieloide y priones, un antígeno de origen no humano tal como antígeno o toxinas microbianas, nanobiales o virales que incluyen proteína F de virus sincitial respiratorio, toxina de ántrax, veneno de víbora y digoxina; en donde el anticuerpo quimérico actúa como un agonista o antagonista o es activo a ya sea células indeseadas agotadas (exterminadas o eliminadas) (por ejemplo anti-CD4) al actuar con complemento, o células exterminadoras (por ejemplo, células NK) o es activo como un agente citotóxico o para causar enlace del receptor Fc por un fagocito o neutraliza la actividad biológica de su objetivo. Más de preferencia, el antígeno es TNFa, mucho más de preferencia TNFa humano. Alternativamente, el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo puede enlazar un antígeno no humano. De preferencia el antígeno no humano se selecciona del grupo que consiste de la proteína F de virus sincitial respiratorio, citomegalovirus, veneno de víbora y digoxina. Los términos "se enlaza a" como se utiliza en la presente, se propone para referirse al enlace de un antígeno por una región variable de inmunoglobulina de un anticuerpo con una constante disociación (Kd) de lµM o menor como es medido por el análisis de resonancia de plasmón de superficie utilizando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie BlAcore™ y software de evaluación cinética BlAcore™ (por ejemplo versión 2.1). La constante de afinidad o disociación (Kd) para una interacción de enlace específico es de preferencia aproximadamente 500 pM a aproximadamente 50 pM, más de preferencia aproximadamente 500 nM o menor, más de preferencia aproximadamente 300 nM o menor y de preferencia por lo menos aproximadamente 300 nM a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 200 nM a aproximadamente 50 pM, y más de preferencia por lo menos, aproximadamente 100 nM a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 75 nM a aproximadamente 50 pM, aproximadamente 10 nM a aproximadamente 50 pM. Los anticuerpos de la presente invención son ventajosos en la terapia humana debido a que la probabilidad de inducción de una respuesta de anti-anticuerpo humano será reducida . Los anticuerpos recombinantes producidos de acuerdo con la invención que enlazan un antígeno objetivo pueden ser identificados y aislados al clasificar una librería de inmunoglobulina combinatoria (por ejemplo, una librería de exhibición de fago) para aislar miembros de la librería que exhiben especificidad de enlace deseada y comportamiento funcional (por ejemplo neutralización de TNFa se puede medir utilizando células L929) . Será entendido que todos los procedimientos donde las porciones o derivados que enlazan antígeno de anticuerpo son utilizados, por ejemplo, dominios Fabs, scFv y V o anticuerpos de dominio, dependen dentro del alcance de la presente invención. La técnica de exhibición de fago se ha descrito extensivamente en la técnica y ejemplos de métodos y compuestos para generar y clasificar tales librerías y afinidad de maduración de los productos de estos se pueden encontrar en, por ejemplo, Barbas y colaboradores, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982; Clarkson y colaboradores,- 1991, Nature, 352:624:628; Dower y colaboradores,, publicación de PCT No. WO 91/17271, patente norteamericana No. 5,427,908, patente norteamericana No. 5,580,717 y EP 527,839; Fuchs y colaboradores, 1991, Bio/Technology, 9:1370-1372; Garrad y colaboradores, 1991 Bio/Technology, 9:1373: 1377; Garrard y colaboradores, publicación de PCT No. WO 92/09690; Gram y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Griffiths y colaboradores, 1993 EMBO J, 12:725:734; Griffiths y colaboradores, patente norteamericana No. 5,885,793 y EP 589,877; Hawkins y colaboradores, 1992, J Mol Biol, 226:889-896; Hay y colaboradores, 1992, Hum Antibod Hybridomas, 3:81-85; Hoogenboom y colaboradores, 199J Nuc Acid Res, 19:4133-4137; Huse y colaboradores, 1989, Science, 246:1275-1281; Knappik y colaboradores, 2000, J Mol Biol, 296:57-86; Knappik y colaboradores, PCT WO 97/08320; Ladner y colaboradores, patente norteamericana No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,571,698, No. 5,837,500 y EP 436,597; McCafferty y colaboradores, 1990, Nature. 348:552-554; McCafferty y colaboradores, publicación de PCT No. WO 92/01047, patente norteamericana No. 5,969,108 .y EP 589,877; Salfeld y colaboradores, PCT WO 97/29131, US Provisional Application No. 60/126,603; y Winter y colaboradores, PCT WO 92/20791 y EP 368,684.

Las librerías recombinantes que expresan los anticuerpos de la invención se pueden expresar sobre la superficie de microorganismos, por ejemplo, levadura o bacteria (ver publicaciones de PCT W099/36569 y 98/49286) . El Método de Anticuerpo de Linfocito Seleccionado o SLAM como es referido en el estado de la técnica, es otro medio para generar anticuerpos de alta afinidad rápidamente. Distinto a los procedimientos de exhibición de fago todos los anticuerpos son completamente divalentes. Con el fin de generar anticuerpos de primate de Nuevo Mundo, los primates del Nuevo Mundo se inmunizan con un antígeno humano, por ejemplo, un polipéptido de TNFa. Después las células de inmunización se remueven y se proliferan colectivamente en microcavidades individuales. Los sobrenadantes se remueven de las cavidades y se prueban para tanto el enlace y la función. Las secuencias de gen se pueden recuperar para la manipulación subsecuente, por ejemplo, humanización, fragmento Fab, generación scFv o dAb. Así otro ejemplo es la derivación del ligando de la invención mediante SLAM y sus derivados (Babcook, J.S. y colaboradores, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 93; 7843-7848, patente norteamericana 5,627,052 y publicación de PCT WO 92/Q2551). Las adaptaciones de SLAM, tal como el uso de alternativas para probar sobrenadantes tal como en charola, también están dentro del alcance de esta invención.

En un sistema de expresión la librería de péptido/proteína recombinante se visualiza sobre ribosomas (por ejemplo ver Roberts, RW y Szostak, J.W.1997. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 94:12297-123202 y publicación de PCT No. WO98/31700) . Así otro ejemplo involucra la generación y transcripción in vi tro de una librería de DNA (por ejemplo de anticuerpos y derivados) de preferencia preparados de células inmunizadas, pero no así limitadas) la traducción de la librería tal que la proteína y los mRNAs "inmunizados" se establece en el ribosoma, selección por afinidad (por ejemplo mediante enlace a RSP) , aislamiento de mRNA, traducción inversa y amplificación subsecuente (por ejemplo, mediante la reacción en cadena de polimerasa o la tecnología relacionada) . Rondas adicionales de selección y amplificación se pueden acoplar como sea necesario para la maduración de afinidad a través de la introducción de mutación somática en este sistema o por otros métodos de maduración de afinidad como es conocido en el estado de la técnica. (R.A. Irving y colaboradores, Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)). Otro ejemplo observa la aplicación de la tecnología de compartimentalización de emulsión a la generación de los anticuerpos de la invención. En la compartimentalización de emulsión, los métodos in vi tro y de clasificación óptica se combinan con la compartimentalización de proteína traducida y sus secuencias de codificación de nucleótidos en fase acuosa dentro de una gotita de aceite en una emulsión (ver las publicaciones de PCT Nos. WO99026711 y WO0040712). Los elementos principales para la generación y selección de anticuerpos son esencialmente similares al método in vi tro de exhibición de ribosoma. El anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de acuerdo con la invención se puede derivar o enlazar a otra molécula funcional. Por ejemplo, el anticuerpo o porción que enlaza antígeno se puede enlazar funcionalmente mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera, a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina) . Los agentes citotóxicos comúnmente utilizados para generar inmunotoxinas incluyen isótopos radioactivos tales como luIn o 90Y, selenio, ribonucleasas, toxinas microbianas de dominio de enlace - truncadas suprimidas tal como exotoxina Pseudomonas o toxina de Difteria, inhibidores de tubulina tal como caliqueamicina (ozagamicina) , maitansinoides (incluyendo DM-1) , auristatinas y taxoides, proteínas de inactivación de ribosoma tal como ricina, eboluna I, saporina y gelonina y profármacos tal como melfalan. Los agentes detectables útiles con el cual un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo se puede derivar incluyen compuestos fluorescentes. Agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalensulfonilo, ficoeritrina y los similares. Un anticuerpo también puede ser derivado con enzimas detectables tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y los similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, este se detecta al adicionar reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción detectable. Un anticuerpo también puede ser derivado con biotina, y detectado a través de la medición indirecta de avidina o enlace de estreptavidina. La presente invención también se extiende a anticuerpo PEGilados o porción que enlaza anticuerpo que proporciona vida media incrementada y resistencia a degradación sin una pérdida en la actividad (por ejemplo, reducción en afinidad de enlace) con relación a los polipéptidos de anticuerpo no PEGilado. El anticuerpo o porción que enlaza antígeno como es descrito en la presente, puede ser acoplado, utilizando métodos conocidos en la técnica, a moléculas poliméricas (de preferencia PEG) útiles para lograr la vida media incrementada y las propiedades de resistencia a la degradación. Las porciones de polímero que pueden ser utilizadas en la invención pueden ser sintéticas o que ocurren naturalmente e incluyen, pero no están limitadas a, polialquileno de cadena recta o ramificada, polímeros de polialquenileno o polioxialquileno, o un polisacárido ramificado o no ramificado tal como un homo- o heteropolisacárido . Ejemplos preferidos de polímero sintético que pueden ser utilizados en la invención incluyen poli (etilenglicol) de cadena recta o ramificada (PEG), poli (propilenglicol) o poli (alcohol vinílico) y derivados o formas sustituidas de los mismos. Los polímeros sustituidos particularmente preferidos para el enlace de anticuerpos como es descrito en la presente incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi (polietilenglicol) . Las porciones poliméricas que ocurren naturalmente que pueden ser utilizadas además de o en lugar de PEG incluyen lactosa, amilosa, dextrano, o glicógeno, así como derivados de los mismos que serían reconocidos por personas expertas en la técnica . Las formas derivadas de moléculas poliméricas incluyen, por ejemplo, derivados que tienen porciones adicionales o grupos reactivos presentes en los mismos para permitir la interacción con residuos de aminoácidos del polipéptido de anticuerpos descritos en la presente. Tales derivados incluyen esteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS) , polímeros de propionato de succinimidilo y agentes reactivos selectivos de sulfhidrilo tal como maleimida, vinil sulfona y tiol. Los polímeros derivados particularmente preferidos incluyen, pero no están limitados a polímeros PEG que tienen las fórmulas: PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS; PEG-0-CH2-NHS; PEG-0-CH2CH2-C02-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-02CNH-CH(R) -C02-NHS; PEG-NHC0~CH2CH2-C0-NHS y PEG-0-CH2, -C02-NHS; en donde R es (CH2) 4) NHC02 (mPEG) . Los polímeros PEG pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificadas en donde las porciones PEG múltiples están presentes en un solo polímero. El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS, SPA; VS, o Tiol) se pueden unir directamente al polímero PEG o se puede unir al PEG por la vía de una molécula enlazadora. El tamaño de los polímeros útiles en la invención puede estar entre en intervalo de entre 500 Da a 60 kDa, por ejemplo, entre 1000 Da y 60 kDa, 10 kDa y 60 kDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, 40 kDa y 60 kDa, y hasta entre 50 kDa y 60 kDa. Los polímeros utilizados en la invención particularmente PEG, pueden ser polímeros de cadena recta o pueden presentar una conformación ramificada. Las moléculas de polímero (PEG) útiles en la invención se pueden unir a un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica. La primera etapa en la unión de PEG u otro polímero a un monómero o multímero de polipéptido de anticuerpo de la invención es la sustitución de los grupos de extremo de hidroxilo del polímero PEG mediante grupos funcionales que contiene electrófilo. Particularmente, los polímeros de PEG se unen ya sea residuos de cisteína o lisina presentes en los monómeros o multímeros de polipéptido del anticuerpo. Residuos de cisteína y lisina pueden estar ocurriendo naturalmente, o pueden ser diseñadas en la molécula de polipéptido de anticuerpo. Por ejemplo, residuos de cisteína pueden ser recombinantemente diseñados al C-terminal de un polipéptido de anticuerpo o residuo en localizaciones accesibles de solvente específico en un polipéptido de anticuerpo pueden ser sustituidos con cisteína o lisina. El anticuerpo puede ser enlazado a una o más moléculas que pueden incrementar su vida media in vivo . Estas moléculas se enlazan al anticuerpo en un sitio sobre el anticuerpo diferente al sitio de enlace de antígeno, de modo que no interfiere/impiden estéricamente el sitio de enlace de antígeno. Típicamente, tales moléculas son polipéptidos que ocurren naturalmente in vivo y que resiste la degradación o remoción por mecanismos endógenos. Será obvio para un experto en la técnica que fragmentos o derivados de tales moléculas que ocurren naturalmente pueden ser utilizadas, y que algunos no pueden ser polipéptidos. Las moléculas que incrementa la vida media puede ser seleccionado de las siguientes. (a) proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, colágeno, laminina, integrina y fibronectina . (b) proteínas encontradas en la sangre, por ejemplo fibrina a-2 macroglobulina, albúmina de suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína A amiloide de suero, heptaglobina, proteína, ubicuitina, uteroglobulina, ß-2 de microglobulina, plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inhibidor de quipsina pancreática; (c) proteínas de suero inmune, por ejemplo, IgE, IgG, IgM; (d) proteínas de transporte, por ejemplo, proteína de enlace de retinol, a-1 microglobulina; (e) defensinas, por ejemplo, beta-defensina 1, defensinas 1, 2 y 3 de neutrófilo; (f) proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejidos neurales, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportadores de ascorbato; (g) receptor de transferrina específico de proteina de fusión de agente farmacéutico de ligando-Neuro (ver US5977307); receptor de célula endotelial capilar de cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF 1), receptor del factor 2 de crecimiento similar a insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina; (h) proteínas localizadas al riñon, por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador Kl de anión orgánico, antígeno de Heymann; (i) proteínas localizadas al hígado, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, G250; (j) factor X de coagulación de sangre; (k) a-1 antitripsina; (1) HNF la; (m) proteínas localizadas al pulmón, por ejemplo, componente secretorio (enlaza IgA) ; (n) proteínas localizadas al Corazón, por ejemplo, HSP 27; (o) proteínas localizadas a la piel, por ejemplo, queratina; (p) proteínas específicas de hueso, tales como las proteínas morfogénicas de hueso (BMPs) por ejemplo, BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también referida como proteína osteogénica (OP-I) y -8 (OP-2) ; (q) proteínas específicas de tumor, por ejemplo, antígeno de trofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas, por ejemplo, catepsina B (encontrada en el hígado y el bazo) ; (r) proteínas específicas de enfermedad, por ejemplo, antígenos expresados solamente en células T activadas: incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocito); ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309, 1999; OX40 (un miembro de la familia de receptor TNF, expresado en células T activadas y la única molécula de célula T coestimuladora conocida que es específicamente regulada hacia arriba en el virus de leucemia de células T humano tipo-I (HTLV-I) de células productoras - ver J. Immunol . 2000 Jul 1;16561); 263-70; metaloproteasas (asociados con artritis/cánceres), incluyendo CG6512 Drosofila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH de murino; factores de crecimiento angiogénico, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblasto acídico (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblasto básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial Vascular/factor de permeabilidad vascular (VF-GFZVPF) , factor-a de crecimiento de transformación (TGF-a) , factor-alfa de necrosis de tumor (TNF-a), angiogenina inteleucina-3 (1L-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF) , factor de crecimiento placental (PlGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas de midquina factor-BB (PDGF), fractalquina; (s) proteínas de estrés (proteínas de choque térmico) ; (t) proteínas involucradas en el transporte Fc; y (u) vitaminas por ejemplo B12, Biotina. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, junto con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Un "excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes de retardo y absorción isotónicos y los similares que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y los similares así como combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo (incluyendo composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo) suficiente para tratar o aminorar una enfermedad o desorden especificado o uno o más de sus síntomas o prevenir o reducir la ocurrencia de enfermedad o desorden. El término "cantidad diagnósticamente efectiva" o "cantidad efectiva para la diagnosis" y cognados de los mismos, se refiere a una cantidad de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo (que incluye composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo), suficiente para diagnosticar una enfermedad o desorden especificado y/o uno o más de sus manifestaciones, donde la diagnosis incluye la identificación de la existencia de la enfermedad o desorden y/o detección del grado de severidad de la enfermedad o desorden. Frecuentemente, la diagnosis será llevada a cabo con referencia a una línea de base o nivel de detección o antecedente observado para individuos sin la enfermedad o desorden. Los niveles de detección arriba del antecedente o niveles de línea de base (niveles elevados de detección) son indicativos de la presencia y en algunos casos, la severidad de la condición. Cuando se utiliza con respecto a métodos de tratamiento y el uso del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo (incluyendo composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo) , un individuo "en necesidad del mismo" puede ser un individuo quien se ha diagnosticado con o previamente tratado para la enfermedad o desorden a ser tratado. Con respecto a los métodos de diagnosis, un individuo "en necesidad del mismo" pueden ser un individuo quien se sospecha que tiene una enfermedad o desorden, está en riesgo para una enfermedad o desorden, o se ha diagnosticado previamente con la enfermedad o desorden (por ejemplo, la diagnosis puede incluir el monitoreo de la severidad (por ejemplo, progresión/regresión) de la enfermedad o desorden a través del tiempo y/o conjunción con la terapia) . Se prefiere que el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo bloquea o estimula las funciones de receptores o neutraliza los productos solubles activos, tal como uno o más de las interleucinas, TNF o C5a. Más de preferencia, el producto soluble activo es TNF-a humano. La composición puede ser una variedad de formas, incluyendo formas de dosificación líquidas, semi sólidas o sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusionables) dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas o supositorios. De preferencia, la composición está en la forma de una solución inyectable para inmunización. La administración puede ser intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, intratecal, e intraarterial. De Preferencia la dosificación está en el intervalo de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 10 mg/kg del peso del cuerpo administrado diariamente, semanalmente, bi-o tri-semanalmente o mensualmente, más de preferencia aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5 mg/kg de peso del cuerpo por semana. La composición también se puede formular como un polvo estéril para la preparación de soluciones inyectables estériles . En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como la formulación de liberación controlada, que incluyen implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulado. Los polímeros compatibles se pueden utilizar tal como etilen acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres o ácido poliláctico. La composición también se puede formular para administración oral. En esta modalidad, el anticuerpo puede ser encerrado en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimida en tabletas o incorporada directamente en la dieta del sujeto. La composición también se puede formular para administración rectal. El anticuerpo puede ser administrado con el fin de enlazar . e identificar células seleccionadas in vi tro e in vivo para enlazar y destruir células seleccionadas in vivo, con el fin de penetrar dentro y destruir las células seleccionadas in vivo . Alternativamente, el anticuerpo puede ser utilizado como una inmunotoxina para suministrar un agente citotóxico, por ejemplo, una toxina o agente quimioterapéutico, a un tipo de célula particular tal como una célula de tumor. La producción de inmunotoxinas será familiar para personas expertas en la técnica. En la modalidad preferida, la composición se administra a un humano. La presente invención también proporciona el uso del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo en una aplicación de diagnóstico para detectar un antígeno asociado con una enfermedad o desorden particular. Más particularmente, la invención proporciona el uso del anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo en un método para diagnosticar a un sujeto que tiene un antígeno asociado con una enfermedad particular o desorden particular, que comprende administrar al sujeto una cantidad diagnósticamente efectiva de un anticuerpo, una porción que enlaza antígeno del mismo o composición farmacéutica, como es descrito en la presente, de acuerdo con el tercer aspecto. De preferencia el sujeto es un humano. El anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno del mismo, de preferencia marcado, se puede utilizar para detectar la presencia de un antígeno, o niveles elevados de un antígeno (por ejemplo TNF-a) en una muestra biológica, tal como suero o plasma utilizando un inmunoensayo de convención, tal como un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RÍA) o inmunohistoquímica de tejido. De preferencia, el antígeno al cual el anticuerpo quimérico o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza, es péptido, proteína, carbohidrato, glucopoteína, lípido o glicolípido en naturaleza, seleccionado de un antígeno asociado con tumor incluyendo antígeno carcinoembriónico, EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL y receptores VEGF., un antígeno involucrado en enfermedad o desorden inmune o inflamatorio que incluye CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC clase I, MHC clase II, GM-CSF, interferona-?, IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-a, y IgE, un antígeno expresado en una célula hospedera que incluye glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos y receptores de adhesión incluyendo CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD56, CD58, CD62 o CD144, un antígeno que comprende una citoquina, quimioquina, factor de crecimiento u otro modulador fisiológicamente soluble o un receptor del mismo que incluye eotaxina, IL-6, IL-8, TGF-ß, C3a, C5a, VEGF, NGF y sus receptores, un antígeno involucrado en enfermedades de desórdenes del sistema nervioso central que incluye ß-amieloide y priones, un antígeno de origen no humano tal como antígeno de porciones microbianas, nanobiales o virales que incluye proteína F de virus sincitial respiratorio, toxina de ántrax, veneno de víbora y digoxina; en donde el anticuerpo quimérico actúa como un agonista o antagonista o es activo para ya sea agotarse (eliminar o eliminarse) de células indeseadas (por ejemplo anti-CD4) al actuar con complemento, o células exterminadoras (por ejemplo, células NK) o es activa como un agente citotóxico o para causar enlace de receptor Fc mediante un fagocito o neutraliza la actividad biológica de este objetivo. El anticuerpo TNF-a anti-humano o porción que enlaza antígeno del mismo de acuerdo con la invención también se puede utilizar en aplicaciones de cultivo de célula donde se desea inhibir la actividad de TNF-a. La presente invención también proporciona un método para tratar una enfermedad o desorden caracterizado por actividad de TNF-a humano en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo un anticuerpo, una porción que enlaza antígeno del mismo o una combinación farmacéutica, como es descrito en la presente, de acuerdo con la presente invención en la cual el anticuerpo porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza a TNF-a. El término "enfermedad o desorden caracterizado por la actividad TNF-a humano" como se utiliza en la presente se propone para incluir enfermedades o desórdenes en las cuales la presencia de TNF-a en un sujeto que sufre de la enfermedad o desorden se ha mostrado que es o se sospecha de ser ya sea responsable para o involucrado en la patofisiología de la enfermedad o desorden o un factor que contribuye al empeoramiento de enfermedad o desorden. Por consiguiente, una enfermedad o desorden en la cual la actividad de TNF-a es prejudicial es una enfermedad o desorden en la cual la inhibición de la actividad de TNF-a se espera que alivie los síntomas y/o la progresión de la enfermedad o desorden. Tales enfermedades o desórdenes pueden ser evidenciados, por ejemplo, un incremento en la concentración de TNF-a en un fluido biológico de un sujeto que sufre de la enfermedad o desorden (por ejemplo, un incremento en la concentración de TNF-a en el suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto), que puede ser detectado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de la invención específico para TNF-a. Una enfermedad o desorden caracterizado por la actividad de TNF-a humana se propone para incluir enfermedades o desórdenes en las cuales la presencia de TNF-a en un sujeto que sufre de la enfermedad o desorden se ha mostrado que es, o se sospecha de ser, ya sea responsable para la patofisiología de la enfermedad o desorden o un factor que contribuye a un empeoramiento de la enfermedad o • desorden. De preferencia, la enfermedad o desorden caracterizado por la actividad TNF-a humana se selecciona del grupo que consiste de sepsis, incluyendo choque séptico, choque endotóxico, sepsis gran negativo síndrome de choque séptico, enfermedad autoinmune, incluyendo artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis, psoriaris y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico, enfermedad infecciosa, incluyendo fiebre y mialgias debido a la infección y caquexis secundaria a la infección; enfermedad de injerto contra huésped; crecimiento tumoral o metastásico; enfermedades pulmonares incluyendo el síndrome de angustia respiratoria de adulto, pulmón de choque, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis pulmonar y silicosis; enfermedad de intestino inflamatorio incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa; enfermedades cardiacas, enfermedades del hueso inflamatorio, hepatitis, disturbios de coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, formación queloide y formación de tejido de cicatrización. Los compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en la composición. El anticuerpo o fragmento que enlaza anticuerpo puede ser formulado con y/o administrado simultáneamente, por separado o secuencialmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, anticuerpos que enlazan a otros objetivos tales como citoquinas o moléculas de superficie celular o alternativamente uno o más agentes químicos que inhiben la producción o actividad de TNF-a humana. En otro aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo, junto con empaquetamiento e instrucciones para el uso. En ciertas modalidades, las instrucciones para el uso incluye instrucciones en cómo administrar efectivamente una cantidad terapéutica de un anticuerpo o porción que enlaza antígeno de la invención. Por toda esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende", sería entendido que implica la inclusión de un elemento establecido, un número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia. Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o los similares que se han incluido en la presente especificación es solamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se va a tomar como una admisión de que cualquiera o todas estas materias forman parte de la base de la técnica previa o fue en el conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención como existió en Australia o en otra parte antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. Con el fin de que la naturaleza de la presente invención pueda ser más claramente entendida, formas preferidas de las mismas ahora serán descritas con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLO 1 Fusión de una región variable de tití a una región constante humana Materiales y Métodos Síntesis y Clonación del Gen La cadena VH (Número de Acceso: AAM54057, SEQ ID N0:1) del anticuerpo derivado de tití específico de MOG se expresó con la región constante humana (CH1 de cadena pesada, IgGl humano, articulación, dominios CH2 & CH3 (tal como el número de acceso de NCBI P01857) (SEQ ID NO:2)). Esto se logró mediante la traducción posterior de la secuencia de aminoácido en una secuencia de DNA que se optimizó para la expresión de célula mamífera utilizando la tecnología GeneOptimizer y se sintetizó de novo por ensamble de oligonucleótidos sintéticos (GeneArt, Alemania) . Durante la optimización de secuencia DNA los sitios de enzima de restricción específicos Ase I y Tth 1111 se incluyeron para permitir la manipulación futura de la región VH. Después de la síntesis de gen la secuencia completa que incluye la secuencia Kozak se clonó en el sitio de clonación múltiple del vector accesorio pEE6,4 GS (Lonza Biologies) . La cadena VL (Número de Acceso: AAM54058, SEQ 10 NO: 3) del anticuerpo derivado de tití específico de MOG se expresó con una región constante de cadena ligera capa humana (tal como el número de acceso NCBI AAA58989) (SEQ ID N0:4). El DNA que codifica la secuencia de aminoácido de cadena ligera (VL-Capa) se preparó como es descrito en lo anterior para la cadena pesada. Durante la optimización de secuencia de DNA y síntesis de los sitios de enzima de restricción específicos Bsi Wl/i^sr II se incluyeron para permitir la manipulación futura de la región V . Después de la síntesis del gen la secuencia completa que incluye la secuencia Kozak se clonó en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEE12.4 GS (Lonza Biologies) . Para la expresión estable los dos vectores de gen único (pEE6.4-VH-IgG? y pEEl2. -VL-Capa) se combinaron en un vector de gen doble. Esto se hizo al digerir cada uno de la cadena principal pEE6.4 del cásete de expresión de cadena pesada (promotor hCMV-MIE, secuencia Kozak, región constante humana VH de tití, y sitio poliA SV40) utilizando el Notl y BarnHl . El resultante del fragmento se clonó utilizando los sitios Notl y BamHl en el vector pEE!2. -VL-Capa corriente debajo de los casetes de expresión de cadena ligera (promotor hCMV-MIE, secuencia Kozak, VI de tití, región constante Capa humana y sitio poliA SV40) creando un vector que expresa tanto ambas de la cadena pesada y ligera de AV138 (SEQ ID N0s:5 y 6) . Transfección Para cada transfección 175 µl de Lipofectamina 2000 se adicionó a 5 mL de medio Optimem I (Invitrogen Cat Nos. 1 1668-027 y 31985-062) en una cavidad de una placa de 6 cavidades. En una segunda cavidad 70 µl del vector de expresión (70 µg) se adicionó a 5 mL del medio Optimem I. Después de una incubación a temperatura ambiente de 5 minutos, los contenidos de las dos cavidades se mezclaron conjuntamente y se dejaron durante 20 minutos de incubación adicionales. Después de esta segunda incubación, la mezcla de transfección completa se adicionó a un matraz de cultivo de tejido T175 que contiene las células CH0K1SV. Las células se incubaron durante 72 a 96 horas y los sobrenadantes se recolectaron. Los sobrenadantes se centrifugaron a 4000 x g durante 5 minuto para formar en pelotillas, los residuos de células, y fueron esterilizados con filtro a través del tiempo con cartucho de 0.22 µm. Purificación del Anticuerpo El sobrenadante se pasó sobre una columna de HiTrap Protein A (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0402-01) tres veces a un gasto de flujo de 1 mL/min. La columna luego se lavó con fosfato de sodio 20 mM durante 40 mins a 1 mL/m. El anticuerpo se eluyó en ácido cítrico a 0.1 M pH 3.5 con fracciones recolectadas e inmediatamente neutralizadas con Tris-HCl 1 M pH 9.0. Muestras de anticuerpo luego se desalificaron en columna de PD-10 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0851-01) . El análisis del anticuerpo mediante SDS-PAGE y la HPLC de exclusión de tamaño confirmó el peso molecular correcto en la presencia de anticuerpo ensamblado y la concentración de anticuerpo. Análisis del Manchado de Western La habilidad de AB138 para retener el enlace al antígeno M26, MOG de rata (glicoproteína de mielina-oligodendrocito) , se investigó mediante el manchado de Western. 130 mg de médula espinal de rata (IMVS, Australia) se homogeniza en 1.8 ml de Reactivo de Lisis Celular CelLytic M (SIGMA C2978) y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después de la homogenizacíón se realizó al retirar el lisado a través de una aguja de 27 g 1/2 varias veces seguido por la centrifugación a 4°C y 13000 g durante 30 minutos. La pelotilla sobrenadante se diluyó en solución reguladora de muestra SDS-PAGE (Tris-HCl 125 mM pH 6.8, SDS al 5%, azul de bromofenol al 0.25%, glicerol al 25%). Junto con esto 200 µl de células CHOK1SV en 1 X 106 células viable por ml se cuidaron a 13000 x g a 4°C durante 1 minuto y se resuspendieron en 200 µl de Reactivo de Lisis Celular CclLytic M (SIGMA). Después de la centrifugación a 4°C y 13000 x g durante 30 minutos el sobrenadante se mezcló con la cantidad apropiada de solución reguladora de muestra SDS-PAGE. Todas las muestras, junto con una muestra de marcadores de peso molecular, se corrieron sobre un gel de vaciado Novex al 4-20% (Invitrogen, Australia) durante 2 horas a 120 V. Las proteínas luego se transfirieron a PVDF (BioRad, Australia) utilizando un aparato de manchado de Western en solución reguladora de Tris-Glicina 1 X con metanol al 20% (BioRad, Cat 161+-0771) a 4°C en 250 mA durante 2 horas. La membrana luego se bloqueó mediante incubación con 5 % de polvo de leche descremada en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana luego se lavó con 1 X PBS tres veces seguido por una incubación durante la noche a 4°C con AB 138 en PBS en 10 ug/mL. Después del lavado, la membrana de incubó con conjugado Antihumano IgG de cabra (H+L) HRP (Sigma, Australia) diluido 1:5000 in 1 X PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, el anticuerpo enlazado se detectó utilizando el Sistema de Análisis de Manchado de Western ECL (Amersham Biosciences Cat: RPN2109) . Un experimento paralelo se realizó en el cual AB138 se reemplazó con un anticuerpo de control negativo de especificidad irrelevante igualado a un isotipo (anticuerpo monoclonal anti-TNF-a) con el fin de identificar cualquiera de los eventos de enlace no específicos. Resultados Después de la expresión y purificación de proteína exitosa, el análisis de manchado de Western se realizó sobre AB 138 para determinar si retuvo la actividad de enlace a MOG de rata. AB138 enlazó a una proteína con tamaño aproximado de 25 kDa presente en el lisado clarificado de médula espinal de rata, en la proteína no presente en el lisado CH0K1SV clarificada (Figura 1). El anticuerpo de control negativo no enlazó la proteína presente en cualquier lisado indicando la interacción entre AB138 y la proteína de tamaño 25 kDa no fue debido al artefacto o los eventos de enlace no específicos asociados con la región constante humana (Figura 2) . Esta proteína iguala el tamaño esperado de MOG de rata de la secuencia de señal (24.9 kDa) . Este resultado indica que AB138 retuvo la afinidad para MOG de rata presente en el lisado de médula espinal de rata y demuestra que un anticuerpo de fusión humano de tití puede retener la habilidad que enlaza antígeno. Se puede apreciar por alguien experto en la técnica que el MOG de rata podría ser producido utilizando tecnologías de DNA recombinante y la habilidad de AB138 para enlazar MOG de rata determinado en los ensayos de enlace tal como ELISA o el análisis Biacore. EJEMPLO 2 Ingeniería de un anticuerpo monoclonal 1. Terminología Una secuencia donadora se define como cualquier secuencia de inmunoglobulina derivada de una especie diferente a un primate del Nuevo Mundo. Una secuencia aceptora se define como una secuencia de inmunoglobulina derivada de un primate del Nuevo Mundo. Un residuo común es un residuo que es común (por ejemplo >30%) en una posición de aminoácido dada cuando se determina mediante la comparación con secuencias de inmunoglobulina disponible para una especie. Un residuo no común es un residuo que es no común (por ejemplo, =30%) a una posición de aminoácido dada cuando se determina por la comparación con las secuencias de inmunoglobulina disponible para una especie. Ingeniería es el proceso de transferir características de enlace estructurales de una secuencia donadora en una secuencia aceptora tal que las características de enlace estructural mantienen su actividad de enlace. Un aminoácido de estructura se define como un aminoácido localizado en una región variable de anticuerpo pero no localizado en una CDR. 2. Abreviaciones CDR región de determinación de complentariedad, MOG, glicoproteína de mielina/oligodendrocito TNF-a, factor-alfa de necrosis de tumor; VH, cadena pesada variable; V , cadena ligera variable; BSA, albúmina de suero bovino. 3. Proceso de Ingeniería . A. Producción de un anticuerpo monoclonal (diferente de un anticuerpo monoclonal de primate de Nuevo Mundo) . B. Selección de una secuencia de inmunoglobulina aceptora derivada de primate de Nuevo Mundo, sobre la base de alta homología de secuencia de aminoácido y baja inmunogenicidad predicha. C. Identificación de las CDRs para ambas de las secuencias de inmunoglobulina donadora y aceptora de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Ver "Sequences of Proteins of Immunological Interest" E. Kabat y colaboradores, U.S. Department of Health y Human Services, 1983) . D. Determinación de diferencias en la secuencia de estructura mediante la alineación de las secuencias donadora y aceptora. E. Predicción de la estructura de inmunoglobulina donadora mediante la modelación tridimensional y la determinación de proximidad de las diferencias de secuencia de estructura con relación a las CDRs. Sustitución opcional de residuos aceptores con residuos donadores de acuerdo con los criterios de sustitución 1 &2 (enseguida) .

F. Sustitución de las secuencias CDR aceptoras completas con la secuencia CDR donadora completas. G. Determinación de residuos comunes mediante la comparación de la secuencia de aminoácido de estructura donadora/aceptora de la línea germinal y la secuencia de estructura de inmunoglobulina aceptoras disponibles. La sustitución opcional de residuos aceptores con 'residuos donadores de acuerdo con los criterios de sustitución 3 & 4 (enseguida) . H. Producción de un anticuerpo quimérico con regiones variables aceptoras y regiones constantes humanas. I. Expresión de proteína de inmunoblogulina diseñada. J. Análisis de ensayo de la proteína de inmunoglobulina diseñada . Criterio de sustitución: En la generación de un anticuerpo diseñado basado en las diferencias en las secuencias de estructura, las sustituciones de un aminoácido aceptor con el aminoácido donador correspondiente se puede hacer en posiciones que caen en los siguientes criterios: i) .si el residuo donador se predice capaz de interactuar con el antígeno basado en la modelación tridimensional; (ii) si el residuo donador se determina que se encuentra dentro de 3.2 Á de las CDRs donadoras basado en la modelación tridimensional; (iii) si el residuo donador es uno común en las secuencias de inmunoglobulina de especies aceptoras; (iv) si el residuo donador es no común en la línea germinal donadora. El anticuerpo diseñado se predice que es no inmunogénico o de baja inmunogenicidad en humanos al seleccionar secuencias aceptoras apropiadas basado en la homología de secuencia de aminoácidos con secuencias humanas equivalentes y baja inmunogenicidad predicha. El anticuerpo diseñado enlazará al antígeno de la inmunoglobulina donadora con una afinidad de enlace similar a la inmunoglobulina donadora. La afinidad de enlace del anticuerpo diseñado puede ser además incrementado por métodos de maduración de afinidad (R.A. Irving y colaboradores, Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)). LA INGENIERÍA DEL ANTICUERPO DE MURINO AB164 PARA PRODUCIR ANTICUERPO AB197 4. Secuencias de inmunoglobulina donadoras La producción de un hibridoma de murino que secreta un anticuerpo monoclonal AB164 contra TNF-a humano se produjo utilizando la tecnología de hibridoma y sirvió como las secuencias de inmunoglobulina donadoras (SEQ ID NOs : 7 y 8) .

. Selección de secuencias de inmunoglobulina aceptoras La secuencia de un anticuerpo monoclonal contra MOG de rata (mielina/glucoproteína de oligodendrocito) se obtuvo de (http : //www. ncbi.nlm.nih.gov/) y se utilizó como la secuencia aceptora. Este anticuerpo monoclonal se derivó de un tití común (tití de oreja blanca) { Calli thrix jacchus) , un primate del Nuevo Mundo. Las regiones de estructura de la cadena VH (Número de Acceso: AAM54057, SEQ ID N0:1) y la cadena VL (Número de Acceso: AAM54058, SEQ ID No: 3) se examinaron para su inmunogenicidad predicha en humanos mediante el programa de predicción de enlace de MHC clase II Propred (http: //www. imtech. res . in/raghava/propred) utilizando un análisis de valor de umbral de 1% de todos los alelos. Un análisis BLAST de la secuencia, excluyendo CDRs, de la cadena VH (Número de Acceso: AAM54057, SEQ TD N0:1) y la cadena VL (Número de Acceso: ?AM54058, SEQ ID No: 3) del anticuerpo específico de MOG identificó la secuencia de cadena pesada homologa humana más cercana (Número de Acceso: AAH19337.1; SEQ ID NO: 9) y la secuencia de cadena ligera (Número de Acceso: BAC53922.1; SEQ ID NO:10). Notablemente, este análisis de predicción indica que la región de estructura variable de cadena pesada aceptora seleccionada es probable que sea menos inmunogénica que su equivalente humano. La región de variable de cadena pesada aceptora tiene un péptido en la estructura, LRPEDTAVY, que se predice que enlaza MHC clase II codificado por los alelos DRB1_0101, DRB1_0102, DRBl_03O9. Mientras que la cadena pesada homologa humana más cercana tiene tres, péptidos, en la estructura, que se predijeron que enlaza MHC clase II. Esto incluyó el péptido WVRQAPGQGL que se predice que enlaza MHC clase II' codificado por los alelos DRB1_0101, DRB1_0102 y DRB1_0309; el péptido VYMELTS que se predice que enlaza MHC clase II codificado por los alelos DRB1_0401, DRBI_0408, DRB1_0421, DRB1_0426, DRB1_1101, DRB1-1128, DRB1_1305; y el péptido LRSEDTAVY, que se predice que enlaza MHC clase II codificado por los alelos DRB1_0401, DRB1_0421, DRB1_0426. La región de estructura variable de cadena ligera específica de MOG y el homólogo humano más cercano se predijeron que son no inmunogénicos. 6. Identificación de las CDRs en las regiones variables donadoras/aceptoras . Utilizando las reglas de Kabat (Ver "Sequences of Proteins of Inmunological Interest" E. Kabat y colaboradores, U.S. Department of Health y Human Services, 1983) las CDRs se determinaron para las cadenas VH y VL de AB164 (SEQ ID NOs : 7 y 8 respectivamente) y para las cadenas VH y VL de la inmunoglobulina específica de MOG de tití (SEQ ID No : 1 y 3 respectivamente) (Tabla 1).

Tabla 1 : Posiciones de aminoácido para las CDRs de las cadenas VH y VL de AB164 (SEQ ID NOs : 7 y 8) e inmunoglobulina específica de MOG (SEQ ID NOs : 1 y 3) 7. Alineación ' de secuencias donadoras y aceptoras Alineación de cadena VH Las secuencias de aminoácidos para las cadenas VH de AB164 e inmunoglobulina específica de MOG (SEQ ID Nos : 7 y 1) se alinearon (Figura 3) . El número de residuos difiere por uno con un aminoácido extra localizado en la CDR3 de la cadena VH de inmunoglobulina específica de MOG. La identidad de secuencia entre las dos secuencias es 63.6%. Las secuencias de aminoácido de los CDRs difiere como es esperado dadas las especificidades de antígenos diferentes de anticuerpos donadores y aceptores. Hay 22 aminoácidos de diferencias entre las secuencias de las regiones de estructura . Alineación de Cadena VL El aminoácido para las cadenas VL de AB164 e inmunoglobulina específica de MOG (SEQ ID No: 8 y 3) se alinearon (Figura 4). El número de residuos difiere por cuatro aminoácidos adicionales localizados en la CDRl de AB164. La identidad de secuencia entre las dos secuencias es 62.3%. Las secuencias de aminoácidos de los CDRs difiere como es esperado dado las diferentes especificidades de antígeno de anticuerpo donadores y aceptores. Hay 23 aminoácidos de diferencias entre las secuencias en las regiones de estructura . 8. Modelación tridimensional predicha de las cadenas VH y VL de AB164 Utilizando el software de modelación de predicción tridimensional SWISS-PROT y Deep View (http: //swissmodel . expasy .org/) se determinó un modelo tridimensional de las cadenas VH y VL de AB164. Las CDRs se identificaron. Las diferencias de aminoácido entre las secuencias donadoras y aceptoras en la región de estructura, como es determinado por la alineación previamente descrita, se identificaron y se hizo una predicción sobre su proximidad a las CDRs (Tablas 3 y 4). 9. Sustitución de CDRs aceptoras con CDRS donadoras Las CDRs de las cadenas VH y VL de inmunoglobulina específica de MOG se reemplazaron con CDRs de las cadenas VH y VL de AB164 (Tabla 2) Tabla 2 : El reemplazo de las CDRs de la secuencia aceptora (inmunoglobulina específica de MOG) con las CDRs de la secuencia aceptora (AB164) 10. Determinación de los residuos comunes en las secuencias Ig de línea germinal de murino y de tití y selección de secuencia de estructura diseñada Cadena VH La alineación de línea germinal de murino de la región VH se puede encontrar en http://www.ibt.unam.mx/vir/vh mice directory . html#GL Las secuencias VH de tití se pueden obtener de http : //www . ncbi . nlm. nih . gov/entrez/querv. fcgi?dh:=Protein&itoo l=toolbar mediante la búsqueda para todas las secuencias de aminoácido VH de Ca tli thrix jacchux y la alineación de estas secuencias.

Utilizando herramientas de alineación de residuos comunes en ambas de las líneas germinales de murino y las secuencias de Calli thrix ja cchus disponibles se determinaron en cada posición de aminoácidos donde una diferencia de aminoácidos en la secuencia de estructura entre la secuencia donadora y aceptora ocurrió (Tabla 3) Tabla 3: Diferencias de estructura de VH en la secuencia donadora/aceptora , su proximidad a la CDRs y sus residuos comunes relativos en las especies donadoras/aceptoras. Una determinación de los residuos comunes de cada posición en la línea germinal de murino respectiva y las secuencias de VH de tití disponibles se realizó. En posiciones seleccionadas que cumplieron con un criterio particular del aminoácido aceptor se reemplazó con un aminoácido donador y el número de ese criterio es dado; 1. si el residuo donador se predice capaz de interactuar con el antígeno basado en la modelación tridimensional ; 2. si el residuo donador se determina que se encuentra dentro de 3.2 A de la CDRS donadora basada en la modelación tridimensional; 3. si el residuo donador es un residuo común en las secuencias de inmunoglobulina específica de aceptor; . si el residuo donador es no común en la línea germinal donadora.

En las posiciones que no logran los criterios de la secuencia donadora se utilizó y los criterios listados como Ninguno . Nota: Residuos no comunes son compartidos en gris y las sustituciones están en negritas. *La línea germinal de murino no contiene datos de secuencia en la posición 113 y como tal secuencia de tití se utilizó aquí. En resumen, hubo 8 sustituciones de aminoácido de estructura en las cuales la secuencia aceptora se reemplazo con secuencia donadora. Hubo cuatro aminoácidos en los cuales la secuencia aceptora se sustituyó con la secuencia donadora debido a que el residuo donador se determinó que se encuentra dentro de 3.2 Á de las CDRs donadoras, basado en la modelación tridimensional. Dos sustituciones de aminoácido se hicieron debido a que los residuos donadoras se predijeron capaces de interactuar con el antígeno que es localizado sobre la vuelta de un circuito que está en estrecha proximidad (aunque no menor que 3.2 Á) con CDR-2. Además, dos sustituciones de aminoácidos se hicieron debido a que el residuo donador se encontró que es común en las especies aceptoras de las secuencias de inmunoglobulina disponible. Un cambio adicional también podría ser hecho en la posición 97. Cadena V La alineación de línea germinal de murino de las regiones V se pueden encontrar en http://www.ihLunam.mx/vir/vk roice directory . html#GLvk Las secuencias VL de tití se pueden obtener de http: //www. pcbi . nlm. nih. gov/entrez/query . fegi?db=Protein&itoo l=toolbar al buscar para todas las secuencias de aminoácidos de Calli thrix j a cchus y la alineación de estas secuencias. Utilizando las herramientas de alineación los residuos comunes en la línea germinal de murino en las secuencias de inmunoglobulina de titi disponibles se determinaron de cada posición de aminoácido con relación a las diferencias de aminoácidos en la secuencia de estructura entre la secuencia donadora y aceptora (Tabla 4) .

Tabla 4 : Diferencias de estructura de VL en la secuencia donadora/aceptora, su proximidad a las CDRs y sus residuos comunes relativos en las especies donadoras/aceptoras. Una determinación de los residuos comunes de cada posición en la secuencia línea germinal de murino respectiva y las secuencias de VL de tití disponibles se realizó. En cada posición los criterios para seleccionar diferencias en las secuencias de estructura dadas en lo anterior se aplicó. En una posición que cumplió con un criterio particular el aminoácido aceptor se reemplazó con un aminoácido donador y el número de ese criterio se da enseguida: 1. si el residuo donador se predice capaz de interactuar con el antígeno basado en la modelación tridimensional; 2. si el residuo donador se determina que se encuentra dentro de 3.2 Á de la CDRs donadoras basada en la modelación tridimensional; 3. si el residuo donador es un residuo común en las secuencias de inmunoglobulina de especies aceptoras; 4. si el residuo donador es no común en la línea germinal donadora. En las posiciones que no logran los criterios la secuencia aceptora se utilizó y los criterios se listan como Ninguno . Nota: Residuos no comunes son compartidos en gris y las sustituciones están en negritas. *La línea germinal de murino no contiene datos de secuencia en la posición 104 y más allá y como tal se utilizó aquí la secuencia de tití. En resumen, hubo 1 sustitución de aminoácido de estructura en la cual la secuencia aceptora se reemplazo con la secuencia donadora a medida que el resido donador se determinó que se encuentra dentro de 3.2 Á de la CDRs donadora basado en la modelación tridimensional. MATERIALES Y MÉTODOS El hibridoma AB164 se generó mediante la fusión de esplenocitos de ratones inmunizados con TNF-a humano, con la línea de célula de mieloma SP2/0-Agl4 mediante métodos estándares (Fazekas de St . Groth, S., y colaboradores, Journal of Immunological Methods 35: 1-21 (1980); Sugasawara, R., Journal of Tissue Culture Methods 12: 93-95 (1989)). 11. Secuenciación de anticuerpo monoclonal AB164 RNA total (tRNA) se extrajo de 1 x lO7 a 1 x 108 células viables utilizando las columnas de RNeasy Mini o Midi (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la cuantificación, el tRNA se utilizó como una plantilla para la síntesis de cDNA de primera hebra utilizando un cebador oligo (dT) y la Transcriptasa Inversa Superscript II (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente el tRNA se degradó utilizando RNasa H y el cDNA de una sola hebra restante se marcó con un extremo poli-G utilizando transferasa terminal y dGTP (Roche) . Las reacciones de PCR se realizaron utilizando Herculase (Stratagene), una mezcla de polimerasa de alta fidelidad. En cada caso un oligo (dC) se utilizó como el cebador delantero con una cadena pesada IgGi específica o una cadena ligera Kappa específica del cebador trasero. Después de 30 ciclos de reacciones de PCR se incubaron en la presencia de Taq de polimerasa para adicionar bases A colgantes. El producto PCR resultante luego se clonó en pGcmT-Easy (Promega) y se transformó en células de E. coli Top 10 competente (Invitrogen). Los plásmidos se extrajeron del cultivo durante la noche de colonias individuales utilizando las columnas QIAquick Miniprep (QIAgen) y se cuantificaron. 100 a 500 ng se mezclaron por duplicado con 6.4 pmol de ya sea pUC3 delantero o cebador pUC3 trasero y se sometieron a la secuenciación de ciclos utilizando la química de BigDye v3.1 (AppliedBiosystems) . Los Electrofotoretrogramos se resolvieron en el Analizador de DNA ABI PRISM 3700 y después de la alineación de secuencias derivadas, se realizó la corrección manual de los callos de base aberrantes. Una vez de cuatro secuencias de igualación (2 delanteros y 2 traseros) se obtuvieron la secuencia de los anticuerpos se confirmó la región variable. Estas secuencias luego se tradujeron en secuencias de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera de AB164 (SEQ ID NOS : 7 y 8) 12. Creación de AB138 (región variable derivada de tití específica de MOG-quimera de región humana) y AB103 (región variable de murino anti-TNFa quimera de región constante humana) La región VH (Número de Acceso: AAM54057, SEQ ID No:l) de la secuencia aceptora se expresó con una región constante humana (CH de cadena pesada de IgGI humana, articulación, dominio CH2 & CH3 tal como el número de acceso de NCBI P01857) (SEQ ID No:2). La región VL. (Número de Acceso: AAM54058, SEQ ID No: 3) de la secuencia aceptora se expresó con un dominio constante de cadena ligera capa humana (tal como el número de acceso NCBI : AAA58989) (SEQ ID No: 4), El anticuerpo quimérico resultante se designó AB138 (SEQ ID NOs : 5 y 6) . Este anticuerpo se utilizó como una plantilla en la cual se hicieron las alteraciones en las cadenas VH y VL. Las regiones VH y VL de AB164 de murino completo (SEQ ID No : 7 y 8) se expresaron con las mismas regiones constantes humanas como es descrito en lo anterior. Este anticuerpo quimérico se le dio la designación AB103. Clonación de AB103 Las regiones VH y VL del AB164 completamente murino (SEQ ID No: 7 y 8) se tradujeron nuevamente en secuencias de DNA que se optimizaron para la expresión de célula mamífera utilizando la tecnología GeneOptimizer y se sintetizaron de novo mediante el ensamble de oligonucleótidos sintéticos (GeneArt, Alemania). Para el gen VH cada secuencia se flanqueó en el extremo 5' y el sitio Ascl , una secuencia Kozak (GCCACC) y una secuencia guía gamma IgG humana (secuencia de aminoácido MEWS VFLFFLSVTTGVHS) . En el extremo 3' la secuencia DNA se manipuló para introducir el sitio de enzima de restricción Tth 1111 sin comprometer la secuencia de aminoácido requerida. Para el gen V cada secuencia se flanquea en el extremo 5' con un sitio Bsi Wl, una secuencia Kozak (GCCACC) y una secuencia guía Kappa humana (secuencia de aminoácido MSVPTQVLGLLLLWLTDARC) . En el extremo 3' la secuencia de DNA se manipuló para introducir un sitio de enzima de restricción Rsr II sin comprometer la secuencia de aminoácido requerida. Después de la síntesis del gen de novo, las regiones variables se proporcionaron clonadas en un vector pCRScript (Stratagene) y se liberaron mediante Ase 1/ Tth lili y Bsi Vil /Rsr II digestión para la secuencia VH y VL respectivamente. Las secuencias liberadas se ligaron en cadenas principales de vector de gen únicas derivadas de los vectores creados para expresar AB138 preparado mediante Ase I I Tth lili para PEE6. -VH-IgGI y Bsi Vll /Rsr II para la digestión de pEE12. -VL-Kappa . Cada gen se ligó en la cadena principal preparada utilizando el Sistema de Ligación de DNA Rápido LigaFast de Promega Rapid DNA de Promega (Cat No. M8221) . Las ligaciones luego se transformaron en One Shot Top 10 (células químicamente competentes (Invitrogen Cat No. C4040-03) y las colonias positivas se identificaron mediante técnicas estándares. Un vector de gen doble para expresión estable se preparó como se resumió en lo anterior (Ejemplo 1) . Cantidades grandes de los vectores resultantes se prepararon mediante midiprep de cultivos durante la noche utilizando columnas midiprep QIAfilter (QIAgen Cat No. 12243). Los vectores se prepararon para la transfección al precipitar 20 µg en etanol al 100% con 1/10 volumen de acetato de sodio 3M (pH 5.2) (Sigma Cat Nos. E7023-500ML y S2889 respectivamente) . Después de un lavado en etanol al 70% los vectores se resuspendieron en 40 µl de T.E. pH 8.0 (Sigma Cat No. T9285-100 ML) a una concentración de trabajo de 0.5 µg/µl. 13. Creación del anticuerpo monoclonal diseñado AB197 Utilizando la inmunoglobulina específica de MOG como una secuencia aceptora y al reemplazar la CDRs y los residuos nominados en la' estructura con aquellos de la secuencia donadora (AB164), se determinaron las secuencias de anticuerpo VH y V diseñadas. Estas secuencias de proteína de región variable se expresaron con regiones constantes humanas (SEQ ID NOs : 2 y 4). El anticuerpo diseñado resultante se designó AB197 (SEQ ID NOs: 11 y 12). La Tabla 5 describe el origen de especie de la CDRs, estructura de VH/VL y las regiones constantes para cada anticuerpo Tabla 5: Origen de especies de la CDRs, estructura de VH/VL, y las regiones constantes para AB138, AB164, AB197, AB103 Clonación de AB197 Al reemplazar las CDRS y los residuos nominados en la estructura de la secuencia aceptora con aquellos de la secuencia donadora, las secuencias de anticuerpo VH y V diseñadas se determinaron (SEQ ID Nos: 11 y 12). La secuencia de anticuerpo se tradujo nuevamente en secuencias de DNA y se sintetizó de novo mediante el ensamble de oligonucleótidos sintéticos (GeneArt, Alemania). Durante la síntesis los sitios de enzima de restricción relevante se incorporaron en la secuencia para permitir la clonación de la generación de un vector del gen doble que expresa AB197 como es descrito previamente (Ejemplo 1) . 14. Expresión de AB103, AB197 y ?B164 Transfección de AB103 y AB197 Para cada transfección, 175 µl de Lipofectamma 2000 se adicionó 5 mL del medio Optimem I (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 y 31985-062) en una cava dad de una placa de 6 cavidades. En una segunda cavidad 70 µl del vector de expresión (70 µg) se adiciono a 5 mL del medio Optimen I. Después de una incubación a temperatura ambiente de 5 minutos, los contenidos de las dos cavidades se mezclaron conjuntamente y se dejaron durante 20 minutos adicionales de incubación. Después de esta segunda incubación, la mezcla de transfección completa se adicionó a un matraz de cultivo de tejido T175 que contiene las células CHOK1SV. Las células se incubaron durante 72 a 96 horas y los sobrenadantes se recolectaron. Los sobrenadantes se centrifugaron a 4,000 x g durante 5 minutos para formar en pelotillas los residuos similares, y se estilizaron en filtro a través del filtro de cartucho de 0.22 µm. Producción de anticuerpo monoclonal de murino AB164 Las células de hibridoma que expresan AB164 se cultivaron utilizando métodos de cultivo de tejido estándares y el sobrenadante se recolectó y se centrifugó a 4,000 x g durante 5 minutos para formar en pelotillas los residuos celulares seguidos por la esterilización del filtro a través del filtro de cartucho 0.22 µm. Purificación del Anticuerpo AB103, AB197 y AB164 El sobrenadante se pasó sobre una columna de Proteína A HiTrap (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0402-01) tres veces a un gasto de flujo de 1 mL/min. La columna luego se lavó con fosfato de sodio 20 mM durante 40 mins a 1 mL/min. El anticuerpo se eluyó con ácido cítrico 0.1 M pH 3.5 con las fracciones recolectadas e inmediatamente neutralizada con Tris-HCl 1 M pH 9.0. Las muestras de anticuerpo luego se desalificaron en una columna PD-10 (Amersham Biosciences, Cat No: 17-0851-01) . El análisis del anticuerpo mediante SDS-PAGE y la HPLC de exclusión de tamaño confirmó el peso molecular, la presencia de anticuerpo ensamblado y la concentración de anticuerpo . 15. Ensayos de enlace de afinidad Métodos Métodos de ELISA TNF-a (Peprotech Cat No:300-01A) se diluyó a 1 µg/mL en solución reguladora de recubrimiento de carbonato (fosfato de disodio 10 mM) , hidrógeno fosfato de sodio 20 mM pH 9.6) . 100 µL de esta solución se adicionó a cada cavidad y a una placa de 96 cavidades y se incubó a 4°C durante la noche en un contenedor humidificado . La placa luego se lavó tres veces con solución reguladora de lavado (PBS 0.01 M pH 7.2, Tween-20 0.05%) y luego tres veces con PBS 0.01 M pH 7.2. Las cavidades luego se bloquearon al adicionar 200 µL de solución reguladora de bloqueo (BSA al 1% p/v en PBS 0.01 M pH 7.2) a cada cavidad y al incubar la placa a 25°C, en un contenedor humidificado, durante 1 hora. El anticuerpo se diluyó en diluyente de anticuerpo (BSA al 1% p/v, Tween-20 al 0.05% en PBS 0.01 M pH 7.2) suficiente para generar una curva de trituración que cubre los intervalos 6.00 µg/mL a 0.0578 ng/mL. Las cavidades se incubaron con anticuerpo durante 1 hora a 25°C. La placa luego se lavó como es descrito previamente. 100 µL de conjugado Anti-IgG H + L anticuerpo HRP (Zymed, Cat No:81-71200) en 1:2000 en diluyente de anticuerpo se utilizó para detectar el AB197 enlazado y AB103. 100 µL de conjugado HRP de anticuerpo de inmunoglobulina Anti murino (Dako, Cat No:P0260) en 1:2000 en diluyente de anticuerpo se utilizó para detectar el AB164 enlazado. Las cavidades con diluyente anticuerpo solamente se utilizaron para medir la absorbencia antecedente. Después de la incubación a 25°C, en un contenedor humidificado, durante 1 hora la placa se lavó nuevamente como es descrito previamente. 100 µL de solución de sustrato de TMB (Zymed, Cat No: 00-2023) se adicionó a cada cavidad y el color se permitió revelar durante 4 min. 100 µL of HCl I M se adicionó para terminar la reacción de revelado de -color y la absorbencia se determinó a 450 nm (ref . 620 nm) Resultados de ELISA ELISA se utilizó para comparar el enlace de AB164, AB197 y AB103 a TNF-a de cubierta a la fase sólida. A partir de estos resultados todos los anticuerpos exhibieron enlace fuerte para el TNF-a con todos los valores EC50 menor o igual a 0.68 µg/ml (Figura 5, Tabla 6) . El reemplazo de una región constante de murino (AB164) con la región constante de IgGi (AB103) no disminuyó significativamente la afinidad de enlace como se puede observar al comparar los perfiles de enlace de los anticuerpos AB164 y AB103. La ingeniería de AB164 para producir AB197 no dio por resultado ninguna pérdida significante del enlace de TNF-a, como se puede observar mediante la comparación de los perfiles de enlace de los anticuerpos AB164 y AB197. (Figura 5) Tabla 6 Ensayo de neutralización de citotoxicidad de TNF-a utilizando el método de células vivas (ensayo de neutralización de L929) Células L929 (ATCC No: CCH) se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen Cat No: 21870-076) que contiene suero bovino fetal al 10%, 50 µg/mL de Penicilina/Estreptomicina (Sigma Cat No: P0781), L-glutamina 2 mM (Invitrogen Cat No: 25030- 081) y 2-mercaptoetanol 10 µM (Invitrogen Cat No: 21985-023) las células alcanzaron un nivel de 70% de confluencia. Cada cavidad de la placa de cultivo de tejido de 96 cavidades se adicionó 50 µL del medio. Para investigar la citotoxicidad 'de TNF-a sobre las células L929, 50 µL de solución de trabajo de TNF-a por cavidad (30 ng/mL) se adicionó a la primera columna de la placa por triplicado con diluciones semilogarítmicas en serie realizadas a través de la placa a alcanzar una concentración final de 9 fg/mL. Las cavidades de control con 50 µL de medio sin TNF-a también se prepararon (V=100%) . A todas las cavidades 50 µL de la célula L929 en 5 X 10"5 células/mL se adicionó. Las cavidades de control adicionales también se prepararon conteniendo 100 µL del medio sin células adicionales o TNF-a (fondo) . A todas las cavidades se adicionó Actinomicina D (Sigma Cat No: A1410) a 40 µg/mL. Para investigar la neutralización mediante anticuerpos diseñados contra TNF-a se realizó un ensayo de neutralización, 23 µL de anticuerpo en 10 µg/mL se adicionó a la primera columna de una placa separada por triplicado y en diluciones logarítmicas en serie se realizaron a través de la placa alcanzando una concentración final de 30.4 pg/mL. A estas cavidades 50 µL de células L-929 en 5 X 10"5 células/mL se adicionó. Se adicionó 25 µL adicionales de Actinomicina-D a todas las cavidades. Todas las placas se incubaron a 37 °C con C02 al 5% durante 20 horas. Después de la incubación 25 uL de MTS/PES CellTiter 96 AQucous One Solution Reagent (Promega Cat No: G358B) se adicionó a todas las cavidades y se incubó durante 2 horas a 37°C. La absorbencia se leyó en 492 nm (ref. 630 nm) utilizando un lector de placa de ELISA. La absorbencia promedio de todos los tratamientos replicados se sustrajo de la absorbencia promedio de las cavidades y células y de control en TNF (fondo) . A partir de esto, el % de viabilidad de las células L-929 se calculó como: A492 cavidades experimentales % Viabilidad = xlOO A492 V= 100% viable El ensayo de neutralización de citotoxicidad de TNF-a utilizando células vivas (ensayo de neutralización de L-929) da por resultado AB164, AB197 y AB103 que fueron capaces de neutralizar la citotoxicidad inducida por TNF-a (Figura 6, Tabla 7) .

Tabla 7 Será apreciado por personas expertas en la técnica que numerosas variaciones y/o modificaciones se pueden hacer a la invención como es mostrado en las modalidades específicas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como es descrita ampliamente. Las presentes modalidades, por lo tanto se van a considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo que tiene una región variable, caracterizado porque comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura', en donde las regiones de estructura son, o son derivadas de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo, y en donde por lo menos una de las CDRs es una CDR de primate no del Nuevo Mundo.
2. 2. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable comprende tres CDRs y cuatro regiones de estructura.
3. 3. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR de murino.
4. 4. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR de ratón.
5. 5. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR de rata.
6. 6. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR humana.
7. 7. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR sintética.
8. 8. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la región variable comprende por lo menos una secuencia de CDR de conejo.
9. 9. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la región variable comprende una combinación de CDRs de diferentes fuentes.
10. 10. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la región variable comprende 3 secuencias de CDR de murino.
11. 11. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las 3 secuencias de CDR de murino son secuencias de CDR de ratón.
12. 12. Un anticuerpo o fracción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la región variable comprende 3 secuencias de CDR humano.
13. 13. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la región variable comprende 4 secuencias de estructura de primate del Nuevo Mundo.
14. 14. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la región variable comprende 4 regiones de estructura en las cuales las regiones de estructura son derivadas de regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo.
15. 15. Un anticuerpo o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la porción que enlaza antígeno es un anticuerpo de dominio.
16. 16. Un anticuerpo o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el anticuerpo o porción que enlaza antígeno además comprende una secuencia de región constante de primate del Viejo Mundo humano o no humano.
17. 17. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque las regiones de estructura de primate del Nuevo Mundo son de un primate del Nuevo Mundo seleccionado del grupo que consiste de titís, tamarinos, mono ardilla, mono tití, mono araña, mono lanudo, capuchino, uakaris, sakis, mono nocturno o transnochador y el mono aullador.
18. 18. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el primate del Nuevo Mundo es un tití.
19. 19. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el anticuerpo o porción que enlaza antígeno se enlaza a un antígeno que es péptido, proteína, carbohidrato, glucoproteína, lípido o glucolípido en naturaleza, seleccionado de un antígeno asociado con tumor que incluye antígeno carcinoembriónico, EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA, CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL y receptores de VBGF, un antígeno involucrado en enfermedad o desorden inmune o inflamatorio que incluye CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC clase I, MHC clase II, GM-CSF, interferona-?, IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-a e IgE, un antígeno expresado sobre una célula hospedera que incluye glucoproteína Ilb/IIIa, P-glucoproteína, receptores purinérgicos y receptores de adhesión que incluyen CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD56, CD58, CD62 o CD144, un antígeno que comprende una citoquina, quimioquina, factor de crecimiento u otro modulador fisiológico soluble o un receptor del mismo que incluye eotaxina, IL-6, IL-8, TGF-ß, C3a, C5a, VEGF, NGF y sus receptores, un antígeno involucrado en enfermedades o desórdenes del sistema nervioso central que incluyen ß-amiloides y priones, un antígeno de origen no humano tal como antígenos o toxinas microbianas, nanobiales o virales que incluye proteína F de virus sincitial respiratorio, toxina de ántrax, veneno de víbora y digoxina; en donde el anticuerpo quimérico actúa como un agonista o antagonista que es activo ya sea para agotar (exterminar o eliminar) células indeseadas (por ejemplo, anti-CD4) al actuar con complemento, o células exterminadoras (por ejemplo, células NK) o es activo como un agente citotóxico o para causar enlace de receptor Fc por un fagocito o neutraliza la actividad biológica del subcultivo.
20. 20. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el antígeno es TNFa humano.
21. 21. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la secuencia de por lo menos una región de estructura se modifica para incrementar el enlace.
22. 22. Un anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la secuencia de por lo menos una región de estructura se modifica para disminuir la inmunogenicidad predicha en humanos .
23. 23. Un equipo, caracterizado porque comprende un anticuerpo o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, o una composición farmacéutica del mismo, empaquetamiento e instrucciones para el uso.
24. 24. Un anticuerpo de primate del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo, caracterizado porque enlaza un antígeno de superficie celular o una citoquina en donde el anticuerpo o porción gue enlaza antígeno del mismo comprende una región variable que comprende por lo menos dos regiones de determinación de complementariedad (CDRs) y por lo menos tres regiones de estructura, en donde la CDRs se selecciona tal que el anticuerpo o porción se enlaza al antígeno de superficie de célula o a la citoquina.
25. 25. Un anticuerpo de primate del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo como se reclama en la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza a un antígeno de superficie de célula seleccionado del grupo que consiste de CD3, CD20, CD33, EGF-R, Her-2 y CD25.
26. 26. Un anticuerpo de primate del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo como se reclama en la reivindicación 24, caracterizado porque el anticuerpo o porción que enlaza antígeno del mismo se enlaza a TNFa o VEGF.
27. 27. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque la porción que enlaza antígeno es un anticuerpo de dominio .
28. 28. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque el anticuerpo o porción que enlaza antígeno además comprende una secuencia de región constante de primate del Viejo Mundo humano o no humano.
29. 29. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque el primate del Nuevo Mundo se selecciona del grupo que consiste de titís, tamarinos, mono ardilla, mono tití, mono araña, mono lanudo, capuchino, unkaris, sakis, mono nocturno o trasnochador y el mono aullador.
30. 30. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el primate del Nuevo Mundo es un tití.
31. 31. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 'a 30, caracterizado porque la secuencia de por lo menos una región de estructura se modifica para incrementar el enlace.
32. 32. Un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, caracterizado porque la secuencia de por lo menos una región de estructura se modifica para disminuir la inmunogenicidad predicha en humanos .
33. 33. Un equipo, caracterizado porque comprende un anticuerpo del Nuevo Mundo diseñado o una porción que enlaza antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, o una composición farmacéutica del mismo, empaquetamiento e instrucciones para el uso.