KR20180123559A - PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 함유 의약 조성물 - Google Patents

PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 함유 의약 조성물 Download PDF

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아야노 야마모토
아키노리 치쿠시
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

분해물, 다량체, 산성측 유사체, 염기성측 유사체, 불용성 이물의 생성을 억제하여 이루어지는, 안정한 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는 의약 조성물을 제공한다. 상기 의약 조성물은 pH가 4 내지 5.5이며, 원한다면, 제약학적으로 허용되는 완충제, 등장화제 및 계면 활성제를 더 함유할 수 있다.

Description

PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 함유 의약 조성물
본 발명은, 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물에 관한 것이다.
신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF)는 신경 영양 인자(neurotrophic factor)라고 총칭되는 액성 인자의 하나이며, 생체 내에 있어서 뉴런의 발생, 분화, 기능 유지에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다.
본 출원인에 의해, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG)을 결합시킨(이하, 「PEG화」라고 약기하기도 함) 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트가, 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 또는 치료(예를 들어, 변형성 관절증에 수반하는 관절통(OA 동통), 류머티즘에 수반하는 관절통, 암성 동통, 신경 인성 동통, 만성 요통, 수술 후 동통, 대상 포진 후 신경통, 유통(有痛)성 당뇨병성 신경 장애, 골절통, 방광통 증후군 등의 동통이나, 간질성 방광염, 급성 췌염, 만성 췌염, 자궁 내막증 등)에 유용한 것이 공표되어 있다(특허문헌 1).
한편, 근년 각종 항체 등의 단백질을 포함하는 의약품이 개발되어, 실제로 의료 현장에 제공되고 있다. 이들 의약품의 대부분은, 정맥 내 투여나 피하 투여 등에 의해 투약되기 때문에, 의료 현장에는, 액체 제제 또는 동결 건조 제제 등의 비경구 의약 조성물의 형태로서 제공된다. 특히, 비경구 의약 조성물은 직접 체 내에 투여되는 것을 전제로 하기 때문에, 안정된 의약품 제제인 것이 바람직하다.
즉, 항체 등의 단백질을 함유하는 용액에서는, 불용성 이물의 형성 등을 억제하는 것이 바람직하고, 또한 유효성의 관점에서, 분해물, 다량체, 유사체 등의 형성을 억제하는 것이 바람직하다.
따라서, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 개발하기 위해서는, 지금도 개선의 여지가 있다.
또한, 항인간 NGF 항체 또는 인간 NGF를 함유하는 안정된 의약 조성물에 관한 발명(특허문헌 2, 3 및 4)이 알려져 있지만, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트에 관한 것은 아니다.
국제 공개 제2013/022083호 국제 공개 제2010/032220호 국제 공개 제95/05845호 국제 공개 제2011/116090호
본 발명의 목적은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 제공하는 데 있다.
상세하게는, 본 발명의 목적은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하고, 예를 들어 열이나 온도 조건 등에 의해 증대되는, 분해물, 다량체, 산성측 유사체, 염기성측 유사체의 생성을 억제하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하고, 예를 들어 동결 융해, 물리적 진동 등에 의해 증대되는, 불용성 이물의 생성을 억제하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 용액의 pH를 특정한 범위로 조정하고, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 제제화함으로써, 안정된 의약 조성물을 조제할 수 있는 것(후기 실시예 1), 또한 특정한 등장화제를 첨가하는 것(후기 실시예 2), 계면 활성제를 첨가하는 것(후기 실시예 3) 등에 의해, 더욱 안정된 의약 조성물을 제공할 수 있는 것 등을 지견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은
[1] PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하고, pH가 4 내지 5.5인, 안정된 의약 조성물로서,
해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는,
(1) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트, 및
(2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트
로부터 선택되고,
상기 PEG화가, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시킨 것인 의약 조성물,
[2] 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 더 함유하는, [1]의 의약 조성물,
[3] pH가 4.5 내지 5.5인, [1] 또는 [2]의 의약 조성물,
[4] 제약학적으로 허용되는 완충제가, 시트르산, 아세트산 및 히스티딘, 그리고 그들의 제약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1] 내지 [3] 중 어느 의약 조성물,
[5] 제약학적으로 허용되는 완충제가 시트르산 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염인, [1] 내지 [4] 중 어느 의약 조성물,
[6] 제약학적으로 허용되는 완충제의 농도가 1 내지 200mmol/L인, [1] 내지 [5] 중 어느 의약 조성물,
[7] 의약 조성물이 액체 제제 또는 동결 건조 제제인, [1] 내지 [6] 중 어느 의약 조성물,
[8] 의약 조성물이 액체 제제인, [1] 내지 [7] 중 어느 의약 조성물,
[9] 제약학적으로 허용되는 등장화제가, 아르기닌, D-소르비톨, D-만니톨, 트레할로오스, 수크로오스, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 이노시톨, 둘시톨, 아라비톨, 이소말트, 락티톨 및 말티톨로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1] 내지 [8] 중 어느 의약 조성물,
[10] 제약학적으로 허용되는 등장화제의 농도가 1 내지 500mmol/L인, [1] 내지 [9] 중 어느 의약 조성물,
[11] 제약학적으로 허용되는 계면 활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머의 적어도 한쪽인, [1] 내지 [10] 중 어느 의약 조성물,
[12] 제약학적으로 허용되는 계면 활성제가 폴리소르베이트 80인, [1] 내지 [11] 중 어느 의약 조성물,
[13] 제약학적으로 허용되는 계면 활성제의 농도가 0.001 내지 1％(w/v)인, [1] 내지 [12] 중 어느 의약 조성물,
[14] PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 농도가 0.1 내지 200mg/mL인, [1] 내지 [13] 중 어느 의약 조성물,
[15] PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는, [1]의 의약 조성물,
[16] PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는, [1]의 의약 조성물,
[17] 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식이 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인, [1] 또는 [16]의 의약 조성물,
[18] pH를 4 내지 5.5로 조정하는 것을 특징으로 하는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 안정화하는 방법으로서,
해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는,
(1) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트, 및
(2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트
로부터 선택되고,
상기 PEG화가, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시킨 것인 상기 방법,
[19] 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 사용하는, [18]의 방법
에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는 안정된 의약 조성물, 상세하게는 분해물, 다량체, 산성측 유사체, 염기성측 유사체, 불용성 이물의 생성을 억제하여 이루어지는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은, 등장화제(D-만니톨) 및 계면 활성제(폴리소르베이트 80)를 포함하는 pH 4.0 내지 6.0의 범위의 처방(시료 No.D-1 내지 D-7)에 대해서, 25℃ 또는 40℃ 2주의 보관 조건에 있어서의 분해물의 증가량(％)을 나타내는 그래프이다. ●은 20mmol/L 시트르산, ■은 20mmol/L 히스티딘을 완충제로서 사용한 샘플의 결과를 나타낸다.
도 2는, 등장화제(D-만니톨) 및 계면 활성제(폴리소르베이트 80)를 포함하는 pH 4.0 내지 6.0의 범위의 처방(시료 No.D-1 내지 D-7)에 대해서, 25℃ 또는 40℃ 2주의 보관 조건에 있어서의 산성측 유사체의 증가량(％)을 나타내는 그래프이다. ●은 20mmol/L 시트르산, ■은 20mmol/L 히스티딘을 완충제로서 사용한 샘플의 결과를 나타낸다.
도 3은, 등장화제(D-만니톨 또는 D-소르비톨) 및 계면 활성제(폴리소르베이트 80)를 포함하고, 시트르산에 의해 소정 pH(4.6, 4.9, 5.2)로 조정한 처방에 대해서, 5℃, 25℃, 40℃에서의 보관 후의 다량체량(％)을 나타내는 그래프이다.
도 4는, 등장화제(D-만니톨 또는 D-소르비톨) 및 계면 활성제(폴리소르베이트 80)를 포함하고, 시트르산에 의해 소정 pH(4.6, 4.9, 5.2)로 조정한 처방에 대해서, 5℃, 25℃, 40℃에서의 보관 후의 분해물량(％)을 나타내는 그래프이다.
도 5는, 등장화제(D-만니톨 또는 D-소르비톨) 및 계면 활성제(폴리소르베이트 80)를 포함하고, 시트르산에 의해 소정 pH(4.6, 4.9, 5.2)로 조정한 처방에 대해서, 5℃, 25℃, 40℃에서의 보관 후의 산성측 유사체량(％)을 나타내는 그래프이다.
본 명세서에 있어서 「안정」이란, 예를 들어 열, 광, 온도, 습도, 진탕, 및/또는 동결 융해에 대하여 안정된 것을 의미한다. 예를 들어, 의약 조성물을 소정 조건 하에 보존 후, 상기 의약 조성물 중에 포함되는, 다량체, 분해물, 산성측 유사체, 또는 염기성측 유사체의 양, 또는 그들의 총량이 어느 특정량 이하인 것을 의미한다. 또한, 어느 양태로서, 의약 조성물을 소정 조건 하에 보존 후, 불용성 이물이, 눈으로 보아 관찰되지 않는 것을 의미한다.
상기 「다량체」는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트가 모여서 생성되는 복합체이다. 다량체를 측정하는 방법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 사이즈 배제 크로마토그래피법(SE-HPLC법), 겔 전기 영동법, 모세관 전기 영동법, 마이크로플로우 이미징법 등이 포함되고, 어떤 형태로서는, SE-HPLC법이다. SE-HPLC법에 있어서는, 검출된 피크의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 계산한다. 또한, 메인 피크란, 활성 본체의 피크를 의미한다. SE-HPLC의 메인 피크보다 유지 시간이 짧은 피크를 모두 다량체로 한다. SE-HPLC법에 의해 측정되는 다량체의 양으로서는, 어떤 형태로서 10％ 이하, 다른 형태로서 5％ 이하이다.
상기 「분해물」은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 일부가 탈리되어 생성하는 단편체이다. 분해물을 측정하는 방법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 SE-HPLC법, 겔 전기 영동법, 모세관 전기 영동법 등이 포함되고, 어떤 형태로서는, SE-HPLC법이다. SE-HPLC법에 의한 분해물의 측정 방법은 상기한 SE-HPLC법에 의한 다량체의 측정과 동일하게 하여 행한다. 또한, SE-HPLC의 메인 피크보다 유지 시간이 긴 피크를 모두 분해물로 한다. SE-HPLC법에 의해 측정되는 분해물의 양으로서는, 어떤 형태로서 10％ 이하, 다른 형태로서 5％ 이하이다.
또한, 분해물의 양의 증가량(특정한 조건에서 특정한 기간 보관 후의 분해물량과 시험(보존) 개시 시의 분해물량의 차분)에 대해서는, 예를 들어 2.5％ 이하, 어느 양태로서 2.0％ 이하이고, 어느 양태로서는, 25℃ 2주, 1개월(4주) 또는 40℃ 2주 보존 후의 분해물의 양의 증가량이 예를 들어 2.5％ 이하, 어느 양태로서 2.0％ 이하이고, 다른 형태로서는, 40℃ 2주 보존 후의 분해물의 양의 증가량이 2.5％ 이하이고, 기타의 형태로서는, 40℃ 2주 보존 후의 분해물의 양의 증가량이 2.0％ 이하이다.
상기 「산성측 유사체」는, 양이온 교환 크로마토그래피법, 또는 이미징 모세관 등전점 전기 영동법에 의한 분석에서 주성분보다 빨리 용출되는 피크로서 확인되는 유사체이다. 산성측 유사체를 측정하는 방법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피법(IE-HPLC법), 겔 전기 영동법, 모세관 전기 영동법, 이미징 모세관 등전점 전기 영동법(icIEF법) 등이 포함되고, 어떤 형태로서는, IE-HPLC법, 또는 icIEF법이다. IE-HPLC법 및 icIEF법은, 상기한 SE-HPLC법과 동일하게 하여 피크의 백분율(％)을 계산한다. IE-HPLC법 및/또는 icIEF법에 의해 측정되는 산성측 유사체의 양으로서는, 어떤 형태로서 50％ 이하, 다른 형태로서 35％ 이하, 기타의 형태로서 25％ 이하이다.
또한, 산성측 유사체의 양의 증가량(특정한 조건에서 특정한 기간 보관 후의 산성측 유사체량과 시험(보존) 개시 시의 산성측 유사량의 차분)에 대해서는, 예를 들어 15％ 이하, 어느 양태로서 10％ 이하이다. 보다 구체적으로는, 25℃ 2주, 1개월(4주) 또는 40℃ 2주 보존 후의 산성측 유사체의 양의 증가량이 예를 들어 15％ 이하, 어느 양태로서 10％ 이하이다.
상기 「염기성측 유사체」는, IE-HPLC법 또는 icIEF법에 의한 분석으로부터 주성분보다 늦게 용출되는 피크로서 확인되는 유사체이다. 염기성측 유사체를 측정하는 방법으로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 IE-HPLC법, 겔 전기 영동법, 모세관 전기 영동법, icIEF법 등이 포함되고, 어떤 형태로서는, IE-HPLC법 또는 icIEF법이다. IE-HPLC법 및 icIEF법은, 상기한 SE-HPLC법과 동일하게 하여 피크의 백분율(％)을 계산한다. icIEF법에 의해 측정되는 염기성측 유사체의 양으로서는, 어떤 형태로서 50％ 이하, 다른 형태로서 25％ 이하, 기타의 형태로서 20％ 이하이다.
상기 「불용성 이물」은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트나 의약품 첨가물 등이 모여서 생성되는 불용성의 복합체이다. 불용성 이물은 예를 들어, 제16 개정 일본 약전에 기재된 주사제의 불용성 이물 검사법 또는 거기에 준하여 눈으로 보아 확인할 수 있다.
「안정된 의약 조성물」이란, 냉장 온도(2 내지 8℃)에서 적어도 1개월(4주), 바람직하게는 3개월, 보다 바람직하게는 6개월, 더욱 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년; 또는 실온(22 내지 28℃)에서 적어도 2주, 바람직하게는 1개월, 더욱 바람직하게는 3개월, 보다 바람직하게는 6개월, 적합하게는 1년; 또는 가속 조건(37 내지 43℃)에서 적어도 2주, 바람직하게는 1개월(4주), 다량체, 분해물, 산성측 유사체 또는 염기성측 유사체의 양, 또는 그들의 총량이 상술한 어느 특정량 이하인 의약 조성물을 의미한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2만 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라 불린다. 또한 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불린다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄를 포함하고, L형과 K형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 폴리펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개를 포함하고 있다.
쇄 내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100 내지 110잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프간에서 유사하고, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 아미노 말단(N 말단)에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이라도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않으며, 가변 영역이라고 불리고, 각 도메인은 각각 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불린다. 가변 영역으로부터 카르복시 말단(C 말단)측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하며 정상 영역이라고 불리고, 각 도메인은 각각 CH1, CH2, CH3, 또는 CL이라 표시된다.
항체의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 의한다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것을 알았고, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라 불린다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라 불리고, 이 영역은 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄간 S-S 결합을 포함한다. 예를 들어, 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는, 중쇄간의 S-S 결합을 구성하고 있는, 각각 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은, 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄간 S-S 결합보다도 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. 항체를 펩신으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄간 S-S 결합보다도 C 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, F(ab')2 프래그먼트가 생성된다. F(ab')2 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄간 S-S 결합으로 결합된 2량체 구조의 프래그먼트이다. Fab' 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성되고, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, Fab' 프래그먼트는, 모두 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는다.
항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산에의 수식 등을 들 수 있고, 각종 항체에 있어서, 중쇄 C 말단의 리신이 결실되는 것이나 중쇄 N 말단의 글루타민 대부분이 피로글루탐산에의 수식을 받는 것이 알려져 있다(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426). 또한, 이러한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것이 아닌 것도 당해 분야에서 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
본 발명의 의약 조성물은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, PEG화한 이하의 (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 및/또는 PEG화한 이하의 (2)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유한다:
(1) 서열 번호 1의 아미노산 번호 1로부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3의 아미노산 번호 1로부터 113까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트,
(2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
(국제 공개 제2013/022083호)
하나의 실시 형태에 있어서, 상기 (2)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식은, 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 (2)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 서열 번호 1의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산에 수식된 아미노산 번호 1로부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3의 아미노산 번호 1로부터 113까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트이다.
본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 정상 영역으로서는, 어떤 서브클래스의 정상 영역(예를 들어, 중쇄 정상 영역으로서 Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4의 정상 영역, 경쇄 정상 영역으로서 Igλ또는 Igκ의 정상 영역)도 선택 가능할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 중쇄 정상 영역으로서, 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 경쇄 정상 영역으로서, 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 인간 Igγ1 정상 영역인 중쇄 정상 영역 및 인간 Igκ 정상 영역인 경쇄 정상 영역을 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 이하의 (3) 및/또는 (4)의 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유한다:
(3) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트,
(4) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 상기 (4)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식은, 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 (4)의 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 서열 번호 1의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산에 수식된 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열에서 되는 경쇄가 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, PEG화한 이하의 (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 및 PEG화한 이하의 (2)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유한다:
(1) 서열 번호 1의 아미노산 번호 1로부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3의 아미노산 번호 1로부터 113까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트,
(2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 이하의 (3) 및 (4)의 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유한다:
(3) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트,
(4) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
본 발명에는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 이하의 특징을 갖는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 포함된다:
서열 번호 1의 31로부터 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 1의 50으로부터 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 1의 98로부터 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고 서열 번호 3의 24로부터 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 3의 55로부터 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 3의 94로부터 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트.
본 발명에는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 이하의 (a) 및 (b)로부터 선택되는 숙주 세포를 배양함으로써 생산할 수 있는 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 포함된다:
(a) 서열 번호 1의 아미노산 번호 1로부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 3의 아미노산 번호 1로부터 113까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포,
(b) 서열 번호 1의 아미노산 번호 1로부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 서열 번호 3의 아미노산 번호 1로부터 113까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명에는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 이하의 (a) 및 (b)로부터 선택되는 숙주 세포를 배양함으로써 생산할 수 있는 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 포함된다:
(a) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포,
(b) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명에 있어서, Fab' 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄의 프래그먼트로 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는, 중쇄-경쇄간의 S-S 결합을 구성하고 있는 시스테인 잔기 이외의 적어도 하나의 시스테인 잔기(본 명세서 중, 「힌지 영역 시스테인」이라고도 함)가 포함된다. 힌지 영역 시스테인은, PEG에서의 수식 부위로서 사용할 수 있다. Fab' 프래그먼트 중의 힌지 영역 시스테인의 수는, 사용하는 항체의 클래스에 의해 1 내지 수개 사이에서 상이할 수 있지만, 당업자에 의해 용이하게 조정 가능하다. 예를 들어, 인간의 IgG1 클래스(통상, 힌지 영역에 있어서 2개의 힌지 영역 시스테인을 가짐)의 Fab' 프래그먼트를 제작하는 경우, 중쇄의 힌지 영역에 있어서, 최초의 힌지 영역 시스테인의 코드 부위와 2번째의 힌지 영역 시스테인의 코드 부위 사이에 정지 코돈을 삽입함으로써, 힌지 영역 중에 1개의 힌지 영역 시스테인을 갖는 Fab' 프래그먼트를 제작할 수 있고, 2번째의 힌지 영역 시스테인의 코드 부위 뒤에 정지 코돈을 삽입함으로써, 힌지 영역 중에 2개의 힌지 영역 시스테인을 갖는 Fab' 프래그먼트를 제작할 수 있다.
본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화함으로써 제작할 수 있다. Fab' 프래그먼트에의 PEG의 결합은, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여 실시 가능하다(예를 들어, 유럽 특허 제0948544호 명세서). 본 발명에 있어서는, 직쇄 또는 분지쇄의, 임의의 평균 분자량의 PEG 또는 그의 유도체가 사용 가능하고, 사용 목적에 따라서 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 힌지 영역 시스테인에의 PEG의 결합을 용이하게 하기 위해서, PEG의 유도체를 사용해도 된다. 예를 들어, 말레이미드와 같은 티올 반응기를 링커를 통해 결합시킨 PEG 유도체를 사용하고, 힌지 영역 시스테인의 티올기와 말레이미드기를 공유 결합시킬 수 있다. 일반적으로 PEG의 평균 분자량은 약 500 내지 약 50000Da이며, 바람직하게는 약 5000 내지 약 40000Da이며, 보다 바람직하게는, 약 10000 내지 약 40000Da의 범위이다.
본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에게 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명에 사용되는 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 제작 방법으로서는, 국제 공개 제2013/022083호에 개시된 방법을 들 수 있다.
1 단위 의약 조성물(제제) 중의 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 양으로서는, Fab'-PEG 환산으로, 예를 들어 0.1 내지 200mg, 어떤 형태로서 0.1 내지 40mg, 다른 형태로서 20 내지 40mg, 다른 형태로서 60 내지 150mg, 또 다른 형태로서 40 내지 120mg을 들 수 있다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
의약 조성물이 고체 상태(예를 들어, 동결 건조 제제, 분무 건조 제제 등)인 경우, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 양으로서는, Fab'-PEG 환산으로, 예를 들어 0.1 내지 200mg, 어떤 형태로서 0.1 내지 40mg, 다른 형태로서 20 내지 40mg, 다른 형태로서 60 내지 150mg, 또 다른 형태로서 40 내지 120mg을 들 수 있다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
용시 용해시킬 때, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 농도로서는, 용시 용해 후의 Fab'-PEG 환산으로, 예를 들어 0.1 내지 200mg/mL, 어떤 형태로서 0.1 내지 40mg/mL, 다른 형태로서 20 내지 40mg/mL, 다른 형태로서 60 내지 150mg/mL, 또 다른 형태로서 40 내지 120mg/mL를 들 수 있다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
의약 조성물이 액체 상태(용액)인 경우, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 농도로서는, Fab'-PEG 환산으로, 예를 들어 0.1 내지 200mg/mL, 어떤 형태로서 0.1 내지 40mg/mL, 다른 형태로서 20 내지 40mg/mL, 다른 형태로서 60 내지 150mg/mL, 또 다른 형태로서 40 내지 120mg/mL를 들 수 있다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
용량으로서는, 예를 들어 Fab'-PEG 환산으로, 예를 들어 0.1 내지 200mg, 어떤 형태로서 0.1 내지 40mg, 다른 형태로서 20 내지 40mg, 다른 형태로서 60 내지 150mg, 또 다른 형태로서 40 내지 120mg을 포함한다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
적응증으로서는, 인간 NGF가 병태 형성에 관여하는 각종 질환의 예방 및/또는 치료, 예를 들어 변형성 관절증에 수반하는 관절통(OA 동통), 류머티즘에 수반하는 관절통, 암성 동통, 신경 인성 동통, 만성 요통, 수술 후 동통, 대상 포진 후 신경통, 유통성 당뇨병성 신경 장애, 골절통, 방광통 증후군 등의 동통이나, 간질성 방광염, 급성 췌염, 만성 췌염, 자궁 내막증 등을 포함한다.
본 발명에 사용되는 「제약학적으로 허용되는 완충제」로서는, 제약학적으로 허용되며, 용액 상태에 있어서 원하는 pH 범위 내에서 완충능을 갖는 것이면, 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로는, 다음 pH 범위 내에서 완충능을 갖는 것이다. 예를 들어, 4 내지 5.5, 어떤 형태로서 4.0 내지 5.5, 다른 형태로서 4.5 내지 5.5, 다른 형태로서 4.6 내지 5.2이다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다. 또한, pH는, 의약 조성물이 액체 제제인 경우에는, 해당 액체 제제의 pH로 하고, 의약 조성물이 동결 건조 제제 또는 분무 건조 제제인 경우, 해당 제제가 물에 재용해될 때의 해당 용해액의 pH로 한다.
완충제 성분으로서는, 예를 들어 시트르산, 아세트산, 또는 히스티딘, 또는 그들의 제약학적으로 허용되는 염 등을 포함한다. 다른 형태로서는, 시트르산, 아세트산, 또는 그들의 제약학적으로 허용되는 염 등을 포함한다. 다른 형태로서는, 무수 시트르산 및/또는 시트르산3나트륨2수화물을 포함한다.
이들 완충제 성분은 1종 또는 2종 이상 적절히 적량 사용할 수 있다. 또한, pH를 원하는 pH 범위 내로 조정하기 위해서, 염산이나 수산화나트륨 등을 적절히 첨가해도 된다.
완충제의 농도는, pH를 원하는 pH 범위 내로 조정할 수 있는 양이면, 특별히 제한되지 않는다. 완충제의 농도는, 주사 용수에 의해 용해되며 용액 상태(액체 제제)인 경우, 예를 들어 1 내지 200mmol/L, 다른 형태로서 1 내지 100mmol/L, 다른 형태로서 5 내지 100mmol/L, 또 다른 형태로서 1 내지 50mmol/L이다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
완충제의 양은, 의약 조성물이 동결 건조 제제 또는 분무 건조 제제인 경우, 해당 제제가 물에 재용해될 때의 해당 용해액 내의 완충제가 상술한 농도가 되는 양이다.
본 발명에 사용되는 「제약학적으로 허용되는 등장화제」로서는, 제약학적으로 허용되며, 등장 작용을 가지고, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 안정성에 영향을 미치지 않는 것 또는 안정화 작용을 갖는 것이면, 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로는, 예를 들어 염류, 아미노산류, 당 또는 당알코올류를 들 수 있다.
염류로서는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 황산나트륨, 황산칼슘 등을 들 수 있다. 어떤 형태로서는, 염화나트륨이다.
아미노산류로서는, 예를 들어 아르기닌(L-아르기닌) 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 염산염), 글리신, 리신, 오르니틴 등을 들 수 있다. 어떤 형태로서는, 아르기닌, 글리신이며, 다른 형태로서는 아르기닌이다.
당 또는 당알코올류로서는, 예를 들어 D-소르비톨, D-만니톨, 트레할로오스, 수크로오스, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 이노시톨, 둘시톨, 아라비톨, 이소말트, 락티톨, 말티톨 등을 들 수 있다. 어떤 형태로서, D-소르비톨, D-만니톨이며, 다른 형태로서, D-소르비톨이다.
등장화제로서는, 어떤 형태로서, 아르기닌 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염, D-소르비톨, D-만니톨, 트레할로오스, 수크로오스, 크실리톨, 에리트리톨, 이노시톨, 아라비톨, 이소말트, 락티톨, 말티톨이며, 다른 형태로서는, L-아르기닌염산염, D-소르비톨이다.
이들 등장화제는 1종 또는 2종 이상 적절히 선택되어 사용할 수 있다.
또한, 염류, 아미노산류, 당 또는 당알코올은, PEG화 항인간 항체 Fab' 프래그먼트의 안정성에 영향을 미치지 않거나 또는 안정화되는 범위 내에 있어서, 의약 조성물 중에 포함된다.
등장화제의 농도는, 등장 작용을 가지고, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 안정성에 영향을 미치지 않는 농도라면, 특별히 제한되지 않는다.
주사 용수에 의해 용해되며 용액 상태(액제)인 경우의 농도로서, 예를 들어 1 내지 500mmol/L, 어떤 형태로서 1 내지 400mmol/L, 다른 형태로서 1 내지 300mmol/L, 다른 형태로서 50 내지 500mmol/L, 또 다른 형태로서 100 내지 300mmol/L, 또 다른 형태로서 200 내지 300mmol/L이며, 또 다른 형태로서 100 내지 200mmol/L이다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
등장화제의 양은, 의약 조성물이 동결 건조 제제 또는 분무 건조 제제인 경우, 해당 제제가 물에 재용해될 때의 해당 용해액 내의 등장화제가 상술한 농도가 되는 양이다.
본 발명에 사용되는 「제약학적으로 허용되는 계면 활성제」로서는, 제약학적으로 허용되며, 계면 활성 작용 및 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 안정화 작용을 갖는 것이면, 특별히 제한되지 않는다.
구체적으로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 예를 들어 모노카프릴산소르비탄, 모노라우르산소르비탄, 모노팔미트산소르비탄 등의 소르비탄지방산에스테르; 모노카프릴산글리세롤, 모노미리스트산글리세롤, 모노스테아르산글리세롤 등의 글리세린지방산에스테르; 모노스테아르산데카글리세릴, 디스테아르산데카글리세릴, 모노리놀레산데카글리세릴 등의 폴리글리세롤지방산에스테르; 모노라우르산폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노올레산폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노팔미트산폴리옥시에틸렌소르비탄, 트리올레산폴리옥시에틸렌소르비탄, 트리스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르; 테트라스테아르산폴리옥시에틸렌소르비톨, 테트라올레산폴리옥시에틸렌소르비톨 등의 폴리옥시에틸렌소르비톨지방산에스테르; 모노스테아르산폴리옥시에틸렌글리세릴 등의 폴리옥시에틸렌글리세린지방산에스테르; 디스테아르산폴리에틸렌글리콜 등의 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르; 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 등 폴리옥시에틸렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 프로필에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌수소화 피마자유 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌소르비톨밀납 등의 폴리옥시에틸렌밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌라놀린 등의 폴리옥시에틸렌라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌지방산아미드, 예를 들어 폴리옥시에틸렌옥타데칸아미드 등의 6 내지 18의 HLB를 갖는 계면 활성제; 음이온성 계면 활성제, 예를 들어 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등의 C10 내지 C18 알킬기를 갖는 알킬황산염; 폴리옥시에틸렌라우릴황산나트륨 등의, 첨가된 에틸렌옥시드 단위의 평균 몰수가 2 내지 4이며, 알킬기의 탄소 원자의 수가 10 내지 18인 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염; 술포숙신산라우릴나트륨 등의 C8 내지 C18 알킬기를 갖는 술포숙신산알킬염; 레시틴, 글리세로인지질 등의 천연의 계면 활성제; 스핑고미엘린 등의 스핑고인지질; 또는 C12 내지 C18 지방산의 자당에스테르를 포함한다.
이들 계면 활성제는 1종 또는 2종 이상 적절히 선택되어 사용할 수 있다.
어떤 형태로서 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르이며, 다른 형태로서 폴리소르베이트 또는 플루로닉형 계면 활성제이며, 다른 형태로서 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85 또는 플루로닉형 계면 활성제이며, 또 다른 형태로서 폴리소르베이트 20, 80 또는 폴록사머(폴록사머 188), 다른 형태로서 폴리소르베이트 80이다.
또한, 계면 활성제는 불용성 이물 등의 형성을 억제하는 작용을 갖고 있으며, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 안정화시키는 범위 내에 있어서, 의약 조성물 중에 포함된다.
계면 활성제의 농도는, 계면 활성 작용 및 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 안정화 작용을 갖는 농도라면, 특별히 제한되지 않는다.
주사 용수에 의해 용해되며 용액 상태(액체 제제)인 경우, 0.001 내지 1％(w/v), 어떤 형태로서 0.01 내지 0.5％(w/v), 다른 형태로서 0.01 내지 0.03％(w/v)이다. 또한, 상기한 각 하한과 각 상한은, 원한다면 임의로 조합할 수 있다.
계면 활성제의 양은, 의약 조성물이 동결 건조 제제 또는 분무 건조 제제인 경우, 해당 제제가 물에 재용해될 때의 해당 용해액 내의 계면 활성제가 상술한 농도가 되는 양이다.
본 발명의 의약 조성물은, 용액을 용기에 충전하여, 액체 제제로서, 또한 용액을 동결 건조법이나 분무 건조법에 의해, 동결 건조 제제 또는 분무 건조 제제 등의 비경구 의약 조성물로서 제공할 수 있다. 적합하게는 액체 제제이다.
본 발명의 의약 조성물 중에서도 특히, 시트르산, 아르기닌 및 폴리소르베이트를 포함하는 액체 제제, 또는 시트르산, D-소르비톨 및 폴리소르베이트를 포함하는 액체 제제가 적합하다.
본 발명의 의약 조성물에는, 원한다면, 현탁제, 용해 보조제, 보존제, 흡착 방지제, 황 함유 환원제, 산화 방지제 등의 의약품 첨가물을 적절히 첨가할 수 있다.
현탁제로서는, 예를 들어 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 트라가칸트말, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.
용해 보조제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 마크로골, 피마자유 지방산에틸에스테르 등을 들 수 있다.
보존제로서는, 예를 들어 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.
흡착 방지제로서는, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥시드·프로필렌옥시드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.
황 함유 환원제로서는, 예를 들어 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥틱산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소 원자수 1 내지 7의 티오알칸산 등의 술프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는, 예를 들어 메티오닌, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈산트리아밀, 갈산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산2나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
각종 의약품 첨가물은, 본 발명의 원하는 효과를 달성할 수 있는 양의 범위에서, 적절히 적량 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 제조 방법은, 자체 공지된 제조 방법에 의해, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하고, pH를 4 내지 5.5로 조정하는 방법을 포함하고, 원한다면, 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 충전하는 용기는, 사용 목적에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들어, 바이알, 앰플, 주사기와 같은 규정 용량의 형상의 것, 병과 같은 대용량의 형상의 것을 포함한다. 어떤 형태로서 주사기(디스포저블 주사기를 포함함)를 포함한다. 해당 주사기에 미리 용액을 충전하여, 프리필드 시린지 용액 제제로서 제공함으로써, 의료 현장에 있어서, 용해 조작 등의 조작이 불필요하게 되어, 신속한 대응이 가능해진다.
용기의 재질에 대해서는, 유리, 플라스틱 등을 들 수 있다. 또한, 용기 내의 표면 처리로서는, 실리카 코팅 처리, 실리콘 코팅 처리, 술퍼 처리, 각종 저알칼리 처리 등이 실시되어도 된다.
본 발명에는, pH를 4 내지 5.5로 조정하는 것을 특징으로 하는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 안정화하는 방법이 포함된다. 본 발명의 안정화 방법에서는, 원한다면, 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 더 사용할 수 있다.
본 발명의 안정화 방법에서 사용하는 「PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트」, 「제약학적으로 허용되는 완충제」, 「제약학적으로 허용되는 등장화제」 및 「제약학적으로 허용되는 계면 활성제」에 대해서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 당해 설명을 그대로 적용할 수 있다. 또한, 이들 각 성분의 배합량, 배합 방법 등에 대해서는, 본 발명의 의약 조성물에 있어서의 당해 설명을 그대로 적용할 수 있다.
본 발명의 안정화 방법에서는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 제조할 때, pH를 4 내지 5.5로 조정함으로써, 또한 원한다면, 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 더 사용함으로써, 분해물, 다량체, 산성측 유사체, 염기성측 유사체, 불용성 이물의 생성을 억제할 수 있다.
실시예
이하, 참고예, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 의해 한정 해석되는 것은 아니다.
실시예에 있어서 사용된 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는, 국제 공개 제2013/022083호의 실시예 19에 기재된 제법 또는 거기에 준한 방법에 의해 입수하였다.
《참고예: PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 제작》
본 실시예에서 사용한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 서열 번호 2에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 1에, 해당 Fab' 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 서열 번호 4에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 3에 각각 나타낸다. 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 1의 31로부터 35, 50으로부터 65, 98로부터 110까지의 아미노산 서열을 포함한다. 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2, CDR3은, 서열 번호 3의 24로부터 39, 55로부터 61, 94로부터 102까지의 아미노산 서열을 포함한다.
국제 공개 제2013/022083호에 따라서, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터(Lonza사)를 구축하였다. CHOK1SV 세포(Lonza사)에 트랜스펙션함으로써 Fab' 프래그먼트의 안정 발현화주를 취득하고, Fab' 프래그먼트를 발현시켰다. 배양 상청을 친화성 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, Fab' 프래그먼트를 얻었다. 또한, 공정에는, 바이러스의 불활성화 공정과 바이러스 제거 막 공정을 포함한다. 이어서, 얻어진 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 환원제로 환원하고, PEG 말레이미드(제품명: SUNBRIGHT GL2-400MA, 니찌유 가부시끼가이샤제)와 결합시켰다. 또한 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 제작하였다. 또한, 정제한 Fab' 프래그먼트의 아미노산 수식을 분석한 결과, 그 대부분에 있어서 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화가 발생하였다.
《실시예 1: 최적 pH 선정에 의한 안정화 효과》
PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 농도가 Fab' 환산으로 10mg/mL(Fab'-PEG 환산으로 약 20mg/mL)가 되게, 표 1에 나타내는 완충액(농도는 모두 20mmol/L)으로 희석 조제한 처방액(시료 No.A-1 내지 A-8)을 0.22㎛ 필터로 멸균 여과 후, 1.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 실시하고, 도치 상태에서 25℃ 1개월의 보관을 실시하였다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
또한, Fab' 환산 농도 및 Fab'-PEG 환산 농도는, 자외·가시 분광 광도계 Nanodrop 2000c(Thermo Scientific, MA, U.S.A)를 사용하여 측정하였다. 2μL의 샘플을 스테이지에 어플라이하고, 280nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 단백 농도는, 얻어진 280nm 흡광도 및 흡광 계수 1.48mL/mg/cm(Fab' 환산 농도의 경우), 또는 0.79mL/mg/cm(Fab'-PEG 환산 농도의 경우)를 사용하여 산출하였다.
SE-HPLC법, IE-HPLC법에 의한 평가 결과를 표 1에 나타낸다.
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 TSKgel(등록 상표) G3000SWXL 칼럼(도소제)을 접속하고, 10mmol/L 인산/500mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 용액에, 10％가 되도록 아세토니트릴을 첨가한 조성의 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 샘플은 Fab' 환산으로 50μg(Fab'-PEG 환산으로 약 100μg)이 되는 주입량으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 샘플 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
SE-HPLC 측정으로 검출된 피크의 면적을 자동 분석법에 의해 측정하고, 메인 피크를 포함하는 전체 피크 면적의 총합으로 나눔으로써, 백분율(％)로서 계산하였다. 또한, 메인 피크란, 활성 본체의 피크를 의미한다.
SE-HPLC의 메인 피크보다 유지 시간이 짧은 피크를 모두 다량체, 유지 시간이 긴 피크를 모두 분해물로 하였다.
IE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 Propac WCX-10 칼럼(Dionex제)을 접속하고, 측정을 행하였다. 이동상 A 라인에 20mmol/L의 2-모르폴리노에탄술폰산(MES)/pH 6.0, 이동상 B 라인에 20mmol/L의 MES/500mmol/L 염화나트륨/pH 6.0의 이동상을 접속하고, 1mL/분의 유속으로 흘렸다. 샘플은 이동상 A로 Fab' 환산 농도 1mg/mL로 희석하고, 10μL를 주입하였다. 구배 프로그램은, 이동상 B를 0％로 2분간 유지 후, 50분간에 5％까지 이동상 B의 비율을 직선적으로 증가시켰다. 계속해서, 100％까지 이동상 B의 비율을 직선적으로 증가시키고, 세정을 행한 후, 이동상 B의 비율을 0％까지 직선적으로 감소시켜, 약 10분간 유지하고, 다음 샘플 주입까지 평형화를 행하였다. 분석 시간은 약 70분이며, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다. 칼럼 온도는 40℃, 샘플 온도는 5℃로 설정하였다.
피크의 백분율은 SE-HPLC와 동일한 방법에 의해 계산하였다.
상기 시험에 있어서의 IE-HPLC의 12분 부근의 피크를 산성측 유사체로 하였다.
결과, pH 7 부근의 A-5에서는 다량체, 분해물, 산성측 유사체의 증가가 확인되었다.
본 결과로부터, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는 pH 4 내지 6 부근에서 제제화함으로써, 다량체, 분해물 및 산성측 유사체의 생성이 억제되는 것이 나타났다.
Figure pct00001
《실시예 2: 등장화제의 선택에 의한 안정화 효과》
PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 농도가 Fab' 환산으로 20mg/mL(Fab'-PEG 환산으로 약 40mg/mL), 20mmol/L 시트르산(pH 5.5)의 완충액의 처방에 6종의 의약품 첨가제물(L-아르기닌염산염, 염화나트륨, 글리신, D-소르비톨, 수크로오스 및 D-만니톨)을 등장이 되는 농도로 첨가한 처방(시료 No.B-1 내지 B-7)에 있어서의, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 안정성(다량체량, 분해물량, 다분산도)을 평가하였다. 각 처방 조성으로 조제한 샘플을, 0.22㎛ 필터로 멸균 여과 후, 0.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 실시하고, 정치 상태에서 40℃ 4주의 보관을 실시하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
다량체량, 분해물량은 SE-HPLC법에 의해, 실시예 1과 동일하게 하여 분석하였다.
다분산도의 측정은 DynaPro Platereader(Wyatt제)을 사용하여 동적 광산란(DLS)법에 의해 측정하였다.
염화나트륨 첨가 처방에서는, 40℃ 4주 보관 후의 다량체량 및 분해물량이, 무첨가 처방과 비교하여, 증가하는 경향이 확인되었다.
L-아르기닌염산염 첨가 처방 및 글리신 첨가 처방에서는, 무첨가 처방과 비교하여, 40℃ 4주 보관 후의 분해물량의 증가가 확인되었다. D-소르비톨, D-만니톨첨가 처방에서는, 40℃ 4주 보관 후의, 다량체량과 분해물량, 다분산도는 무첨가 처방과 동등하였다.
또한, 무첨가의 처방과 비교하여, 분해물량의 증가가 있었던 처방에 대해서, 다량체량, 산성측 유사체량, 염기성측 유사체량 등의 변동 등을 고려한 후, 종합적으로 안정성을 판단한다.
Figure pct00002
《실시예 3: 계면 활성제의 첨가에 의한 안정화 효과》
PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 농도가 Fab' 환산으로 20mg/mL(Fab'-PEG 환산으로 약 40mg/mL), 20mmol/L 시트르산(pH 5.5) 처방에, 계면 활성제인 폴리소르베이트 80을 3개의 농도 수준(0.01, 0.02, 0.05％(w/v))으로 첨가한 샘플(시료 No.C-1 내지 C-4)에 대해서, 동결 융해 스트레스에 대한 물리적 안정성을 평가하였다. 샘플은 각 처방 조성으로 조제하고, 0.22㎛ 필터로 멸균 여과 후, 0.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 행했다.
동결 융해 스트레스 시험은, 샘플을 정치 상태에서 -80℃의 냉동고 내에 보관하여 동결시킨 후, 샘플을 냉동고로부터 취출하고, 5℃의 냉장고 내에 정치 상태에서 보관하고, 융해시켰다. 이 동결 융해 사이클을 3회 반복함으로써 행하였다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
눈으로 본 외관 평가의 결과를 표 3에 나타낸다.
외관 평가에서는, 폴리소르베이트 80 무첨가 처방에서, 동결 융해 스트레스에 의한 다수의 불용성 이물의 발생이 확인되었지만, 폴리소르베이트 80을 첨가한 처방에서는, 어느 농도에 있어서도 불용성 이물은 확인되지 않았다.
Figure pct00003
《실시예 4: 등장화제, 계면 활성제를 포함하는 처방의 최적 pH 선정에 의한 안정화 효과 1》
PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 농도가 Fab' 환산으로 20mg/mL(Fab'-PEG 환산으로 약 40mg/mL) 포함하고, 20mmol/L 시트르산, 또는 히스티딘을 완충제로 하고, 240mmol/L의 D-만니톨, 0.02％(w/v) 폴리소르베이트 80을 첨가한 처방(시료 No.D-1 내지 D-7)에 대해서, pH 4.0 내지 6.0의 범위에서 샘플을 조제하고, 정치 상태에서의 25℃ 및 40℃ 보관 시에 있어서의 안정성을 SE-HPLC법, IE-HPLC법, DLS법으로 평가하였다. 샘플은 각 처방 조성으로 제조 후, 0.22㎛ 필터로 멸균 여과하고, 0.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 행했다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
SE-HPLC법 및 IE-HPLC법은 실시예 1과 동일하게 하여, DLS법은 실시예 2와 동일하게 하여 측정하였다.
결과를 도 1, 도 2 및 표 4에 나타낸다.
분해물은 pH 5.0에서, 초기품에 비교하여 증가량이 최소가 되었다. 또한, 산성측 유사체는 어느 보관 조건에 있어서도, pH가 높아질수록 초기품으로부터의 증가량은 커지는 경향이 확인되었다.
표 4의 DLS 측정 결과로부터는, 40℃ 2주 보관품에 있어서, pH가 낮을수록 평균 입자 직경 및 다분산도의 값이 커졌고, 응집체를 형성하기 쉬운 경향이 확인되었다.
Figure pct00004
《실시예 5: 등장화제, 계면 활성제를 포함하는 처방의 최적 pH 선정에 의한 안정화 효과 2》
pH 4.6, pH 4.9 및 pH 5.2에 시트르산(농도는 모두 20mmol/L)을 사용하여 조제한 처방액에, 240mmol/L의 D-만니톨 및 0.02％(w/v) 폴리소르베이트 80을 첨가한 처방, 및 240mmol/L의 D-만니톨 대신에 240mmol/L의 D-소르비톨을 첨가한 처방(pH 4.9)에 대해서, 정치 상태에서의 5℃, 25℃, 40℃에 있어서의 보관 안정성을 평가하였다. 또한, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 농도가 Fab' 환산으로 20mg/mL(Fab'-PEG 환산으로 약 40mg/mL)이다. 샘플은 각 처방 조성으로 제조 후, 0.22㎛ 필터로 멸균 여과하고, 0.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 행했다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
다량체 및 분해물은 SE-HPLC법에 의해 측정하고, 산성측 유사체는 IE-HPLC법에 의해 측정하였다. SE-HPLC법 및 IE-HPLC법은 실시예 1과 동일하게 하여 실시하였다.
결과를 도 3 내지 도 5에 도시한다.
pH 4.6 내지 5.2의 범위에서, D-만니톨 처방 및 D-소르비톨 처방 모두 안정된 것이 확인되었다.
《실시예 6: 등장화제, 계면 활성제를 포함하는 처방의 완충제 선정에 의한 안정화 효과》
표 5에 나타내는 2개의 처방(시료 No.E-1 및 E-2)에 대해서, 정치 상태에서 각 조건(5℃, 25℃, 40℃) 하에 4주 보관 후의 안정성을 평가하였다. 샘플은 각 처방 조성으로 제조 후, 0.22㎛ 필터로 멸균 여과하고, 1.3mL씩 유리 바이알(3mL 용량)에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 행했다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 염산 및/또는 수산화나트륨을 첨가하였다.
다량체 및 분해물은 SE-HPLC법에 의해 측정하고, 산성측 유사체는 IE-HPLC법에 의해 측정하였다. SE-HPLC법 및 IE-HPLC법은 실시예 1과 동일하게 하여 실시하였다.
결과를 표 6에 나타낸다.
E-1 및 E-2 모두 안정되었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
《실시예 7: 완충제, 등장화제, 계면 활성제를 포함하는 처방의 안정성 평가》
20mmol/L 시트르산을 사용하여 pH 4.9로 조제한 처방 용액에, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 농도가 Fab'-PEG 환산으로 40mg/mL(Fab' 환산으로 약 20mg/mL), D-소르비톨 농도가 240mmol/L, 폴리소르베이트 80 농도가 0.02％(w/v)가 되게 첨가한 표 7에 나타내는 처방에 대해서, 동결 융해 또는 진탕 또는 광 스트레스를 준 후, 및 정치 상태에서 각 조건(-20℃, 5℃, 25℃) 하에 3개월 보관 후의 안정성을 평가하였다. 또한, 시트르산과 시트르산3나트륨2수화물은 합계가 시트르산으로서 20mmol/L가 되고, pH가 4.9가 되는 비율로 첨가하였다. 염산 또는 수산화나트륨은, 필요에 따라서 완충액 제조 시에 pH 4.6 내지 5.2가 되게 첨가하였다. 조제한 샘플은 0.22㎛ 필터로 멸균 여과 후, 3mL 바이알에 1.2mL 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 실시하고, 각 조건에서 보관하였다.
동결 융해 시험에 대해서는, 실시예 3과 마찬가지로 행하였다.
진탕 안정성 시험에 대해서는, 샘플을 횡치 상태에서 진탕기(RECIPRO SHAKER SR-1; TAITEC제)에 설치하고, 실온 하에 150rpm의 속도로 48시간 진탕함으로써 행하였다.
광안정성 시험에 대해서는, 샘플을 횡치 상태에서 보관하고, D65 램프를 사용하여 1000lux의 광을 48시간 조사함으로써 행하였다.
외관은 눈으로 관찰하고, pH는 pH 미터, 다량체 및 분해물은 SE-HPLC법, 산성측 유사체는 IE-HPLC법, 평균 입자 직경 및 다분산도는 DLS법에 의해 측정하였다. 눈 관찰은 실내광 하에서 실시하고, pH는, 교정용 표준액을 사용하여 교정을 실시한 pH 미터를 사용하여 실시하며, SE-HPLC법 및 IE-HPLC법은 실시예 1과 동일하게 하여, 또한 DLS법은 실시예 2와 동일하게 하여 실시하였다.
결과를 표 8 및 표 9에 나타내지만, 보관 후에 있어서도 안정되었다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
《실시예 8: 고농도 제제의 최적 pH 선정에 의한 안정화 효과》
PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 농도가 Fab'-PEG 환산으로 100mg/mL(Fab' 환산으로 약 50mg/mL)가 되게, 표 10에 나타내는 조성이 되도록 스핀 칼럼을 사용하여 완충액 교환·농축을 실시하고, 0.02w/v％가 되도록 폴리소르베이트 80을 첨가한 후, 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 여과액을 0.25mL 또는 1.15mL씩 3mL 유리 바이알에 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를 실시하고, 25℃, 40℃에 있어서의, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 보관 안정성(다량체량, 분해물량, 산성측 유사체량)을 평가하였다.
또한, 소정의 pH가 되도록, 필요에 따라서 pH 조정제로서, 완충액 제조 시에 수산화나트륨을 첨가하였다.
다량체 및 분해물은 SE-HPLC법에 의해 측정하고, 산성측 유사체는 icIEF법에 의해 측정하였다.
SE-HPLC 측정은, HPLC 시스템에 TSKgel(등록 상표) G3000SWXL 칼럼(도소제)을 접속하고, 20mmol/L 인산/400mmol/L 염화나트륨 pH 7.0의 조성을 갖는 용액에, 17.5％가 되도록 아세토니트릴을 첨가한 조성의 이동상을 0.5mL/분의 유량으로 흘렸다. 샘플은 Fab'-PEG 환산으로 50μg이 되는 주입량으로 하였다. 칼럼 온도는 30℃, 샘플 온도는 5℃로 설정하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
icIEF 측정은, iCE3 시스템에 cIEF Cartridge FC-Coated(Protein Simple제)를 접속하고, 측정을 행하였다. 약 0.2％ 메틸셀룰로오스, 약 2.7％ Pharmalyte3-10, 약 1.6％ Pharmalyte8-10.5, 약 1.1％ CHAPS, 약 0.5％ pI 마커 5.85, 약 0.5％ pI 마커 9.46을 포함하는 샘플 매트릭스 120μL와, 초순수로 PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트 농도 10mg/mL로 희석한 샘플 5μL를 혼화하고, 측정 시료로 하였다. Prefocusing은 1500V에서 1분, Focusing은 3000V에서 16분 실시하고, 검출은 UV 280nm에서 실시하였다.
표 11에 다량체량 측정 결과, 표 12에 분해물 측정 결과 및 표 13에 산성측 유사체 측정 결과를 나타낸다. 고농도 제제에 있어서도 pH가 높아질수록, 다량체, 분해물, 산성측 유사체량이 증가하는 경향이 확인되었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
《실시예 9: 고농도 제제의 완충제, 등장화제, 계면 활성제를 포함하는 처방의 안정성 평가 검토》
실시예 8과 동일하게 하여, 20mmol/L 시트르산을 사용하여, 표 14의 pH로 조제한 처방 용액에, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 농도가 Fab'-PEG 환산으로 100mg/mL(Fab' 환산으로 약 50mg/mL), D-소르비톨 농도가 240mmol/L, L-아르기닌염산염 농도가 140mmol/L, 폴리소르베이트 80 농도가 0.02％(w/v)가 되게 첨가한 표 14에 나타내는 처방에 대해서, 정치 상태에서 각 조건(5℃, 25℃) 하에 1개월 또는 3개월 보관 후의 안정성을 평가하였다. 조제한 샘플은 0.22㎛ 필터로 멸균 여과 후, 3mL 바이알에 0.8mL 충전하여, 고무 마개로 타전 후, 감아 조이기를실시하고, 각 조건에서 보관하였다.
다량체 및 분해물은 SE-HPLC법에 의해 측정하고, 산성측 유사체 및 염기성측 유사체는icIEF법에 의해 측정하였다. SE-HPLC법 및 icIEF법은 실시예 8과 동일하게 하여 실시하였다.
결과를 표 15에 나타내지만, 시트르산, 아르기닌 및 폴리소르베이트를 포함하는 고농도 제제, 또는 시트르산, D-소르비톨 및 폴리소르베이트를 포함하는 고농도 제제는 보관 후에 있어서도 안정되었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
본 발명에 따르면, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물, 상세하게는 분해물, 다량체, 산성측 유사체, 염기성측 유사체, 불용성 이물의 생성을 억제하여 이루어지는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하여 이루어지는, 안정된 의약 조성물을 제공할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정한 양태를 따라서 설명했지만, 당업자에게 자명한 변법이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.
<서열표 프리텍스트>
서열 번호 1의 서열은, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트의 아미노산 서열이며, 서열 번호 2의 서열은, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 유전자의 염기 서열이며, 서열 번호 3의 서열은 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄 아미노산 서열이며, 서열 번호 4의 서열은 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 경쇄 유전자의 염기 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Pharmaceutical composition containing PEGylated Fab' fragment of anti-human NGF antibody <130> A17003-004 <150> JP 2016-061353 <151> 2016-03-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain fragment of anti-human NGF antibody Fab' fragment <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Asn Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Pro Glu Ser Gly Met Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 225 230 <210> 2 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain fragment gene of anti-human NGF antibody Fab' fragment <400> 2 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctgggt ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcgaccata gtggaagcac caacaacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtaggcacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgttcgag agatgggggc 300 cccgaatcgg ggatgggggc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actcccttag tagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc gcagcctga 699 <210> 3 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of anti-human NGF antibody Fab' fragment <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain gene of anti-human NGF antibody Fab' fragment <400> 4 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gattcaacta tttgggttgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac tctgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaacgga ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660

Claims (19)

  1. PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하고, pH가 4 내지 5.5인, 안정된 의약 조성물로서,
    해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는,
    (1) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트, 및
    (2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트
    로부터 선택되고,
    상기 PEG화가, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시킨 것인 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 더 함유하는 의약 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, pH가 4.5 내지 5.5인 의약 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 완충제가, 시트르산, 아세트산 및 히스티딘, 그리고 그들의 제약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 의약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 완충제가 시트르산 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염인 의약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 완충제의 농도가 1 내지 200mmol/L인 의약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 의약 조성물이 액체 제제 또는 동결 건조 제제인 의약 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 의약 조성물이 액체 제제인 의약 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 등장화제가, 아르기닌, D-소르비톨, D-만니톨, 트레할로오스, 수크로오스, 크실리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 이노시톨, 둘시톨, 아라비톨, 이소말트, 락티톨 및 말티톨로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 의약 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 등장화제의 농도가 1 내지 500mmol/L인 의약 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 계면 활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머의 적어도 한쪽인 의약 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 계면 활성제가 폴리소르베이트 80인 의약 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 계면 활성제의 농도가 0.001 내지 1％(w/v)인 의약 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 농도가 0.1 내지 200mg/mL인 의약 조성물.
  15. 제1항에 있어서, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물.
  16. 제1항에 있어서, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트로서, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시켜 PEG화한 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물.
  17. 제1항 또는 제16항에 있어서, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식이 중쇄 가변 영역 N 말단의 피로글루타밀화인 의약 조성물.
  18. pH를 4 내지 5.5로 조정하는 것을 특징으로 하는, PEG화 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트를 안정화하는 방법으로서,
    해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트는,
    (1) 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 3에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트, 및
    (2) (1)의 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab' 프래그먼트인, 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트
    로부터 선택되고,
    상기 PEG화가, 해당 항인간 NGF 항체 Fab' 프래그먼트의 힌지 영역 시스테인의 티올기에, 티올 반응기를 결합시킨 PEG 유도체의 티올 반응기를 공유 결합시킨 것인 상기 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 완충제, 제약학적으로 허용되는 등장화제, 및 제약학적으로 허용되는 계면 활성제를 사용하는 방법.
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