KR20140047116A - 신규 항 인간 ngf 항체 - Google Patents
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Abstract
(과제) 높은 중화 활성을 유지하면서 태아에 대한 영향이나 혈전 형성 등의 부작용 리스크를 저감한 안전성이 우수한 항 인간 NGF 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및 상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 이용한 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료 수단의 제공.
(해결 수단) 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
(해결 수단) 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
Description
본 발명은 신규한 항 인간 NGF 항체, 보다 구체적으로는 항 인간 NGF 항체의 Fab' 프래그먼트에 관한 것이다.
신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF)는 신경 영양 인자(neurotrophic factor)라고 총칭되는 액성 인자의 하나이고, 생체 내에서 뉴런의 발생, 분화, 기능 유지에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. NGF의 수용체로서는 고친화성의 trkA 수용체(수용체형 티로신키나아제)와 저친화성의 p75NTR 수용체가 알려져 있다. 이 중 p75NTR은 모든 신경 영양 인자와 결합하고, 뉴런의 발생 과정에서 아폽토시스에 관여하고 있는 것이 보고되어 있지만, 그 역할은 아직 충분히 해명되어 있지 않다. 한편, NGF와 trkA 수용체의 녹 아웃 마우스는 마찬가지의 피노타이프를 나타내는 것이 알려져 있고(비특허문헌 1), NGF의 생리 작용은 주로 trkA 수용체를 통하여 발현한다고 생각되고 있다.
1993년에 래트에 대한 NGF의 투여에 의해 통증이 유발되는 것이 보고되어 있고(비특허문헌 2), 그 후 인간에 대한 NGF의 정맥내 투여에 의해 전신성 근육통을 일으키는 것, 또한 국소 투여에 의해 전신적인 효과에 더하여 주사 부위의 통각과민 및 이질통증을 유발하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한, trkA 수용체의 녹 아웃 마우스에서 통각이 결여되는 것이 보고되어 있고(비특허문헌 4), NGF는 통증의 발현에 강하게 관여하는 분자라고 생각되고 있다. 인간 동통 병태와의 관련성에 대해서는 변형성 관절증(osteoarthritis; OA)의 관절 연골에서 NGF/trkA의 발현이 항진하고 있는 것이나(비특허문헌 6), 류마티스성 관절염(비특허문헌 7)이나 간질성 방광염(비특허문헌 8)의 환자에서 NGF 레벨의 상승이 실증되어 있다.
이들 점으로부터 NGF에 특이적으로 결합하고, 그 작용을 저해하는 활성을 갖는 모노클로날 항체를 개발할 수 있으면, 동통을 비롯한 NGF에 관련하는 각종 질환의 치료, 예방, 진단에 유용할 것으로 기대된다.
현재까지 임상 개발이 진행되고 있는 인간 NGF에 대한 항체로서는 인간화 항 인간 NGF 항체인 타네주맙(Tanezumab)(특허문헌 1) 및 PG110(특허문헌 2), 완전 인간형 항 인간 NGF 항체인 REGN475(특허문헌 3), 플라누맙(Fulranumab)(특허문헌 4), 및 MEDI-578(특허문헌 5)이 보고되어 있다. 그 중에서도 타네주맙은 가장 개발이 선행하고 있어, 그 임상 결과로부터 변형성 관절증에 따른 관절통, 만성 요통, 간질성 방광염에 따른 방광통 등의 동통에 대하여 강력하고 폭넓은 진통 효과를 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9 내지 11).
일반적으로 항체 의약의 유효 투여량을 규정하는 주된 요인으로서는 항체가 갖는 항원에 대한 중화 활성이나 체내에 존재하는 항원의 양을 들 수 있지만, 중화 활성을 향상시키는 것은 투여량의 저감으로 이어지고, 결과적으로 환자의 경제적인 부담이나 의료 비용의 저감에도 이어지는 매우 유익한 개량이라고 말할 수 있다. 또한, 투여량의 저감을 실현할 수 있으면 피하 투여를 행하는 것도 가능해진다. 피하 투여는 일정한 조건을 만족시키면 집에서 자기 주사할 수 있는 최대의 장점을 갖고, 또한 일반적으로 정맥내 투여에서는 대부분의 경우, 일정 시간을 들여 점적 투여되는 데 비하여 피하 투여에서는 볼러스로 투여할 수 있는 점도 유용하여, 의사와 환자 쌍방에 있어서 정맥내 투여 제제와 피하 투여 제제를 선택할 수 있는 것은 바람직한 것이다. 그러나, 일반적으로 피하 투여에서는 1회에 투여할 수 있는 용량이 1mL 정도로 소량이고, 이 액량 중에 약효를 발현하기에 충분한 항체가 포함될 필요가 있다. 또한, 정맥내 투여와는 달리 생체 이용률도 고려해야 한다. 즉, 피하 투여의 제제를 실현하기 위해서는 용해성이 우수하고, 또한 저용량이어도 충분한 약효를 발현하는 항체를 제작하는 것이 요구된다. 따라서, 종래의 항체보다도 NGF에 대한 중화 활성이 보다 높은 항체를 취득하는 것은 NGF에 관련된 질환의 치료 및 그 편리성 향상에 유용하다.
또한, 전술한 바와 같이 NGF는 뉴런의 발달에 중요한 인자이지만, NGF의 기능을 저해하는 의약품의 개발에 있어서는 안전성의 관점에서도 충분한 검토가 필요하다. 특히, 안전성에 관하여 검토해야 할 사항의 하나로서 태아에 대한 영향을 들 수 있다. 현재까지 NGF의 기능 저해에 대하여 NGF 변이가 선천성 무통증의 원인인 것이나(비특허문헌 5), 동물 실험에 있어서 임신 모르모트에 NGF에 대한 자기 항체를 생산시켜 생체 내의 NGF를 저해하면, 출산한 신생 모르모트가 무통 증상을 나타내는 것(비특허문헌 12)이 보고되어 있다. 또한, NGF나 trkA의 결손 마우스를 이용한 시험으로부터도 NGF 작용의 결실에 의해 배의 감각 신경 및 교감 신경의 뉴런의 발달이 저해되는 것이 실증되어 있고(비특허문헌 4 및 13), 이들 점으로부터도 NGF가 발생 초기의 신경 발달에 필수적인 인자인 것이 이해된다. 한편, NGF가 관련된 질환에는 간질성 방광염(환자의 반수 이상이 44세 이하이고, 환자의 90%가 여성(비특허문헌 14)), 만성 요통(평균 연령은 40 내지 50세이고, 환자의 50% 강이 여성(비특허문헌 15 내지 17)), 편두통(15 내지 40세에서 잘 발생하고, 환자의 80%가 여성(비특허문헌 18)) 등, 임신 적령기의 여성에게 높은 비율로 발생하는 질환도 포함된다. 이러한 상황에서 항 NGF 항체를 의약품으로서 개발하는 경우에 임신 중인 여성에 있어서의 태아에 대한 부작용 리스크를 회피하는 것이 매우 중요해진다.
또한, 항 NGF 항체를 의약품으로서 개발하는 경우의 별도의 리스크 요인으로서, 면역 복합체(IC)의 형성을 들 수 있다. 항체와 항원이 결합한 면역 복합체는 통상 비장이나 간장 등의 망내계에서 처리되지만, 면역 이상 등의 병태시나 형성되는 IC 크기가 큰 경우에는 IC가 가용성을 잃어 혈전 형성의 리스크가 높아지는 것 외에, 신사구체에 축적하여 신장염의 발증에 관련한다고 여겨지고 있다. IgG는 2가 항체이지만, 항원이 다가인 경우, IC는 격자 형성(lattice formation)에 의해 여러 가지 크기를 취할 수 있다. IC의 크기는 항체와 항원의 양이나 비, 항체의 친화성 등에 의존하고, 예를 들면 항 VEGF 항체 베바시주맙(Bevacizumab)(상품명: 아바스틴)은 IgG1 항체이고, 이는 이량체의 VEGF와 결합하여 IC를 형성하여 혈전 형성을 유발한다는 보고가 있다. 구체적으로는 인간 FcγRIIα 수용체 Tg 마우스에게 아바스틴과 VEGF를 투여하면 폐동맥 혈전이 형성되는 것이 관찰되고 있다(비특허문헌 19). 또한, 화학 요법과 아바스틴의 치료를 받은 전이성암의 환자는 화학 요법만의 플라세보군과 비교하여 동맥 혈전의 발생률이 높은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 20). NGF도 생체 내에서는 이량체를 형성하여 생리 작용을 발휘하는 점으로부터, 항 NGF 항체의 의약품 개발에 있어서도 IC 형성의 리스크를 회피하여 안전성을 보다 높이는 것이 바람직하다.
이들 점으로부터 높은 중화 활성을 유지하면서 태아에 대한 영향이나 혈전 형성 등의 부작용 리스크를 저감한 안전성이 우수한 항 NGF 항체를 취득하는 것이 NGF에 관련된 각종 질환의 치료 또는 예방에 있어서 매우 중요하다.
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본 발명의 과제는 높은 중화 활성을 유지하면서 태아에 대한 영향이나 혈전 형성 등의 부작용 리스크를 저감한 안전성이 우수한 항 인간 NGF 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 의학상 또는 산업상 유용한 물질·방법으로서 이하의 발명을 포함하는 것이다.
[1] 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
[2] 상기 Fab' 프래그먼트의 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역인 [1]의 Fab' 프래그먼트.
[3] 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역인 [1]의 Fab' 프래그먼트.
[4] 상기 Fab' 프래그먼트의 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역이고, 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역인 [1]의 Fab' 프래그먼트.
[5] 서열 번호 10, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 [1]의 Fab' 프래그먼트.
[6] 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
[8] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
[9] [7] 및/또는 [8]의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[10] [9]의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[11] 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 [10]의 숙주 세포.
(a) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(b) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[12] [10] 또는 [11]의 숙주 세포를 배양하고, 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트를 생산하는 방법.
[13] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트를 포함하는 동통 치료약.
[14] 상기 동통이 변형성 관절증에 따른 관절통인 [13]의 치료약.
[15] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트를 투여하는 공정을 포함하는 동통을 예방 또는 처치하기 위한 방법.
[16] 상기 동통이 변형성 관절증에 따른 관절통인 [15]의 방법.
[17] 동통의 예방 또는 처치에 사용하기 위한 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 Fab' 프래그먼트.
[18] 상기 동통이 변형성 관절증에 따른 관절통인 [17]의 Fab' 프래그먼트.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 이러한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 그 높은 중화 활성에 의해 투여량의 감소, 투여 간격의 확대, 투여 방법의 개선 (예를 들면 피하 주사제) 등의 임상 적용에 있어서의 우수한 개선을 가져옴과 함께, 태아에 대한 영향이나 혈전 형성 등의 부작용 리스크가 저감된 안전성이 매우 우수한 것으로, 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방이나 치료에 있어서 크게 공헌하는 것이다.
도 1은 마우스 콜라겐 유발 관절염 모델의 발바닥에 있어서의 항체 체류량의 경시적 변화를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 기술한다.
본 발명자들은 항 인간 NGF 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트의 제작에 있어서 상당한 예의 검토를 거듭한 결과, 높은 중화 활성을 유지하면서 태아에 대한 영향이나 혈전 형성 등의 부작용 리스크를 저감한 안전성이 우수한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 제작하는 것에 성공하였다.
항체 분자의 기본 구조는 각 클래스 공통으로 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, 클래스마다 특징적인 구조를 갖고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 γ, μ, α, δ, ε쇄라고 불린다. 또한, IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 존재하고, 각각 γ1, γ2, γ3, γ4라고 불리고 있다. 경쇄는 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, L형과 K형의 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는 어떤 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개를 포함하고 있다.
쇄 내 S-S 결합은 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있으며, 아미노산 100 내지 110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프 사이에서 유사하며, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은 동종 동물의 동일 클래스(서브 클래스)로부터의 표품이어도 그 아미노산 서열이 일정하지 않고, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 이보다 C 말단측의 아미노산 서열은 각 클래스 또는 서브 클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은 각각 CH1, CH2, CH3 또는 CL로 표시된다.
항체의 항원 결정 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 의하고 있다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합이라는 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역의 가변성은 어느 쇄에나 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것을 알 수 있고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부르고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인의 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라고 불리고, 이 영역은 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄 사이 S-S 결합을 포함한다. 예를 들면, 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는 중쇄 사이의 S-S 결합을 구성하고 있는 각각 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄 사이 S-S 결합보다도 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되고, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. 항체를 펩신으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄 사이 S-S 결합보다도 C 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되고, F(ab')2 프래그먼트가 생성된다. F(ab')2 프래그먼트는 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄 사이 S-S 결합으로 결합한 이량체 구조의 프래그먼트이다. Fab' 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되고, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄 사이 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, Fab' 프래그먼트는 모두 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는다.
본 발명자들이 제작에 성공한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 이하의 특징을 갖는 Fab' 프래그먼트이다.
서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
구체적으로는 본 발명자들은 인간 모노클로날 항체 개발 기술 「벨록이뮨」(VelocImmune antibody technology; Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항체를 제작하고, 각종 생물학적 활성 시험 및 물성 시험을 이용한 항체의 스크리닝에 의해 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 동정하는 것에 성공하였다. 벨록이뮨 기술에서는 내인성의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 대응하는 인간 가변 영역으로 치환된 트랜스제닉 마우스를 목적의 항원(예를 들면 인간 βNGF)으로 면역한 후, 항체를 발현하는 마우스의 림프계 세포를 취득하고, 마우스 미엘로마 세포와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작한다. 이어서, 이 하이브리도마 세포를 목적의 항원에 특이적으로 결합하고, 원하는 중화 활성을 갖는 항체를 생산하는지 여부에 대하여 스크리닝한다. 여기서 생산되는 항체는 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체(본 명세서 중 키메라 항체라고도 칭함)이다. 이어서, 목적의 항원에 특이적으로 결합하고, 원하는 중화 활성을 갖는 항체가 동정된 경우, 그 하이브리도마 세포로부터 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 단리하고, 그 DNA를 원하는 클래스의 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA에 연결한다. 이와 같이 하여 얻어진 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 세포 내(예를 들면 CHO 세포)에서 발현시켜 항체 분자를 생산한다. 해당 방법에 의해 제작된 항체의 중쇄 및 경쇄는 인간 면역 글로불린 유전자에 유래하는 「완전 인간형」항체의 중쇄 및 경쇄이다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 본원 명세서에 개시되는 그 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보에 기초하여 해당 분야에서 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 그 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인간 항체의 중쇄 정상 영역의 일부분(CH1 도메인과, 힌지 영역 시스테인을 포함하는 힌지 영역의 일부를 포함함) 및 경쇄 정상 영역에 각각 연결하여 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트로서 제작할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 아미노산(서열 번호 6)을 코딩하는 염기 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 유전자 단편, 및 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역 아미노산(서열 번호 4)을 코딩하는 염기 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 제작한다. 그리고, 이 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자를 인간 항체의 적당한 클래스의 중쇄 정상 영역 부분 및 경쇄 정상 영역의 각 유전자와 연결시켜 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트의 유전자를 제작한다. 이어서, 이 유전자를 적당한 발현 벡터에 연결하고, 배양 세포 중에 도입한다. 마지막으로 이 배양 세포를 배양하여 배양 상청으로부터 모노클로날 Fab' 프래그먼트를 얻을 수 있다.
본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산을 코딩하는 유전자 단편은, 예를 들면 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 염기 서열에 기초하여 해당 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는 WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
이어서, 상기한 가변 영역 유전자 단편과 인간 항체의 정상 영역 유전자를 연결시켜 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트 유전자를 제작한다. 인간 항체의 정상 영역은 어떠한 서브 클래스의 정상 영역(예를 들면, 중쇄로서 γ1, γ2, γ3 또는 γ4, 경쇄로서 λ 또는 κ쇄의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있지만, 바람직하게는 중쇄 정상 영역으로서는 인간 Igγ1을, 경쇄 정상 영역으로서는 인간 Igκ를 이용할 수 있다.
이 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트 유전자의 제작에 이어지는, 해당 유전자의 발현 벡터로의 도입, 발현 벡터의 배양 세포로의 도입, 배양 세포의 배양, Fab' 프래그먼트의 정제 등에 대해서는 해당 분야에서 공지된 여러 가지 방법을 사용하여 행할 수 있다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 유전자와 연결되는 발현 벡터로서는 예를 들면 GS 벡터 pEE6.4나 pEE12.4(Lonza Biologics사)를 들 수 있지만, 항체 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않다. 또한, AG-γ1이나 AG-κ(예를 들면 WO94/20632를 참조) 등의 미리 인간 Ig 정상 영역 유전자를 갖는 것을 이용할 수도 있다.
상기한 발현 벡터는 예를 들면 인산칼슘법, 전기 천공법 등에 의해 배양 세포 중에 도입된다.
발현 벡터를 도입하는 배양 세포로서는 예를 들면 CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등의 배양 세포를 사용할 수 있고, 이것을 통상법에 의해 배양하면 된다.
상기 배양 후, 배양 상청 중에 축적된 Fab' 프래그먼트는 각종 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있고, 예를 들면 카파셀렉트(KappaSelect) 등에 의한 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명의 Fab' 프래그먼트는 전술한 바와 같은 재조합 발현법을 이용하여 제작할 수도 있지만, 일단 전장 항체로서 제작한 후에 펩신으로 소화하여 얻어진 F(ab')2 프래그먼트를 2-머캅토에탄올과 같은 환원제로 처리하여 Fab' 프래그먼트로서 제작할 수도 있다.
바람직하게는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 해당 분야에서 공지된 방법을 이용하여 서열 번호 6에 나타나는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA, 및 서열 번호 4에 나타나는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 합성하고, 이들을 적당한 클래스의 인간 항체 정상 영역 유전자, 바람직하게는 중쇄에 대해서는 인간 Igγ1 정상 영역 유전자, 경쇄에 대해서는 인간 Igκ 정상 영역 유전자와 연결하여 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트 유전자를 구축하고, 해당 분야에서 공지된 여러 가지 방법을 이용하여 상기 유전자를 발현 벡터에 도입하고, 상기 발현 벡터를 배양 세포에 도입하여 상기 배양 세포를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 Fab' 프래그먼트를 정제함으로써 용이하게 취득할 수 있다. 바람직하게는 서열 번호 6에 나타나는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA는 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열을 포함한다. 바람직하게는 서열 번호 4에 나타나는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA는 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함한다.
본 명세서 중 「Fab' 프래그먼트」란 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄의 프래그먼트로 구성되는 1가의 항체의 프래그먼트이고, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄-경쇄 사이의 S-S 결합을 구성하고 있는 시스테인 잔기 이외의 적어도 1개의 시스테인 잔기(본 명세서 중 「힌지 영역 시스테인」이라고도 칭함)가 포함된다. 힌지 영역 시스테인은 후술하는 폴리에틸렌글리콜에서의 수식 부위로서 사용할 수 있다. Fab' 프래그먼트 중의 힌지 영역 시스테인의 수는 사용하는 항체의 클래스에 의해 1 내지 수개의 사이에서 상이할 수 있지만, 당업자에 의해 용이하게 조정 가능하다. 예를 들면 인간의 IgG1 클래스(통상 힌지 영역에 있어서 2개의 힌지 영역 시스테인을 가짐)의 Fab' 프래그먼트를 제작하는 경우, 중쇄의 힌지 영역에 있어서 최초의 힌지 영역 시스테인의 코딩 부위와 2번째 힌지 영역 시스테인의 코딩 부위의 사이에 정지 코돈을 삽입함으로써, 힌지 영역 중에 1개의 힌지 영역 시스테인을 갖는 Fab' 프래그먼트를 제작할 수 있고, 2번째 힌지 영역 시스테인의 코딩 부위의 뒤에 정지 코돈을 삽입함으로써, 힌지 영역 중에 2개의 힌지 영역 시스테인을 갖는 Fab' 프래그먼트를 제작할 수 있다.
서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 인간 Igγ1 정상 영역의 부분을 포함하는 본 발명의 바람직한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트는, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이다. 바람직하게는 서열 번호 10, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA는, 서열 번호 9, 서열 번호 13, 또는 서열 번호 15에 나타나는 염기 서열을 포함한다. 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역과 인간 Igκ 정상 영역을 포함하는 본 발명의 바람직한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄는, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다. 바람직하게는 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA는 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 포함한다.
서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트와, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 바람직한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서는, 후술 실시예에 기재되는 완전 인간형 1-15(N52D) 항체 Fab' 프래그먼트를 들 수 있다. 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트와, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 바람직한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서는, 후술 실시예에 기재되는 완전 인간형 1-15(N52D-A) 항체 Fab' 프래그먼트를 들 수 있다. 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트와, 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 본 발명의 바람직한 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서는, 후술 실시예에 기재되는 완전 인간형 1-15(N52D-P) 항체 Fab' 프래그먼트를 들 수 있다.
본 발명은 서열 번호 6의 31 내지 35번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 6의 50 내지 65번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 6의 98 내지 110번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 24 내지 39번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 4의 55 내지 61번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 4의 94 내지 102번째의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트도 포함한다. 이러한 Fab' 프래그먼트도 또한 전술한 바와 같은 절차에 따라 당업자에게 용이하게 제작될 수 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 그 힌지 영역 시스테인을 통하여 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시켜 수식할 수도 있다. Fab' 프래그먼트에의 PEG의 결합은 해당 분야에서 공지된 방법을 사용하여 실시 가능하다(예를 들면 유럽 특허 EP0948544). 본 발명에서는 직쇄 또는 분지쇄의 임의의 평균 분자량의 PEG 또는 그의 유도체가 사용 가능하고, 사용 목적에 따라 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 종양 조직이나 염증 반응시에 있어서는 정상 조직과 비교하여 혈관 투과성이 현저히 항진하고 있어, 도달한 물질은 혈관 밖에 누출하여 종양이나 염증 조직에 축적하는 경향이 있다(EPR 효과). 또한, 분자량이 작은 물질은 혈관에 재흡수되기 쉽고, 분자량이 큰 물질은 재흡수되기 어려운 것도 알려져 있다. 따라서, Fab' 프래그먼트의 병소 조직에서의 체류성을 개선하기 위해서 높은 평균 분자량(예를 들면 약 40000Da)의 PEG를 결합할 수도 있고, 체외에의 빠른 배설이 바람직한 경우에는 낮은 평균 분자량(예를 들면 약 10000Da)의 PEG를 결합할 수도 있다. 또한, 힌지 영역 시스테인에 대한 PEG의 결합을 쉽게 하기 위해서 PEG의 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이 말레이미드와 같은 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체를 사용하고, 힌지 영역 시스테인의 티올기와 말레이미드기를 공유 결합시킬 수 있다. 일반적으로 PEG의 평균 분자량은 약 500Da 내지 약 50000Da이고, 바람직하게는 약 5000Da 내지 약 40000Da이고, 보다 바람직하게는 약 10000Da 내지 약 40000Da의 범위이다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 인간 NGF에 결합한다. 얻어진 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 인간 NGF에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는 ELISA나 FACS 등의 방법이 있다. 예를 들면, ELISA를 이용하는 경우, 인간 βNGF를 ELISA 플레이트에 고정화하고, 이에 대하여 Fab' 프래그먼트를 첨가하여 반응시킨 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소로 표지한 항 카파 항체 등의 이차 항체를 반응시키고, 세정한 후, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들면, HRP 표지의 경우, TMB 발색 시약) 등을 이용한 활성 측정에 의해 이차 항체의 결합을 동정한다. 또한, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트에는 인간 NGF에 더하여 다른 동물 유래의 NGF(예를 들면 마우스 NGF)에도 결합하는 Fab' 프래그먼트도 포함되고, 이들 단백질에 대한 결합 활성을 측정할 수도 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 인간 NGF에 대한 중화 활성을 갖고 있다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 「중화 활성」이란 NGF에 대한 결합에 의해 NGF를 통하여 초래되는 임의의 생물 활성을 저해하는 활성을 의미하고, NGF의 1개 또는 복수의 생물 활성을 지표로 평가할 수 있다. 이러한 중화 활성으로서는 예를 들면 NGF와 그 수용체인 trkA의 결합 저해 활성, NGF-trkA 시그널 매개 세포 내 칼슘 유입 저해 활성, NGF 의존성의 세포 생존 시그널 저해 활성을 들 수 있고, 후술 실시예에 기재되는 바와 같은 방법을 이용함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 효과를 보다 상세하게 평가하기 위해서 생체 내 (in vivo)에서의 시험을 이용할 수도 있다. 예를 들면 후술 실시예에 기재된 바와 같이 마우스 관절염 모델을 이용하는 진통 효과 시험 등을 이용하여 Fab' 프래그먼트의 생체 내에서의 약효를 평가할 수 있고, 또한 병소 이행성 시험을 이용하여 그 병소 조직 체류 효과를 평가할 수도 있다.
또한, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트에 대하여 부작용 리스크를 평가할 수도 있다. 예를 들면, 후술 실시예에 기재되는 바와 같이 임신 중인 동물에 있어서의 Fab' 프래그먼트 투여 후의 태반 통과 시험을 사용함으로써, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트가 태아에게 영향을 미칠 가능성에 대하여 평가할 수 있다. 또한, 후술 실시예에 기재되는 바와 같이 NGF와의 면역 복합체(IC) 형성 시험을 이용하여 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트와 NGF의 사이에서 형성되는 IC의 크기를 측정하고, 혈전 형성을 유발할 가능성에 대하여 평가할 수 있다.
그 외, 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 각종 안정성(예를 들면 열 안정성, 장기 보존 안정성, 고농도 안정성)을 평가하는 방법으로서는, 예를 들면 시차 주사 열량 측정이나 보존 중인 응집체 형성의 측정을 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 필요에 따라 정제된 후, 통상법에 따라 제제화되고, 변형성 관절증에 따른 관절통(OA 동통), 류마티스에 따른 관절통, 암성 동통, 신경인성 동통, 만성 요통, 수술 후 동통, 대상포진 후 신경통, 유통성 당뇨병성 신경 장해, 골절통, 방광통 증후군 등의 동통이나 간질성 방광염, 급성 췌염, 만성 췌염, 자궁 내막증 등의 NGF가 병태 형성에 관련하는 질환의 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 바람직하게는 동통 치료제, 보다 바람직하게는 변형성 관절증에 따른 관절통 치료제로서 이용할 수 있다. 이들 치료제 등의 제형의 예로서는 주사제, 점적용제 등의 비경구제로 할 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 제제화시에는 약학적으로 허용되는 범위에서 이들의 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.
상기 제제화시의 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 첨가량은 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 또는 항체의 결합 역가 등에 따라 다르지만, 예를 들면 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 이용하면 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그것을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 중 어느 하나 또는 양쪽을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에서 본 발명의 Fab' 프래그먼트 또는 그 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 발현하고, 이들 폴리펩티드를 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않다. 예를 들면 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들면 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 발현 벡터는 전술한 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 또는 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 코딩하는 유전자, 또는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자, 및 해당 유전자에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 세균 중에서 본 발명의 Fab' 프래그먼트 또는 그 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia)균인 경우, 예를 들면 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서의 발현용 프로모터로서는 예를 들면 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 바실러스속균에서의 발현용 프로모터로서는 SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 포유 동물 세포 등의 진핵 세포인 경우, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서 세균, 특히 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 더 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈, 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우 인핸서 서열, 본 발명의 Fab' 프래그먼트 또는 그 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있을 수도 있다. 또한, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예를 들면 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 코딩하는 유전자 또는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자가 도입된 형질 전환체를 제공한다. 이러한 형질 전환체는 예를 들면 본 발명의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환함으로써 제작할 수 있다. 형질 전환체의 제작에 이용되는 숙주 세포로서는 상기 발현 벡터에 적합하고, 형질 전환될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들면 세균(에쉐리키아속균, 바실러스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물 세포 또는 곤충 세포(예를 들면 Sf9) 등)가 예시된다. 형질 전환은 자체 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 형질 전환체는 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이거나, 또는 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 형질 전환체는 전술한 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이거나, 또는 전술한 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 코딩하는 유전자 또는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 숙주 세포에 발현시키는 것, 즉 이러한 형질 전환체를 이용하는 것을 포함하는 본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 생산 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 방법에서 사용되는 숙주 세포는 전술한 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이고, 본 발명의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 따로따로 또는 동시에 포함할 수도 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 생산에 있어서 형질 전환체는 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 영양 배지는 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는 예를 들면 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는 예를 들면 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스팁 리커, 펩톤, 카제인, 육엑기스, 대두박, 감자 추출액 등이 예시된다. 또한, 희망에 따라 다른 영양소(예를 들면 무기염(예를 들면 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들면 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 포함하고 있을 수도 있다.
형질 전환체의 배양은 자체 공지된 방법에 의해 행해진다. 배양 조건, 예를 들면 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은 적절하게 선택된다. 예를 들면, 숙주가 동물 세포인 경우, 배지로서는 약 5 내지 20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, Vol.122, p.501, 1952), DMEM 배지(Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967), 199 배지(proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하고, 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 72시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 예를 들면 태아 소 혈청을 포함하는 그레이스(Grace's) 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) 등을 들 수 있고, 그 pH는 약 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 40℃에서 15 내지 100시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들면 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는 pH가 5 내지 8인 배지이다. 숙주가 이.콜라이(E.coli)인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(Miller 등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은 필요에 따라 통기, 교반하면서 통상 14 내지 43℃, 약 3 내지 24시간 행할 수 있다. 숙주가 바실러스(Bacillus)속균인 경우, 필요에 따라 통기, 교반을 하면서 통상 30 내지 40℃, 약 16 내지 96시간 행할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서 예를 들면 버크홀더(Burkholder) 최소 배지(Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980)를 들 수 있고, pH는 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 내지 35℃에서 약 14 내지 144시간 행해지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.
본 발명의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 전술한 바와 같은 형질 전환체를 배양하고, 상기 형질 전환체로부터 회수, 바람직하게는 단리, 정제할 수 있다. 단리, 정제 방법으로서는 예를 들면 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실 아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 대하여 전반적으로 기재하였으나, 더욱 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공하되, 이들은 예시 목적으로 하는 것으로서 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
<실시예>
시판되고 있는 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 대해서는 특별한 언급이 없는 한 첨부의 프로토콜에 따라 실험을 행하였다.
(실시예 1: 벨록이뮨 마우스에 대한 면역)
인간 NGF에 대한 항체를 벨록이뮨 마우스에 면역함으로써 취득하였다. 본 발명자들은 얻어지는 항체의 다양성을 높이기 위해서 복수의 면역 방법, 투여 경로, 아쥬반트, 면역 기간 등을 검토하였다. 면역원로서는 인간 βNGF(R&D System사)를 사용하고, 인간 βNGF를 용해하여 아쥬반트와 혼화한 후에 면역에 사용하는 방법과, 인간 βNGF를 열 변성(0.5% SDS 용액 하, 80℃, 10분 처리)한 후에 아쥬반트와 혼화하여 면역하는 방법을 검토하였다. 투여 경로로서는 족척 투여과 복강 내 투여를 검토하였다. 아쥬반트로서는 타이터맥스 골드(TiterMax Gold)(CytRx Corporation), 완전 프로인트 아쥬반트(Sigma사), 불완전 프로인트 아쥬반트(Sigma사), 및 RIBI 아쥬반트(Corixa Corporation)를 검토하였다. 또한 첨가하는 면역 부활제로서는 CpG 올리고뉴클레오티드와 알루미늄 포스페이트 겔(BRENNTAG사)을 검토하였다. 면역 기간으로서는 3주간 내지 14주간까지 검토하였다. 수회 면역한 후, 마우스 미정맥으로부터 채혈을 행하고, 역가를 모니터함으로써 인간 NGF에 결합하는 항체를 생산하는 벨록이뮨 마우스의 선택을 행하였다.
역가 측정은 이하의 표준적인 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 맥시소프(Maxisorp) 384 플레이트(Nunc사)에 인간 βNGF를 1웰당 10ng 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이트하여 고상화하였다. 다음날, 플레이트를 세정액(TBST: 0.05% Tween-20 함유 트리스 버퍼(TBS))으로 1회 세정 후, 블록킹제(20% Blocking One(나카라이테스크사) 함유 TBST)를 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다. TBST 세정액으로 1회 세정 후, 채혈한 혈액의 희석 계열을 제작하여 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 5% 블록킹 원(Blocking One) 함유 TBST 세정액으로 2000배에 희석한 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지 염소 항마우스 Ig 항체(HRP-goat anti-mouse Ig antibody; Zymed사)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, TBST 세정액으로 3회 세정하였다. TMB 발색 시약(스미토모베이크라이트사)을 첨가하여 실온에서 10분 정치한 후, 정지액(2mol/L 황산)을 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 측정하였다.
(실시예 2: 항 인간 NGF 항체 생산 하이브리도마의 제작)
항체가의 상승을 확인하여 선택한 마우스에게 최종 면역(항원의 정맥내 투여 또는 복강내 투여)을 행하였다. 정법에 따라 면역한 마우스의 비장이나 림프절 등을 적출하여 림프구를 수집하고, 이것을 마우스 미엘로마 세포 SP2/0과 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작하였다. 하이브리도마를 한계 희석하고, 단일 클론으로 한 후, 상청으로부터 프로테인 A 또는 프로테인 G 칼럼(GE헬스케어재팬사)을 이용하여 항체를 정제하였다.
(실시예 3: NGF-trkA 결합 저해 평가)
인간 βNGF(R&D System사)와 EZ-LINK 5-(비오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine)(PIERCE사)을 실온 암소에서 30분 반응시켜 비오틴 표지를 행하고, 탈염 칼럼으로 과잉량의 비오틴을 제거하고, 비오틴 표지 인간 βNGF를 취득하였다. 또한, 제작한 비오틴표지 인간 βNGF에 대해서는 생물 활성이 원래의 인간 βNGF와 동등한 것을 이하의 실시예 6 및 실시예 7에서 확인하였다.
저해 활성을 이하의 방법을 이용하여 측정하였다. 백색 맥시소프 384 플레이트(Nunc사)에 인간 trkA(R&D Systems사)를 1웰당 60ng 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이트하여 고상화하였다. 다음날, 플레이트를 TBST 세정액으로 1회 세정 후, 블록킹제(20% Blocking One(나카라이테스크사) 함유 TBST)를 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 다음으로, 상기에서 제작한 비오틴 표지 인간 βNGF(0.2μg/ml)와 실시예 2에서 얻은 항체를 혼화한 것을 블록킹 후의 trkA 고상 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 알칼리 포스파타아제 표지 스트렙토아비딘(PIERCE사)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이트 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 화학 발광 검출 시약인 APU4(BioFX사)를 첨가하여 그 화학 발광량을 엔비젼(EnVision) 카운터(퍼킨엘머사)로 측정하였다.
(실시예 4: 종 교차성 평가)
항체가 마우스 βNGF에 대하여 교차성을 갖는 경우, 해당 항체를 이용하여 마우스 병태 모델에서의 약효 평가를 행하는 것이 가능해진다. 따라서, 실시예 3의 방법에 있어서 마우스 βNGF(R&D Systems사)를 이용하여 비오틴 표지 마우스 βNGF를 제작함으로써 항체의 마우스 βNGF에 대한 교차성을 평가하였다.
(실시예 5: 결합 특이성 평가)
실시예 1에 기재된 ELISA법을 이용하여 항체의 NGF에 대한 결합 특이성을 평가하였다. 구체적으로는 NGF와 가장 상동성이 높은 패밀리 분자인 NT-3을 이용하여 실시예 1의 방법에 있어서 인간 NT-3(PeproTech사)을 1웰당 20ng 첨가하여 플레이트에 고상화하여 평가하였다.
(실시예 6: NGF-trkA 시그널 저해 평가)
항체의 NGF-trkA 시그널의 저해 활성에 대하여 평가하였다. NGF는 그 수용체인 trkA를 통하여 세포 내 칼슘(Ca2+) 농도의 상승을 야기한다. 통상, 이 Ca2+ 농도 변화는 칼슘 지시약 존재하에서 세포 내 Ca2+ 농도 측정 시스템(FLIPR; 몰리큘러디바이스사)을 이용하면 평가할 수 있다.
저해 활성을 이하의 방법을 이용하여 측정하였다. 인간 trkA를 안정적으로 발현시킨 HEK293 세포(WO2009/054468)를 실험 전일에 2×104 세포/웰이 되도록 96웰 폴리-D-리신-코팅 플레이트(닛본벡톤디킨슨사)에 분주하고, 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 칼슘 지시약(Fluo4-AM; 도진도사)을 포함하는 DMEM 배지(3.6mM 수산화나트륨(NaOH), 2.5mM 프로베네시드(Sigma사) 함유)로 치환하고, 37℃에서 30분 정치하였다. 이어서, 세정액(행크스 평형 염액(HBSS)(20mM 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES), 3.6mM 수산화나트륨, 2.5mM 프로베네시드(Sigma사), 0.1% 소 혈청 알부민))으로 세포를 2회 세정하고, 배지를 이 세정액150μl/웰로 치환하였다. 세포 플레이트를 FLIPR 내에 세팅하였다. FLIPR의 조작에 의해, 실시예 2에서 얻은 항체와 NGF의 혼화액을 50μl/웰 첨가하고(NGF 최종 농도 100ng/ml), 세포 내 Ca2 + 농도 변화를 측정하였다. 세포 내 Ca2+ 농도 변화의 최대값과 최소값의 차를 산출하고, 측정 데이터로서 보존하였다.
(실시예 7: NGF 의존성 세포 생존 시그널 저해 평가)
천연에 trkA 및 p75 수용체를 발현하고 있는 PC12 세포를 무혈청 조건으로 배양한 경우, NGF는 세포의 생존을 수일간 유지할 수 있다. 이하의 방법을 이용하여 항체의 NGF 의존적 세포 생존 시그널에 대한 저해 활성을 평가하였다.
96웰의 콜라겐 코팅 플레이트(아사히테크노사)에 PC12 세포를 1웰당 1×104 세포로 뿌리고, 2.5% 소 태아 혈청 및 15% 말 비동화 혈청(Invitrogen사)을 포함하는 F12K 배지(Invitrogen사)에서 37℃, 5% CO2로 밤새 인큐베이트하였다. 다음날, 배지를 F12K만의 무혈청 조건에 치환하였다. 1시간 후, 항체 및 인간 βNGF(최종 농도 50ng/ml)를 첨가하고, 72시간 배양을 행하였다. 그 후, 배양액을 아스피레이터로 제거하고, 세포의 내재성 ATP 정량 시약(CellTiter Glo; Promega사)에 의해 세포의 생존능을 측정하였다.
(실시예 8: Fab 프래그먼트의 제작)
Fab 프레파라트 키트(Pierce사)를 사용하고, 항체 1mg/ml에 소화 효소 파파인 결합 겔을 첨가하고, 37℃, 3시간 처리하였다. 처리한 반응액을 프로테인 G 칼럼(GE헬스케어재팬사)에 첨가하고, 절단된 Fc 및 미반응된 IgG를 칼럼에 흡착시켜 제거하고, 용출 분획을 회수함으로써 Fab 프래그먼트를 얻었다. 얻어진 Fab 프래그먼트에 대하여 실시예 3, 실시예 6, 및 실시예 7에 기재한 시험으로 평가를 행하였다.
실시예 3 내지 8에 의한 평가의 결과, 1-15라고 명명한 항체(키메라 항체)가 높은 중화 활성, 종 교차성, 결합 특이성을 가짐과 함께, 1가의 항체 프래그먼트로 한 경우에도 높은 중화 활성을 유지하는 것이 확인되었다.
(실시예 9: 항체 유전자 서열의 결정)
동정된 1-15 항체에 대하여 본 발명자들은 하이브리도마로부터 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다. 구체적으로는 하이브리도마 클론을 1×105 이상 준비하고, 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(QIAGEN사)에 첨부한 RLT 버퍼로 현탁 후, 퀴아슈레더(QIAshredder)(QIAGEN사)를 이용하여 세포의 파쇄를 행하였다. 그 후 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 주형으로 하여 DNA 증폭 키트(SMARTer RACE cDNA Amplification kit; Clontech사)를 이용하여 cDNA의 합성을 행하였다. 얻어진 cDNA를 이용여 PCR 반응을 행하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 신장 및 증폭하였다. 이 PCR 산물을 직접 서열 분석기(ABI PRISM 3100; Applied Biosystems사)로 서열 해석을 행하였다. 또한, PCR 산물을 pCR3.1-TOPO(Invitrogen사) 등의 PCR 산물 서브 클로닝용 벡터에 재조합한 후, 유전자 서열을 해석하여 서열 결정을 행하였다.
결정된 1-15 항체의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 1에, 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 3에, 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. 1-15 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 카바트(Kabat) 번호 부여에 기초하는 중쇄 가변 영역의 31 내지 35번째, 50 내지 65번째, 및 95 내지 102번째의 영역이고, 각각 서열 번호 2의 31 내지 35번째, 50 내지 65번째, 및 98 내지 110번째의 아미노산 서열을 포함한다. 1-15 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 카바트 번호 부여에 기초하는 경쇄 가변 영역의 24 내지 34번째, 50 내지 56번째, 및 89 내지 97번째의 영역이고, 각각 서열 번호 4의 24 내지 39번째, 55 내지 61번째, 및 94 내지 102번째의 아미노산 서열을 포함한다.
(실시예 10: 가변 영역의 당쇄 수식 부위의 변이체 제작)
전술한 1-15 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산(서열 번호 2)에는 N-X-(T/S)의 N형 당쇄 수식 모티프 서열이 포함되어 있다. 구체적으로는 서열 번호 2로 나타내는 중쇄 가변 영역에 있어서의 카바트 번호 부여에 기초하는 52번째의 Asn(N52)이 당쇄 수식 부위에 해당한다. 당쇄 수식 부위가 존재하면 세포 배양의 사이에 항체에 대한 당쇄의 부가가 발생하지만, 당쇄의 부가는 배양 조건이나 발현시키는 숙주에 의존하는 것이 알려져 있다. 즉, 수립한 동일한 항체 생산 세포이어도 배양 조건(배지, 세포 밀도 등)에 따라 당쇄 부가의 정도가 변할 가능성이 있고, 균일한 품질의 항체 의약품을 취득하기가 어려워질 가능성이 있다. 따라서, 본 발명자들은 1-15 항체의 중쇄 가변 영역에 있어서의 N52에 변이를 도입한 1-15(N52D)를 제작하였다.
제작한 1-15(N52D)의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 서열 번호 5에, 아미노산 서열을 서열 번호 6에 각각 나타낸다. 1-15(N52D) 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 카바트 번호 부여에 기초하는 중쇄 가변 영역의 31 내지 35번째, 50 내지 65번째, 및 95 내지 102번째의 영역이고, 서열 번호 6의 31 내지 35번째, 50 내지 65번째, 및 98 내지 110번째의 아미노산 서열을 포함한다.
(실시예 11: 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트의 제작)
전술한 1-15 및 1-15(N52D)의 중쇄 가변 영역과 1-15의 경쇄 가변 영역을 이용하여 각각의 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트를 제작하였다.
1-15 및 1-15(N52D)의 각 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열을, 그리고 3'측에 인간 Igγ1의 정상 영역 유전자(Man Sung Co 등, (1992) J Immunol. Vol.148(4): 1149-1154)를 각각 연결하고, 이 중쇄 프래그먼트 유전자를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza Biologics사)에 삽입하였다. 여기서, Fab' 프래그먼트로서 발현시키기 위해서 중쇄 정상 영역 유전자에 있어서 EU 인덱스에 기초하는 226번째의 Cys(후술하는 서열 번호 8 및 10의 아미노산 서열 중의 230번째의 Cys에 대응)의 코돈의 뒤에 정지 코돈을 삽입하였다. 또한, 1-15의 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열을, 그리고 3'측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자(Man Sung Co 등, 앞에서 게재함)를 각각 연결하고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4(Lonza Biologics사)에 삽입하였다.
일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 Fab' 프래그먼트의 발현을 행하였다. 일과성 발현에 대해서는 프리스타일 293 익스프레션 미디움(FreeStyle 293 Expression medium)(Invitrogen사)으로 약 100만개/mL에 배양된 프리스타일 293 세포(Invitrogen사)에 대하여 전술한 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 GS 벡터를 293 펙틴(Invitrogen사)을 이용하여 트랜스펙트하고, 7일간 배양하였다. 항상적 발현에 대해서는 전술한 양 GS 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, DNA 라이게이션 키트(다카라바이오사)를 이용하여 라이게이션을 행하고, 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양 유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축하였다. 이 발현 벡터는 중쇄 프래그먼트 및 경쇄와 글루타민 합성 효소(Glutamine synthetase)를 코딩하고 있고, CHO-K1SV 세포에 대한 트랜스펙션에 의해 발현시켰다. 각 방법으로 발현시킨 후, 배양 상청을 카파셀렉트(GE헬스케어재팬사)를 이용하여 정제하고, 각 Fab' 프래그먼트를 얻었다.
제작한 완전 인간형 1-15 항체 Fab' 프래그먼트(1-15-Fab'라고도 칭함)의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 7에, 아미노산 서열을 서열 번호 8에 각각 나타낸다.
제작한 완전 인간형 1-15(N52D) 항체 Fab' 프래그먼트(1-15(N52D)-Fab'라고도 칭함)의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 9에, 아미노산 서열을 서열 번호 10에 각각 나타낸다.
각 Fab' 프래그먼트의 경쇄는 공통으로 그의 염기 서열은 서열 번호 11에, 아미노산 서열은 서열 번호 12에 각각 나타낸다.
(실시예 12: 완전 인간형 항체 Fab' 프래그먼트의 중화 활성 및 발현량 평가)
실시예 11에서 취득한 1-15-Fab'와 1-15(N52D)-Fab'에 대하여 실시예 3 및 실시예 6에 기재한 시험으로 평가하였다. 실시예 3의 시험에 있어서 1-15-Fab' 및 1-15(N52D)-Fab'의 IC50은 각각 0.17μg/ml 및 0.18μg/ml였다. 실시예 6의 시험에 있어서 1-15-Fab' 및 1-15(N52D)-Fab'의 IC50은 각각 0.021μg/ml 및 0.018μg/ml였다. 이들 결과로부터 1-15(N52D)-Fab'는 개변 전의 1-15-Fab'와 동일한 정도의 중화 활성을 유지하고, 변이의 도입에 의해서도 중화 활성에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.
또한, 각 Fab' 프래그먼트의 항상적 발현을 행하고, 안정 발현 세포 풀 배양의 상청 중에 있어서의 항체 생산량을 측정하였다. 그 결과, 1-15-Fab' 및 1-15(N52D)-Fab'의 각 배양 상청 중의 농도는 각각 86mg/L 및 106mg/L이고, 1-15(N52D)-Fab'는 개변 전의 1-15-Fab'보다도 높은 양으로 생산되는 항체인 것이 나타났다.
(실시예 13: PEG화 Fab' 프래그먼트의 제작과 중화 활성 평가)
이어서, 본 발명자들은 전술한 1-15(N52D)-Fab'에 대하여 PEG의 도입을 행하였다. 카파셀렉트로 정제 후, Fab' 프래그먼트를 TCEP 염산염(Tris(2-carboxyethyl) phosphine HCl)에 의해 환원 반응을 함으로써 PEG화 가능한 구조체로 하였다.
구체적으로는 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)로 1.2mg/ml에 조정한 Fab' 프래그먼트 용액에 1mM이 되도록 TCEP를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 20mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 5.0)로 희석하여 pH를 조정하였다. 이것을 양이온 교환 수지(SP-5PW; 도소 제조)에 흡착시키고, NaCl 구배로 용출하고, 메인 피크를 회수하였다. 얻어진 Fab' 프래그먼트를 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)로 1mg/ml가 되도록 희석하고, pH를 6.8에 조정 후, 4℃에서 하룻밤 이상 정치하여 자연 산화시켰다. 이것에 최종 농도 0.1mM이 되도록 40kDa PEG(SUNBRIGHT GL2-400MA; NOF CORPORATION)를 첨가하고, 실온에서 2시간 정치 후, 4℃에서 밤새 정치하였다. 동 PEG는 말단에 말레이미드기를 갖고 있기 때문에, 중쇄 프래그먼트의 카르복실 말단의 Cys(EU 인덱스에 기초하는 C226; 서열 번호 10의 230번째의 Cys)와 빠르게 반응한다. 이것을 20mM 아세트산나트륨 버퍼(pH 4.5)로 희석하여 pH를 조정 후, 재차 양이온 교환 수지(SP-5PW; 도소 제조)에 흡착시키고, NaCl의 구배로 용출하고, 메인 피크를 회수하였다. 이와 같이 하여 PEG화한 Fab' 프래그먼트를 정제하였다. 이 PEG화한 1-15(N52D)-Fab'를 1-15(N52D)-Fab'-PEG라고도 칭한다.
PEG화 전 및 PEG화한 1-15(N52D)-Fab'에 대하여 실시예 3에 나타내는 방법으로 중화 활성을 평가하였다. 그 결과, 1-15(N52D)-Fab'의 IC50이 0.15μg/ml이었음에 비하여, 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 IC50은 0.12μg/ml(Fab' 프래그먼트 농도로서)이고, 1-15(N52D)-Fab'는 PEG의 부가에 의해서도 중화 활성에 영향을 받지 않는 것이 확인되었다.
또한, 실시예 6의 방법을 이용하여 1-15(N52D)-Fab'-PEG와 선행 항 인간 NGF 항체 타네주맙의 인간 및 마우스 NGF에 대한 중화 활성을 비교하였다. 그 결과, 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 IC50이 인간 NGF에 대하여 0.051μg/ml, 마우스 NGF에 대하여 0.069μg/ml이었음에 비하여, 타네주맙의 IC50은 인간 NGF에 대하여 0.17μg/ml, 마우스 NGF에 대하여 0.23μg/ml이고, 1-15(N52D)-Fab'-PEG가 인간 및 마우스의 어느 NGF에 대해서나 타네주맙보다 3.3배 정도 강력한 중화 활성을 갖는 것이 확인되었다.
(실시예 14: 마우스 아쥬반트 유발 관절염 모델에 의한 진통 효과 시험)
본 발명자들은 전술한 1-15(N52D)-Fab'-PEG에 대하여 마우스 아쥬반트 유발 관절염 모델에 대한 진통 효과를 평가하였다.
1-15(N52D)-Fab'-PEG를 마우스 정맥내에 투여하고(0.03mg/kg, 0.1mg/kg, 0.3mg/kg, 투여 용량은 10mL/kg), 후지 족척에 프로인트 완전 아쥬반트(Sigma사) 1mg/mL를 25μL 투여하여 동통을 야기하였다. 야기 24시간에 20분간의 상승 행동을 측정하였다. 구체적으로는 슈퍼멕스 자발 운동량 측정 시스템(무로마치기카이)을 이용하여 마우스의 자발적인 상승 행동의 횟수를 적외선 빔 센서로 20분간 자동 계측하였다(Matson 등, JPET 320: 194-201, 2007). 비교 대조로서 선행 항체 타네주맙을 이용하였다. 그 결과, 타네주맙의 정맥내 투여에서의 진통 효과가 ED50=0.27mg/kg이었음에 비하여, 1-15(N52D)-Fab'-PEG는 ED50=0.11mg/kg으로 진통 효과를 발휘하고, 약 3배의 유효성을 나타냈다.
(실시예 15: 래트 태반 통과 시험)
암컷 래트의 임신 17일째에 1-15(N52D)-Fab'-PEG 또는 타네주맙을 정맥내에 투여하고(100mg/kg, 투여 용량 10mL/kg), 3일 후의 모체 및 태아의 혈액 중의 항체 농도를 측정하였다.
항체 농도의 측정은 이하와 같이 행하였다. 멀티-어레이 플레이트(MULTI-ARRAY Plate)(Standard) 96 플레이트(Meso Scale Discovery사)에 인간 βNGF(R&D Systems사)를 1웰당 25ng 첨가하여 실온에서 1시간 정치함으로써 고상화하였다. 플레이트를 TBST 세정액으로 3회 세정 후, 블록킹제(1% 카제인 TBS; 서모피셔사)를 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 다음으로, 경시적으로 채혈한 혈액을 희석한 혈액 샘플을 블록킹 후의 인간 βNGF 고상 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 교반하면서 60분 반응 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 비오틴 표지 항 인간 카파 항체(면역생물연구소)를 첨가하였다. 실온에서 교반하면서 60분 반응 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 술포-태그(SULFO-TAG) 표지 스트렙토아비딘(Meso Scale Discovery사)을 첨가하였다. 실온에서 교반하면서 60분 반응 후, TBST 세정액으로 3회 세정하고, 리드 버퍼(Read Buffer) T(Meso Scale Discovery사)를 첨가하여, 그 전기 화학 발광량을 섹터 이미저(SECTOR Imager) 6000(Meso Scale Discovery사)으로 측정하였다.
본 시험을 3마리의 래트 모체에 있어서 행한 결과, 3일 후의 래트 모체 혈중에 있어서의 1-15(N52D)-Fab'-PEG 및 타네주맙의 항체 농도는 각각 평균 12.1μg/ml 및 7.1μg/ml였다. 한편, 각 래트 모체로부터 3예씩 태아를 적출(합계 9예)한 태아 혈중에 있어서의 항체 농도에 대해서는 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 혈중 농도가 전체 예에서 정량 한계의 0.01μg/ml 이하였던 것에 비하여, 타네주맙의 혈중 농도는 평균 5.39μg/ml였다. 즉, 타네주맙의 태아 이행율은 75.9%이었음에 비하여, 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 태아 이행율은 검출 한계의 0.08% 이하의 이행율이었다. 이로부터 1-15(N52D)-Fab'-PEG는 태아에 있어서의 NGF 저해에 의한 부작용 리스크를 회피하고, 안전성이 우수한 약제인 것이 시사되었다.
(실시예 16: 면역 복합체(IC)의 형성)
1-15(N52D)-Fab'-PEG가 IC를 형성하는지의 여부 또는 형성되는 IC의 크기가 어느 정도가 되는지를 평가하였다. 구체적으로는 1-15(N52D)-Fab'-PEG를 1mg/ml와 인간 βNGF(R&D Systems사)를 몰비로 1:1이 되도록 혼화하고, 실온에서 3시간 인큐베이트하여 IC를 형성시켰다. 이 반응액을 동적 광산란을 측정하는 기기 제타사이저 나노(Zetasizer Nano)(Malvern사)를 이용하여 IC의 입경과 분포를 측정하였다. 해석에는 제타사이저(Zetasizar) v6.01(Malvern사)을 이용하고, 입경은 강도(Intensity)(%)로 해석한 값(d.nm)으로 나타냈다.
측정된 입자 크기를 이하의 표 1에 나타낸다. 이 실험에 있어서 NGF 단독의 입경은 평균으로 6.2nm였다. 타네주맙 단독으로는 11.7nm에 피크 직경이 출현하였다. 타네주맙과 NGF를 인큐베이트하여 IC를 형성시킨 것을 측정하면, 피크 직경이 91.3nm에 시프트하였다. 한편, 컨트롤 항체로서 NGF와 결합하지 않은 항체를 이용한 경우, 피크 직경은 11.7nm 그대로였다. 시프트 폭으로부터 고려하면, 타네주맙과 NGF는 각각 복수 분자를 결합한 거대 분자가 되고, 거대 크기의 IC를 형성하고 있다고 추측되었다. 이에 비하여 1-15(N52D)-Fab'-PEG와 NGF의 IC의 형성을 측정한 결과, 피크 직경이 18.1nm 내지 24.4nm에 시프트하였다. 시프트 폭으로부터 고려하면, 1:1 결합만을 반영하여 1-15(N52D)-Fab'-PEG에서는 격자 형성되지 않는 것이 시사되었다.
(실시예 17: 병소 조직 이행성)
수컷 DBA/1 마우스 족관절에 콜라겐(소 관절 유래 타입 2 콜라겐, 10mg/mL; 콜라겐기술연수회) 및 완전 프로인트 아쥬반트(0.5mg/mL; DIFCO사)의 1:1의 에멀전을 피하 투여하여 콜라겐 유발 관절염 모델을 제작하였다. 야기 4주일 후에 재차 에멀전을 투여하고, 관절염을 발증시켰다. 후지 관절염의 발증 정도(스코어·종창의 크기)를 관찰하고, 마우스의 군을 나누었다. 1-15(N52D)-Fab'-PEG 및 타네주맙의 1mg/ml PBS 용액에 대하여 SAIVITM 신속 항체 표지 키트(Rapid Antibody Labeling Kit), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록 상표) 680(Life Technologies사)을 이용하여 형광 표지를 행하였다. 각각을 2mg/kg으로 미정맥으로부터 투여를 행하였다(N=4). 종창한 발바닥에 축적되는 형광을 IVIS 스펙트럼(Spectrum)(Caliper/Xenogen사)을 이용하여 투여 후 1시간부터 50시간까지 해석하고, 형광 강도를 수치화하였다.
도 1에 발바닥의 항체 체류량의 경시적 변화를 나타낸다. 1-15(N52D)-Fab'-PEG는 타네주맙에 비교하여 분명한 병소 조직 체류 효과를 나타내고, 그 효과는 48시간까지 지속되었다. 이 결과로부터 1-15(N52D)-Fab'-PEG는 효율적으로 진통 효과를 발휘한다고 생각되고, 약효 강도 이상으로 저용량으로 진통 효과를 기대할 수 있고, 나아가서는 병소 부위 선택적으로 집적하기 때문에 안전성이 우수한 약제가 될 수 있는 것을 기대할 수 있다.
(실시예 18: Fab' 프래그먼트의 아미노산 부가체의 제작)
본 발명자들은 1-15(N52D)-Fab'에 있어서 PEG의 도입 효율을 개선하기 위해서 중쇄 프래그먼트의 카르복실 말단의 Cys 잔기의 뒤에 2개의 알라닌(A) 또는 프롤린(P)을 부가한 Fab' 프래그먼트를 제작하여 발현 및 정제하였다. 이들 Fab' 프래그먼트의 제작에 있어서는 실시예 11과 마찬가지의 방법을 이용하고, 여기서 1-15(N52D)-Fab'의 중쇄 프래그먼트의 카르복실 말단 Cys 잔기의 코돈의 뒤에 2개의 알라닌 또는 프롤린의 코돈을 삽입하고, 그 후에 정지 코돈을 삽입하였다.
알라닌 부가한 1-15(N52D)-Fab'(완전 인간형 1-15(N52D-A) 항체 Fab' 프래그먼트; 1-15(N52D-A)-Fab'라고도 칭함)의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 13에, 아미노산 서열을 서열 번호 14에 각각 나타낸다. 프롤린 부가한 1-15(N52D)-Fab'(완전 인간형 1-15(N52D-P) 항체 Fab' 프래그먼트; 1-15(N52D-P)-Fab'라고도 칭함)의 중쇄 프래그먼트의 염기 서열을 서열 번호 15에, 아미노산 서열을 서열 번호 16에 각각 나타낸다. 또한, 각 Fab' 프래그먼트의 경쇄는 1-15(N52D)-Fab'의 경쇄와 동일하고, 그의 염기 서열은 서열 번호 11에, 아미노산 서열은 서열 번호 12에 각각 나타난다.
(실시예 19: PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'의 제작 및 중화 활성 및 약리 평가)
1-15(N52D-A)-Fab'에 대하여 실시예 13과 마찬가지의 방법을 이용하여 40kDa PEG를 결합시키고, PEG화한 1-15(N52D-A)-Fab'(이하, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG라고도 칭함)를 얻었다.
1-15(N52D-A)-Fab'-PEG에 대하여 실시예 3에 나타내는 방법을 이용하여 중화 활성을 평가하였다. 그 결과, 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 IC50이 0.081±0.034μg/ml였음에 비하여, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG의 IC50은 0.074±0.021μg/ml였다. 또한, 이 때 타네주맙의 IC50은 0.410±0.099μg/ml였다.
다음으로, 실시예 6에 나타내는 방법을 이용하여 중화 활성을 비교하였다. 그 결과, 1-15(N52D)-Fab'-PEG의 IC50이 인간 NGF에 대하여 0.061±0.011μg/ml였음에 비하여, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG의 IC50은 0.064±0.028μg/ml였다.
또한, 실시예 14에 나타내는 방법을 이용하여 아쥬반트 유발 관절염 모델에 있어서의 진통 효과를 평가하였다. 그 결과, 1-15(N52D)-Fab'-PEG는 ED50=0.14mg/kg으로 진통 효과를 발휘하였음에 비하여, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG는 ED50=0.21mg/kg으로 진통 효과를 발휘하였다.
이상으로부터 카르복실 말단의 Cys 잔기의 뒤에 2개의 알라닌을 부가함으로써도 중화 활성 및 약리 활성에 영향을 받지 않는 것이 확인되었다.
(실시예 20: 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG의 결합 친화성의 평가)
1-15(N52D-A)-Fab'-PEG 및 타네주맙의 NGF 항원에 대한 결합 열역학을 등온 적정형 열량 측정(Isothermal titration calorimetry; ITC)에 의해 검토하였다(Scappaticci FA, J Natl Cancer Inst. 2007, 99:1232-9. Velazquez-Campoy, A., et al, Curr Protoc Cell Biol. 2004, Chapter 17, Unit 17-18.). 모든 측정은 GE 헬스케어사 제조의 오토(Auto)-iTC200을 이용하여 행하였다. 실험에서는 1가의 Fab' 프래그먼트와 1분자의 항원 사이의 결합을 평가하기 위해서 이하의 농도로 시험을 행하고, 시험은 전부 PBS 용매 중에서 행하였다. 구체적으로는 적정용 시린지에 들어있는 인간 βNGF 44μM(R&D systems사)를 1.4μL씩 30회에 걸쳐 항체 시료(3μM의 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG 또는 1.5μM의 타네주맙)를 채운 열량계 셀에 적정하고, 이때에 생긴 열량을 검출하였다. 얻어진 데이터를 장치 부속의 소프트를 이용하여 단일 부위 결합 모델(Single site binding model)에 의해 해석함으로써 항원-항체 결합에 수반되는 결합 친화력(Kd), 결합비(n), 결합 자유 에너지(ΔG), 결합 엔탈피(ΔH), 및 결합 엔트로피(-TΔS)를 어림하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
그 결과, 타네주맙의 Kd값이 20.41nM이었음에 비하여 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG의 Kd값은 1.49nM이고, 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG의 결합 친화성은 타네주맙보다도 10배 이상 강력하였다.
(실시예 21: 각종 PEG 크기의 PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'의 제작 및 중화 활성 평가)
실시예 18에서 제작한 1-15(N52D-A)-Fab'에 대하여 실시예 13과 마찬가지의 절차를 이용하여 5kDa PEG 또는 10kDa PEG를 결합시켰다. 구체적으로는 20mM 트리스 염산 버퍼(pH 7.4)로 제조한 Fab' 프래그먼트 용액을 TCEP로 환원시킨 후, 탈염 칼럼을 이용하여 Fab' 프래그먼트를 회수하였다. 얻어진 Fab' 프래그먼트에 PEG(SUNBRIGHT GL2-50MA 또는 SUNBRIGHT GL2-100MA; 모두 NOF CORPORATION)를 첨가하여 4℃에서 밤새 정치하였다. 이와 같이 하여 얻어진 5kDa PEG 또는 10kDa PEG를 결합시킨 1-15(N52D-A)-Fab'를 각각 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG라고 칭한다.
다음으로, 실시예 6에 나타내는 방법을 이용하여 각 PEG화 Fab' 프래그먼트의 중화 활성을 비교하였다. 비교 대조로서 실시예 19에서 제작한 1-15(N52D-A)-Fab'-PEG(40kDa PEG를 결합; 이하, 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG라고도 칭함)를 이용하였다. 이번 실험에서는 NGF 최종 농도를 50ng/ml로 실시하였다. 그 결과, 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG, 및 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG의 IC50은 각각 0.030μg/ml, 0.028μg/ml, 및 0.023μg/ml였다. 이 결과로부터, PEG 크기는 5kDa 내지 40kDa의 크기에 있어서는 Fab' 프래그먼트의 중화 활성에 영향을 미치지 않는 것을 알았다.
(실시예 22: 각종 PEG 크기의 PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'의 마우스 PK 평가)
각종 PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'의 마우스 PK 평가를 행하였다. 구체적으로는 0.3mg/kg의 각종 PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'를 정맥내에 투여하고, 투여 후 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 및 168시간마다 채혈하였다. 얻어진 혈액 중의 피검 항체량을 샌드위치 ELISA법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로는 피검 항체를 NGF를 고정화한 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery사 제조)에 첨가하였다. 플레이트에 결합한 피검 항체를 비오틴 표지 항 인간 카파 항체로 인식하고, 이것을 술포-태그 표지 스트렙토아비딘으로 검출하였다. 혈중 농도의 산출은 각 표준품으로 검량선을 제작하여 구하였다. 산출한 혈중 농도로부터 혈중 반감기(T1/2: 시간)를 계산하였다. 그 결과, 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG, 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG, 및 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG의 T1/2은 각각 13.8±2.2시간, 17.7±0.4시간, 및 39.2±3.7시간이었다.
(실시예 23: 래트 발바닥 절개 모델에 의한 진통 효과 시험)
임상에 있어서의 수술 후 통증을 반영하는 래트 발바닥 절개 후통 모델(Brennan et al. Current Protocols in Pharmacology 2004; 5.34.1-5.34.8)을 이용하여 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG 및 1-15(N52D-A)-Fab'-10kPEG의 술후통에 대한 진통 효과를 평가하였다.
구체적으로는 각 군 8마리로 하고, 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG 또는 -10kPEG를 래트 정맥내에 투여하고(0.1mg/kg, 0.3mg/kg, 1mg/kg, 투여 용량은 1mL/kg), 우후지 발바닥을 발뒤꿈치 선단으로부터 5mm 부분을 기점으로 하여 10mm 발가락 방향으로 직선적으로 절개하여 즉시 나일론실로 2개소 매트리스 봉합함으로써 동통을 야기하였다. 야기 5시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 및 5일에 수술부위 부근의 동통역치를 측정하였다. 측정은 우고 바실(Ugo Basile)사 제조 다이나믹 플랜터 애너시져미터(Dynamic plantar anesthesiometer)를 이용하여 래트의 발바닥에의 가압에 대한 도피 행동을 나타내는 압력을 측정하였다. 비교 대조로서 선행 항체 타네주맙을 이용하였다.
그 결과, 수술 후 1일의 타네주맙의 정맥내 투여에서의 진통 효과가 ED50=0.26mg/kg이었음에 비하여 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG 또는 -10kPEG는 모두 ED50=0.15mg/kg으로 진통 효과를 발휘하고, 약 2배의 유효성을 나타냈다. 또한, 1-15(N52D-A)-Fab'-5kPEG 또는 -10kPEG의 유의한 진통 효과는 각각 수술 후 3일 또는 4일까지 관찰되었다.
(실시예 24: 응집 안정성 평가)
1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG를 pH 5, pH 6, pH 7.4, 및 pH 9의 각 조건으로 1mg/ml 및 10mg/ml에 용해하였다. 이들을 각각 50℃의 조건에 두고, 2주일 후의 응집 안정성에 대하여 평가를 행하였다. 응집성의 평가는 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 행하고, 애질런트(Agilent)사 제조 1100을 이용하여 측정하였다. 측정 조건은 이동상의 버퍼로서 0.1M 인산나트륨(0.2M 아르기닌 함유)(pH 6.8)을 이용하고, 칼럼은 TSK 겔 수퍼(Super) Sw3000(TOSOH, 2.0mmID×300mm)을 이용하였다. 검출 파장은 280nm에서 행하였다. 1mg/ml로의 시험에서는 비교 항체로서 타네주맙을 이용하고, 그 결과를 표 3에 나타낸다. 10mg/ml로의 시험에서는 비교 항체로서 타네주맙 및 REGN475를 이용하고, 그 결과를 표 4에 나타낸다.
그 결과, 타네주맙 및 REGN475는 2주일 후에 현저한 응집체의 생산 상승이 관찰되었음에 비하여, 1-15(N52D-A)-Fab'-40kPEG에서는 응집체가 거의 검출되지 않았다. 이 결과로부터, PEG화 1-15(N52D-A)-Fab'는 보존 안정성이 우수한 의약품이 될 수 있을 가능성이 높은 것이 시사되었다.
<산업상 이용가능성>
본 발명의 항 인간 NGF 항체, 보다 구체적으로는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
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caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caacaacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240
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<220>
<223> VL of anti-human NGF antibody
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Arg
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<223> VH gene of anti-human NGF antibody
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<223> VH of anti-human NGF antibody
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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<223> L-chain of anti-human NGF antibody
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<223> H-chain fragment of anti-human NGF antibody
<400> 16
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230
Claims (12)
- 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
- 제1항에 있어서, 상기 Fab' 프래그먼트의 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역인 Fab' 프래그먼트.
- 제1항에 있어서, 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역인 Fab' 프래그먼트.
- 제1항에 있어서, 상기 Fab' 프래그먼트의 중쇄 정상 영역이 인간 Igγ1 정상 영역이고, 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄 정상 영역이 인간 Igκ 정상 영역인 Fab' 프래그먼트.
- 제1항에 있어서, 서열 번호 10, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab' 프래그먼트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 Fab' 프래그먼트.
- 제1항의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
- 제7항 및/또는 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제9항의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
- 제10항에 있어서, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
(a) 제1항의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(b) 제1항의 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 상기 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포. - 제10항 또는 제11항의 숙주 세포를 배양하고, 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함하는 제1항의 항 인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 생산하는 방법.
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