KR20220036998A - 항 cd47/pd-l1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

항 cd47/pd-l1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 특히 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체, 완충액, 안정화제 및 계면활성제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 상기 제제의 치료 또는 예방 용도에 관한 것이다.

Description

항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 항체 제제 분야에 관한 것이다. 특이적으로, 본 발명은 재조합 항-분화 클러스터 47(CD47) 및 항 예정사 리간드 1(PD-L1) 이중특이성 항체(항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체로도 지칭됨)를 포함하는 약제학적 제제, 특히 안정적인 고농도 항체 액체 제제, 상기 약제학적 제제의 제조 방법 및 약제학적 제제의 치료 및/또는 예방 용도에 관한 것이다.
분화 클러스터 274(CD274) 또는 B7 homolog 1(B7-H1)로도 알려진 PD-L1은 40-kDa I형 막관통 단백질이다. PD-L1은 활성화된 T 세포에 존재하는 자신의 수용체 PD-1에 결합하고 T 세포의 활성화를 하향 조절한다(Latchman 등, 2001, Nat. Immunol., 2:261-8; Carter 등, 2002, Eur. J. Immunol., 32:634-43). PD-L1 발현은 인간의 폐암, 난소암, 대장암 및 여러 골수종을 포함하는 많은 암에서 발견되고, PD-L1 발현은 흔히 암의 좋지 않은 예후와 관련이 있다(Iwai 등, (2002) PNAS, 99:12293-7; Ohigashi 등, (2005) Clin Cancer Res., 11:2947-53; Okazaki 등, (2007) Intern. Immun., 19:813-24; Thompson 등, (2006) Cancer Res., 66:3381-5). 일부 종양 환자의 경우, 면역억제는 PD1과 PD-L1 사이의 국소적 상호작용을 억제함으로써 역전시킬 수 있다고 제안되어 있다.
Roche가 개발한 항 PD-L1 항체 아테졸리주맙(atezolizumab), Merck KGaA와 Pfizer가 공동 개발한 항 PD-L1 항체 아벨루맙(avelumab), 및 AstraZeneca가 개발한 더발루맙(durvalumab)은 일부 종양 환자를 치료하는 데 효과를 보였다. 다른 항 PD-L1 항체는 YW243.55.S70(중쇄 및 경쇄 가변 영역은 WO2010/077634의 서열 번호 20 및 21로 나타남), WO2007/005874에 개시된 항 PD-L1 항체 등을 포함한다.
인테그린-관련 단백질(IAP)로도 알려진 분화 클러스터 47(CD47)은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CD47은 세포 표면 면역글로불린인데 그 리간드는 포식세포 및 수지상 세포들에 의해 주로 발현되는 SIRPα와 상호작용을 하여, 여러 개의 연속단계 반응을 생성함으로써, 흡수를 억제하고 포식세포(macrophages) 및 수지상 세포들에 의해 CD47을 발현하는 세포들의 식세포작용을 억제한다. CD47 과발현(overexpression)이 종양에서 관측되었다. 그러나, CD47의 발현은 또한 많은 정상 조직에서 발견되며 이는 정상 혈액계 세포에만 CD47을 표적하는 항체의 비특이성 결합으로 이어져 항원 함몰의 원인이 된다.
항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 종양 세포의 CD47과 PD-L1을 동시에 표적한다. 종양 세포에서 PD-L1에 대한 특이적으로 결합은 종양 세포에 대한 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 선택적으로 결합하도록 촉진하고, 많은 정상 조직에서 발현되는 CD47에 대한 결합을 방지한다. 따라서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 항종양 효과를 강화하는 동시에 부작용도 감소시킬 수 있다.
PCT 출원인 PCT/CN2018/123886(2018년 12월 26일에 출원)은 신규 항체 모델을 개시하고 신규 항체 모델로 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 구성 및 발현한다. 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 Raji-PD-L1 세포를 NOD-SCID 마우스에 접종하여 얻은 종양 보유 마우스에 투여하며, 결과는 항 CD47 모노클로날 항체 및 항 PD-L1 모노클로날 항체의 투여와 비교하여 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 항종양 활성을 현전히 개선하고, 종양의 성장을 현저하게 억제할 수 있으며, 심지어 종양을 완벽하게 제거할 수 있음을 보여준다. 또한, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 또한 현저히 감소한 혈구응집을 나타내어, 임상 치료에서 부작용을 현전히 감소시킬 것이다. 당업계에서 SIRPα/CD47 신호전달 경로 및 PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 각종 질환을 치료, 예방 또는 지연시키기 위해 사용될 수 있는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제가 필요로 한다.
항체 제제는 항체를 대상체에게 투여하기 적합하게 만드는 것은 물론, 저장 및 차후의 사용에서도 안정성을 유지하는 방식으로 제형화해야 한다. 예를 들어, 액체 항제를 적절하게 제형화하지 못하면 용액에서 항체가 분해, 응집, 바람직하지 않은 화학적 변형 등을 일으킬 수 있다. 항체 제제에서의 항체 안정성은 제제에 사용하는 완충액, 안정화제, 계면활성제에 달려 있다.
일부 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체가 개시되어 있지만, 안정성이 뛰어나고 대상체에게 투여하기 적합한 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함하는 신규 약제학적 제제는 여전히 당업계에서 해결해야 하는 과제이다. 따라서 질환 치료 또는 예방에 사용하기 적합한 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체가 필요로 한다.
본 발명은 전술한 요구를 충족시키기 위해 CD47 및 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (i) 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질, (ii) 완충액, (iii) 안정화제, 및 (iv) 계면활성제를 포함하는 액체 항체 제제를 제공한다.
본 명세서에 개시된 항체 제제에 포함된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 삼중 사슬 항체이며, 이는 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하거나, 또한 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 적어도 약 107M-1, 바람직하게는 약 108M-1, 보다 바람직하게는 약 109M-1이상의 친화성 상수로 종양 세포 표면의 CD47에 결합할 수 있고, 이로써 대식세포의 표면의 SIRPα에 CD47이 결합하는 것을 차단하고 종양 조직 침입 부위에서 대식세포에 의한 종양 세포에 대한 식세포작용을 촉진하며; 적어도 약 107M-1, 바람직하게는 약 108M-1, 보다 바람직하게는 약 109M-1 이상의 친화성 상수로 종양 세포 표면의 PD-L1에 결합할 수 있고, 이로써 종양 세포 표면의 PD-L1에 T 세포 상의 Pd-1이 결합하는 것을 억제하여 T 세포가 활성화되도록 유도하고 항종양 효과를 내도록 한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 (2018년 12월 26일에 출원된) PCT 출원 번호 PCT/CN2018/123886에 개시된 재조합 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체이며, 이의 내용은 본 출원의 목적을 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 삼중 사슬 항체이며, 이는 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제 3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하고, 제 1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍은 GSIEHYYWS(서열 번호 3)로 나타나는 VH CDR1, YIYYSGSTNYNPSLKS(서열 번호 4)로 나타나는 VH CDR2, ARGKTGSAA(서열 번호 5)로 나타나는 VH CDR3, RASQGISRWLA(서열 번호 10)로 나타나는 VL CDR1, AASSLQS(서열 번호 11)로 나타나는 VL CDR2, 및 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 QQTVSFPIT(서열 번호 12)로 나타나는 VL CDR3, 또는 6개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)를 보이는 서열을 포함하고; 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항체 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항체 결합 부위 모두가 AYTISRNSMG(서열 번호 17)로 나타나는 CDR1, IESDGST(서열 번호 18)로 나타나는 CDR2, 및 AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(서열 번호 19)로 나타나는 CDR3, 또는 3개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)를 보이는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 항원 결합 부위로서의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍은 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 서열 번호 2/9의 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열, 또는 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위 모두 서열 번호 15 및/또는 서열 번호 16으로 나타나는 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS(서열 번호 2);
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK(서열 번호 9);
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCQASAYTISRNSMGWFRQAPGKQREGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLGNAKNTLYLEMNSLKPEDTAMYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTQVTVSS(서열 번호 15);
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSS(서열 번호 16).
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 서열 번호 1로 나타나는 제1 폴리펩티드 사슬, 서열 번호 8로 나타나는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 서열 번호 14 또는 서열 번호 22로 나타나는 제3 폴리펩티드 사슬, 또는 서열 중 어느 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함한다:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 1);
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 8);
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 14);
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 22).
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 농도는 약 1~200mg/mL이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 농도는 약 5~150mg/mL이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 농도는 약 5mg/mL, 10mg/mL, 20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL, 50mg/mL, 60mg/mL, 70mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 110mg/mL, 120mg/mL, 130mg/mL, 140mg/mL 또는 150mg/mL이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내 완충액의 농도는 약 1~30mM이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내 완충액의 농도는 약 5~25mM, 예를 들어, 약 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM이다.
한 실태양태에서, 완충액은 히스티딘, 히스티딘 염산염 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내의 안정화제의 농도는 약 50~500mM이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내의 안정화제의 농도는 약 100~400mM, 예를 들어, 약 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM 또는 400mM이다.
한 실시양태에서, 안정화제는 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 아르기닌, 아르기닌 염산염 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염이다. 한 실시양태에서, 액체 항체 제제는 안정화제로서의 아르기닌 염산염을 포함하며; 아르기닌 염산염은 바람직하게는 약 50~250mM, 보다 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재하며; 및/또는 액체 항체 제제는 안정화제로서의 수크로스를 포함하며; 수크로스는 바람직하게는 약 50~250mM, 보다 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재한다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 중 계면활성제의 농도는 약 0.1~1mg/mL이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 중 계면활성제의 농도는 약 0.2~0.8mg/mL이며, 예를 들어, 약 0.2mg/mL, 약 0.3mg/mL, 약 0.4mg/mL, 약 0.5mg/mL, 약 0.6mg/mL, 약 0.7mg/mL 또는 약 0.8mg/mL이다.
한 실시양태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 계면활성제로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 중 계면활성제는 폴리소르베이트-80이다.
일부 실시양태에서, 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어, 약 0.002~0.2mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함한다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 약 0.01~0.1mg/mL, 예를 들어, 0.01mg/mL, 0.02mg/mL, 0.03mg/mL, 0.04mg/mL, 0.05mg/mL, 0.06mg/mL, 0.08mg/mL 또는 0.1mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함한다.
한 실시양태에서, 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0이다. 일부 실시양태에서, 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0 중 어느 하나, 예를 들어, 약 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0이다.
한 실시양태에서, 액체 제제는 약제학적 제제로, 바람직하게는 주사제, 보다 바람직하게는 피하 주사제 또는 정맥 내 주사제이다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 정맥 내 주입액이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 다음을 포함한다:
(i) 약 1~200mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
(ii) 약 1~30mM의 히스티딘 및/또는 히스티딘 염산염;
(iii) 약 50~500mM의 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염; 및
(iv) 약 0.1~1mg/mL의 폴리소르베이트-80; 여기서
선택적으로, 상기 액체 제제는 0.002~0.2mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함하며,
상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이다.
바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 다음을 포함한다:
(i) 약 50~150mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
(ii) 약 3~25mM의 히스티딘 및/또는 히스티딘 염산염;
(iii) 약 150~300mM의 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염; 및
(iv) 약 0.2~0.8mg/mL의 폴리소르베이트-80; 여기서
선택적으로, 상기 액체 제제는 0.01~0.1mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함하며,
상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이다.
바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 다음을 포함한다:
(i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
(ii) 약 20mM의 히스티딘;
(iii) 약 180mM의 아르기닌 염산염; 및
(iv) 약 0.2mg/mL의 폴리소르베이트-80; 여기서
선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA를 더 포함하며,
상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이다.
바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 다음을 포함한다:
(i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
(ii) 약 20mM의 히스티딘;
(iii) 약 100mM의 아르기닌 염산염 및 4%의 수크로스; 및
(iv) 약 0.2mg/mL의 폴리소르베이트-80; 여기서
선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA를 더 포함하며,
상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이다.
바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 다음을 포함한다:
(i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
(ii) 약 2.52mg/mL의 히스티딘 및 약 0.79mg/mL의 히스티딘 염산염;
(iii) 약 37.92mg/mL의 아르기닌 염산염; 및
(iv) 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트-80; 여기서
선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA를 더 포함하며,
상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제를 고체화함으로써 얻은 고체 항체 제제를 제공한다. 고체화 처리는, 예를 들어, 결정화, 분무 건조 또는 동결 건조로 구현된다. 바람직한 한 실시양태에서, 고체 항체 제제는, 예를 들어, 주사를 위한 동결 건조 분말의 형태이다. 본 명세서에 개시된 재구성 제제를 제공하기 위해 사용하기에 앞서 적합한 매개체(vehicle)에서 고체 항체 제제를 재구성 할 수 있다. 재구성 제제는 또한 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제이다. 한 실시양태에서, 적합한 매개체는 주사용 수, 주사용 유기 용매(주사용 오일, 에탄올, 프로필렌 글리콜 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 액체 제제는 장기간, 예를 들어 적어도 24개월 이상 동안 안정적으로 저장할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 약 -80°C 내지 약 45°C, 예를 들어, -80°C, 약 -30°C, 약 -20°C, 약 0°C, 약 5°C, 약 25°C, 약 35°C, 약 38°C, 약 40°C, 약 42°C 또는 약 45°C에서 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월 또는 그 이상 동안 안정적으로 저장할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 적어도 24개월 동안 안정적으로 저장할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 적어도 40°C에서 안정적이다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 약 2~8°C에서 적어도 12개월, 바람직하게는 적어도 24개월 동안 안정적이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 실온, 또는 예를 들어, 약 25°C에서 적어도 3개월, 바람직하게는 적어도 6개월 동안 안정적으로 유지된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 약 40°C에서 적어도 1개월 동안 안정성을 유지한다.
한 실시양태에서, 저장 후 제제의 안정성은 제제의 성상, 가시적 입자, 단백질 함량, 순도 및/또는 전하 변이체의 변화를 검출함으로써 표시될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성을 고온 스트레스 시험으로, 예를 들어 40±2°C에서 적어도 1주, 2주 또는 바람직하게는 1개월 동안 저장한 후에, 또는 25±2°C에서 적어도 1개월 또는 2개월 동안 저장한 후에 검사할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성은 저장 후 육안으로 검사되며, 여기서 본 명세서에 개시된 액체 제제는 성상상 투명하고 살짝 유백색, 무색 내지 담황색 액체 및 입자가 없는 것을 유지한다. 한 실시양태에서, 투명도 검출기를 이용해 육안 검사를 실시했을 때 제제에 가시적 입자가 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 저장 후 안정성은 단백질 함량의 변화를 확인함으로써 검사되며, 여기서 단백질 함량의 변화율은, 예를 들어 자외선 분광광도(UV)법에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하(예를 들어, 7%~8%), 바람직하게는 5% 이하이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성은 본 명세서에 개시된 액체 제제의 탁도 변화를 확인함으로써 검사되며, 여기서 변화는 예를 들어, OD350mm 방법에 의해 측정했을 때 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여 0.04 이하, 바람직하게는 0.03 이하, 보다 바람직하게는 0.02 이하이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 저장 후 안정성은 본 명세서에 개시된 액체 제제의 순도 변화을 확인함으로써 검사되며, 여기서 단량체 순도의 변화는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여 10% 이하, 예를 들어, 5%, 4% 또는 3% 이하(예를 들어 1~2%), 바람직하게는 1% 이하이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성은 본 명세서에 개시된 제제의 순도 변화를 확인함으로써 저장 후 검사되며, 여기서 단량체 순도의 변화는 비환원 및/또는 환완 모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(CE-SDS)에 의해 측정했을 때 10% 이하, 예를 들어, 9.5%, 8.5%, 7.5% 또는 6.5% 이하로 감소된다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성은 이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF)에 의해 저장 후 검사되고, 여기서 항체의 전하 변이체(주성분, 산성 성분, 염기성 성분)의 전체 변화는 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여 50% 이하, 예를 들어, 45%, 40%, 35%, 30% 또는 25% 이하이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 안정성은 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의해 저장 후 검사되고, 여기서 항체의 전하 변이체(주성분, 산성 성분, 염기성 성분)의 전체 변화는 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여 40% 이하, 예를 들어, 38%, 36%, 34%, 32% 또는 30% 이하이다.
한 실시양태에서, 제제는 예를 들어, 2°C 내지 8°C에서 적어도 24개월 동안, 실온에서 적어도 3개월 동안, 또는 40°C ± 2°C에서 1개월 동안 저장 후에도 안정성을 유지하고, 바람직하게는, 하기 특성 중 하나 이상을 가진다:
(i) 순도가 SEC-HPLC에 의해 측정했을 때 90%를 초과하며, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하고;
(ii) 순도가 환원 또는 비환원 CE-SDS에 의해 측정했을 때 85%를 초과하며, 바람직하게는 86%, 87%, 88% 또는 89%를 초과하고;
(iii) iCIEF에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 성분(주성분, 산성 성분 및 염기성 성분)의 전체 변화가 50% 이하, 예를 들어, 45%, 40%, 35%, 30% 또는 25% 이하;
(iv)CEX-HPLC에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 성분(주성분, 산성 성분 및 염기성 성분)의 전체 변화가 40% 이하, 예를 들어, 38%, 36%, 34%, 32% 또는 30% 이하; 및
(v) ELISA에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 상대적 결합활성이 70~130%, 예를 들어, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% 또는 130%이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 또는 고체 항체 제제를 포함하는 전달 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 전달 장치는, 예를 들어 정맥 내, 피하, 피내 또는 근육 내 주사, 또는 정맥 내 주입에 사용하기 위하여, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 또는 고체 항체 제제를 포함하는 사전 충전형 주사기의 형태로 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 또는 고체 항체 제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 대상체(예를 들어, 포유동물)에 전달하는 방법을 제공하며, 예를 들어, 사전 충전형 주사기 형태의 전달 장치를 사용하여 전달할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 SIRPα/CD47 신호전달 경로 및 PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 질병을 치료, 예방 또는 지연시키는 전달 장치(예를 들어, 사전 충전형 주사기) 또는 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 또는 고체 항체 제제의 용도를 제공하며, 여기서 질병은 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 림프종, 유방암, 위암, 폐암, 식도암, 장암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 췌장암, 방광암, 신경교종, 흑색종 및 다른 고체 종양; 자가 면역 질환 및 염증 질환, 예를 들어, 알레르기성 천식 또는 궤양성 대장염; 및 인간 이외 장기 이식(이종이식편)에서 거부반응을 포함하는 세포 또는 조직 또는 장기 이식에서 거부반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 혈액 질환 또는 고체 종양을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 이하의 상세한 설명을 참조하여 명확해질 것이다.
하기에 상세히 설명된 본 발명의 바람직한 실시양태는 하기 도면과 함께 읽으면 더 잘 이해할 수 있을 것이다. 본 발명을 설명하기 위하여 현재 바람직한 실시양태를 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명이 도면이 도시하는 실시양태의 구체적인 배치 및 수단에 한정되지 않음을 이해해야 한다.
도 1은 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체의 구조를 설명하는데 있어서, 제1 폴리펩티드 사슬이 제2 폴리펩티드 사슬과 쌍을 이루어 제1 항원 결합 부위를 형성하고, 제3 폴리펩티드 사슬은 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위를 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬의 제2 단일 도메인 항원 결합 부위와 제3 단일 도메인 항원 결합 부위는 그 사이에 가요성 링커 펩티드를 가진다.
도 2는 SEC-HPLC에 의해 확인했을 때, 상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제 샘플의 단백질 순도 변화 추이를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 1M은 1개월 차를 나타낸다.
도 3은 CE-SDS에 의해 확인했을 때, 상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제 샘플의 단백질 순도 변화 추이를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 1M은 1개월 차를 나타낸다.
도 4는 iCIEF에 의해 확인했을 때, 상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제 샘플의 전하 변이체의 주성분 변화 추이를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 1M은 1개월 차를 나타낸다.
도 5는 SEC-HPLC에 의해 확인했을 때, 0일, 1주, 2주 및 4주 동안 40±2°C에서 저장 후 각종 안정화제(제법 2~5)를 포함하는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제의 시간에 따른 주요 피크 순도 변화를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 1W는 1주 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 4W는 4주 차를 나타낸다.
도 6은 CE-SDS에 의해 확인했을 때, 0일, 1주, 2주 및 4주 동안 40±2°C에서 저장 후 각종 안정화제(제법 2~5)를 포함하는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제의 시간에 따른 주요 피크 순도 변화를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 1W는 1주 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 4W는 4주 차를 나타낸다.
도 7은 iCIEF에 의해 확인했을 때, 0일, 1주, 2주 및 4주 동안 40±2°C에서 저장 후 각종 안정화제(제법 2~5)를 포함하는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제의 시간에 따른 전하 변이체의 주성분 변화를 나타낸다. 가로축에서 T0는 0일 차를 나타내고, 1W는 1주 차를 나타내고, 2W는 2주 차를 나타내며, 4W는 4주 차를 나타낸다.
본 발명을 상세히 기술하기에 앞서, 기술된 특정 방법 및 실험 조건은 달라질 수 있으며, 본 발명은 이러한 방법 또는 조건에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하려는 것이 아니다.
정의
별도로 정의하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 당업자들이 통상적으로 이해하는 의미를 지닌다. 본 발명의 목적을 위하여 하기 용어를 다음과 같이 정의한다.
수치와 함께 사용되는 용어 "약(about)"은 명시된 수치 미만의 하한 5% 및 명시된 수치 이상의 상한 5% 범위의 수치를 망라하는 것으로 간주한다.
용어 "및/또는(and/or)"은 둘 이상의 선택지를 연결하기 위해 사용되는 경우 선택지 중 임의의 하나 또는 둘 이상을 가리키는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함한다(comprise/comprising)"는 기술한 요소, 정수(integer) 또는 단계를 포함하되, 그 외의 요소, 정수 또는 단계를 배제하지는 않음을 의도한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함한다(comprise/comprising)"는, 별도로 표시하지 않는 한 기술한 요소, 정수 또는 단계로 완전히 구성되는 상황 또한 망라한다. 예를 들어, 특정 서열를 "포함하는" 항체 가변 영역이라고 언급할 경우, 특정 서열로 구성된 항체 가변 영역도 망라하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 넓게는 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 가리키는데, 각종 구조를 가진 자연발생적 또는 인공적 항체를 망라하고, 삼중 사슬 항체, 무손상 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함하나 여기에 한정되지는 않는다.
용어 "온전체 항체(whole antibody)", "전장 항체(full-length antibody)", "완전한 항체(complete antibody)", 및 "무손상 항체(intact antibody)" 등은 이황화 결합(disulfide bonds)으로 연결된 최소 2개의 중쇄(H)과 2개의 경쇄(L)을 포함하는 당 단백질(glycoprotein)을 지칭하여 번갈아 사용된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(약어 VH로 표시) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(약어 VL로 표시) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 영역 및 VL 영역은 고변이 영역(상보성 결정 영역, CDR)으로 추가적으로 분할하고, 이의 사이에 더 많은 보존 영역(프레임워크 영역, FR)을 삽입할 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서부터 카르복실-말단을 향해 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서대로 배열된다. 불변 영역은 항체 및 항원의 결합과 직접적인 관련은 없지만 각종 이펙터 기능을 한다.
용어 "항체 제제"는 활성 성분으로서 항체의 생물학적 활성이 효과적으로 발휘되는 것을 허용 가능한 형태로 존재하는 제제를 가리키며, 제제가 투여되는 대상체에 허용할 수 없는 독성을 가지는 다른 성분을 함유하지 않는다. 이러한 항체 제제는 일반적으로 멸균 상태이다. 일반적으로, 항체 제제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용 가능한" 부형제는 제제에 사용되는 활성 성분의 유효량을 대상체에 전달할 수 있도록 포유동물 대상체에 합리적으로 투여할 수 있는 제제이다. 부형제의 농도는 투여 방식에 맞게 조정하며, 예를 들어, 주사에 허용 가능한 농도일 수 있다.
본 명세서에서 "본 명세서에 개시된 항체 제제"로도 지칭되는 용어 "항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제"는 활성 성분으로서의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 제제를 가리킨다. 활성 성분으로서 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질이 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 후 인간 또는 비인간 동물에 대한 치료 또는 예방을 목적으로 투여하는 데에 적합하다. 본 명세서에 개시된 항체 제제는, 예를 들어, 즉시 사용 가능한 사전 충전형 주사기에 들어 있는 수성 액체 제제로, 또는 사용 직전에 생리학적으로 허용 가능한 용액에서 용해 및/또는 현탁하여 재구성(즉, 재용해)되는 동결 건조 제제로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 액체 제제 형태이다.
"안정적인" 항체 제제는 항체가 특정 조건 하에서 저장했을 때 항체가 물리적 및/또는 화학적 안정성을 허용 가능한 수준으로 유지되는 제제를 말한다. 항체 제제의 항체는 특정 기간 동안 저장했을 때 이의 화학적 구조를 100% 유지하지 못할 수 있지만, 항체가 특정 기간 동안 저장 후 전형적으로 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 구조 또는 기능을 유지한다면, 상기 항체 제제는 "안정적"인 것으로 간주될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 항체 응집 또는 분해 또는 화학적 변형이 제조, 제제화, 운송 및 장기 저장 동안 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제에서 거의 검출되지 않아 결과적으로 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 생물학적 활성이 거의 또는 전혀 손실되지 않으며 높은 안정성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 저장 후 이의 물리적 및 화학적 안정성을 크게 유지한다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 실온에서 또는 40°C에서 적어도 1개월 동안, 및/또는 2°C~8°C에서 적어도 24개월 동안 안정성을 유지할 수 있다.
단백질의 안정성을 확인하기 위한 각종 분석 기술은 당업계에서 공지되어 있다(예를 들어, 문헌인 Peptide and Protein Drug Delivery, 247- 301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs (1991) 및 문헌인 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993) 참조). 안정성은 선택한 온도에서 선택한 저장 시간 동안 확인될 수 있다. 예를 들어, 저장 시간은 제제의 예상 유효기한에 기반하여 선택될 수 있다. 대안적으로, 가속 안정성 시험이 채택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 제제에 대한 다양한 스트레스 시험을 실시함으로써 안정성 시험이 수행된다. 이러한 시험은 제제화된 항체 제제가 제조, 저장 또는 운송 중 직면할 수 있는 극한 조건을 나타낼 수 있으며, 또한 비제조, 저장 또는 운송 중 항체 제제에서 항체의 불안정성을 가속화하는 조건을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 제제화된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 고온 스트레스 하에서 항체의 안정성을 검사하기 위해 유리병에 채워 넣을 수 있다.
제제가 응집, 침전, 탁도 및/또는 변성을 나타내지 않거나 일정 기간 동안 저장한 후에 응집, 침전, 탁도 및/또는 변성의 수준이 매우 낮으면, 항체가 제제에서 "그의 물리적 안정성을 유지"하는 것으로 간주될 수 있다. 제제 내 항체의 응집으로 인해 발생하는 안정성 문제는 잠재적으로 환자의 면역 반응 증가로 이어질 수 있다. 따라서, 제제 내 항체의 응집을 최소화하거나 방지해야 한다. 광 산란법을 사용하여 제제 내의 가시적인 응집체를 확인할 수 있다. SEC를 사용하여 제제 내의 가용성 응집체를 확인할 수 있다. 또한, 제제의 안정성은 제제의 성상, 색상 및/또는 투명도를 육안으로 검사하거나, OD350nm 방법으로 제제의 탁도를 검출하거나, 또는 비환원 CE-SDS 방법으로 제제의 순도를 확인하여 표시될 수 있다. 한 실시양태에서, 제제의 안정성은 특정 기간 동안 특정 온도에서 저장한 후 제제 중 항체 단량체의 백분율을 확인함으로써 측정되며, 제제 중 항체 단량체의 백분율이 높을수록 제제의 안정성도 높아지는 것이다.
물리적 안정성의 "허용 가능한 정도"는 특정 기간 동안 특정 온도에서 저장 후 제제에서 검출된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 단량체의 적어도 약 92%를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 허용 가능한 정도의 물리적 안정성은 적어도 2주, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 또는 그 이상 동안 특정 온도에서 저장 후에도 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 단량체 의 적어도 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 나타낸다. 물리적 안정성을 평가할 때, 약제학적 제제가 저장되는 특정 온도는 약 -80°C 내지 약 45°C 범위 내의 임의의 온도, 예를 들어, 약 -80°C, 약 -30°C, 약 -20°C, 약 0°C, 약 4°C~8°C, 약 5°C, 약 25°C, 약 35°C, 약 37°C, 약 40°C, 약 42°C 또는 약 45°C일 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제제를 약 40±2°C에서 1개월 또는 4주 동안 저장 후에도 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 단량체의 적어도 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 검출되면 상기 약제학적 제제는 안정적인 것으로 간주한다. 약 25°C에서 2개월 동안 저장 후에도 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 단량체의 적어도 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 검출되면 상기 약제학적 제제는 안정적인 것으로 간주한다. 약 5°C에서 9개월 동안 저장 후에도 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 단량체의 적어도 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 검출되면 상기 약제학적 제제는 안정적인 것으로 간주한다.
제제의 항체가 일정 기간 동안 저장 후에도 유의미한 화학적 변화가 나타나지 않으면 상기 항체는 "그의 화학적 안정성을 유지"하는 것으로 간주될 수 있다. 대부분의 화학적 불안정성은 항체의 공유적 변형 형태(예를 들어, 항체의 전하 변이체) 형성으로 인해 발생한다. 염기성 변이체는 예를 들어 아스파르트산 이성질체화 및 N-말단과 C-말단 변형에 의해 형성될 수 있으며, 산성 변이체는 탈아미드화, 시알릴화 및 당화에 의해 생성될 수 있다. 항체의 화학적 변화 형태를 검출 및/또는 정량화하여 화학적 안정성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 제제에서 항체의 전하 변이체는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 또는 이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF)에 의해 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, 특정 기간 동안 특정 온도에서 저장한 후 제제 중 항체의 전하 변이체의 백분율 변화를 확인함으로써 제제의 안정성을 측정되며, 여기서 변화율이 작을수록 제제의 안정성도 높아지는 것이다.
"허용 가능한 수준"의 화학적 안정성은 특정 기간 동안 특정 온도에서 저장 후에도 제제에서 전하 변이체(예를 들어, 주성분, 산성 성분, 또는 염기성 성분)의 변화율(%)이 30% 이하, 예를 들어 20% 이하인 것을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 허용 가능한 수준의 화학적 안정성은, 적어도 2주, 적어도 28일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월, 또는 그 이상의 기간 동안 특정 온도에서 저장 후에도 전하 변이체(산성 성분)의 변화율이 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 이하인 것을 나타낼 수 있다. 화학적 안정성을 평가할 때, 약제학적 제제가 저장되는 온도는 약 ~80°C 내지 약 45°C 범위 내 임의의 온도, 예를 들어, 약 -80°C, 약 -30°C, 약 -20°C, 약 0°C, 약 4~8°C, 약 5°C, 약 25°C 또는 약 45°C일 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제제는 5°C에서 24개월 동안 저장 후에도 산성 성분의 전하 변이체의 변화율이 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만이면 안정적인 것으로 간주할 수 있다. 25°C에서 2개월 동안 저장 후에도 산성 성분의 전하 변이체 변화율이 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5% 또는 약 0.1% 미만이면, 상기 약제학적 제제는 안정적인 것으로 간주될 수 있다. 40°C에서 1개월 동안 저장 후에도 산성 성분의 전하 변이체 변화율이 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5% 또는 약 0.1% 미만이면, 상기 약제학적 제제는 안정적인 것으로 간주될 수 있다.
용어 "동결 건조 제제"는 액체 제제의 동결 건조 공정에 의해 얻거나 얻기 가능한 조성물을 가리킨다. 바람직하게는, 상기 동결 건조 제제는 수분 함량이 5% 미만, 바람직하게는 3% 미만인 고체 조성물이다.
용어 "재구성 제제"는 생리학적으로 허용 가능한 용액에서 고체 제제(예를 들어, 동결 건조 제제)를 용해 및/또는 현탁하여 얻은 액체 제제를 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실온"은 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 20℃ 내지 27℃, 보다 바람직하게는 25℃의 온도를 가리킨다.
"스트레스 조건"은 화학적 및/또는 물리적으로 항체 단백질에 악영향을 미치고 허용 불가한 수준의 항체 단백질의 불안정화를 초래할 수 있는 환경을 가리킨다. "고온 스트레스"는 항체 제제를 일정 기간 동안 실온 또는 그 이상의 온도(예를 들어, 40±2°C)에서 저장하는 것을 가리킨다. 항체 제제의 안정성은 고온 스트레스 가속 시험에 의해 검사될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구 투여"는 전형적으로 주사 또는 주입에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 가리키며, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피부 내, 복강 내, 기관 내, 피하, 표피하, 관절 내, 피막하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내의 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 안정적인 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 대상체에 비경구적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 피하, 피내, 근육 내, 또는 정맥 내 주사에 의해 대상체에 투여된다.
I. 항체 제제
본 발명은 (i) 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질, (ii) 완충액, (iii) 안정화제, (iv) 계면활성제 및 선택적으로 (v) 다른 부형제를 포함하며, 여기서 항체 제제의 pH는 약 6.4~7.0인 안정적인 액체 항체 제제를 제공한다. 바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제는 주사제의 형태이다.
(i) 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질
본 명세서에 개시된 항체 제제 내의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 삼중 사슬 항체이며, 이는 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제 3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하거나; 또한 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함한다. 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 적어도 107M-1, 바람직하게는 약 108M-1, 보다 바람직하게는 약 109M-1 또는 그 이상의 친화성 상수로 CD47에 결합할 수 있고, 적어도 107M-1, 바람직하게는 약 108M-1, 보다 바람직하게는 약 109M-1 또는 그 이상의 친화성 상수로 PD-L1에 결합할 수 있어, 항체가 CD47 및 PD-L1 분자의 이중특이적 표적을 특징으로 하는 치료제 및/또는 예방제로 사용될 수 있도록 한다.
PD-L1 또는 CD47에 특이적으로 결합한 VH/VL 쌍은 임의 종래의 기술에서 보고된 항 PD-L1 항체 및 미래에 개발되는 항 PD-L1 항체의 VH/VL 쌍의 6개 CDR, 또는 6개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화가 있는 서열(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)을 포함하며; 또는 임의 종래의 기술에서 보고된 항 CD47 항체 및 미래에 개발되는 항 CD47 항체의 VH/VL 쌍의 6개 CDR, 또는 6개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화가 있는 서열(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)을 포함한다.
PD-L1 또는 CD47에 특이적으로 결합한 제1 VHH 및 제2 VHH는 모두 자연적으로 경쇄가 없는 항체의 중쇄 가변 도메인(예를 들어, 낙타과 종에서 자연적으로 발생하는 중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인)으로부터 유래한다. 제1 VHH와 제2 VHH는 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 VHH와 제2 VHH는 낙타, 알파카, 단봉낙타, 라마 및 과나코와 같은 낙타과 종에서 생산된 항체로부터 유래할 수 있다. 낙타과 이외의 종에서도 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산할 수 있으며, 해당 VHH도 본 명세서에 개시된 항체 단백질의 범위에 포함된다. 제1 VHH 및 제2 VHH는 임의 종래의 기술에서 보고된 항 PD-L1 항체 및 미래에 개발되는 항 PD-L1 항체의 VHH의 3개 CDR, 또는 3개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화가 있는 서열(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)을 포함하며; 또는 임의 종래의 기술에서 보고된 항 CD47 항체 및 미래에 개발되는 항 CD47 항체의 VHH의 3개 CDR, 또는 3개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화가 있는 서열(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍은 GSIEHYYWS(서열 번호 3)로 나타나는 VH CDR1, YIYYSGSTNYNPSLKS(서열 번호 4)로 나타나는 VH CDR2, ARGKTGSAA(서열 번호 5)로 나타나는 VH CDR3, RASQGISRWLA(서열 번호 10)로 나타나는 VL CDR1, AASSLQS(서열 번호 11)로 나타나는 VL CDR2, 및 중국특허출원 제CN201710759828.9호에 보고된 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 QQTVSFPIT(서열 번호 12)로 나타나는 VL CDR3, 또는 6개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)를 가지는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH는 AYTISRNSMG(서열 번호 17)로 나타나는 CDR1, IESDGST(서열 번호 18)로 나타나는 CDR2, 및 AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(서열 번호 19)로 나타나는 CDR3, 또는 3개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 삭제)를 가지는 서열을 포함한다.
용어 "CDR", "상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역"(본 명세서에서 초가변 영역 "HVR"과 서로 교환해서 사용 가능)은 항원의 에피토프에 대한 결합을 주로 담당하는 항체의 가변 영역 내의 아미노산 영역을 가리킨다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 일반적으로 CDR1, CDR2, CDR3으로 지칭하고, N-말단으로부터 순차적으로 번호를 매긴다. 주어진 VH, VL 또는 VHH 아미노산 서열의 CDR 서열을 결정하는 각종 방안이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기반하여 결정되고 가장 일반적으로 사용된다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia 방안은 구조적 루프의 위치에 기반한다(Chothia and Lesk, J. mol. biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 Kabat HVR과 Chothia 구조적 루프를 절충한 방법으로서, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기반한다. 아울러 HVR은 참조 CDR 서열(예를 들어, 본 명세서에 개시된 예시적인 CDR)과 동일한 Kabat 넘버링 위치를 기반으로 결정될 수 있다.
아미노산 변화, 예를 들어, 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 대체하는 아미노산 변경을 가리킨다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에서 공지되어 있다. 본 명세서의 임의의 실시양태에서, 바람직한 한 측면에서, 보존적 치환 잔기는 하기 보존적 치환표 A, 바람직하게는 표 A에 나타난 바람직한 치환 잔기로부터 온 것이다.
표 A
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한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍은 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 서열 번호 2/9의 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열, 또는 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH는 서열 번호 15 및/또는 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬 내의 면역글로불린의 중쇄 불변 영역의 종류는 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 면역글로불린의 중쇄 불변 영역이고, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열이다. 더 바람직하게는 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어, 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성) 서열들이다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 IgG4(예를 들어, 인간 IgG4)에서 사용되는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항 CD47 PD-L1 항체 단백질은 IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)에서 사용되는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 삼중 사슬 항체의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인들은 각기 "CPPC" 아미노산 서열을 가지는 경첩 영역(hinge region)을 포함하고 및/또는 각기 Y349C 및 S354C(Kabat의 EU 넘버링을 따름)을 가지는데, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬은 Fc 영역에 사슬 내 이황화 결합(interchain disulfide bonds)을 형성하여, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬의 정확한 쌍짓기를 안정화한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및/또는 제3 폴리펩티드 사슬은 항체 이펙터(effector)의 기능에 영향을 주는 Fc 도메인 내에서 아미노산의 돌연변이를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 이펙터의 기능은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)이다. 한 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 영역의 CH2 도메인에 존재한다. 예를 들어, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 제1 폴리펩티드 사슬 및/또는 제3 폴리펩티드 사슬의 위치 234 및 235(EU 넘버링)에서의 아미노산의 치환을 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, 아미노산 치환은 L234A 및 L235A(또는 "LALA 돌연변이"라고도 지칭함)이다.
또 다른 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제2 폴리펩티드 사슬은 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 경쇄 불변 영역 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서,항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬과 제3 폴리펩티드 사슬은 Fc 도메인 내에 각각 돌기("knob")와 공동("hole")을 포함하고, 또는 이의 반대를 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인 내의 돌기(또는 공동)는 제3 폴리펩티드 사슬의 Fc 도메인의 공동(또는 돌기)에 위치할 수 있어, 제1 폴리펩티드 사슬과 제3 폴리펩티드 사슬은 서로 간에 안정된 "구멍 내 매듭(knob-in-hole)"을 형성하도록 한다. 한 실시양태에서, 아미노산의 치환 T366W는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬 중 하나에 포함되고, 이 아미노산 치환 T366S, L368A 및 Y407V(EU 넘버링)는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬 중 다른 하나에 포함된다. 따라서, 1개의 사슬 내의 돌기는 다른 사슬 내의 공동에 배치하여 제1 폴리펩티드 사슬 및 제3 폴리펩티드 사슬이 정확히 쌍을 이루도록 유도한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 CH1 도메인과 CL 도메인은 각각 돌기와 공동을 포함하고, 또는 이의 반대를 포함하며, CH1 도메인 내의 돌기(또는 공동)는 CL 도메인 내의 공동(또는 돌기)에 위치할 수 있어, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 서로 간에 안정된 "구멍 내 매듭(knob-in-hole)"을 형성하도록 한다.
한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 서열 번호 1로 나타나는 제1 폴리펩티드 사슬, 서열 번호 8로 나타나는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 서열 번호 14로 나타나는 제3 폴리펩티드 사슬, 또는 서열 중 어느 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 서열 번호 1로 나타나는 제1 폴리펩티드 사슬, 서열 번호 8로 나타나는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 서열 번호 22로 나타나는 제3 폴리펩티드 사슬, 또는 서열 중 어느 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어"서열 동일성은 서열이 비교 창(comparison window)에서 뉴클레오티드 단위 또는 아미노산 단위 기준으로 동일한 수준"을 가리킨다. "서열 동일성(%)"은, 비교 창에서 최적으로 정렬된 서열 2개를 비교하는 단계; 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G 및 I) 또는 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 2개의 서열에서 동일한 위치의 수를 확인하여 매칭된 위치의 수를 제공하는 단계; 매칭된 위치의 수를 비교 창 내 위치의 총 수(즉 창 크기)로 나누는 단계; 및 그 결과를 100으로 곱하여 확대시키는 단계;를 통해 산출될 수 있다. 서열 동일성을 확인하기 위한 최적의 정렬은 당업계에 공지되어 있는 각종 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는, 비교 대상인 전장 서열 범위 또는 표적 서열 영역 내에서 최적의 정렬을 실현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 PD-L1 및 CD47 단백질과 동시에 결합할 수 있으며, 각 모 항체의 친화성 상수를 유지하여 SIRPα/CD47 신호전달 경로 및 PD1/PD-L1 신호전달 경로가 차단될 수 있어 항체 제제가 SIRPα/CD47 신호전달 경로 및/또는 PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 각종 질환 또는 질병을 치료, 예방 또는 지연시키는 데 사용될 수 있다.
바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 특허 출원 번호 PCT/CN2018/123886(2018년 12월 26일에 출원됨)에 개시된 재조합 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질이며, 이는 서열 번호 1로 나타나는 제1 폴리펩티드 사슬, 서열 번호 8로 나타나는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 서열 번호 14로 나타나는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 한 실시양태에서, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 재조합 발현에 의해 생성되고 정제된다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 항체는 유의미한 항종양 활성을 나타낸다. 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 Raji-PD-L1 세포를 NOD-SCID 마우스에 접종하여 얻은 종양 보유 마우스에 투여하며, 결과는 항 CD47 모노클로날 항체 및 항 PD-L1 모노클로날 항체의 투여와 비교하여 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 항종양 활성을 현전히 개선했고, 이는 약 90% 이상의 종양 성장 억제, 예를 들어 100% 및/또는 50% 이상의 종양 소실률을 초래할 수 있다. 또한, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체는 현저히 감소한 혈구응집을 나타내어, 임상 치료에서 부작용을 현전히 감소시킬 것이다.
본 명세서에 개시된 항체 제제 내의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 양은 제제의 특정 원하는 특성, 특정 환경 및 제제가 사용되는 특정 목적에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 제제는 액체 제제이며, 이는 약 5~150mg/mL, 예를 들어, 약 5mg/mL, 10mg/mL, 20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL, 50mg/mL, 60mg/mL, 70mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 110mg/mL, 120mg/mL, 130mg/mL, 140mg/mL 또는 150mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함할 수 있다.
(ii) 완충액
완충액은 허용 가능한 범위 내에서 용액의 pH를 제어할 수 있는 시약이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 제제 내 완충액은 본 명세서에 개시된 제제의 pH를 약 6.4~7.0, 예를 들어, 약 6.5로 제어할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 pH는 약 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0이다.
일부 실태 양태에서, 본 명세서에 개시된 제제 내 완충액은 히스티딘, 히스티딘 염산염 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내 완충액의 농도는 약 1~30mM이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 항체 제제 내 완충액의 농도는 약 5~25mM, 예를 들어, 약 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM이다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 제제 내 완충액은 약 16.3mM의 히스티딘과 약 3.77mM의 히스티딘 염산염의 조합이다.
(iii) 안정화제
본 발명에 사용하기에 적합한 안정화제는 당류, 폴리올 및 아미노산, 및 이들의 조합으로부터 선택할 수 있다. 안정화제로 사용되는 당류에는 수크로스 및 트레할로스가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 안정화제로 사용되는 폴리올에는 소르비톨이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 안정화제로 사용되는 아미노산에는 아르기닌 및 아르기닌 염산염이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 약 50~500mM, 바람직하게는 약 100~400mM, 예를 들어, 약 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM 또는 400mM의 양으로 본 명세서에 개시된 액체 제제에 존재한다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 안정화제로서 수크로스를 포함한다. 본 명세서에 개시된 액체 제제 내 수크로스 양은 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 안정화제로서의 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염을 포함한다. 본 명세서에 개시된 액체 제제 내 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염 양은 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 안정화제로서의 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염의 조합을 포함한다. 이 조합에서, 수크로스는 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재할 수 있다. 이 조합에서, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염은 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재할 수 있다.
(iv) 계면활성제
본 명세서에서 사용되는 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 가지는 유기 물질을 가리키며; 즉, 상기 구조는 용해도 경향이 반대인 기, 전형적으로 지용성 탄화수소 사슬 및 수용성 이온성 기로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제의 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드)이다. 본 명세서에 개시된 제제에 포함될 수 잇는 구체적인 비이온성 계면활성제에는, 예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-60 또는 폴리소르베이트-40, Plonik 등이 포함된다. 바람직한 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 액체 제제는 계면활성제로서의 폴리소르베이트-80을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체 제제의 계면활성제의 양은 제제의 특정 제제의 특정한 필요한 특성, 특정 환경 및 제제를 사용하는 특정 목적에 따라 달라질 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 제제는 약 0.1~1mg/mL, 바람직하게는 약 0.2~0.8mg/mL, 예를 들어, 약 0.2mg/mL, 0.3mg/mL, 0.4mg/mL, 0.5mg/mL, 0.6mg/mL, 0.7mg/mL 또는 0.8mg/mL의 폴리소르베이트 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트-80)를 포함할 수 있다.
(v) 기타 부형제
본 명세서에 개시된 항체 액체 제제는 기타 부형제를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 액체 제제는 부형제로서의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA 또는 이의 염)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA 또는 이의 염)를 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA 또는 이의 염)를 포함한 본 명세서에 개시된 항체 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA 또는 이의 염)를 포함하지 않은 제제보다 더 안정적이다.
그 밖의 사항을 고려하여 기타 부형제를 본 명세서에 개시된 제제에 사용할 수 있다. 이러한 부형제에는, 예를 들어 향미제, 항균제, 감미료, 대전방지제, 항산화제, 젤라틴 등이 포함된다. 본 명세서에 개시된 제제에 사용하기에 적합한 전문에 기술하거나 기타 이미 잘 알려진 제약 부형제 및/또는 첨가제로는 당업계에 공지되어 있는 것이며, 예를 들어, The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 제4판, Rowe 등 편집, American Pharmaceuticals Association (2003); 및 Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 제21판, Gennaro 편집, Lippincott Williams & Wilkins (2005)에 열거된 바와 같다,
II. 제제의 제조
본 발명은 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함하는 안정적인 제제를 제공한다. 본 명세서에 개시된 제제에 사용된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 항체 생산에 대해 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된다. 예를 들어, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 PCT/CN2018/123886에 기재된 바와 같이 재조합적으로 제조된다.
약물의 활성 성분으로서 항체를 사용하는 것은 이제 매우 보편적인 방식이다. 약제학적 등급으로 치료 항체를 정제하는 기술 또한 당업계에서 공지되어 있는 사실이다. 예를 들어, Tugcu 등 (문헌[Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 99 (2008) 599-613])은 단백질 A를 포획한 후에 이온 교환 크로마토그래피(음이온 IEX 및/또는 양이온 CEX 크로마토그래피)가 사용되는 항체 3 컬럼 정제 방법을 기재한다. Kelley 등(문헌[Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 101 (2008) 553-566])은 단백질 A 친화 크로마토그래피 후에 약한 분배 음이온 교환 수지를 사용하는 2 컬럼 정제 방법을 기재한다.
일반적으로, 재조합으로 생성한 항체를 통상적인 정제 방법을 사용해 정제하여 항체 제제를 제제화할 수 있도록 충분한 재현성과 적당한 순도를 가지는 약물을 제공한다. 예를 들어, 항체가 재조합 발현 세포로부터 배양 배지로 분비된 후, 발현 시스템의 상청액은 시판 단백질 농축 필터(예를 들어, Amicon 한외여과 장치)를 사용하여 농축될 수 있다. 이어서, 크로마토그래피, 투석 및 친화성 정제와 같은 방법으로 항체를 정제할 수 있다. 단백질 A는 IgG1, IgG2 및 IgG4 항체의 정제를 위한 친화성 리간드로서 적합하다. 이온 교환 크로마토그래피와 같은 기타 항체 정제법도 사용할 수 있다. 충분한 순도의 항체를 얻은 후, 항체를 포함하는 제제가 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
예를 들어, 제조는 하기 단계에 의해 수행될 수 있다: (1) 발효 후 발효액을 원심분리하고 정제하여 세포와 같은 불순물을 제거함으로써 상청액을 얻는 단계; (2) 친화성 크로마토그래피(예를 들어, IgG1, IgG2 및 IgG4 항체에 대한 특이적 친화성을 가지는 단백질 A 컬럼)를 사용하여 항체를 포획하는 단계; (3) 바이러스를 비활성화하는 단계; (4) 단백질의 불순물을 제거하기 위해 정제하는(일반적으로 CEX 양이온 교환 크로마토그래피를 채택함) 단계; (5) (예를 들어 4 log10 이상만큼 바이러스 역가를 감소시키기 위해) 바이러스를 여과하는 단계; 및 (6) 한외여과/정용여과를 수행하는 단계(단백질이 안정성을 촉진하고 주사에 적합한 농도로 농축하기에 유리한 제제 완충액으로 전환하도록 하는 데 사용할 수 있음). 예를 들어, 문헌[B. Minow, P. Rogge, K. Thompson, BioProcess International, Vol. 10, No. 6, 2012, pp. 48-57]을 참조한다.
III. 제제의 분석 방법
항체 제제를 저장하는 동안 항체가 응집, 분해 또는 화학적 변형되어 항체 이질성(크기 이질성 및 전하 이질성 포함), 응집체 및 단편 등이 초래될 수 있으며, 이는 항체 제제의 품질에 영향을 미친다. 따라서, 항체 제제의 안정성을 모니터링할 필요가 있다.
항체 제제의 안정성을 검사하기 위한 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체 제제의 순도가 분석될 수 있고, 항체의 응집 수준은 환원 CE-SDS, 비환원 CE-SDS 및 SEC-HPLC와 같은 방법에 의해 평가될 수 있고; 항체 제제의 전하 변이체는 모세관 등전점 전기영동(cIEF), 이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF), 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 등에 의해 분석될 수 있다. 또한, 제제의 성상을 육안으로 검사함으로써 제제의 안정성을 빠르게 확인할 수 있다. 제제의 탁도 변화는 가용성 및 불용성 응집체의 양에 대한 정보를 제공하는 OD350nm 방법으로도 검출할 수 있다. 또한, 제제 내 단백질 함량의 변화는 자외선 분광광도법(UV 방법)으로 검출할 수 있다.
비환원 CE-SDS법은 모세관을 분리 채널로 사용하여 모노클로날 항체의 순도를 확인하는 방법이다. CE-SDS에서, 단백질 이동은 단백질의 분자량에 비례하는 SDS 결합으로 인한 표면 전하에 의해 유도된다. 모든 SDS-단백질 복합체는 유사한 질량 대 전하 비율을 가지므로 분자의 크기 또는 유체역학적 반경에 기반한 전기영동 분리가 모세관의 분자체(molecular sieve) 겔 매트릭스에서 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 변성된 무손상 항체의 순도를 모니터링하는 데 널리 사용되고 있다. 일반적으로, 비환원 CE-SDS에서 시험 샘플은 SDS 샘플 완충액 및 요오도아세트아미드와 혼합된다. 이어서 혼합물을 68°C~72°C에서 약 10~15분 동안 인큐베이션하고 실온으로 냉각한 다음, 분석을 위해 상청액을 원심분리할 수 있다. 단백질 이동은 전기영동 스펙트로그램을 얻기 위해 자외선 검출기를 사용하여 검출된다. 항체 제제의 순도는 모든 피크 면적의 합에 대한 IgG 주요 피크 면적의 백분율로 산출될 수 있다. CE-SDS에 대한 추가 설명은, 예를 들어, 문헌[Richard R. et al, Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products, Electrophoresis, 2008, 29, 3612-3620]을 참조한다.
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)는 모노클로날 항체의 표준화 및 품질 관리를 위한 또 다른 중요한 방법이다. 이 방법은 주로 분자의 크기 또는 유체역학적 반경의 차이에 기반하여 분자를 분리시킨다. 항체는 SEC-HPLC에 의해 고분자량 종(HMMS), 주요 피크(주로 항체 단량체) 및 저분자량 종(LMMS)의 세 가지 주요 형태로 분리될 수 있다. 항체의 순도는 크로마토그램의 모든 피크 면적의 합에 대한 주요 피크 면적의 백분율로 산출될 수 있다. 제제 중 항체 단량체의 백분율은 가용성 응집체 및 스플라이스의 함량에 대한 정보를 제공하는 SEC-HPLC에 의해 측정할 수 있다. SEC-HPLC에 대한 추가 설명은 문헌[J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[R. Yang 등, High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography (SE-UHPLC), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032]; 및 문헌[Alexandre Goyon 등, Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies, I- Non-denaturing chromatographic techniques, Journal of Chromatography, http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010]을 참조한다.
이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF)을 사용하여 모노클로날 항체의 전하 이질성을 분석할 수 있다. 이러한 방법은 전하 변이체의 정량적 분포를 제공할 수 있다. iCIEF는 pH 구배(겉보기 pI 값)의 전하 차이를 기반하여 분자를 분리한다. iCIEF에서 분리 컬럼은 전형적으로 짧은 모세관(예를 들어, 실리카 모세관, 길이 5cm, 내경 100μm)이며,단백질은 고전압 하의 모세관 컬럼에 집속하고, 초점은 280nM에서 작동하는 전체 컬럼 이미징 검출 시스템에 의해 실시간 온라인으로 모니터링된다. 상기 기술의 한 장점은 항체 샘플의 각종 전하 변이체를 전체 컬럼 검출 시스템에 의해 동시에 기록할 수 있다는 것이다. 일반적으로 iCIEF에서, 샘플은 요소 및 메틸셀룰로오스, pI 분자 표준물질(pI molecular weight standard) 및 양쪽성 전해질을 함유하는 iCIEF 완충액과 혼합된다. 이어서 샘플을 일정 시간 집속한 후, iCIEF 분석기(예컨대, iCE280 분석기(단백질 샘플, Santa Clara,CA.))의 iCIEF 컬럼(예컨대 ProtionSimple에서 소재의 iCIEF 컬럼)을 사용하여 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 집속한 mAb 전하 변이체의 스펙트럼을 얻을 수 있다. iCEIF 스펙트럼에서, 주요 피크(즉, 주성분) 이전에 용리된 단백질 관련 피크는 산성 성분으로 분류되고, 주요 피크 이후에 용리된 단백질 관련 피크는 염기성 성분으로 분류된다. 주성분, 산성 성분 및 염기성 성분의 상대량은 전체 피크 면적에 대한 백분율로 나타낼 수 있다. iCIEF의 추가 설명은, 예를 들어, 문헌[Salas-Solano O 등, Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies:an interlaboratory study, J Sep Sci. 2012 Nov; 35(22):3124-9. doi: 10.1002/jssc.201200633. Epub 2012 Oct 15]; 및 문헌[Dada OO 등, Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation, Electrophoresis. 2015 Nov; 36(21-22):2695-2702. doi: 10.1002/elps.201500219. Epub 2015 Sep 18]을 참조한다.
항체 제제 중 항체의 전하 변이체는 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의해 확인할 수도 있다. 상기 방법에서, CEX-HPLC 컬럼에서 메인 피크의 체류 시간보다 먼저 용리된 피크를 "산성 피크"로, 메인 피크의 체류 시간보다 늦게 CEX-HPLC 컬럼에서 용리된 피크는 "염기성 피크"로 표시한다.
가속 안정성 연구를 사용하여 제품의 안정성을 확인할 수 있으며, 이는 안정적인 약제학적 제제의 스크리닝을 용이하게 한다. 예를 들어, 가속 안정성 연구를 위해 제제 샘플을 더 제고된 온도(예를 들어, 약 40±2°C 및 25±2°C)에서 둘 수 있다. 시험 지표에는 성상, 가시적 입자, 단백질 함량, 탁도, 순도(SEC-HPLC 및 비환원 CE-SDS) 및 전하 변이체(iCIEF 및 CEX-HPLC)가 포함될 수 있다.
또한, 항체의 효능 또는 생물학적 활성을 검출할 수 있다. 예를 들어, 제제 내 항체가 이의 항원성 분자(CD47 분자 및 PD-L1분자)에 결합하는 능력을 검사할 수 있다. 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 정량화하기 위한 면역분석 검정과 같은 각종 방법, 예를 들어 ELISA가 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제는 안정적이다다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 또는 비환원 CS-SDS에 의해 확인했을 때, 약 25°C, 37°C, 40°C 또는 45°C에서 적어도 1개월 또는 2개월, 예를 들어, 40±2°C에서 1개월 동안 저장 후에 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상이다. 한 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%는 CEX-HPLC에 의해 확인했을 때, 약 25°C, 37°C, 40°C 또는 45°C에서 적어도 1개월 또는 2개월 동안 저장 후에, 예를 들어, 40±2°C에서 1개월 동안 저장 후에 비 염기성 및 비 산성 형태(즉, 주요 피크 또는 주요 전하 형태)로 존재한다.
IV. 제제의 용도
본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함한 항체 제제는 SIRPα/CD47 신호전달 경로 및/또는 PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 각종 질환 또는 질병을 치료, 예방 또는 지연할 때 사용할 수 있다. 여기에서 "SIRPα/CD47 신호전달 경로와 관련된 질환 및 장애" 및/또는 "PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 질환 또는 장애"는 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질 제제를 사용하여 치료(예를 들어, 개선)되거나 예방될 수 있는 질환 또는 질병을 가리킨다. 본 명세서에 개시된 항체를 사용하여 치료의 효과를 볼 수 있는 임의의 질환 또는 질병은 본 발명을 적용하기에 적합하다.
한 측면에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함하는 제제는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 다발 골수종(MM), 림프종, 유방암, 위암, 폐암, 식도암, 장암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 췌장암, 방광암, 신경교종, 흑색종 및 기타 고체 종양을 포함하되 이에 한정되지 않는, 대상체의 각종 혈액 질환 및 고체 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용할 수 있다. 또한, NOD 마우스 계 내에 인간 줄기세포를 이식하는 것은 SIRPα/CD47 신호전달 경로(WO 2009/046541)를 차단함으로써 강화할 수 있으므로, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함하는 제제는 인간 줄기세포 이식에 잠재적으로 유용하다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포함한 제제는 SIRPα+ 세포, 예를 들어 알레르기성 천식 또는 궤양대장염에 의한 자가면역 질환 및 염증성 질병을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 이러한 장애는 급성 및 만성 염증성 장애, 알레르기 및 알레르기성 질환, 자가면역 질화, 허혈성 질병, 심각한 전염병 및 인간 이외 장기 이식(이종이식편)을 포함한 세포 또는조직 또는 장기 이식에서의 거부반응을 포함한다.
본 발명은 또한 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질을 포유동물에게 전달하기 위한, 또는 상기에 기술한 질환 및 질병 중 하나 이상을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 약제를 제조하는 데 있어서 본 명세서에 개시된 제제의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유 동물은 인간이다.
본 명세서에 개시된 항체 제제는 각종 경로로 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 주입에 의해 또는 주사기에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 제제(예를 들어, 사전 충전형 주사기)를 포함하는 전달 장치(예를 들어, 주사기)를 제공한다. 환자는 1차 활성 성분으로 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 유효량, 즉, 관심 질환 또는 질병을 치료, 개선 또는 예방하기에 충분한 양을 받을 것이다.
치료 효과에는 생리학적 증상의 감소가 포함될 수 있다. 특정 대상체에 대한 항체의 최적 유효량 및 농도는 환자의 나이, 체중, 건강 상태 및/또는 성별, 질환의 성질 및 정도, 특정 항체의 활성, 신체에 의한 이의 제거를 포함하는 각종 요인과, 이 항체 제제와 함께 조합되어 투여되는 가능한 다른 치료제에 따라 달라질 것이다. 특정 경우에는, 전달되는 유효량은 임상의의 판단 하에 확인될 수 있다. 치료할 적응증에 따라, 유효 용량은 약 0.005mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중 또는 약 0.1mg/kg 체중 내지 약 20mg/kg 체중 범위일 수 있다. 상기 측면에서, 이미 공지되어 있는 항체 기반 약물의 사용은 몇 가지 지침을 제공할 수 있다. 상기 투여량은 단회량 용법 또는 다회량 용법일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 설명된 것이다. 실시예는 본 발명의 청구범위를 제한하지 않으며, 어떠한 경우에도 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
약어
CE-SDS: 모세관 전기영동-도데실 황산나트륨
CEX-HPLC: 양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피
ELISA: 효소결합면역흡착검사
FLD-HPLC: 형광 검출이 있는 HPLC
iCIEF: 이미지화 모세관 등전점 전기영동
SEC-HPLC: 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피
실시예
재조합 항-분화 클러스터 47(CD47) 및 항 예정사 리간드 1(PD-L1) 이중특이성 항체 주사의 안정적인 장기간 저장을 위한 제제 제법을 개발하고 제품의 품질이 유효기한(적어도 24개월) 동안 제어 가능하다는 것을 보장하기 위해, 제법 스크리닝 시험은 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제의 안정성에 대한 상이한 부형제의 영향을 조사하기 위해 설계된다. 시험에 사용된 재료 및 방법은 다음과 같다:
재료 및 방법
1.1. 본 발명의 제제 연구에 사용되는 재료
Figure pct00002
비고: N/A는 "적용 불가"를 표시한다.
1.2. 본 발명의 제제 연구에 사용되는 기구 및 장치
Figure pct00003
1.3. 제제 안정성 관련 시험 항목 및 방법
상기 항체 제제를 가지고 하기 항목을 대상으로 검사하였다: (1) 가시적 입자의 성상 및 존재; (2) 자외선 방법(UV 방법)에 의해 확인된 제제의 단백질 함량; (3) 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC))에 의해 확인되고 모든 피크 면적의 합에 대한 단량체 면적의 백분율로 표현되는 항체 제제의 순도; (4) 환원 모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(환원 CE-SDS) 및/또는 비환원 모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(비환원 CE-SDS)에 의해 확인되고 모든 피크 면적의 합에 대한 단량체 면적의 백분율로 표현되는 항체 제제의 순도; (5) 이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF)에 의해 확인되고 주성분, 산성 성분 및 염기성 성분의 백분율로 표현되는 항체 제제의 전하 변이체; 및 (6) 면역분석법, 예를 들어 직접 ELISA에 의해 확인된항원 CD47 및 PD-L1에 대한 항체 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체의 상대적 결합활성.
가시적 입자의 검출
샘플에서 가시적 입자는 문헌[the National Pharmacopoeia Committee, the Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015년 판, volume IV General Rules 0904 "Test for Visible Particles"), Beijing, China Medical Science Press, 2015]에 기재된 방법에 따라 투명도 검출기(모델 번호 YB-2, Tianda Tianfa, 텐진)를 사용하여 검출되었다.
단백질 함량의 확인
샘플의 단백질 함량은 자외선 분광광도계(모델번호 UV-1800, Shimadzu, 일본)를 사용하여 확인되었다.
순도(SEC-HPLC)
크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 분리를 수행하였고, 여기서 이동상은 인산염 완충액이며(3.12g의 인산이수소나트륨 이수화물, 8.77g의 염화나트륨 및 34.84g의 아르기닌은 초순수에서 용해되었고, 용액의 pH는 염산에 의해 6.8로 조정되었고, 용적은 1000mL까지 만들어졌음), 크로마토그래피 컬럼 보호 용액은 0.05%(w/v) NaN3, 주입 부피는 50μL, 유량률은 0.5mL/min, 획득 시간은 30분, 컬럼 온도는 25°C이며, 검출 파장은 280nm이었다. 샘플는 초순수로 2mg/mL로 희석하여 샘플 용액으로 사용되었다. 상기에 기술한 바와 동일한 방법으로 제제 완충액을 희석하여 바탕 용액(blank solution)을 제조하였다. 바탕 용액과 샘플 용액을 각각 50μL씩 액체 크로마토그래프에 주입하고 검출을 시작하였다.
순도(환원 CE-SDS)
순도는 모세관 겔 전기영동에 의해 검출되었다. 모세관은 내경 50μm, 전체 길이 30.2cm, 유효 길이 20.2cm의 무코팅 모세관이었다. 전기영동에 앞서 모세관 컬럼은 수산화나트륨 0.1mol/L, 염산 0.1mol/L, 초순수 및 70psi에서의 전기영동 겔로로 세척되었다. 적절한 양의 초순수로 샘플을 2.0mg/mL로 희석하고, 희석된 샘플 50μL를 1.5mL 원심분리 튜브에 첨가했다. 그 다음, 원심분리 튜브에 pH 6.5의 샘플 완충액 45μL(구연산 일수화물 0.32g 및 인산수소이나트륨 12수화물 2.45g을 초순수 45mL에 용해하고 용적을 50mL로 만들어 구연산-인산 완충액을 준비하고; 완충액 200μL를 정밀하게 측정한 후 10%(w/v) 황산도데실나트륨용액 80μL를 첨가했으며; 물을 가한 총 용적이 1mL가 되도록 한 다음 혼합물을 잘 혼합하여 샘플 완충액을 얻음), 내부 표준물 1μL(10kDa 단백질, 5mg/mL)(Beckman Coulter, 카탈로그 번호 제390953호) 및 β-메르캅토에탄올 5 μL를 첨가했다. 얻은 혼합물을 잘 혼합하여 70℃±2℃에서 10분±2분간 가열한 후 상온으로 냉각한 다음에 샘플 병에 옮겨 샘플 용액으로 사용하였다. 상기와 동일한 방법으로, 샘플과 동일한 용적의 제제 완충액을 처리하여 바탕 용액을 제조하였다. 샘플 주입 조건: -20초 동안 5 kV; 분리 전압: -35분 동안 15 kV. 모세관 컬럼의 온도는 25℃로 조절하였고, 검출 파장은 220nm였다.
순도(비환원 CE-SDS 방법)
순도는 모세관 겔 전기영동에 의해 검출되었다. 모세관은 내경 50μm, 전체 길이 30.2cm, 유효 길이 20.2cm의 무코팅 모세관이었다. 전기영동에 앞서 모세관 컬럼은 수산화나트륨 0.1mol/L, 염산 0.1mol/L, 초순수 및 70psi에서의 전기영동 겔로로 세척되었다. 적절한 양의 초순수로 샘플을 2.0mg/mL로 희석하고, 희석된 샘플 50μL를 1.5mL 원심분리 튜브에 첨가했다. 그 다음, 원심분리 튜브에 pH 6.5의 샘플 완충액 45μL(구연산 일수화물 0.32g 및 인산수소이나트륨 12수화물 2.45g을 초순수 45mL에 용해하고 용적을 50mL로 만들어 구연산-인산 완충액을 준비하고; 완충액 200μL를 정밀하게 측정한 후 10%(w/v) 황산도데실나트륨용액 80μL를 첨가했으며; 물을 가한 총 용적이 1mL가 되도록 한 다음 혼합물을 잘 혼합하여 샘플 완충액을 얻음), 내부 표준물 1μL(10kDa 단백질, 5mg/mL)(Beckman Coulter, 카탈로그 번호 제390953호) 및 250mmol/L NEM 용액 5μL(N-에틸말레이미드 62mg을 초순수 2mL에 용해)를 첨가했다. 얻은 혼합물을 잘 혼합하여 70℃±2℃에서 10분±2분간 가열한 후 상온으로 냉각한 다음에 샘플 병에 옮겨 샘플 용액으로 사용하였다. 상기와 동일한 방법으로, 샘플과 동일한 용적의 제제 완충액을 처리하여 바탕 용액을 제조하였다. 샘플 주입 조건: -20초 동안 5 kV; 분리 전압: -35분 동안 15 kV. 모세관 컬럼의 온도는 25℃로 조절하였고, 검출 파장은 220nm였다.
전하 변이체(iCIEF 방법)
전하 변이체는 이미지화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF)에 의해 검출되었다. 모세관의 내경은 100μm, 전체 길이는 5cm였다. 모세관 컬럼은 전기영동에 앞서 0.5% 메틸셀룰로오스 용액(이하 MC 용액으로 약칭) 및 초순수로 세척되었다. 샘플을 55초 동안 진공에서 주입하고 1.5kV에서 1분 동안 사전 포커싱을 실행하고, 포커싱은 3kV에서 8분, 샘플 주입 시간은 55초, 샘플 트레이의 온도는 10°C였고, 모세관 컬럼 온도는 실온이었고, 검출 파장은 280 nm였다. 음극성 안정화제는 500mmol/L의 아르기닌이며, 양극성 안정화제는 200mmol/L의 이미노디아세트산이었다. 3mol/L의 요소를 첨가하여 단백질 용해도를 높이고, 0.5% MC 용액을 첨가하여 단백질과 모세관 사이의 접착력을 감소시켰다. 물로 샘플을 0.5mg/mL로 희석한 후, 희석된 샘플 용액 20μL와 미리 혼합한 용액 83μL를 잘 혼합하여 샘플 용액을 제조하였다. 제제 완충액을 사용하여 동일한 절차를 수행하여 바탕 용액을 제조하였다.
상대적 결합활성(직접 ELISA)
스트렙타비딘(Thermo, 카타로그 번호: 21125)을 1x PBS을 사용해 1μg/mL로 희석한 후, 96-웰 마이크로플레이트에 100μL/웰로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 세척 후 플레이트를 차단 용액(5% FBS, 300μL/웰)으로 37°C에서 2시간 동안 차단했다. 비오틴화된 항원(CD47에 대한 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체의 항 CD47 말단의 상대적 결합활성 검출용으로 Beijing Sino Biological(카탈로그 번호:12283-H08H-200)의 인간 CD47 단백질(His-tag)이 사용되었다; PD-L1에 대한 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체의 항 PD-L1-말단의 상대적 결합 활성 검출용으로 ACRO BIOSYSTEMS(카탈로그 번호: PD1-H5229- 1MG)의 재조합 인간 PDL1/CD274를 사용함)을 1× PBS를 사용해 0.5μg/mL로 희석한 후, 96-웰 마이크로플레이트에 100μL/웰로 37℃에서 0.5시간 동안 코팅하였다. 2% FBS를 100μL/웰로 첨가하여 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 40μg/mL로 희석하고, 4배 연속 희석을 수행하여 제12 농도(0.01~10000ng/mL)를 얻었다. 연속 희석된 샘플을 세척된 마이크로플레이트에 100μL/웰로 첨가하고 자동 온도 조절 인큐베이터에 넣어 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후 2% FBS로 희석한 HRP 결합 염소 항인간 IgG-Fc 단편(BETHYL, USA, 카탈로그 번호 제A80-104P호)을 2차 항체로(30000배 희석, 100μL/웰) 37°C에서 20분 동안 반응을 위해 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 100μL의 TMB 발색 용액을 첨가하였다. 10분의 발색 반응 후, 1mol/L의 H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 반응을 종결시켰다. 450 nm에서의 OD 값은 620nm를 기준 파장으로 하여 측정하였다. 모든 농도 구배에서 샘플의 농도 값을 가로축으로, 모든 농도 구배에서 샘플의 OD450nm-OD620nm 값을 세로축으로 취하여, 각 항원에 대한 항체의 결합활성을 반영하기 위해 EC50 값을 Prism 4-파라미터 피팅에 의해 산출하였다.
실시예 1. 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체의 제조 및 정제
항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 Kh2NF-PC는 PCT/CN2018/123886에 기재된 바와 같이 HEK293 세포(INVITROGEN에서 구입)에서 재조합적으로 발현되었고 정제되었다. 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 Kh2NF-PC 항체는 3개의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단까지의 하기 아미노산 서열을 가진다:
펩티드 사슬 #1:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 1)
여기서 펩티드 사슬 #1은 항 CD47 항체 ADI29341로부터 유래된 하기 VH 아미노산 서열:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSS(서열 번호 2);
VH 아미노산 서열의 C-말단에서 인간 IgG1로부터 유래된 하기 CH1 아미노산 서열:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT(서열 번호 6); 및
CH1 아미노산 서열의 C-말단에서 인간 IgG1로부터 유래된 하기 Fc 영역 아미노산 서열:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 7)을 포함한다.
펩티드 사슬 #2:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 8)
여기서 펩티드 사슬 #2은 항 CD47 항체 ADI29341로부터 유래된 하기 VL 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIK(서열 번호 9); 및
VL 아미노산 서열의 C-말단에서 인간 카파 경쇄 불변 영역(CL)의 하기 아미노산 서열:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 13)을 포함한다.
펩티드 사슬 #3:
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 14)
여기서 펩티드 사슬 #3은 제1 항 PD-L1 VHH 및 제2 항 PD-L1 VHH의 하기 아미노산 서열:
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASAYTISRNSMGWFRQAPGKGLEGVAAIESDGSTSYSDSVKGRFTISLDNSKNTLYLEMNSLRAEDTAVYYCAAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNYWGQGTLVTVSS(서열 번호 16);
제1 항 PD-L1 VHH 및 제2 항 PD-L1 VHH의 아미노산 서열 사이의 링커 펩티드 아미노산 서열: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 20); 및
제2 항 PD-L1 VHH의 아미노산 서열의 C-말단에서 인간 IgG1로부터 유래된 하기 Fc 영역 아미노산 서열:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 21)을 포함한다.
실시예 2. 제제(I)의 안정성에 pH가 미치는 영향을 검증한 시험
이 실시예는 pH 5.0~6.5에서의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함하는 제제의 안정성을 조사한다. 총 4개의 pH 값, 즉, 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5를 설계하였다.
2.1. 실험 절차
10 mM의 히스티딘-5%(w/v) 소르비톨 완충액을 제조하였고, pH를 희석된 염산으로 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5로 조정하였다. 정제된 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 Kh2NF-PC 단백질(7.3mg/mL)을 한외여과를 걸쳐 얻은 상이한 pH 값의 용액으로 교환하였다. 교환 후 샘플 내 이중특이성 항체 단백질의 함량은 약 100.0mg/mL로 조정되었고, 그 다음 폴리소르베이트-80의 최종 농도가 0.70 mg/mL가 될 때까지 폴리소르베이트-80을 첨가하였다. 용액을 여과하여 2R 바이알에 분취한 다음, 마개를 씌우고 캡을 씌웠다. 샘플의 안정성을 40±2°C에서 조사하였고 구체적인 실험 방안은 표 1에 나타나 있다.
표 1. 실험 방안
Figure pct00004
비고: (1) x는 샘플링이 이 시점에서 수행됨을 나타낸다. (2) 상기 시점에서 샘플링한 후 얻은 샘플을 먼저 초저온 냉장고에 넣고, 직후의 검출을 위해 동결시킨 다음, 필요에 따라 검출을 위해 해동시켰다.
2.2. 확인 기준
제품에 대한 지식과 기구 및 방법의 정밀도에 따라 샘플 시험 지표가 초기 값과 비교하여 변하지 않았는지 확인하는 기준을 설정하여 샘플이 변했는지 표 2에 자세히 설명된 대로 확인하였다.
표 2. 품질 변화 유무의 확인 기준
Figure pct00005
2.3. 제법 스크리닝 시험의 실험 결과 (I)
(1) 성상 및 가시적 입자
1개월 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5 및 6.0에서 샘플 성상은 상이한 탁도 및 침전의 정도가 나타났고, pH 6.5 샘플만 성상 및 가시적 입자 면에서 표준에 부합했다.
(2) 단백질 함량
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 단백질 함량의 검출 결과는 표 3에 나타나 있다. 결과는 pH 6.5 샘플의 단백질 함량이 1개월 동안 40±2°C에서 저장 후에도 현저하게 변하지 않았음을 나타낸다.
표 3. 상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 단백질 함량
(UV 방법, mg/mL)
Figure pct00006
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
(3) 순도
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 단백질 순도는 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 결과는 표 4에 나타나 있다. 결과는 pH 6.5 샘플의 단백질 순도가 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 0일 차의 순도에 비해 4.1% 감소했음을 나타낸다.
표 4. SEC-HPLC에 의해 확인된 샘플의 단백질 순도(%)
Figure pct00007
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 단백질 순도는 비환원 CE-SDS 및 환원 CE-SDS에 의해 확인되었다. 결과는 표 5 및 표 6에 나타나 있다. 결과는 pH 6.5 샘플의 단백질 순도가 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 0일 차의 순도에 비해 두 방법에서 각각 7.7% 및 3.7% 감소했음을 나타낸다.
표 5. 비환원 CE-SDS에 의해 확인된 샘플의 단백질 순도(%)
Figure pct00008
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
표 6. 환원 CE-SDS에 의해 확인된 샘플의 단백질 순도(%)
Figure pct00009
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
(4) 전하 변이체
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 단백질 함량은 iCIEF에 의해 확인되었다. 결과는 표 7에 나타나 있다. 결과는 pH 6.5 샘플의 주성분 및 산성 성분이 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 현저하게 변하였음을 나타낸다. 0일 차의 값과 비교하여 산성 성분은 36.6%에서 60.1%로 23.5% 증가하였고, 주성분은 62.5%에서 39.1%로 23.4% 감소하였으며, 염기성 성분은 현저하게 변하지는 않았다.
표 7. iCIEF에 의해 확인된 샘플의 전하 변이체(%)
Figure pct00010
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
(5) 상대적 결합활성
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 샘플의 상대적 결합활성은 직접 ELISA에 의해 확인되었다. 결과는 표 8에 나타나 있다. 결과는 pH 6.5 샘플에서 CD47 및 PD-L1 각각에 대한 단백질의 항 CD47 말단 및 항 PD-L1 말단의 상대적 결합활성이 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 변하지 않았음을 나타낸다.
표 8. 직접 ELISA에 의해 확인된 샘플의 상대적 결합활성(%)
Figure pct00011
비고: N/A1는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시하며, N/A2는 시험 항목이 설정되지 않음을 표시한다.
상기 실험의 결과는 pH 5.0, 5.5, 6.0 및 6.5에서 제제에 대해, 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질(예를 들어, Kh2NF-PC 단백질)이 pH 6.5 제제에서 안정적이었음을 나타낸다. 약 6.5의 pH에서 제제의 안정성을 조사하기 위해 추가 실험이 수행되었다.
실시예 3. 제제 (II)의 안정성에 pH가 미치는 영향을 검증한 시험
이 실시예는 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 제제에서 단백질의 안정성에 대한 pH 6.2~7.0의 영향을 조사하며, 총 5개의 pH 값, 즉 6.2, 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0이 설계되었다.
3.1. 실험 절차
구체적인 절차는 상이한 pH 값을 제외하고는, 실시예 2의 "2.1. 실험 절차"와 동일하다.
3.2. 확인 기준
실시예 2의 표 2를 참조한다.
3.3. 실험 결과
(1) 성상 및 가시적 입자
1개월 동안 40±2°C에서 저장 후, pH 6.2 샘플만 유백색 성상을 나타냈으며, pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0의 샘플은 모두 성상 및 가시적 입자 면에서 표준에 부합했다.
(2) 단백질 함량
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 단백질 함량의 검출 결과는 표 9에 나타나 있다. 결과는 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0 샘플에서 단백질 함량은 1개월 동안 40±2°C에서 저장 후 현저하게 변하지 않았음을 나타낸다.
표 9. 상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 단백질 함량(UV 방법, mg/mL)
Figure pct00012
비고: N/A는 시험 항목이 설정되지 않았음을 표시한다.
(3) 순도
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 단백질 함량은 SEC-HPLC에 의해 확인되었다. 결과는 표 10에 나타나 있고, 순도 변화 추이는 도 2에 나타나 있다. 결과는 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 순도가 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 0일 차의 순도에 비해 각각 3.0%, 3.7%, 4.9% 및 5.6% 어느 정도 감소하였음을 나타낸다.
표 10. SEC-HPLC에 의해 확인된 샘플의 단백질 순도(%)
Figure pct00013
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 단백질 함량은 비환원 CE-SDS에 의해 확인되었다. 결과는 표 11에 나타나 있고, 순도 변화 추이는 도 3에 나타나 있다. 결과는 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 순도가 1개월 동안 40±2°C에서 조사 후 0일 차의 순도에 비해 각각 7.0%, 6.1%, 6.7% 및 7.3% 감소하였음을 나타낸다.
표 11. 비환원 CE-SDS에 의해 확인된 샘플의 단백질 순도(%)
Figure pct00014
비고: N/A는 시험 항목이 설정되지 않았음을 표시한다.
(4) 전하 변이체
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 단백질 함량은 iCIEF에 의해 확인되었다. 결과는 표 12에 나타나 있고, 순도 변화 추이는 도 4에 나타나 있다. 결과는 상이한 pH 값에서 샘플의 주성분 및 산성 성분이 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 변하였음을 나타낸다. pH가 높을수록 주성분이 더 빨리 감소하고 산성 성분이 더 빨리 증가한다.
표 12. iCIEF에 의해 확인된 샘플의 전하 변이체(%)
Figure pct00015
비고: N/A는 시험 항목이 설정되지 않았음을 표시한다.
(5) 상대적 결합활성
상이한 기간 동안 40±2°C에서 저장 후 pH 6.4, 6.5, 6.8 및 7.0에서 샘플의 상대적 결합활성은 직접 ELISA에 의해 확인되었다. 결과는 표 13에 나타나 있다. 결과는 pH 6.4, 6.5 및 7.0의 샘플에서 CD47 및 PD-L1에 대한 단백질의 항 CD47 말단 및 항 PD-L1 말단의 상대적 결합활성이 1개월 차 40±2°C에서 조사 후 현저하게 변하지 않았음을 나타낸다.
표 13. 직접 ELISA에 의해 확인된 샘플의 상대적 결합활성(%)
Figure pct00016
비고: N/A는 시험 항목이 설정되지 않았음을 표시한다.
실시예 2 및 실시예 3에서 제제의 안정성에 pH가 미치는 영향을 검증한 시험의 결과는 : pH 5.0~6.2에서 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체(예를 들어, Kh2NF-PC) 단백질을 40±2°C에서 1개월 동안 저장하면 샘플이 탁해지거나 시간에 따라 유백색 침전물이 나타난다; pH 6.4~7.0의 샘플을 40±2°C에서 1개월 동안 저장하면 샘플은 성상 및 가시적 입자 면에서 표준에 부합하며, 단백질 함량은 현저하게 변하지 않으며, CD47과 PD-L1에 대한 상대적 결합활성은 크게 변하지 않음을 나타낸다. 따라서, 다음 예시에서는 후속 실험을 위해 pH 6.4~7.0 중 pH 6.5를 선택했다.
실시예 4. 제법 스크리닝 시험
4.1. 안정화제 스크리닝 시험
항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함한 제제의 안정성에 미치는 영향에 대해 상이한 안정화제(소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 아르기닌 염산염 등)를 조사하였다.
4.1.1 안정화제 스크리닝의 절차
총 5가지 제법이 설계되었으며 표 14에 자세히 나타나 있다. 제법의 완충액을 표 14에 따라 제조하고 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체(Kh2NF-PC) 단백질(3.6mg/mL)을 한외여과를 걸쳐 얻은 각각의 제법 용액으로 교환하였다. 각 제법 용액 내 단백질 함량을 교환 후 약 100.0mg/mL로 조정하였고, 그 다음 폴리소르베이트-80의 최종 농도가 0.20mg/mL가 될 때까지 폴리소르베이트-80을 첨가하였다. 용액을 여과하여 바이알에 분취한 다음, 마개를 씌우고 캡을 씌웠다. 샘플의 안정성을 40±2°C에서 조사하였고 구체적인 방안은 표 15에 나타나 있다. 시험 지표에는 성상, 가시적 입자, 단백질 함량, 순도(SEC-HPLC) 및 전하 변이체(iCIEF)가 포함된다.
표 14. 안정화제 스크리닝 시험을 위해 선택한 제법에 대한 정보
Figure pct00017
비고: 표에서 %는 % w/v를 가리키고, 이하 동일하게 적용된다.
표 15. 안정성 조사 방안
Figure pct00018
비고: (1) x는 샘플링이 이 시점에서 수행됨을 나타낸다. (2) 상기 시점에서 샘플링한 후 얻은 샘플을 먼저 초저온 냉장고에 넣고, 직후의 검출을 위해 동결시킨 다음, 필요에 따라 검출을 위해 해동시켰다.
4.1.2. 확인 기준
특정 기준에 대해 실시예 2의 표 2를 참조한다.
4.1.3. 안정화제 스크리닝 시험
(1) 성상 및 가시적 입자
제법 샘플을 4주 차까지 40±2°C에서 관측하고; 1주 차 조사 후 제법 1 샘플에서 탁함 또는 침전을 관측하였고, 다른 제법 샘플은 성상 및 가시적 입자 면에서 표준에 부합하였다.
(2) 단백질 함량
제법 샘플을 4주 차까지 40±2°C에서 관측하고, 단백질 함량의 결과는 표 16에 나타나 있다. 표 16에서 알 수 있듯이, 제법 2, 제법 3, 제법 4 및 제법 5 샘플의 단백질 함량은 40±2°C에서 4주 동안 저장 후 변화가 없었다.
표 16. 안정화제 스크리닝 시험의 단백질 함량 결과(UV 방법, mg/mL)
Figure pct00019
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
(3) 순도
순도(SEC-HPLC): 40±2°C에서 4주 관측한 결과는 표 17에 나타나 있고, 순도 변화 추이는 도 5에 나타나 있다. 결과는 제법 2, 제법 3, 제법 4 및 제법 5 샘플의 순도가 4주 동안 40±2°C에서 조사 후 0일 차의 순도에 비해 각각 2.6%, 3.0%, 0.7% 및 0.7% 감소하였음을 나타낸다.
표 17. 안정화제 스크리닝 시험의 순도 결과(SEC-HPLC, %)
Figure pct00020
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
순도(비환원 CE-SDS): 40±2°C에서 4주 관측한 결과는 표 18에 나타나 있고, 순도 변화 추이는 도 6에 나타나 있다. 모든 제법 샘플의 순도가 4주 차 40±2°C에서 조사 후 감소했고, 제법 2, 제법 3, 제법 4 및 제법 5 샘플의 순도가 0일 차의 순도에 비해 각각 6.8%, 7.2%, 9.1% 및 9.2% 감소하였음을 나타낸다.
표 18. 안정화제 스크리닝 시험의 순도 결과(비환원 CE-SDS, %)
Figure pct00021
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
(4) 전하 변이체(iCIEF)
40±2°C에서 4주 관측 후 전하 변이체의 결과는 표 19에 나타나 있고, 전하 변이체의 주성분 변화 추이는 도 7에 나타나 있다.
결과는 4주 차 40±2°C에서 조사 후 모든 제법 샘플의 전하 변이체의 주성분 및 산성 성분이 현저하게 변하였고; 주성분은 감소하였고, 산성 성분은 증가하였으며, 샘플의 변화 추이는 기본적으로 동일하였음을 나타낸다.
표 19. 안정화제 스크리닝 시험의 전하 변이체 결과(iCIEF, %)
Figure pct00022
비고: N/A는 샘플의 성상이 표준에 맞지 않기 때문에 샘플에 대해 검출이 수행되지 않음을 표시한다.
안정제 스크리닝 테스트 결과는 40±2°C에서 4주간 저장 후, 제법 2, 제법 3, 제법 4 및 제법 5 샘플이 성상 및 가시 입자의 면에서 표준에 부합하며, 단백질 함량이 변하지는 않고 샘플의 순도가 약간 감소함을 나타내는데, 여기서 제법 4 및 제법 5 샘플은 순도(SEC-HPLC) 및 전하 변이체(iCIEF)에서 상당한 이점을 나타낸다.
4.2. 삼투압 시험
4.2.1 시험 절차
0시간(T0)에서 제법 4 및 제법 5 샘플의 삼투압은 다채널 삼투압계를 사용하여 측정되었다. 각 샘플을 두 번 측정하고 두 번 측정한 값의 평균을 취했다.
4.2.2. 시험 결과
0시간(T0)에서 제법 4 및 제법 5 샘플의 삼투압 결과는 표 20에 나타나 있다.
표 20. 삼투압 측정 결과
Figure pct00023
인간 혈장의 삼투압이 약 285~310mOsmol/kg이기 때문에 제법 4 및 제법 5 샘플의 삼투압은 약제학적 제제의 허용 가능한 삼투압 범위 내에 있다. 또한, 제법 4 샘플의 삼투압이 인간 혈장의 삼투압에 가깝다는 점에서 제법 4의 제제가 바람직하다.
실시예 5. 제제 안정성에 금속 킬레이트제가 미치는 영향
EDTA는 대표적인 금속 킬레이트제이다. 본 실시예는 EDTA가 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체(Kh2NF-PC) 단백질의 안정성에 미치는 영향을 연구한다.
5.1. EDTA가 제제 안정성에 미치는 영향에 대한 조사 방안
총 2개의 제법을 설계하였는데, 여기서 제법 6은 EDTA가 없는 대조군이고 제법 7은 최종 농도 0.02mg/mL에서 EDTA가 있는 군다. 구체적인 제법 정보는 표 21에 나타나 있다. 제법의 완충액을 표 21에 따라 제조하고 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체(Kh2NF-PC) 단백질을 한외여과를 걸쳐 얻은 각각의 제법 용액으로 교환하였다. 교환 후, 각 제제 용액의 단백질 함량을 약 100.0mg/mL로 조정하였다.
표 21. EDTA가 제제 안정성에 미치는 영향에 대한 제법 정보
Figure pct00024
제제의 안정성에 EDTA가 미치는 영향에 대한 상세한 실험 조건 및 샘플링 일정은 표 22에 나타나 있다.
표 22. EDTA가 제제 안정성에 미치는 영향에 대한 조사 방안
Figure pct00025
비고: (1) x는 샘플링이 이 시점에서 수행됨을 나타낸다. (2) 상기 시점에서 샘플링한 후 얻은 샘플을 먼저 초저온 냉장고에 넣고, 직후의 검출을 위해 동결시킨 다음, 필요에 따라 검출을 위해 해동시켰다.
5.2. 실험 결과
4주 차까지 40±2°C에서 관측한 결과는 표 23에 나타나 있다.
표 23. 제제 안정성에 대한 EDTA의 실험 결과
Figure pct00026
표 23의 결과는 전하 변이체 검출 결과(CEX-HPLC)에 따르면, 제법 7 샘플의 전하 변이체의 주요 피크는 제법 6 샘플의 전하 변이체의 주요 피크보다 더 큰 이점을 보이며; 폴리소르베이트-80(FLD-HPLC)의 검출 결과에 따르면, 제법 6 샘플의 폴리소르베이트-80 함량은 시간에 따라 감소하며, 제법 7 샘플은 제법 7 샘플에 금속 킬레이트제 EDTA를 첨가하여 금속 이온으로 인한 폴리소르베이트-80의 분해를 억제한다는 점에서 제법 6 샘플보다 우수하다는 것을 보여준다. 금속 킬레이트제의 예로서 EDTA는 금속 이온과 결합할 수 있어 하기의 적어도 두 가지의 상황에서 폴리소르베이트-80의 분해를 억제할 수 있다. 하나는 세포 배양, 정제 및 기타 관련 작업 단계를 포함한 단백질의 전체 생산 공정에 있어서, 일부 금속 이온이 도입되어 산소 및 금속 이온 모두의 존재 하에서 폴리소르베이트-80의 산화 분해로 이어질 수 있다는 것이고; 다른 하나는 일부 숙주 세포 단백질이 제법 샘플의 단백질에 남아 있을 수 있고 폴리소르베이트-80을 분해할 수 있는 관련 효소가 이러한 불순물 단백질에 존재할 수 있으며 효소는 촉매 기능을 수행하기 위한 보조 인자로서 금속 이온이 필요하다는 것이며; 따라서, 제법 샘플에 첨가된 금속 킬레이트제는 금속 이온에 결합하여 폴리소르베이트-80의 분해를 억제하여 제법의 안정성을 높일 수 있다.
따라서, 가장 바람직한 제제 방안은 100.0mg/mL의 재조합 항-분화 클러스터 47(CD47) 및 항 예정사 리간드 1(PD-L1) 이중특이성 항체, 약 2.52mg/mL의 히스티딘, 0.79mg/mL의 히스티딘 염산염, 37.92mg/mL의 아르기닌 염산염, 0.50mg/mL 폴리소르베이트-80, 0.02 mg/mL의 EDTA, pH 6.5인 것으로 확인된다.
실시예 6. 500L 제조물 안정성에 대한 조사
500L 제조물은 안정성 조사를 위해 실시예 5의 제제 방안(약 100.0mg/mL의 재조합 항-분화 클러스터 47(CD47) 및 항 예정사 리간드 1(PD-L1) 이중특이성 항체, 약 2.52mg/mL의 히스티딘, 0.79mg/mL의 히스티딘 염산염, 37.92mg/mL의 아르기닌 염산염, 0.50mg/mL의 폴리소르베이트-80, 0.02 mg/mL의 EDTA, pH 6.5)을 사용하여 제조된다.
6.1. 안정성 조사 및 조사 방안 마련
안정성 조사를 위해 하기 제조물 500L를 제조했다: 101.8mg/mL의 재조합 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질, 2.52mg/mL의 히스티딘, 0.79mg/mL의 히스티딘 염산염, 37.92mg/mL의 아르기닌 염산염, 0.50mg/mL의 폴리소르베이트-80, 0.02 mg/mL의 EDTA, pH 6.5.
표 24. 제조물 안정성에 대한 조사 방안
Figure pct00027
표 25. 품질 기준
Figure pct00028
비고: 1. 보고 데이터는 검출 항목에 대한 허용 범위가 설정되지 않았으며, 실제로 검출된 데이터를 직접 보고할 수 있음을 가리킨다. 이하 동일하게 적용된다.
2. SEC-HPLC에서 주요 피크+중합체+단편은 100%이고, 주요 피크가 95% 이상인 한, 나머지 5% 이하는 단편과 중합체의 양이므로 단편 및 중합체 양의 데이터는 보고 데이터이다. 이하 동일하게 적용된다.
3. 비환원 CE-SDS에서 주요 피크+단편은 100%이고, 주요 피크가 90% 이상인 한, 나머지 10% 이하는 단편의 양이므로 단편의 양의 데이터는 보고 데이터이다. 이하 동일하게 적용된다.
4. 환원 CE-SDS에서 중쇄 및 경쇄 함량+글리코실화되지 않은 중쇄+단편은 100%이고 중쇄 및 경쇄 함량이 90% 이상인 한 나머지 10% 이하가 글리코실화되지 않은 중쇄 및 단편의 양이므로 글리코실화되지 않은 중쇄의 양 및 단편의 양 모두의 데이터가 보고 데이터이다. 이하 동일하게 적용된다.
5. CEX-HPLC에서 주성분+산성 성분+염기성 성분은 100%이며, 주성분의 양이 44.9% 이상인 한, 나머지 55.1% 이하는 산성 성분과 염기성 성분의 양이므로산성 성분의 양 및 염기성 성분의 양 모두의 데이터가 보고 데이터이다. 이하 동일하게 적용된다.
6. 본 명세서는 문헌[Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015년 판, volume III)]의 관련 명세서이며 이하 동일하게 적용된다; 예를 들어, 문헌[General Rules 0904 "Test for Visible Particles"]이 가시적 입자에 대한 검사를 규정한다.
6.2. 안정성 조사 결과
500L 제조물에 대한 안정성 조사 결과는 하기 표에 나타나 있다.
표 26. 장기간 안정성 연구 결과(5±3°C)
Figure pct00029
Figure pct00030
비고: 1. N/A는 검출이 수행되지 않음을 나타내는데 해당 인덱스는 일반적으로 두 끝점에 대해서만 검출되며 두 끝점이 요구 사항을 충족하면 그 사이의 각 지점 값이 요구 사항을 충족하는 것으로 간주된다.
2. 환원 CE-SDS에서 주요 피크+NGHCCD47+단편은 100%이고, 주요 피크가 90% 이상인 한, 나머지 10% 이하는 NGHCCD47 사슬 및 단편의 양이므로 NGHCCD47의 양 및 단편의 양의 데이터가 보고 데이터이다.
표 26의 검출 결과에서 알 수 있듯이, 제조물은 6개월 후에 품질 기준을 충족하였다.
표 27. 가속 안정성 연구 결과(25±2°C/60±5%RH)
Figure pct00031
비고: N/A는 검출이 수행되지 않음을 나타내는데 해당 인덱스는 일반적으로 두 끝점에 대해서만 검출되며 두 끝점이 요구 사항을 충족하면 그 사이의 각 지점 값이 요구 사항을 충족하는 것으로 간주된다.
표 27의 검출 결과에서 알 수 있듯이 가속 안정성 시험에서 6개월 후 모든 지표에 대해 제조물이 기준에 부합한다.
표 28. 강제 조건 시험 결과(40±2°C/75%±5%RH)
Figure pct00032
비고: N/A는 검출이 수행되지 않음을 나타내는데 해당 인덱스는 일반적으로 두 끝점에 대해서만 검출되며 두 끝점이 요구 사항을 충족하면 그 사이의 각 지점 값이 요구 사항을 충족하는 것으로 간주된다.
표 28의 검출 결과에서 알 수 있듯이 강제 조건 안정성 시험에서 8주 후 모든 지표에 대해 제조물이 기준에 부합한다.
결론적으로, 상기 실험을 통해 본 명세서에 개시된 제제 방안은 스케일업 생산에서 제제에 대한 안정성 요건을 만족함을 발견하였다.
본 발명의 예시적인 실시양태가 상기에 기술되어 있다. 이러한 내용은 예시에 불과하며, 본 발명의 범주 내에서 다양한 다른 대체, 개조 및 수정이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 열거된 특정 실시양태에 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISITNG <110> Innovent Biologics(Suzhou) Co., Ltd. <120> 항-CD47/PD-L1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도 <130> <160> 22 <170> PatentIn 버전 3.3 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47/PDL1 이중특이성 항체의 제1 펩티드 사슬 <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Glu His Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Lys Thr Gly Ser Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VH29341 <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Glu His Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Lys Thr Gly Ser Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VH CDR129341 <400> 3 Gly Ser Ile Glu His Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VH CDR229341 <400> 4 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VH CDR329341 <400> 5 Ala Arg Gly Lys Thr Gly Ser Ala Ala 1 5 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 인간 IgG로부터 유래한 CH1 아미노산 서열1 <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 <210> 7 <211> 221 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 인간 IgG로부터 유래한 Fc 영역 아미노산 서열1 <400> 7 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47/PDL1 이중특이성 항체의 제2 폴리펩티드 <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VL 아미노산 서열29341 <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VL CDR129341 <400> 10 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VL CDR229341 <400> 11 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 항 CD47 항체 ADI-의 VL CDR329341 <400> 12 Gln Gln Thr Val Ser Phe Pro Ile Thr 1 5 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 인간 카파 경쇄 불변 영역(CL)의 아미노산 서열 <400> 13 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 14 <211> 510 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 이중특이성 항체의 제3 펩티드 사슬(VHH 사이에 링커 펩티드 포함) <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 165 170 175 Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala 180 185 190 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser 195 200 205 Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp 210 215 220 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 225 230 235 240 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro 245 250 255 Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn 260 265 270 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His 275 280 285 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 290 295 300 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 305 310 315 320 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 325 330 335 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 340 345 350 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 355 360 365 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 370 375 380 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 385 390 395 400 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 405 410 415 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 420 425 430 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 435 440 445 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 450 455 460 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 465 470 475 480 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 485 490 495 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 500 505 510 <210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> 낙타류 리네우스(Camelus Linnaeus) <220> <223> 낙타의 VHH <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Gly Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 인간화된 VHH <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser 130 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> VHH의 CDR1 <400> 17 Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> VHH의 CDR2 <400> 18 Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> VHH의 CDR3 <400> 19 Ala Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu 1 5 10 15 Ala Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr 20 25 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 링커 펩티드 <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 21 <211> 226 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 인간 IgG로부터 유래한 Fc 영역 아미노산 서열1 <400> 21 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 22 <211> 490 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 이중특이성 항체의 제3 펩티드 사슬(VHH 사이에 링커 펩티드 없음) <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Arg Asn 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu Ala 100 105 110 Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Ser Arg Asn Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Glu Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ser 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu 225 230 235 240 Gly His Leu Ala Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 275 280 285 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 290 295 300 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 305 310 315 320 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 325 330 335 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 340 345 350 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 355 360 365 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 370 375 380 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 385 390 395 400 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 405 410 415 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 420 425 430 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 435 440 445 Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 450 455 460 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 465 470 475 480 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 485 490

Claims (17)

  1. 액체 항체 제제로서,
    (i) 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 완충액;
    (iii) 안정화제;
    (iv) 계면활성제; 및
    선택적으로, (v) 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 포함하며,
    상기 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 삼중 사슬 항체이며, 상기 삼중 사슬 항체는 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제 3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하거나; 제1 항원 결합 부위로서의 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 VH/VL 쌍, 및 각각 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 제3 단일 도메인 항원 결합 부위로서의 제3 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 제1 VHH 및 제2 VHH를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 액체 항체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 예를 들어, 약 6.4, 6.5, 6.8 또는 7.0인, 액체 항체 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 액체 항체 제제 내의 상기 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 농도는 약 1~200mg/mL, 바람직하게는 약 5~150mg/mL, 예를 들어, 약 5mg/mL, 10mg/mL, 20mg/mL, 30mg/mL, 40mg/mL, 50mg/mL, 60mg/mL, 70mg/mL, 80mg/mL, 90mg/mL, 100mg/mL, 110mg/mL, 120mg/mL, 130mg/mL, 140mg/mL 또는 150mg/mL인, 액체 항체 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 액체 항체 제제 내의 완충액은 히스티딘, 히스티딘 염산염 및 이들의 조합으로부터 선택되며; 상기 완충액의 농도는 바람직하게는 약 1~30mM, 보다 바람직하게는 약 5~25mM, 예를 들어, 약 5mM, 10mM, 15mM, 20mM 또는 25mM인, 액체 항체 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정화제는 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 아르기닌, 아르기닌 염산염 및 이들의 조합으로부터 선택되며; 바람직하게는 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염이며, 상기 안정화제의 농도는 바람직하게는 약 50~500mM, 보다 바람직하게는 약 100~400mM, 예를 들어, 약 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM 또는 400mM인, 액체 항체 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체 항체 제제는 상기 안정화제로서의 아르기닌 염산염을 포함하며; 바람직하게는 아르기닌 염산염은 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재하며; 및/또는 상기 액체 항체 제제는 상기 안정화제로서의 수크로스를 포함하며; 바람직하게는 수크로스는 약 50~250mM, 바람직하게는 약 100~200mM(예를 들어, 약 100mM, 110mM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM 또는 200mM)의 양으로 존재하는, 액체 항체 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체 항체 제제 내의 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 계면활성제로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리소르베이트-80인, 액체 항체 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제의 농도가 약 0.1~1mg/mL, 바람직하게는 약 0.2~0.8mg/mL이며, 예를 들어 약 0.2mg/mL, 약 0.3mg/mL, 약 0.4mg/mL, 약 0.5mg/mL, 약 0.6mg/mL, 약 0.7mg/mL 또는 약 0.8mg/mL인, 액체 항체 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체 제제는 약 0.002~0.2mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 바람직하게는 약 0.01~0.1mg/mL, 예를 들어 약 0.01mg/mL, 0.02mg/mL, 0.03mg/mL, 0.04mg/mL, 0.05mg/mL, 0.06mg/mL, 0.08mg/mL 또는 0.1mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)와 같은 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함하는, 액체 항체 제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1 항원 결합 부위로서의, 상기 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 상기 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 상기 VH/VL 쌍은 GSIEHYYWS(서열 번호 3)로 제시된 VH CDR1, YIYYSGSTNYNPSLKS(서열 번호 4)로 제시된 VH CDR2, ARGKTGSAA(서열 번호 5)로 제시된 VH CDR3, RASQGISRWLA(서열 번호 10)로 제시된 VL CDR1, AASSLQS(서열 번호 11)로 제시된 VL CDR2, 및 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 QQTVSFPIT(서열 번호 12)로 제시된 VL CDR3, 또는 6개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 결실)를 가지는 서열을 포함하고; 상기 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 상기 제2 단일 도메인 항체 결합 부위 및 상기 제3 단일 도메인 항체 결합 부위 모두 AYTISRNSMG(서열 번호 17)로 제시된 CDR1, IESDGST(서열 번호 18)로 제시된 CDR2, 및 AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(서열 번호 19)로 제시된 CDR3, 또는 상기 3개의 CDR 중 1개 이상의 CDR과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 변화(예를 들어, 아미노산 치환 또는 결실)를 가지는 서열을 포함하며;
    보다 바람직하게는 상기 제1 항원 결합 부위로서의 상기 제1 폴리펩티드 사슬 및 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 CD47에 특이적으로 결합하는 상기 VH/VL 쌍은 항 CD47 항체 ADI-29341로부터 유래된 서열 번호 2/ 서열 번호 9의 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 쌍을 이루는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 상기 제2 단일 도메인 항원 결합 부위 및 상기 제3 단일 도메인 항원 결합 부위 모두 서열 번호 15 및/또는 서열 번호 16으로 제시된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함하며;
    가장 바람직하게는, 상기 삼중 사슬 항체는 서열 번호 1로 제시된 제1 폴리펩티드 사슬; 서열 번호 8로 제시된 제2 폴리펩티드 사슬, 및 서열 번호 14 또는 서열 번호 22로 제시된 제3 폴리펩티드 사슬, 또는 상기 서열 중 어느 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는) 서열을 포함하는, 액체 항체 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질은 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된, 액체 항체 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체 제제는 주사제, 바람직하게는 피하 또는 정맥 내 주사를 위한 주사제, 또는 주입액, 예를 들어 정맥 내 주입을 위한 주입액인, 액체 항체 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체 항체 제제는,
    (i) 약 1~200mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 약 1~30mM의 히스티딘 및/또는 히스티딘 염산염;
    (iii) 약 50~500mM의 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염; 및
    (iv) 약 0.1~1mg/mL의 폴리소르베이트-80을 포함하며,
    선택적으로, 상기 액체 제제는 0.002~0.2mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함하며,
    상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이고;
    예를 들어, 상기 액체 항체 제제는,
    (i) 약 50~150mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 약 3~25mM의 히스티딘 및/또는 히스티딘 염산염;
    (iii) 약 150~300mM의 수크로스, 아르기닌 및/또는 아르기닌 염산염; 및
    (iv) 약 0.2~0.8mg/mL의 폴리소르베이트-80을 포함하며,
    선택적으로, 상기 액체 제제는 0.01~0.1mg/mL의 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA)를 더 포함하며,
    상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이며; 또는
    상기 액체 항체 제제는,
    (i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 약 20mM의 히스티딘;
    (iii) 약 180mM의 아르기닌 염산염; 및
    (iv) 약 0.2mg/mL의 폴리소르베이트-80을 포함하며,
    선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA를 더 포함하며,
    상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이며; 또는
    상기 액체 항체 제제는,
    (i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 약 20mM의 히스티딘;
    (iii) 약 100mM의 아르기닌 염산염 및 4%의 수크로스; 및
    (iv) 약 0.2mg/mL의 폴리소르베이트-80을 포함하며,
    선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA 를 더 포함하며,
    상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5이며; 또는
    상기 액체 항체 제제는,
    (i) 약 100mg/mL의 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질;
    (ii) 약 2.52mg/mL의 히스티딘 및 약 0.79mg/mL의 히스티딘 염산염;
    (iii) 약 37.92mg/mL의 아르기닌 염산염; 및
    (iv) 약 0.5mg/mL의 폴리소르베이트-80을 포함하며,
    선택적으로, 상기 액체 제제는 금속 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 예를 들어 약 0.02mg/mL의 EDTA 를 더 포함하며,
    상기 액체 제제의 pH는 약 6.4~7.0, 바람직하게는 약 6.5인, 액체 항체 제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는, 예를 들어, 2~8°C에서 적어도 24개월 동안, 실온에서 적어도 3개월 동안, 또는 40°C±2°C에서 1개월 동안 저장 후에도 안정성을 유지하며, 바람직하게는,
    (i) 순도가 SEC-HPLC에 의해 측정했을 때 90%를 초과하며, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하고;
    (ii) 순도가 환원 또는 비환원 CE-SDS에 의해 측정했을 때 85%를 초과하며, 바람직하게는 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 또는 92%를 초과하고;
    (iii) iCIEF에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 성분(주성분, 산성 성분 및 염기성 성분)의 전체 변화가 50% 이하, 예를 들어, 48%, 46%, 44%, 42% 또는 40% 이하이고;
    (iv) CEX-HPLC에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 성분(주성분, 산성 성분 및 염기성 성분)의 전체 변화가 40% 이하, 예를 들어, 38%, 36%, 34%, 32% 또는 30% 이하이고; 및
    (v) ELISA에 의해 측정했을 때, 저장 0일 차의 초기 값과 비교하여, 제제 내 항 CD47/PD-L1 이중특이성 항체 단백질의 상대적 결합활성이 70~130%, 예를 들어, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120% 또는 130%인, 액체 항체 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 상기 액체 항체 제제를 고체화하여 얻은 고체 항체 제제로서, 상기 고체 제제는, 예를 들어, 주사용 동결 건조 분말의 형태인, 고체 항체 제제.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 상기 액체 항체 제제 또는 제14항에 따른 상기 고체 항체 제제를 포함하는, 전달 장치.
  16. 정맥 내 또는 근육 내 주사에 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 상기 액체 항체 제제 또는 제14항에 따른 상기 고체 항체 제제를 포함하는, 사전 충전형 주사기.
  17. SIRPα/CD47 신호전달 경로 및 PD1/PD-L1 신호전달 경로와 관련된 질병을 치료, 예방 또는 지연하는 약제를 제조하는데 있어서의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 상기 액체 항체 제제 또는 제14항에 따른 상기 고체 항체 제제의 용도로서, 상기 장애는 예를 들어, 각종 고체 종양 및 혈액 질환(예를 들어, 백혈병, 림프종 또는 골수종, 예를 들어 다발성 골수종), 자가면역질환, 급성 및 만성 염증성 질환, 감염성 질환 및 전이성 병변을 포함하는, 용도.
KR1020227002361A 2019-06-25 2020-06-24 항 cd47/pd-l1 이중특이성 항체를 포함하는 제제, 이의 제조 방법 및 용도 KR20220036998A (ko)

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