KR20200003107A - 항-lag3 항체의 제제, 및 항-lag3 항체 및 항-pd-1 항체의 공동-제제 - Google Patents

항-lag3 항체의 제제, 및 항-lag3 항체 및 항-pd-1 항체의 공동-제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-LAG3 항체의 제제, 및 항-PD-1 항체 및 항-LAG3 항체의 공동-제제, 및 다양한 장애의 치료에서 그들의 용도를 제공한다.

Description

항-LAG3 항체의 제제, 및 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 공동-제제
본 발명은 일반적으로 치료 항체의 제제, 및 다양한 장애의 치료에서 그들의 용도에 관한 것이다.
항체는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에서, 또는 가변 도메인 내의 그들의 프레임워크 서열에서 다소 상이할 수 있지만, 이들은 전형적으로 CDR 서열에서 가장 크게 상이하다. 동일한 단백질, 동일한 폴리펩티드, 또는 심지어 잠재적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체조차도 완전히 상이한 CDR 서열을 포함할 수 있다. 인간에서 사용하기 위한 치료 항체는 또한 인간 생식계열 항체 서열로부터 또는 인간화 항체와 같은 비-인간 (예를 들어, 설치류) 생식계열 항체 서열로부터 수득될 수 있고, 따라서 잠재적인 서열에서 또 다른 추가의 다양성이 유도될 수 있다. 이들 서열 차이는 잠재적으로 용액 중에서 상이한 안정성 및 용액 파라미터에 대한 상이한 반응성을 초래할 수 있다. 또한, 아미노산 배열에서의 작은 변화 또는 1개 또는 몇개의 아미노산 잔기에서의 변화는 서열-특이적 분해 경로에 대해 매우 상이한 항체 안정성 및 민감성을 초래할 수 있다. 결과적으로, 현재 항체 안정성을 최적화하는데 필요한 용액 조건을 예측하는 것이 가능하지 않다. 각각의 항체를 개별적으로 연구하여 최적의 용액 제제를 결정해야 한다. Bhambhani et al. (2012) J. Pharm. Sci. 101:1120.
또한 항체는 예를 들어 다른 치료 단백질, 예컨대 호르몬 및 사이토킨과 비교할 때 매우 큰 단백질 (~150,000 Da)이다. 항체 약물은 효능 및 일관된 투약을 보장하기 위해 보관하는 동안 안정해야 하며, 따라서 어떠한 제제가 선택되건 간에, 바람직한 성질, 예컨대 고농도, 투명성 및 허용되는 점도를 지속시키고, 또한 전형적인 보관 조건하에 허용가능하게 긴 보관 수명에 걸쳐 이들 성질 및 약물 효능을 유지하는 것이 중요하다.
LAG3 (CD223)은 활성화된 T 세포 (Huard et al. Immunogenetics 39:213-217, 1994), NK 세포 (Triebel et al. J Exp Med 171:1393-1405, 1990), B 세포 (Kisielow et al. Eur J Immunol 35:2081-2088, 2005) 및 형질세포양 수지상 세포 (Workman et al. J Immunol 182:1885-1891, 2009) 상에서 발현되는 세포 표면 분자이며 이들 림프구 하위 집합의 기능에서 중요한 역할을 한다. 또한, LAG3과 그의 주요 리간드인 부류 II MHC의 상호작용은 수지상 세포 기능을 조절하는데 소정의 역할을 하는 것으로 생각된다 (Andreae et al. J Immunol 168:3874-3880, 2002). 최근의 임상전 연구는 CD8 T-세포 소진에서 LAG-3의 역할을 입증하였다 (Blackburn et al. Nat Immunol 10:29-37, 2009).
만성 바이러스 감염에서와 같이, 종양 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 염증전 사이토킨의 감소된 생성 및 항원 재자극에 대한 저반응성을 특징으로 하는 손상된 이펙터 기능 및 소진된 표현형을 나타낸다. 이는 세포 외인성 메카니즘, 예컨대 조절성 T-세포 (Treg), 및 세포 내인성 메카니즘, 예컨대 소진된 종양-침윤 림프구 (TIL) 상에서 상향조절된 억제성 분자에 의해 매개된다. 이들 억제성 메카니즘은 효과적인 항종양 면역에 대한 엄청난 장벽을 나타낸다.
LAG-는 관용된 TIL 상에서 발현되고, 이는 이들이 종양-매개된 면역 저해에 기여함을 시사한다. LAG3의 억제는 치료 이익을 얻을 수 있는 항원-특이적 T 세포의 개선된 활성화를 유도할 수 있다.
PD-1은 면역 조절 및 말초 관용성 유지에서 중요한 분자인 것으로 인식된다. PD-1은 비투약 T, B 및 NKT 세포 상에서 적당히 발현되고, 림프구, 단핵구 및 골수 세포 상에서 T/B 세포 수용체 신호전달에 의해 상향조절된다. PD-1에 대한 2가지 공지된 리간드인 PD-L1 (B7-H1) 및 PD-L2 (B7-DC)가 다양한 조직에서 발생하는 인간 암에서 발현된다. 예를 들어 난소암, 신장암, 결장직장암, 췌장암, 간암 및 흑색종의 큰 샘플 집합에서, PD-L1 발현이 후속적인 치료와 무관하게 불량한 예후와 상관관계가 있고 전반적인 생존을 감소시킨 것으로 확인되었다. 유사하게, 종양 침윤 림프구 상에서 PD-1 발현은 유방암 및 흑색종에서 기능부전 T 세포를 나타내고 신장암에서 불량한 예후와 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 따라서, PD-L1 발현 종양 세포가 PD-1 발현 T 세포와 상호작용하여, T 세포 활성화를 약화시키고 면역 감시를 회피시키며, 이로써 종양에 대한 손상된 면역 반응에 기여한다고 제안되었다.
PD-1과 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 중 하나 또는 둘 다와의 상호작용을 억제하는 몇몇 모노클로날 항체가 암 치료를 위해 임상 개발 중에 있다. 이러한 항체의 효능이 다른 승인된 또는 실험된 암 요법, 예를 들어 방사선, 수술, 화학요법제, 표적화 요법, 종양에서 조절되지 않는 다른 신호전달 경로를 억제하는 작용제, 및 다른 면역 강화제와 조합하여 투여되는 경우에 강화될 수 있는 것으로 제안되었다.
결과적으로, 치료 항체, 예컨대 인간 LAG-3에 결합하는 항체에 대한 안정한 제제, 뿐만 아니라 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 안정한 공동-제제가 요구되고 있다. 이러한 안정한 제제는 바람직하게는 자가-투여용 약물의 보관에 대한 전형적인 조건하에, 즉, 시린지 중에서 냉장고 온도에서 수개월 내지 수년에 걸쳐 안정성을 나타낼 것이고, 상응하는 약물 생성물에 대해 긴 보관 수명을 나타낼 것이다.
본 발명은 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다. 출원인은 용액 중에서 항-LAG3의 상 분리를 완화시키는 특정한 부형제를 개발하였다. 한 측면에서, 본 발명은 10-1000 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5-8의 완충제를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 pH 약 5-8의 완충제, 및 15-250 mM의 총 농도의 아르기닌, 히스티딘 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 NaCl 중 1종 이상을 포함하는 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제, pH 약 5-8의 완충제, 25-200 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제제는 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 약 pH 5.8-6.0; 약 70 mM의 L-아르기닌-그의 HCl; 및 임의적으로 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다. 제제는 임의적으로 항-PD-1 항체를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편 및 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편과 10-1000 mM의 총 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 pH 약 5-8의 완충제, 및 임의적으로 3-100 mM의 메티오닌의 공동-제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제제는 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체 및 약 25 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8-6.0; 약 70 mM의 L-아르기닌-그의 HCl; 및 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다. 놀랍게도, 항-LAG3/항-PD-1 공동-제제는 개별 항체 제제에 비해 양호한 안정성을 나타낸다. 제제는 재구성을 위해 동결건조될 수 있거나 또는 액체 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 재구성된 또는 액체 제제 (용액 제제)를 암 또는 감염의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 제제는 만성 감염을 치료하는데 사용된다. 또한, 암 또는 감염의 치료를 위한 의약의 제조에서 용액 또는 동결건조된 제제의 용도를 고려한다.
도 1: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 mHIAC에 의해 측정 시 컨테이너당 ≥10 μm인 입자의 개수.
도 2: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 mHIAC에 의해 측정 시 컨테이너당 ≥25 μm인 입자의 개수.
도 3: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 ELISA에 의해 측정 시 효능.
도 4: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 UP-SEC에 의한 단량체 (%).
도 5: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 UP-SEC에 의한 고분자량 종 (%).
도 6: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 HP-IEX에 의한 산성 변이체 (%).
도 7: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 HP-IEX에 의한 총 주요 피크 (%).
도 8: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 HP-IEX에 의한 염기성 변이체 (%).
도 9: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 CE-SDS 환원성에 의한 순도 중쇄 + 경쇄 (%).
도 10: -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서 보관된 항-LAG3 약물 생성물 샘플에 대해 CE-SDS 비환원성에 의한 순도 무손상 IgG (%).
도 11: 트립토판 표면 노출을 나타내는 항-LAG3 항체 Ab6의 상동성 모델. Trp102는 상동성 모델을 이용하여 계산되는 이용가능한 표면적 (85.25Å2)에 의해 측정되는 노출된 표면이다.
도 12: 10 mM의 히스티딘 완충제 pH 5.6 중에서 염 (50 mM의 NaCl)의 존재하에 및 L-아르기닌 히드로클로라이드 (40 mM)의 존재하에 항-LAG3 항체의 자가-상호작용 (KD)의 감소 및 콜로이드 안정성 (OD350) 및 상대적인 용해도 (%PEG중간점)의 개선.
도 13: pH 5.8에서 및 pH 6.0에서 10 mM의 히스티딘 완충제 중에서 항-LAG3 항체의 확산 상호작용 파라미터 (KD) 및 혼탁도 (50 mg/mL에서의 OD350)에 대한 L-아르기닌 히드로클로라이드의 효과.
도 14: 항-LAG3 항체 pH 범위 연구 (5.3 내지 6.4).
도 15: L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3 (10 mM L-히스티딘 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)의 확산 상호작용 파라미터 (kD).
도 16: L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)의 상대적인 용해도.
도 17: L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)의 하전된 종에서 % 변화.
도 18: 제2 비리알 계수 (B22) 측정을 이용하여 L-아르기닌, 염화나트륨 또는 그의 혼합물에 의해 10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3 제제의 최적화.
도 19: L-아르기닌, 염화나트륨 또는 그의 혼합물의 존재하에 10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3 제제의 콜로이드 안정성 (OD350).
도 20: L-아르기닌, 염화나트륨 또는 그의 혼합물의 존재하에 10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제 중에서 항-LAG3 (60 mg/mL)의 점도.
도 21: L-아르기닌, 염화나트륨 또는 그의 혼합물의 존재하에 10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제 중에서 항-LAG3 (25 mg/mL)의 삼투질 농도.
도 22: 40℃ 및 25℃ 보관 조건에서 시간에 따른 제제 (F1-F6)의 혼탁도 분석.
도 23: 40℃ 보관 조건에서 시간에 따른 제제 (F1-F6)의 혼합-모드 크로마토그래피 분석. 각각의 mAb (항-LAG3 및 항-PD-1)에 대한 단량체 백분율에서의 변화를 제제 F1-F6에 대해 시간에 따라 플롯한다.
도 24: 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드와 2.5% 내지 9% 안정화제의 존재하에 또는 70 mM 염화나트륨과 2.5% 내지 9.0% 안정화제의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제)의 고분자량 (HMW) 종, 단량체 및 저분자량 (LMW) 종에서의 % 변화.
도 25: 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드와 2.5% 내지 9% 안정화제의 존재하에 또는 70 mM 염화나트륨과 2.5% 내지 9.0% 안정화제의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제)의 하전된 종에서의 % 변화.
도 26: 70 mM의 L-아르기닌과 2.5% 내지 9% 안정화제의 존재하에 또는 70 mM 염화나트륨과 2.5% 내지 9.0% 안정화제의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8)의 Tm1, Tm2 및 T개시.
도 27: 진탕 스트레스를 가할 때 상이한 농도의 폴리소르베이트 80의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 콜로이드 안정성 (OD350).
도 28: 진탕 스트레스를 가할 때 상이한 농도의 폴리소르베이트 80의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8 완충제, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스)의 고분자량 (HMW) 종, 단량체 및 저분자량 (LMW) 종에서의 % 변화.
도 29: 진탕 스트레스를 가할 때 상이한 농도의 폴리소르베이트 80의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 하전된 종에서의 % 변화.
도 30: 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 단독에서 및 증가하는 농도의 L-메티오닌의 존재하에서 콜로이드 안정성 (OD350).
도 31: 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 단독에서 및 증가하는 농도의 L-메티오닌의 존재하에서 고분자량 (HMW) 종 및 단량체에서의 % 변화.
도 32: 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 단독에서 및 증가하는 농도의 L-메티오닌의 존재하에서 하전된 종에서의 % 변화.
도 33: 25 mg/mL의 항-LAG3 제제 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)의 단독에서 및 증가하는 농도의 L-메티오닌의 존재하에서 산화에서의 % 변화.
도 34: 10 mM 완충제의 존재하에, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 단독에서 및 상이한 안정화제의 존재하에서 200 mg/mL의 항-LAG3의 혼탁도 (OD350)에서의 % 변화.
도 35: 10 mM 완충제의 존재하에, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 단독에서 및 상이한 안정화제의 존재하에서 200 mg/mL의 항-LAG3의 고분자량 (HMW) 종, 단량체 및 저분자량 (LMW) 종에서의 % 변화.
도 36: 10 mM 완충제의 존재하에, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 단독에서 및 상이한 안정화제의 존재하에서 200 mg/mL의 항-LAG3의 하전된 종에서의 % 변화.
도 37: 40 내지 70 mM의 염 (염화나트륨) 및 20 내지 70 mM의 아미노산 단독 및 일부 조합의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3의 혼탁도 (OD350)에서의 % 변화.
도 38: 40 내지 70 mM의 염 (염화나트륨) 및 20 내지 70 mM의 아미노산 단독 및 일부 조합의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3의 고분자량 (HMW) 종, 단량체 및 저분자량 (LMW) 종에서의 % 변화.
도 39: 40 내지 70 mM의 염 (염화나트륨) 및 20 내지 70 mM의 아미노산 단독 및 일부 조합의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3의 하전된 종에서의 % 변화.
도 40: 40 내지 70 mM의 염 (염화나트륨) 및 20 내지 70 mM의 아미노산 단독 및 일부 조합의 존재하에 25 mg/mL의 항-LAG3의 수력학적 직경에서의 % 변화.
첨부된 청구항을 비롯하여 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 단어는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는다면 그들의 상응하는 복수 형태를 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 언급된 단백질 및 대상체는 또 다른 종이 아니라 인간 단백질 및 인간 대상체이다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는다면, "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 지칭한다. 항체 결합 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단의 생성물일 수 있다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개의 중쇄의 일부분 또는 단편을 함유하며, 따라서 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 사슬간 디술피드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.
F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 따라서 2개의 중쇄 사이에 사슬간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이에서 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')2 단편"은 항체의 펩신 절단 생성물일 수 있다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) 및 89-97 (CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인에서 잔기 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) 및 95-102 (CDRH3)) (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이들 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)) (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR 잔기로 본원에서 정의되는 초가변 영역 잔기 이외의 이들 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 상기 잔기 넘버링은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템과 관련이 있고, 첨부된 서열 목록에 있는 서열 넘버링에 반드시 상세하게 상응하지는 않는다.
"증식 활성"은 예를 들어 정상적인 세포 분열, 뿐만 아니라 암, 종양, 이형성증, 세포 형질전환, 전이 및 혈관신생을 촉진시키거나, 그에 필요하거나 또는 그와 특이적으로 관련이 있는 활성을 포괄한다.
용어 "암", "종양", "암성" 및 "악성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기재한다. 암의 예에는 암종, 예컨대 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더욱 특별한 예에는 편평상피암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 호지킨(Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대 간 암종 및 간세포암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 골수종 (예컨대, 다발성 골수종), 침샘 암종, 신장암, 예컨대 신장 세포 암종 및 윌름스(Wilms) 종양, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
암성 세포가 성장하고 번식함에 따라, 이들은 암성 조직의 덩어리, 즉, 종양을 형성하고, 이는 정상적인 인접한 조직에 침범하여 이를 파괴시킨다. 악성 종양은 암이다. 악성 종양이 일반적으로 제거될 수 있지만, 이들은 다시 성장할 수 있다. 악성 종양으로부터의 세포는 근처 조직 및 장기에 침범하여 그를 손상시킬 수 있다. 또한, 암 세포가 악성 종양으로부터 벗어나서 혈류 또는 림프계로 들어갈 수 있고, 이는 암 세포가 원발성 종양 (즉, 원래의 암)으로부터 전파되어 다른 장기에서 새로운 종양을 형성하는 방식이다. 신체에서 암의 전파는 전이로 불린다 (What You Need to Know About Cancer- an Overview, NIH Publication No. 00-1566; posted Sept. 26, 2000, updated Sept. 16, 2002 (2002)).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고형 종양"은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 성장 또는 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성 (암성이 아님) 또는 악성 (암성)일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 그를 형성하는 세포의 유형으로 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종 및 림프종이다. 백혈병 (혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다 (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암종"은 신체의 표면을 덮고 호르몬을 생성하며 샘을 구성하는 세포인 상피 세포의 암을 지칭한다. 암종의 예는 피부, 폐, 결장, 위, 유방, 전립선 및 갑상선의 암이다.
제약 조성물 정의
본원에서 사용된 바와 같이, "수성" 제약 조성물은 제약학적 사용에 적합한 조성물이며, 수성 담체는 주사용 멸균수이다. 제약학적 사용에 적합한 조성물은 멸균성, 균질성 및/또는 등장성일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 인간 대상체에게 비경구 투여하기에 적합하다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 정맥내 및/또는 피하 투여에 적합하다.
용어 "약"은 물질 또는 조성물의 양 (예를 들어, mM 또는 M), 제제 성분의 백분율 (v/v 또는 w/v), 용액/제제의 pH, 또는 방법에서 단계를 특징화하는 파라미터의 값 등을 수식할 때, 예를 들어 물질 또는 조성물의 제조, 특징화 및/또는 사용과 관련된 전형적인 측정, 취급 및 샘플링 절차를 통해; 이들 절차에서 기계적 오차를 통해; 조성물을 제조 또는 사용하는데 또는 절차를 수행하는데 사용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도에서의 차이 등을 통해 발행할 수 있는 수치적인 양에서의 변이를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, "약"은 ± 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10%의 변이를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "x% (w/v)"는 x g/100 ml와 동등하다 (예를 들어, 5% w/v는 50 mg/ml이다).
용어 "완충제"는 동결건조 이전에 및/또는 재구성 이후에 액체 제제에서 허용되는 범위의 용액 pH를 유지시키는 것들을 포괄하고, 숙시네이트 (나트륨 또는 칼륨), 히스티딘, 아세테이트, 포스페이트 (나트륨 또는 칼륨), 트리스(Tris) (트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄), 디에탄올아민, 시트레이트 (나트륨) 등이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "공동-제제화된" 또는 "공동-제제" 또는 "공동제제" 또는 "공동제제화된"은, 개별적으로 제제화되어 보관된 다음, 투여하기 전에 혼합되거나 별도로 투여되기 보다는, 함께 제제화되고 단일 바이알 또는 용기 (예를 들어, 주사 기기)에서 조합된 생성물로 보관되는 적어도 2가지 상이한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 한 실시양태에서, 공동-제제는 2가지 상이한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 함유한다.
"글리콜"은 2개의 히드록실 기를 갖는 알킬을 지칭한다.
"당 알콜"은 당으로부터 유래된 폴리올을 지칭하고, 일반식 HOCH2(CHOH)nCH2OH (n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)를 갖는다. 예로는 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨, 크실리톨 및 글리세롤이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "폴리올"에는 글리콜 및 당 알콜이 포함된다.
용어 "동결건조," "동결건조된" 및 "냉동건조된"은 건조시키고자 하는 물질을 먼저 냉동시킨 다음, 진공 환경에서 승화에 의해 얼음 및 냉동된 용매를 제거하는 공정을 지칭한다. 부형제는 보관시 동결건조된 생성물의 안정성을 개선시키기 위해 동결건조되기 이전의 제제에 포함될 수 있다.
"비환원성 당"은 유리 알데히드 기 또는 유리 케톤 기를 함유하지 않거나 또는 이를 함유하도록 전환될 수 없기 때문에 환원제로서 작용할 수 없는 당이다. 비환원성 당의 예에는 이당류, 예컨대 수크로스 및 트레할로스가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분이 효과적이도록 하는 형태를 갖고, 제제가 투여되는 대상체에게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는" 부형제 (비히클, 첨가제)는 사용되는 활성 성분의 효과적인 용량을 제공하기 위해 대상체 포유류에게 합리적으로 투여될 수 있는 것들이다.
"재구성 시간"은 동결건조된 제제를 용액에 의해 재수화시켜 입자-무함유의 투명해진 용액을 형성하는데 필요한 시간이다.
"안정한" 제제는 그 안에 있는 단백질이 보관시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 보유하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하고, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)에서 검토되었다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 안정한 제제는 냉장된 온도 (2-8℃)에서 적어도 12 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 냉장된 온도 (2-8℃)에서 적어도 18 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 3 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 6 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 12 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또 다른 실시양태에서, 안정한 제제는 실온 (23-27℃)에서 적어도 18 개월 동안 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 항체 제제의 안정성에 대한 기준은 다음과 같다. 전형적으로, SEC-HPLC에 의해 측정 시 10%, 바람직하게는 5% 이하의 항체 단량체가 분해된다. 전형적으로, 제제는 시각적 분석에 의해 무색이거나 또는 투명 내지는 약간 유백색이다. 전형적으로, 제제의 농도, pH 및 삼투질 농도는 +/-10% 이하의 변화를 갖는다. 효능은 전형적으로 대조군 또는 기준의 60-140%, 바람직하게는 80-120% 이내이다. 전형적으로, 예를 들어 HP-SEC에 의해 측정 시 10%, 바람직하게는 5% 이하의 항체 클립핑(clipping), 즉, % 저분자량 종이 관찰된다. 전형적으로, 예를 들어 HP-SEC에 의해 측정 시 10%, 바람직하게는 5% 이하의 항체 응집, 즉, % 고분자량 종이 형성된다.
"계면활성제"는 천연에서 양친매성인 표면 활성제이다.
항체가 색상 및/또는 투명성의 시각적 검사시에 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 동적 광 산란에 의해 측정 시에 응집, 침전 및/또는 변성의 유의한 증가를 나타내지 않는 경우에, 이는 제약 제제에서 "그의 물리적 안정성을 보유한다". 단백질 형태의 변화는 단백질 3차 구조를 측정하는 형광 분광학에 의해, 및 단백질 2차 구조를 측정하는 FTIR 분광학에 의해 평가할 수 있다.
항체가 유의한 화학적 변경을 나타내지 않는다면, 이는 제약 제제에서 "그의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 단백질 화학 구조를 종종 변경시키는 분해 과정에는 가수분해 또는 클립핑 (크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법에 의해 평가됨), 산화 (질량 분광학과 조합된 펩티드 맵핑 또는 MALDI/TOF/MS와 같은 방법에 의해 평가됨), 탈아미드화 (이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 전기영동, 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법에 의해 측정됨), 및 이성질체화 (이소아스파르트산 함량, 펩티드 맵핑 등을 측정함으로써 평가됨)가 포함된다.
주어진 기간에서 항체의 생물학적 활성이 제제가 제조된 시점에서 나타낸 생물학적 활성의 예정된 범위 내에 있는 경우에, 항체는 제약 제제에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다". 항체의 생물학적 활성은 예를 들어 항원 결합 검정에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 12 개월 이내에 안정한 항체 제제의 생물학적 활성은 기준의 60-140% 이내이다.
용어 "등장성"은 관심 제제가 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 270-328 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 약간 저장성인 압력은 250-269이고, 약간 고장성인 압력은 328-350 mOsm이다. 삼투압은 예를 들어 증기압 또는 빙결식 삼투압계를 이용하여 측정될 수 있다.
"재구성된" 제제는 단백질이 재구성된 제제에서 분산되도록 동결건조된 단백질 제제를 희석제 중에 용해시킴으로써 제조된 것이다. 재구성된 제제는 투여 (예를 들어, 비경구 투여)에 적합하고, 임의적으로 피하 투여에 적합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 농도는 제약 제제의 제조에서 이러한 농도와 일반적으로 관련이 있는 범위 내에서 근사치로서 해석되어야 한다. 구체적으로, 농도가 정확할 필요는 없지만, GMP 조건하에 제조된 약물에 대해 전형적으로 예상되는 허용오차 내에서 명시된 농도와 달라질 수 있다. 유사하게, pH 값은 GMP 조건하에 제조되고 전형적인 보관 조건하에 보관된 약물에 대해 전형적으로 예상되는 허용오차 내에 있는 근사치이다.
"pH 5.0 내지 6.0의 pH"와 같이 pH 값의 범위가 인용되는 경우, 상기 범위는 인용된 값을 포함하는 것으로 의도된다. pH는 전형적으로 25℃에서 표준 유리구 pH 측정기를 사용하여 측정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "pH X의 히스티딘 완충제"를 포함하는 용액은 pH X를 갖고 히스티딘 완충제를 포함하는 용액을 지칭하고, 즉, pH는 용액의 pH를 지칭하는 것으로 의도된다.
분석 방법
생성물 안정성을 평가하기에 적합한 분석 방법에는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 동적 광 산란 시험 (DLS), 시차 주사 열량측정법 (DSC), iso-asp 정량화, 효능, 350 nm에서의 UV, UV 분광학 및 FTIR이 포함된다. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986))는 생성물 중에서 단량체 백분율을 측정하고, 가용성 응집물의 양에 대한 정보를 제공한다. DSC (Pharm. Res., 15:200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982))는 단백질 변성 온도 및 유리 전이 온도에 대한 정보를 제공한다. DLS (American Lab., November (1991))는 평균 확산 계수를 측정하고, 가용성 및 불용성 응집물의 양에 대한 정보를 제공한다. 340 nm에서의 UV는 340 nm에서 산란된 광 강도를 측정하고, 가용성 및 불용성 응집물의 양에 대한 정보를 제공한다. UV 분광학은 278 nm에서의 흡광도를 측정하고, 단백질 농도에 대한 정보를 제공한다. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45:231 (1998); Pharm. Res., 12:1250 (1995); J. Pharm. Scien., 85:1290 (1996); J. Pharm. Scien., 87:1069 (1998))은 아미드 원 영역에서 IR 스펙트럼을 측정하고, 단백질 2차 구조에 대한 정보를 제공한다.
샘플 중 iso-asp 함량은 등량 이소아스파르테이트 검출 시스템 (Isoquant Isoaspartate Detection System, 프로메가(Promega))을 이용하여 측정된다. 키트는 표적 단백질에서 이소아스파르트산 잔기의 존재를 특이적으로 검출하기 위해 효소 단백질 이소아스파르틸 메틸트랜스퍼라제 (PIMT)를 사용한다. PIMT는 공정에서 S-아데노실-L-메티오닌으로부터의 메틸 기를 알파-카르복실 위치의 이소아스파르트산으로 전달하는 것을 촉매하여, S-아데노실-L-호모시스테인 (SAH)을 생성한다. 이는 비교적 작은 분자이며, 일반적으로 키트에 제공된 SAH HPLC 표준을 이용하여 역상 HPLC에 의해 단리되고 정량화될 수 있다.
항체의 효능 또는 생체동일성은 그의 항원에 결합하는 그의 능력에 의해 측정될 수 있다. 항체와 그의 항원의 특이적 결합은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 면역검정, 예컨대 ELISA (효소-결합된 면역흡착 검정)에 의해 정량화될 수 있다.
항-LAG3 항체
CDR 잔기는 상이한 항체들 사이에서 고도로 가변성이고, 인간 생식계열 서열로부터 (전체 인간 항체의 경우) 또는 비-인간 (예를 들어, 설치류) 생식계열 서열로부터 기원할 수 있다. 프레임워크 영역 또한 항체마다 유의하게 상이할 수 있다. 불변 영역은 선택된 항체가 람다 (λ) 또는 카파 (κ) 경쇄를 갖는지 여부에 따라 및 항체의 부류 (또는 이소타입) (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 및 하위 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 따라 달라질 것이다.
하기 예시된 LAG3 항체는 비-인간 (이 경우에는 마우스) 생식계열 서열 또는 인간 생식계열 서열로부터 유래된 CDR 서열을 갖는다. 생식계열 서열은 체세포 돌연변이 유래된 변화를 제외하고 항체의 CDR 서열이 유래된 서열 레파토리를 포함하고, 결과적으로 마우스 생식계열에서 출발하여 수득된 CDR은 인간 생식계열로부터 출발한 것과 전체적으로 상이할 것으로 예상된다. 인간 생식계열 서열의 사용은 종종 인간 생식계열로부터의 CDR 서열이 다른 종으로부터 유래된 것에 비해 인간에서 덜 면역원성일 것이라는 근거에 따라 정당화되고, 이는 CDR이 그들의 기원 종에 따라 전체적으로 달라질 것이라는 근본적인 신념을 반영한다. CDR 다양성의 증가가 친화도와 같이 원하는 성질을 갖는 항체를 발견할 가능성을 증가시키지만, 이는 생성된 항체의 안정한 용액 제제를 개발하는데 있어서의 어려움을 추가로 확대시킨다.
동일한 항원에 결합하는 항체조차도 서열이 매우 상이할 수 있고, 항원을 완전히 분리시키기 위해 항체에 비해 서열이 더욱 밀접하게 관련있을 필요는 없다. 낮은 서열 유사성을 기반으로 하여, 항체의 화학적 성질, 따라서 분해에 대한 그들의 민감성은 그들의 공통된 표적에도 불구하고 유사한 것으로 간주될 수 없다.
상기 논의된 바와 같이, 항체는 크고 매우 복잡한 폴리펩티드 복합체이며, 용액 중에서 다양한 형태의 분해 및 불안정성을 겪는다. 항체의 서열의 다양성, 따라서 구조는 광범위한 화학적 성질을 발생시킨다. 항원 결합 특이성에서의 명백한 서열-특이적인 차이 외에도, 항체는 다양한 분해 경로, 응집 및 침전에 대해 다양한 민감성을 나타낸다. 아미노산 측쇄는 반응성 기, 예컨대 카르복시- (D,E), 아미노- (K), 아미드- (N,Q), 히드록실- (S,T,Y), 술프히드릴- (C), 티오에테르- (M) 기, 뿐만 아니라 히스티딘, 페닐알라닌 및 프롤린 잔기 상의 잠재적으로 화학적 반응성 부위의 존재 또는 부재에서 차이가 있다. 항원 결합 상호작용에 직접적으로 관여하는 아미노산 측쇄는 측쇄 변형에 의한 불활성화에 대한 명백한 후보이지만, 다른 위치에서의 분해 또한 CDR의 입체적 배향 (예를 들어, 프레임워크 잔기에서의 변화), 이펙터 기능 (예를 들어, Fc 영역에서의 변화 - 예를 들어, Liu et al. (2008) Biochemistry 47:5088 참고) 또는 자가-회합/응집과 같은 인자에 영향을 미칠 수 있다.
항체는 임의의 수많은 잠재적인 분해 경로를 겪는다. 항체에서, 특히 CDR에서 메티오닌 잔기의 산화는 항원 결합을 방해하는 경우에 문제가 될 수 있다. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731; Lam et al. (1997)　J. Pharm. Sci. 86:1250. 다른 잠재적인 분해 경로에는 아스파라긴 탈아미드화 (Harris et al. (2001) Chromatogr., B　752:233; Vlasak et al. (2009) Anal. Biochem. 392:145) 트립토판 산화 (Wei et al. (2007) Anal. Chem. 79:2797), 시스테이닐화 (Banks et al. (2008) J. Pharm. Sci. 97:775), 당화 (Brady et al. (2007) Anal. Chem. 79:9403), 피로글루타메이트 형성 (Yu et al. (2006) J. Pharm. Biomed. Anal. 42:455), 디술피드 셔플링 (Liu et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:29266), 및 가수분해 (Davagnino et al. (1995) J. Immunol. Methods 185:177)가 포함된다. Ionescu & Vlasak (2010) Anal. Chem. 82:3198에서 논의되었다. Liu et al. (2008) J. Pharm. Sci. 97:2426 또한 참고한다. 일부 잠재적인 분해 경로는 구체적인 아미노산 잔기의 존재 뿐만 아니라 주변 서열에 의존한다. 탈아미드화 및 이소아스파르테이트 형성은 N 또는 D 잔기 이후의 (C-말단으로) 펩티드 결합의 자발적인 분자내 재배열을 일으킬 수 있고, N-G 및 D-G 서열이 특히 민감하다. Reissner & Aswad (2003) CMLS Cell. Mol. Life Sci. 60:1281.
항체는 또한 보관하는 동안에 서열-의존적인 비효소적 단편화를 겪는다. Vlasak & Ionescu (2011) mAbs 3:253. 반응성 측쇄, 예컨대 D, G, S, T, C 또는 N의 존재는 폴리펩티드 백본을 절단하는 분자내 절단 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 서열 특이적 가수분해 반응은 전형적으로 pH 의존적이다. Id. 예를 들어 CDR이 매우 많은 소수성 잔기를 포함할 때 항체는 또한 서열-의존적인 응집을 겪을 수 있다. Perchiacca et al. (2012) Prot. Eng. Des. Selection 25:591. 응집은 피하 투여를 위해 고농도로 제제화될 필요가 있는 항체에서 특히 문제가 되고, 심지어 일부는 용해도를 증가시키기 위해 하전된 잔기를 첨가함으로써 항체 서열을 변형시켰다. Id.
항체에 의한 잠재적인 서열-특이적 안정성 문제의 다양성을 반영하면, 잠재적인 항체 제제 또한 다양하다. 항체의 서열 가변성은 생성된 항체의 화학적 이종성을 유도하고, 이는 광범위한 잠재적인 분해 경로를 생성한다. 제제는 예를 들어 항체 농도, 완충제, pH, 계면활성제의 존재 또는 부재, 장성 조절제 (이온성 또는 비이온성)의 존재 또는 부재, 분자 군집화제의 존재 또는 부재에서 차이가 있을 수 있다. 상업적으로 입수가능한 치료 항체는 포스페이트 완충제 (예를 들어, 아달리무맙), 포스페이트/글리신 완충제 (예를 들어, 바실릭수맙), 트리스 완충제 (예를 들어, 이필리무맙), 히스티딘 (예를 들어, 우스테키누맙), 시트르산나트륨 (예를 들어, 리툭시맙); 및 pH 4.7 (예를 들어, 세르톨리주맙) 및 pH 5.2 (예를 들어, 아달리무맙)에서 pH 7.0-7.4 (예를 들어, 세툭시맙)까지 중에서 광범위한 용액 제제로 판매된다. 이들은 또한 임의적으로 이나트륨 에데테이트 (예를 들어, 알렘투주맙), 만니톨 (예를 들어, 이필리무맙), 소르비톨 (예를 들어, 골리무맙), 수크로스 (예를 들어, 우스테키누맙), 염화나트륨 (예를 들어, 리툭시맙), 염화칼륨 (예를 들어, 알렘투주맙) 및 트레할로스 (예를 들어, 라니비주맙)를 함유하고; 모두 0.001% (예를 들어, 아브식스맙) 내지 0.1% (예를 들어, 아달리무맙) 범위의 폴리소르베이트-80이 있는 및 없는 제제로 입수가능하다.
인간화 항-LAG3 및 항-PD-1 항체의 생물학적 활성
본 발명의 제제는 재구성될 때 또는 액체 제제에서 생물학적으로 활성인 항-LAG3 항체 및 그의 단편 및 임의적으로 항-PD1 항체 및 그의 단편을 포함한다.
예시적인 항-LAG3 항체가 하기에 제공된다 (WO 2016/028672에 개시되고, 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨):
ㆍ Ab1: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 35); 및
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; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
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ㆍ Ab2: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 35); 및
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Figure pct00008
(서열식별번호: 46 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
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CDR-L2: GASNLES (서열식별번호: 40);
CDR-L3: QQSTEDPRT (서열식별번호: 41);
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CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 44)
ㆍ Ab3: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
Figure pct00009
(서열식별번호: 35)
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(서열식별번호: 48); 또는
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(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
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(서열식별번호: 49 (CDR은 밑줄 표시함))
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CDR-L2: GASNLES (서열식별번호: 40);
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ㆍ Ab4: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 35); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
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(서열식별번호: 52 (CDR은 밑줄 표시함))
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ㆍ Ab5: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 35); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 54); 또는
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(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00020
(서열식별번호: 55 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
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CDR-H2: DINPNNGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 56); 및
CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 44)
ㆍ Ab6: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
Figure pct00021
(서열식별번호: 35); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린:
Figure pct00022
(서열식별번호: 57); 또는
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(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00024
(서열식별번호: 58 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
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CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 44)
ㆍ Ab7: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
Figure pct00025
(서열식별번호: 35); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 60); 또는
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(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
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(서열식별번호: 61 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (서열식별번호: 39);
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ㆍ Ab8: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
Figure pct00029
(서열식별번호: 35); 및
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(서열식별번호: 63); 또는
하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00031
(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00032
(서열식별번호: 64 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
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ㆍ Ab9: 하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린:
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(서열식별번호: 35); 및
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(서열식별번호: 66); 또는
하기 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00035
(서열식별번호: 37 (CDR은 밑줄 표시함)); 및
하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인:
Figure pct00036
(서열식별번호: 67 (CDR은 밑줄 표시함))
; 또는 하기 CDR을 포함하는 것:
CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (서열식별번호: 39);
CDR-L2: GASNLES (서열식별번호: 40);
CDR-L3: QQSTEDPRT (서열식별번호: 41);
CDR-H1: DYNVD (서열식별번호: 42);
CDR-H2: DINPNGGGTIYAQKFQE (서열식별번호: 68); 및
CDR-H3: NYRWFGAMDH (서열식별번호: 44)
본 발명은 서열식별번호: 35의 서열을 갖는 2개의 동일한 경쇄 및 서열식별번호: 36, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63 또는 66의 서열을 갖는 2개의 동일한 중쇄를 포함하는 항-LAG3 항체의 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 35의 서열을 갖는 2개의 동일한 경쇄 및 서열식별번호: 57의 서열을 갖는 2개의 동일한 중쇄를 포함하는 항-LAG3 항체의 제제를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 38, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 또는 67의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 39의 경쇄 가변 영역 CDRL1 서열, 서열식별번호: 40의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 41의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDRH1 서열, 서열식별번호: 43, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65 또는 68의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 44의 CDRH3 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 39의 경쇄 가변 영역 CDRL1 서열, 서열식별번호: 40의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 41의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 42의 중쇄 가변 영역 CDRH1 서열, 서열식별번호: 59의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 44의 CDRH3 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다.
상기 제제에 포함될 수 있는 다른 항-LAG3 항체에는 WO2014008218에 개시된 BMS-986016; IMP731 및 IMP701이 포함된다. 따라서, 본 발명은 서열식별번호: 69의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 70의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDRL1 서열, 서열식별번호: 72의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 73의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 74의 중쇄 가변 영역 CDRH1 서열, 서열식별번호: 75의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 76의 CDRH3 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다.
상기 제제는 하기 예시된 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편을 추가로 포함할 수 있다.
표 1. 예시적인 PD-1 항체 서열
Figure pct00037
Figure pct00038
표 2. 본 발명의 제제, 방법 및 용도에 유용한 추가의 PD-1 항체 및 항원 결합 단편.
Figure pct00039
본 발명의 또 다른 측면에서, 제제는 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편; 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 항-LAG3 항체; 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 10의 중쇄 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 39의 경쇄 CDRL1 서열, 서열식별번호: 40의 CDRL2 서열 및 서열식별번호: 41의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 42의 중쇄 CDRH1 서열, 서열식별번호: 59의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 44의 CDRH3 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 서열식별번호: 1의 경쇄 CDRL1 서열, 서열식별번호: 2의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 3의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 6의 중쇄 CDRH1 서열, 서열식별번호: 7의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 8의 CDRH3 서열을 포함하는 항-PD-1 항체의 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 제제에서 항-LAG3 항체 대 항-PD-1 항체의 비는 1:1, 1:2 또는 1:3이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제제에서 항-LAG3 항체 대 항-PD-1 항체의 몰비는 1:1, 2:1, 3:1 또는 3.5:1이다.
본 발명의 추가의 측면에서, 제제는 서열식별번호: 69의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 70의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편 및 서열식별번호: 14의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 19의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 71의 경쇄 가변 영역 CDRL1 서열, 서열식별번호: 72의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 73의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 74의 중쇄 가변 영역 CDRH1 서열, 서열식별번호: 75의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 76의 CDRH3 서열을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편, 및 서열식별번호: 11의 경쇄 가변 영역 CDRL1 서열, 서열식별번호: 12의 CDRL2 서열, 서열식별번호: 13의 CDRL3 서열, 및 서열식별번호: 16의 중쇄 가변 영역 CDRH1 서열, 서열식별번호: 17의 CDRH2 서열 및 서열식별번호: 18의 CDRH3 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 제제를 제공한다.
상기 제제의 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:4 또는 서열식별번호:4의 변이체를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:9 또는 서열식별번호:9의 변이체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:14 또는 서열식별번호:14의 변이체를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:19 또는 서열식별번호:19의 변이체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:27 또는 서열식별번호:27의 변이체를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:28 또는 서열식별번호:28의 변이체, 서열식별번호:29 또는 서열식별번호:29의 변이체, 또는 서열식별번호:30 또는 서열식별번호:30의 변이체를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 변이체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 기준 서열과 동일하다. 일부 실시양태에서, 치환은 프레임워크 영역에서 (즉, CDR의 외부에서) 일어난다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제제는 상기 기재된 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 하나와 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 서열 상동성을 갖는 VL 도메인 및/또는 VH 도메인을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, PD-1 또는 LAG3에 대해 특이적인 결합을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제제의 항체 또는 항원 결합 단편은 1, 2, 3, 4 또는 5개까지 또는 그보다 많은 아미노산 치환을 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함하고, PD-1 또는 LAG3에 대해 특이적인 결합을 나타낸다.
본 발명의 실시양태에서, 항체는 서열식별번호:5에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄 및 서열식별번호:10에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 대안적인 실시양태에서, 항체는 서열식별번호:15에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄 및 서열식별번호:20에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 추가의 실시양태에서, 항체는 서열식별번호:32에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄 및 서열식별번호:31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 추가의 실시양태에서, 항체는 서열식별번호:33에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄 및 서열식별번호:31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 항체는 서열식별번호:34에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 경쇄 및 서열식별번호:31에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 중쇄를 포함하는 항-PD-1 항체이다. 본 발명의 일부 제제에서, 항체는 펨브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙 바이오시밀러이다. 본 발명의 일부 제제에서, 항체는 니볼루맙 또는 니볼루맙 바이오시밀러이다.
보통, 본 발명의 항-PD-1 또는 항-LAG3 항체 및 항원 결합 단편의 아미노산 서열 변이체는 기준 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열 (예를 들어, 중쇄, 경쇄, VH, VL, 프레임워크 또는 인간화 서열)과 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 본원에서 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬시키고, 필요에 따라 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입시킨 후에, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 항-PD-1 또는 항-LAG3 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 항체 서열로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 고려되어야 한다.
제제
본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 제제는 항체 응집물 (고분자량 종) 및 미립자의 형성을 최소화하거나, 콜로이드 안정성을 개선시키거나, 단편화 (저분자량 종)를 최소화시키거나, 또는 항체가 시간에 걸쳐 그의 생물학적 활성을 유지함을 보장한다. 한 측면에서, 제제는 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10-1000 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함한다. 또 다른 측면에서, 제제는 약 10-250 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3, 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제는 25-250 mM의 총 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제는 40-250 mM의 총 농도를 갖는다.
한 측면에서, 부형제는 15-250 mM 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 측면에서, 부형제는 25-250 mM 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 40-150 mM 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 40-100 mM 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 70 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 70-150 mM 농도의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 아르기닌 (L 또는 D 형태)의 제약상 허용되는 염의 예에는 L-아르기닌-히드로클로라이드 및 L-아르기닌 숙시네이트가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 상기 실시양태의 다른 측면에서, 제제는 비이온성 계면활성제, 당 또는 폴리올, 또는 글루타민, 글리신, 프롤린 또는 메티오닌을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 부형제는 25-250 mM의 총 농도를 갖는 NaCl 및 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 70-100 mM의 총 농도를 갖는 NaCl 및 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합이다. 한 실시양태에서, NaCl 대 아르기닌 농도 비는 1:1이다. 또 다른 실시양태에서, NaCl 농도는 35 mM이고, 아르기닌 농도는 35 mM이다. 또 다른 실시양태에서, NaCl 농도는 50 mM이고, 아르기닌 농도는 50 mM이다.
추가의 측면에서, 부형제는 약 40-150 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 40-100 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 70-130 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 70-100 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 70 mM의 NaCl이다. 상기 실시양태의 다른 측면에서, 제제는 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다.
추가의 측면에서, 부형제는 약 25-200 mM의 L-히스티딘이다. 추가의 실시양태에서, L-히스티딘은 약 50-200 mM을 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, L-히스티딘은 약 40-100 mM을 갖는다.
추가의 측면에서, 부형제는 약 25-200 mM의 L-글루타민, L-글리신, L-프롤린 또는 L-메티오닌, 또는 이들의 조합이다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 50-200 mM을 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 40-100 mM을 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 70 mM을 갖는다.
한 실시양태에서, 부형제는 약 25-200 mM의 L-글루타민, L-글리신, L-아스파르테이트, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 약 20-50 mM을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 20 mM을 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 40-100 mM을 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, 부형제는 약 70 mM을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 20 mM의 L-아스파르테이트 및 50 mM의 L-글리신이다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 20 mM의 L-글루타민 및 50 mM의 L-글리신이다.
한 실시양태에서, 조성물은 중성 또는 약간 산성 pH (pH 5-8)를 갖는 완충제 중의 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편, 및 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약상 허용되는 제제이다. 한 실시양태에서, pH 약 5.5-6.5의 완충제가 상기 조성물에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, pH 약 5.5-6.0의 완충제가 상기 조성물에서 사용된다. 추가의 실시양태에서, pH 약 5.0-6.0의 완충제가 상기 조성물에서 사용된다. 완충제는 5-1000 mM의 농도를 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 5-150 mM의 농도를 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, 완충제는 5-300 mM의 농도를 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, 완충제는 약 1-300 mM의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 1-30 mM의 농도를 갖는다. 더욱 추가의 실시양태에서, 완충제는 5-30 mM의 농도를 가질 수 있다. 더욱 추가의 실시양태에서, 완충제는 5-20 mM의 농도를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 완충제는 히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트이다. 바람직한 완충제는 약 10 mM의 히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트를 함유한다.
한 실시양태에서, 제제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제, pH 약 5-8의 히스티딘 완충제 또는 아세테이트 완충제, 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의적으로 메티오닌 (L 또는 D 형태), EDTA, DTPA, 트립토판 (L 또는 D 형태) 또는 피리독신을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제, 50-500 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-8, 10-1000 mM의 NaCl, KCl 및 LiCl로부터 선택된 일가 양이온의 염 또는 CaCl2, MgCl2, ZnCl2, FeCl2 및 FeCl3으로부터 선택된 다가 양이온의 염, 임의적으로 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의적으로 메티오닌 (D 또는 L 형태), EDTA, DTPA, 트립토판 및 피리독신을 포함한다.
제제는 1-100 uM, 1-30 uM, 1-20 uM, 10 uM-30 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함할 수 있다. 제제는 또한 1-30 mM의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 또한 1-20 mM의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 제제는 또한 5-15 mM의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 제제는 또한 5-10 mM의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 제제는 또한 10 mM 또는 적어도 10 mM의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 때때로 질소 오버레이 (덮개화, 예를 들어 질소 오버레이시에 단지 5% 또는 10%의 잔류 O2)를 생성 단계 동안에 및/또는 바이알 밀폐 이전에 사용하여, 항체를 산화에 대해 안정화시킨다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 제제는 당, 폴리올 또는 비이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 당은 글루코스, 수크로스, 트레할로스 및 락토스 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 당은 이당류, 예컨대 수크로스, 트레할로스 및 말토스이다. 한 실시양태에서, 당은 비환원성 당이다. 또 다른 실시양태에서, 당은 비환원성 이당류, 예컨대 수크로스 또는 트레할로스, 또는 이들의 조합이다. 한 실시양태에서, 당은 10-200 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 당은 30-120 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 당은 50-90 mg/ml의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 폴리올은 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리올은 당 알콜이다. 한 실시양태에서, 당 및 폴리올은 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 폴리올은 글리콜이다. 한 실시양태에서, 글리콜은 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 폴리올은 10-200 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 폴리올은 10-50 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 폴리올은 5-30 mg/ml의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 제제는 약 10-250 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 20-200 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제제는 약 50-80 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 50-90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 제제는 약 70-80 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 제제는 적어도 약 50 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 20-200 mg/ml의 소르비톨, PEG400 또는 글리세롤을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제제는 약 20-50 mg/ml의 소르비톨, PEG400 또는 글리세롤을 포함한다.
한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 또 다른 실시양태에서, 계면활성제는 트윈(Tween)80® (폴리소르베이트 80), 트윈20® (폴리소르베이트 20), 플루로닉(Pluronic)F88®, 플루오로닉 F-127®, 플루로닉F68®, 트리톤(Triton) X-100®으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이고, 당은 수크로스 또는 트레할로스이다. 폴리소르베이트 80 또는 20 계면활성제는 제제 중에서 약 0.005 내지 약 1 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 폴리소르베이트 80 또는 20 계면활성제는 제제 중에서 약 0.05 내지 약 1 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 폴리소르베이트 80 또는 20 계면활성제는 제제 중에서 약 0.1 내지 약 0.5 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80 또는 20 계면활성제는 제제 중에서 약 적어도 0.005 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 폴리소르베이트 80 또는 20 계면활성제는 또한 제제 중에서 약 적어도 0.1 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다. 폴리소르베이트 80 계면활성제는 제제 중에서 약 0.2 mg/ml의 양으로 존재할 수 있다.
상기 제제의 다른 측면에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%이다. 상기 제제의 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 98%이다. 상기 제제의 추가의 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 99%이다. 상기 제제의 추가의 실시양태에서, 25℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 98%이다.
상기 제제의 다른 측면에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 중쇄 및 경쇄는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%이다. 한 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 중쇄 및 경쇄는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%이다. 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 중쇄 및 경쇄는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 97%이다.
상기 제제의 다른 측면에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 무손상 IgG는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%이다. 한 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 무손상 IgG는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%이다. 또 다른 실시양태에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 무손상 IgG는 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 97%이다.
본 발명의 다른 측면에서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 산성 변이체는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 15% 미만이다.
제제의 상기 실시양태는 또한 이전 섹션에서 논의된 바와 같이 항-LAG3 항체 및 항-PD1 항체의 공동-제제에 적용될 수 있다.
하기 실시양태 또한 본 발명의 측면이다:
1. 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제, pH 약 5-8의 히스티딘 또는 아세테이트 완충제, 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 임의적으로 메티오닌, EDTA, DTPA, 트립토판 및 피리독신을 포함하는 액체 제제.
2. 실시양태 1에 있어서, 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 약 10-250 mg/mL의 수크로스; 약 0.005-2 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-300 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-8; 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-100 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
3. 실시양태 1에 있어서, 약 10-100 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-200 mg/mL의 수크로스; 약 0.1-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-150 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.0 - pH 6.5; 약 30-1000 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-30 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
4. 실시양태 1에 있어서, 약 10-100 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50-80 mg/mL의 수크로스; 약 0.2-0.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 10-50 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.0 - pH 6.0; 약 40-150 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-30 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
5. 실시양태 1에 있어서, 약 10-50 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2-0.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 10 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.6 - pH 6.2; 약 40-100 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
6. 실시양태 1에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.8-6.0; 약 70 mM의 아르기닌 또는 아르기닌-HCl을 포함하는 제제.
7. 재구성 이후에 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제, pH 약 5-8의 히스티딘 또는 아세테이트 완충제, 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 메티오닌, EDTA, DTPA, 트립토판 및 피리독신을 포함하는 동결건조된 제제.
8. 실시양태 7에 있어서, 재구성 이후에 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 약 10-250 mg/mL의 수크로스; 약 0.005-2 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-1000 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-8; 약 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-100 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
9. 실시양태 7에 있어서, 재구성 이후에 약 10-100 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-200 mg/mL의 수크로스; 약 0.1-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-150 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.0 - pH 6.5; 적어도 30 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 임의적으로 약 1-100 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
10. 실시양태 7에 있어서, 재구성 이후에 약 10-50 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50-80 mg/mL의 수크로스; 약 0.2-0.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 10-50 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.0 - pH 6.0; 약 40-150 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-30 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
11. 실시양태 7에 있어서, 재구성 이후에 약 10-50 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2-0.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 10 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.6 - pH 6.2; 및 약 40-100 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
12. 실시양태 7에 있어서, 재구성 이후에 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 히스티딘 완충제 약 pH 5.8-6.0; 및 약 70 mM의 아르기닌 또는 아르기닌-HCl을 포함하는 제제.
13. 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제; 약 50-500 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-8; 약 10-1000 mM의 NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 또는 FeCl2; 임의적으로 약 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 메티오닌, EDTA, DTPA, 트립토판 및 피리독신을 포함하는 액체 제제.
14. 실시양태 13에 있어서, 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제; 50-150 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-6.5; 약 30-100 mM의 NaCl 또는 KCl; 임의적으로 약 40-150 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 임의적으로 약 1-100 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
15. 재구성 이후에 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제; 약 50-300 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-8; 약 10-1000 mM의 NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 또는 FeCl2; 임의적으로 약 10-1000 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 메티오닌, EDTA, DTPA, 트립토판 및 피리독신을 포함하는 동결건조된 제제.
16. 실시양태 15에 있어서, 재구성 이후에 약 10-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당 또는 폴리올; 비이온성 계면활성제; 약 50-150 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5-6.5; 약 30-100 mM의 NaCl 또는 KCl; 임의적으로 약 40-150 mM의 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 임의적으로 약 1-100 uM의 DTPA 또는 EDTA를 포함하는 제제.
17. 실시양태 1, 7, 13, 15 또는 16에 있어서, 당이 수크로스 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
18. 실시양태 1, 7, 13, 15 또는 16에 있어서, 폴리올이 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
19. 실시양태 1, 7, 13, 15 또는 16에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
20. 실시양태 1, 7, 13, 15 또는 16에 있어서, 계면활성제가 트윈80®, 트윈20®, 플루로닉F88®, 플루오로닉 F-127®, 플루로닉F68®, 트리톤 X-100®으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
21. 실시양태 1, 7, 13, 15 또는 16에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이고, 상기 당이 수크로스 또는 트레할로스인 제제.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 적어도 -70℃ 미만으로 냉동된 것인 제제.
23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체가 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%인 제제.
24. 실시양태 1-23 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 중쇄 및 경쇄가 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%인 제제.
25. 실시양태 1-24 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 무손상 IgG가 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%인 제제.
26. 실시양태 1-25 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 산성 변이체가 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 15% 미만인 제제.
27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 38, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 또는 67의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인 제제.
28. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 있어서, 항-LAG3 항체가 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
29. 실시양태 1-28 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 항체를 추가로 포함하는 제제.
30. 실시양태 29에 있어서, 항-PD1 항체가 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
31. 실시양태 29에 있어서, 항-PD1 항체가 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
32. 실시양태 31에 있어서, 항-LAG3 항체 및 항-PD1 항체의 비가 1:1, 1:2 또는 1:3인 제제.
하기 실시양태 또한 본 발명의 측면이다:
1. 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10-1000 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함하는 제제.
2. 실시양태 1에 있어서, 약 10-250 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3, 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 25-250 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함하는 제제.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 부형제가 25-250 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.
4. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 부형제가 40-100 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.
5. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 부형제가 25-250 mM의 총 농도를 갖는 NaCl 및 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합인 제제.
6. 실시양태 5에 있어서, NaCl 대 L-아르기닌 농도 비가 1:1인 제제.
7. 실시양태 6에 있어서, NaCl 농도가 35 mM이고, L-아르기닌 농도가 35 mM인 제제.
8. 실시양태 6에 있어서, NaCl 농도가 50 mM이고, L-아르기닌 농도가 50 mM인 제제.
9. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 부형제가 약 40-150 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl인 제제.
10. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 부형제가 약 25-200 mM의 L-히스티딘인 제제.
11. 실시양태 10에 있어서, L-히스티딘이 약 40-100 mM을 갖는 것인 제제.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 완충제가 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트인 제제.
13. 실시양태 12에 있어서, 완충제가 약 1-300 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
14. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, 당, 폴리올 또는 비이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 제제.
15. 실시양태 14에 있어서, 당이 비환원성 이당류인 제제.
16. 실시양태 15에 있어서, 당이 트레할로스 또는 수크로스, 또는 이들의 조합인 제제.
17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 당이 10-200 mg/ml의 농도를 갖는 것인 제제.
18. 실시양태 14에 있어서, 폴리올이 당 알콜인 제제.
19. 실시양태 14에 있어서, 폴리올이 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, 폴리올이 약 10-200 mg/ml의 농도를 갖는 것인 제제.
21. 실시양태 14에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 및 폴록사머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
22. 실시양태 14에 있어서, 비이온성 계면활성제가 트윈80®, 트윈20®, 플루로닉F88®, 플루오로닉 F-127®, 플루로닉F68®, 트리톤 X-100®으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
23. 실시양태 14에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80 또는 20인 제제.
24. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 및 당 수크로스 또는 트레할로스, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 제제.
25. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 약 10-250 mg/mL의 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤; 약 0.005-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-300 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
26. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 약 30-120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
27. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 약 50-90 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 5-30 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
28. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50-90 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-20 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
29. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-200 mg/mL의 글리세롤, 소르비톨 또는 PEG400; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
30. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 40-150 mM의 L-글루타민, L-글리신, L-프롤린 또는 L-메티오닌; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
31. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 약 40-150 mM의 NaCl 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 3-150 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
33. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 5-70 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
34. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
35. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 당, 폴리올, 비이온성 계면활성제, pH 약 5-8의 히스티딘 또는 아세테이트 완충제, 10-1000 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
36. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8-6.0; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 L-아르기닌-HCl을 포함하는 제제.
37. 실시양태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 액체 제제인 제제.
38. 실시양태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 적어도 -70℃ 미만으로 냉동된 제제.
39. 실시양태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 동결건조된 제제로부터 재구성된 액제인 제제.
40. 실시양태 37-39 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체가 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%인 제제.
41. 실시양태 37-40 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 중쇄 및 경쇄가 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%인 제제.
42. 실시양태 37-41 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 무손상 IgG가 비환원된 CE-SDS에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 90%인 제제.
43. 실시양태 37-42 중 어느 하나에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 산성 변이체가 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 15% 미만인 제제.
44. 실시양태 1-43 중 어느 하나에 있어서, 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편이 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인 제제.
45. 실시양태 1-43 중 어느 하나에 있어서, 항-LAG3 항체가 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
46. 실시양태 1-43 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 제제.
47. 실시양태 46에 있어서, 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 몰비가 1:1인 제제.
48. 실시양태 46에 있어서, 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 몰비가 1:1, 2:1, 3:1 또는 3.5:1인 제제.
49. 실시양태 1-48 중 어느 하나에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 1의 CDRL1, 서열식별번호: 2의 CDRL2 및 서열식별번호: 3의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 6의 CDRH1, 서열식별번호: 7의 CDRH2 및 서열식별번호: 8의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 제제.
50. 실시양태 49에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
51. 실시양태 49에 있어서, 항-PD-1 항체가 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
52. 실시양태 46-51 중 어느 하나에 있어서, 약 10-120 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약 10-120 mg/mL의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
53. 약 10-120 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 서열식별번호: 1의 CDRL1, 서열식별번호: 2의 CDRL2, 서열식별번호: 3의 CDRL3, 서열식별번호: 6의 CDRH1, 서열식별번호: 7의 CDRH2 및 서열식별번호: 8의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 25-250 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함하는 제제.
54. 실시양태 53에 있어서, 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편이 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 상기 항-PD-1 항체가 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
55. 실시양태 53에 있어서, 항-LAG3 항체가 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하고, 상기 항-PD-1 항체가 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
56. 실시양태 53-55 중 어느 하나에 있어서, 약 10-120 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 10-120 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 30-120 mg/mL의 비환원성 이당류; 약 0.05-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; pH 약 5.0 - 6.5의 완충제; 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
57. 실시양태 53-55 중 어느 하나에 있어서, 약 20-30 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-30 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 50-90 mg/mL의 수크로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0 - 6.0; 약 40-100 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
58. 실시양태 53-57 중 어느 하나에 있어서, 약 3-100 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
59. 실시양태 53-57 중 어느 하나에 있어서, 약 5-15 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
60. 실시양태 53-57 중 어느 하나에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 25 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
61. 실시양태 1-60 중 어느 하나에 있어서, 암 또는 감염을 치료하기 위한 제제.
한 실시양태에서, 제제는
약 20 내지 220 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체는 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2 및 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2 및 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함함;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제제는
약 20 내지 220 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함함;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 제제는
약 20 내지 220 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체는 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함함;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
한 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체는 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함함;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8;
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함함;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8;
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체는 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함함;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8;
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
한 측면에서, 제제는
약 10 내지 120 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 10 내지 120 mg/mL의 서열식별번호: 1의 CDRL1, 서열식별번호: 2의 CDRL2, 서열식별번호: 3의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 6의 CDRH1, 서열식별번호: 7의 CDRH2 및 서열식별번호: 8의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
또 다른 측면에서, 제제는
약 10 내지 120 mg/mL의 항-LAG3 항체, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함함;
약 10 내지 120 mg/mL의 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
추가의 측면에서, 제제는
약 10 내지 120 mg/mL의 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 항-LAG3 항체;
약 10 내지 120 mg/mL의 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 항-PD-1 항체;
약 30 내지 120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스;
약 0.05 내지 2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 3 내지 30 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.0-6.5;
약 40 내지 150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
임의적으로, 약 5 내지 70 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2 및 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2 및 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8.
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2 및 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2 및 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 항-PD-1 항체;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8.
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
더욱 추가의 실시양태에서, 제제는
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 항-LAG3;
약 25 mg/mL의 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 항-PD-1 항체;
약 50 mg/mL의 수크로스;
약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80;
약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8.
약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및
약 10 mM의 L-메티오닌을 포함한다.
동결건조된 제제
치료용 단백질의 동결건조된 제제는 몇몇 이점을 제공한다. 동결건조된 제제는 일반적으로 용액 제제에 비해 보다 양호한 화학적 안정성을 제공하며, 따라서 증가된 보관 수명을 제공한다. 동결건조된 제제는 또한 임상적 인자, 예컨대 투여 또는 투약 경로에 따라 상이한 농도로 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 제제는 필요에 따라 피하 투여를 위해 고농도로 (즉, 적은 부피로) 또는 정맥내로 투여되는 경우 저농도로 재구성될 수 있다. 고농도는 또한 특정한 대상체에 대해 높은 용량이 요구되는 경우에, 특히 주사 부피가 최소화되어야 하는 피하로 투여되는 경우에 필요할 수 있다. 항체 약물의 피하 투여는 자가-투여를 가능하게 한다. 자가-투여는 예를 들어 정맥내 투여를 위해 의학 시설에 방문하는 것과 관련된 시간 및 비용을 피하게 한다. 피하 전달은 주사 부위에서 단일 주사로 실제로 전달될 수 있는 용액의 부피에 의해 제한되며, 일반적으로 약 1 내지 1.5 mL이다. 이러한 제한은 종종 원하는 양의 약물을 전달하기 위해 비교적 고농도의 용액을 요구한다. 전형적으로, 피하 자가-투여는 주사하기 전에 환자가 약물을 다시 현탁시킬 필요가 없도록 동결건조된 형태가 아니라 약물의 액체 용액 제제로 사전 충전된 시린지 또는 그로 충전된 오토인젝터를 사용하여 달성된다.
전형적으로, 동결건조된 제제는 약물 생성물 (DP)을 고농도로 재구성할 것을 예상하여, 즉, 적은 부피의 액체로 재구성할 것을 예상하여 제조된다. 이어서, 물 또는 등장성인 완충제에 의한 후속적인 희석을 용이하게 이용하여 DP를 저농도로 희석할 수 있다. 전형적으로, 예를 들어 피하 투여를 위해 높은 DP 농도로 재구성될 때 대략 등장성인 제제를 생성하는 수준으로 부형제가 본 발명의 동결건조된 제제에 포함될 수 있다. 낮은 DP 농도를 생성하기 위해 많은 부피의 물로 재구성하면 필연적으로 재구성된 액제의 장성이 감소될 것이지만, 이러한 감소는 등장성 용액 (0.9% 염화나트륨, USP 또는 5% 덱스트로스 용액, USP)과의 혼합물로서 비-피하, 예를 들어 정맥내로 투여하는 동안에 거의 유의하지 않을 수 있다. 등장성을 낮은 DP 농도에서 원하는 경우, 동결건조된 분말을 표준의 적은 부피의 물로 재구성한 다음, 등장성 희석제, 예컨대 0.9% 염화나트륨으로 추가로 희석할 수 있다.
본 발명의 동결건조된 제제는 동결건조 이전의 용액을 동결건조 (냉동-건조)시킴으로써 형성된다. 냉동-건조는 제제를 냉동시키고, 후속적으로 일차 건조 동안에 적합한 온도에서 물을 승화시킴으로써 달성된다. 이 조건하에, 생성물 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도보다 낮다. 전형적으로, 일차 건조를 위한 선반 온도는 적합한 압력에서, 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr에서 약 -30 내지 -25℃의 범위이다 (단, 일차 건조 동안에 생성물이 냉동된 채로 유지됨). 제제, 샘플을 보유하는 컨테이너의 크기 및 유형 (예를 들어, 유리 바이알), 및 동결건조될 제제의 부피는 건조에 필요한 시간에 영향을 미칠 것이고, 이는 수시간 내지 수일의 범위 (예를 들어, 40-60 시간)일 수 있다. 이차 건조는 컨테이너의 유형 및 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 따라 약 0-40℃에서 수행될 수 있다. 이차 건조 시간은 생성물에서 원하는 잔류 수분에 의해 영향을 받고, 전형적으로 적어도 약 5 시간이 걸린다. 전형적으로, 동결건조된 제제의 수분 함량은 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 일차 건조 단계 동안에 이용되는 것과 동일할 수 있다. 냉동-건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 달라질 수 있다.
일부 예에서, 운반 단계를 피하도록 단백질의 재구성이 수행되어야 하는 컨테이너에서 단백질 제제를 동결건조시키는 것이 바람직할 수 있다. 이 예에서 컨테이너는 예를 들어 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다.
본 발명의 동결건조된 제제는 투여하기 전에 재구성될 수 있다. 단백질은 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 또는 100 mg/mL의 농도로 또는 더 고농도, 예컨대 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL 또는 300 mg/mL 내지 약 500 mg/mL로 재구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 10-300 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 20-250 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 150-250 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 180-220 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 50-150 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 50 mg/ml이다. 한 실시양태에서, 재구성 이후에 단백질 농도는 약 25 mg/ml이다. 재구성된 제제의 피하 전달이 의도되는 경우에는 높은 단백질 농도가 특히 유용하다. 그러나, 다른 투여 경로, 예컨대 정맥내 투여의 경우에는, 저농도의 단백질이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 약 5-25 mg/mL).
일반적으로, 재구성은 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25℃의 온도에서 수행될 수 있지만, 필요에 따라 다른 온도가 이용될 수 있다. 재구성을 위해 필요한 시간은 예를 들어 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라질 것이다. 예시적인 희석제에는 멸균수, 주사용 정균수 (BWFI), pH 완충된 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충된 식염수), 멸균성 식염수 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 덱스트로스 용액이 포함된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-LAG3 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)은 정맥내 투여를 위해 동결건조된 분말로 제제화된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)는 피하 투여를 위해 동결건조된 분말로 제제화된다. 특정한 실시양태에서, 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)는 약 40-300 mg/바이알로 제공되고, 사용하기 전에 주사용 멸균수에 의해 재구성된다. 다른 실시양태에서, 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)는 약 200 mg/바이알로 제공되고, 사용하기 전에 주사용 멸균수에 의해 재구성된다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제의 목표 pH는 6.0이다. 다양한 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 제제는 항-LAG3 항체를 고농도로, 예컨대 약 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 250 mg/mL 이상으로 재구성하는 것을 가능하게 한다. 다른 실시양태에서, 재구성 이후에 항-LAG3 항체 농도는 약 10-300, 20-250, 150-250, 180-220, 20-200, 40-100 또는 50-150 mg/ml이다. 다른 실시양태에서, 동결건조 이전에 항-LAG3 항체 농도는 약 10-300, 150-250, 180-220, 10-100, 10-50 또는 25-50 mg/ml이다.
다른 실시양태에서, 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 항-PD-1 항체 또는 항원 결합 단편의 동결건조된 제제는 동결건조된 제제로부터 생성된 재구성된 액제의 측면에서 정의된다. 재구성된 액제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 약 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 또는 100 mg/mL 또는 그보다 고농도, 예컨대 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 또는 약 300 mg/mL까지의 농도로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 재구성된 제제는 10-300 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 10-200 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 10-100 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 10-60 또는 15-50 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재구성된 제제는 10-25 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재구성된 제제는 20-30 또는 25 mg/mL의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
액체 제제
액체 항체 제제는 예를 들어 수성 제약 제제인 약물 물질을 취하고, 정제 공정의 마지막 단계로서 원하는 완충제로 완충제 교환함으로써 제조될 수 있다. 이 실시양태에는 동결건조 단계가 없다. 최종 완충제 중의 약물 물질을 원하는 농도로 농축시킨다. 부형제, 예컨대 안정화제 및 계면활성제를 약물 물질에 첨가하고, 적절한 완충제를 사용하여 최종 단백질 농도로 희석한다. 최종의 제제화된 약물 물질을 0.22μm 여과기를 이용하여 여과하고, 최종 컨테이너 (예를 들어, 유리 바이알)에 충전시킨다. 제제는 바이알에 보관될 수 있고, 주사 기기 또는 용기를 통해 전달될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 10-300 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 20-250 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 40-100 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 10-60 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 20-30 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 10-30 mg/mL의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 액체 제제 중에 있고, 약 15-50 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 약 10-100 mg/mL의 농도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항-LAG3 항체는 약 20-30 또는 25 mg/mL의 농도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 제제는 약 10-300 mg/ml의 농도를 갖는 액체 제제에 항-PD-1 항체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 20-250 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 40-100 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 10-60 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 20-30 mg/ml의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 10-30 mg/mL의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 15-50 mg/ml의 농도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 10-100 mg/mL의 농도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 20-30 또는 25 mg/mL의 농도를 갖는다.
한 실시양태에서, 액체 제제는 pH 약 5-8, 5.0-6.5, 5.5-6.5, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2의 완충제, 및 아르기닌 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 pH 약 5-8의 완충제를 포함한다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 pH 약 5.0-6.5의 완충제를 포함한다. 한 실시양태에서, 액체 제제는 pH 약 5.0-6.0의 완충제를 포함한다. 다른 실시양태에서, 완충제는 히스티딘이다. 또 다른 실시양태에서, 완충제는 시트레이트 또는 아세테이트이다. 추가의 실시양태에서, 액체 제제는 pH 약 5-8, 5.0-6.5, 5.5-6.5, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2의 아세테이트 완충제, 및 아르기닌 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 액체 항체 제제는 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 주사에 적합하고; 피하 주사에 특히 적합하다.
투약 및 투여
독성은 치료제, 예컨대 인간화 항-LAG3 또는 항-PD-1 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)의 적절한 투여를 선택하는데 있어서의 고려사항이다. 단독으로 또는 면역저해제와의 조합으로 투여되는 항체 조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해, 예를 들어 LD50 (집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 비는 치료 지표이며, 이는 LD50 대 ED50의 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 항체가 바람직하다. 이들 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량의 범위를 제제화하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성을 거의 또는 전혀 갖지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 용량은 사용된 투약 형태 및 이용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다.
투여에 적합한 경로에는 예를 들어 비경구 전달, 예컨대 근육내, 피내, 피하, 척수내 주사, 뿐만 아니라 경막내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내가 포함된다. 약물은 다양한 통상적인 방식으로, 예컨대 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사로 투여될 수 있다. 용액의 부피가 제한될 수 있는 투여 방식 (예를 들어, 피하 투여)은 동결건조된 제제를 고농도에서 재구성하는 것을 가능하게 한다.
대안적으로, 항체를 전신 방식이 아니라 국부적으로, 예를 들어 종종 데포 또는 지속 방출 제제로 면역병리학을 특징으로 하는 병원체-유도된 병변으로 항체의 직접적인 주사를 통해 투여할 수 있다. 추가로, 항체를 표적화 약물 전달 시스템으로, 예를 들어 면역병리학을 특징으로 하는 병원체-유도된 병변을 표적으로 하는 조직-특이적 항체로 코팅된 리포좀으로 투여할 수 있다. 리포좀은 발병 조직을 선택적으로 표적화하여 흡수할 것이다.
치료를 위한 투여 섭생법의 선택은 몇몇 인자, 예컨대 실체의 혈청 또는 조직 대사회전 속도, 증상의 수준, 실체의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스에서 표적 세포의 접근가능성에 따라 좌우된다. 바람직하게는, 투여 섭생법은 허용되는 수준의 부작용과 일치하게 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화시킨다. 따라서, 전달된 생물학적 작용제의 양은 부분적으로 특정한 실체 및 치료할 상태의 중증도에 따라 좌우된다. 항체, 사이토킨 및 소분자의 적절한 용량을 선택하기 위한 지침이 이용가능하다. 예를 들어, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)를 참고한다.
적절한 용량의 결정은 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에서 공지되거나 의심되는 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예상되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 이루어진다. 단백질의 적절한 용량 ("치료 유효량")은 예를 들어 치료되는 상태, 상태의 중증도 및 과정, 단백질이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 치료, 환자의 임상적 병력 및 단백질에 대한 반응, 사용되는 단백질의 유형, 및 주치의의 결정에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 최적 용량보다 다소 적은 양으로 투여를 시작하고, 그 후에 임의의 부정적인 부작용에 비해 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 증분으로 증가시킨다. 중요한 진단 척도에는 예를 들어 염증의 증상 또는 염증성 사이토킨의 생성 수준이 포함된다. 단백질은 적합하게는 1회로 또는 반복적으로 환자에게 투여된다. 단백질은 단독으로 또는 다른 약물 또는 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
항체 또는 항체 단편은 연속적인 주입에 의해, 또는 예를 들어 1 일, 주당 1-7회, 1 주, 2 주, 3 주, 매달, 격월 등의 간격으로 투여함으로써 제공될 수 있다. 바람직한 투여 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 피하는 최대 용량 또는 투여 빈도와 관련된 것이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 제제는 정맥내 (IV) 주입 또는 주사에 의해 투여될 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 제제는 피하 투여에 의해 투여될 것이다. 피하 투여는 시린지를 사용하여 또는 다른 주사 기기 (예를 들어, 인젝트-이지(Inject-ease®) 기기); 인젝터 펜; 또는 무바늘 기기 (예를 들어, 메디젝터(MediJector) 및 바이오젝터(BioJector®))를 사용하여 주사에 의해 수행될 수 있다.
피하 투여는 시린지, 오토인젝터, 인젝터 펜 또는 무바늘 주사 기기를 사용하여 주사에 의해 수행될 수 있다. 정맥내 주사는 적합한 상업용 희석제, 예컨대 식염수 용액 또는 물 중 5% 덱스트로스를 사용하여 제제를 희석한 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 고농도 용액 제제가 고농도 항체를 필요로 하는 용도에서 특히 유리하지만, 고농도가 필요하지 않거나 또는 바람직하지 않은 상황에서 제제를 저농도로 사용할 수 없는 이유는 없다. 보다 저농도의 항체는 저용량 피하 투여를 위해, 또는 전달될 수 있는 부피가 실질적으로 1 ml 초과인 다른 방식의 투여 (예컨대, 정맥내 투여)에서 유용할 수 있다. 이러한 저농도에는 15, 10, 5, 2, 1 mg/ml 이하가 포함될 수 있다.
용도
본 발명은 암 및 감염의 치료에 사용하기 위한 항-인간 LAG3 항체의 동결건조된 또는 액체 제제를 제공한다.
관련 기술분야의 기술자는 용어 "암"이 신체의 세포가 비정상적이기 시작하고 제어되지 않게 분열하는 질환에 대한 명칭임을 알고 있을 것이다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암에는 심장: 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지 암종 (편평상피 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암종), 폐포 (세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골 과오종, 중피종; 위장: 식도 (편평상피 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위 (암종, 림프종, 평활근육종), 췌장 (관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종 종양, 비포마), 소장 (선암종, 림프종, 유암종 종양, 카포시(Karposi) 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암종, 관 선종, 융모 선종, 과오종, 평활근종) 결장직장; 비뇨생식관: 신장 (선암종, 윌름스(Wilm's) 종양 [신장모세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도 (편평상피 암종, 전이 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종 종양, 지방종); 간: 간세포암 (간세포 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골: 골원성 육종 (골육종), 섬유육종, 악성 섬유 조직구종, 연골육종, 유잉(Ewing) 육종, 악성 림프종 (망상 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 골연골종 (골연골 외골증), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액양 섬유종, 유골성 골종 및 거대 세포 종양; 신경계: 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 뇌척수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배세포종 [송과체종], 다형성 교모세포종, 희소돌기아교세포종, 슈반세포종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁 (자궁내막 암종), 자궁경부 (자궁경부 암종, 종양 이전 자궁경부 이형성증), 난소 (난소 암종 [장액성 낭선종, 점액성 낭선종, 분류되지 않는 암종], 과립난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 미분화배세포종, 악성 기형종), 음문 (편평상피 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명 세포 암종, 편평상피 암종, 포도상 육종 (배아 횡문근육종), 나팔관 (암종), 유방; 혈액학: 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성], 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종 [악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평상피 암종, 카포시 육종, 이형성 모반 병변, 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 및 부신: 신경모세포종이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 암은 결장직장암, 위암 및 두경부암으로부터 선택된다.
실시예
실시예 : 장기간 안정성 연구
항-LAG3 항체 (서열식별번호: 35 및 57, 경쇄 및 중쇄)를 냉동된 약물 생성물 (≤-70℃에서 보관 권장) 또는 냉장된 약물 생성물 (2 내지 8℃에서 보관 권장)로서 개발하였고, 안정성 연구를 하기 실시예에서 수행하였다. 제제 A: 25 mg/mL의 항-LAG3 항체 (서열식별번호: 35 및 57, 경쇄 및 중쇄); 50 mg/mL의 수크로스; 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 10 mM의 히스티딘 완충제 pH 5.8; 70 mM의 L-아르기닌-HCl. 냉동된 약물 생성물은 주입하기 전에 주위 실온에서 해동해야 한다. 약물 생성물을 플라스틱 플립-오프 캡과 함께 13-mm 탄성 스토퍼 및 알루미늄 밀봉부를 구비한 단일-사용의 멸균성 2 mL 유형 1 유리 튜브 바이알에 포장하였다. 각각의 바이알은 25 mg/mL의 농도에서 50 mg의 라벨 표시 (2.2 mL 충전)를 함유한다.
권장된 장기간 보관 조건으로서 ≤-70℃를 이용하는 ICH 지침에 따라 안정성 연구를 -80℃ ± 10℃에서 (똑바로), -20℃ ± 5℃의 가속된 보관 조건에서 (똑바로), 및 5℃ ± 3℃의 스트레스를 가하는 조건에서 (거꾸로) 수행하였다. 추가로, 추가 정보로서 25℃ (25℃ ± 3℃ / 60% ± 5% 상대 습도, 거꾸로) 및 40℃ (40℃ ± 2℃/ 75% ± 5% 상대 습도, 거꾸로)에서 데이터를 수집하였다.
실시예 2: 미립자 물질 연구
제제 A에서 항-LAG3 항체에 대한 미립자 물질 데이터를 HIAC 방법의 변형된 버젼인 mHIAC를 이용하여 보다 작은 샘플 부피를 이용하여 수집하였다. USP <787> HIAC 시험 방법은 2 마이크로미터 내지 100 마이크로미터의 육안으로 볼 수 없는(sub-visible) 미립자의 검출을 위해 이용되어 왔다. 층류 후드하에서, 용액 샘플을 실온으로 만든 다음, 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 부드럽게 모아서, 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 적어도 6 mL의 합한 부피를 수득하였다. 모은 샘플을 부드럽게 소용돌이치게 하고, 30 분 동안 그대로 두었다. 모으기 전에 동결건조된 샘플을 2.2 mL의 주사용수로 재구성하였다. 재구성 이후에, 샘플을 시험하기 전에 주위 조건하에서 30 분 동안 그대로 두었다. 샘플 분석 이전에, 50 mL 독립형 원심분리 튜브의 바닥에 샘플링 프로브 팁을 거의 삽입함으로써 장비를 0.22 마이크로미터 여과된 물로 5회 플러싱하였다. 팜스펙(PharmSpec) 소프트웨어하에서, 50 mL의 밀리-큐(Milli-Q) 물에 샘플링 포트를 잠기게 함으로써 USP_36_788 환경 표준 절차 시험을 기준선으로서 수행하였다. 상기 시험이 깨끗한 시스템임을 보장하는 USP_36_788_환경을 통과한 경우에만 샘플 분석을 수행하였다. 팜스펙 소프트웨어의 하드웨어 설정에서, 상기 방법은 하기 투입 파라미터에 따라 설정되었다: 샘플 부피 (1.0 mL), 작동 횟수 (5), 희석 계수 (1.00), 용기 부피 (0 mL), 첫번째 작동 폐기 (예), 작동 카운터에 대해 16가지 채널을 작업 파라미터를 위해 선택하였다 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75 및 90 마이크로미터). 샘플 작동 이전에, 위약을 사용하여 시린지를 1회 세척하였다 (샘플 프로브가 샘플 용액에 잠겨서 장비를 통한 공기 흐름을 피하도록 함). 작동이 끝날 때, 프로브 및 센서를 위약으로 헹구었다. 위약 세척 단계를 각각의 샘플에 대해 반복하였다. 샘플 분석의 경우, 1 mL의 5회 측정을 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 처음 2회 작동은 폐기하였고, 나머지 3회 작동을 평균하여 최종 결과를 수득하였다.
12 개월째에 컨테이너당 ≥ 10 μm 뿐만 아니라 컨테이너당 ≥ 25 μm인 육안으로 볼 수 없는 입자에서의 변화는 -80℃, -20℃ 및 5℃ 조건에서 유의하지 않았다. (도 1 및 도 2).
실시예 3: 결합 ELISA에 의한 효능
효능 검정은 고정된 재조합 인간 LAG-3 (rhLAG-3)에 대한 항-LAG3 결합을 통해 제제 A에서 항-LAG3 활성을 평가한다. 항-LAG3 기준 물질 및 시험 샘플의 계열 희석액을 사용하여 용량 반응 곡선을 생성하였다. 최대 결합의 50%를 나타내는 항-LAG3 기준 물질 및 시험 샘플의 농도인 EC50 값을 4-파라미터 로지스틱 곡선 대입 분석을 이용하여 결정하였다. 상대적인 효능은 소프트맥스® 프로(SoftMax® Pro)에서 용량-반응 곡선의 평행선 분석을 적용하여 계산하였다. 시험 샘플의 효능은 기하 표준 편차 및 95% 신뢰 구간과 함께 기준 물질에 대한 기하 평균 효능으로서 보고하였다.
항-LAG3에 대해 -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃ 보관 조건에서의 효능 안정성 데이터를 도 3에 도시하였다. 지금까지 수득된 결과에서 변화가 관찰되지 않았고, 데이터는 기준과 비교하여 60% - 140% 효능의 허용 기준 내에 있다. 25℃에서는 변화가 보이지 않는 반면에, 40℃에서는 비록 명시된 허용 기준 내에 아직 있긴 하지만 3 개월째에 효능에서의 감소가 보였다.
실시예 4: UP-SEC 측정에 의한 순도
제제 A에서 항-LAG3 항체의 순도를 초고성능 크기 배제 크로마토그래피 (UP-SEC)에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. 초고성능 - 크기 배제 크로마토그래피 (UP-SEC)를 이동상 (100 mM 포스페이트, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 수행하였다. 컬럼 온도를 25 ± 3℃로 유지하였고, 등용매 용리를 이용하여 유속을 0.5 mL/min으로 유지하였다. 희석된 샘플을 워터스(Waters) BEH200 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 UPLC에 주사하였다 (5 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
UP-SEC에 의한 순도는 % 단량체의 경우 도 4 및 % 고분자량 종의 경우 도 5에 하기에 도시된다. -80℃ 및 -20℃에서 12 개월까지 보관 시간 또는 조건의 함수로서 % 단량체 또는 % 고분자량 종에서 변화가 없었다 (5℃에서 % 고분자량 종에서만 약간 증가가 있음). 25℃에서, 초기에 비해 5 개월째에 고분자량 종에서 0.3% 증가가 관찰되었고, % 단량체에서의 상응하는 0.5% 감소 및 0.2% 저분자량 종의 출현이 있었다. 40℃에서 3 개월째에 초기에 비해 고분자량 종에서의 1.5% 증가 및 % 단량체에서의 1.8% 감소가 있었다. -80℃, -20℃ 및 5℃에서는 저분자량 종에 대한 피크가 관찰되지 않았다.
실시예 5: 환원된 및 비환원된 CE-SDS
환원 조건하에 CE-SDS 시험 방법을 이용하여, 경쇄 (LC), 중쇄 (HC) 및 그들의 분해 생성물을 그들의 크기에 따라 대체가능한 SDS-겔 매트릭스를 함유하는 모세관에서 분해시킴으로써 IgG 모노클로날 항체의 순도를 측정하였다. 비환원된 조건하에, CE-SDS 시험 방법을 이용하여, 무손상 IgG를 그들의 크기에 따라 대체가능한 SDS-겔 매트릭스를 함유하는 모세관에서 그의 성분으로부터 분해시킴으로써 IgG 모노클로날 항체의 순도를 측정하였다. 두 경우 모두에서 (환원된 및 비환원된), 결과는 전체 보정된 피크 면적 백분율로부터 계산하여 각각의 피크의 보정된 면적 백분율로 보고된다. 샘플을 CE-SDS 기술에 의해 분석하였으며, 단백질을 환원된 및 비환원된 조건하에 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)에 의해 변성시키고, 모세관 전기영동 (CE) (베크만-코울터(Beckman-Coulter) 프로테옴랩(ProteomeLab) PA800 플러스 CE 시스템 및 IgG 순도/이질성 검정 키트)을 이용하여 분리하였다. 환원된 조건의 경우, mAb 샘플을 1.0% SDS의 존재하에 변성시켰고, 5% β-머캅토에탄올을 사용하여 환원시켰다. 비환원된 조건의 경우, mAb 샘플을 1.0% SDS의 존재하에 변성시켰고, N-에틸말레이미드 (NEM)로 처리하였다. 70℃에서 10 분 동안 가열한 후, 각각의 샘플을 5 kV에서 20 초 동안 SDS 겔 매트릭스로 충전된 노출된 용융 실리카 모세관 상으로 주사한 후, 비환원된 및 환원된 조건 둘 다에 대해 15 kV에서 40 분 동안 분리시켰다. 분리된 단백질 밴드를 220 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다. 단백질은 그의 겉보기 분자량을 기준으로 분리한다. 비환원된 조건하에서, 주요 IgG 피크 이외의 모든 종은 불순물로 분류되었다. 환원된 조건하에서, IgG는 중쇄 및 경쇄로 분해되었다. 다른 모든 종은 불순물로 분류되었다. 두 경우 모두, 결과는 전체 보정된 피크 면적 백분율로부터 계산하여 각각의 피크의 보정된 면적 백분율로 보고되었다.
제제 A에서 항-LAG3 항체의 CE-SDS에 의한 순도 데이터가 항-LAG3 항체에 대해 도 9 및 도 10에 도시된다. 도 9는 환원된 CE-SDS에 의한 % 순도 (중쇄 + 경쇄)를 도시하고, 도 10은 비환원된 CE-SDS 조건에 대한 % 순도 검정 (무손상 IgG)을 도시한다. -80℃, -20℃ 및 5℃에서 12 개월까지 % 순도 (환원된) 또는 % 무손상 IgG (비환원된)에서 측정가능한 변화가 없다. 전반적으로, 모든 결과는 중쇄 + 경쇄 ≥ 90.0% 및 무손상 IgG ≥ 90.0%의 허용 기준 내에 있다. 25℃에서는 5 개월까지 % 중쇄 + 경쇄에서 및 % 무손상 IgG에서 각각 1.5% 및 1.0%의 감소가 확인된 반면에, 40℃에서는 % 중쇄 + 경쇄 및 % 무손상 IgG에 대한 순도에서 각각 5.4% 및 5.8%의 감소가 확인되었다.
실시예 6: HP-IEX에 의한 전하 변이체 측정
고성능 이온-교환 크로마토그래피 (HP-IEX)를 이용하여 전하 프로파일을 평가하였다. 이온 교환 HPLC 방법을 280 nm에서의 UV 검출기를 구비한 디오넥스 맵팩(Dionex MAbPac®) SCX-10 컬럼을 이용하여 수행하였다. 주사 부피를 10 μL로 설정하고, 컬럼 온도를 35℃로 유지시켰다. 샘플을 정제수에 의해 5 g/L로 희석하고, 50 μg을 분석을 위해 주사하였다. 샘플의 IEX 분석을 위해 사용된 이동상은 하기 이동상의 구배를 가졌다:
이동상 A: 25 mM 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES), 14 mM 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올 (트리스), pH 6.25
이동상 B: 25 mM MES, 22 mM 트리스, 100 mM 염화리튬, pH 6.85
스트립핑 완충제 C: 15 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 40 mM 트리스, 10 mM 2-(시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES), 500 mM 염화나트륨, pH 8.1
유속을 0.5-1.0 mL/min으로 유지하였다. 결과는 크로마토그램의 총 면적을 기준으로 상대적인 백분율로서 제시된다. 산성 3, 산성 2 및 산성 1의 합계는 카테고리 "산성 변이체"로 보고된 반면에, 염기성 1, 염기성 2 및 염기성 3의 합계는 카테고리 "염기성 변이체"로 보고되었다. % 주요는 카테고리 "주요"로 보고되었다.
제제 A에서 항-LAG3 항체의 HP-IEX 방법에 의한 % 산성 변이체, % 총 주요, 및 % 염기성 변이체가 항-LAG3 항체에 대해 -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃ 온도 조건에 대해 각각 도 6, 도 7 및 도 8에 도시된다. -80℃, -20℃ 및 5℃ 보관 조건에서는 12 개월 동안 안정성 데이터를 모니터링한 후에 어떠한 전하 변이체에서도 변화가 관찰되지 않는다. 25℃에서는, 초기와 비교하여 안정성에 있어서 5 개월 후에, % 총 주요 피크가 9.7% 감소하였고, % 산성 변이체가 11% 증가한 반면에, % 염기성 변이체는 1.4%의 미미한 감소를 나타내었다. 40℃에서는, 초기와 비교하여 안정성에 있어서 3 개월 후에, % 총 주요 피크는 36.2%의 유의한 감소를 나타내었고, % 산성 변이체는 39.3%만큼 유의하게 증가한 반면에, % 염기성 변이체는 3.1%의 적은 감소를 나타내었다.
실시예 7: 혼탁도 연구
제제 A에서 항-LAG3 항체의 혼탁도를 스펙트라맥스(Spectramax) M5 판독기를 사용하여 350 nm에서 분광광도법적 흡광도로부터 측정하였다. -80℃, -20℃ 및 5℃에서 보관의 경우 12 개월 이후의 안정성의 보관 시간 또는 조건의 함수로서 혼탁도에서 큰 변화가 없었다. 추가 정보로서 사용되는 25℃ 및 40℃ 보관으로부터 수집된 데이터의 경우에는, 25℃에서 수행된 샘플에 대해 혼탁도가 초기 시점에 0.074에서 5 개월 후에 0.100으로 증가하였다. 40℃에서 수행된 샘플에 대해 초기 시점에서 0.074에서 3 개월 후에 0.150으로 혼탁도에서의 유의한 증가가 관찰되었다
요약하면, 항-LAG3 항체에 대한 12 개월의 안정성 데이터는 ≤-70℃의 보관 조건에서 보관 후에 실질적인 변화를 나타내지 않는다. 추가로, -20℃의 가속된 조건 또는 5℃의 스트레스를 가하는 조건에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 8: 항-LAG3 항체의 pH 범위 연구
항-LAG3 항체 제제 A를 5.8의 표적 제제 pH를 고려하여 5.3 내지 6.4의 pH 범위에서 스크리닝하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, pH 5.3 내지 pH 6.4에서 농도, 혼탁도, % 고분자량 종, % 저분자량 종 또는 % 단량체에서 유의한 변화가 없었다. % 산성 변이체에서의 감소 (예를 들어, pH 5.5에서 17.28% 내지 pH 6.0에서 14.10%)와 함께 % 주요 피크에서의 증가 (예를 들어, pH 5.5에서 64.0% 내지 pH 6.0에서 66.9%)가 pH 5.3 내지 pH 6.4에서 관찰되었다. Z-ave 수력학적 직경에서의 변화는 pH 5.3 내지 pH 6.4에서 최소 (1 nm 미만)였다. pH가 ~ 6.3의 등전점에 가까워짐에 따라 (즉, pH 6.0 및 pH 6.4), 밀리리터당 육안으로 볼 수 없는 미립자 (≥ 5 μm, ≥ 10 μm 및 ≥ 25 μm 크기 범위)에서의 적은 증가가 관찰되었다. 전반적으로, 항-LAG3 항체는 pH 5.3 내지 pH 6.4에서 안정한 것으로 확인되었고, 이는 표적 제제 pH로서 pH 5.8의 선택을 확인시켜 준다.
실시예 9: 항-LAG3 항체의 자가-회합을 감소시키기 위한 조건의 연구
확산 상호작용 파라미터 (k D ) 측정
10 mM의 히스티딘 pH 5.6 중에서 B22는 음성인 것으로 확인되었으며, 이는 자가-회합하는 상기 분자 고유의 성질을 나타낸다. 10 mM의 히스티딘 pH 5.6 중 50 mM의 염화나트륨의 존재는 도 12에 도시된 바와 같이 항-LAG3 항체의 확산 상호작용 파라미터 (KD)를 증가시키거나 또는 자가-상호작용을 감소시키고, 상대적인 용해도를 증가시키고, 혼탁도 (OD350)를 감소시키는 것으로 확인되었다. 10 mM의 히스티딘 pH 5.6 중에서 항-LAG3 항체의 안정성은 확산 상호작용 파라미터 (KD), 혼탁도 (OD350) 및 상대적인 용해도 (%PEG중간점) 검정을 이용하여 40 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드의 존재하에 연구하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 자가-상호작용 및 혼탁도는 극적으로 감소한 것으로 확인된 반면에, 항-LAG3 항체의 상대적인 용해도는 10 mM의 히스티딘 완충제 pH 5.6 중에서 40 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드의 첨가시에 유의하게 개선된 것으로 확인되었다. 50 mg/mL의 항-LAG3 항체를 사용하여 L-아르기닌 히드로클로라이드 범위 연구 (40 mM-100 mM)를 pH 5.8 내지 pH 6.0에서 수행하였고, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 농도 (14.7 mg/mL)가 자가-상호작용을 감소시키고 콜로이드 안정성을 개선시키는데 효과적인 것으로 확인되었다 (도 13).
항-LAG3이 보다 낮은 이온 강도 (10 mM)에서 완충제 중에서 상 분리하는 것으로 확인되었다. 상이한 농도 수준 (mM)에서 3가지 상이한 하전된 종 [L-아르기닌, L-히스티딘 및 염화나트륨 (NaCl)]의 존재하에 항-LAG3의 자가-회합 성질 뿐만 아니라, 콜로이드, 물리적, 화학적 뿐만 아니라 열 안정성을 평가하기 위해, 9가지 상이한 제제를 하기 표 3에 열거한 바와 같이 제조하였다. 10 mM의 L-히스티딘 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 중에서 제제화되지 않은 항-LAG3 (~37 mg/mL)을 3가지 10 mM의 히스티딘 pH 5.8 완충제 용액; 각각 100 mM의 L-아르기닌, 100 mM의 염화나트륨 또는 100 mM의 L-히스티딘을 함유하는 완충제 용액에 대해 투석하였다. 각각의 제제의 투석물을 사용하여 항-LAG3을 25 mg/mL에서 제제화하였다. 40 mM 내지 130 mM의 L-아르기닌 또는 염화나트륨을 함유하는 제제는 각각의 항-LAG3 스톡 용액을 L-히스티딘 완충제 pH 5.8로 희석하고, 항-LAG3을 25 mg/mL로 농축시킴으로써 제조하였다.
Figure pct00040
9가지 제제의 확산 상호작용 파라미터 (kD)를 5개의 획득에 대해 20℃에서 동적 광 산란 (DLS)을 이용하여 평가하였다. 각각의 제제의 일련의 희석된 농도 (mg/mL)에 대한 기록된 확산 계수 값 (cm2/s)의 플롯의 기울기 및 y-절편으로부터 상호작용 파라미터 (kD)를 계산하였다. 양의 확산 상호작용 파라미터 (kD)는 반발성 상호작용을 시사한다. L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 농도가 증가함에 따라 (> 40 mM), 항-LAG3의 kD가 증가하였고, 이는 분자 자가-회합의 감소 (적은 분자 군집화)를 시사한다. 상기 효과는 L-아르기닌에 이어서 염화나트륨 및 L-히스티딘의 상대적인 순서로 비교적 현저하였다 (도 15 참고).
상대적인 용해도 연구
9가지 제제의 자동화된 상대적인 용해도 스크리닝을 10 mg/mL의 단백질 농도를 요구하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-유도된 침전을 이용하여 평가하였다. 40% (w/v) PEG 6000을 각각의 완충제 용액 중에서 제조한 후에, PEG-6000의 용액을 2%-36% (w/v)의 다양한 증가량으로 JANUS G3 자동화된 액체 취급 시스템을 사용하여 제조하였다. 10 mg/mL의 단백질 용액을 96-웰 코스타 투명 플레이트 중의 PEG 용액에 첨가하여, 1 mg/mL의 최종 검정 농도를 수득하였다. 상기 플레이트를 실온에서 밤새 평형화시켰고, 아비진(Abgene) PCR 플레이트로 옮기고, 4600 rpm에서 30 분 동안 회전시켜, 단백질을 각각의 웰의 바닥으로 침전시켰다. 상청액을 각각의 웰로부터 새로운 96-웰 코스타 투명 플레이트로 옮겼다. 상기 플레이트를 스펙트라맥스 M5 플레이트 판독기 상에서 280 및 320 nm에서 판독하여, 밤새 인큐베이션하는 동안 침전으로 인한 단백질 손실을 측정하였다. 흡광도 (280-320) 대 PEG 농도 데이터를 분석하여 %PEG중간점을 측정하였다.
항-LAG3은 증가하는 농도의 하전된 종, 예컨대 L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨 (40 mM 내지 100 mM)의 존재하에 개선된 상대적인 용해도를 나타내었고, 이는 이들 농도에서 항-LAG3의 분자 군집화에서의 감소를 시사한다. 도 16을 참고한다. 상대적인 용해도에서의 개선의 크기는 3가지 하전된 종들 사이에서 유사하였다.
하전된 종에서의 변화 연구
L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3의 하전된 이질성 및 등전점 (pI)에서의 변화를 프로테인심플(ProteinSimple)의 모세관 등전점 전기영동 (cIEF) 시스템을 이용하여 평가하였다. 모세관에 주사하기 전에, 샘플을 담체 양쪽성 전해질과 혼합하였다. 모세관에 전기장을 인가함으로써, 모세관에서 담체 양쪽성 전해질에 의해 pH 구배를 생성하였고, 단백질 분자를 국부적 pH 값이 등전위 pH (pI) 값과 동일한 모세관에서의 위치로 이동시켰다. iCE 시스템 (프로테인심플로부터의 iCE3)을 이용하여 전체 모세관을 완전히 스캔함으로써 분리된 단백질의 검출을 달성하였다. 장비로 찍은 마지막 영상을 데이터 정량화를 위해 사용하였다. 분해된 피크의 면적 백분율은 개별 종의 면적을 단백질의 총 면적으로 나눔으로써 추정된다. 단백질의 pI 값은 단백질을 협차(bracketing)하는 2개의 pI 마커 사이의 거리를 선형으로 보정함으로써 추정된다. 작업 파라미터에는 10℃의 오토샘플러 온도; 플루오로카본 (FC) 코팅된 카트리지, 280 nm의 검출 파장, 1500 V에서 1 분의 초점조절 기간이 포함되었다. 9가지 제제를 96-웰 플레이트로 옮기고, cIEF를 사용하여 초기 시점에서 하전된 종에서의 변화 (% 산성 변이체, % 주요 피크 및 % 염기성 변이체)에 대해 평가하였다. 9가지 제제의 나머지 샘플을 또 다른 96-웰 플레이트로 옮기고, 단단하게 밀봉하고, 50℃에서 10 일 동안 열 스트레스를 가하였다. 스트레스를 가할 때, 하전된 종에서의 변화를 다시 평가하였다. 도 17에서의 데이터는 초기와 비교하여 열 스트레스를 가할 때 % 산성 변이체에서의 변화 (차이), 주요 피크에서의 % 변화, 뿐만 아니라 염기성 변이체에서의 % 변화를 보고한다.
염화나트륨은 항-LAG3 제제에 대해 % 산성 변이체 및 % 주요 피크에서 가장 적은 변화를 나타내었고, 다음으로 L-아르기닌 및 L-히스티딘이었다. 염화나트륨은 40 내지 100 mM의 농도 범위, 특히 ≥70 mM 농도에서 화학적 안정성에서의 개선을 나타내었다. L-아르기닌은 70 mM 농도에서 보다 양호한 화학적 안정성을 나타낸 반면에, L-히스티딘은 100 mM 농도에서까지 보다 양호한 화학적 안정성을 나타내었다.
L-아르기닌 또는 염화나트륨 (NaCl)의 존재하에 항-LAG3의 자가-회합 성질 뿐만 아니라 콜로이드 안정성을 평가하기 위해, 12기지 상이한 제제를 표 4에 열거된 바와 같이 제조하였다. 10 mM의 L-히스티딘 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 중에서 제제화되지 않은 항-LAG3 (~37 mg/mL)을 4가지 10 mM의 히스티딘 pH 5.8 완충제 용액; 각각 150 mM의 L-아르기닌, 150 mM의 염화나트륨, 또는 35 mM의 L-아르기닌 및 35 mM의 염화나트륨의 혼합물, 또는 50 mM의 L-아르기닌 및 50 mM의 염화나트륨의 혼합물을 함유하는 완충제 용액에 대해 투석하였다. 각각의 제제의 투석물을 사용하여 항-LAG3을 25 mg/mL에서 제제화하였다. 40 mM 내지 130 mM의 L-아르기닌 또는 염화나트륨을 함유하는 제제는 각각의 항-LAG3 스톡 용액을 L-히스티딘 완충제 pH 5.8로 희석하고, 항-LAG3을 25 mg/mL로 농축시킴으로써 제조하였다.
Figure pct00041
제2 비리알 계수 (B22) 측정
12가지 제제 각각에 대한 제2 비리알 계수 (B22) 측정을 동적 광 산란 (DLS)을 이용하여 5 mg/mL에서 수행하였다. 자동화 측정을 173˚의 후방산란을 이용하여 20℃에서 수행하였다.
양의 제2 비리알 계수 (B22)는 제제 매트릭스에서 단백질 분자들 사이의 반발성 상호작용 (보다 낮은 군집화)을 시사한다. 40 mM 초과의 농도에서 L-아르기닌 및 염화나트륨 둘 다 분자 군집화를 감소시키는데 유리한 것으로 보였다. 도 18을 참고한다.
혼탁도 (OD 350 ) 측정
제제 매트릭스에서 항-LAG3의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해, 12가지 제제의 혼탁도 (OD350)를 자외선 (UV) 흡광 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 플레이트 흡광에 대해 보정된 경로 확인에 의해 96-웰 코스타 투명 플레이트에서 350 nm 파장에서 샘플의 UV 흡광도를 측정하였다.
항-LAG3은 L-아르기닌 또는 염화나트륨의 농도가 증가함에 따라 개선된 콜로이드 안정성 (OD350)을 나타내었으며, 둘 사이의 값은 유사하였다. 도 19를 참고한다. 항-LAG3 제제 매트릭스에서 동등한 비의 L-아르기닌 및 염화나트륨 (35:35 또는 50:50) 또한 유사한 콜로이드 안정성을 나타내었다.
점도 측정
상이한 제제 매트릭스에서 항-LAG3의 농축가능성을 평가하기 위해, 표 4에 열거된 12가지 항-LAG3 제제를 15℃에서 3000 rpm의 에펜도르프 원심분리를 이용하여 60 mg/mL까지 농축시켰다. 12가지 제제의 점도를 96-웰 플레이트 상에서 레오센스 VROC® 이니튬(RheoSense VROC® Initium) 점도계를 사용하여 20℃에서 측정하였다.
L-아르기닌 또는 염화나트륨 혼합물의 존재하에 60 mg/mL에서 항-LAG3의 점도는 40 내지 150 mM의 농도 범위에서 유사하였다. 동등한 비의 L-아르기닌 및 염화나트륨 (35:35 또는 50:50)의 존재하에 60 mg/mL에서의 점도는 유사한 점도 값을 나타내었다. 도 20을 참고한다.
삼투질 농도 측정
항-LAG3의 삼투질 농도를 바프로(Vapro) 증기압 5520 삼투압계를 사용하여 측정하였다. 측정하기 전에 단위를 100 mmol/kg, 290 mmol/kg 및 1000 mmol/kg 보정 표준으로 보정하였다.
표 4에 열거된 12가지 항-LAG3 제제의 삼투질 농도는 L-아르기닌 또는 염화나트륨의 존재하에 유사한 것으로 확인되었다. 동등한 비의 L-아르기닌 및 염화나트륨 (50:50)의 존재하에 삼투질 농도는 유사한 점도 값을 나타낸 반면에, 35:35의 동등한 비는 보다 낮은 삼투질 농도 값을 나타내었다. 도 21을 참고한다.
실시예 10: 하전된 종 (염 및 아미노산)에 의한 예비-제제 스크리닝
하전된 종 (염 및 아미노산)의 존재하에 항-LAG3의 안정성을 평가하기 위해, 표 5에 열거된 10가지 제제를 제조하였고, 고처리량 분석에 의해 항-LAG3의 물리화학적 성질에서의 변화에 대해 스크리닝하였다. 제제를 96-웰 플레이트에서 적절하게 밀봉하고, 50℃에서 10 일 동안 건식 열 오븐에서 스트레스를 가하였다. 열 스트레스를 가한 샘플 또한 항-LAG3의 물리화학적 성질 변화에 대해 평가하였다. 20 mM 농도의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산을 그들의 용해도 한계를 기준으로 하여 선택하였다.
Figure pct00042
혼탁도 (OD 350 )에 대한 프로토콜
9가지 제제의 혼탁도 (OD350)를 자외선 (UV) 흡광 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 플레이트 흡광에 대해 보정된 경로 확인에 의해 96-웰 코스타 투명 플레이트에서 350 nm 파장에서 샘플의 UV 흡광도를 측정하였다.
도 37에 도시된 바와 같이, 열 스트레스를 가할 때, 항-LAG3의 콜로이드 안정성 (OD350)에서의 변화는 40 mM의 염화나트륨 또는 L-아르기닌과 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산 사이에서 유사하였다. 유사하게, 70 mM의 염화나트륨 또는 L-아르기닌에 의한 항-LAG3의 콜로이드 안정성 (OD350)에서의 변화는 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산과 50 mM 글리신 (70 mM 총 강도)의 조합과 유사하였다. 40 mM 또는 70 mM의 L-히스티딘의 존재하에 항-LAG3의 콜로이드 안정성 (OD350)에서의 변화는 비교적 높았다.
UP-SEC
샘플의 순도를 UP-SEC에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. UP-SEC를 이동상 (100 mM 포스페이트, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 액퀴티 H 클래스 (DS) 상에서 수행하였다. 컬럼 온도를 25 ± 3℃로 유지하였고, 등용매 용리를 이용하여 유속을 0.5 mL/min으로 유지하였다. 희석된 샘플을 워터스 BEH200 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 UPLC에 주사하였다 (1 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
도 38에 도시된 바와 같이, 열 스트레스를 가할 때, 항-LAG3에 대한 가용성 응집물 수준 (% 고분자량 종, HMW)에서의 변화 및 % 단량체에서의 변화를 40 내지 70 mM 염화나트륨과 20 내지 70 mM 아미노산 단독 및 일부 조합 사이에서 비교하였다. 저분자량 종에서의 변화는 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산, 40 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 염화나트륨, 및 20 mM의 L-아스파르트산 및 50 mM의 글리신 조합의 경우에 비교적 낮았다.
cIEF
L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3의 하전된 이질성 및 등전점 (pI)에서의 변화를 프로테인심플의 모세관 등전점 전기영동 (cIEF) 시스템을 이용하여 평가하였다. 모세관에 주사하기 전에, 샘플을 담체 양쪽성 전해질과 혼합하였다. 모세관에 전기장을 인가함으로써, 모세관에서 담체 양쪽성 전해질에 의해 pH 구배를 생성하였고, 단백질 분자를 국부적 pH 값이 등전위 pH (pI) 값과 동일한 모세관에서의 위치로 이동시켰다. iCE 시스템 (프로테인심플로부터의 iCE3)을 이용하여 전체 모세관을 완전히 스캔함으로써 분리된 단백질의 검출을 달성하였다. 장비로 찍은 마지막 영상을 데이터 정량화를 위해 사용하였다. 분해된 피크의 면적 백분율은 개별 종의 면적을 단백질의 총 면적으로 나눔으로써 추정된다. 단백질의 pI 값은 단백질을 협차하는 2개의 pI 마커 사이의 거리를 선형으로 보정함으로써 추정된다. 작업 파라미터에는 10℃의 오토샘플러 온도; 플루오로카본 (FC) 코팅된 카트리지, 280 nm의 검출 파장, 1500 V에서 1 분의 초점조절 기간이 포함되었다. 도 39에서의 데이터는 초기와 비교하여 열 스트레스를 가할 때 % 산성 변이체에서의 변화 (차이), 주요 피크에서의 % 변화, 뿐만 아니라 염기성 변이체에서의 % 변화를 보고한다.
도 39에 도시된 바와 같이, 항-LAG3의 % 산성 변이체 및 주요 피크에서의 변화는 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산, 40 mM의 L-히스티딘 및 40 mM의 L-아르기닌 사이에서 유사하였다. 상기 변화는 40 mM의 염화나트륨의 경우에 가장 낮았다. 유사하게, 70 mM에서 % 산성 변이체 및 주요 피크에서의 변화는 L-히스티딘, 및 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산과 50 mM의 글리신의 조합 사이에서 유사하였다. 상기 변화는 70 mM의 염화나트륨 및 70 mM의 L-아르기닌에서 가장 낮았다. % 염기성 변이체에서의 변화는 표 5에 열거된 10가지 모든 제제의 경우에 최소였다.
DLS
수력학적 직경의 측정을 96 웰 유리 바닥 플레이트 상에서 와이어트(Wyatt) 동적 광 산란 (DLS) 장비를 사용하여 수행하였다. 샘플을 5 mg/mL의 단백질 농도로 희석하고, 20℃에서 158˚의 산란 검출을 이용하여 자동화 모드로 작동시켰고, 5회의 측정에 대한 작동 시간은 5 초였다.
도 40에 도시된 바와 같이, 항-LAG3의 직경에서의 % 변화는 20 mM의 L-아스파르트산 또는 L-글루탐산 및 50 mM의 글리신과의 그의 조합의 경우에 최소였다. 직경에서의 변화는 염화나트륨 (40 내지 70 mM), L-아르기닌 (40 내지 70 mM) 및 L-히스티딘 (40 내지 70 mM)의 경우 6 내지 11%이었고, 검정 변동성 내에 있었다.
실시예 11: 안정화제 스크리닝
당 및 폴리올과 같은 상이한 안정화제의 존재하에 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 중에서 또는 70 mM 염화나트륨 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)의 안정성을 평가하기 위해, 11가지 제제를 표 6에 열거된 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00043
초고성능 크기-배제 크로마토그래피 (UP-SEC)
샘플의 순도를 UP-SEC에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. UP-SEC를 이동상 (100 mM 포스페이트, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC 시스템 H-클래스 바이오 상에서 수행하였다. 컬럼 온도를 25 ± 3℃로 유지하였고, 등용매 용리를 이용하여 유속을 0.5 mL/min으로 유지하였다. 희석된 샘플을 워터스 BEH200 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 UPLC에 주사하였다 (5 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
도 24에 도시된 바와 같이, 항-LAG3의 고분자량 종에서의 % 변화 및 % 단량체 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8, 70 mM의 L-아르기닌 중에서 25 mg/mL)는 안정화제, 예컨대 수크로스, 트레할로스, PEG 400 및 글리세롤의 존재하에 보다 낮은 것으로 확인되었다. 상기 효과는 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 중에서 25 mg/mL) 단독에 비해 보다 높은 수크로스 및 트레할로스 농도 (9% w/v)에서 현저하였다. 유사하게, 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8, 70 mM 염화나트륨 중에서 25 mg/mL)의 고분자량 종에서의 % 변화 및 % 단량체는 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘 pH 5.8, 70 mM 염화나트륨 중에서 25 mg/mL) 단독에 비해 수크로스의 존재하에 보다 낮은 것으로 확인되었고, 보다 높은 수크로스 및 트레할로스 농도에서 (9% w/v) 현저한 효과를 가졌다.
하전된 종에서의 변화 (cIEF)
L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3의 하전된 이질성 및 등전점 (pI)에서의 변화를 프로테인심플의 모세관 등전점 전기영동 (cIEF) 시스템을 이용하여 평가하였다. 모세관에 주사하기 전에, 샘플을 담체 양쪽성 전해질과 혼합하였다. 모세관에 전기장을 인가함으로써, 모세관에서 담체 양쪽성 전해질에 의해 pH 구배를 생성하였고, 단백질 분자를 국부적 pH 값이 등전위 pH (pI) 값과 동일한 모세관에서의 위치로 이동시켰다. iCE 시스템 (프로테인심플로부터의 iCE3)을 이용하여 전체 모세관을 완전히 스캔함으로써 분리된 단백질의 검출을 달성하였다. 장비로 찍은 마지막 영상을 데이터 정량화를 위해 사용하였다. 분해된 피크의 면적 백분율은 개별 종의 면적을 단백질의 총 면적으로 나눔으로써 추정된다. 단백질의 pI 값은 단백질을 협차하는 2개의 pI 마커 사이의 거리를 선형으로 보정함으로써 추정된다. 작업 파라미터에는 10℃의 오토샘플러 온도; 플루오로카본 (FC) 코팅된 카트리지, 280 nm의 검출 파장, 1500 V에서 1 분의 초점조절 기간이 포함되었다.
11가지 제제를 2 mL 멸균성 바이알에 충전하고 (2.0 mL 충전), 밀봉하고, 캡핑하고, 시각적으로 검사하였다. 11가지 제제의 초기 시점에는 2 내지 8℃에서 (빛으로부터 보호하여) 보관하였고, 열-스트레스를 가하기 위한 샘플은 건식 열 오븐에서 50℃에서 10 일 동안 빛으로부터 보호하면서 컨테이너에 거꾸로 두었다. 도 25의 데이터는 초기와 비교하여 열 스트레스를 가할 때 % 산성 변이체에서의 변화 (차이), 주요 피크에서의 % 변화, 뿐만 아니라 염기성 변이체에서의 % 변화를 보고한다.
도 25에 도시된 바와 같이, 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)은 5% 수크로스의 존재하에 감소된 화학적 경향을 나타내었다. 트레할로스 (5% w/v 및 10% w/v), 소르비톨, PEG 400, 및 글리세롤의 안정화 효과는 유사하였다. 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM 염화나트륨 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)은 수크로스의 부재하에 보다 양호한 화학적 안정성을 나타내었다.
DSC
표 6에 열거된 항-LAG3의 11가지 제제의 열 용량 (cp) (kcal/℃)을 시차 주사 미세열량측정 (DSC)을 이용하여 1 mg/mL에서 측정하였다. 11가지 제제에 대한 Tm1, Tm2 및 T개시를 cp (cal/mol/℃) 대 온도 (℃)의 플롯으로부터 측정하였다.
도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, Tm1, Tm2 및 T개시 값을 기반으로 하여, 수크로스 및 트레할로스 (각각 5% w/v 내지 9% w/v에서)는 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)에 대해서 뿐만 아니라 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM 염화나트륨 pH 5.8 중에서 25 mg/mL)에 대해서 안정화 효과를 가졌다. 소르비톨, PEG 400 및 글리세롤의 안정화 효과는 유사하였다.
실시예 12: 폴리소르베이트 농도 범위 연구
제제 매트릭스 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, pH 5.8 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)에서 폴리소르베이트 80의 최적의 농도를 결정하기 위해, 표 7에 나타낸 바와 같이 각각 폴리소르베이트를 0 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 범위로 함유하는 8가지 상이한 제제를 제조하였다. 상기 제제를 300 rpm에서 7 일까지 진탕에 노출시켰다. 2가지 제제는 위약으로 이루어졌다 (항-LAG3이 없는 동일한 제제 매트릭스, 즉, 표 7의 제제 #1에서 0.1 mg/mL 또는 1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80).
Figure pct00044
Figure pct00045
혼탁도
상이한 농도의 폴리소르베이트 80을 함유하는 제제 매트릭스에서 항-LAG3의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해, 8가지 제제의 혼탁도 (OD350)를 자외선 (UV) 흡광 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 플레이트 흡광에 대해 보정된 경로 확인에 의해 96-웰 코스타 투명 플레이트에서 350 nm 파장에서 샘플의 UV 흡광도를 측정하였다.
도 27에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리소르베이트 80의 부재하에, 제제 매트릭스 중의 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, pH 5.8 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)은 진탕시에 혼탁도에서의 증가를 나타내었다. 제제 매트릭스 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, pH 5.8 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)에서 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 농도의 존재하에, 항-LAG3은 안정한 것으로 확인되었다. 0.1 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 위약의 콜로이드 안정성에는 영향이 없었다.
UP-SEC
샘플의 순도를 UP-SEC에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. UP-SEC를 이동상 (0.1M 인산나트륨 일염기성 일수화물, 0.1 M 인산나트륨 이염기성 이수화물, 0.1M L-아르기닌, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 워터스 액퀴티 액체 크로마토그래피 시스템 상에서 수행하였다. 희석된 샘플을 단백질 BEH SEC 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 액체 크로마토그래피에 주사하였다 (5 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
도 28에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리소르베이트 80 (0.1 내지 1.0 mg/mL 농도)의 존재하에서는 가용성 응집물 수준 (% 고분자량 종) 또는 단편화 (% 저분자량 종)에서의 변화 또는 % 단량체에서의 변화가 없었다. 항-LAG3은 제제 매트릭스에서 폴리소르베이트 80의 존재하에 콜로이드 안정한 것으로 확인되었다.
HP-IEX
항-LAG3 제제에서 전하 변이체를 측정하기 위해, 고성능 이온 교환 크로마토그래피 (HP-IEX)를 이용하였다. 디오넥스 맵팩® SCX-10,10 μm 4 x 250 mm 컬럼, 및 25 mM MES, 14 mM 트리스, pH 6.25에서 25 mM MES, 22 mM 트리스, 100 mM LiCl pH 6.85까지의 이동상 구배를 이용하여 분석을 수행하였다. UV 검출을 280 nm에서 수행하였다. 이 방법은 또한 임의적인 스트립핑 완충제 (15 mM EDTA 40 mM 트리스, 10 mM CHES, 500 mM의 NaCl, pH 8.1)를 포함하여, 검정의 신뢰도 및 지속성을 개선시킨다. 샘플을 5 mg/mL에서 10 μL의 주사 부피로 제조하였다.
도 29에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리소르베이트 80 (0.1 내지 1.0 mg/mL 농도)의 존재하에서는 하전된 종 수준 (% 산성 변이체, % 주요 피크, % 염기성 변이체)에서의 변화가 없었다. 항-LAG3은 제제 매트릭스에서 폴리소르베이트 80의 존재하에 콜로이드 안정한 것으로 확인되었다.
실시예 13: 항산화제 스크리닝
제제 중의 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, pH 5.8 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)에 대한 항산화제의 효과를 측정하기 위해, 3가지 상이한 수준의 L-메티오닌을 제제에서 평가하였다. 4가지 상이한 제제를 표 8에 열거된 바와 같이 제조하고, 2 mL의 유형 1 유리 바이알에 충전하고 (2.2 mL), 적절하게 밀봉하였다. 4가지 제제를 0.2 ICH, 0.5 ICH, 및 1ICH 광 스트레스 (자외선 및 차가운 백색광 또는 가시광)에 노출시켰다. 4가지 제제 각각에 대한 어두운 대조군 (호일로 둘러쌈) (대조군) 또한 1 이하의 ICH 광 스트레스에 노출시켰다.
Figure pct00046
혼탁도
4가지 제제의 혼탁도 (OD350)를 자외선 (UV) 흡광 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 플레이트 흡광에 대해 보정된 경로 확인에 의해 96-웰 코스타 투명 플레이트에서 350 nm 파장에서 샘플의 UV 흡광도를 측정하였다.
도 30에서 볼 수 있는 바와 같이, L-메티오닌 (5 mM 내지 10 mM)은 표 8에 열거된 바와 같이 대조군에 비해 항-LAG3 (25 mg/mL의 항-LAG3, 10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)을 콜로이드 안정화시키는 것으로 확인되었으며, 최적의 양은 10 mM의 L-메티오닌이었다. 1 ICH 광 노출시 어두운 대조군 샘플의 경우에는 콜로이드 불안정성에 대한 영향이 없었다.
UP-SEC
샘플의 순도를 UP-SEC에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. UP-SEC를 이동상 (100 mM 포스페이트, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 UPLC 액퀴티 H 클래스 시스템 상에서 수행하였다. 희석된 샘플을 단백질 BEH SEC 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 액체 크로마토그래피에 0.5 mL/min의 유속으로 주사하였다 (5 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm 및 280 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
도 31에서 볼 수 있는 바와 같이, L-메티오닌 (5 mM 내지 10 mM)은 표 8에 열거된 대조군과 비교하여 항-LAG3 제제 (25 mg/mL의 항-LAG3, 10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌, 5% w/v 수크로스, pH 5.8)에서 가용성 응집물 형성 (%HMW)을 감소시키는 것으로 확인되었고, 10 mM의 L-메티오닌이 최적의 양이었다. 1 ICH 광 노출시 어두운 대조군 샘플에서는 가용성 응집물이 형성되지 않는 것으로 확인되었다.
HP-IEX
항-LAG3 제제에서 전하 변이체를 측정하기 위해, 고성능 이온 교환 크로마토그래피 (HP-IEX)를 이용하였다. 디오넥스 맵팩® SCX-10,10 μm 4 x 250 mm 컬럼, 및 25 mM MES, 14 mM 트리스, pH 6.25에서 25 mM MES, 22 mM 트리스, 100 mM LiCl pH 6.85까지의 이동상 구배를 이용하여 분석을 수행하였다. UV 검출을 280 nm에서 수행하였다. 이 방법은 또한 임의적인 스트립핑 완충제 (15 mM EDTA 40 mM 트리스, 10 mM CHES, 500 mM의 NaCl, pH 8.1)를 포함하여, 검정의 신뢰도 및 지속성을 개선시킨다. 샘플을 5 mg/mL에서 10 μL의 주사 부피 및 0.5 내지 1.0 mL/min의 유속으로 제조하였다.
도 32에서 볼 수 있는 바와 같이, 5 mM 내지 10 mM의 L-메티오닌이 대조군과 비교하여 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)에 대해 1 이하의 ICH 광 노출시 하전된 종 (% 산성 변이체 및 % 염기성 변이체)에서의 증가를 감소시키는데 효과적인 것으로 확인되었다. 1 ICH 어두운 대조군 샘플의 경우에는 하전된 종에 대한 영향이 없었다.
환원된 펩티드 맵핑
항-LAG3의 산화적인 번역후 변형의 산화 수준에서의 변화를 환원된 펩티드 맵핑을 이용하여 평가하였다. 환원된 펩티드 맵핑을 이동상 A (LC/MS 등급 물 중에서 0.1% 트리플루우로아세트산), 이동상 B (LC/MS 등급 아세토니트릴 중에서 0.1% 트리플루오로아세트산)를 사용하여 워터스 액퀴티 H 바이오 클래스 시스템 상에서 수행하였다. 주사 부피는 50 μL이었고, 0.2 mL/min의 유속 및 214 nm의 검출 흡광도를 갖는 HALO 펩티드 ES-C18 컬럼을 구비하였다. 질량 분광분석은 모세관 3.0, 30의 샘플 콘, 120℃의 공급물 온도, 콘 기체 30, 탈용매화 기체, 100-200의 m/z 범위, 2 내지 110 분에서 수집된 MS로 이루어졌다. 샘플을 컬럼 작동 이전에 적절한 시약으로 환원시키고 알킬화시켰다. 블랭크 (샘플-없음) 소화를 수행하여, 관심 영역에서 용리하는 샘플-없음 관련 피크를 확인하였다.
도 33에서 볼 수 있는 바와 같이, 5 mM 내지 10 mM의 L-메티오닌은 대조군과 비교하여 1 ICH 광 노출시 항-LAG3 (10 mM의 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드, 5% w/v 수크로스, 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80 중에서 25 mg/mL의 항-LAG3)의 번역후 변형의 산화를 감소시키는데 효과적인 것으로 확인되었다.
실시예 14: 항-LAG3의 고농도 연구
pH 5.8의 3가지 상이한 완충제 (히스티딘, 아세테이트 및 시트레이트; 각각 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드를 함유함) 중에서 및 상이한 안정화제의 존재하에서 L-히스티딘, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8을 함유하는 제제에서 항-LAG3의 고농도 (200 mg/mL) 실행가능성을 평가하기 위해, 9가지 제제를 표 9에 열거된 바와 같이 제조하였다. 각각의 9가지 제제를 96-웰 플레이트에 충전하고, 적절하게 밀봉하였다. 상기 제제에 50℃에서 10 일 동안 건식 열 오븐에서 스트레스를 가하였다. 초기의 및 스트레스를 가한 샘플에 대해 분석을 수행하였다.
Figure pct00047
혼탁도
9가지 제제의 혼탁도 (OD350)를 자외선 (UV) 흡광 분광광도계를 사용하여 평가하였다. 플레이트 흡광에 대해 보정된 경로 확인에 의해 96-웰 코스타 투명 플레이트에서 350 nm 파장에서 샘플의 UV 흡광도를 측정하였다.
도 34에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-LAG3 (10 mM L-히스티딘 70 mM의 L-아르기닌, pH 5.8 중에서 200 mg/mL의 항-LAG3)의 콜로이드 안정성 (OD350)은 대조군 (10 mM L-히스티딘 70 mM의 L-아르기닌, pH 5.8 중에서 200 mg/mL의 항-LAG3)과 비교할 때 안정화제로서 70 mM의 L-메티오닌의 존재하에 더욱 낮았다. 200 mg/mL의 항-LAG3 제제 중에서 70 mM의 L-글루타민 및 70 mM의 프롤린의 안정화 효과 (콜로이드)는 유사하다. 유사하게, 200 mg/mL의 항-LAG3 제제 중에서 5% w/v의 글리세롤 및 70 mM의 L-글리신의 안정화 효과 (콜로이드)는 유사하다. 200 mg/mL의 항-LAG3의 콜로이드 안정성은 5% w/v의 수크로스의 존재하에 비교적 높았다.
UP-SEC
샘플의 순도를 UP-SEC에 의해 평가하였고, 단량체의 백분율 뿐만 아니라 고분자량 종 (HMW)의 백분율 및 늦은 용리 피크 (LMW 종)를 측정하였다. UP-SEC를 이동상 (100 mM 포스페이트, 100 mM 염화나트륨, pH 7.0)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석함으로써 액퀴티 H 클래스 (DS) 상에서 수행하였다. 컬럼 온도를 25 ± 3℃로 유지하였고, 등용매 용리를 이용하여 유속을 0.5 mL/min으로 유지하였다. 희석된 샘플을 단백질 BEH200 컬럼 및 UV 검출기를 구비한 UPLC에 주사하였다 (5 μL). 샘플 중의 단백질을 크기별로 분리하고, 214 nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
도 35에서 볼 수 있는 바와 같이, 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드의 존재하에 10 mM의 L-히스티딘 완충제는 고농도의 항-LAG3 제제 (200 mg/mL)에 대해 10 mM의 L-아세테이트 또는 10 mM의 시트레이트 완충제에 비해 가용성 응집물 수준을 감소시키는데 효과적이다. 추가로 5% (w/v) 수크로스는 가용성 응집물 수준을 감소시키는데 있어서 안정화제로서 효과적이고, 이어서 5% (w/v) 글리세롤이다. 아미노산, 즉, 70 mM의 L-글루타민, 70 mM의 L-글리신, 70 mM의 프롤린 및 70 mM의 L-메티오닌의 안정화 효과는 유사하다.
하전된 종에서의 변화 (cIEF)
L-아르기닌, L-히스티딘 또는 염화나트륨의 존재하에 항-LAG3의 하전된 이질성 및 등전점 (pI)에서의 변화를 프로테인심플의 모세관 등전점 전기영동 (cIEF) 시스템을 이용하여 평가하였다. 모세관에 주사하기 전에, 샘플을 담체 양쪽성 전해질과 혼합하였다. 모세관에 전기장을 인가함으로써, 모세관에서 담체 양쪽성 전해질에 의해 pH 구배를 생성하였고, 단백질 분자를 국부적 pH 값이 등전위 pH (pI) 값과 동일한 모세관에서의 위치로 이동시켰다. iCE 시스템 (프로테인심플로부터의 iCE3)을 이용하여 전체 모세관을 완전히 스캔함으로써 분리된 단백질의 검출을 달성하였다. 장비로 찍은 마지막 영상을 데이터 정량화를 위해 사용하였다. 분해된 피크의 면적 백분율은 개별 종의 면적을 단백질의 총 면적으로 나눔으로써 추정된다. 단백질의 pI 값은 단백질을 협차하는 2개의 pI 마커 사이의 거리를 선형으로 보정함으로써 추정된다. 샘플을 5 mg/mL에서 제조하였고, 작업 파라미터에는 10℃의 오토샘플러 온도; 플루오로카본 (FC) 코팅된 카트리지, 280 nm의 검출 파장, 1500 V에서 1 분의 초점조절 기간이 포함되었다.
200 mg/mL의 항-LAG3의 화학적 안정성은 70 mM의 L-아르기닌 히드로클로라이드 pH 5.8의 존재하에 10 mM의 아세테이트 완충제와 비교하여 10 mM의 L-히스티딘 뿐만 아니라 10 mM의 시트레이트 완충제 중에서 유사하였다. 5% (w/v) 글리세롤은 하전된 종 (% 산성 및 염기성 변이체)에서의 변화를 감소시키는데 효과적이었고, 이어서 5% (w/v) 수크로스 (% 염기성 변이체)이었다. 아미노산, 즉, 70 mM의 L-글루타민, 70 mM의 L-글리신, 70 mM의 프롤린 및 70 mM의 L-메티오닌의 안정화 효과는 유사하였다.
실시예 15: 항-PD-1 및 항-LAG3 항체의 공동-제제의 안정성 연구
항-PD-1 항체 (중쇄 서열식별번호: 10 및 경쇄 서열식별번호: 5) 및 항-LAG3 항체 (중쇄 서열식별번호: 57 및 경쇄 서열식별번호: 37)의 공동-제제를 표 10에 제시하였다.
표 10
Figure pct00048
열 안정성 연구
열 안정성 연구를 13 mm 혈청 스토퍼를 갖는 2 mL의 바이알에서 5℃ (주위 습도), 25℃ (60% 습도) 및 40℃ (75% 상대 습도) 보관 조건에서 12 주까지 F1-F6의 1.0 mL 액체 제제를 사용하여 수행하였다. 안정성 샘플을 혼탁도 및 혼합-모드 크로마토그래피 (MMC)에 의해 평가하였다.
혼합-모드 크로마토그래피
혼합-모드 크로마토그래피는 공동-제제에서 개별 항체 (항-LAG3 및 항-PD1)의 분리를 가능하게 하였고, 또한 공동-제제에서 항-LAG3 응집물 및 항-PD1 응집물 및 산화의 모니터링을 가능하게 하였다. MMC에서, 각각의 mAb에 대한 단량체의 백분율을 각각의 mAb의 주요 피크 면적에 의해 결정하였다. 항-LAG3의 경우, 고분자 (응집물) 및 저분자 종 (단편)의 백분율을 계산하였다. 항-PD1의 경우, 고분자 (응집물) 및 저분자 종 (단편) 뿐만 아니라 산화 종 (Ox1 및 Ox2)의 백분율을 각각의 종에 상응하는 개별 피크 면적을 기준으로 하여 계산하였다. 혼합-모드 크로마토그래피는 이동상 (PBS, pH7.4)에서 샘플을 1.0 mg/mL로 희석시킴으로써 수행하였다. 컬럼 온도는 25℃로 유지하였고, 등용매 용리를 이용하여 유속을 0.5 mL/min으로 유지하였다. 희석된 샘플을 맞춤형 세팍스 제닉스(Sepax Zenix) SEC-300 컬럼을 구비한 HPLC에 주사하였다 (15 μL). 샘플 중에서 상이한 성분을 크기 및 소수성 둘 다에 의해 분리하고, 280nm에서 UV 흡수에 의해 검출하였다.
혼탁도 측정
스펙트라맥스 M5 플레이트 판독기 상에서 350 nm 및 500 nm의 분광광도법적 흡광도에서 열 안정성 샘플에 대해 혼탁도 분석을 수행하였다.
결론
공동-제제 (F3, F5 및 F6)은 개별 제제에 비해 유사하거나 또는 보다 양호한 안정성을 나타내었다 (도 22 및 23). 제제 F2는 40℃ 보관에서 제제 F4에 비해 비교적 적은 혼탁도 및 단량체 손실을 나타내었고, 이는 항-PD1이 항-LAG3 제제에서 보다 양호한 안정성을 보여줌을 나타낸다 (도 22 및 23). F5 및 F6 공동-제제는 개별 제제에 비해 40℃에서 12 주 보관후에 시간에 걸쳐 단량체에서 최소의 변화를 나타내었다. L-메티오닌은 공동-제제 (F5, F6)에서 단량체 손실을 최소화하는데 도움이 되었다 (도 23).
SEQUENCE LISTING <110> Merck Sharp & Dohme Corp. Desai, Preeti G. Shi, Shuai Antochshuk, Valentyn Burlage, Rubi Raghava, Smita <120> FORMULATIONS OF ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND CO-FORMULATIONS OF ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES <130> 24451-WO-PCT <150> US 65/500,330 <151> 2017-05-02 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Pembrolizumab-Light chain CDR1 <400> 1 Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pembrolizumab-Light chain CDR2 <400> 2 Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pembrolizumab-Light chain CDR3 <400> 3 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pembrolizumab-Light chain variable region <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu 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Claims (54)

  1. 약 5-300 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 10-1000 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 및 FeCl2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함하는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 10-250 mg/ml의 농도의 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 15-300 mM의 총 농도의 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, NaCl, KCl, LiCl로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제, 및 pH 약 5.0-6.5의 완충제를 포함하는 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 15-250 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 40-100 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 20-250 mM의 총 농도를 갖는 NaCl 및 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염의 조합인 제제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 약 40-150 mM의 NaCl, KCl 또는 LiCl인 제제.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 약 15-200 mM의 L-히스티딘, L-아스파르테이트, L-글루타민 또는 L-글리신인 제제.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 부형제가 약 40-100 mM의 L-히스티딘인 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제 또는 시트레이트 완충제인 제제.
  10. 제9항에 있어서, 완충제가 약 1-300 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 당 또는 폴리올, 및 비이온성 계면활성제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 제제.
  12. 제11항에 있어서, 당이 비환원성 이당류인 제제.
  13. 제12항에 있어서, 당이 트레할로스 또는 수크로스, 또는 이들의 조합인 제제.
  14. 제11항에 있어서, 폴리올이 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 당 또는 폴리올이 약 10-200 mg/ml의 농도를 갖는 것인 제제.
  16. 제11항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트인 제제.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80으로부터 선택된 계면활성제, 및 수크로스 및 트레할로스로부터 선택된 당, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 제제.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10-250 mg/mL의 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤; 약 0.005-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 및 약 3-300 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 30-120 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 및 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 50-90 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 및 약 5-30 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0-6.5를 추가로 포함하는 제제.
  21. 제11항에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50-90 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 5-20 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 및 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  22. 제11항에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-200 mg/mL의 글리세롤, 소르비톨 또는 PEG400; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 및 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-150 mM의 L-글루타민, L-글리신, L-프롤린 또는 L-메티오닌; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 및 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 20-220 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-150 mM의 L-히스티딘, 아세테이트 또는 시트레이트 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 및 약 40-150 mM의 NaCl 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 3-150 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5-70 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 L-히스티딘 완충제 pH 약 5.8-6.0; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 L-아르기닌-HCl을 포함하는 제제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 제제인 제제.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 -70℃ 미만으로 냉동된 제제.
  31. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 제제로부터 재구성된 액제인 제제.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체가 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%인 제제.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 산성 변이체가 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 15% 미만인 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편이 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것인 제제.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LAG3 항체가 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 제제.
  37. 제36항에 있어서, 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 몰비가 1:1인 제제.
  38. 제36항에 있어서, 항-LAG3 항체 및 항-PD-1 항체의 몰비가 1:1, 2:1, 3:1 또는 3.5:1인 제제.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 1의 CDRL1, 서열식별번호: 2의 CDRL2 및 서열식별번호: 3의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 6의 CDRH1, 서열식별번호: 7의 CDRH2 및 서열식별번호: 8의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 것인 제제.
  40. 제39항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
  41. 제39항에 있어서, 항-PD-1 항체가 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10-120 mg/mL의 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약 10-120 mg/mL의 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
  43. 서열식별번호: 39의 CDRL1, 서열식별번호: 40의 CDRL2, 서열식별번호: 41의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 42의 CDRH1, 서열식별번호: 59의 CDRH2, 서열식별번호: 44의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 서열식별번호: 1의 CDRL1, 서열식별번호: 2의 CDRL2, 서열식별번호: 3의 CDRL3을 포함하는 가변 경쇄 영역, 및 서열식별번호: 6의 CDRH1, 서열식별번호: 7의 CDRH2 및 서열식별번호: 8의 CDRH3을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 25-250 mM 농도의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 pH 약 5-8의 완충제를 포함하는 제제.
  44. 제43항에 있어서, 항-LAG3 항체 또는 항원 결합 단편이 서열식별번호: 37의 경쇄 가변 영역 서열 및 서열식별번호: 58의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 서열식별번호: 9의 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 4의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제제.
  45. 제43항에 있어서, 항-LAG3 항체가 서열식별번호: 35의 경쇄 서열 및 서열식별번호: 57의 중쇄 서열을 포함하고, 항-PD-1 항체가 서열식별번호: 10의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 5의 경쇄 서열을 포함하는 것인 제제.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10-120 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 10-120 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 30-120 mg/mL의 비환원성 이당류; 약 0.05-2.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; pH 약 5.0 - 6.5의 완충제; 및 약 40-150 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20-30 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 20-30 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 50-90 mg/mL의 수크로스 또는 트레할로스; 약 0.05-1.0 mg/mL의 폴리소르베이트 80 또는 20; 약 3-30 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5.0 - 6.5; 및 약 40-100 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3-100 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
  49. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5-15 mM의 L-메티오닌을 추가로 포함하는 제제.
  50. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25 mg/mL의 항-LAG3 항체; 약 25 mg/mL의 항-PD-1 항체; 약 50 mg/mL의 수크로스; 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80; 약 10 mM의 히스티딘 완충제 pH 약 5.8; 약 70 mM의 L-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염; 및 약 10 mM의 L-메티오닌을 포함하는 제제.
  51. 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 단량체가 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 ≥ 95%인 제제.
  52. 제43항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 5℃에서 항-LAG3 항체의 % 산성 변이체가 이온 교환 크로마토그래피에 의해 측정 시 3 개월 후에 15% 미만인 제제.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는 용기 또는 주사 기기.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 감염의 치료를 위한 제제.
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