EA024292B1 - Новое антитело против ngf человека - Google Patents

Новое антитело против ngf человека Download PDF

Info

Publication number
EA024292B1
EA024292B1 EA201490433A EA201490433A EA024292B1 EA 024292 B1 EA024292 B1 EA 024292B1 EA 201490433 A EA201490433 A EA 201490433A EA 201490433 A EA201490433 A EA 201490433A EA 024292 B1 EA024292 B1 EA 024292B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fragment
pab
antibody
human
heavy chain
Prior art date
Application number
EA201490433A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490433A1 (ru
Inventor
Масадзуми Камохара
Хироцугу Танака
Юкари Койа
Дзун Такасаки
Ацуо Йонезава
Еидзи Йосими
Original Assignee
Астеллас Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Астеллас Фарма Инк. filed Critical Астеллас Фарма Инк.
Publication of EA201490433A1 publication Critical patent/EA201490433A1/ru
Publication of EA024292B1 publication Critical patent/EA024292B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

Проблема. Получить антитело против NGF человека, которое обладает уменьшенными влиянием на плоды и риском побочных действий, включающим тромбоз, при сохранении высокой нейтрализующей активности, и которое имеет превосходную безопасность, или его антиген-связывающий фрагмент; а также средство профилактики или лечения различных заболеваний, развитие болезненных состояний которых связано с NGF человека, который использует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Решение. Фрагмент Fab' антитела против NGF человека, который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Description

(57) Проблема. Получить антитело против ΝΟΡ человека, которое обладает уменьшенными влиянием на плоды и риском побочных действий, включающим тромбоз, при сохранении высокой нейтрализующей активности, и которое имеет превосходную безопасность, или его антигенсвязывающий фрагмент; а также средство профилактики или лечения различных заболеваний, развитие болезненных состояний которых связано с ΝΟΡ человека, который использует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Решение. Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека, который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность §Εζ) ГО N0:6, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность §Εζ) ГО N0:4.
Область техники
Настоящее изобретение относится к новому антителу против ΝΟΡ человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к РаЬ' фрагменту антитела против ΝΟΡ человека.
Уровень техники
Фактор роста нервной ткани (ΝΟΡ) является одним из гуморальных факторов, в целом называемых нейротрофными факторами, и играет важную роль в формировании и дифференцировке нейронов, а также в поддержании функций нейронов в организме. В качестве рецепторов ΝΟΡ известны высокоаффинный рецептор 1гкЛ (рецепторная тирозинкиназа) и низкоаффинный рецептор ρ75ΝΤΚ. Имеется информация, сообщающая, кроме прочего, о том, что ρ75ΝΤΚ связывается со всеми нейротрофными факторами и вовлечен в апоптоз в процессе формирования нейронов. Однако до сих пор роль ρ75ΝΤΚ достаточным образом не объяснена. Между тем известно, что мыши с нокаутом по ΝΟΡ и рецептору 1гкЛ имеют одинаковый фенотип (непатентный документ 1), и полагают, что физиологическое действие ΝΟΡ выражается, главным образом, через рецептор 1гкЛ.
В 1993 г. появилось сообщение, что введение ΝΟΡ крысам вызывает боль (непатентный документ 2), а позже появилось сообщение, что внутривенное введение ΝΟΡ человеку вызывает системную миалгию, а местное применение ΝΟΡ вызывает системный эффект и приводит к гиперпатии и аллодинии в месте инъекции (непатентный документ 3). Кроме того, сообщалось, что мыши с нокаутом по рецептору йкЛ проявляют анальгезию (непатентный документ 4), из чего полагают, что ΝΟΡ является молекулой, глубоко вовлеченной в проявление боли. Что касается связи между ΝΟΡ и патологическим состоянием боли у человека, было показано, что экспрессия ΝΟΡ/ΙγΚΛ усилена в суставных хрящах при остеоартрите (ОА) (непатентный документ 6) и что уровень ΝΟΡ повышен у пациентов, страдающих ревматоидным артритом (непатентный документ 7) или интерстициальным циститом (непатентный документ 8).
Исходя из приведенных выше фактов, ожидалось, что в случае создания моноклонального антитела, которое будет специфически связываться с ΝΟΡ и имеет ингибиторную активность в отношении действия ΝΟΡ, его можно использовать для лечения, профилактики и диагностики различных заболеваний, включая боль, связанную с ΝΟΡ.
Сообщается об антителах против ΝΟΡ человека, которые известны на настоящий момент и клинически испытаны: танезумаб (патентный документ 1) и РО110 (патентный документ 2), как о гуманизированных антителах против ΝΟΡ человека, и ΡΕΟΝ475 (патентный документ 3), фулранумаб (патентный документ 4) и ΜΕΌΙ-578 (патентный документ 5), как полностью человеческие антитела против ΝΟΡ человека. Среди них наибольшие усилия уделяются разработке танезумаба, и имеется информация о том, что по результатам клинического анализа это антитело вызывает мощный и обширный обезболивающий эффект при боли, такой как артралгия, сопровождающаяся остеоартритом, хронической боли в спине и цисталгии, сопровождающейся интерстициальным циститом (непатентные документы 9-11).
В целом, в качестве главных факторов, определяющих эффективную дозу лекарственного средства, содержащего антитело, рассматривается нейтрализующая активность антитела против антигена и количество антигенов, присутствующих в организме. Усиление нейтрализующей активности приводит к снижению дозы и, следовательно, может быть полезным усовершенствованием, ведущим к уменьшению финансовых расходов на пациентов и стоимости препарата. Если уменьшение дозы может быть достигнуто, то также возможно проводить подкожное введение. Подкожное введение имеет важное преимущество, заключающееся в том, что пациент, при удовлетворении определенных условий, может выполнять инъекцию самостоятельно в домашних условиях. Кроме того, если лекарственный препарат, содержащий антитело, обычно вводят капельно в течение определенного времени во многих случаях путем внутривенного введения, при подкожном введении лекарство может быть введено в виде болюса, что обеспечивает еще одно преимущество. И врач, и пациент могут выбрать препарат для внутривенного введения и препарат для подкожного введения, что желательно. Однако при подкожном введении доза, которую можно ввести при одном введении, составляет, в целом, всего около 1 мл, поэтому доза должна содержать существенное количество антител, чтобы реализовать лекарственную эффективность. Далее, в отличие от внутривенного введения при подкожном введении требуется оценить его биодоступность. То есть, для того чтобы реализовать препарат для подкожного введения, требуется получить антитело, которое проявляет высокую растворимость и проявляет существенную лекарственную эффективность даже в малых дозах. Соответственно, если антитело, которое имеет более высокую нейтрализующую активность против ΝΟΡ, сравнить с антителами, известными в данной области, то они более эффективны для лечения заболеваний, связанных с ΝΟΡ, и для повышения удобства лечения.
При том что ΝΟΡ, как описано выше, является важным фактором роста нейронов, существенная проверка критериев безопасности необходима при разработке медицинских препаратов, которые ингибируют функцию ΝΟΡ. В частности, одним из аспектов, для которого требуется проверка по критериям безопасности, являются эффекты на плод. К настоящему времени в отношении функционального ингибирования ΝΟΡ имеются сообщения, информирующие, что мутации ΝΟΡ являются причиной врожденной анальгезии (непатентный документ 5) и что в эксперименте на животных, если у беременных морских свинок вызывали образование аутоантител против ΝΟΡ, ингибируя, таким образом, ΝΟΡ в организме, у новорожденных морских свинок наблюдали симптом анальгезии (непатентный документ 12). Да- 1 024292 лее, в эксперименте на ΝΟΡ- или !гкА-дефектных мышах было показано, что недостаточность действия ΝΟΡ ингибирует рост нейронов сенсорных нервов и симпатических нервов у эмбриона (непатентные документы 4 и 13). На основании этих результатов ясно, что ΝΟΡ является необходимым фактором нейрогенеза на ранних стадиях развития. Заболевания, связанные ΝΟΡ, также включают заболевания, которыми часто страдают женщины в детородном возрасте, такие как интерстициальный цистит (половина или более пациентов были в возрасте 44 года и моложе, 90% пациентов были женщинами (непатентный документ 14)), хронические боли в спине (средний возраст 40-50, более 50% пациентов были женщинами (непатентные документы 15-17)) и мигрень (возраст максимума проявлений в диапазоне от 15 до 40 лет, 80% пациентов были женщинами (непатентный документ 18)). В этой ситуации при разработке антител против ΝΟΡ в качестве медицинского лекарственного препарата очень важно устранить риск побочных эффектов на плод беременных женщин.
Еще одним фактором риска при разработке антитела против ΝΟΡ в качестве медицинского препарата рассматривается образование иммунного комплекса (1С). Иммунный комплекс, который представляет собой комбинацию антигена и антитела, в целом, подвергается воздействию в ретикулоэндотелиальной системе, такой как селезенка или печень. Однако сообщалось, что при патологическом состоянии, таком как иммунное нарушение, или если размер образовавшегося 1С велик, 1С теряет растворимость, что связано с риском образования тромбов и возникновением нефрита, вызванного накоплением 1С в клубочках. При том что 1дО является бивалентным антителом, когда антиген является поливалентным, 1С может иметь различные размеры вследствие формирования решетчатой структуры. Размер 1С зависит от количества антител и антигенов и соотношения между ними, аффинности антитела и т.п. Например, антитело против УЕОР - бевацизумаб (наименование продукта: Авастин) представляет собой антитело 1дО1, и имеется информация о том, что это антитело образует 1С путем связывания с димером УЕОР и вызывает образование тромба. Конкретно, если авастин и УЕОР вводили мыши Тд с рецепторами человека РсуКЛа, то наблюдалось образование тромба легочной артерии (непатентный документ 19). Кроме того, имеется информация о том, что артериальный тромб чаще формируется у пациентов с метастазирующим раком, которые получают химиотерапию с авастином, по сравнению с плацебо-группой, получавшей только химиотерапию (непатентный документ 20). Так как ΝΟΡ также образует димер в организме для проявления физиологической активности, то желательно дальнейшее улучшение безопасности путем устранения риска образования 1С при разработке медицинского препарата антитела против ΝΟΡ.
По причинам, приведенным выше, для лечения или профилактики различных заболеваний, связанных с ΝΟΡ, очень важно получить антитело против ΝΟΡ, которое превосходно с точки зрения безопасности, путем уменьшения риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и образование тромбов, при этом сохраняя высокую нейтрализующую активность.
Предшествующий уровень техники
Патентные документы.
Патентный документ 1. АО 2004/058184.
Патентный документ 2. АО 2005/061540.
Патентный документ 3. АО 2009/023540.
Патентный документ 4. АО 2005/019266.
Патентный документ 5. АО 2006/077441.
Непатентные документы.
Непатентный документ 1. Сопоует ТС., е! а1., Кеу. №иго8ст 1997, 8:13-27.
Непатентный документ 2. Ье^т О.К., е! а1., 1. №ито8сг 1993, 13:2136-48.
Непатентный документ 3. РеНу В.О., е! а1., Апп. №ито1. 1994, 36:244-6.
Непатентный документ 4. §теупе К.Т, е! а1., №Циге. 1994, 368:246-9.
Непатентный документ 5. 1пйо Υ., е! а1., Ν;·ιΙ. Оепе!. 1996, 13:485-8.
Непатентный документ 6. 1аппопе Р., е! а1., Кйеита!о1оду. 2002, 41:1413-8.
Непатентный документ 7. А1ое Ь., е! а1., С1ш. Ехр. Кйеита!о1. 1997, 15:433-8.
Непатентный документ 8. Ьо^е Е.М., е! а1., Вг. 1. Ито1. 1997, 79:572-7.
Непатентный документ 9. Ьапе Ν/Е., е! а1., Ν. Епд1. 1. Мей. 2010, 363:1521-31.
Непатентный документ 10. Еуапк К.Т, е! а1., 1. Ито1. 2011, 185:1716-21.
Непатентный документ 11. Ка1/ Ν., е! а1., Раш. 2011, ш ргекк.
Непатентный документ 12. .ТоЬпкоп Е.М. 1т., е! а1., 8с1епсе. 1980, 210:916-8.
Непатентный документ 13. Сто^1еу С., е! а1., Се11. 1994, 76:1001-11.
Непатентный документ 14. Раупе С.К., е! а1., 1. Ито1. 2007, 177:2042-9.
Непатентный документ 15. МапсЫкапй Ь., е! а1., Раш РйукЮап. 2010, 13:Е279-92.
Непатентный документ 16. АПкещ Р., е! а1., 1АМА. 2010, 304:45-52.
Непатентный документ 17. Виупак К., е! а1., Ехрег! Орш РйаттасоШет. 2010, 11:1787-804.
Непатентный документ 18. §ака1 Р., е! а1., Серйа1а1д1а. 1997, 17:15-22.
Непатентный документ 19. Меуег Т., е! а1., 1. ТЬготЬ Наеток!. 2009, 7:171-81.
Непатентный документ 20. §саррайсш Р.А., е! а1., 1. Ν;·ιΐ1 Сапсег 1пк!. 2007, 99:1232-9.
- 2 024292
Сущность изобретения
Техническая проблема.
Задача настоящего изобретения заключается в получении антитела против ΝΟΡ человека или его антигенсвязывающего фрагмента, которое имеет наилучшие с точки зрения безопасности свойства за счет уменьшения риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромба при этом сохраняя 1 высокую нейтрализующую активность.
Решение проблемы.
Настоящее изобретение относится к нижеследующим изобретениям, которые представляют собой вещества и способы, применяемые в медицине или промышленности.
1. Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:6; и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:4.
2. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константная область тяжелой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константную область 1ду 1 человека.
3. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константная область легкой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константную область 1дк человека.
4. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок 1§γ 1 человека, а константный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок 1дк человека.
5. Фрагмент РаЬ' по п.1, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:14 или 8ЕО ГО N0:16; и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:12.
6. Фрагмент РаЬ' по любому из пп.1-5, в котором фрагмент РаЬ' конъюгирован с полиэтиленгликолем.
7. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по любому из пп.1-6.
8. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ' по любому из пп.1-6.
9. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.7 и/или 8.
10. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.9.
11. Клетка-хозяин по п. 10, которая выбрана из группы, состоящей из:
(a) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по любому из пп.1-6, и полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ'; и (b) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по любому из пп.1-6, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ'.
12. Способ получения фрагмента РаЬ' антитела против N0Р человека по любому из пп.1-6, 6гк..\Г.оЬс| экспрессирование фрагмента РаЬ' антитела против N0Р человека путем культивирования клеток-хозяев по пп.10, 11.
13. Средство для лечения боли, которое содержит фрагмент РаЬ' по любому из пп.1-6.
14. Средство для лечения боли по п.13, где боль представляет собой боль при остеоартрите.
15. Способ профилактики или лечения боли, включающий введение фрагмента РаЬ' по любому из пп.1-6.
16. Способ по п.15, где боль представляет собой боль при остеоартрите.
17. Фрагмент РаЬ' по любому из пп. 1-6 для использования в профилактики или лечения боли.
18. Фрагмент РаЬ' по п. 17, где боль представляет собой боль при остеоартрите.
Благоприятные эффекты изобретения.
Фрагмент РаЬ' антитела против N0Р человека по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с N0Р человека. Благодаря своей высокой нейтрализующей активности, фрагмент РаЬ' антитела против N0Р человека по изобретению обеспечивает высокие преимущества для клинических применений, таких как уменьшение дозы, расширение интервалов введения и улучшение способа введения (например, подкожной инъекции). Более того, по уменьшению риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромбов, фрагмент РаЬ' антитела против N0Р человека по настоящему изобретению имеет значительное превосходство по отношению безопасности и вносит значительный
- 3 024292 вклад в профилактику или лечение различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с ΝΟΡ человека.
Краткое описание фигур
На фигуре показано временное изменение количества антител, находящихся в подошве стопы модельных мышей с артритом, индуцированным коллагеном.
Описание вариантов воплощения
Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно.
Авторы настоящего изобретения повторили творческое исследование для получения антитела против ΝΟΡ человека или его антигенсвязывающего фрагмента. Им удалось получить фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека, который обладает превосходными качествами в отношении безопасности благодаря уменьшению риска побочных эффектов, таких как эффекты на плод и формирование тромбов при поддержании высокой нейтрализующей активности.
Основная структура молекулы антитела является общей среди соответствующих классов антител и образована тяжелой цепью, имеющей молекулярный вес 50000-70000, и легкой цепью, имеющей молекулярный вес 20000-30000. Тяжелая цепь, в целом, состоит из полипептидной цепи, включающей около 440 аминокислот, а каждый класс имеет свою характерную структуру. Тяжелые цепи называются γ, μ, α, δ и ε-цепями, соответственно 1§О, 1дМ, 1дА, 1§И и 1дЕ. Кроме того, 1§О имеет подклассы, такие как 1дО1, 1дО2, 1§О3 и 1дО4, и эти цепи называются γ1, γ2, γ3 и γ4 соответственно. Легкая цепь, в целом, состоит из полипептидной цепи, включающей около 220 аминокислот, известны два типа легких цепей, включающих легкие цепи Ь-типа и К-типа, которые называются λ- и κ-цепями соответственно. Что касается пептидного строения базовой структуры молекулы антитела, то две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидными мостиками (8-8 связи) и нековалентными связями, а их молекулярный вес составляет 150000-190000. Два типа легких цепей могут быть соединены в пару какой-либо тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.
В тяжелой цепи присутствуют четыре 8-8 мостика (пять мостиков в μ- и ε-цепях) и два - в легкой цепи. Одна из петель образована из 100-110 аминокислотных остатков, и эта стерическая структура сходна среди соответствующих петель и называется структурной единицей или доменом. И для тяжелых цепей, и для легких цепей аминокислотная последовательность домена, расположенного на его Ν-конце, не является постоянной, даже по сравнению со стандартным образцом того же класса (подкласса) того же вида животных, и этот домен называется вариабельным участком. Каждый из доменов называется вариабельным участком тяжелой цепи (Ун) и вариабельным участком легкой цепи (Уъ) соответственно. Так как аминокислотная последовательность на С-концевой части домена почти постоянна в каждом классе или подклассе, то этот участок называется константным участком, и каждый из доменов обозначается как Сн1, Сн2, Сн3 и Сь соответственно.
Сайт антигенной детерминанты антитела образован Ун и Уъ, и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого сайта. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с комплементами или различными клетками, отражает различия в структуре константного участка среди различных классов 1д. Известно, что вариабельность вариабельных участков тяжелой цепи и легкой цепи главным образом ограничена тремя небольшими гипервариабельными участками, присутствующими в обеих цепях, и эти участки называются антигенсвязывающими участками (СИР; СИР1, СИР2 и СИР3, начиная с Ν-концевой стороны). Остающаяся часть вариабельного участка называется каркасным участком (РР) и является относительно константной.
Участок между доменом Сн1 и доменом Сн2 константного участка тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Этот участок включает множество остатков пролина и имеет много межцепочечных 8-8 мостиков, соединяющих две тяжелые цепи. Например, каждая шарнирная область 1дО1, 1дО2, 1§О3 и 1§О4 человека включает 2, 4, 11 и 2 остатка цистеина соответственно, которые образуют 8-8 мостики между тяжелыми цепями. Шарнирная область является участком, высокочувствительным к протеолитическим ферментам, таким как папаин или пепсин. Когда антитело переваривается папаином, то его тяжелая цепь расщепляется в положении ближе к Ν-концевой стороне, чем к 8-8 мостику между тяжелыми цепями в шарнирной области, в результате чего антитело разделяется на два фрагмента РаЬ и один фрагмент Рс. Фрагмент РаЬ образован легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включая вариабельный участок тяжелой цепи (Ун), домен Сн1 и часть шарнирной области. Когда антитело переваривается пепсином, то его тяжелая цепь расщепляется в положении, более близком к С-концевой стороне, чем к 8-8 мостику, между тяжелыми цепями шарнирной области, в результате образуются фрагменты Р(аЬ')2. Фрагмент Р(аЬ')2 представляет собой фрагмент, имеющий димерную структуру, в которой два фрагмента РаЬ связываются между собой 8-8 мостиками между тяжелыми цепями в шарнирной области. Фрагмент РаЬ' образован легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включая вариабельный участок тяжелой цепи (Ун), домен Сн1 и часть шарнирной области. Остатки цистеина, образующие 8-8 мостики между тяжелыми цепями, включены в участок шарнирной области. И фрагмент РаЬ, и фрагмент Р(аЬ')2, и фрагмент РаЬ' включают вариабельный участок и имеют антигенсвязывающую активность.
- 4 024292
Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению, который авторы настоящего изобретения успешно получили, представляет собой фрагмент РаЬ', имеющий нижеследующие характеристики.
Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека содержит вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности §Еф ГО N0:6, и вариабельного участка легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности §Еф ГО N0:4.
Конкретно, авторами настоящего изобретения было сконструировано антитело с помощью методики создания моноклональных антител человека, Уе1ос1ттипе тоике [Уе1ос1ттиие аийЬобу 1есЬио1оду; Кедепегоп 1пс. (патент США № 6596541)], и проверили антитела с использованием анализов на различные виды биологической активности и физические свойства, добившись, таким образом, идентификации фрагмента РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению. Согласно технологии Уе1ос1ттипе трансгенные мыши, у которых вариабельные участки тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина замещены соответствующими вариабельными участками человека подвергаются воздействию антигена, представляющего интерес (например, βΝΟΡ человека), а затем от мышей получали лимфатические клетки, которые экспрессировали антитела. Лимфатические клетки сливали с клетками миеломы мыши, чтобы получить гибридомы. Клетки гибридомы проверяли, чтобы идентифицировать клетки гибридомы, которые продуцируют такие антитела, которые специфически связываются с антигеном, представляющим интерес. Антитела, которые продуцируются таким образом, представляют собой антитела, имеющие вариабельные участки антител человека и константные участки антител мыши (также обозначаемые как химерные антитела). Затем, если антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном и имеет желаемую нейтрализующую активность, идентифицировано, ДНК, которые кодируют вариабельные участки тяжелой цепи и легкую цепь антитела, выделяли из клеток гибридомы и связывали с ДНК, кодирующими константные участки тяжелой цепи и легкую цепь желаемого класса антител человека. Полученный ген, кодирующий тяжелую цепь и легкую цепь антитела, экспрессировали в клетках (например, клетках СНО), чтобы продуцировать молекулу антитела. Тяжелая цепь и легкая цепь антитела, продуцированные вышеописанным способом, представляют собой тяжелую цепь и легкую цепь полностью человеческого антитела, происходящего от гена иммуноглобулина человека.
Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению может быть без труда получен специалистами в данной области на основе информации о последовательности его вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, описанного в настоящем документе, с помощью способа, общеизвестного в данной области. Предпочтительно фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению может быть получен как полностью человеческий фрагмент РаЬ' антитела путем соединения его вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельных участков легкой цепи с частью константного участка тяжелой цепи (который включает домен СН1 и частью шарнирной области, включающей цистеин в шарнирной области) и константным участком легкой цепи антитела человека, соответственно. Конкретно, получают фрагмент гена вариабельного участка тяжелой цепи, имеющий последовательность оснований, которая кодирует аминокислоты вариабельного участка тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению (§Еф ГО Ν0:6), и ген фрагмента вариабельного участка легкой цепи, имеющего последовательность оснований, который кодирует аминокислоты вариабельного участка легкой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению (§Еф ГО Ν0:4). Затем гены вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи связываются с каждым геном части константного участка тяжелой цепи и константного участка легкой цепи в соответствующий класс антител человека для получения полностью человеческого гена фрагмента РаЬ' антитела. Затем этот ген соединяют с соответствующим вектором экспрессии и вводят в культивируемые клетки. Наконец, эти культивируемые клетки культивировали и, таким образом, получали моноклональный фрагмент РаЬ' из супернатанта культуры.
Фрагменты гена, которые кодируют аминокислоты вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, могут быть синтезированы с помощью способа синтеза генов, известного в данной области, на основе, например, последовательностей оснований, созданных на основе аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи. Примеры такого способа синтеза генов включают различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способ синтеза генов антител, описанный в \У0 90/07861.
Затем вышеописанные фрагменты генов вариабельного участка соединяются с геном константного участка антитела человека для получения полностью человеческого гена фрагмента РаЬ'. Хотя какойлибо подкласс константного участка (например, константный участок тяжелой цепи, такой как γ1-, γ2-, γ3- или γ4-цепи, или константный участок легкой цепи, такой как λ или κ-цепи) может быть выбран как константный участок антитела человека, Ιβγΐ человека как константный участок тяжелой цепи и 1дк человека как константный участок легкой цепи, могут быть использованы предпочтительно.
После получения такого полностью человеческого гена фрагмента РаЬ' антитела введение гена в вектор экспрессии, введение вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирование культиви- 5 024292 руемых клеток, очистка фрагмента РаЬ' и т.п. могут быть выполнены с помощью различных способов, известных в данной области.
Примеры векторов экспрессии, которые присоединены к полученным таким образом генам, включают С8 вектор РЕЕЕ6.4 или рЕЕ12.4 (Ьоп/а Βίοίοβίοδ). но не ограничиваются конкретно этим, если они в состоянии экспрессировать такой ген антитела. Также может быть использован вектор экспрессии, уже имеющий константный участок гена 1д человека, такой как Ά0-γ1 или ЛС-κ (например, см. \νϋ 94/20632).
Вышеописанный вектор экспрессии вводят в культивируемые клетки путем, например, кальцийфосфатного способа или способа электропробоя мембраны и т.п.
Примеры культивируемых клеток, в которые введен вектор экспрессии, включают культивируемые клетки, такие как клетки СН0-К18У, клетки СН0-Э044 и клетки 293, и эти клетки могут культивироваться общепринятым способом.
Фрагмент РаЬ', накопленный в супернатанте культуры после культивирования, описанного выше, может быть очищен с помощью различных типов колоночной хроматографии. Например, возможно проведение колоночной хроматографии с использованием Карра8с1сс1 или т.п.
Фрагмент РаЬ' по настоящему изобретению может быть получен с помощью способа рекомбинантной экспрессии, как описано выше.
Однако фрагмент РаЬ' может быть получен выполнением сначала пепсинового переваривания после получения полноразмерного антитела и обработки полученного фрагмента Р(аЬ')2 восстановителем, таким как 2-меркаптоэтанол.
Предпочтительно фрагмент РаЬ' антитела против Ν0Ρ человека по настоящему изобретению может быть легко получен синтезом ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи 8Еф ГО N0:6, и ДНК, содержащую последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи 8Еф ГО N0:4, и соединения ДНК с подходящим классом константных участков генов антитела человека, предпочтительно, константным участком гена тяжелой цепи 1§γ 1 человека и константным участком гена легкой цепи 1дк человека, чтобы сконструировать ген фрагмента РаЬ' полностью человеческого антитела с использованием способа, известного в данной области, и введения гена в вектор экспрессии, введения вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирования культивируемых клеток и очистки фрагмента РаЬ', собранного из культивируемых клеток с помощью различных способов, известных в данной области. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую аминокислотные последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 8Еф ГО N0:6, содержит последовательности оснований 8Еф ГО N0:5. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую аминокислотные последовательности вариабельного участка легкой цепи 8Е0 ГО N0:4, содержит последовательности оснований 8Еф ГО N0:3.
В данном изложении фрагмент РаЬ' обозначает фрагмент моновалентного антитела, образованный легкой цепью и фрагментом тяжелой цепи, включающий вариабельный участок тяжелой цепи (УН), домен СН1 и часть шарнирной области. В часть шарнирной области включен по меньшей мере один остаток цистеина (также называемый в данном изложении цистеином шарнирной области), иной, чем остатки цистеина, образующие 8-8 мостик между тяжелой цепью и легкой цепью. Цистеин шарнирной области может быть использован как сайт модификации полиэтиленгликолем, описанный ниже. Количество цистеина в шарнирной области во фрагменте РаЬ' изменяется в диапазоне от 1 до нескольких остатков цистеина в зависимости от класса используемых антител, и легко может быть установлено специалистом в данной области. Например, когда получают фрагмент РаЬ', относящийся к классу 1дО1 человека (в целом, имеющий два цистеина в шарнирной области), стоп-кодон встраивают между кодирующим сайтом первого цистеина в шарнирной области и кодирующим сайтом второго цистеина в шарнирной области тяжелой цепи, в результате чего может быть получен фрагмент РаЬ', имеющий один цистеин в шарнирной области. В дополнение, если стоп-кодон встроен после кодирующего сайта второго цистеина в шарнирной области, может быть получен фрагмент РаЬ', имеющий два цистеина в шарнирной области.
Предпочтительный фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' антитела против NОР человека по настоящему изобретению, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:6, и части константного участка 1§γ 1 человека, представляет собой фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:10, 8Е0 ГО N0:14 или 8Еф ГО N0:16. Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' антитела против NОР человека, состоящий из аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:10, 8Еф ГО N0:14 или 8Еф ГО N0:16, содержит последовательность оснований 8Е0 ГО N0:9, 8Еф ГО N0:13 или 8Еф ГО N0:15. Предпочтительная легкая цепь фрагмента РаЬ' антитела против NОР человека по настоящему изобретению, содержащая вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:4, и константного участка 1дк человека, представляет собой легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:12.
- 6 024292
Предпочтительно ДНК, содержащая последовательность оснований, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека, состоящую из аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0:12, содержит последовательность оснований 8Е0 ГО N0:11.
В качестве предпочтительного фрагмента РаЬ' антитела против Ν0Ρ человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:10, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:12, приводится полностью человеческий фрагмент РаЬ' антитела 1-15 (N520), описанный ниже в разделе Примеры. В качестве предпочтительного фрагмента РаЬ' антитела против N0Р человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:14, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:12, приводится фрагмент РаЬ' полностью человеческого антитела 1-15 (№20-Л). описанного в разделе Примеры. В качестве предпочтительного фрагмента РаЬ' антитела против N0Р человека по настоящему изобретению, который содержит фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:16, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:12, приводится фрагмент РаЬ' полностью человеческого антитела 1-15 (N520-?), описанного в разделе Примеры.
Настоящее изобретение также содержит фрагмент РаЬ' антитела против N0Р человека, который содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий С0Р1, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 31 до 35 из 8Е0 ГО N0:6, С0Р2, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 50 до 65 из 8Е0 ГО N0:6, и С0Р3, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 98 до 110 из 8Е0 ГО N0:6, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий С0Р1, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 24 до 39 из 8Е0 ГО N0:4, С0Р2, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 55 до 61 из 8Е0 ГО N0:4, и С0Р3, состоящий из аминокислотной последовательности в положении от 94 до 102 из 8Е0 ГО N0:4. Фрагмент РаЬ' также может быть получен специалистами в данной области в соответствии с процедурами, такими, как описаны выше.
Фрагмент РаЬ' антитела против N0Р человека по настоящему изобретению может быть модифицирован путем конъюгирования с полиэтиленгликолем (РЕО) через цистеин в шарнирной области. РЕО может быть конъюгирован с фрагментом РаЬ' с помощью способов, известных в данной области (например, ЕР 0948544). В настоящем изобретении подходит линейный или разветвленный РЕО, имеющий произвольный средний молекулярный вес, или его производные, которые легко могут быть выбраны специалистами в данной области в соответствии с предполагаемым использованием. Например, в ткани опухоли или во время воспалительной реакции проницаемость сосудов значительно повышена по сравнению с нормальной тканью, так что вещества, достигающие ткани, склонны к утечке из кровеносных сосудов и накапливанию в опухоли или воспаленной ткани (эффект ЕРР). Также известно, что низкомолекулярное вещество легко реабсорбируется в кровеносные сосуды, а высокомолекулярные вещества легко не реабсорбируются. Следовательно, чтобы улучшить удерживаемость фрагмента РаЬ' в пораженной ткани, с этим фрагментом может быть конъюгирован РЕО, имеющий высокий молекулярный вес (например, около 40000 Да). Когда фрагмент РаЬ' желательно быстро экскретировать из организма, с этим фрагментом может быть конъюгирован РЕО, имеющий малый средний молекулярный вес (например, около 10000 Да). Далее, чтобы облегчить связывание РЕО с цистеином шарнирной области, может быть использовано производное РЕО. Например, как описано в разделе Примеры, возможно использовать производное РЕО, с которым связана тиореактивная группа, такая как малеимид, и связать тиоловую группу цистеина в шарнирной области с малеимидной группой через ковалентную связь. В целом, средний молекулярный вес РЕО составляет от около 500 до около 50000 Да, предпочтительно от около 5000 до около 40000 Да и более предпочтительно от около 10000 до около 40000 Да.
Фрагмент РаЬ' антитела против NОР человека по настоящему изобретению связывается с NОР человека. В качестве способа измерения активности связывания полученного фрагмента РаЬ' антитела против NОР человека с NОР человека существует способ, такой как ЕЬ1§Л или РАС8. Например, при использовании ЕЬТЗА, βNОР человека иммобилизован на планшете ЕЬТЗА, фрагмент РаЬ' добавляют к нему, чтобы вызвать реакцию, а затем второму антителу, такому как анти-κ антитело, помеченному ферментом, таким как пероксидаза хрена (НРР) позволяли прореагировать с реакционной смесью. После отмывки планшета активность измеряли с помощью детектирования активности реагента (например, хромогенного реагента ТМВ в случае мечения НРР), идентифицируя, таким образом, связывание вторых антител. В дополнение, фрагмент РаЬ' антитела против NОР человека по настоящему изобретению также включает фрагмент РаЬ', который связывает NОР, происходящий от другого животного (например, NОР мыши), так же как NОР человека, так что может быть измерена связывающая активность в отношении такого белка.
Фрагмент РаЬ' антитела против NОР человека по настоящему изобретению имеет нейтрализующую активность по отношению к NОР человека. При использовании в данном изложении термин нейтрализующая активность фрагмента РаЬ' антитела против NОР человека обозначает активность, которая ин- 7 024292 гибирует какую-либо биологическую активность, вызванную ΝΟΡ, путем связывания с ΝΟΡ, а нейтрализующая активность может быть оценена с помощью одного или множества биологической активности ΝΟΡ как показателя. Примеры такой нейтрализующей активности включают ингибиторную активность против связывания ΝΟΡ с 1гкЛ. который представляет собой рецептор ΝΟΡ, ингибиторную активность против потока кальция внутрь клетки, опосредованного НСРЧгкЛ-сигналом. и ингибиторную активность против ΝΟΡ-зависимой сигнализации, связанной с выживанием клетки. Нейтрализующая активность может быть оценена с помощью способов, описанных в разделе Примеры.
Чтобы более конкретно оценить эффект фрагмента РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению, был выполнен анализ ίη νίνο. Например, как описано в разделе Примеры, эффективность лекарственного средства фрагмента РаЬ' может быть оценена по обезболивающему эффекту или тому подобному с использованием модели артрита на мышах. Также возможно оценить эффект удерживания в поврежденной ткани с использованием анализа на проникновение в поврежденную ткань.
Далее, фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению может быть также оценен с точки зрения риска побочных действий. Например, как описано в разделе Примеры, с использованием анализа переноса через плаценту, выполненного после введения фрагмента РаЬ' беременным животным, можно оценить возможность того, что фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению может вызвать эффекты на плод. В дополнение, как описано в разделе Примеры, размер иммунного комплекса (1С), образованного фрагментом РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению и ΝΟΡ, измеряли с помощью анализа на формирование 1С с ΝΟΡ, на основании чего может быть оценена возможность формирования тромба.
В дополнение, в качестве способа оценки различных типов стабильности (например, термостабильности, стабильности при длительном хранении и стабильности в высоких концентрациях) фрагмента РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению, приводятся способ с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии и способ измерения формирования агрегатов при хранении.
Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению, если требуется, очищают и затем получают в виде формы обычными способами и может быть использован для лечения боли, такой как боль при остеоартрите (боль ОА), ревматическая боль, боли, связанной с раковым заболеванием, невропатические боли, хронические боли в спине, послеоперационные боли, посттерапевтическая невралгия, болезненная диабетическая невропатия, боли при переломах и при синдроме раздраженного мочевого пузыря и заболеваниях, формирование патологических состояний которых связано с NΟΡ, таких как интерстициальный цистит, острый панкреатит, хронический панкреатит и эндометриоз.
Фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению может быть использован предпочтительно как средство для лечения боли и, более предпочтительно, как средство для лечения боли при остеоартрите. Примеры форм лечебного средства и тому подобного включают парентеральные формы, такие как инъецируемые средства и средства для вливаний, которые, предпочтительно, вводятся путем внутривенного введения, подкожного введения и т.п. В процессе составления формы могут быть использованы носители и добавки, которые соответствуют данной форме в фармакологически приемлемом диапазоне.
Количество фрагмента РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению, добавленное в вышеописанную форму, варьирует в зависимости от жестокости симптомов у пациента или возраста, используемой формы дозировки лекарственной формы или титра связывания антитела и тому подобного; например, может быть использовано от около 0,001 до 100 мг/кг антитела.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению и вектор экспрессии, содержащий то же самое. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' антитела против ΝΟΤ человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий это поодиночке или вместе. Вектор экспрессии по настоящему изобретению не ограничен конкретно, так что он может экспрессировать ген, который кодирует фрагмент РаЬ' по настоящему изобретению или вариабельный участок его тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи в различных клетках-хозяевах прокариотических клеток и/или эукариотических клеток и продуцируют эти полипептиды. Их примеры включают плазмидные векторы, вирусные векторы (например, аденовирус, ретровирус) и т.п. Предпочтительно вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит полинуклеотид, содержащий или последовательность, кодирующую тяжелую цепь фрагмента или легкую цепь фрагмент вышеописанного фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, или оба полинуклеотида, содержащие последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению.
Вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать ген, который кодирует фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению, или ген, который кодирует вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' антитела против
- 8 024292
ΝΟΡ человека по настоящему изобретению, и промотор, функционально связанный с геном. Примеры промотора для экспрессии гена, кодирующего фрагмент РаЬ' по настоящему изобретению или вариабельный участок его тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи бактерии, включает промотор Тгр, промотор 1ас, промотор гесА, промотор ХРЬ, промотор 1рр, промотор 1ае и т.п., если хозяевами являются бактерии рода ЕксйепсПа. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают промотор РН05, промотор РСК, промотор САР и промотор АЭН, а некоторые примеры промотора для экспрессии в роде ВасШик включают промотор 8601. промотор 8Р02, промотор репР и т.п. Если хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, примеры промотора включают промотор, происходящий из 8У40, ретровирусный промотор, промотор теплового шока и т.п.
Если в качестве клетки-хозяина используется бактерия, в частности ЕксйепсЫа сой, вектор экспрессии по настоящему изобретению может также содержать стартовый кодон, стоп-кодон, терминаторный участок и реплицируемый участок. Если в качестве хозяев используют дрожжи, клетки животных или клетки насекомых, вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать стартовый кодон и стоп-кодон. В этом случае он может содержать энхансерную последовательность, некодирующий участок на 5' стороне и 3' стороне гена, который кодирует фрагмент РаЬ' по настоящему изобретению или его вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок легкой цепи, сигнальную последовательность секреции, сайт сплайсинга, участок полиаденилирования, реплицируемый участок и т.п. Также он может содержать маркер отбора, который применяется обычно (например, ген тетрациклинрезистентности, ген ампициллин-резистентности, ген канамицин-резистентности, ген неомицинрезистености, ген редуктазы дигидрофолиевой кислоты) в соответствии с предполагаемым применением.
Настоящее изобретение также относится к трансформанту, введенному с геном, кодирующим фрагмент РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению, или с геном, кодирующим вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению. Такой трансформант может быть получен путем, например, трансформации клетки-хозяина вектором экспрессии по настоящему изобретению. Клеткихозяева, которые используются для получения трансформанта, конкретно не ограничены, постольку, поскольку это пригодно для вышеупомянутого вектора экспрессии и для трансформации; их примеры включают различные клетки, такие как природные клетки или искусственно сформированные линии клеток, обычно используемые в области по настоящему изобретению (например, бактерии (бактерии рода ЕксйепсЫа, бактерии рода ВасШик), дрожжи (род 8ассЬатотусек, род РюЫа и т.п.), клетки животных или клетки насекомых (например, 8£9) и т.п. Трансформация может быть выполнена каким-либо известным способом самим по себе.
Предпочтительно трансформант по настоящему изобретению представляет собой или клеткухозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ', или клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ'. Более предпочтительно трансформант по настоящему изобретению представляет собой либо клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи вышеупомянутого фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента РаЬ', или клеткухозяин, трансформированную вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи вышеупомянутого РаЬ' по настоящему изобретению, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь фрагмента РаЬ'.
Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования фрагмента РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению, включающему экспрессирование в клетке-хозяине гена, кодирующего фрагмент РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению, или гена, кодирующего вариабельный участок тяжелой цепи и/или вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению, все это - при использовании такого трансформанта. Предпочтительно клетка-хозяин, которая используется в вышеизложенном способе, представляет собой клетку-хозяин, трансформированную вышеописанным вектором экспрессии по настоящему изобретению, и она может по отдельности или одновременно содержать полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи фрагмента РаЬ'.
При продуцировании фрагмента РаЬ' антитела против NСР человека по настоящему изобретению трансформант может быть культивирован в питательной среде. Питательная среда содержит источник углерода и источник неорганического азота или источник органического азота, которые требуются для
- 9 024292 роста трансформанта. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал, сахарозу и т.п.; примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый жмых, экстракт картофеля и т.п. Если желательно, могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлористый кальций, однозамещенный фосфат натрия, хлористый магний), витамины, антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.п.) и т.п.).
Культивирование трансформанта проводится способом, который известен сам по себе. Условия культивирования, например, температура, рН среды и время культивирования выбираются подходящим образом. Например, если хозяин представляет собой клетку животного, в качестве среды может быть использована среда МЕМ, содержащая от около 5 до 20% фетальной бычьей сыворотки (Зс1епсе, Уо1. 122, р. 501, 1952), среда ΌΜΕΜ (У1го1о§у, Уо1.8, р. 396, 1959), среда КРМ1 1640 (1. Ат. Мей. Аззос, Уо1. 199, р. 519, 1967), среда 199 (Ргос. Зос. Ехр. Бю1. Мей., Уо1. 73, р. 1, 1950) и т.п. рН среды предпочтительно составляет около 6 до 8, культивирование обычно проводится при около 30 до 40°С в течение около 15 до 72 ч, а аэрация или перемешивание могут проводиться, если требуется. Когда хозяин представляет собой клетку насекомого, например, может быть упомянута среда Грейса, содержащая фетальную бычью сыворотку (Ргос. №И. Асай. 8сг. ИЗА, Уо1. 82, р. 8404, 1985) и т.п., а ее рН составляет предпочтительно от около 5 до 8. Культивирование обычно проводится при около 20-40°С в течение 15-100 ч, а если требуется, могут быть выполнены аэрация или перемешивание.
Если хозяин представляет собой бактерию, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, пригодна, например, жидкая среда, содержащая вышеупомянутые источники питательных веществ. Среда, имеющая рН 5-8, является предпочтительной. Когда хозяин представляет собой Е.соП, предпочтительные примеры среды включают среду ЬВ, среду М9 (МШег е! а1., Ехр. Мо1. Оеие1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу, р. 431, 1972) и т.п. В этом случае культивирование обычно проводят при 14-43°С в течение около 3-24 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо. Когда хозяин представляет собой бактерию рода ВасШиз, культивирование обычно проводили при 30-40°С в течение около 16-96 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо. Когда хозяин представляет собой дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Буркхолдера (ВозПаи, Ргос. ЫаП. Асай. Зск ИЗА, Уо1. 77, р. 4505, 1980), а рН среды желателен 5-8. Культивирование обычно проводят при около 20-35°С в течение около 14-144 ч, тогда как аэрация или перемешивание выполняется, если необходимо.
Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ человека по настоящему изобретению может быть получен, предпочтительно, выделен и очищен, из культуры трансформанта, как описано выше. Примеры способа выделения и очистки включают способы, основанные на различиях растворимости, таких как высаливание и осаждение растворителя; способы, основанные на различиях молекулярного веса, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в додецилсульфат-полиакридамидном геле; способы, основанные на различиях электрического заряда, такие как ионообменная хроматография и хроматография на гидроксил апатите; способы, основанные на специфической аффинности, такие как аффинная хроматография; способы, основанные на различиях гидрофобности, такие как обращенно-фазная хроматография высокого разрешения; способы, основанные на различиях изоэлектрической точки, такие как изоэлектрическое фокусирование и т.п.
Хотя настоящее изобретение, в целом описано выше, конкретные примеры представлены в данном документе только для лучшего понимания настоящего изобретения. Эти примеры направлены только на иллюстративные цели и не ограничивают сферу настоящего изобретения.
Примеры
На стадиях, использующих коммерчески доступные наборы или реагенты, эксперименты выполняли в соответствии с прилагаемыми протоколами, если не обозначено иное.
Пример 1. Иммунизация мышей Уе1ос1ттипе.
Антитело против ΝΟΡ человека было получено иммунизацией мышей Уе1ос1ттипе. Чтобы увеличить разнообразие получаемых антител, авторы настоящего изобретения проверили множество способов иммунизации, путей введения, адъювантов, периодов иммунизации и т.п. Используя βΝΟΡ человека (Κ&Ό Зуз!етз, 1пс.) в качестве иммуногена, авторы настоящего изобретения проверили способ иммунизации, в котором βΝΟΡ человека был использован для иммунизации путем смешивания с адъювантом после растворения, и способ иммунизации, в котором βΝΟΡ человека использовали путем смешивания его с адъювантом после термической денатурации (обработка при 80°С в течение 10 мин в 0,5% растворе лаурилсульфата натрия (3Ό3)). В качестве пути введения проверяли введение в подушечку стопы и интраперитонеальное введение. В качестве адъюванта проверяли ТПегМах Оо1й (Су1Кх СогрогаПоп), полный адъювант Фройнда (З1дта), неполный адъювант Фройнда (З1дта), и адъювант ΚΙΒΙ (Сопха Согрогайоп). В качестве добавляемого иммуноактиватора проверяли олигонуклеотид СрО и гель фосфата алюминия (ΒΚ.ΕΝΝΤΛΟ). В качестве периода иммунизации проверяли 3-14 недель. После того, как животное было иммунизировано несколько раз, кровь собирали из хвостовой вены мыши, а титр контролировали. Таким образом, отбирали мышей Уе1ос1ттипе, продуцирующих антитело, связывающее ΝΟΡ человека.
- 10 024292
Титр измеряли с использованием стандартного способа ЕЫ§Л. βΝΟΡ человека добавляли в планшет Мах18отр 384 (№тс) 10 нг/лунку и иммобилизовали путем инкубирования в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет отмывали один раз отмывочным раствором (ΤΒδΤ: трис-буфер (ΤΒδ), содержащий 0,05% Т\уссп-20). затем туда добавляли блокирующее средство (ΤΒδΤ, содержащий 20% В1оскш§ Опе (ЯасаЫ Το^ικ. 1пс.)), и планшет оставляли при комнатной температуре на 1 ч. После однократной отмывки планшета отмывочным раствором ΤΒδΤ собранную кровь серийно разбавляли и добавляли в планшет. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором ΤΒδΤ и туда добавляли НКР-козьи антитела против Ι§ мыши (2уте6), которые были разбавлены в 2000 раз отмывочным раствором ΤΒδΤ, содержащим 5% ΒΛΙοπβ Опе. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором ΤΒδΤ. В планшет добавляли хромогенный реагент ТМВ (δυΜΙΤΟΜΟ ΒΆΚΕΕΙΤΕ СО., ΕΤΌ) и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 10 мин, затем туда добавляли стоп-раствор (2 моль/л серной кислоты), чтобы остановить реакцию, и измеряли поглощение при 450 нм.
Пример 2. Получение гибридомы, продуцирующей антитело против ΝΟΡ человека.
Мыши, отобранные путем подтверждения повышения титра антител, были заключительно иммунизированы (внутривенное или интраперитонеальное введение антигена). Селезенку, лимфатический узел или т.п. иммунизированных мышей выделяли обычным способом, чтобы собрать лимфоциты, и лимфоциты сливали с клетками миеломы мыши δΡ2/0, получая, таким образом, гибридому. Гибридома подвергалась серийному разведению и моноклонированию, а антитело очищали из супернатанта с помощью колонок с белком А или белком С (СЕ НеаНйсате 1арап).
Пример 3. Оценка ингибирования связывания ΝΟΤ-ΛΑ.
βNСΡ человека (Κ&Ό δу8ΐет8, 1пс.) позволяли прореагировать с ΕΖ-ΕΙΝΚ 5-(биотинамидо)пентиламином (Р1етсе) при комнатной температуре в течение 30 мин в темном месте, чтобы провести мечение биотином, а избыток биотина удаляли с помощью обессоливающих колонок, получая, таким образом, βΝΟΡ человека, меченный биотином. В примерах 6 и 7, подтверждено, что полученный βΝΟΡ человека, меченный биотином, имеет такую же биологическую активность, как оригинальный βΝΟΡ человека.
Ингибиторную активность измеряли нижеследующим способом. 1ткА человека (Κ&Ό δу8ΐет8, 1пс.) добавляли в белый планшет Махкогр 384 (Пипс) по 60 нг/лунку и иммобилизовали путем инкубирования в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет отмывали один раз отмывочным раствором ΤΒδΤ, а затем добавляли в него блокирующее средство (ΤΒδΤ, содержащий 20% ΒΜ^ Опе (Шсакн Τе8^ие, 1пс.)), и планшет оставляли стоять при комнатной температуре в течение часа. Затем смесь, полученную смешиванием меченного биотином βΝΟΡ человека (0,2 мкг/мл), полученного, как описано выше, с антителом, полученным в примере 2, добавляли в планшет с иммобилизованным 1ткА, прошедшим блокирование. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет три раза отмывали отмывочным раствором ΤΒδΤ и туда добавляли стрептавидин, меченный щелочной фосфатазой (Р1етсе). Через 1 ч инкубации при комнатной температуре планшет отмывали три раза отмывочным раствором ΤΒδΤ, а затем добавляли ΑΡυ4 (ΒώΡχ), который представляет собой реагент для детектирования хемилюминесценции, и измеряли количество хемилюминесценции счетчиком Епу18юп (Ретк1пЕ1тет Со., Ы6.).
Пример 4. Оценка межвидовой перекрестной реактивности.
Если антитело имеет перекрестную реактивность с βΝΟΡ мыши, можно выполнить оценку эффективности лекарственного препарата на модели патологии мыши с использованием антитела. В результате, меченный биотином βΝΟΡ мыши готовили способом по примеру 3 с использованием βΝΟΡ мыши (Κ&Ό δу8ΐет8, 1пс.), посредством которого оценивали перекрестную реактивность антитела против βΝΟΡ мыши.
Пример 5. Оценка специфичности связывания.
Специфичность связывания антитела против ΝΟΡ оценивали с помощью способа ЕЬКА, описанного в примере 1. Конкретно, использовали ΝΤ-3 как семейство молекул, демонстрирующих наивысшую гомологию с ΝΟΡ. ΝΤ-3 человека (Ρер^оΤесЬ) добавляли в планшет способом по примеру 1 20 нг/лунку и иммобилизовали на планшете, таким образом позволяя выполнить оценку.
Пример 6. Оценка ингибирования сигнализации ΝΟΡ-ΛΑ.
Оценивали ингибиторную активность антитела против ΝΟΡ-ΛΑ сигнализации. ΝΟΡ повышает внутриклеточную концентрацию кальция (Са2') через 1ткА как рецептор ΝΟΡ. В целом, изменение концентрации Са2' может быть оценено в присутствии кальциевого индикатора с помощью системы измерения концентрации внутриклеточного кальция (Са2') (НЫРК; Мо1еси1аг Иеуюев, ЬЬС).
Ингибиторную активность измеряли нижеследующим способом. Клетки НЕК293 (УО2009/054468), в которых вызвана стабильная экспрессия 1ткА человека, разносили в покрытые поли-И-лизином лунки 96-луночного планшета Щес^, Июкшзоп апб Сотрапу, 1арап) 2х104 клеток/лунку за день до эксперимента и культивировали в течение ночи. На следующий день культуральную среду заменяли на культуральную среду ИМЕМ (содержащую 3,6 мМ гидрата окиси натрия (№ЮН) и 2,5 мМ пробенецида ^1дта)), содержащую кальциевый индикатор (Ρ1ио4-ΑΜ; Оо|1пбо), и оставляли стоять при 37°С в тече- 11 024292 ние 30 мин. Затем клетки дважды отмывали отмывочным раствором (сбалансированным солевым раствором Хенкса) (ΗΒδδ) (20 мМ 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этан сульфоновая кислота (ΗΕΡΕδ), 3,6 мМ гидрата окиси натрия, 2,5 мМ пробенецида (81дта) и 0,1% бычьего сывороточного альбумина), и культуральную среду заменяли этим отмывочным раствором по 150 мкл/лунку. Планшет с клетками помещали в РЫРР. Управляя РЫРР, смешанный раствор антитела, полученный по примеру 2, и ΝΟΡ добавляли в планшет по 50 мкл/лунку (конечная концентрация ΝΟΡ - 100 нг/мл) и измеряли изменение внутриклеточной концентрации Са2+. Разницу между максимальным и минимальным значениями изменения внутриклеточной концентрации Са2+ рассчитывали и сохраняли в качестве данных измерения.
Пример 7. Оценка ингибирования ΝΟΡ-зависимой сигнализации выживания клеток.
Когда клетки РС 12, естественно экспрессирующие 1гкЛ и р75 рецепторы, культивируются в бессывороточных условиях, ΝΟΡ дает возможность клеткам выживать в течение нескольких дней. Нижеследующим способом оценивали ингибиторную активность антитела против ΝΟΡ-зависимой сигнализации выживания клеток.
Клетки РС 12 высевали в 96-луночный покрытый коллагеном планшет (ΑδΑΗΙ ΤΕΟΗΝΘ СО., ЬТО.) по 1х 104 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в культуральной среде Ρ12Κ (1пуйгодеп), содержащей 2,5% фетальной бычьей сыворотки и 15% инактивированной лошадиной сыворотки (1пуйгодеп) при 37°С под 5% СО2. На следующий день культуральную среду заменяли на только Ρ12Κ в бессывороточных условиях. Через 1 ч туда добавляли антитело и βΝΟΡ человека (конечная концентрация 50 нг/мл), после чего культивировали в течение 72 ч. Затем культуральный раствор удаляли с помощью аспиратора и измеряли жизнеспособность клеток с помощью реагента (СеНТПег О1о; аготеда Согрогайои), количественно определяющего эндогенную АТФ клеток.
Пример 8. Получение фрагмента РаЬ.
Гель, с которым связан переваривающий фермент папаин, добавляли к 1 мг/мл антитела с использованием набора препарата РаЬ (Р1егсе), после чего обрабатывался при 37°С в течение 3 ч. Раствор, прошедший реакцию, наносили на колонку с белком Ο (ΟΕ НеаИЪсаге Оран), расщепленный Рс и непрореагировавший 1дО удаляли абсорбцией на колонке, а элюированную фракцию собирали, получая, таким образом, фрагменты РаЬ. Полученные фрагменты РаЬ оценивали с помощью экспериментов, описанных в примерах 3, 6 и 7.
В результате оценки примеров 3-8, было подтверждено, что антитело, именуемое 1-15 (химерное антитело) имеет высокую нейтрализующую активность, межвидовую перекрестную реактивность и специфичность связывания и сохраняет высокую нейтрализующую активность, даже когда это антитело присутствует в форме фрагмента моновалентного антитела.
Пример 9. Определение последовательности гена антитела.
Для идентифицированного антитела 1-15 авторы настоящего изобретения клонировали гены, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи антитела из гибридом. Конкретно, клон гибридомы получали в количестве 1х105 или более и суспендировали в буфере РЬТ, который включен в набор РЫеа8у Μίηί Κίΐ (6ΙΑΟΕΝ), а затем клетки были дезинтегрированы с помощью ОЫхйгеййег (ΟΙΑΟΕΝ). Затем в соответствии с протоколом экстрагировали РНК и, используя экстрагированную РНК в качестве матрицы, синтезировали кДНК с помощью набора для амплификации ДНК (ЗМАКТег РΑСΕ сЭХА Атрййсайоп Κίΐ; С1оп1есН). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли с помощью полученной кДНК, удлиняя и амплифицируя таким образом вариабельный участок тяжелых цепей и легких цепей. Анализ последовательности выполняли непосредственно на продуктах ПЦР с помощью сиквенатора (ΑΒΙ ΡΡΙδΜ 3100; Аррйеб Вю5у51ет5). В дополнение продукты ПЦР рекомбинировали с вектором субклонирования продукта ПЦР, таким как рСР3.1-ТОРО (1пуйгодеп), после чего анализировали последовательность гена, в результате определяя последовательность.
Определенная последовательность оснований вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 показана в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:1, а ее аминокислотная последовательность показана в 8ΕΟ ГО ΝΟ:2. Далее, последовательность оснований вариабельного участка легкой цепи антитела показана в 8ΕΟ ГО ΝΟ:3, а ее аминокислотная последовательность показана в 8ΕΟ ГО ΝΟ:4. СГОКЕ СГОК2 и СГОР3 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 представляют собой участки в положениях от 31 до 35, 50-65 и 95-102 вариабельного участка тяжелой цепи, основываясь на нумерации Кэбота соответственно, которые состоят из аминокислотных последовательностей в положении от 31 до 35, 50-65 и 98-110 в 8ΕΟ ГО ΝΟ:2 соответственно. СГОКЕ СГОК2 и СГОР3 вариабельного участка легкой цепи антитела 1-15 представляют собой участок в положении от 24 до 34, 50-56 и 89-97 вариабельного участка легкой цепи, основываясь на нумерации Кэбота соответственно, которые состоят их аминокислотных последовательностей в положении от 24 до 39, 55-61 и 94-102 в 8ΕΟ ГО ΝΟ:4 соответственно.
Пример 10. Получение мутанта сайта гликозилирования вариабельного участка.
Аминокислоты (8ΕΟ ГО ΝΟ:2) вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15, описанного выше, включают последовательность мотива гликозилирования Ν-типа, Ν-Χ-(Τ/δ). Конкретно, в вариабельном участке тяжелой цепи, показанном в 8ΕΟ ГО ΝΟ:2, Αδη (Ν52) в положении 52, основываясь на нумерации Кэбота, соответствует сайту гликозилирования. Известно, что гликозилирование антитела
- 12 024292 происходит в ходе культивирования клетки, если антитело имеет сайт гликозилирования, в зависимости от условий культивирования или хозяина, экспрессирующего антитело. Другими словами, даже среди одинаково полученных клеток, продуцирующих антитело, степень гликозилирования, вероятно, варьирует в зависимости от условий культивирования (таких как культуральная среда и плотность клеток), что приводит к возможности того, что возможны трудности с получением из антитела лекарственного средства одинакового качества. Поэтому авторы настоящего изобретения получили 1-15 (Ν52Ό), который был получен путем введения мутации в N52 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15.
Последовательность оснований вариабельного участка тяжелой цепи полученного 1-15 (Ν52Ό) показана в ЗЕф ГО N0:5, а ее аминокислотная последовательность показана в ЗЕС ГО N0:6. СИК1, СИК2 и СИК3 вариабельного участка тяжелой цепи антитела 1-15 (Ν52Ό) представляет собой участки в положении от 31 до 35, 50-65 и 95-102 вариабельного участка тяжелой цепи, основываясь на нумерации Кэбота соответственно, который содержит аминокислотные последовательности в положении от 31 до 35, 50-65 и 98-110 в ЗЕф ГО N0:6 соответственно.
Пример 11. Получение полностью человеческого фрагмента РаЬ' антитела.
Используя вариабельный участок тяжелой цепи 1-15 и 1-15 (N520). описанные выше, и вариабельный участок легкой цепи 1-15, получали соответствующие полностью человеческие фрагменты РаЬ' антитела.
Сигнальная последовательность была соединена с 5'-стороной соответствующего вариабельного участка тяжелой цепи генов 1-15 и 1-15 (N520), а константный участок гена Ι§γ 1 человека (Мап Зипд Со. е! а1., (1992), 1. 1ттипо1. Уо1. 148 (4): 1149-1154) был соединен с его 3'-стороной соответственно. Этот ген фрагмента тяжелой цепи был встроен в ОЗ вектор РЕЕЕ6.4 (Боп/а Вю1одю5). В то же время, чтобы экспрессировать гены как фрагмент РаЬ', стоп-кодон был встроен после кодона Сук в положении 226 (соответствующем Сук в положении 230 аминокислотной последовательностей ЗЕС ГО N0:8 и ЗЕС ГО N0:10, описанных ниже), основываясь на индексе ЕЙ, в гене константного участка тяжелой цепи. В дополнение, сигнальная последовательность была соединена с 5'-стороной вариабельного участка легкой цепи гена 1-15, а константный участок гена κ-цепи человека (Мап Зипд Со. е! а1., описано выше) был соединен с его 3'-стороной соответственно. Этот ген легкой цепи был встроен в ОЗ вектор рЕЕ12.4 (Боп/а Вю1одюк).
Фрагмент РаЬ' экспрессировали двумя путями, включая кратковременную экспрессию и постоянную экспрессию. При кратковременной экспрессии, клетки Ргеек1у1е 293 ОпуЦгодеп), культивировавшиеся в среде экспрессии Ргеек1у1е 293 (1пуйтодеп) при около 1000000 клеток/мл, были трансфицированы вышеописанными векторами ОЗ фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи с помощью 293 Гес11п (1пуйтодеп), после чего культивировались в течение семи дней. При постоянной экспрессии оба вектора ОЗ, описанные выше, расщеплялись ферментами рестрикции №0 и Руц1, после чего следовало лигирование с помощью набора для лигирования ДНК (ТЛКЛКЛ ΒΙ0 ГОС), в результате чего конструировался вектор ОЗ, в который встроены гены и фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи. Этот вектор экспрессии кодирует фрагмент тяжелой цепи, легкую цепь и глютамин синтетазу и экспрессируется после трансфекции в клетки СН0-К1-ЗУ. После того как векторы экспрессировались соответствующими путями, супернатант культуры очищали с помощью КарраЗе1ес! (ОЕ НеаКйсате 1арап) с получением соответствующих фрагментов РаЬ'.
Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи полностью человеческого фрагмента РаЬ' антитела 1-15 (также обозначаемого как 1-15-РаЬ') показана в ЗЕС ГО N0:7, а его аминокислотная последовательность показана в ЗЕС ГО N0:8 соответственно.
Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи полученного полностью человеческого фрагмента РаЬ' антитела 1-15 (N520) (также обозначаемого как 1-15 (№2Э)-РаЬ'), показана в ЗЕС ГО N0:9, а его аминокислотная последовательность показана в ЗЕС ГО N0:10 соответственно.
Легкая цепь соответствующих фрагментов РаЬ' одинакова, а их последовательность оснований показана в ЗЕС ГО N0:11, а их аминокислотная последовательность показана в ЗЕС ГО N0:12 соответственно.
Пример 12. Оценка нейтрализующей активности и уровня экспрессии полностью человеческого фрагмента РаЬ' антитела.
1-15-РаЬ' и 1-15 (№2Э)-РаЬ', полученные в примере 11, были оценены с помощью экспериментов, описанных в примерах 3 и 6. В эксперименте по примеру 3 1С50 1-15-РаЬ' и 1-15 (№2Э)-РаЬ' составила 0,17 и 0,18 мкг/мл соответственно. В эксперименте по примеру 6 1С50 1-15-РаЬ' и 1-15 (№2Э)-РаЬ' составила 0,021 и 0,018 мкг/мл соответственно. На основании этих результатов было подтверждено, что нейтрализующая активность 1-15 (№2Э)-РаЬ' поддерживалась на почти таком же уровне, что у немодифицированного 1-15-РаЬ' и что нейтрализующая активность не меняется, даже если введена мутация.
В дополнение, соответствующие фрагменты РаЬ' экспрессировались путем постоянной экспрессии, и измеряли количество антитела, продуцированного в супернатанте культуры клеточного пула стабильной экспрессии. В результате, концентрации соответствующих супернатантов культуры 1-15-РаЬ' и 1-15 (№2Э)-РаЬ' составили 86 и 106 мг/л соответственно, что показывает, что 1-15 (№2Э)-РаЬ' является
- 13 024292 антителом, которое продуцируется в большем количестве, чем немодифицированный 1-15-РаЬ'.
Пример 13. Получение пэгилированного фрагмента РаЬ' и оценка нейтрализующей активности.
Далее, авторы настоящего изобретения ввели РЕС в 1-15 (Ы52П)-РаЬ'. После очистки с помощью Карра8е1ес! фрагмент РаЬ' подвергался реакции восстановления с помощью гидрохлорида ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфин НС1), в результате чего фрагмент РаЬ' превращался в пэгилированную структуру.
Конкретно, ТСЕР добавляли к раствору фрагмента РаЬ', чью концентрацию устанавливали на уровне 1,2 мг/мл с помощью 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,8), так что ТСЕР составляла 1 мМ, после чего проходила реакция при 37°С в течение 2 ч, а получившееся разбавляли 20 мМ натрийацетатным буфером (рН 5,0), чтобы установить рН. Этот раствор адсорбировался на катионообменной смоле (8Р-5РУ; ТО8ОН СОКРОКЛТЮЫ) и подвергался элюции в градиенте НС1, и основной пик собирали. Полученный фрагмент РаЬ' разбавляли 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,8), так что выход составил 1 мг/мл, рН устанавливали на 6,8, а затем раствор оставляли стоять при 4°С на ночь или более, так что он окислялся естественным образом. 40 кДа РЕС (ЗИПБЫСНТ СЬ2-400МЛ; ЫОР СОКРОКЛТЮЫ) добавляли к раствору, чтобы получить конечную концентрацию 0,1 мМ, и раствор оставляли стоять при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при 4°С в течение ночи. Этот РЕС, имеющий малеимидную группу на конце, быстро реагирует с Сук (С226, основываясь на индексе ЕЙ; Сук в положении 230 в §ЕЦ ГО ΝΌ:10) карбоксильного конца фрагмента тяжелой цепи. Раствор разбавляли 20 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,5), чтобы установить рН, а затем адсорбировали снова на катионообменной смоле (8Р-5РУ; ТО8ОН СОКРОКАТЮП), полученное подвергали элюции градиентом НС1, и главный пик собирали. Полученный пэгилированный фрагмент РаЬ' очищали. Этот пэгилированный 1-15 (Ы52П)-РаЬ' также называется 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС.
Нейтрализующая активность не-пэгилированного и пэгилированного 1-15 (Ы52П)-РаЬ' оценивали способом, показанным в примере 3. В результате, тогда как 1С50 1-15 (Ы52П)-РаЬ' составляет 0,15 мкг/мл, 1С50 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС составляет 0,12 мкг/мл (по концентрации фрагмента РаЬ'), в результате подтвердилось, что нейтрализующая активность 1-15 (Ы52П)-РаЬ' не меняется, даже если добавлен РЕС.
В дополнение, с помощью способа по примеру 6 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС сравнили с антителом против ΝΠΕ человека предшествующего уровня техники - танезумабом, по нейтрализующей активности по отношению к ЫСР человека и мыши. В результате, тогда как 1С50 1-15 (№2Э)-РаЬ'-РЕС составила 0,051 мкг/мл для ЫСР человека и 0,069 мкг/мл для ЫСР мыши, 1С50 танезумаба составила 0,17 мкг/мл для ΝΠΕ человека и 0,23 мкг/мл для ЫСР мыши. Следовательно, подтверждено, что нейтрализующая активность 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС в около 3,3 раза выше, чем танезумаба, по отношению к ЫСР человека и мыши.
Пример 14. Анализ на обезболивающий эффект на модели артрита, вызванного адъювантом, у мыши.
Авторы настоящего изобретения оценивали обезболивающий эффект вышеупомянутого 1-15 (№2Э)-РаЬ'-РЕС на модели артрита, вызванного адъювантом, у мыши.
1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС вводили мышам внутривенно (0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг; доза составила 10 мл/кг), и 1 мг/мл полного адъюванта Фройнда (81дта) вводили в количестве 25 мкл в подушечку передней лапы, чтобы вызвать боль. Через 24 ч после того, как была индуцирована боль, в течение 20 мин измеряли поведенческую реакцию в виде вертикальной стойки (на задних лапах). Конкретно, с помощью системы мониторинга спонтанной активности ЗИРЕКМЕХ (МитотасЫ Κί1«·ιί Со., Ыб.) количество времени спонтанного положения мыши в вертикальной стойке в течение 20 мин измеряли с помощью сенсора инфракрасного излучения (Ма!коп е1 а1., 1РЕТ 320:194-201, 2007). В качестве сравнительного контроля использовали антитело танезумаб, относящееся к предшествующему уровню техники. В результате, тогда как внутривенное введение танезумаба вызывало обезболивающий эффект с ЕП50=0,27 мг/кг, 1-15 (Ν52Ό)РаЬ'-РЕС вызывал обезболивающий эффект с ЕЭ50 = 0,11 мг/кг, что показывает эффективность, большую в около 3 раз.
Пример 15.: Анализ на перенос через плаценту крысы.
1-15 (№2Э)-РаЬ'-РЕС или танезумаб вводили внутривенно (100 мг/кг, доза составляла 10 мл/кг) самкам крыс на 17-й день беременности. Через три дня измеряли концентрацию антитела в крови матери и плода.
Концентрацию антитела измеряли нижеследующим образом. βΝΠΕ человека (Κ&Ό §ук!етк, 1пс.) добавляли в 96-луночный планшет МиЬТ1-АККАУ р1а1е (§!апбатб) (Меко 8са1е Оксоуегу) по 25 нг/лунку и иммобилизовали, оставляя стоять при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшет отмывали три раза отмывочным раствором ТВ8Т и туда добавляли блокирующее средство (1% казеин ТВ§; Тйетто Р1кйег) и оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем образец крови, полученный путем разбавления собранной тем временем крови, добавляли в планшет с иммобилизованным βΝΠΕ человека, подвергшимся блокированию. После того как смесь реагировала при комнатной температуре в течение 60 мин при встряхивании, планшет отмывали три раза отмывочным раствором ТВ8Т, а затем туда добавляли меченное биотином к антитело человека (1ттипо-Вю1одюа1 ЬаЬогаФпек Со., Ыб.). После
- 14 024292 того, как смесь прореагировала в течение 60 мин при комнатной температуре при встряхивании, планшет три раза отмывали отмывочным раствором ТВ8Т и туда добавляли ЗиЬЕО-ТАО-меченный стрептавидин (Меко 8са1е ОЕсоусгу). После того как смесь прореагировала в течение 60 мин при комнатной температуре при встряхивании, планшет три раза отмывали отмывочным раствором ТВ8Т, туда добавляли Кеаб Вийет Т (Меко 8са1е П18соуегу) и измеряли величину электрохимической люминесценции с помощью 8ЕСТОК 1тадег 6000 (Меко 8са1е П18соуету).
Этот эксперимент выполняли на трех крысах-матерях. Через три дня концентрация антител 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС и танезумаба в крови крыс-матерей составила в среднем 12,1 и 7,1 мкг/мл соответственно. Между тем, что касается концентрации антител в крови 3 плодов, полученных от каждой из крысматерей (всего 9 плодов), тогда как концентрация 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС в крови составила 0,01 мкг/мл (предел количественного определения) или менее во всех плодах, концентрация танезумаба в крови составила в среднем 5,39 мкг/мл. То есть, тогда как танезумаб переносился в плод на уровне 75,9%, 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС переносился в плод на уровне 0,08% (предел определения) или менее. Эти результаты предполагают, что 1-15 (Ы52П)-РаЬ'-РЕС представляет собой медицинское средство, обладающее превосходным качеством по безопасности за счет устранения риска побочных действий, вызванных в плоде вследствие ингибирования ΝΟΡ.
Пример 16. Формирование иммунного комплекса (1С).
Оценивали, образует ли 1С 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС или насколько велик размер сформированного 1С. Конкретно, 1 мг/мл 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС смешивали с βΝΟΡ человека (Κ&Ό 8ук1етк, 1пс.) в молярном соотношении 1:1, после чего следовала инкубация при комнатной температуре в течение 3 ч, с образованием в результате 1С. Размер частиц и распределение 1С в этом реакционном растворе измеряли с помощью 2е1ак1/ег №то (Макет) в качестве инструмента, измеряющего динамическое рассеяние света. Для анализа использовали 2е1ак1/ег ν6.01 (Макет), а размер частиц индицировался по значению (6. нм), анализировавшихся в значениях интенсивности (%).
Измеренные размеры частиц показаны в табл. 1. В этом эксперименте размер частиц только ΝΟΡ составил в среднем 6,2 нм. В случае только танезумаба пиковый размер наблюдался на 11,7 нм. Когда измеряли 1С, образовавшийся при инкубации танезумаба и ΝΟΡ, пиковый размер смещался к 91,3 нм. С другой стороны, когда антитело, не связанное с ΝΟΡ, использовалось как контрольное антитело, пиковый размер составлял те же 11,7 нм. Рассматривая изменения величины, предполагалось, что каждый танезумаб и ΝΟΡ превращается в макромолекулу в результате комбинирования множества молекул, в результате чего образуется 1С крупного размера. По контрасту с этим, когда измеряли формирование 1С 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС и ΝΟΡ, пиковый размер смещался с 18,1 к 24,4 нм. При рассмотрении изменения величины этот результат отражает только связывание одна к одной и предполагает, что формирования пространственной структуры с 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС не происходит.
Таблица 1
Образец Размер частиц
Пиковый (ά. нм) Средний (ά. нм)
Контрольный 1дС 1дС 11,7 12, 8
1дС+гЬЫ6Г 11,7 12, 6
Танезумаб 1дС 11,7 13, 0
1дС+гЬЫ6Г 91,3 99, 2
1-15(Ν52ϋ)-ГаЬ'- РЕ6 1дС 18,1 19, 8
1дС+гЬЫСГ 24,4 26, 0
Пример 17. Распределение свойств в поврежденной ткани.
Эмульсию, включающую коллаген (бычий коллаген из сустава тип 2, 10 мг/мл; Со11адеп 1есНп1цие теотккйор) и полный адъювант Фройнда (0,5 мг/мл; Э1ЕСО) в соотношении 1:1 вводили подкожно в голеностопный сустав мыши ΌΒΆ/1, в результате получая модель артрита, индуцированного коллагеном. Через четыре недели после индукции артрита эмульсию вводили снова, чтобы вызвать артрит. Степень развития артрита (оценка и величина опухоли) в передних конечностях наблюдали в группе мышей. Флуоресцентное мечение выполняли на 1 мг/мл РВ8 растворах 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС и танезумаба с использованием набора δΑίνΐ™ Кар16 ЛпйЬобу ЬаЬеНпд Κίΐ, А1еха Е1иог (зарегистрированная торговая марка) 680 (Ьйс ТесНпо1од1ек Сотротайоп). 2 мг/кг (Ν=4) каждого раствора вводили хвостовую вену. Накопление флуоресценции, накапливающейся в опухшей подушечке стопы, анализировали с помощью ΐνΐδ Зресйит (СаНрет/Хеподеп), и интенсивность флуоресценции указывалась как численные значения.
Фигура показывает изменение во времени количества антитела, удерживающегося в подошве. 1-15 (№20)-ЕаЬ'-РЕС демонстрировало эффект удерживания в поврежденной ткани более ясно по сравнению с танезумабом, и этот эффект сохранялся в течение 48 ч. Исходя из этого результата, 1-15 (Ν52Ό)ЕаЬ'-РЕО расценивается как эффективно вызывающее обезболивающий эффект, и ожидается, что это
- 15 024292 антитело в малой дозе способно вызывать обезболивающий эффект, равный или больший, чем эффект лекарственного средства. Также ожидается, что 1-15 (№2Э)-РаЬ'-РЕС может быть превосходным в отношении безопасности медицинского средства, поскольку это антитело селективно накапливается в месте повреждения.
Пример 18. Получение аминокислотного аддукта фрагмента РаЬ'.
Чтобы улучшить эффективность введения РЕО в 1-15 (№2О)-РаЬ', авторы настоящего изобретения получили фрагменты РаЬ', которые были получены путем добавления двух аланинов (А) или пролинов (Р) после остатка Сук в карбоксильном конце фрагмента тяжелой цепи и выполнили экспрессию и очистку. Такой же способ, как в примере 11, был использован для получения этих фрагментов РаЬ'. По этому способу кодон двух аланина или пролина встраивается после кодона остатка Сук на карбоксильном конце фрагмента тяжелой цепи 1-15 (№2Э)-ЕаЬ'. а стоп-кодон встраивается после этого кодона.
Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи 1-15 (№2О)-РаЬ' с добавленным аланином (полностью человеческий 1-15 (№2Э-А) фрагмент РаЬ'антитела; также обозначаемый как 1-15 (N520А)-РаЬ'), показана в 8ЕЦ ГО N0:13, а ее аминокислотная последовательность показана в 8ЕЦ ГО N0:14 соответственно. Последовательность оснований фрагмента тяжелой цепи с добавлением пролина 1-15 (№20)-РаЬ' (полностью человеческий 1-15 (№20-Р) фрагмента РаЬ'антитела; также обозначаемая как 1-15 (№2О-Р)-РаЬ'), показана в 8ЕЦ ГО N0:15, а ее аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ГО N0:16 соответственно. Легкая цепь соответствующих фрагментов РаЬ' такова же, как легкая цепь 1-15 (№2О)-РаЬ', а последовательность оснований и ее аминокислотная последовательность показаны в 8Е0 ГО N0:11 и 8ЕЦ ГО N0:12 соответственно.
Пример 19. Получение пэгилированного 1-15 (№20-А)-РаЬ' и оценка нейтрализующей активности и фармакологическая оценка) 40 кДа РЕО конъюгировали с 1-15 (№20-А)-РаЬ' таким же образом, как в примере 13, в результате получая пэгилированный 1-15 (№20-А)-РаЬ' (здесь и далее также обозначаемый как 1-15 ^52О-А)-РаЬ'-РЕО).
Нейтрализующую активность 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО оценивали по способу, описанному в примере 3. В результате, тогда как 1С50 1-15 (№2О)-РаЬ'-РЕО составила 0,081±0,034 мкг/мл, 1С50 1-15 (N520А)-РаЬ'-РЕО составила 0,074±0,021 мкг/мл. В дополнение, 1С50 танезумаба в то же время составила 0,410 ± 0,099 мкг/мл.
Далее, нейтрализующую активность сравнивали с помощью способа, описанного в примере 6. В результате, тогда как 1С50 1-15 (№2О)-РаЬ'-РЕО составила 0,061±0,011 мкг/мл для NОР человека, 1С50 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО составила 0,064±0,028 мкг/мл.
Далее, обезболивающий эффект на модели артрита, вызванного адъювантом, оценивали с помощью способа, описанного в примере 14. В результате, 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО продемонстрировал обезболивающий эффект на модели артрита.
Приведенные выше результаты подтверждают, что даже при добавлении двух аланинов после остатка Сук на карбоксильном конце, нейтрализующая активность и фармакологическая активность не изменены.
Пример 20. Оценка аффинности связывания 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО.
Термодинамику связывания 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО и танезумаба с антигеном NОР исследовали с помощью изотермической титрационной калориметрии (1ТС) (8саррабсс1 РА, ί. №·ιΐ1 Сапсег Ιηκΐ. 2007, 99:1232-9. Уе1а/чне/-Сотроу, А., е1 а1., Сигг РгоЮс Се11 ΒίοΙ. 2004, СНар1ег 17, Ипб 17-18). Все измерение целиком выполняли с помощью АШочТС 200, произведенного ОЕ НеабНсаге. В ходе эксперимента выполняли анализ при нижеследующих концентрациях, так чтобы оценить связывание моновалентного фрагмента РаЬ' с одной молекулой антигена, а весь анализ проводили в растворе РВ8. Конкретно, 44 мкМ βNОР человека (К&О 8ук1етк, 1пс.), содержащиеся в титровальном шприце, титровали в калориметрическую ячейку, заполненную образцом антитела (3 мкМ 1-15 (№2О-А) -РаЬ'-РЕО или 1,5 мкМ танезумаба) по 1,4 мкл 30 раз, и детектировалось количество тепла, продуцированное в результате. Полученные данные анализировали с помощью модели моносайтового связывания с помощью программного обеспечения, прилагающегося к прибору, таким образом рассчитывая аффинность связывания (Кб), соотношение связывания (п), свободную энергию связывания (ΔΟ), энтальпию связывания (Δ) и энтропию связывания (-ΤΔ8), связанные со связыванием антиген-антитело. Эти результаты показаны в табл. 2.
В результате, значение Кб танезумаба составило 20,41 нМ, значение Кб 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО составило 1,49 нМ, что показывает, что аффинность связывания 1-15 (№2О-А)-РаЬ'-РЕО было более сильным в 10 раз или более, чем таковое танезумаба (табл. 2).
- 16 024292
Таблица 2
ка (нм) ДС (кал/моль) ΔΗ (кал/моль) -ΤΔ5 (кал/моль)
Танезумаб 20, 41 -10490 -4759 -5731
1-15 (Ν52ϋ-Α) -ГаЬ'- РЕС 1,49 -12041 -20806 8765
Пример 21. Получение пэгилированного 1-15 (Ν52Ο-Α)-ΡηΡ, имеющего РЕО различного размера, и оценка нейтрализующей активности.
1-15 (Ν52Ο-Λ)-Ρ;ώ'. полученный по примеру 18, конъюгировали с 5 кДа РЕО или 10 кДа РЕО с помощью процедуры, сходной с таковой по примеру 13. Конкретно, раствор фрагмента Ρ;ώ', полученный с помощью 20 мМ ТГ18-НС1 буфера (рН 7,4), подвергали восстанавливающей обработке с помощью ТСЕР. Затем фрагмент Ρ;ώ' собирали с помощью высаливающей колонки. РЕО (δυΝΒΚΙΟΗΤ ОЬ2-50МЛ или δυΝΒΚΙΟΗΤ ОЬ2-100МЛ; ΝΟΡ СΟΚРΟΚΑΤЮN) добавляли к полученному фрагменту Ρ;ώ' и раствор оставляли стоять при 4°С в течение ночи. 1-15 (№2О-Л)-фрагменты Ρ;ώ', конъюгированные с 5 кДа РЕО или с 10 кДа РЕО, которые были получены таким образом, именовались 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ и 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-10кРΕΟ соответственно.
Затем с помощью способа, показанного в примере 6, соответствующие пэгилированные фрагменты ΡαΡ сравнивали между собой по нейтрализующей активности. В качестве сравнительного контроля использовали 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-РΕΟ (конъюгированный с 40 кДа РЕО; здесь и далее также обозначаемый как 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-40кРΕΟ), полученный по примеру 19. В то же время выполняли анализ при конечной концентрации ΝΟΡ 50 нг/мл. В результате, 1С50 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ, 1-15 (Ν52Ο-Α)-ΡηΡ10кРЕО и 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-40кРΕО составили 0,030, 0,028 и 0,023 мкг/мл соответственно. Исходя из этих результатов, понятно, что РЕО, размеры которого находятся в диапазоне от 5 до 40 кДа, не влияет на нейтрализующую активность фрагментов Ρ;ώ'.
Пример 22. Оценка РК мыши для пэгилированного 1-15 (Ν52Ο-Α)-Ρ;·ιΚ имеющего РЕО различных размеров.
Оценка РК мыши была выполнена для различных типов пэгилированных 1-15 (Ν52Ό-Α)-ΡαΚ Конкретно, 0,3 мг/кг различных типов пэгилированных 1-15 (Ν52Ο-Α)-ΡηΡ вводили внутривенно, кровь собирали на 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 и 168 ч после введения. Количество тестируемого антитела в полученной крови измеряли с помощью сэндвич-ЕША. Конкретно, тестируемое антитело добавляли в планшет ΜδΌ (Меко 8са1е Ойсоусгу), в котором иммобилизован ΝΟΡ. Антитело, связанное с планшетом, распознавали с помощью к-антитела человека, меченного биотином, которое затем детектировалось с помощью стрептавидина, меченного δυΕΡΟ-ΤΑΟ. Концентрацию антитела в крови рассчитывали с помощью создания калибровочной кривой с использованием соответствующих стандартов. Из рассчитанной концентрации антитела в крови, рассчитывали время полужизни антитела в крови (Т1/2: час). В результате, Т1/2 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ, 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-10кРΕΟ и 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-40кРΕΟ составили 13,8±2,2 ч, 17,7±0,4 ч и 39,2±3,7 ч соответственно.
Пример 23. Анализ на обезболивающий эффект с использованием модели надреза подошвы крысы.
Используя модель боли после надреза подошвы крысы (Вгеппап е1 а1., Сиггеи! Рго1осо1к ίη РНагшасо1оду 2004; 5.34.1-5.34.8), которая рассматривается как отражающая послеоперационную боль в клинической практике, оценивали обезболивающий эффект 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ и 1-15 (Ν52Ο-Α)-ΡηΡ10кРЕО на послеоперационную боль.
Конкретно, в каждой группе было по 8 крыс, и 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ или -10кРЕО вводили крысам внутривенно (0,1, 0,3 и 1 мг/кг, доза составила 1 мл/кг). Затем в подошве правой передней лапы делался прямой надрез, который имел величину 10 мм в направлении пальцев в положении, удаленном на 5 мм от конца пятки, а затем немедленно накладывался матрасный шов нейлоновой нитью в двух местах, вызывая таким образом боль. Болевые пороги в области операции измеряли через 5 ч и на первый, второй, третий, четвертый и пятый дни после индукции боли. Для измерения был использован динамический подошвенный анестезиометр производства фирмы идо Вакйе, чтобы измерить давление, при котором крысы демонстрируют реакцию избегания, когда давление прикладывается к подошве. В качестве сравнительного контроля использовали антитело танезумаб из предшествующего уровня техники.
В результате внутривенное введение танезумаба приводило к обезболивающему эффекту ЕО50=0,26 мг/кг в 1-й послеоперационный день, и 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ, и -10кРЕО вызывали обезболивающий эффект Е05о=0,15 мг/кг, что примерно около в два раза более эффективно. В дополнение, существенный обезболивающий эффект 1-15 (N52^-Α)-ΡаЬ'-5кРΕΟ и -10кРЕО продолжал наблюдаться и в 3- и 4-й послеоперационные дни соответственно.
- 17 024292
Пример 24. Оценка стабильности агрегации.
1-15 (№2О-Л)-РаЬ'-40кРЕО растворяли до 1 и 10 мг/мл в условиях рН 5, 6, 7,4 и 9. Каждый из этих растворов содержали при 50°С, чтобы оценить стабильность агрегации через 2 недели. Чтобы оценить свойства агрегации, выполняли эксклюзионную хроматографию с помощью ЛдПсШ 1100 производства фирмы Лдйей. В качестве условий измерения использовали 0,1 М фосфат натрия, содержащий 0,2 М аргинина (рН 6,8) в качестве буфера подвижной фазы, а ΤδΚ де1 §ирег 8\у3000 (ΤΘδΘΗ, 2,0 мм ГО х300 мм) использовали в качестве колонки. Длина волны детектирования составила 280 нм. В анализе при 1 мг/мл, танезумаб использовали как антитело сравнения, а результаты показаны в табл. 3. В анализе при 10 мг/мл, танезумаб и ΚΕΟΝ 475 использовали как антитела сравнения, а результаты показаны в табл. 4.
В результате для танезумаба и ΚΕΟΝ 475 заметное увеличение количества образовавшихся агрегатов наблюдалось через две недели. По контрасту с этим для 1-15 (№2О-Л)-РаЬ'-40кРЕО агрегаты почти не детектируются. Этот результат предполагает, что пэгилированный 1-15 (№2Э-Л)-РаЬ' с высокой вероятностью может быть лекарством, имеющим превосходную стабильность при хранении.
Таблица 3
рН Время (дни) 1-15(Ν52Ό-Α)-ГаЬ’- 40кРЕ6 Танезумаб
Агрегация (%) Агрегация (%)
Полимер Димер Полимер Димер
рН 5 0 0, 0 0,7 0, 2 2,5
14 0, 0 0,7 11,7 5, 6
рН 6 0 0, 0 0,7 0, 3 2,7
14 0, 0 0, 6 1, з 3, Θ
рН 7,4 0 0, 0 0,7 0, 3 2,8
14 0, 0 0, 6 3, 1 3,8
рН 9 0 0, 0 0, 6 0, 3 2,8
14 0, 4 1,1 5, 7 4,7
Таблица 4
рН Время 1 -15(Ν52ϋ-Α)- Танезумаб ΚΕ3Ν 475
(дни) ВаЬ'-40кРЕС
Агрегация (%) Агрегация (%) Агрегация (8)
Полимер Димер Полимер Димер Полимер Димер
рН 5 0 0,0 0,4 0, 9 4, 8 0,3 1,7
14 0, 1 0,5 23,5 8, 4 8, 7 3, 9
РН 6 0 0,0 0,4 - - 1,2 3, 0
14 0,0 0,7 - - 2, 1 3, 6
рн 0 0,0 0,5 1,7 6, 1 0, 3 2, 0
7,4 14 0,0 0,8 5, 6 7, 8 4,0 2, 6
рН 9 0 0,0 0, 6 1, 8 6, 4 0,3 1, 8
14 0,0 1,5 7, 1 7,5 12, 9 2, 9
Не тестировали.
Промышленная применимость
Антитело против NΟΡ человека, более конкретно - фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека по настоящему изобретению подходит для профилактики или лечения различных заболеваний, формирование патологических состояний которых связано с NΟΡ человека.

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Фрагмент РаЬ' антитела против ΝΟΡ (фактор роста нервной ткани) человека, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности
    8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:6; и вариабельный участок легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8ΕΟ ГО ΝΟ:4.
  2. 2. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок ^1 человека.
  3. 3. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок Цк человека.
  4. 4. Фрагмент РаЬ' по п.1, в котором константный участок тяжелой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок ^1 человека, а константный участок легкой цепи фрагмента РаЬ' представляет собой константный участок Цк человека.
  5. 5. Фрагмент РаЬ' по п.1, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности 8ΕΟ ГО ΝΟ:10, 8ΕΟ ГО ΝΟ:14 или 8ΕΟ ГО ΝΟ:16; и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8ΕΟ ГО ΝΟ:12.
  6. 6. Фрагмент РаЬ' по любому из пп.1-5, в котором фрагмент РаЬ' конъюгирован с полиэтиленгликолем.
  7. 7. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по п.1.
  8. 8. Полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ' по п.1.
  9. 9. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.7 и/или 8.
  10. 10. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.9.
  11. 11. Клетка-хозяин по п.10, которая выбрана из группы, состоящей из:
    (a) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, имеющий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по п.1, и полинуклеотид, имеющий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ'; и (b) клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, имеющий последовательность, которая кодирует фрагмент тяжелой цепи фрагмента РаЬ' по п.1, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, имеющий последовательность, которая кодирует легкую цепь фрагмента РаЬ'.
  12. 12. Способ получения фрагмента РаЬ' антитела против NΟΡ человека, включающий экспрессию фрагмента РаЬ' антитела против NΟΡ человека, путем культивирования клетки-хозяина по п.10 или 11.
  13. 13. Фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека, полученный способом по п.12.
  14. 14. Фрагмент РаЬ' антитела против NΟΡ человека по п.13, где фрагмент РаЬ' конъюгирован с полиэтиленгликолем.
EA201490433A 2011-08-11 2012-08-10 Новое антитело против ngf человека EA024292B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011176209 2011-08-11
JP2011269215 2011-12-08
PCT/JP2012/070433 WO2013022083A1 (ja) 2011-08-11 2012-08-10 新規抗ヒトｎｇｆ抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490433A1 EA201490433A1 (ru) 2014-05-30
EA024292B1 true EA024292B1 (ru) 2016-09-30

Family

ID=47668585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490433A EA024292B1 (ru) 2011-08-11 2012-08-10 Новое антитело против ngf человека

Country Status (28)

Country Link
US (2) US8986952B2 (ru)
EP (1) EP2743348B1 (ru)
JP (1) JP5376095B2 (ru)
KR (1) KR101999867B1 (ru)
CN (1) CN103748222B (ru)
AR (1) AR087506A1 (ru)
AU (1) AU2012293161B2 (ru)
BR (1) BR112014002576B1 (ru)
CA (1) CA2841181C (ru)
CY (1) CY1119914T1 (ru)
DK (1) DK2743348T3 (ru)
EA (1) EA024292B1 (ru)
ES (1) ES2663968T3 (ru)
HR (1) HRP20180155T1 (ru)
HU (1) HUE036079T2 (ru)
IL (1) IL230797A (ru)
IN (1) IN2014CN00614A (ru)
LT (1) LT2743348T (ru)
ME (1) ME02944B (ru)
MX (1) MX351273B (ru)
NO (1) NO2743348T3 (ru)
PL (1) PL2743348T3 (ru)
PT (1) PT2743348T (ru)
RS (1) RS56876B1 (ru)
SI (1) SI2743348T1 (ru)
TW (1) TWI554519B (ru)
WO (1) WO2013022083A1 (ru)
ZA (1) ZA201400741B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
JP6190723B2 (ja) 2010-12-01 2017-08-30 アルダーバイオ ホールディングス エルエルシー 抗ｎｇｆ組成物およびその使用
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
CN107614683B (zh) * 2015-05-22 2020-12-22 安斯泰来制药株式会社 新型抗人NGF抗体Fab片段
TW201738269A (zh) * 2016-03-25 2017-11-01 安斯泰來製藥股份有限公司 含有ＰＥＧ化抗人類ＮＧＦ抗體Ｆａｂ’片段之醫藥組成物
CN109929035B (zh) * 2017-12-15 2022-06-28 安源医药科技（上海）有限公司 抗人ngf抗体及其制备方法和用途
EP3795176A4 (en) 2018-05-15 2022-01-12 Astellas Pharma Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR SUPPRESSION OF ATRIAL FIBRILLATION WITH ANTI-HUMAN NGF ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AS AN ACTIVE SUBSTANCE

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010535509A (ja) * 2007-08-10 2010-11-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト神経成長因子に対する高親和性ヒト抗体

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
KR100337069B1 (ko) * 1993-03-11 2002-10-11 사이단호진가가쿠오요비겟세이리요호오겐큐쇼 항-hiv모노클로날항체
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2448956C (en) 2001-05-30 2017-10-03 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
NZ540730A (en) 2002-12-24 2010-09-30 Rinat Neuroscience Corp Anti-NGF antibodies and methods using same
NZ599196A (en) 2003-07-15 2014-01-31 Amgen Inc Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
KR101298383B1 (ko) 2005-01-24 2013-08-20 엘란 파마 인터내셔널 리미티드 Ｎｇｆ에 대한 특이적 결합 멤버
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
RU2461551C2 (ru) 2007-10-24 2012-09-20 Астеллас Фарма Инк. Азолкарбоксамидное соединение или его фармацевтически приемлемая соль
PT2448970E (pt) 2009-05-04 2014-10-20 Abbvie Res B V Anticorpos contra factor de crescimento nervoso (ngf) com estabilidade in vivo melhorada

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010535509A (ja) * 2007-08-10 2010-11-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト神経成長因子に対する高親和性ヒト抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARBER Ken, Fate of novel painkiller mAbs hangs in balance, Nat. Biotechnol., 2011.03, Vol. 29, No. 3, p. 173, 174 *

Also Published As

Publication number Publication date
RS56876B1 (sr) 2018-04-30
AU2012293161B2 (en) 2017-04-27
MX351273B (es) 2017-10-06
EP2743348A1 (en) 2014-06-18
ME02944B (me) 2018-04-20
CN103748222B (zh) 2015-07-22
ES2663968T3 (es) 2018-04-17
US20140155582A1 (en) 2014-06-05
HRP20180155T1 (hr) 2018-03-23
CY1119914T1 (el) 2018-06-27
US20150218265A1 (en) 2015-08-06
KR101999867B1 (ko) 2019-07-12
LT2743348T (lt) 2018-05-10
CA2841181C (en) 2022-01-25
DK2743348T3 (en) 2018-02-26
KR20140047116A (ko) 2014-04-21
TW201319086A (zh) 2013-05-16
TWI554519B (zh) 2016-10-21
EP2743348A4 (en) 2015-04-29
IN2014CN00614A (ru) 2015-04-03
PT2743348T (pt) 2018-02-23
EP2743348B1 (en) 2018-01-10
EA201490433A1 (ru) 2014-05-30
MX2014001627A (es) 2014-05-28
SI2743348T1 (en) 2018-04-30
AR087506A1 (es) 2014-03-26
NO2743348T3 (ru) 2018-06-09
CA2841181A1 (en) 2013-02-14
IL230797A0 (en) 2014-03-31
JP5376095B2 (ja) 2013-12-25
US8986952B2 (en) 2015-03-24
PL2743348T3 (pl) 2018-04-30
AU2012293161A1 (en) 2014-02-06
WO2013022083A1 (ja) 2013-02-14
JPWO2013022083A1 (ja) 2015-03-05
ZA201400741B (en) 2014-11-26
CN103748222A (zh) 2014-04-23
IL230797A (en) 2017-06-29
BR112014002576A2 (pt) 2021-01-12
HUE036079T2 (hu) 2018-06-28
BR112014002576B1 (pt) 2022-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024292B1 (ru) Новое антитело против ngf человека
US9127055B2 (en) Method of treating pain with anti-human NGF antibody
JP6486908B2 (ja) 肝細胞増殖因子に結合する設計アンキリン反復タンパク質
US20200407420A1 (en) Her-1, her-3 and igf-1r compositions and uses thereof
EA011449B1 (ru) Моноклональное антитело человека к cd40 и способы его применения
EA032985B1 (ru) Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc
EA026119B1 (ru) Новое антитело против рецептора il-23 человека
ES2665851T3 (es) Nuevo anticuerpo anti-CTGF humano
EP4177275A1 (en) Coagulation factor xi (fxi) binding protein
JP6135161B2 (ja) 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
US10478477B2 (en) Method for prophylaxis or treatment of erbb1 positive cancers using a variant peptidase d with reduced activity
WO2014180485A2 (en) Pappalysin regulator
KR20190135478A (ko) 항 gpr20 항체
JP2016000003A (ja) 新規抗ヒトｔｗｅａｋ抗体
Hu et al. Generation of a mouse monoclonal antibody recognizing both the native and denatured forms of human VEGF

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM