CN106999561A - 用于治疗前列腺癌的pd‑1拮抗剂和基于李斯特菌的疫苗的组合 - Google Patents

用于治疗前列腺癌的pd‑1拮抗剂和基于李斯特菌的疫苗的组合 Download PDF

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Abstract

本公开描述了组合疗法以及所述组合疗法治疗前列腺癌的用途，所述组合疗法包括程序性死亡1受体(PD‑1)的拮抗剂和表达前列腺组织特异性抗原(PSA)的基于李斯特菌的菌株。

Description

用于治疗前列腺癌的PD-1拮抗剂和基于李斯特菌的疫苗的 组合
技术领域
本发明涉及可用于治疗癌症的组合疗法。具体地讲，本发明涉及程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂与减毒活重组李斯特菌(Listeria)菌株组合用于治疗前列腺癌，该减毒活重组李斯特菌菌株包含含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽融合至肿瘤相关抗原而形成的融合蛋白。
背景技术
PD-1被认为在免疫调节和外周耐受维持中发挥着重要作用。PD-1在未暴露的T、B和NKT细胞上中度表达，并且通过淋巴细胞、单核细胞和骨髓细胞上的T/B细胞受体信号转导而上调(1)。
PD-1、PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)的两个已知配体在各种组织中产生的人类癌症中表达。在大量例如卵巢癌、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和黑素瘤样品组中，据显示PD-L1表达与预后差和总体存活率下降相关，不论后续治疗如何(2-13)。相似地，据发现肿瘤浸润性淋巴细胞上的PD-1表达是乳腺癌和黑素瘤中T细胞功能异常的标志(14-15)，并且与肾癌的预后差相关(16)。因此，已提出PD-L1表达性肿瘤细胞与PD-1表达性T细胞相互作用，以减弱T细胞活化和逃避免疫监视，从而造成削弱的对肿瘤的免疫应答。
抑制PD-1与其配体PD-L1和PD-L2中的一者或两者之间的相互作用的多个单克隆抗体正在临床开发中以用于治疗癌症。已提出，如果与其他已批准的或实验中的癌症疗法例如放疗、外科手术、化疗剂、靶向疗法、抑制肿瘤中失调的其他信号转导通路的药剂以及其他免疫增强剂组合施用，可增强此类抗体的功效。
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Lm)是导致李斯特菌溶血的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。一旦侵入宿主细胞，Lm即可通过产生裂解血管膜的成孔蛋白李斯特菌溶血素0(LLO)而逃离吞噬溶酶体，使其进入细胞质，在细胞质中，根据肌动蛋白多聚化蛋白(ActA)的迁移性而复制并传播到相邻的细胞。在细胞质中，Lm分泌性蛋白被蛋白酶降解，并加工成内质网中与MHC I类分子相关的肽。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供用于治疗人类个体中的前列腺癌的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和减毒活细菌菌株，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对前列腺特异性抗原(PSA)表达细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗人类个体中的前列腺癌的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗人类个体中的前列腺癌的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗人类个体中的前列腺癌的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与减毒活细菌菌株组合使用的PD-1拮抗剂，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的PD-1拮抗剂，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株组合使用的PD-1拮抗剂。在另一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合使用的PD-1拮抗剂。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与PD-1拮抗剂组合使用的减毒活细菌菌株，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与PD-1拮抗剂组合使用的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与PD-1拮抗剂组合使用的LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
在又一个实施例中，本发明提供用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与PD-1拮抗剂组合使用的LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
其他实施例提供使用PD-1拮抗剂制造药剂的用途，该药剂与减毒活细菌菌株组合施用时，用于治疗人类中的前列腺癌，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)，以及使用减毒活细菌菌株制造药剂的用途，该药剂与PD-1拮抗剂组合施用时，用于治疗患者中的前列腺癌，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
其他实施例提供使用PD-1拮抗剂制造药剂的用途，该药剂与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合施用时，用于治疗人类中的前列腺癌，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化，以及使用减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株制造药剂的用途，该药剂与PD-1拮抗剂组合施用时，用于治疗患者中的前列腺癌，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。
其他实施例提供使用PD-1拮抗剂制造药剂的用途，该药剂与LmddA-142(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株组合施用时用于治疗人类中的前列腺癌，以及使用LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株制造药剂的用途，该药剂与PD-1拮抗剂组合施用时，用于治疗患者中的前列腺癌。
其他实施例提供使用PD-1拮抗剂制造药剂的用途，该药剂与LmddA-143(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合施用时，用于治疗人类中的前列腺癌，以及使用LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株制造药剂的用途，该药剂与PD-1拮抗剂组合施用时，用于治疗患者中的前列腺癌。
在又一个实施例中，本发明提供使用PD-1拮抗剂和减毒活细菌菌株制造药剂的用途，该药剂用于治疗患者中的前列腺癌，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。在一些实施例中，该药剂包括试剂盒，并且该试剂盒还包括包装说明书，该包装说明书包括使用PD-1拮抗剂与减毒活细菌菌株组合治疗患者中的前列腺癌的说明，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
在另一个实施例中，本发明提供使用PD-1拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株制造药剂的用途，该药剂用于治疗患者中的前列腺癌，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。在一些实施例中，该药剂包括试剂盒，并且该试剂盒还包括包装说明书，该包装说明书包括使用PD-1拮抗剂与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合治疗患者中的前列腺癌的说明，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。
在又一个实施例中，本发明提供使用PD-1拮抗剂和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株制造药剂的用途，该药剂用于治疗患者中的前列腺癌。在一些实施例中，该药剂包括试剂盒，并且该试剂盒还包括包装说明书，该包装说明书包括使用PD-1拮抗剂与LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株组合治疗患者中的前列腺癌的说明。
在又一个实施例中，本发明提供使用PD-1拮抗剂和LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，KLK3融合至染色体中的hly基因)菌株制造药剂的用途，该药剂用于治疗患者中的前列腺癌。在一些实施例中，该药剂包括试剂盒，并且该试剂盒还包括包装说明书，该包装说明书包括使用PD-1拮抗剂与LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合治疗患者中的前列腺癌的说明。
在所有上述治疗方法、药剂和用途中，PD-1拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合，优选地还抑制PD-L2与PD-1的结合。在上述治疗方法、药剂和用途的一些实施例中，PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1或PD-L1并阻断PD-L1与PD-1的结合。在一个实施例中，PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体，其包含重链和轻链，并且其中重链和轻链包含图6所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)。
在治疗方法、药剂和用途的所有上述实施例中，减毒活细菌菌株包括为减毒营养缺陷型菌株的重组李斯特菌。在一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌菌株载体，该载体因缺失毒力基因actA而为减毒的并保留了质粒，以通过补充dal基因用于融合至PSA抗原多肽的截短LLO(tLLO)在体内和体外表达。在一些实施例中，klk3基因融合至染色体中的hly基因，以用于表达tLLO-PSA融合多肽。在治疗方法、药剂和用途的一些上述实施例中，李斯特菌菌株是单核细胞增多性李斯特菌。在治疗方法、药剂和用途的一些上述实施例中，PSA抗原融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)。在一个实施例中，tLLO是N末端LLO蛋白片段。在一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原直接互相融合。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原通过异源性肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是PSA抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短LLO在C末端截短以得到N末端LLO。在治疗方法、药剂和用途的所有上述实施例中，PSA是前列腺上皮细胞分泌的激肽释放酶丝氨酸蛋白酶(KLK3)，在一个实施例中，它被广泛用作前列腺癌的标记物。在一些实施例中，PSA是全长多肽。在其他实施例中，PSA是全长多肽的一部分。在一个实施例中，PSA抗原由klk3基因编码。
在上述治疗方法、药剂和用途的一些实施例中，减毒活细菌菌株是游离型表达tLLO-PSA融合蛋白的dal(-)dat(-)actA(-)单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，tLLO由LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段为LLO蛋白的非溶血形式。在一个实施例中，PSA由全长蛋白构成。在另一个实施例中，PSA由不足全长蛋白构成。
在本发明的上述治疗方法、药剂和用途的一些实施例中，前列腺癌是转移性的。
在本发明的上述治疗方法、药剂和用途的其他实施例中，前列腺癌是去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
在本发明的上述治疗方法、药剂和用途的其他实施例中，在用至少一种前述治疗剂治疗之后，患者被诊断为转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
另外，在任何上述治疗方法、药剂和用途的一些实施例中，前列腺癌检测呈PD-L1和PD-L2的一者或两者的表达阳性。在一些实施例中，前列腺癌的PD-L1表达升高。
附图说明
图1示出了本发明所用的示例性抗PD-1单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-6)。
图2示出了本发明所用的另一个示例性抗PD-1单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:7-12)。
图3示出了本发明所用的示例性抗PD-1单克隆抗体的重链可变区和全长重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。
图4示出了本发明所用的示例性抗PD-1单克隆抗体的替代轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:15-17)。
图5A和5B示出了本发明所用的示例性抗PD-1单克隆抗体的替代轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:18-20)。图5A示出了K09A-L-11轻链(SEQ ID NO:18)和K09A-L-16轻链(SEQID NO:19)的全长序列。图5B示出了K09A-L-17轻链(SEQ ID NO:20)的全长序列。
图6示出了MK-3475的重链和轻链(分别为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)的氨基酸序列。
图7示出了纳武单抗(nivolumab)的重链和轻链的氨基酸序列(分别为SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24)。
图8示出了klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域示意图；
图9A-9C.图9A示出了pADV134质粒的图谱。图9B和9C示出了用于PSA递送的抗生素独立性游离型表达载体pADV142质粒的图谱，其中抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白(图9B)构成；以及pADV142质粒的核苷酸序列，其中下划线部分编码智人(Homosapiens)激肽释放酶3(前列腺特异性抗原)(图9C)。
图10示出了1-2期研究的两个部分的示意图，该研究设计为评估ADXS31-142(单核细胞增多性李斯特菌(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142))作为单药疗法以及与派姆单抗(pembrolizumab)(MK-3475)组合治疗mCRPC受试者的安全性和耐受性。
具体实施方式
缩写.在整个本发明的具体实施方式和实例中将使用以下缩写：
APC 抗原呈递细胞
BID 每日两次，每次一剂
CBD 胆固醇结合域
CDR 互补决定区
CFU 集落形成单位
CHO 中国仓鼠卵巢
DFS 无病存活期
DTR 剂量限值毒性
FFPE 福尔马林固定石蜡包埋
FR 框架区
IgG 免疫球蛋白G
IHC 免疫组织化学
KLK3 激肽释放酶相关肽酶3；也称为APS、PSA、hK3、KLK2A1
LLO 李斯特菌溶血素O多肽
tLLO 截短李斯特菌溶血素O多肽
Lm 单核细胞增多性李斯特菌
LmddA-142 单核细胞增多性李斯特菌(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)；也称为ADXS31-142
LmddA-143 单核细胞增多性李斯特菌(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)
MTD 最大耐受剂量
NCBI 美国国家生物技术信息中心
NCI 美国国家癌症研究所
OR 总应答
ORF 开放阅读框
OS 总体存活率
PCR 聚合酶链式反应
PD 进行性疾病
PSA 前列腺特异性抗原
PFS 无进展存活期
PR 部分应答
Q2W 两周一次，每次一剂
Q3W 三周一次，每次一剂
Q4W 四周一次，每次一剂
QD 每天一次，每次一剂
RECIST 实体肿瘤的应答评估标准
SD 稳定疾病
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
TIL 肿瘤浸润性淋巴细胞
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白k轻链可变区
I.定义
下文具体定义了某些技术和科学术语，以使得可以更容易地理解本发明。除非在本文档的别处特别定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
当“约”用于修饰用数字确定的参数(例如，PD-1拮抗剂或用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞或减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)的减毒活细菌菌株(该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化)或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的剂量，或本文所述的组合疗法的治疗时间长度)时，意指该参数可在该参数的所述数值上下变化达10％。例如，约200mg PD-1拮抗剂(即MK-3475)的剂量可在180mg和220mg之间变化。
如本文(包括所附权利要求书)所用，除非上下文明确地相反指出，否则词语的单数形式诸如“一个”、“一种”和“该/所述”也包括其对应的复数指代。
适用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体的“施用”和“处理/治疗”是指使外源性药剂、治疗剂、诊断剂或组合物接触动物、人类、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。细胞的处理涵盖使试剂接触细胞，以及使试剂接触流体，其中该流体与细胞接触。“施用”和“处理/治疗”还指体外和离体用试剂、诊断剂、结合化合物或用另一种细胞处理例如细胞。术语“受试者”包括任何生物体，优选地动物，更优选地哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、狗、猫、兔)以及最优选地人。
术语“可药用载体”是指适用于将PD-1拮抗剂或用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株(该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化)或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株施用给人的制剂的任何非活性物质。
如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物或结合活性的任何形式免疫球蛋白分子。因此，它以最广泛的意义使用，并且具体涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体和驼源化单域抗体。“亲本抗体”是在修饰抗体以用于预期用途(诸如人源化抗体以用作人类治疗剂)之前通过使免疫系统暴露至抗原而获得的抗体。如本文所用，术语“抗体”不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且除非另外指明，还涵盖其与完整抗体竞争特异性结合的任何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗原结合部分包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、域抗体(dAb，例如鲨鱼和羊驼抗体)、包含互补决定区(CDR)的片段、单链可变片段抗体(scFv)、大抗体、微抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv以及包含足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。抗体包括任何类型的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其子类)，并且抗体不必属于任何具体类型。根据免疫球蛋白重链恒定区的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同的类型。免疫球蛋白有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的若干类型可进一步分为子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类型免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
如本文所用，“可变区”或“V区”意指在不同的抗体之间序列可变的IgG链的片段。它延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。通常，重链和轻链两者的可变区包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，它们位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常由框架区对齐，从而使得能够结合到特定的表位。一般来讲，从N末端至C末端，轻链和重链可变域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883的定义将氨基酸分配到每个域。
如本文所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即轻链可变域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。参见Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(通过序列来限定抗体的CDR区)；另见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构来限定抗体的CDR区)。如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变域残基。
如本文所用，除非另外指明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保持特异性结合全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保持一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的例子包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
“特异性结合到”特定的靶蛋白的抗体是表现出优先结合该靶而不是其他蛋白的抗体，但该特异性不需要绝对结合特异性。如果抗体的结合是样品中存在靶蛋白的决定因素，例如不产生不期望的结果诸如假阳性，则抗体被视为对其预期靶标“特异性的”。本发明所用的抗体或其结合片段将以比非靶蛋白的亲和力高至少两倍、优选地高至少十倍、更优选地高至少20倍以及最优选地高至少100倍的亲和力结合靶蛋白。如本文所用，如果抗体结合到包含给定氨基酸序列的多肽，但不结合到缺乏该序列的蛋白，则抗体被认为特异性结合到包含该给定氨基酸序列例如成熟人PD-1或人PD-L1分子的氨基酸序列的多肽。
“嵌合抗体”是指这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种(例如，人类)或属于特定抗体类型或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而该链的其余部分与来源于另一个物种(例如，小鼠)或属于另一种抗体类型或子类的抗体中的对应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可。
“人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。如果人抗体在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则该人抗体可包含鼠科碳水化合物链。相似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”是指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“人源化抗体”是指包含来自非人(例如，鼠科)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。任选地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。必要时，向抗体克隆名称添加前缀“hum”、“hu”或“h”，以区分人源化抗体与亲本啮齿类抗体。啮齿类抗体的人源化形式通常将包含亲本啮齿类抗体的相同CDR序列，但可包括某些氨基酸置换，以提高亲和力、提高人源化抗体的稳定性，或出于其他原因。
术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”是指或描述通常特征为细胞生长不受调控的哺乳动物的生理状况。
“生物治疗剂”意指在支持肿瘤维持和/或生长或抑制抗肿瘤免疫应答的任何生物学通路中阻断配体/受体信号转导的生物分子，诸如抗体或融合蛋白。
如本文所用，除非另外指明，否则“CDR”意指使用Kabat编号系统确定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
“化疗剂”是指可引起癌细胞死亡或妨碍癌细胞生长、分裂、修复和/或功能的化学或生物物质。化疗剂的类型包括但不限于：烷基化剂、抗代谢物、激酶抑制剂、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)、抗孕酮、雌激素受体下调剂(ERD)、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗雄激素、芳香酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制在异常细胞增殖或肿瘤生长中复制的基因的表达的反义寡核苷酸。可用于本发明的治疗方法的化疗剂包括细胞抑制剂和/或细胞毒性剂。
本公开提供的抗体和组合物可通过任何合适的肠道施用途径或肠胃外施用途径施用。术语“肠道途径”是指通过胃肠道的任何部分施用。肠道途径的例子包括口腔、粘膜、颊面和直肠途径或胃内途径。“肠胃外途径”是指除肠道途径之外的施用途径。肠胃外施用途径的例子包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、肿瘤内、膀胱内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、经气管、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内、皮下或局部施用。本公开的抗体和组合物可使用任何合适的方法，诸如通过经口摄取、鼻胃管、胃造口管、注射、输注、可植入输注泵和渗透泵施用。合适的施用途径和方法可根据多个因素而变化，诸如所用的特定抗体、所需的吸收速率、所用的特定制剂或剂型、待治疗的疾病的类型或严重性、特定作用位点以及患者的病症，并且本领域的技术人员可轻松加以选择。
如本文所用，就药剂的施用而言，术语“同时施用”是指施用药剂使得各个药剂在相同的时间存在于受试者中。除药剂的伴随施用(通过相同或替代途径)之外，同时施用可包括在不同的时间施用药剂(通过相同或替代途径)。
具有效应A和B的两个单独化合物的Bliss独立性组合应答C为C＝A+B-A*B，其中每个效应以0和1之间的分数抑制表示。(参考文献：Bliss(1939)Annals of AppliedBiology)Bliss值(定义为实验应答和计算的Bliss独立性值之间的差值)表明组合中的两个化合物的效应是叠加的还是协同的。
Bliss值为零(0)视为叠加的。术语“叠加的”意指两种靶向剂的组合的结果为每种靶向剂单独的总和。
如本文所用，“Chothia”意指Al-Lazikani等人,JMB 273:927-948(1997)中描述的抗体编号系统。
“保守修饰变体”或“保守置换”是指蛋白中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚度等)的其他氨基酸置换，以使得可频繁地作出改变，而不改变蛋白的生物学活性或其他所需性质，诸如抗原亲和力和/或特异性。本领域的技术人员认识到，一般来讲，多肽非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页(第4版))。此外，结构或功能类似的氨基酸的置换不太可能破坏生物学活性。示例性保守置换如下表1所示。
表1.示例性保守氨基酸置换
在整个说明书和权利要求书中使用的“基本上由...组成”和诸如“基本上由...构成”的变型表示包括任何所引用的要素或要素组，以及任选包括不实质性改变指定施用方案、方法或组合物的基本或新颖性质的具有与所引用的要素类似或不同性质的其他要素。作为非限制性例子，基本上由所引用的氨基酸序列组成的抗体也可包括不实质性影响抗体的性质的一个或多个氨基酸的添加和/或置换。
“诊断性抗PD-L单克隆抗体”意指特异性结合到在某些哺乳动物细胞表面上表达的指定PD-L(PD-L1或PDL2)的成熟形式的mAb。成熟PD-L缺乏预分泌前导序列，也称为前导肽。除非另外指明或从上下文显而易见，否则术语“PD-L”和“成熟PD-L”在本文中可互换使用，并且应理解为意指相同的分子。
如本文所用，诊断性抗人PD-L1mAb或抗hPD-L1mAb是指特异性结合成熟人PD-L1的单克隆抗体。可用作诊断性mAb以在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织切片中进行PD-L1表达的免疫组织化学(IHC)检测的诊断性抗人PD-L1mAb的具体例子是抗体20C3和抗体22C3，它们在WO2014/100079中有所描述。已报道在FFPE组织切片中用于PD-L1表达的IHC检测的另一种抗人PD-L1mAb(Chen,B.J.等人,Clin Cancer Res 19:3462-3473(2013))是可从Sino Biological,Inc.(Beijing,P.R.China；Catalog number 10084-R015)(中国北京义翘神州生物技术有限公司，目录号10084-R015)公开获得的兔抗人PD-L1mAb。
如本文所用，“框架区”或“FR”意指排除CDR区的免疫球蛋白可变区。
“同源性”是指两条多肽序列最佳对齐时，它们之间的序列相似性。当两条比较序列中的位置均被相同的氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个不同Ab的轻链CDR中的位置被丙氨酸占据，则两个Ab在该位置是同源的。同源性的百分比为两条序列共有的同源位置数量除以比较位置的总数×100。例如，如果序列最佳对齐时，两条序列中的10个位置有8个匹配或同源，则两条序列80％同源。一般来讲，在对齐两条序列时进行比较以得到最大同源性百分比。例如，比较可通过BLAST算法进行，其中选择算法的参数，以在相应参考序列的整个长度上得到相应序列之间的最大匹配。
以下参考文献涉及通常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法：Altschul,S.F.等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等人,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等人,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等人,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；比对评分系统：Dayhoff,M.O.等人,"A model ofevolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(编),第345-352页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人,"Matrices for detecting distantrelationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷,增刊3."M.O.Dayhoff(编),第353-358页,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等人,(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.等人,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；比对统计学：Karlin,S.等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268；Karlin,S.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877；Dembo,A.等人,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；以及Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multipledistinct local alignments."in Theoretical and Computational Methods in GenomeResearch(S.Suhai编),(1997)第1-14页,Plenum,New York。
“分离的抗体”和“分离的抗体片段”是指纯化状态，在此语境中意指指定的分子基本上不含其他生物分子，诸如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物，或其他材料，诸如细胞碎片和生长培养基。一般来讲，术语“分离的”并非意图指完全不含此类材料或指不含水、缓冲液或盐，除非它们以显著妨碍如本文所述的结合性化合物的实验或治疗用途的量存在。
如本文所用，“Kabat”意指Elvin A.Kabat首先采用的免疫球蛋白比对和编号系统((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。
如本文所用，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指一群基本上均匀的抗体，即除可以微量存在的可能的天然存在的突变之外，构成该群体的抗体分子的氨基酸序列是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量在其可变域尤其是其CDR中具有不同氨基酸序列的不同抗体，这些氨基酸序列通常具有对不同表位的特异性。修饰语“单克隆”表示从基本上均匀的抗体群获得的抗体特性，并且不应理解为需要通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等人(1975)Nature 256:495首先描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)制备。单克隆抗体也可使用例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597描述的技术从噬菌体抗体文库分离。另见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
“患者”或“受试者”是指需要治疗的或参与临床试验、流行病学研究或用作对照的任何单个人受试者。
“PD-1拮抗剂”意指阻断癌细胞上表达的人PD-L1与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的人PD-1的结合，并且优选地还阻断癌细胞上表达的人PD-L2与免疫细胞表达的PD-1的结合的任何化合物或生物分子。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：PD-1为PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；PD-L1为PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；PD-L2为PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。示例性人PD-1氨基酸序列可见于NCBI基因座No.:NP_005009。示例性人PD-L1和PD-L2氨基酸序列分别可见于NCBI基因座No.:NP_054862和NP_079515。
可用于本发明的任何治疗方法、药剂和用途的PD-1拮抗剂包括特异性结合到人PD-1或人PD-L1的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可包括人恒定区。在一些实施例中，人恒定区选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，并且在一些实施例中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施例中，抗原结合片段选自：Fab、Fab’-SH、F(ab’)2、scFv和Fv片段。
结合到人PD-1并且可用于本发明的治疗方法、药剂和用途的mAb的例子在US7488802、US7521051、US8008449、US8354509、US8168757、WO2004/004771、WO2004/072286、WO2004/056875和US2011/0271358中有所描述。在本发明的治疗方法、药剂和用途中用作PD-1拮抗剂的特定抗人PD-1mAb包括：MK-3475，一种具有WHO Drug Information,第27卷,第2期,第161-162页(2013年)所述的结构并且包含图6所示的重链和轻链氨基酸序列的人源化IgG4mAb；纳武单抗(BMS-936558)，一种具有WHO Drug Information,第27卷,第1期,第68-69页(2013年)所述的结构并且包含图7所示的重链和轻链氨基酸序列的人IgG4mAb；WO2008/156712中所述的人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17；以及MedImmune开发的AMP-514。
结合到人PD-L1并且可用于本发明的治疗方法、药剂和用途的mAb的例子在WO2013/019906、W02010/077634A1和US8383796中有所描述。在本发明的治疗方法、药剂和用途中用作PD-1拮抗剂的特定抗人PD-L1mAb包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C以及分别包含WO2013/019906的SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:21的重链和轻链可变区的抗体。
可用于本发明的任何治疗方法、药剂和用途的其他PD-1拮抗剂包括特异性结合到人PD-1或人PD-L1的免疫粘附素，例如包含PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的融合蛋白，所述部分融合至恒定区诸如免疫球蛋白分子的Fc区。特异性结合到PD-1的免疫粘附分子的例子在WO2010/027827和WO2011/066342中有所描述。在本发明的治疗方法、药剂和用途中用作PD-1拮抗剂的特定融合蛋白包括AMP-224(也称为B7-DCIg)，它是PD-L2-FC融合蛋白并且结合到人PD-1。
在本发明的治疗方法、药剂和用途的一些实施例中，PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)轻链CDR SEQ ID NO:1、2和3以及重链CDR SEQ ID NO:4、5和6；或(b)轻链CDR SEQ ID NO:7、8和9以及重链CDR SEQ ID NO:10、11和12。
在发明的治疗方法、药剂和用途的其他实施例中，PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合到人PD-1并且包含(a)包含SEQ ID NO:13或其变体的重链可变区，以及(b)包含选自SEQ ID NO:15或其变体、SEQ ID NO:16或其变体和SEQ ID NO:17或其变体的氨基酸序列的轻链可变区。重链可变区的变体序列除框架区中(即，在CDR外部)具有最多17个保守氨基酸置换之外，与参考序列相同，并且优选地框架区中具有小于十个、九个、八个、七个、六个或五个保守氨基酸置换。轻链可变区的变体序列除框架区中(即，在CDR外部)具有最多五个保守氨基酸置换之外，与参考序列相同，并且优选地框架区中具有小于四个、三个或两个保守氨基酸置换。
在本发明的治疗方法、药剂和用途的另一个实施例中，PD-1拮抗剂是单克隆抗体，其特异性结合到人PD-1并且包含(a)包含SEQ ID NO:14的重链以及(b)包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的轻链。
在本发明的治疗方法、药剂和用途的又一个实施例中，PD-1拮抗剂是单克隆抗体，其特异性结合到人PD-1并且包含(a)包含SEQ ID NO:14的重链以及(b)包含SEQ ID NO:18的轻链。
下表2提供了用于本发明的治疗方法、药剂和用途的示例性抗PD-1mAb的氨基酸序列列表，并且这些序列如图1-5所示。
如本文所用，“PD-L1”表达或“PD-L2”表达意指细胞表面上指定PD-L蛋白或细胞或组织内指定PD-L mRNA的任何可检测的表达水平。PD-L蛋白表达可在肿瘤组织切片的IHC分析中使用诊断性PD-L抗体或通过流式细胞术检测。或者，肿瘤细胞的PD-L蛋白表达可使用特异性结合到所需PD-L靶标例如PD-L1或PD-L2的结合剂(例如，抗体片段、亲和体等等)通过PET成像检测。用于检测和测定PD-L mRNA表达的技术包括RT-PCR和实时定量RT-PCR。
在肿瘤组织切片的IHC分析中定量PD-L1蛋白表达的许多方法已有描述。参见例如Thompson,R.H.等人,PNAS 101(49)；17174-17179(2004)；Thompson,R.H.等人,CancerRes.66:3381-3385(2006)；Gadiot,J.等人,Cancer 117:2192-2201(2011)；Taube,J.M.等人,Sci Transl Med 4,127ra37(2012)；以及Toplian,S.L.等人,New Eng.J Med.366(26):2443-2454(2012)。
一种方法利用PD-L1表达阳性或阴性的简单二元终点，其中阳性结果以表现出细胞表面膜染色的组织学证据的肿瘤细胞的百分比确定。如果在至少1％优选地5％的总肿瘤细胞中观察到IHC染色，则将肿瘤组织切片计为PD-L1表达阳性。在一个实施例中，如果样品中1％至49％的总肿瘤细胞表现出膜染色，则前列腺肿瘤样品被确定为PD-L1弱表达，如果样品中至少50％的肿瘤细胞表现出膜染色，则被确定为PD-L1强表达，每种情况使用WO2014/100079中描述的抗体22C3通过IHC分析确定。
在另一种方法中，肿瘤组织切片中的PD-L1表达在肿瘤细胞中以及浸润性免疫细胞中定量，该浸润性免疫细胞包含大量淋巴细胞。肿瘤细胞和表现出膜染色的浸润性免疫细胞的百分比单独定量为<5％、5至9％，然后以10％递增直到100％。对于肿瘤细胞，如果分数<5％，则PD-L1表达计为阴性，如果分数≥5％，则为阳性。免疫浸润物中的PD-L1表达以称为调整炎症分数(AIS)的半定量测定而报告，该分数通过膜染色细胞的百分比乘以浸润物的强度来确定，分为无(0)、轻度(分数为1，淋巴细胞很少)、中度(分数为2，肿瘤被淋巴组织细胞聚集体局灶浸润)或重度(分数为3，扩散浸润)四个等级。如果AIS≥5，则肿瘤组织切片计为免疫浸润物的PD-L1表达阳性。
PD-L mRNA表达水平可与定量RT-PCR通常使用的一个或多个参考基因诸如泛素C的mRNA表达水平相比较。
在一些实施例中，根据与适当对照的PD-L1表达水平(蛋白和/或mRNA)的比较，将肿瘤中恶性细胞和/或浸润性免疫细胞的PD-L1表达水平(蛋白和/或mRNA)确定为“过表达”或“升高”。例如，对照PD-L1蛋白或mRNA表达水平可以是在相同类型的非恶性细胞中或来自匹配正常组织的切片中定量的水平。在一些实施例中，如果样品中PD-L1蛋白(和/或D-L1mRNA)高于对照至少10％、20％或30％，则将肿瘤样品中的PD-L1表达确定为升高。
如本文所用，“前列腺癌工作组2(PCWG2)标准”(Prostate Cancer Working Group2(PCWG2)criteria)具有与Scher等人,(2008)“Design and End Points of ClinicalTrials for Patients With Progressive Prostate Cancer and Castrate Levels ofTestosterone:Recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials WorkingGroup”J.Clin.Oncol.26(7):1148-159所示相同的意义，该文献全文并入本文。
如本文所用，“RECIST 1.1响应标准”意指Eisenhauer等人,E.A.等人,Eur.JCancer 45:228-247(2009)视情况根据测定响应所处的背景而针对目标病变或非目标病变所述的定义。
“持续响应”意指在停止用治疗剂或本文所述的组合疗法治疗后的持续治疗效果。在一些实施例中，持续响应具有的持续时间与治疗持续时间至少相同，或比治疗持续时间长至少1.5、2.0、2.5或3倍。
术语“协同”或“协同的”用于指两种药剂组合的响应大于每种药剂的单独响应的总和。更具体地讲，在体外环境中，协同的一个指标称为“Bliss协同”。如上文定义的Bliss值所确定，Bliss协同是指“超过Bliss独立性”。当Bliss值大于零(0)，或更优选地大于0.2时，则视为表示协同。当然，本文使用的“协同”还涵盖体外协同，如通过另外和/或替代方法所测定的那样。本文对某组合的体外生物学效应(包括但不限于大于或等于该组合的各个组成部分的总和的抗癌症效应)的提及可与Bliss值相关。另外，本文使用“协同”(包括组成部分的组合是否表现出等于或大于各个组成部分的总和的活性)可通过另外和/或替代的方法测定，并且是本领域的技术人员已知的或对他们将是显而易见的。在一个实施例中，本文所述的基于李斯特菌的免疫疗法与本文所述的抗PD-1抗体的组合提供协同抗肿瘤活性。
“组织切片”是指组织样品的单个部分或块片，例如从正常组织或肿瘤的样品切下的薄组织切片。
如本文所用，“治疗”或“处理”癌症意指将PD-1拮抗剂和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的组合疗法施用给患有前列腺癌或诊断为前列腺癌的受试者，以实现至少一种积极治疗效果，比如减少癌细胞的数量、减小肿瘤大小、降低癌细胞浸润周围器官的速率或降低肿瘤转移或肿瘤生长的速率。癌症的积极治疗效果可用多种方式测定(参见W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。例如，就肿瘤生长抑制而言，根据NCI标准，T/C≦42％是抗肿瘤活性的最低水平。T/C<10％视为高抗肿瘤活性水平，T/C(％)＝治疗的中值肿瘤体积/对照的中值肿瘤体积×100。在一些实施例中，通过本发明的组合实现的治疗是PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一者。PFS(也称为“肿瘤进展的时间”)表示在治疗期间和之后癌症不生长的时间长度，包括患者经历CR或PR的时间，以及患者经历SD的时间。DFS是指在治疗期间和之后患者保持无病的时间长度。OS是指与未暴露的或未治疗的个体或患者相比预期寿命的延长。在一些实施例中，本发明的组合的响应是使用RECIST1.1响应标准所评估的PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中的任一者。可有效地治疗癌症患者的本发明的组合的治疗方案可根据各种因素而变化，诸如患者的疾病状态、年龄和体重，以及疗法引起受试者中的抗癌症响应的能力。虽然本发明的任何方面的实施例可能不会有效地在每位受试者中实现积极治疗效果，但应在统计学上具有显著性数量的受试者中实现该效果，如本领域已知的任何统计检验确定的那样，诸如学生t检验、chi2检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。
术语“治疗方案”、“投药方案”和给药方案可互换使用，是指在本发明的组合中施用每种治疗剂的剂量和时间安排。
适用于诊断为或怀疑患有癌症的受试者的“肿瘤”是指任何大小的恶性或潜在恶性瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性瘤。实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常生长组织或组织块。针对形成肿瘤的细胞类型，而对不同类型的实体肿瘤命名。实体肿瘤的例子为恶性毒瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成实体肿瘤(NationalCancer Institute,Dictionary of Cancer Terms(美国国家癌症研究所，《癌症术语词典》))。
“肿瘤负担”(也称为“肿瘤负荷”)是指整个身体中分布的肿瘤物质的总量。肿瘤负担是指整个身体(包括淋巴结和骨髓)中的癌细胞总数或肿瘤总大小。肿瘤负担可通过本领域已知的多种方法确定，比如测量从受试者移除时肿瘤的尺寸，例如使用卡尺测量，或在身体中时使用成像技术例如超声、骨骼扫描、计算机断层成像(CT)或磁共振成像(MRI)扫描测量。
术语“肿瘤大小”是指肿瘤的总大小，可以肿瘤的长度和宽度测量。肿瘤大小可通过本领域已知的多种方法确定，比如测量从受试者移除时肿瘤的尺寸，例如使用卡尺测量，或在身体中时使用成像技术例如骨骼扫描、超声、CT或MRI扫描测量。
在一些实施例中，本发明提供包含减毒活细菌菌株的免疫原性组合物，例如李斯特菌疫苗菌株包含核酸分子，其中该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合至PSA抗原或其片段的含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽。在一个实施例中，免疫原性组合物包含用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株。在又一个实施例中，免疫原性组合物包含LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。在又一个实施例中，免疫原性组合物包含LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。在一些实施例中，本发明提供治疗肿瘤或癌症、防御肿瘤或癌症以及诱导对肿瘤或癌症的免疫应答，例如治疗前列腺癌的方法，该方法包括将本文提供的免疫原性组合物施用给受试者的步骤。
在一些实施例中，包含减毒活细菌菌株(例如李斯特菌疫苗菌株)的免疫原性组合物包含核酸分子，其中该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中包含融合至PSA抗原或其片段的含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽的所述融合多肽可用于预防或治疗人受试者中的肿瘤或癌症(例如前列腺癌)的方法，该方法包括将本文提供的免疫原性组合物菌株施用给受试者的步骤，该重组李斯特菌菌株包含重组多肽，该重组多肽包含LLO蛋白的N末端片段和肿瘤相关抗原，由此重组李斯特菌菌株诱导对肿瘤相关抗原的免疫应答，从而治疗人受试者中的肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该免疫应答是T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。
在一些实施例中，减毒活李斯特菌菌株包含核酸分子，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合至PSA抗原或其片段的含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽。在一些实施例中，核酸分子包含在游离型表达载体中。在其他实施例中，核酸分子整合进染色体DNA。
在一个实施例中，包含编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸分子整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，核酸在所述减毒的李斯特菌疫苗菌株的质粒中。在另一个实施例中，核酸在所述减毒的李斯特菌疫苗菌株的细菌人工染色体质粒中。
应当理解“免疫原性组合物”可包含本文提供的重组李斯特菌，和佐剂。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本文提供的重组李斯特菌。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或如本文所提供的佐剂。还应当理解，这样的组合物增强免疫应答或提高效应T细胞与调节性T细胞比率或引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步提供的。如全文所用，术语“免疫原性组合物”和“组合物”可互换使用，均具有相同的含义和特性。
在施用本文提供的免疫原性组合物之后，本文提供的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤部位存在的效应T细胞增加。在另一个实施例中，本文提供的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。技术人员将会理解，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施例中，效应T细胞的比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。如本文所用，术语“减毒”意指细菌在动物中的致病能力降低。换句话讲，减毒李斯特菌菌株的病原学特性与野生型李斯特菌相比已降低，虽然减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠的静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，甚至更优选地至少约10,000倍，最优选地至少约100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因此是不杀死施用该菌株的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在该环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。本发明的减毒菌株因此是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
在一个实施例中，本文提供的减毒的李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。在另一个实施例中，本文提供的减毒的李斯特菌菌株包含质粒，该质粒包含编码抗生素抗性基因的核酸。在另一个实施例中，减毒的李斯特菌菌株表达PSA多肽，其中编码该多肽的核酸可操作地整合进李斯特菌基因组LLO基因的开放阅读框中。
在一个实施例中，本文提供的减毒的李斯特菌能够逃离吞噬溶酶体。
在一个实施例中，李斯特菌基因组包含内源性ActA基因的缺失，在一个实施例中，基因是毒力因子。在一个实施例中，这样的缺失提供了供人类使用的进一步减毒从而更安全的李斯特菌菌株。根据该实施例，PSA抗原或其片段与LLO同框整合进李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，整合的核酸分子被整合进ActA基因座。
在一个实施例中，表达载体包含核酸分子，该核酸分子包含重组多肽，该重组多肽包含PSA抗原或其片段。在另一个实施例中，该重组多肽还包含截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或融合至PSA抗原的PEST序列肽。在另一个实施例中，截短LLO蛋白是N末端LLO或其片段。在另一个实施例中，截短ActA蛋白是N末端ActA蛋白或其片段。
在另一个实施例中，该减毒菌株为LmddA。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△actA。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PrfA。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PlcB。在另一个实施例中，减毒菌株为Lm△PlcA。在另一个实施例中，该菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的菌株的固有特性。在另一个实施例中，该菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本发明的菌株为表达非溶血LLO的李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株为营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。
在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌AA菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。
在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，如本文所提供的涉及代谢酶合成的其他基因也可用作李斯特菌诱变的靶标。
在另一个实施例中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，代谢酶为氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于所述重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，代谢酶为丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶为D-氨基酸转移酶。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，所述营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充所述营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，该构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原从重组李斯特菌菌株携带的载体表达。在另一个实施例中，所述游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的抗原融合至包含PEST序列的多肽。在另一个实施例中，所述包含PEST序列的多肽是截短LLO。在另一个实施例中，所述包含PEST序列的多肽是ActA。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是氨基酸代谢酶缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dat基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是二氨基庚二酸合成中涉及到的基因缺陷的。CysK.在另一个实施例中，该基因为维生素-B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施例中，该基因为trpA。在另一个实施例中，该基因为trpB。在另一个实施例中，该基因为trpE。在另一个实施例中，该基因为asnB。在另一个实施例中，该基因为gltD。在另一个实施例中，该基因为gltB。在另一个实施例中，该基因为leuA。在另一个实施例中，该基因为argG。在另一个实施例中，该基因为thrC。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是一个或多个上文描述的基因缺陷的。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为氨基酸合成基因。在另一个实施例中，该基因为folP。在另一个实施例中，该基因为二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为ispF。在另一个实施例中，该基因为磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施例中，该基因为hisF。在另一个实施例中，该基因为hisH。在另一个实施例中，该基因为fliI。在另一个实施例中，该基因为核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为cobS。在另一个实施例中，该基因为cobB。在另一个实施例中，该基因为cbiD。在另一个实施例中，该基因为尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施例中，该基因为cobQ。在另一个实施例中，该基因为uppS。在另一个实施例中，该基因为truB。在另一个实施例中，该基因为dxs。在另一个实施例中，该基因为mvaS。在另一个实施例中，该基因为dapA。在另一个实施例中，该基因为ispG。在另一个实施例中，该基因为folC。在另一个实施例中，该基因为柠檬酸合酶。在另一个实施例中，该基因为argJ。在另一个实施例中，该基因为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施例中，该基因为menB。在另一个实施例中，该基因为甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施例中，该基因为carB。在另一个实施例中，该基因为carA。在另一个实施例中，该基因为thyA。在另一个实施例中，该基因为mgsA。在另一个实施例中，该基因为aroB。在另一个实施例中，该基因为hepB。在另一个实施例中，该基因为rluB。在另一个实施例中，该基因为ilvB。在另一个实施例中，该基因为ilvN。在另一个实施例中，该基因为alsS。在另一个实施例中，该基因为fabF。在另一个实施例中，该基因为fabH。在另一个实施例中，该基因为假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为pyrG。在另一个实施例中，该基因为truA。在另一个实施例中，该基因为pabB。在另一个实施例中，该基因为atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一个实施例中，该基因为phoP。在另一个实施例中，该基因为aroA。在另一个实施例中，该基因为aroC。在另一个实施例中，该基因为aroD。在另一个实施例中，该基因为plcB。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施例中，该基因为ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为糖ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为ZIP锌转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为硫酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为镁转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Na/Pi-协同转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸糖转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为主要协助家族转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钼ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钴ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铵转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为锰ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为上述蛋白之一的亚基。
在一个实施例中，本文提供了核酸分子，该核酸分子用于转化李斯特菌以便获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文提供的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，该核酸分子整合进李斯特菌基因组并携带非功能性毒力基因。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌中是突变的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施例中，该毒力基因为actA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。技术人员应当理解，该毒力基因可为本领域已知的任何与重组李斯特菌中的毒力相关的基因。
在又一个实施例中，李斯特菌菌株为inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、dal/dat突变体、prfA突变体、plcB缺失突变体或缺乏plcA和plcB的双突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌包含这些基因的缺失或突变，无论是单独的，还是组合的。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌缺乏所述基因的每一个。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌缺乏至少1个且最多10个本文提供的任何基因，包括actA、prfA和dal/dat基因。在另一个实施例中，prfA突变体为D133V prfA突变体。
在一个实施例中，减毒活李斯特菌为重组李斯特菌。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组内化素C(inlC)基因的突变或缺失。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组actA基因和基因组内化素C基因的突变或缺失。在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体以及任何游离型遗传元件中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是毒力菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，毒力基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，毒力基因从染色体缺失。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株为减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏prfA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏inlB基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌同时缺乏actA和inlB基因。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。
技术人员将理解的是，术语“突变”及其语法等同形式包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并且包括缺失突变、截短、失活、断裂或易位。这些类型的突变是本领域众所周知的。
在一个实施例中，为了选择包含编码代谢酶或补充本文提供的基因的质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本发明的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含本发明的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌菌株载体的生产。
技术人员应当理解，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。
在一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端LLO蛋白片段和PSA抗原的基因不直接互相融合。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和PSA抗原通过异源性肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是PSA抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短LLO在C末端截短以得到N末端LLO。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
如本文所用，术语“接头”是指连接两个异源性多肽或其片段或域的氨基酸序列。例如，连接tLLO和PSA多肽。一般来讲，如本文所用，接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放读框编码的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员将认识到，接头可包含另外的氨基酸，诸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。
如本文所用，术语“可操作地连接”意味着将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来讲，这意味着将启动子和转录引发或起始序列定位在编码区的5'。
术语“开放阅读框”或“ORF”为生物体基因组的一部分，其包含可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施例中，ORF的开始和结束端不等同于mRNA的末端，但它们通常包含在该mRNA内。在一个实施例中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，在一个实施例中，可操作地整合进基因组中与内源多肽一起作为开放读框的核酸分子为已整合进基因组中与内源多肽处于相同开放读框中的核酸分子。
在一个实施例中，本文提供的减毒的李斯特菌菌株表达重组多肽。在另一个实施例中，所述减毒的李斯特菌菌株包含编码重组多肽的质粒。在另一个实施例中，本文提供的重组核酸在本文提供的减毒的李斯特菌菌株的质粒中。在另一个实施例中，该质粒是不整合进所述减毒的李斯特菌菌株染色体中的游离型质粒。在另一个实施例中，该质粒是整合进所述李斯特菌菌株染色体中的整合型质粒。在另一个实施例中，该质粒为多拷贝质粒。
在一个实施例中，本文提供的组合物和方法的所述减毒的李斯特菌菌株包含编码前列腺特异性抗原(PSA)的第一或第二核酸分子，在一个实施例中，该核酸分子是前列腺肿瘤高度表达的前列腺癌标记物。在一个实施例中，PSA是前列腺上皮细胞分泌的激肽释放酶丝氨酸蛋白酶(KLK3)，在一个实施例中，它被广泛用作前列腺癌的标记物。
在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含编码KLK3蛋白的核酸分子。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:25；GenBank登录No.CAA32915)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:25的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCYGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:26)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:26的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:26的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:26的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:26的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:27；GenBank登录No.AAA59995.1)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQID No:27的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:27的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：ggtgtcttaggcacactggtcttggagtgcaaaggatctaggcacgtgaggctttgtatgaagaatcggggatcgtacccaccccctgtttctgtttcatcctgggcatgtctcctctgcctttgtcccctagatgaagtctccatgagctacaagggcctggtgcatccagggtgatctagtaattgcagaacagcaagtgctagctctccctccccttccacagctctgggtgtgggagggggttgtccagcctccagcagcatggggagggccttggtcagcctctgggtgccagcagggcaggggcggagtcctggggaatgaaggttttatagggctcctgggggaggctccccagccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgagaggggccatggttggggggatgcaggagagggagccagccctgactgtcaagctgaggctctttcccccccaacccagcaccccagcccagacagggagctgggctcttttctgtctctcccagccccacttcaagcccatacccccagtcccctccatattgcaacagtcctcactcccacaccaggtccccgctccctcccacttaccccagaactttcttcccatttgcccagccagctccctgctcccagctgctttactaaaggggaagttcctgggcatctccgtgtttctctttgtggggctcaaaacctccaaggacctctctcaatgccattggttccttggaccgtatcactggtccatctcctgagcccctcaatcctatcacagtctactgacttttcccattcagctgtgagtgtccaaccctatcccagagaccttgatgcttggcctcccaatcttgccctaggatacccagatgccaaccagacacctccttctttcctagccaggctatctggcctgagacaacaaatgggtccctcagtctggcaatgggactctgagaactcctcattccctgactcttagccccagactcttcattcagtggcccacattttccttaggaaaaacatgagcatccccagccacaactgccagctctctgagtccccaaatctgcatccttttcaaaacctaaaaacaaaaagaaaaacaaataaaacaaaaccaactcagaccagaactgttttctcaacctgggacttcctaaactttccaaaaccttcctcttccagcaactgaacctcgccataaggcacttatccctggttcctagcaccccttatcccctcagaatccacaacttgtaccaagtttcccttctcccagtccaagaccccaaatcaccacaaaggacccaatccccagactcaagatatggtctgggcgctgtcttgtgtctcctaccctgatccctgggttcaactctgctcccagagcatgaagcctctccaccagcaccagccaccaacctgcaaacctagggaagattgacagaattcccagcctttcccagctccccctgcccatgtcccaggactcccagccttggttctctgcccccgtgtcttttcaaacccacatcctaaatccatctcctatccgagtcccccagttccccctgtcaaccctgattcccctgatctagcaccccctctgcaggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctggggtctggggagcaggtgtctgtgtcccagaggaataacagctgggcattttccccaggataacctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttctggttcaggtcacatggggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtctccatctgtgtccctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttggtaactggcttcggttgtgtctctccgtgtgactattttgttctctctctccctctcttctctgtcttcagtctccatatctccccctctctctgtccttctctggtccctctctagccagtgtgtctcaccctgtatctctctgccaggctctgtctctcggtctctgtctcacctgtgccttctccctactgaacacacgcacgggatgggcctgggggaccctgagaaaaggaagggctttggctgggcgcggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccaaggcaggtagatcacctgaggtcaggagttcgagaccagcctggccaactggtgaaaccccatctctactaaaaatacaaaaaattagccaggcgtggtggcgcatgcctgtagtcccagctactcaggagctgagggaggagaattgcattgaacctggaggttgaggttgcagtgagccgagaccgtgccactgcactccagcctgggtgacagagtgagactccgcctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaaagaaaagaaaagaaaaggaagtgttttatccctgatgtgtgtgggtatgagggtatgagagggcccctctcactccattccttctccaggacatccctccactcttgggagacacagagaagggctggttccagctggagctgggaggggcaattgagggaggaggaaggagaagggggaaggaaaacagggtatgggggaaaggaccctggggagcgaagtggaggatacaaccttgggcctgcaggcaggctacctacccacttggaaacccacgccaaagccgcatctacagctgagccactctgaggcctcccctccccggcggtccccactcagctccaaagtctctctcccttttctctcccacactttatcatcccccggattcctctctacttggttctcattcttcctttgacttcctgcttccctttctcattcatctgtttctcactttctgcctggttttgttcttctctctctctttctctggcccatgtctgtttctctatgtttctgtcttttctttctcatcctgtgtattttcggctcaccttgtttgtcactgttctcccctctgccctttcattctctctgcccttttaccctcttccttttcccttggttctctcagttctgtatctgcccttcaccctctcacactgctgtttcccaactcgttgtctgtattttggcctgaactgtgtcttcccaaccctgtgttttctcactgtttctttttctcttttggagcctcctccttgctcctctgtcccttctctctttccttatcatcctcgctcctcattcctgcgtctgcttcctccccagcaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagtgtacgcctgggccagatggtgcagccgggagcccagatgcctgggtctgagggaggaggggacaggactcctgggtctgagggaggagggccaaggaaccaggtggggtccagcccacaacagtgtttttgcctggcccgtagtcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcggtgagtcatccctactcccaagatcttgagggaaaggtgagtgggaccttaattctgggctggggtctagaagccaacaaggcgtctgcctcccctgctccccagctgtagccatgccacctccccgtgtctcatctcattccctccttccctcttctttgactccctcaaggcaataggttattcttacagcacaactcatctgttcctgcgttcagcacacggttactaggcacctgctatgcacccagcactgccctagagcctgggacatagcagtgaacagacagagagcagcccctcccttctgtagcccccaagccagtgaggggcacaggcaggaacagggaccacaacacagaaaagctggagggtgtcaggaggtgatcaggctctcggggagggagaaggggtggggagtgtgactgggaggagacatcctgcagaaggtgggagtgagcaaacacctgcgcaggggaggggagggcctgcggcacctgggggagcagagggaacagcatctggccaggcctgggaggaggggcctagagggcgtcaggagcagagaggaggttgcctggctggagtgaaggatcggggcagggtgcgagagggaacaaaggacccctcctgcagggcctcacctgggccacaggaggacactgcttttcctctgaggagtcaggaactgtggatggtgctggacagaagcaggacagggcctggctcaggtgtccagaggctgcgctggcctcctatgggatcagactgcagggagggagggcagcagggatgtggagggagtgatgatggggctgacctgggggtggctccaggcattgtccccacctgggcccttacccagcctccctcacaggctcctggccctcagtctctcccctccactccattctccacctacccacagtgggtcattctgatcaccgaactgaccatgccagccctgccgatggtcctccatggctccctagtgccctggagaggaggtgtctagtcagagagtagtcctggaaggtggcctctgtgaggagccacggggacagcatcctgcagatggtcctggcccttgtcccaccgacctgtctacaaggactgtcctcgtggaccctcccctctgcacaggagctggaccctgaagtcccttcctaccggccaggactggagcccctacccctctgttggaatccctgcccaccttcttctggaagtcggctctggagacatttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaagataggattgcccaggcagaaactgggactgacctatctcactctctccctgcttttacccttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaagtccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagttaggatggggtgtctgtgttatttgtgggatacagagatgaaagaggggtgggatcc(SEQ IDNo:28；GenBank登录No.X14810)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的残基401..446、1688..1847、3477..3763、3907..4043和5413..5568编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:28的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSWVILITELTMPALPMVLHGSLVPWRGGV(SEQ ID No:29；GenBank登录No.NP_001025218)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:29的片段。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgtgggtcattctgatcaccgaactgaccatgccagccctgccgatggtcctccatggctccctagtgccctggagaggaggtgtctagtcagagagtagtcctggaaggtggcctctgtgaggagccacggggacagcatcctgcagatggtcctggcccttgtcccaccgacctgtctacaaggactgtcctcgtggaccctcccctctgcacaggagctggaccctgaagtcccttccccaccggccaggactggagcccctacccctctgttggaatccctgcccaccttcttctggaagtcggctctggagacatttctctcttcttccaaagctgggaactgctatctgttatctgcctgtccaggtctgaaagataggattgcccaggcagaaactgggactgacctatctcactctctccctgcttttacccttagggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg(SEQ ID No:30；GenBank登录No.NM_001030047)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:30的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRK(SEQ IDNo:31；GenBank登录No.NP_001025221)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:31。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:31的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcacccttccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagtgagtaggggcctggggtctggggagcaggtgtctgtgtcccagaggaataacagctgggcattttccccaggataacctctaaggccagccttgggactgggggagagagggaaagttctggttcaggtcacatggggaggcagggttggggctggaccaccctccccatggctgcctgggtctccatctgtgttcctctatgtctctttgtgtcgctttcattatgtctcttggtaactggcttcggttgtgtctctccgtgtgactattttgttctctctctccctctcttctctgtcttcagt(SEQ ID No:32)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:32的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:32的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:32的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:32的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:32的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为KLK3肽的来源的KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:33)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:33的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg(SEQ ID No:34)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQID No:34的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:34的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:34的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:34的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:34的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRKPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:35；GenBank登录No.NP_001025219)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:35的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:35的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:35的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:35的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaagccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattacccaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg(SEQ ID No:36；GenBank登录No.NM_001030048)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:36的残基42-758编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:36的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:36的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:36的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:36的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:37；GenBank登录No.NP_001639)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:37的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：agccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaaccccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaagcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtg(SEQ ID No:38；GenBank登录No.NM_001648)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:38的残基42-827编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:38的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:38的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ IDNo:38的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:38的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:39GenBank登录No.AAX29407.1)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:39的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:39的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:39的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:39。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:39的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：gggggagccccaagcttaccacctgcacccggagagctgtgtcaccatgtgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaactccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaggcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgagccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtagggagagggactggaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ ID No:40；GenBank登录No.BC056665)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:40的残基47-832编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:40的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:40的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:40的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:40的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVA(SEQ ID No:41；GenBank登录No.AJ459782)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:41的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:41的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ IDNo:41的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:41的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSVSHPYSQDLEGKGEWGP(SEQID No:42，GenBank登录No.AJ512346)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:42的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:42的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:42的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:42。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:42的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGERGHGWGDAGEGASPDCQAEALSPPTQHPSPDRELGSFLSLPAPLQAHTPSPSILQQSSLPHQVPAPSHLPQNFLPIAQPAPCSQLLY
(SEQ ID No:43GenBank登录No.AJ459784)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQID No 43的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:43的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:43。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:43的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:43的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO:44GenBank登录No.AJ459783)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:44的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:44的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:44的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:44的片段。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由具有以下序列的核苷酸分子编码：aagtttcccttctcccagtccaagaccccaaatcaccacaaaggacccaatccccagactcaagatatggtctgggcgctgtcttgtgtctcctaccctgatccctgggttcaactctgctcccagagcatgaagcctctccaccagcaccagccaccaacctgcaaacctagggaagattgacagaattcccagcctttcccagctccccctgcccatgtcccaggactcccagccttggttctctgcccccgtgtcttttcaaacccacatcctaaatccatctcctatccgagtcccccagttcctcctgtcaaccctgattcccctgatctagcaccccctctgcaggtgctgcacccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtagcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctacccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcctgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctatgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctgagcacccctatcaactccctattgtagtaaacttggaaccttggaaatgaccaggccaagactcaggcctccccagttctactgacctttgtccttaggtgtgaggtccagggttgctaggaaaagaaatcagcagacacaggtgtagaccagagtgtttcttaaatggtgtaattttgtcctctctgtgtcctggggaatactggccatgcctggagacatatcactcaatttctctgaggacacagataggatggggtgtctgtgttatttgtggggtacagagatgaaagaggggtgggatccacactgagagagtggagagtgacatgtgctggacactgtccatgaagcactgagcagaagctggaggcacaacgcaccagacactcacagcaaggatggagctgaaaacataacccactctgtcctggaggcactgggaagcctagagaaggctgtgaaccaaggagggagggtcttcctttggcatgggatggggatgaagtaaggagagggactgaccccctggaagctgattcactatggggggaggtgtattgaagtcctccagacaaccctcagatttgatgatttcctagtagaactcacagaaataaagagctgttatactgtgaa(SEQ ID No:45；GenBank登录No.X07730)。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:45的残基67-1088编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:45的同源物编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:45的变体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:45的异构体编码。在另一个实施例中，KLK3蛋白由SEQ ID No:45的片段编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRK(SEQ ID No:63；GenBank登录No.NM_001030050)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ IDNo:63的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:63的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:63。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:63的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:63的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，作为KLK3肽的来源的KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:64；GenBank登录No.NM_001064049)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:64的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:64的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:64的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:64的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRKPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:65；GenBank登录No.NM_001030048)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:65的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:65的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:65的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:65的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVA(SEQ ID No:66；GenBank登录No.AJ459782)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:66的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:66的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ IDNo:66的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:66的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSVSHPYSQDLEGKGEWGP(SEQID NO:50GenBank登录No.AJ512346)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:50的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:50的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:50的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ ID NO:50。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:50的片段。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有以下序列：
MWVPVVFLTLSVTWIGERGHGWGDAGEGASPDCQAEALSPPTQHPSPDRELGSFLSLPAPLQAHTPSPSILQQSSLPHQVPAPSHLPQNFLPIAQPAPCSQLLY(SEQ ID NO:51GenBank登录No.AJ459784)。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:51的同源物。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:51的变体。在另一个实施例中，KLK3蛋白的序列包含SEQ IDNO:51。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:51的异构体。在另一个实施例中，KLK3蛋白是SEQ ID No:51的片段。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由以下GenBank登录号之一所示的序列编码：BC005307、AJ310938、AJ310937、AF335478、AF335477、M27274和M26663。在另一个实施例中，KLK3蛋白由以上GenBank登录号之一所示的序列编码。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白由以下GenBank登录号之一所示的序列编码：NM_001030050、NM_001030049、NM_001030048、NM_001030047、NM_001648、AJ459782、AJ512346或AJ459784。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，KLK3蛋白由任何本文所述的序列的变型形式编码，其中该序列缺乏MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSR(SEQ ID NO:52)。
在另一个实施例中，KLK3蛋白具有的序列包含以下GenBank登录号之一所示的序列：X13943、X13942、X13940、X13941和X13944。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他KLK3蛋白。每种KLK3蛋白代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3肽是本领域已知的任何其他KLK3肽。在另一个实施例中，KLK3肽是本领域已知的任何其他KLK3肽的片段。每种类型的KLK3肽代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，“KLK3肽”是指全长KLK3蛋白。在另一个实施例中，该术语是指KLK3蛋白的片段。在另一个实施例中，该术语是指缺乏KLK3信号肽的KLK3蛋白的片段。在另一个实施例中，该术语是指包含除KLK3信号肽之外的整个KLK3序列的KLK3蛋白。在另一个实施例中，“KLK3信号序列”是指天然存在于KLK3蛋白的任何信号序列。在另一个实施例中，本文提供的方法和组合物的KLK3蛋白不包含任何信号序列。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为用于本文提供的方法和组合物的KLK3肽的来源的激肽释放酶相关肽酶3(KLK3蛋白)是PSA蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是P-30抗原蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是γ-精浆蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是激肽释放酶3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是精液琼脂酶(semenogelase)蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是精囊素蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他类型的KLK3蛋白。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体1KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体2KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体3KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体1KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体2KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体3KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体4KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体5KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是转录变体6KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是剪接变体RP5KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他剪接变体KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他转录变体KLK3蛋白。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，KLK3蛋白是成熟KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是前KLK3蛋白。在另一个实施例中，前导序列已从本文提供的方法和组合物的成熟KLK3蛋白移除。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，作为本文提供的方法和组合物的KLK3肽的来源的KLK3蛋白是人KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是灵长类KLK3蛋白。在另一个实施例中，KLK3蛋白是本领域已知的任何其他物种的KLK3蛋白。在另一个实施例中，上述KLK3蛋白中的一者在本领域中称为“KLK3蛋白”。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
术语“同种型”是指这样一种型式的分子，例如蛋白，其与同一蛋白的另一同种型或型式相比仅具有轻微差异。在一个实施例中，同种型可以从不同但相关的基因产生，或在另一个实施例中，可通过选择性剪接从相同基因产生。在另一个实施例中，同种型由单核苷酸多态性引起。
术语“片段”是指比全长蛋白或多肽更短或包含更少氨基酸的蛋白或多肽。在另一个实施例中，片段是指比全长核酸更短或包含更少核苷酸的核酸。在另一个实施例中，片段为N末端片段。在另一个实施例中，片段为C末端片段。在一个实施例中，片段是蛋白、肽或核酸的内切部分。在一个实施例中，片段为功能性片段。在另一个实施例中，片段为免疫原性片段。在一个实施例中，片段具有10-20个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有超过5个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有100-500个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有50-200个核酸或氨基酸，而在另一个实施例中，片段具有10-250个核酸或氨基酸。
本文中使用的术语“免疫原性”或“免疫原性的”是指当蛋白、肽、核酸、抗原或生物体被施用给动物时所述蛋白、肽、核酸、抗原或生物体在所述动物内引起免疫应答的固有能力。因此，在一个实施例中，"增强免疫原性"是指提高当蛋白、肽、核酸、抗原或生物体被施用给动物时所述蛋白、肽、核酸、抗原或生物体在所述动物内引起免疫应答的固有能力。在一个实施例中，可通过如下方面测量蛋白、肽、核酸、抗原或生物体引起免疫应答的能力的提高：更大量的针对蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的抗体、更具多样性的针对抗原或生物体的抗体、更大量的特异于蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的T细胞、针对蛋白、肽、核酸、抗原或生物体的更强的细胞毒性或辅助T细胞应答等等。
在一个实施例中，PSA抗原包含缺乏前24个AA的分泌信号序列的截短的PSA开放阅读框(GenBank登录号NM_001648)。截短的PSA可使用以下引物扩增：Adv60-PSA(XhoI-noATG)F:gtgCTCGAGattgtgggaggctgggagtg(SEQ ID No:46)和Adv61-PSA(SpeI-Stop)R:gatACTAGTttaggggttggccacgatgg(SEQ ID No:47)，并且可亚克隆至LLO的前441个氨基酸框内，以形成本发明的tLLO-PSA融合多肽。LLO-PSA的AA序列如下：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDLEIVGGWECEKHSQPWQVLVA SRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFML CAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCYGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID No:48；PSA序列标有下划线)。在一些实施例中，减毒活单核细胞增多性李斯特菌包含包括序列SEQ ID NO:48的tLLO-PSA融合多肽。在一些实施例中，减毒活单核细胞增多性李斯特菌包含基本上由序列SEQ ID NO:48组成的tLLO-PSA融合多肽。在一些实施例中，减毒活单核细胞增多性李斯特菌包含由序列SEQ ID NO:48组成的tLLO-PSA融合多肽。
该PSA和NM_001648的序列之间存在一个AA差异(在位置N 221Y)。
在一个实施例中，本发明的方法和组合物的重组融合多肽是LLO-KLK3融合多肽。在另一个实施例中，融合多肽具有SEQ ID NO:48所示的序列。在另一个实施例中，融合多肽与SEQ ID NO:48所示的序列同源。在另一个实施例中，融合多肽是SEQ ID NO:48所示的序列的变体。在另一个实施例中，“同源性”是指与SEQ ID No:48中的一者的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源性大于75％。在另一个实施例中，“同源性”是指与序列的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源性大于80％。在另一个实施例中，同源性大于82％。在另一个实施例中，“同源性”是指与序列的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源性大于85％。在另一个实施例中，同源性大于87％。在另一个实施例中，“同源性”是指与序列的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源性大于90％。在另一个实施例中，同源性大于92％。在另一个实施例中，“同源性”是指与序列的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源性大于95％。在另一个实施例中，“同源性”是指与序列的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源性大于97％。在另一个实施例中，同源性大于98％。在另一个实施例中，同源性大于99％。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，截短的LLO包含PEST氨基酸(AA)序列。在另一个实施例中，PEST氨基酸序列为KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:49)。在另一个实施例中，抗原与来自李斯特菌的其他LM PEST AA序列的融合也将提高抗原的免疫原性。
本发明的方法和组合物的N末端LLO蛋白片段在另一个实施例中包含SEQ ID No:54。在另一个实施例中，该片段包含LLO信号肽。在另一个实施例中，该片段包含SEQ ID No:55。在另一个实施例中，该片段大约由SEQ ID No:55构成。在另一个实施例中，该片段基本上由SEQ ID No:54构成。在另一个实施例中，该片段对应于SEQ ID No:55。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:55同源。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:55的片段同源。在一些实施例中，融合至PSA抗原的ΔLLO的长度为416个AA(不包括信号序列)，因为包括含有半胱氨酸484的激活域在内的氨基末端的88个残基被截短。本领域的技术人员将会知道，无激活域具体地讲无半胱氨酸484的任何ΔLLO均适用于本发明的方法和组合物。在另一个实施例中，异源性抗原与任何ΔLLO(包括PEST AA序列SEQ ID NO:49)的融合增强抗原的细胞介导的抗肿瘤免疫性。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，用于构建本发明的菌株的LLO蛋白具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:53；核酸序列在GenBank登录号X15127中示出)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切除。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本发明的菌株中的LLO片段的来源。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的LLO蛋白的N末端片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQ ID NO:54)。
在另一个实施例中，该LLO片段对应于本文所用的LLO蛋白的约AA20-442。
在另一个实施例中，LLO片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(SEQ ID NO:55)。
在另一个实施例中，“截短LLO”或“ΔLLO”是指包含PEST样域的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST氨基酸序列的LLO片段。
在另一个实施例中，该术语是指不包含氨基末端的活化域并且不包含胱氨酸484的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指非溶血性LLO片段。在另一个实施例中，LLO片段因活化域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO片段因半胱氨酸484的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO片段因另一位置的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，LLO因胆固醇结合域(CBD)的缺失或突变而成为非溶血性的，如美国专利No.8,771,702中所述，该专利以引用方式并入本文。在另一个实施例中，LLO或其片段的胆固醇结合域(CBD)中存在突变，其中所述突变包括包含CBD的1-50个氨基酸肽的置换。在一个实施例中，LLO或其片段的CBD中存在突变，其中所述突变包括SEQ ID NO:53的残基C484、W491、W492单独或组合的置换，其中所述重组蛋白表现出相对于野生型LLO溶血活性降低大于100倍。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，LLO片段由LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，LLO片段由LLO的大约前420个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段为LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，该LLO片段为本领域已知的任何其他LLO片段。
在另一个实施例中，同源LLO是指与LLO序列(如，与SEQ ID No:53-55之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源LLO是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:53-55中的一者的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:53-55中的一者的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:53-55中的一者的同一性为100％。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
美国公开No.US-2007-0253976-A1和US-2011-0129499-A1的氨基酸和核苷酸序列全文并入本文中。
术语“同源物”是指与特定核酸或氨基酸序列共享一定百分比的序列同一性的核酸或氨基酸序列。在一个实施例中，本文提供的组合物和方法中可用的序列可为特定LLO序列或其N末端片段的同源物。在另一个实施例中，本文提供的组合物和方法中可用的序列可为抗原性多肽的同源物，在一个实施例中，所述抗原性多肽为KLK3或其功能片段。在一个实施例中，本发明的多肽的同源物，以及在一个实施例中，编码这种同源物的核酸维持亲本多肽的功能特性。例如，在一个实施例中，本发明的抗原性多肽的同源物维持亲本多肽的抗原性特征。在另一个实施例中，本文提供的组合物和方法中可用的序列可为本文所述的任何序列的同源物。在一个实施例中，同源物与特定序列共享至少70％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少72％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少75％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少78％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少80％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少82％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少83％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少85％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少87％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少88％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少90％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少92％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少93％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少95％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少96％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少97％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少98％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少99％的同一性。在另一个实施例中，同源物与特定序列共享至少100％的同一性。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
在一个实施例中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA。
在一个实施例中，应当理解，本文提供的和/或如本文所述的任何序列的同源物被认为是本发明的一部分。
在另一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含作为具有内源性ActA序列的开放阅读框可操作地整合进李斯特菌基因组中的编码PSA融合多肽的核酸分子。在另一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该载体包含编码PSA融合蛋白的核酸分子，该融合蛋白包含融合到ActA或截短ActA的抗原。在一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-233号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利No.7,655,238中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰型式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序缺失，并且包含非保守的QDNKR置换，如美国专利公布No.2014/0186387中所述。
本文中所使用的术语“功能性”在本发明内的含义是指蛋白、肽、核酸、片段或其变体表现出生物活性或功能的固有能力。在一个实施例中，这种生物功能是其与相互作用伴侣例如膜相关受体结合的结合特性，而在另一实施例中，是其三聚化特性。就本发明的功能性片段和功能性变体而言，这些生物功能实际上可以改变，例如在其特异性或选择性方面发生改变，但保留基本的生物功能。
在另一个实施例中，“功能性片段”是免疫原性片段，当给受试者单独或在本文提供的菌株组合物中施用时引起免疫应答。在另一个实施例中，功能性片段具有生物学活性，如技术人员所了解的并且如本文所进一步提供。
术语“核酸”或“核苷酸”是指一串至少两个碱基-糖-磷酸的组合。该术语在一个实施例中包括DNA和RNA。在一个实施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA等人Genes&Devel 16:2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一个实施例中，该术语还包括可包含其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施例中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施例中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施例中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施例中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如NeilsenPE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook和Russell编以及Methods in Enzymology:Methodsfor molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。每种核酸衍生物代表了如本文所提供的独立实施例。
术语“多肽”、“肽”和“重组肽”在另一个实施例中是指任何长度的肽或多肽。在另一个实施例中，本文提供的肽或重组肽具有上文针对HMW-MAA片段列举的长度之一。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。在一个实施例中，术语“肽”是指原生肽(降解产物、合成法合成的肽或重组肽)和/或模拟肽(通常为合成法合成的肽)，诸如作为肽类似物的拟肽和半拟肽，所述肽类似物可具有例如能使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞中的修饰。此类修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并在例如Quantitative DrugDesign,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中有详细说明，该文献以引用方式并入，如同在本文完整示出一样。下文提供该方面的进一步细节。
本文中使用术语“抗原性多肽”来指宿主外源从而当存在于宿主体内时或在另一个实施例中被宿主检测到时导致产生免疫应答的如上文所述的多肽、肽或重组肽。
在一个实施例中，本文中使用“抗原性多肽”来指在存在于受试者细胞中的MHC I类和/或II类分子上加工和呈递从而当存在于宿主体内时或在另一个实施例中被宿主检测到时导致产生免疫应答的如本文所述的多肽、肽重组多肽或重组肽。在一个实施例中，抗原可以是宿主外源的。在另一个实施例中，抗原可以存在于宿主中，但宿主因免疫耐受而不引起对该抗原的免疫应答。
在一个实施例中，该抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施例中，肿瘤相关抗原为PSA。在一个实施例中，如本文所提供的组合物和方法的重组减毒的李斯特菌菌株表达PSA多肽，该PSA多肽由肿瘤细胞表达。在一个实施例中，本文提供的组合物和方法的所述重组李斯特菌菌株包含编码PSA的第一或第二核酸分子，在一个实施例中，该核酸分子是前列腺肿瘤高度表达的前列腺癌标记物。在一个实施例中，PSA是前列腺上皮细胞分泌的激肽释放酶丝氨酸蛋白酶(KLK3)，在一个实施例中，它被广泛用作前列腺癌的标记物。
肽当中的肽键(-CO-NH-)可例如被以下键取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、*-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R为任何烷基，例如甲基)、亚甲基氨基键(carba bond)(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为天然存在于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可出现在沿着肽链的任何键上，甚至同时出现在几个(2-3个)键上。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可被合成的非天然酸诸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr取代。
除以上之外，如本文所提供的肽还可包含一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
术语“寡核苷酸”可与术语“核酸”互换，并且可以指可包括但不限于原核序列、真核mRNA、得自真核mRNA的cDNA、得自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列的分子。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。
技术人员将认识到，术语“含PEST序列的多肽”或“含PEST序列的蛋白”可涵盖截短LLO蛋白，其在一个实施例中为N末端LLO；和截短的ActA蛋白，其在一个实施例中为N末端LLO；或其片段。技术人员还将认识到，术语“含PEST序列的肽”可涵盖LLO蛋白或其ActA蛋白的PEST序列肽或肽片段。PEST序列肽在本领域是已知的，并在美国专利序列号7,635,479和美国专利公开序列号2014/0186387中有所描述，这两篇专利均据此全文并入本文。
在另一个实施例中，原核生物体的PEST序列可根据诸如Rechsteiner和Roberts(TBS 21:267-271,1996)针对单核细胞增多性李斯特菌所述的方法按照常规方式鉴定。或者，来自其他原核生物体的PEST氨基酸序列也可基于这种方法来鉴定。可预期其中存在PEST氨基酸序列的其他原核生物体包括但不限于其他李斯特菌菌种。例如，单核细胞增多性李斯特菌蛋白ActA包含四个这样的序列。这些序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:56)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:57)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:58)和RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:59)。来自链球菌菌种(Streptococcus sp.)的链球菌溶血素O也包含PEST序列。例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)链球菌溶血素O包含在氨基酸35-51处的PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:60)，并且类马链球菌(Streptococcus equisimilis)链球菌溶血素O包含在氨基酸38-54处的PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:61)。另外，据信，PEST序列可嵌入抗原性蛋白内。因此，出于本发明的目的，当关于PEST序列融合时，所谓“融合”是指抗原性蛋白包含抗原例如PSA以及连在抗原一端或嵌入抗原内的PEST氨基酸序列两者。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子从游离型或质粒载体表达，该游离型或质粒载体具有编码含PEST序列的多肽或含PEST序列的肽的核酸序列。在另一个实施例中，该质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。在另一个实施例中，该片段为功能性片段。在另一个实施例中，片段为免疫原性片段。
在另一个实施例中，术语“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，周期为15代。在另一个实施例中，周期为20代。在另一个实施例中，周期为25代。在另一个实施例中，周期为30代。在另一个实施例中，周期为40代。在另一个实施例中，周期为50代。在另一个实施例中，周期为60代。在另一个实施例中，周期为80代。在另一个实施例中，周期为100代。在另一个实施例中，周期为150代。在另一个实施例中，周期为200代。在另一个实施例中，周期为300代。在另一个实施例中，周期为500代。在另一个实施例中，周期为500代以上。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体外(例如培养中)稳定的保持。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体内稳定的保持。在另一个实施例中，核酸分子或质粒在体外和体内都稳定的保持。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
术语“氨基酸”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；通常被体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸，羟赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"可包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。
术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸，其具有与参考核酸相似或改善的结合特性(就所需目的而言)。该术语还包括以与天然存在的核苷酸类似的方式或以为了所需目的而改进的速率进行代谢的核酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构。本发明提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫缩醛、亚甲基(甲基亚氨基)、3'-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和肽核酸(PNA)；参见例如，Oligonucleotides and Analogues,a Practical Approach,F.Eckstein编，IRL Press at Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies,Annals of the New York Academy of Sciences,第600卷,Baserga和Denhardt编(NYAS 1992)；Mulligan(1993)J.Med.Chem.36:1923-1937；Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。PNA含有非离子主链，例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。硫代磷酸酯键描述于例如WO 97/03211；WO96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appi.Pharmacol.144:189-197中。该术语涵盖的其他合成主链包括甲基-膦酸酯键或交替的甲基膦酸酯和磷酸二酯键(Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36:8692-8698)，和苄基膦酸酯键(Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.6:153-156)。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探针和扩增产物互换使用。
在另一个实施例中，本文提供的构建体或核酸分子使用同源重组整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing eitherListeriamonocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH 等人(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。每种技术代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。
在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY等人,Construction,characterization,and use of twoListeriamonocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，这种方法产生单拷贝的整合体。在另一个实施例中，本发明还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本发明使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。作为替代，可补充营养缺陷型宿主菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导位于重组位点侧翼的核酸片段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.,(CurrentOpinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
术语“噬菌体表达载体”或“噬粒”指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型或诱导型表达如本文所提供的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线状或环状表达系统，并涵盖保持游离或者整合进宿主细胞基因组的两种基于噬菌体的表达载体。
如本文所用，术语“游离型表达载体”是指可为线性或环状的并且通常为双链形式的核酸载体。在一个实施例中，游离型表达载体包含所关注的基因。在另一个实施例中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合进细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施例中，存在所插入的异源性基因不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施例中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注的基因的扩增，并在另一个实施例中，在必要时提供病毒反式作用因子。在另一个实施例中，在稳定的转染程序中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNAcloning by direct phenotypic correction of a mutant humancell line(HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expressionvector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficientgene transfection into lympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体、体外细胞。载体也可以单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
术语“融合”是指通过共价键合连接。
术语“转化”是指将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。在另一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源性DNA分子。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在另一个实施例中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合的方法是本领域熟知的，并例如在Nikodinovic J等人(Asecond generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006Nov；56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNAdamage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。每种方法代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，包含本文提供的核酸分子的表达载体还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，由开放阅读框编码的代谢酶为丙氨酸消旋酶(dal)。在另一个实施例中，由开放阅读框编码的代谢酶为D-氨基酸转移酶(dat)。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌菌株在内源性dal/dat基因中包含突变。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat基因。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat/和actA基因。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的编码PSA的核酸序列可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
术语“代谢酶”在一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，酶为营养物的合成所需。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，本发明所用的PSA抗原与前列腺癌相关。
在一个实施例中，本文提供的菌株产生能够浸润肿瘤、破坏肿瘤细胞并根除疾病的效应T细胞。在一个实施例中，天然存在的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)与多种肿瘤中更好的预后相关。此外，T细胞对肿瘤的浸润在临床前和临床试验中都已与免疫疗法的成功相关。在一个实施例中，淋巴细胞浸润到肿瘤部位中依赖于肿瘤血管的内皮细胞中粘附分子的上调，这种上调通常通过促炎性细胞因子诸如IFN-γ、TNF-α和IL-1进行。若干粘附分子已在淋巴细胞浸润到肿瘤中的过程中牵涉，包括细胞间粘附分子1(ICAM-1)、血管内皮细胞粘附分子1(V-CAM-1)、血管粘附蛋白1(VAP-1)和E-选择素。然而，这些细胞粘附分子通常在肿瘤血管中下调。因此，在一个实施例中，如本文所提供的菌株增加TIL，上调粘附分子(在一个实施例中，ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-选择素或它们的组合)，上调促炎性细胞因子(在一个实施例中，IFN-γ、TNF-α、IL-1或它们的组合)或它们的组合。
本发明的方法和组合物的减毒李斯特菌菌株在另一个实施例中是减毒单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是减毒西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是减毒格雷李斯特菌(Listeriagrayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是减毒伊万诺夫李斯特菌(Listeriaivanovii)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是减毒默里李斯特菌(Listeriamurrayi)菌株。在另一个实施例中，李斯特菌菌株是减毒威耳逊李斯特菌(Listeriawelshimeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌属菌种的减毒菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的重组李斯特菌菌株已在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代让该菌株作为菌株载体的功效最大化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施例中，该传代如本文所述进行。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的任何其他方法进行。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
应当理解，本文使用措辞“包括”描述实施例时，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的类似实施例。
当以马库什(Markush)组或其他替代分组描述本发明的方面或实施例时，本发明不仅涵盖以整体列出的整个组，还涵盖该组的每个单独成员和主要组的所有可能亚组，以及不存在一个或多个组员的主要组。本发明还设想了明确排除受权利要求书保护的本发明中的一个或多个任何组员。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如发生矛盾，以本说明书及其所包括的定义为准。在整个本说明书和权利要求书中，措辞“包括”或变型形式，诸如“包含”或“具有”将理解为意味着包含所述整数或整数组，但不包含任何其他整数或整数组。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。下文的术语“如”或“例如”的任何例子不应意指详尽的或限制性的。
示例性方法和材料在本文中有所描述，但类似或等同于本文所述的方法和材料也可用于实施或检验本发明。材料、方法和例子仅为示例性的并且不旨在作为限制性的。
II.方法、用途和药剂
在本发明的一个方面，本发明提供用于治疗个体中的癌症的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和减毒活细菌菌株，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC。在本发明的另一个方面，本发明提供用于治疗个体中的癌症的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。在本发明的又一个方面，本发明提供用于治疗个体中的癌症的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。在本发明的又一个方面，本发明提供用于治疗个体中的癌症的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
该组合疗法也可包括一种或多种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂可以是例如化疗剂、生物治疗剂(包括但不限于VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生长因子受体、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、4-1BB和ICOS的抗体)、免疫原性剂(例如，减毒的癌性细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞诸如用肿瘤来源抗原或核酸脉冲的树突状细胞、免疫刺激细胞因子(例如，IL-2、IFNα2、GM-CSF)以及用编码免疫刺激细胞因子诸如但不限于GM-CSF的基因转染的细胞)。
化疗剂的例子包括烷基化剂诸如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶诸如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟曱蜜胺；番荔枝内酯类(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓虫素；海绵多聚乙酰；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；匐枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、氧化双氯乙基甲胺盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素phiI1，参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类、放线菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素类、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素类、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉-多柔比星、氰吗啉-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄性激素诸如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；蒽尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；乙酸羟吡咔唑；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；类美登素类诸如美登素和美登木素类；丙米腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；足叶草酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；根瘤菌素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是T-2毒素、粘液霉素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；类紫杉醇类，例如紫杉醇和多西他塞；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素诸如视黄酸；卡培他滨；以及任何上述物质的可药用盐、酸或衍生物。还包括作用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston))；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，该芳香酶调控肾上腺中雌激素的生成，比如4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；以及抗雄激素诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、乙酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述物质的可药用盐、酸或衍生物。
根据标准药学实践，本发明的组合疗法中的每种治疗剂可单独或在药剂(在本文中也称为药物组合物)中施用，该药剂包含治疗剂和一种或多种可药用载体、赋形剂和稀释剂。
本发明的组合疗法中的每种治疗剂可同时(即，在相同的药剂中)、并行(即，在单独的药剂中以任何顺序一个接一个施用)或以任何顺序按顺序施用。当组合疗法中的治疗剂具有不同剂型(一种治疗剂是片剂或胶囊剂，另一种治疗剂是无菌液体)和/或以不同的给药计划施用，例如化疗剂至少每天施用，生物治疗剂施用频率较低，诸如一周一次、两周一次或三周一次时，按顺序施用特别有用。
在另一个实施例中，组合疗法的施用提供协同抗肿瘤活性，该组合疗法包括派姆单抗(MK-3475)和减毒活细菌菌株，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC。在另一个实施例中，组合疗法的施用提供协同抗肿瘤活性，该组合疗法包括派姆单抗(MK-3475)和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。在另一个实施例中，组合疗法的施用提供协同抗肿瘤活性，该组合疗法包括派姆单抗(MK-3475)和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。在另一个实施例中，组合疗法的施用提供协同抗肿瘤活性，该组合疗法包括派姆单抗(MK-3475)和LmddA-143(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
PD-1拮抗剂(例如，MK-3475)的剂量单位可以固定剂量即100mg、200mg、300mg或以患者具体剂量即mg/kg(mg治疗剂/kg体重)或mg/m2(毫克/平方米身体表面积的量)表示。
在一个实施例中，本文提供的免疫原性组合物所含的减毒李斯特菌菌株以1×107-3.31×1010个CFU的剂量施用给受试者。在另一个实施例中，该剂量为1×108-3.31×1010个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1×109-3.31×1010个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为7-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为10-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为20-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为30-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为50-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为70-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为100-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为150-500×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-300×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-200×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-150×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-100×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-70×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-50×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-30×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-20×108个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-30×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-20×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-30×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-10×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-10×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为3-10×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-7×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-5×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为3-5×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为0.5×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为5×109个CFU。在另一个实施例中，该剂量为1×1010个CFU。
在另一个实施例中，该剂量为1×107个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1×108个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1.5×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为4×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为5×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为6×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为7×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为8×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为10×109个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1.5×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2.5×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3.3×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为4×1010个生物体。在另一个实施例中，该剂量为5×1010个生物体。每个剂量和剂量范围代表了本发明的独立实施例。
技术人员将认识到，术语“强化”可涵盖向受试者施用单独的或组合的另外的菌株或免疫原性组合物或重组李斯特菌菌株剂量或免疫检查点抑制剂。在本发明方法的另一个实施例中，施用2次强化(或总共3次接种)。在另一个实施例中，施用3次强化。在另一个实施例中，施用4次强化。在另一个实施例中，施用5次强化。在另一个实施例中，施用6次强化。在另一个实施例中，施用超过6次强化。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括用如本文所提供的重组李斯特菌菌株或免疫检查点抑制剂强化受试者的步骤。在另一个实施例中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施例中，强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施例中，用于强化接种的重组免疫检查点抑制剂与用于初始的“初免”接种的抑制剂相同。在另一个实施例中，该强化抑制剂不同于初免抑制剂。在另一个实施例中，将相同的剂量用于初免和强化接种。在另一个实施例中，将大剂量用于强化。在另一个实施例中，将小剂量用于强化。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化疫苗接种施用给受试者的步骤。在一个实施例中，强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施例中，单次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，三次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期由技术人员通过实验确定。在另一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化菌株在初免菌株后8-10周施用。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括用包含本文提供的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，该组合物包含本文提供的减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化免疫原性组合物施用给受试者的步骤。在一个实施例中，该强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文提供的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，剂量由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。
异源性“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider等人,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的最有效方式。Shiver J.W.等人,Nature415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人,Strain 20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人,Strain 19:95-102(2000)；Sin,J.I.等人,DNACell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIV gag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIV gag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等人Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。该专利所考虑的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)和病原菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。
在另一个实施例中，本发明的方法的重组多肽由重组李斯特菌菌株表达。在另一个实施例中，该表达由重组李斯特菌菌株携带的核苷酸分子介导。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
如本文所用，术语“重组李斯特菌”在一些实施例中是指在通篇描述中具有一致含义和特性的减毒的李斯特菌。
在另一个实施例中，包含本发明的菌株的组合物还包含佐剂。在又一个实施例中，本发明的菌株可与佐剂一起施用。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物所用的佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施例中，该佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施例中，该佐剂为编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂为单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂为SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂包含SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂为含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂包含含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂为编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌有丝分裂原。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌毒素。在另一个实施例中，该佐剂为或包含本领域已知的任何其他佐剂。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本文提供的方法还包括在所述重组李斯特菌菌株施用之前或之后共施用免疫检查点蛋白抑制剂的步骤。在一个实施例中，佐剂选自Montanide ISA 51、GM-CSF、KLH、细胞因子、生长因子、细胞群、QS21、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG、矾、白介素、未甲基化的CpG寡核苷酸、刺糖苷、单磷酰脂质A、脂质体、细菌有丝分裂原、细菌毒素或趋化因子或它们的任何组合。
在一些情况下，PD-1拮抗剂和减毒活细菌菌株组合成单剂型，该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC。在一些情况下，PD-1拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合成单剂型，该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化。在一些情况下，PD-1拮抗剂和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株组合成单剂型。在一些情况下，PD-1拮抗剂和LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合成单剂型。
虽然PD-1拮抗剂和减毒活细菌菌株(该减毒活细菌菌株用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC)的同时施用可在整个治疗或预防期间维持，但抗癌活性也可通过单独一种化合物的按顺序施用实现(例如，PD-1拮抗剂，而不施用用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株，然后组合治疗，或者用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株，而不施用PD-1拮抗剂，然后组合治疗)。此外，虽然PD-1拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株(该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化)的同时施用可在整个治疗或预防期间维持，但抗癌活性也可通过单独一种化合物的按顺序施用实现(例如，PD-1拮抗剂，而不施用减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株(该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化)，然后组合治疗，或者减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株(该减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化)，而不施用PD-1拮抗剂，然后组合治疗)。另外，虽然PD-1拮抗剂和LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株的同时施用可在整个治疗或预防期间维持，但抗癌活性也可通过单独一种化合物的按顺序施用实现(例如，PD-1拮抗剂，而不施用LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株，然后组合治疗，或者LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株，而不施用PD-1拮抗剂，然后组合治疗)。此外，虽然PD-1拮抗剂和LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的同时施用可在整个治疗或预防期间维持，但抗癌活性也可通过单独一种化合物的按顺序施用实现(例如，PD-1拮抗剂，而不施用LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株，然后组合治疗，或者LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株，而不施用PD-1拮抗剂，然后组合治疗)。
在一些实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株在PD-1拮抗剂的施用之前施用，而在其他实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株在PD-1拮抗剂的施用之后施用。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一些实施例中，组合疗法中的至少一种治疗剂使用与当该治疗剂作为用于治疗相同癌症的单药疗法时通常利用的相同给药方案(剂量、频率和治疗持续时间)施用。在其他实施例中，患者接受的组合疗法中的至少一种治疗剂的总量小于该治疗剂作为单药疗法时的量，例如更小的剂量、频率更低的剂量和/或更短的治疗持续时间。
本发明的组合疗法可在手术之前或之后使用，以移除肿瘤，并且可在放疗之前、期间或之后使用。
在一些实施例中，将本发明的组合疗法施用给此前未用生物治疗剂或化疗剂治疗的，即未暴露于治疗的患者。在其他实施例中，将组合疗法施用给在用生物治疗剂或化疗剂进行既往治疗之后不能实现持续响应，即经历治疗的患者。在某些实施例中，将本发明的组合疗法施用给此前进行了治疗的转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)患者。
本发明的组合疗法通常用于治疗足够大以通过触诊或通过本领域熟知的成像技术诸如MRI、超声或CAT扫描发现的肿瘤。在一些实施例中，本发明的组合疗法用于治疗大小为至少约200mm3、300mm3、400mm3、500mm3、750mm3或最多1000mm3的晚期肿瘤。
优选地将本发明的组合疗法施用给诊断为PD-L1表达呈阳性的前列腺癌患者。在一些实施例中，在对从患者移除的肿瘤样品的FFPE或冷冻组织切片的IHC分析中，使用诊断性抗人PD-L1抗体或其抗原结合片段检测PD-L1表达。通常，在开始用PD-1拮抗剂和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株治疗之前，患者的内科医生将安排诊断试验来测定从患者移除的肿瘤组织样品中的PD-L1表达，但据设想内科医生可在治疗开始之后的任何时间，比如在治疗循环完成后安排首次或后续诊断试验。每种可能性代表了如本文所提供的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，给药方案是以任何疗法的常规方式为具体患者的病症、响应和相关治疗而定制的，并且可能需要响应于病症的变化和/或根据其他临床状况而调整。
在一些实施例中，为本发明的组合疗法选择给药方案(在本文中也称为施用方案)取决于多种因素，包括实体的血清或组织更新率、症状的程度、实体的免疫原性以及所治疗的个体中目标细胞、组织或器官的可接近性。优选地，给药方案使递送给患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受水平的副作用一致。因此，组合中每种生物治疗剂和化疗剂的剂量和给药频率部分地取决于具体的治疗剂、待治疗的癌症的严重性以及患者特性。选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指导是可用的。参见例如Wawrzynczak(1996)AntibodyTherapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)MonoclonalAntibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,MarcelDekker,New York,NY；Baert等人.(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人.(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人.(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人.(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人.(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人.(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference,第57版)；MedicalEconomics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月)。适当的给药方案的确定可由临床医生例如使用本领域已知或猜想的影响治疗或预期影响治疗的参数或因素进行，并且将取决于例如患者的临床病史(例如，之前的治疗)、待治疗的癌症的类型和分期以及对组合疗法中一种或多种治疗剂的响应的生物标记物。
本发明的组合疗法中的生物治疗剂可通过连续输注，或通过例如每天、每两天、每周三次或每周、两周、三周、每月、每两月一次等的间隔剂量施用。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg体重或更多。参见例如Yang等人(2003)NewEngl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人.(20003)CancerImmunol.Immunother.52:133-144。
在利用抗人PD-1mAb作为组合疗法中的PD-1拮抗剂的一些实施例中，给药方案将包括在整个治疗过程中间隔约14天(±2天)或约21天(±2天)或约30天(±2天)以100至500mg的固定剂量或1至10mg/kg的基于体重的剂量施用抗人PD-1mAb。
在利用抗人PD-1mAb作为组合疗法中的PD-1拮抗剂的其他实施例中，给药方案将包括以约0.005mg/kg至约10mg/kg的剂量施用抗人PD-1mAb，患者间剂量递增。在其他剂量递增实施例中，剂量之间的间隔逐渐缩短，例如第一和第二剂量之间约30天(±2天)、第二和第三剂量之间约14天(±2天)。在某些实施例中，对于第二剂量后续的剂量，给药间隔将为约14天(±2天)。
在某些实施例中，包含本文所述的任何PD-1拮抗剂的药剂将通过静脉内(IV)输注施用给受试者。
在本发明的一个实施例中，组合疗法中的PD-1拮抗剂是纳武单抗，它以选自1mg/kg Q2W、2mg/kg Q2W、3mg/kg Q2W、5mg/kg Q2W、10mg Q2W、1mg/kg Q3W、2mg/kg Q3W、3mg/kgQ3W、5mg/kg Q3W和10mg Q3W的剂量静脉内施用。
在本发明的另一个实施例中，组合疗法中的PD-1拮抗剂是MK-3475，它以选自200mg Q3W、1mg/kg Q2W、2mg/kg Q2W、3mg/kg Q2W、5mg/kg Q2W、10mg Q2W、1mg/kg Q3W、2mg/kg Q3W、3mg/kg Q3W、5mg/kg Q3W和10mg Q3W的剂量或任何这些剂量的等同剂量(例如，MK-3475的药代动力学模型预计，200mg Q3W的固定剂量提供的暴露与2mg/kg Q3W获得的那些一致)在液体药剂中施用。在一些实施例中，MK-3475以液体药剂施用，该药剂在10mM组氨酸缓冲液pH5.5中包含25mg/ml MK-3475、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨酸酯80，并且所选剂量的药剂在30分钟+/-10min的时间周期内通过IV输注施用。
在本发明的另一个实施例中，组合疗法中的减毒的细菌或减毒的李斯特菌是用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株，它在液体药剂中以选自0.5×109、1×109、5×109和1×1010个cfu的剂量施用。在一些实施例中，剂量选自1×109-3.31×1010个CFU、5-500×108个CFU、7-500×108个CFU、10-500×108个CFU、20-500×108个CFU、30-500×108个CFU、50-500×108个CFU、70-500×108个CFU、100-500×108个CFU、150-500×108个CFU、5-300×108个CFU、5-200×108个CFU、5-150×108个CFU、5-100×108个CFU、5-70×108个CFU、5-50×108个CFU、5-30×108个CFU、5-20×108个CFU、1-30×109个CFU、1-20×109个CFU、2-30×109个CFU、1-10×109个CFU、2-10×109个CFU、3-10×109个CFU、2-7×109个CFU、2-5×109个CFU或3-5×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为0.5×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为1×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为5×109个CFU。在另一个实施例中，剂量为1×1010个CFU。
在其他实施例中，剂量选自1×109个生物体、1.5×109个生物体、2×109个生物体、3×109个生物体、4×109个生物体、5×109个生物体、6×109个生物体、7×109个生物体、8×109个生物体、10×109个生物体、1.5×1010个生物体、×1010个生物体、2.5×1010个生物体、3×1010个生物体、.3×1010个生物体、4×1010个生物体或5×1010个生物体。
每个剂量和剂量范围代表了本发明的独立实施例。
在一些实施例中，通过本领域的技术人员已知的任何方法，诸如肠胃外、癌旁侧、经粘膜、鼻内、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内将包含本发明的菌株和组合物的药物组合物施用给受试者。
在本文提供的方法和组合物的另一个实施例中，该菌株或组合物经口施用，并因此将其被配制为适合经口施用的形式，即，作为固体或液体制备物。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制备物来以菌株或组合物施用。适合的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制备物来以疫苗或组合物施用。适合的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
在一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的疫苗可单独地或与药学上可接受的载体相结合地施用给宿主脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。在另一个实施例中，以有效诱导针对李斯特菌菌株本身或针对已对李斯特菌菌种进行修饰后而表达的异源性抗原的免疫应答的量施用疫苗。在另一个实施例中，待施用的疫苗或异源性抗原的量可由本领域的技术人员在拥有本公开时按常规方式确定。在另一个实施例中，药学上可接受的载体包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液。在另一个实施例中，所选择的药学上可接受的载体和将用到的载体的量将取决于多种因素，包括但不限于施用模式、李斯特菌菌株以及接种者的年龄和疾病状态。在另一个实施例中，疫苗的施用可以通过经口途径进行，或其可以是肠胃外的、经鼻内的、经肌内的、经直肠内的、经腹膜内的或多种熟知的施用途径。在另一个实施例中，施用途径可根据传染原或待治疗的肿瘤的类型而选择。
在另一个实施例中，本发明提供治疗、阻遏或抑制受试者中的至少一种肿瘤的方法，该方法包括施用本文提供的免疫原性组合物。
在一些实施例中，减毒的细菌或减毒的李斯特菌或LmddA-142或LmddA-143以液体药剂施用，并且选择剂量的药剂在30分钟+/-10min的时间周期内通过IV输注施用。
MK-3475与用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合的最佳剂量可通过一种或两种这些治疗剂的剂量递增确定。
在一个实施例中，在12周循环中第1、4和7周的第1天用组合疗法治疗患者，MK-3475以200mg的起始剂量施用，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以1×109个cfu的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以0.5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以1×1010个CFU的起始剂量施用。
在一个实施例中，用组合疗法治疗患者，其中MK-3475在12周循环的第1天Q3W以200mg的起始剂量施用，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株在12周循环的第1、4和7周的第1天以1×109个cfu的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以0.5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以1×1010个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，施用在所计划的每个循环的第1天之前不超过3天或之后不超过3天进行。
在一个实施例中，用组合疗法治疗患者，其中MK-3475在12周循环的第1、4、7和10周的第1天以200mg的起始剂量施用，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株在12周循环的第1、4和7周的第1天以1×109个cfu的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以0.5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以5×109个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以1×1010个CFU的起始剂量施用。在另一个实施例中，施用在所计划的每个循环的第1天之前不超过3天或之后不超过3天进行。
在一个实施例中，首先施用MK-3475输注，然后是NSAIDS例如萘普生或布洛芬，并且在用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株输注之前30分钟内口服止吐药物。
在另一个实施例中，MK-3475以200mg Q3W的起始剂量施用，并且用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以1×109和1×1010个cfu之间的起始剂量施用Q3W。在另一个实施例中，MK-3475以200mg Q3W的起始剂量施用，并且用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以0.5×109和1×1010个cfu之间的起始剂量施用Q3W。
在又一个实施例中，用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株以5×109Q3W的起始剂量施用，并且MK-3475以200mg Q3W的起始剂量施用，如果患者不能忍受组合的起始剂量，则用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的剂量减少至1×109个cfu Q3W。
在一些实施例中，低于前述范围下限的剂量水平即可足够，而在其他情况下可利用本领域的技术人员确定的还要大的剂量。
在一些实施例中，治疗循环在组合治疗的第一天开始，并且持续至少12周、24周或48周。在共施用药物的治疗循环的第一天，MK-3475和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的单独IV输注之间的时间安排在约15分钟至约45分钟之间。本发明设想，MK-3475和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403Sdal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株可以任何顺序或通过同时IV输注施用。
在一些实施例中，在患者实现CR之后，组合疗法施用至少2至4周。
在一些实施例中，被选为使用本发明的组合疗法治疗的患者诊断为转移性前列腺癌，并且患者的疾病是进行的或对不超过3种既往全身治疗方案产生耐性。
在一个实施例中，被选为用本发明的组合疗法治疗的患者在开始组合疗法之前1周内具有的血清PSA水平≥5ng/mL。
在另一个实施例中，被选为用本发明的组合疗法治疗的患者在开始组合疗法之前4周内的PSA水平升高。
本发明还提供包含上述PD-1拮抗剂和可药用赋形剂的药剂。当PD-1拮抗剂是生物治疗剂例如mAb时，拮抗剂可使用常规细胞培养和回收/纯化技术在CHO细胞中产生。
在一些实施例中，包含作为PD-1拮抗剂的抗PD-1抗体的药剂可以液体制剂提供，或在使用之前用注射无菌水重构冻干粉末来制备。WO 2012/135408描述了适用于本发明的包含MK-3475的液体和冻干药剂的制剂。在一些实施例中，包含MK-3475的药剂以玻璃小瓶提供，其包含约50mg MK-3475。
本发明还提供这样的药剂，其包含用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株和可药用赋形剂。用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株可以如Wallecha等人CLINICAL ANDSTRAINIMMUNOLOGY,2009年1月,第96–103页所述制备。
PD-1拮抗剂药剂和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株药剂可以试剂盒提供，该试剂盒包括第一容器和第二容器以及包装说明书。第一容器包含至少一剂包含抗PD-1抗体的药剂，第二容器包含至少一剂包含用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的药剂，并且包装说明书或标签包括使用药剂治疗患者的前列腺癌的说明。第一和第二容器可由相同或不同的形状(例如，小瓶、注射器和瓶)和/或材料(例如，塑料或玻璃)构成。试剂盒还可包括可用于施用药剂的其他材料，诸如稀释剂、过滤器、IV袋和管线、针和注射器。在试剂盒的一些实施例中，抗PD-1拮抗剂是抗PD-1抗体，并且说明规定药剂旨在用于治疗通过IHC分析法而检测呈PD-L1表达阳性的前列腺癌患者。
本发明的这些和其他方面(包括下文列出的示例性具体实施例)从本文包含的教导将显而易见。
本发明的示例性具体实施例
1.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，该方法包括向个体施用组合疗法，该组合疗法包括PD-1拮抗剂和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
2.一种用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合使用的PD-1拮抗剂。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
3.一种用于治疗患者中的前列腺癌的药剂，该药剂包含与PD-1拮抗剂组合使用的用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
4.根据实施例3或4所述的药剂，还包含可药用赋形剂或佐剂或它们的组合。
5.使用PD-1拮抗剂制造药剂的用途，该药剂与用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株组合施用时用于治疗患者中的前列腺癌。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
6.使用用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株是制造药剂的用途，该药剂与PD-1拮抗剂组合施用时用于治疗患者中的前列腺癌。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
7.使用PD-1拮抗剂和用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株制造用于治疗患者中的癌症的药剂的用途。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
8.一种试剂盒，该试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中第一容器包含至少一剂包含抗PD-1拮抗剂的药剂，第二容器包含至少一剂包含用于刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的APC的减毒活细菌菌株或通过用表达融合至tLLO的PSA抗原的表达载体转化而生物工程化的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株或LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株或LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株的药剂，并且包装说明书包括使用药剂治疗患者的前列腺癌的说明。每种可能性代表了本文提供的独立实施例。
9.根据实施例8所述的试剂盒，其中说明规定药剂旨在用于治疗通过免疫组织化学(IHC)分析法而检测呈PD-L1表达阳性的前列腺癌患者。
10.根据实施例1至9中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。
11.根据实施例9所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C或包含分别WO2013/019906的SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:21的重链和轻链可变区的单克隆抗体。
12.根据实施例10所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段，并且阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结合。
13.根据实施例12所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a)SEQ ID NO:1、2和3的轻链CDR和SEQ ID NO:4、5和6的重链CDR；或(b)SEQID NO:7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO:10、11和12的重链CDR。
14.根据实施例12所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7、8和9的轻链CDR和SEQ ID NO:10、11和12的重链CDR。
15.根据实施例12所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1单克隆抗体，并且其中重链包含SEQ ID NO:21，轻链包含SEQ ID NO:22。
16.根据实施例12所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1单克隆抗体，并且其中重链包含SEQ ID NO:23，轻链包含SEQ ID NO:24。
17.根据实施例10-16中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中前列腺癌是转移性的。
18.根据实施例17所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中癌症是转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
19.根据实施例10-18中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中患者此前未治疗前列腺癌。
20.根据实施例10-18中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中患者此前已治疗前列腺癌。
21.根据实施例10-20中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中前列腺癌检测呈PD-L1阳性。
22.根据实施例21所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-L1表达升高。
23.根据实施例12所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中PD-1拮抗剂是MK-3475或纳武单抗。
24.根据实施例25所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中MK-3475配制为液体药剂，该液体药剂在10mM组氨酸缓冲液pH 5.5中包含25mg/ml MK-3475、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨酸酯80。
25.根据实施例1至24中任一项所述的方法、药剂、用途或试剂盒，其中减毒的李斯特菌是LmddA-142或LmddA-143。
26.根据实施例1至25中任一项所述的方法、药剂、试剂盒用途，其中PD-1拮抗剂是MK-3475，减毒的李斯特菌是LmddA-142或LmddA-143，患者诊断为转移性前列腺癌，并且PD-1拮抗剂和减毒的李斯特菌的剂量选自下表中的组合之一：
MK-3475 LmddA-142 LmddA-143
200mg Q3W 1×109个cfu 1×109个cfu
200mg Q3W 2×109个cfu 2×109个cfu
200mg Q3W 5×109个cfu 5×109个cfu
200mg Q3W 1×1010个cfu 1×1010个cfu
通用方法
分子生物学标准方法如Sambrook、Fritsch和Maniatis(1982&1989年第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)RecombinantDNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)所述。标准方法还可见于Ausbel等人.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY，其描述了在细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。
蛋白纯化方法(包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶)已有描述(Coligan等人.(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,NewYork)。化学分析、化学改性、翻译后修饰、融合蛋白的制备、蛋白的糖基化已有描述(参见例如Coligan等人.(2000)Current Protocols in ProteinScience,第2卷,John Wiley andSons,Inc.,New York；Ausubel等人.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；AmershamPharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。多克隆和单克隆抗体的制备、纯化和片段化已有描述(Coligan等人.(2001)Current Protcols inImmunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow和Lane,同上)。表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见例如Coligan等人.(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见例如Sheperd和Dean(编)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(编)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,第139-243页；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205；He等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利No.6,329,511)。
人源化的替代方式是使用噬菌体上展示的人抗体文库或转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
抗原的纯化不是抗体生成所必需的。动物可用具有所关注抗原的细胞免疫。然后脾细胞可从已免疫的动物中分离，并且脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity13:233-242；Preston等人,同上supra；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可例如缀合至小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其他目的，并且包括例如偶联至染料、放射性同位素、酶或金属的抗体，例如胶体金(参见例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
流式细胞术方法(包括荧光活化细胞分选(FACS))是可用的(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wileyand Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以用作例如诊断试剂的荧光试剂是可用的(Molecular Probesy(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
免疫系统组织学的标准方法已有描述(参见例如Muller-Harmelink(编)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见例如GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note16:741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
表3提供了序列表中序列的简要说明。
本发明的重组Lm分泌融合至tLLO的PSA(Lm-LLO-PSA)，它在前列腺癌的小鼠模型中引发与肿瘤消退相关的强效PSA特异性免疫应答。用于构建LmddA-142菌株和LmddA-143菌株的载体的详情提供于下表4中。将无抗生素抗性标记物的pADV142质粒用于构建LmddA-142菌株。此新菌株与Lm-LLO-PSA相比减毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA的免疫原性略强并且显著更有效地消退PSA表达性肿瘤。
表4.质粒和菌株
质粒pAdv142的序列(6523bp)如下：
cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctc 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ID NO:62).(图9C)该质粒于2008年2月20日在Genewiz的设施上从大肠杆菌(E.Coli)菌株测序。质粒的图谱如图9B所示。
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本文引用的所有参考文献以引用方式并入，达到正如每个单独的公开、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利特别地和单独地指明以引用方式并入的程度。以引用方式并入这种声明由申请人依据37C.F.R.§1.57(b)(1)意在涉及每个和所有单独的公开、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一者根据37C.F.R.§1.57(b)(2)清楚地限定，即使这些引用不紧邻以引用方式并入的专门声明。说明书中包括以引用方式并入的专门声明(如果有的话)不以任何方式削弱以引用方式并入的该一般声明。本文的参考文献引用不旨在承认该参考文献是相关现有技术，也不构成对这些公开或文档的内容或日期的任何认可。
在以下实例中，陈述了许多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本发明。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
实例
ADXS31-142单独以及与派姆单抗(MK-3475)组合在此前进行了治疗的转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)患者中的1-2期剂量递增和安全性研究
这是在转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)患者中开展的1-2期、开放标签、多中心、非随机、两部分研究。研究的部分A将是ADX31-142单药疗法在转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)受试者中的开放标签、1期、多中心、非随机、剂量确定试验。研究的部分B将是ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)组合在mCRPC受试者中的开放标签、1-2期、多中心、非随机、剂量确定试验。图10示出了本研究的单药疗法和组合部分的示意图。
目的：
部分A：评估ADXS31-142单药疗法的安全性和耐药性，并选择在mCRPC受试者中的推荐2期剂量(RP2D)
部分B：评估ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)组合的安全性和耐药性，并确立该组合在mCRPC受试者中的RP2D
此外，研究的目的包括使用RECIST 1.1免疫相关实体肿瘤响应评估标准(immune-related Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,irRECIST)和前列腺癌工作组2(PCWG2)标准评估ADXS31-142单药疗法和ADXS31-142+派姆单抗(MK-3475)组合疗法的抗肿瘤活性和无进展存活期(PFS)信号，以便为后续随机2期试验的设计提供信息。将测定对ADXS31-142单药疗法和ADXS31-142+派姆单抗(MK-3475)组合疗法的血清前列腺特异性抗原(PSA)和外周免疫学指标的影响。
产品说明
这些产品的每一个在上文进行了详细说明。
ADXS31-142将以浓度为2.7×109个cfu/mL、1.2mL/瓶的注射用浓缩混悬液提供。
派姆单抗(MK-3475)可以两种不同的形式提供：(1)注射用冻干粉(50mg)和(2)浓度为25mg/mL的输注溶液。
部分A–ADXS31-124单药疗法
材料和方法
受试者：
研究将在经组织学确认为mCRPC的疾病已进展的或在转移性情况下对不超过3个化疗、激素或免疫疗法的既往全身治疗方案耐药的男性受试者(≥18岁)中进行；美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group,ECOG)体能状态0-1为合格。然而，在转移性情况下，受试者不可经历超过1个既往化疗方案。具有进行性骨骼或其他转移证据的受试者是合格的。在试验期间受试者可保持去势治疗(促黄体激素释放激素[LHRH]激动剂或拮抗剂)。
剂量：
剂量确定期旨在选择部分B的推荐2期剂量(RP2D)。ADSX31-142单药疗法的起始剂量水平(DL)将为1×109个集落形成单位(cfu)(DL 1)。根据预定的与剂量限制毒性(DLT)率≤0.25相关的DLT标准，通过应用修改的毒性概率区间(mTPI)设计，剂量将递增(5×109个cfu、1×1010个cfu)、保持不变或递减。表5汇总了待使用的ADXS31-142单药疗法剂量。
表5
将最多21名受试者入选(在进入下一期前以推荐剂量治疗最少6名受试者)。在作出剂量递增决定之前，每组评估最少3名受试者。
下表6示出了ADSX31-142–单药疗法的剂量决定。
表6
样本大小＝21、目标毒性概率＝0.25、ε1＝0.05、ε2＝0.05
表6基于21名受试者的样本大小。两个参数ε1和ε2设为默认值0.05。x轴为以当前剂量治疗的受试者的数量；y轴为毒性数。
在推荐的ADXS31-142单药疗法剂量下观察到25％DLT率的情况下，组合方案(部分B)的目标剂量限值毒性(DLT)率将提高30％。
研究部分A和部分B将利用相同的DLT标准。所有毒性将使用CTCAE 4.0版分级。观察的DLT窗口将为4周(在每种药物2剂之后)。如果研究者判断为与研究治疗施用可能、大概或一定相关，则任何以下毒性的发生均将被视为DLT。
终点
疗效终点-本研究使用的疗效终点(PSA/PAP、前列腺癌的其他血清标记物、扫描以及可测定和可评价的疾病评估)是通常用于评估mCRPC的抗肿瘤活性的那些终点。
安全性终点-该试验的主要安全性目标是表征ADXS31-142单独的安全性和耐药性。主要安全性分析将基于经历CTCAE标准所定义的毒性的受试者。安全性将通过对已接受单独ADXS31-142的受试者经历的毒性和等级(包括严重不良事件(SAE)和临床感兴趣事件(ECI))的定量来评估。
生物标记物
将评估T细胞对PSA和其他前列腺癌抗原(可包括PSMA、PAP和前列腺干细胞抗原(PSCA))的特异性应答。T细胞应答将通过酶联免疫吸附分析(ELISA)和/或ELISpot测定。也可进行PBMC免疫学基因表达分析。
将测定血清细胞因子和趋化因子变化，以评估作为治疗结果的免疫刺激。血清细胞因子水平将包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、转化生长因子β(TGFβ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)。血清趋化因子将包括CXCL 9、10和11。
施用途径
ADSX31-142单药疗法将由受过医学训练的人员通过IV输注施用。
方案
ADSX31-142单药疗法将在12周治疗循环中第1、4和7周的第1天每3周一次施用。由于管理原因，试验治疗可在预定的每个循环的第1天之前或之后不超过3天时施用。
所有试验治疗将以30分钟IV输注施用(由于毒性，治疗循环间隔可增加)。在部分A中，在ADXS31-142输注之前，应在30分钟内施用NSAID(萘普生或布洛芬)和止吐药。
肿瘤成像和疾病评估
计算机断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)或骨骼扫描将视为目前可用和可重复的测定被选择用于应答评估的目标病变的最好方法。腹腔/骨盆的常规CT和MRI应使用10mm或更小的连续剖切进行。螺旋CT扫描应使用5mm连续重构算法进行(作为一般规则，病变直径应不小于切片厚度的两倍)。当病变范围清晰并且被充气肺部包围时，胸部X光扫描的病变将是可接受的可测量病变；然而，CT是优选的。超声不是可接受的测量疾病的方法。
可测量和不可测量的病变和疾病
可测量的病变将是在至少一个维度上可准确测量的最长直径≥2.0cm(对于螺旋CT扫描或MRI扫描，≥1.0cm)的那些病变。如果受试者具有一个或多个可测量的病变，则存在可测量的疾病。
不可测量的病变/疾病将是所有其他病变(或疾病部位)，包括小病变(所有测量值<2.0cm(螺旋CT)或<1.0cm(MRI)的那些病变)、或未通过成像技术确认和跟踪的任何以下病变：骨骼病变、软脑膜疾病、腹水、胸膜或心包膜积水、淋巴管炎、皮肤/肺尖、腹部肿块、囊性病变以及出现在先前照射区域内的病变(除非由于放疗完成而记录为新病变)。
目标/非目标病变
所有可测量的病变(每个器官最多2个，总共5个)应被确定待测量的目标病变，并在基线时记录。目标病变应代表所有涉及到的器官。将根据大小(最长直径的病变)和准确重复测量的适用性来选择目标病变。在基线时，计算所有目标病变的最长直径总和，并记录为基线肿瘤负担。基线总和将作为确定目标病变的客观肿瘤应答的基准点。
除目标病变之外的可测量病变以及不可测量疾病的所有部位都将被确定为非目标病变，并在基线时记录。非目标病变将在与目标病变相同的时间点评估。
可测量病变中的应答(RECIST 1.1)
在基线时，测量所有目标病变(每个器官最多2个病变，总共最多5个病变)的最长直径的总和(SumD)。在每个后续肿瘤评估(TA)，将目标病变和新的可测量病变的SumD相加得到总的可测量肿瘤负担(TMTB)：
TMTB＝SumD目标病变+SumD新的可测量病变
每个评估时间点的TMTB变化百分比描述旧的和新的可测量病变出现时的大小和生长动力学。在每个TA，目标和新的可测量病变的应答根据TMTB的变化(在排除irPD之后)确定如下：
完全应答(CR)：所有目标病变消失。任何病理淋巴结(无论是目标还是非目标)在短轴上必须减小至≤10mm。
部分应答(PR)：目标病变的直径总和减小至少30％，其中以基线总和直径作为基准。
稳定疾病(SD)：既无满足PR的足够收缩，也无足够增加
进行性疾病(PD)：目标病变直径的总和增加至少20％，其中以研究的最小总和作为基准(如果基线是研究的最小值，则包括基线总和)。除相对增加20％之外，总和必须还显示出绝对增加至少5mm。(注：一个或多个新病变的出现也视为进展)。
还将评估不可测量病变的应答。
部分B-ADSX31-142+派姆单抗(MK-3475)组合疗法
材料和方法
受试者
受试者已在上文在研究的部分A中进行了描述。部分B的受试者将根据相同的群体标准包括在研究中。计划以RP2D治疗总共30名受试者。
剂量
部分B将由剂量确定期然后是扩展组期构成。剂量确定期旨在选择组合的RP2D。剂量递增/递减将通过应用mTPI设计来探索。
在剂量确定期期间，将最多21名受试者入选剂量递增的ADXS31-142(参见表7)与200mg派姆单抗(MK-3475)的组合(在进入扩展期前，以RP2D治疗最少6名受试者)。将继续进行剂量确定，直到确定初步最大耐受剂量/最大容许剂量(MTD/MAD)，最多为1×1010个cfuADXS31-142的最大剂量。MTD/MAD将为剂量扩展部分的RP2D。如果未确定MTD，则最高计划剂量水平的ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)的组合将视为RP2D。派姆单抗(MK-3475)将保持恒定为200mg。
表7：试验部分B所用的ADXS31-142和派姆单抗(MK-3475)组合疗法剂量
对于本研究的部分A，ADXS31-142的预期剂量将为0.5×109、1×109、5×109和1×1010。
一旦在部分B剂量确定期中选择了ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)的组合的RP2D后，即招募扩展组受试者。在最多30名mCRPC患者中进行RP2D的进一步评估，以评估ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)的组合的安全性和临床活性。
下表8示出了组合疗法的剂量决定
表8
样本大小＝21、目标毒性概率＝0.3、ε1＝0.05、ε2＝0.05
将从获得知情同意书起监测不良事件，并且根据美国国家癌症研究所(NCI)不良事件常用术语标准(CTCAE)4.0版概述的准则对严重性分级。
ADXS31-142与派姆单抗(MK3475)组合治疗将继续直到记录的疾病进展、不可接受的不良事件、阻止进一步施用治疗的并发疾病、研究者决定让受试者退出、受试者撤回同意书、受试者经历完全应答(irCR)并接受一次另外的治疗循环、与试验治疗或过程要求不符、完成24个月的ADXS31142与派姆单抗(MK-3475)治疗或管理原因。达到研究者确认的irCR的受试者，在接受至少2个循环的治疗后，可考虑停止派姆单抗(MK-3475)，继续只用ADXS31-142治疗。在治疗结束后，将在最后一次研究药物施用后对每名受试者的不良事件跟踪30天，严重不良事件或临床感兴趣事件跟踪90天。对出于除疾病进展之外的原因中断治疗的受试者将进行疾病状态的治疗后随访，直到疾病进展，开始非研究癌症治疗，撤回同意书，失去随访或直到申办者终止研究。试验的主要目的是建立MTD或MAD，并确定在mCRPC受试者中ADXS31-142与派姆单抗(MK-3475)的组合的安全性和耐受性。
疗效和安全性终点将如本研究的部分A所描述。
生物标记物研究将如本研究的部分A所描述。
施用途径
ADSX31-142和派姆单抗(MK-3475)各自将由受过医学训练的人员通过IV输注施用。
方案
试验治疗应在所有过程/评估完成后的每个12周循环的第1、4和7周的第1天(对于ADXS31-142)或Q3W(对于派姆单抗[MK-3475])施用。由于管理原因，试验治疗可在预定的每个循环的第1天之前或之后不超过3天时施用。
所有试验治疗将以30分钟IV输注施用(由于毒性，治疗循环间隔可增加)。第一次输注结束和第二次输注开始之间应有大约60分钟。派姆单抗(MK-3475)输注将首先施用。
目标和非目标病变的评估如上文部分A所述。
序列表
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Merck Sharpe and Dohme Corp.
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<160> 66
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<220>
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Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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<220>
<223> 人源化抗体重链
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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<220>
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<400> 16
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Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
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Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 20
<211> 218
<212> PRT
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<220>
<223> 人源化抗体轻链
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 21
<211> 447
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<220>
<223> 人源化抗体重链
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
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Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<220>
<223> 人源化抗体轻链
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 440
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 26
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His
20 25 30
Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val
35 40 45
Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln
50 55 60
Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val
100 105 110
Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys
115 120 125
Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro
130 135 140
Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys
145 150 155 160
Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro
180 185 190
Leu Val Cys Tyr Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His
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Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
225 230 235
<210> 27
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His
20 25 30
Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val
35 40 45
Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln
50 55 60
Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val
100 105 110
Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys
115 120 125
Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro
130 135 140
Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys
145 150 155 160
Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly
165 170 175
Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro
180 185 190
Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His
210 215 220
Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
225 230 235
<210> 28
<211> 5873
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
ggtgtcttag gcacactggt cttggagtgc aaaggatcta ggcacgtgag gctttgtatg 60
aagaatcggg gatcgtaccc accccctgtt tctgtttcat cctgggcatg tctcctctgc 120
ctttgtcccc tagatgaagt ctccatgagc tacaagggcc tggtgcatcc agggtgatct 180
agtaattgca gaacagcaag tgctagctct ccctcccctt ccacagctct gggtgtggga 240
gggggttgtc cagcctccag cagcatgggg agggccttgg tcagcctctg ggtgccagca 300
gggcaggggc ggagtcctgg ggaatgaagg ttttataggg ctcctggggg aggctcccca 360
gccccaagct taccacctgc acccggagag ctgtgtcacc atgtgggtcc cggttgtctt 420
cctcaccctg tccgtgacgt ggattggtga gaggggccat ggttgggggg atgcaggaga 480
gggagccagc cctgactgtc aagctgaggc tctttccccc ccaacccagc accccagccc 540
agacagggag ctgggctctt ttctgtctct cccagcccca cttcaagccc atacccccag 600
tcccctccat attgcaacag tcctcactcc cacaccaggt ccccgctccc tcccacttac 660
cccagaactt tcttcccatt tgcccagcca gctccctgct cccagctgct ttactaaagg 720
ggaagttcct gggcatctcc gtgtttctct ttgtggggct caaaacctcc aaggacctct 780
ctcaatgcca ttggttcctt ggaccgtatc actggtccat ctcctgagcc cctcaatcct 840
atcacagtct actgactttt cccattcagc tgtgagtgtc caaccctatc ccagagacct 900
tgatgcttgg cctcccaatc ttgccctagg atacccagat gccaaccaga cacctccttc 960
tttcctagcc aggctatctg gcctgagaca acaaatgggt ccctcagtct ggcaatggga 1020
ctctgagaac tcctcattcc ctgactctta gccccagact cttcattcag tggcccacat 1080
tttccttagg aaaaacatga gcatccccag ccacaactgc cagctctctg agtccccaaa 1140
tctgcatcct tttcaaaacc taaaaacaaa aagaaaaaca aataaaacaa aaccaactca 1200
gaccagaact gttttctcaa cctgggactt cctaaacttt ccaaaacctt cctcttccag 1260
caactgaacc tcgccataag gcacttatcc ctggttccta gcacccctta tcccctcaga 1320
atccacaact tgtaccaagt ttcccttctc ccagtccaag accccaaatc accacaaagg 1380
acccaatccc cagactcaag atatggtctg ggcgctgtct tgtgtctcct accctgatcc 1440
ctgggttcaa ctctgctccc agagcatgaa gcctctccac cagcaccagc caccaacctg 1500
caaacctagg gaagattgac agaattccca gcctttccca gctccccctg cccatgtccc 1560
aggactccca gccttggttc tctgcccccg tgtcttttca aacccacatc ctaaatccat 1620
ctcctatccg agtcccccag ttccccctgt caaccctgat tcccctgatc tagcaccccc 1680
tctgcaggcg ctgcgcccct catcctgtct cggattgtgg gaggctggga gtgcgagaag 1740
cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca gggcagtctg cggcggtgtt 1800
ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca tcaggaagtg agtaggggcc 1860
tggggtctgg ggagcaggtg tctgtgtccc agaggaataa cagctgggca ttttccccag 1920
gataacctct aaggccagcc ttgggactgg gggagagagg gaaagttctg gttcaggtca 1980
catggggagg cagggttggg gctggaccac cctccccatg gctgcctggg tctccatctg 2040
tgtccctcta tgtctctttg tgtcgctttc attatgtctc ttggtaactg gcttcggttg 2100
tgtctctccg tgtgactatt ttgttctctc tctccctctc ttctctgtct tcagtctcca 2160
tatctccccc tctctctgtc cttctctggt ccctctctag ccagtgtgtc tcaccctgta 2220
tctctctgcc aggctctgtc tctcggtctc tgtctcacct gtgccttctc cctactgaac 2280
acacgcacgg gatgggcctg ggggaccctg agaaaaggaa gggctttggc tgggcgcggt 2340
ggctcacacc tgtaatccca gcactttggg aggccaaggc aggtagatca cctgaggtca 2400
ggagttcgag accagcctgg ccaactggtg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa 2460
ttagccaggc gtggtggcgc atgcctgtag tcccagctac tcaggagctg agggaggaga 2520
attgcattga acctggaggt tgaggttgca gtgagccgag accgtgccac tgcactccag 2580
cctgggtgac agagtgagac tccgcctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2640
aaagaaaaga aaagaaaagg aagtgtttta tccctgatgt gtgtgggtat gagggtatga 2700
gagggcccct ctcactccat tccttctcca ggacatccct ccactcttgg gagacacaga 2760
gaagggctgg ttccagctgg agctgggagg ggcaattgag ggaggaggaa ggagaagggg 2820
gaaggaaaac agggtatggg ggaaaggacc ctggggagcg aagtggagga tacaaccttg 2880
ggcctgcagg caggctacct acccacttgg aaacccacgc caaagccgca tctacagctg 2940
agccactctg aggcctcccc tccccggcgg tccccactca gctccaaagt ctctctccct 3000
tttctctccc acactttatc atcccccgga ttcctctcta cttggttctc attcttcctt 3060
tgacttcctg cttccctttc tcattcatct gtttctcact ttctgcctgg ttttgttctt 3120
ctctctctct ttctctggcc catgtctgtt tctctatgtt tctgtctttt ctttctcatc 3180
ctgtgtattt tcggctcacc ttgtttgtca ctgttctccc ctctgccctt tcattctctc 3240
tgccctttta ccctcttcct tttcccttgg ttctctcagt tctgtatctg cccttcaccc 3300
tctcacactg ctgtttccca actcgttgtc tgtattttgg cctgaactgt gtcttcccaa 3360
ccctgtgttt tctcactgtt tctttttctc ttttggagcc tcctccttgc tcctctgtcc 3420
cttctctctt tccttatcat cctcgctcct cattcctgcg tctgcttcct ccccagcaaa 3480
agcgtgatct tgctgggtcg gcacagcctg tttcatcctg aagacacagg ccaggtattt 3540
caggtcagcc acagcttccc acacccgctc tacgatatga gcctcctgaa gaatcgattc 3600
ctcaggccag gtgatgactc cagccacgac ctcatgctgc tccgcctgtc agagcctgcc 3660
gagctcacgg atgctgtgaa ggtcatggac ctgcccaccc aggagccagc actggggacc 3720
acctgctacg cctcaggctg gggcagcatt gaaccagagg agtgtacgcc tgggccagat 3780
ggtgcagccg ggagcccaga tgcctgggtc tgagggagga ggggacagga ctcctgggtc 3840
tgagggagga gggccaagga accaggtggg gtccagccca caacagtgtt tttgcctggc 3900
ccgtagtctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 3960
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 4020
cagggggcaa aagcacctgc tcggtgagtc atccctactc ccaagatctt gagggaaagg 4080
tgagtgggac cttaattctg ggctggggtc tagaagccaa caaggcgtct gcctcccctg 4140
ctccccagct gtagccatgc cacctccccg tgtctcatct cattccctcc ttccctcttc 4200
tttgactccc tcaaggcaat aggttattct tacagcacaa ctcatctgtt cctgcgttca 4260
gcacacggtt actaggcacc tgctatgcac ccagcactgc cctagagcct gggacatagc 4320
agtgaacaga cagagagcag cccctccctt ctgtagcccc caagccagtg aggggcacag 4380
gcaggaacag ggaccacaac acagaaaagc tggagggtgt caggaggtga tcaggctctc 4440
ggggagggag aaggggtggg gagtgtgact gggaggagac atcctgcaga aggtgggagt 4500
gagcaaacac ctgcgcaggg gaggggaggg cctgcggcac ctgggggagc agagggaaca 4560
gcatctggcc aggcctggga ggaggggcct agagggcgtc aggagcagag aggaggttgc 4620
ctggctggag tgaaggatcg gggcagggtg cgagagggaa caaaggaccc ctcctgcagg 4680
gcctcacctg ggccacagga ggacactgct tttcctctga ggagtcagga actgtggatg 4740
gtgctggaca gaagcaggac agggcctggc tcaggtgtcc agaggctgcg ctggcctcct 4800
atgggatcag actgcaggga gggagggcag cagggatgtg gagggagtga tgatggggct 4860
gacctggggg tggctccagg cattgtcccc acctgggccc ttacccagcc tccctcacag 4920
gctcctggcc ctcagtctct cccctccact ccattctcca cctacccaca gtgggtcatt 4980
ctgatcaccg aactgaccat gccagccctg ccgatggtcc tccatggctc cctagtgccc 5040
tggagaggag gtgtctagtc agagagtagt cctggaaggt ggcctctgtg aggagccacg 5100
gggacagcat cctgcagatg gtcctggccc ttgtcccacc gacctgtcta caaggactgt 5160
cctcgtggac cctcccctct gcacaggagc tggaccctga agtcccttcc taccggccag 5220
gactggagcc cctacccctc tgttggaatc cctgcccacc ttcttctgga agtcggctct 5280
ggagacattt ctctcttctt ccaaagctgg gaactgctat ctgttatctg cctgtccagg 5340
tctgaaagat aggattgccc aggcagaaac tgggactgac ctatctcact ctctccctgc 5400
ttttaccctt agggtgattc tgggggccca cttgtctgta atggtgtgct tcaaggtatc 5460
acgtcatggg gcagtgaacc atgtgccctg cccgaaaggc cttccctgta caccaaggtg 5520
gtgcattacc ggaagtggat caaggacacc atcgtggcca acccctgagc acccctatca 5580
agtccctatt gtagtaaact tggaaccttg gaaatgacca ggccaagact caagcctccc 5640
cagttctact gacctttgtc cttaggtgtg aggtccaggg ttgctaggaa aagaaatcag 5700
cagacacagg tgtagaccag agtgtttctt aaatggtgta attttgtcct ctctgtgtcc 5760
tggggaatac tggccatgcc tggagacata tcactcaatt tctctgagga cacagttagg 5820
atggggtgtc tgtgttattt gtgggataca gagatgaaag aggggtggga tcc 5873
<210> 29
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Trp Val Ile Leu Ile Thr Glu Leu Thr Met Pro Ala Leu Pro
210 215 220
Met Val Leu His Gly Ser Leu Val Pro Trp Arg Gly Gly Val
225 230 235
<210> 30
<211> 1906
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300
gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360
agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga cctcatgctg ctccgcctgt 420
cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga cctgcccacc caggagccag 480
cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat tgaaccagag gagttcttga 540
ccccaaagaa acttcagtgt gtggacctcc atgttatttc caatgacgtg tgtgcgcaag 600
ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660
gcacctgctc gtgggtcatt ctgatcaccg aactgaccat gccagccctg ccgatggtcc 720
tccatggctc cctagtgccc tggagaggag gtgtctagtc agagagtagt cctggaaggt 780
ggcctctgtg aggagccacg gggacagcat cctgcagatg gtcctggccc ttgtcccacc 840
gacctgtcta caaggactgt cctcgtggac cctcccctct gcacaggagc tggaccctga 900
agtcccttcc ccaccggcca ggactggagc ccctacccct ctgttggaat ccctgcccac 960
cttcttctgg aagtcggctc tggagacatt tctctcttct tccaaagctg ggaactgcta 1020
tctgttatct gcctgtccag gtctgaaaga taggattgcc caggcagaaa ctgggactga 1080
cctatctcac tctctccctg cttttaccct tagggtgatt ctgggggccc acttgtctgt 1140
aatggtgtgc ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg 1200
ccttccctgt acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc 1260
aacccctgag cacccctatc aaccccctat tgtagtaaac ttggaacctt ggaaatgacc 1320
aggccaagac tcaagcctcc ccagttctac tgacctttgt ccttaggtgt gaggtccagg 1380
gttgctagga aaagaaatca gcagacacag gtgtagacca gagtgtttct taaatggtgt 1440
aattttgtcc tctctgtgtc ctggggaata ctggccatgc ctggagacat atcactcaat 1500
ttctctgagg acacagatag gatggggtgt ctgtgttatt tgtggggtac agagatgaaa 1560
gaggggtggg atccacactg agagagtgga gagtgacatg tgctggacac tgtccatgaa 1620
gcactgagca gaagctggag gcacaacgca ccagacactc acagcaagga tggagctgaa 1680
aacataaccc actctgtcct ggaggcactg ggaagcctag agaaggctgt gagccaagga 1740
gggagggtct tcctttggca tgggatgggg atgaagtaag gagagggact ggaccccctg 1800
gaagctgatt cactatgggg ggaggtgtat tgaagtcctc cagacaaccc tcagatttga 1860
tgatttccta gtagaactca cagaaataaa gagctgttat actgtg 1906
<210> 31
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys
65
<210> 32
<211> 554
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct tccgtgacgt ggattggtgc tgcacccctc atcctgtctc ggattgtggg 120
aggctgggag tgcgagaagc attcccaacc ctggcaggtg cttgtggcct ctcgtggcag 180
ggcagtctgc ggcggtgttc tggtgcaccc ccagtgggtc ctcacagctg cccactgcat 240
caggaagtga gtaggggcct ggggtctggg gagcaggtgt ctgtgtccca gaggaataac 300
agctgggcat tttccccagg ataacctcta aggccagcct tgggactggg ggagagaggg 360
aaagttctgg ttcaggtcac atggggaggc agggttgggg ctggaccacc ctccccatgg 420
ctgcctgggt ctccatctgt gttcctctat gtctctttgt gtcgctttca ttatgtctct 480
tggtaactgg cttcggttgt gtctctccgt gtgactattt tgttctctct ctccctctct 540
tctctgtctt cagt 554
<210> 33
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215 220
<210> 34
<211> 1341
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300
gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360
agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagcattga accagaggag ttcttgaccc 420
caaagaaact tcagtgtgtg gacctccatg ttatttccaa tgacgtgtgt gcgcaagttc 480
accctcagaa ggtgaccaag ttcatgctgt gtgctggacg ctggacaggg ggcaaaagca 540
cctgctcggg tgattctggg ggcccacttg tctgtaatgg tgtgcttcaa ggtatcacgt 600
catggggcag tgaaccatgt gccctgcccg aaaggccttc cctgtacacc aaggtggtgc 660
attaccggaa gtggatcaag gacaccatcg tggccaaccc ctgagcaccc ctatcaaccc 720
cctattgtag taaacttgga accttggaaa tgaccaggcc aagactcaag cctccccagt 780
tctactgacc tttgtcctta ggtgtgaggt ccagggttgc taggaaaaga aatcagcaga 840
cacaggtgta gaccagagtg tttcttaaat ggtgtaattt tgtcctctct gtgtcctggg 900
gaatactggc catgcctgga gacatatcac tcaatttctc tgaggacaca gataggatgg 960
ggtgtctgtg ttatttgtgg ggtacagaga tgaaagaggg gtgggatcca cactgagaga 1020
gtggagagtg acatgtgctg gacactgtcc atgaagcact gagcagaagc tggaggcaca 1080
acgcaccaga cactcacagc aaggatggag ctgaaaacat aacccactct gtcctggagg 1140
cactgggaag cctagagaag gctgtgagcc aaggagggag ggtcttcctt tggcatggga 1200
tggggatgaa gtaaggagag ggactggacc ccctggaagc tgattcacta tggggggagg 1260
tgtattgaag tcctccagac aaccctcaga tttgatgatt tcctagtaga actcacagaa 1320
ataaagagct gttatactgt g 1341
<210> 35
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met
85 90 95
Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser
100 105 110
Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val
130 135 140
His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr
145 150 155 160
Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
165 170 175
Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala
180 185 190
Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys
195 200 205
Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215
<210> 36
<211> 1325
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaagcc aggtgatgac tccagccacg acctcatgct gctccgcctg tcagagcctg 300
ccgagctcac ggatgctgtg aaggtcatgg acctgcccac ccaggagcca gcactgggga 360
ccacctgcta cgcctcaggc tggggcagca ttgaaccaga ggagttcttg accccaaaga 420
aacttcagtg tgtggacctc catgttattt ccaatgacgt gtgtgcgcaa gttcaccctc 480
agaaggtgac caagttcatg ctgtgtgctg gacgctggac agggggcaaa agcacctgct 540
cgggtgattc tgggggccca cttgtctgta atggtgtgct tcaaggtatc acgtcatggg 600
gcagtgaacc atgtgccctg cccgaaaggc cttccctgta caccaaggtg gtgcattacc 660
caaggacacc atcgtggcca acccctgagc acccctatca accccctatt gtagtaaact 720
tggaaccttg gaaatgacca ggccaagact caagcctccc cagttctact gacctttgtc 780
cttaggtgtg aggtccaggg ttgctaggaa aagaaatcag cagacacagg tgtagaccag 840
agtgtttctt aaatggtgta attttgtcct ctctgtgtcc tggggaatac tggccatgcc 900
tggagacata tcactcaatt tctctgagga cacagatagg atggggtgtc tgtgttattt 960
gtggggtaca gagatgaaag aggggtggga tccacactga gagagtggag agtgacatgt 1020
gctggacact gtccatgaag cactgagcag aagctggagg cacaacgcac cagacactca 1080
cagcaaggat ggagctgaaa acataaccca ctctgtcctg gaggcactgg gaagcctaga 1140
gaaggctgtg agccaaggag ggagggtctt cctttggcat gggatgggga tgaagtaagg 1200
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ctgtg 1325
<210> 37
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 38
<211> 1464
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
agccccaagc ttaccacctg cacccggaga gctgtgtcac catgtgggtc ccggttgtct 60
tcctcaccct gtccgtgacg tggattggtg ctgcacccct catcctgtct cggattgtgg 120
gaggctggga gtgcgagaag cattcccaac cctggcaggt gcttgtggcc tctcgtggca 180
gggcagtctg cggcggtgtt ctggtgcacc cccagtgggt cctcacagct gcccactgca 240
tcaggaacaa aagcgtgatc ttgctgggtc ggcacagcct gtttcatcct gaagacacag 300
gccaggtatt tcaggtcagc cacagcttcc cacacccgct ctacgatatg agcctcctga 360
agaatcgatt cctcaggcca ggtgatgact ccagccacga cctcatgctg ctccgcctgt 420
cagagcctgc cgagctcacg gatgctgtga aggtcatgga cctgcccacc caggagccag 480
cactggggac cacctgctac gcctcaggct ggggcagcat tgaaccagag gagttcttga 540
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ttcaccctca gaaggtgacc aagttcatgc tgtgtgctgg acgctggaca gggggcaaaa 660
gcacctgctc gggtgattct gggggcccac ttgtctgtaa tggtgtgctt caaggtatca 720
cgtcatgggg cagtgaacca tgtgccctgc ccgaaaggcc ttccctgtac accaaggtgg 780
tgcattaccg gaagtggatc aaggacacca tcgtggccaa cccctgagca cccctatcaa 840
ccccctattg tagtaaactt ggaaccttgg aaatgaccag gccaagactc aagcctcccc 900
agttctactg acctttgtcc ttaggtgtga ggtccagggt tgctaggaaa agaaatcagc 960
agacacaggt gtagaccaga gtgtttctta aatggtgtaa ttttgtcctc tctgtgtcct 1020
ggggaatact ggccatgcct ggagacatat cactcaattt ctctgaggac acagatagga 1080
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acaacgcacc agacactcac agcaaggatg gagctgaaaa cataacccac tctgtcctgg 1260
aggcactggg aagcctagag aaggctgtga gccaaggagg gagggtcttc ctttggcatg 1320
ggatggggat gaagtaagga gagggactgg accccctgga agctgattca ctatgggggg 1380
aggtgtattg aagtcctcca gacaaccctc agatttgatg atttcctagt agaactcaca 1440
gaaataaaga gctgttatac tgtg 1464
<210> 39
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 激肽释放酶3，部分
<400> 39
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 40
<211> 1495
<212> DNA
<213> 智人
<400> 40
gggggagccc caagcttacc acctgcaccc ggagagctgt gtcaccatgt gggtcccggt 60
tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat tggtgctgca cccctcatcc tgtctcggat 120
tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc ccaaccctgg caggtgcttg tggcctctcg 180
tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt gcacccccag tgggtcctca cagctgccca 240
ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct gggtcggcac agcctgtttc atcctgaaga 300
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cctgaagaat cgattcctca ggccaggtga tgactccagc cacgacctca tgctgctccg 420
cctgtcagag cctgccgagc tcacggatgc tgtgaaggtc atggacctgc ccacccagga 480
gccagcactg gggaccacct gctacgcctc aggctggggc agcattgaac cagaggagtt 540
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gcaagttcac cctcagaagg tgaccaagtt catgctgtgt gctggacgct ggacaggggg 660
caaaagcacc tgctcgggtg attctggggg cccacttgtc tgtaatggtg tgcttcaagg 720
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ggtggtgcat taccggaagt ggatcaagga caccatcgtg gccaacccct gagcacccct 840
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gcatgggatg gggatgaagt agggagaggg actggacccc ctggaagctg attcactatg 1380
gggggaggtg tattgaagtc ctccagacaa ccctcagatt tgatgatttc ctagtagaac 1440
tcacagaaat aaagagctgt tatactgcga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1495
<210> 41
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
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Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
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Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
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115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala
210 215
<210> 42
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Val Ser His Pro Tyr Ser Gln Asp Leu Glu Gly Lys Gly Glu
210 215 220
Trp Gly Pro
225
<210> 43
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu Arg Gly His Gly Trp Gly Asp Ala Gly Glu Gly Ala Ser Pro Asp
20 25 30
Cys Gln Ala Glu Ala Leu Ser Pro Pro Thr Gln His Pro Ser Pro Asp
35 40 45
Arg Glu Leu Gly Ser Phe Leu Ser Leu Pro Ala Pro Leu Gln Ala His
50 55 60
Thr Pro Ser Pro Ser Ile Leu Gln Gln Ser Ser Leu Pro His Gln Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ser His Leu Pro Gln Asn Phe Leu Pro Ile Ala Gln Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Ser Gln Leu Leu Tyr
100
<210> 44
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
115 120 125
Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile
145 150 155 160
Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
165 170 175
His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
180 185 190
Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
195 200 205
Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln
210 215 220
Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro
225 230 235 240
Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr
245 250 255
Ile Val Ala Asn Pro
260
<210> 45
<211> 1729
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
aagtttccct tctcccagtc caagacccca aatcaccaca aaggacccaa tccccagact 60
caagatatgg tctgggcgct gtcttgtgtc tcctaccctg atccctgggt tcaactctgc 120
tcccagagca tgaagcctct ccaccagcac cagccaccaa cctgcaaacc tagggaagat 180
tgacagaatt cccagccttt cccagctccc cctgcccatg tcccaggact cccagccttg 240
gttctctgcc cccgtgtctt ttcaaaccca catcctaaat ccatctccta tccgagtccc 300
ccagttcctc ctgtcaaccc tgattcccct gatctagcac cccctctgca ggtgctgcac 360
ccctcatcct gtctcggatt gtgggaggct gggagtgcga gaagcattcc caaccctggc 420
aggtgcttgt agcctctcgt ggcagggcag tctgcggcgg tgttctggtg cacccccagt 480
gggtcctcac agctacccac tgcatcagga acaaaagcgt gatcttgctg ggtcggcaca 540
gcctgtttca tcctgaagac acaggccagg tatttcaggt cagccacagc ttcccacacc 600
cgctctacga tatgagcctc ctgaagaatc gattcctcag gccaggtgat gactccagcc 660
acgacctcat gctgctccgc ctgtcagagc ctgccgagct cacggatgct atgaaggtca 720
tggacctgcc cacccaggag ccagcactgg ggaccacctg ctacgcctca ggctggggca 780
gcattgaacc agaggagttc ttgaccccaa agaaacttca gtgtgtggac ctccatgtta 840
tttccaatga cgtgtgtgcg caagttcacc ctcagaaggt gaccaagttc atgctgtgtg 900
ctggacgctg gacagggggc aaaagcacct gctcgggtga ttctgggggc ccacttgtct 960
gtaatggtgt gcttcaaggt atcacgtcat ggggcagtga accatgtgcc ctgcccgaaa 1020
ggccttccct gtacaccaag gtggtgcatt accggaagtg gatcaaggac accatcgtgg 1080
ccaacccctg agcaccccta tcaactccct attgtagtaa acttggaacc ttggaaatga 1140
ccaggccaag actcaggcct ccccagttct actgaccttt gtccttaggt gtgaggtcca 1200
gggttgctag gaaaagaaat cagcagacac aggtgtagac cagagtgttt cttaaatggt 1260
gtaattttgt cctctctgtg tcctggggaa tactggccat gcctggagac atatcactca 1320
atttctctga ggacacagat aggatggggt gtctgtgtta tttgtggggt acagagatga 1380
aagaggggtg ggatccacac tgagagagtg gagagtgaca tgtgctggac actgtccatg 1440
aagcactgag cagaagctgg aggcacaacg caccagacac tcacagcaag gatggagctg 1500
aaaacataac ccactctgtc ctggaggcac tgggaagcct agagaaggct gtgaaccaag 1560
gagggagggt cttcctttgg catgggatgg ggatgaagta aggagaggga ctgaccccct 1620
ggaagctgat tcactatggg gggaggtgta ttgaagtcct ccagacaacc ctcagatttg 1680
atgatttcct agtagaactc acagaaataa agagctgtta tactgtgaa 1729
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
gtgctcgaga ttgtgggagg ctgggagtg 29
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
gatactagtt taggggttgg ccacgatgg 29
<210> 48
<211> 680
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 48
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Leu Glu Ile Val Gly Gly Trp
435 440 445
Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg
450 455 460
Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu
465 470 475 480
Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg
485 490 495
His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser
500 505 510
His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg
515 520 525
Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg
530 535 540
Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu
545 550 555 560
Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp
565 570 575
Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys
580 585 590
Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro
595 600 605
Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly
610 615 620
Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Tyr Gly
625 630 635 640
Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro
645 650 655
Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile
660 665 670
Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
675 680
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 49
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
20 25 30
<210> 50
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu
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Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln
130 135 140
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Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu
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His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val
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Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr
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Cys Ser Val Ser His Pro Tyr Ser Gln Asp Leu Glu Gly Lys Gly Glu
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Trp Gly Pro
225
<210> 51
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu Arg Gly His Gly Trp Gly Asp Ala Gly Glu Gly Ala Ser Pro Asp
20 25 30
Cys Gln Ala Glu Ala Leu Ser Pro Pro Thr Gln His Pro Ser Pro Asp
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Arg Glu Leu Gly Ser Phe Leu Ser Leu Pro Ala Pro Leu Gln Ala His
50 55 60
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Pro Ala Pro Ser His Leu Pro Gln Asn Phe Leu Pro Ile Ala Gln Pro
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Ala Pro Cys Ser Gln Leu Leu Tyr
100
<210> 52
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg
20
<210> 53
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 53
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 54
<211> 441
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 54
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 55
<211> 416
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 55
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 56
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 28
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 57
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 58
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 59
<211> 33
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 59
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 60
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 类马链球菌
<400> 61
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 62
<211> 6523
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagattgt gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtgg 2460
cctctcgtgg cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacag 2520
ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatc 2580
ctgaagacac aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgata 2640
tgagcctcct gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgc 2700
tgctccgcct gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgccca 2760
cccaggagcc agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag 2820
aggagttctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 2880
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 2940
cagggggcaa aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt tatggtgtgc 3000
ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgt 3060
acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctaac 3120
ccgggccact aactcaacgc tagtagtgga tttaatccca aatgagccaa cagaaccaga 3180
accagaaaca gaacaagtaa cattggagtt agaaatggaa gaagaaaaaa gcaatgattt 3240
cgtgtgaata atgcacgaaa tcattgctta tttttttaaa aagcgatata ctagatataa 3300
cgaaacaacg aactgaataa agaatacaaa aaaagagcca cgaccagtta aagcctgaga 3360
aactttaact gcgagcctta attgattacc accaatcaat taaagaagtc gagacccaaa 3420
atttggtaaa gtatttaatt actttattaa tcagatactt aaatatctgt aaacccatta 3480
tatcgggttt ttgaggggat ttcaagtctt taagaagata ccaggcaatc aattaagaaa 3540
aacttagttg attgcctttt ttgttgtgat tcaactttga tcgtagcttc taactaatta 3600
attttcgtaa gaaaggagaa cagctgaatg aatatccctt ttgttgtaga aactgtgctt 3660
catgacggct tgttaaagta caaatttaaa aatagtaaaa ttcgctcaat cactaccaag 3720
ccaggtaaaa gtaaaggggc tatttttgcg tatcgctcaa aaaaaagcat gattggcgga 3780
cgtggcgttg ttctgacttc cgaagaagcg attcacgaaa atcaagatac atttacgcat 3840
tggacaccaa acgtttatcg ttatggtacg tatgcagacg aaaaccgttc atacactaaa 3900
ggacattctg aaaacaattt aagacaaatc aataccttct ttattgattt tgatattcac 3960
acggaaaaag aaactatttc agcaagcgat attttaacaa cagctattga tttaggtttt 4020
atgcctacgt taattatcaa atctgataaa ggttatcaag catattttgt tttagaaacg 4080
ccagtctatg tgacttcaaa atcagaattt aaatctgtca aagcagccaa aataatctcg 4140
caaaatatcc gagaatattt tggaaagtct ttgccagttg atctaacgtg caatcatttt 4200
gggattgctc gtataccaag aacggacaat gtagaatttt ttgatcccaa ttaccgttat 4260
tctttcaaag aatggcaaga ttggtctttc aaacaaacag ataataaggg ctttactcgt 4320
tcaagtctaa cggttttaag cggtacagaa ggcaaaaaac aagtagatga accctggttt 4380
aatctcttat tgcacgaaac gaaattttca ggagaaaagg gtttagtagg gcgcaatagc 4440
gttatgttta ccctctcttt agcctacttt agttcaggct attcaatcga aacgtgcgaa 4500
tataatatgt ttgagtttaa taatcgatta gatcaaccct tagaagaaaa agaagtaatc 4560
aaaattgtta gaagtgccta ttcagaaaac tatcaagggg ctaataggga atacattacc 4620
attctttgca aagcttgggt atcaagtgat ttaaccagta aagatttatt tgtccgtcaa 4680
gggtggttta aattcaagaa aaaaagaagc gaacgtcaac gtgttcattt gtcagaatgg 4740
aaagaagatt taatggctta tattagcgaa aaaagcgatg tatacaagcc ttatttagcg 4800
acgaccaaaa aagagattag agaagtgcta ggcattcctg aacggacatt agataaattg 4860
ctgaaggtac tgaaggcgaa tcaggaaatt ttctttaaga ttaaaccagg aagaaatggt 4920
ggcattcaac ttgctagtgt taaatcattg ttgctatcga tcattaaatt aaaaaaagaa 4980
gaacgagaaa gctatataaa ggcgctgaca gcttcgttta atttagaacg tacatttatt 5040
caagaaactc taaacaaatt ggcagaacgc cccaaaacgg acccacaact cgatttgttt 5100
agctacgata caggctgaaa ataaaacccg cactatgcca ttacatttat atctatgata 5160
cgtgtttgtt tttctttgct ggctagctta attgcttata tttacctgca ataaaggatt 5220
tcttacttcc attatactcc cattttccaa aaacatacgg ggaacacggg aacttattgt 5280
acaggccacc tcatagttaa tggtttcgag ccttcctgca atctcatcca tggaaatata 5340
ttcatccccc tgccggccta ttaatgtgac ttttgtgccc ggcggatatt cctgatccag 5400
ctccaccata aattggtcca tgcaaattcg gccggcaatt ttcaggcgtt ttcccttcac 5460
aaggatgtcg gtccctttca attttcggag ccagccgtcc gcatagccta caggcaccgt 5520
cccgatccat gtgtcttttt ccgctgtgta ctcggctccg tagctgacgc tctcgccttt 5580
tctgatcagt ttgacatgtg acagtgtcga atgcagggta aatgccggac gcagctgaaa 5640
cggtatctcg tccgacatgt cagcagacgg gcgaaggcca tacatgccga tgccgaatct 5700
gactgcatta aaaaagcctt ttttcagccg gagtccagcg gcgctgttcg cgcagtggac 5760
cattagattc tttaacggca gcggagcaat cagctcttta aagcgctcaa actgcattaa 5820
gaaatagcct ctttcttttt catccgctgt cgcaaaatgg gtaaataccc ctttgcactt 5880
taaacgaggg ttgcggtcaa gaattgccat cacgttctga acttcttcct ctgtttttac 5940
accaagtctg ttcatccccg tatcgacctt cagatgaaaa tgaagagaac cttttttcgt 6000
gtggcgggct gcctcctgaa gccattcaac agaataacct gttaaggtca cgtcatactc 6060
agcagcgatt gccacatact ccgggggaac cgcgccaagc accaatatag gcgccttcaa 6120
tccctttttg cgcagtgaaa tcgcttcatc caaaatggcc acggccaagc atgaagcacc 6180
tgcgtcaaga gcagcctttg ctgtttctgc atcaccatgc ccgtaggcgt ttgctttcac 6240
aactgccatc aagtggacat gttcaccgat atgttttttc atattgctga cattttcctt 6300
tatcgcggac aagtcaattt ccgcccacgt atctctgtaa aaaggttttg tgctcatgga 6360
aaactcctct cttttttcag aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt 6420
atattgatta atactaagtt tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag 6480
ctccaaaggc taaagaggac tataccaact atttgttaat taa 6523
<210> 63
<211> 69
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys
65
<210> 64
<211> 220
<212> PRT
<213> 稻
<400> 64
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215 220
<210> 65
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Lys Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met
85 90 95
Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser
100 105 110
Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu
115 120 125
Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val
130 135 140
His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr
145 150 155 160
Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
165 170 175
Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala
180 185 190
Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys
195 200 205
Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro
210 215
<210> 66
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu
20 25 30
Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala
35 40 45
Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala
50 55 60
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu
65 70 75 80
Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe
85 90 95
Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg
100 105 110
Pro Gly Asp Asp Ser Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys
115 120 125
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala
130 135 140
Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg
145 150 155 160
Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
165 170 175
Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro
180 185 190
Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr
195 200 205
Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala
210 215

Claims (50)

1.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用组合疗法，所述组合疗法包括程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂和减毒活细菌菌株，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
2.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用组合疗法，所述组合疗法包括程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
4.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用组合疗法，所述组合疗法包括程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
5.一种用于治疗患者中的前列腺癌的方法，所述方法包括向所述患者施用组合疗法，所述组合疗法包括程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂和减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗PD-1单克隆抗体包含重链和轻链，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂和所述减毒活细菌菌株或所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株同时或按顺序施用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂在不同于所述减毒活细菌菌株或所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株的时间施用。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述前列腺癌是转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述菌株与佐剂一起施用。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述佐剂包括Montanide ISA51、GM-CSF、KLH、细胞因子、生长因子、细胞群、QS21、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG、矾、白介素、未甲基化的CpG寡核苷酸、刺糖苷、单磷酰脂质A、脂质体、细菌有丝分裂原、细菌毒素或趋化因子或它们的任何组合。
13.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活细菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
14.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
15.根据权利要求14所述的药剂，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
16.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
17.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
18.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活细菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
19.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
20.根据权利要求19所述的药剂，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
21.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
22.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
23.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活细菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
24.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
25.根据权利要求24所述的药剂，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
26.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
27.一种用于治疗诊断为前列腺癌的患者的药剂，所述药剂包含与减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株组合使用的程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
28.一种用于治疗个体中的前列腺癌的药剂，所述药剂包含与程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂组合使用的减毒活细菌菌株，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
29.一种用于治疗个体中的前列腺癌的药剂，所述药剂包含与程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂组合使用的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
30.根据权利要求29所述的药剂，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
31.一种用于治疗个体中的前列腺癌的药剂，所述药剂包含与程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂组合使用的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株，并且所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1单克隆抗体，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
32.一种用于治疗个体中的前列腺癌的药剂，所述药剂包含与程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂组合使用的减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌菌株包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株，并且所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1单克隆抗体，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
33.根据权利要求13至32中任一项所述的药剂，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1单克隆抗体。
34.根据权利要求13至33中任一项所述的药剂，其中所述菌株与佐剂一起施用。
35.根据权利要求34所述的药剂，其中所述佐剂包括Montanide ISA 51、GM-CSF、KLH、细胞因子、生长因子、细胞群、QS21、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG、矾、白介素、未甲基化的CpG寡核苷酸、刺糖苷、单磷酰脂质A、脂质体、细菌有丝分裂原、细菌毒素或趋化因子或它们的任何组合。
36.根据权利要求13至35中任一项所述的药剂，其中所述PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1单克隆抗体，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，并且所述抗体配制为液体药剂，所述液体药剂在10mM组氨酸缓冲液pH 5.5中包含7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨酸酯80。
37.根据权利要求13至36中任一项所述的药剂，其中所述癌症是转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
38.根据权利要求13至37中任一项所述的药剂，其中所述前列腺癌检测呈PD-L1表达阳性。
39.根据权利要求13至38中任一项所述的药剂，其中所述PD-1拮抗剂是MK-3475。
40.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中所述第一容器包含至少一剂包含程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂的药剂，所述第二容器包含至少一剂包含减毒活细菌菌株的药剂，并且所述包装说明书包括使用所述药剂治疗患者的前列腺癌的说明，其中所述减毒活细菌菌株刺激能够驱动对PSA表达性细胞的细胞免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。
41.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中所述第一容器包含至少一剂包含程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂的药剂，所述第二容器包含至少一剂包含减毒活单核细胞增多性李斯特菌的药剂，并且所述包装说明书包括使用所述药剂治疗患者的前列腺癌的说明，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌包括用表达融合至截短李斯特菌溶血素O(tLLO)的PSA抗原的表达载体转化的生物工程化菌株。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述tLLO-PSA融合多肽由SEQ ID NO:54的序列或与其至少99％同源的序列构成，其中所述N末端LLO肽增强所述融合肽的免疫原性。
43.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中所述第一容器包含至少一剂包含程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂的药剂，所述第二容器包含至少一剂包含减毒活单核细胞增多性李斯特菌的药剂，并且所述包装说明书包括使用所述药剂治疗患者的前列腺癌的说明，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌包括LmddA-142(10403S dal(-)dat(-)actA(-)pADV142)菌株。
44.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中所述第一容器包含至少一剂包含程序性死亡1蛋白(PD-1)的拮抗剂的药剂，所述第二容器包含至少一剂包含减毒活单核细胞增多性李斯特菌的药剂，并且所述包装说明书包括使用所述药剂治疗患者的前列腺癌的说明，其中所述减毒活单核细胞增多性李斯特菌包括LmddA-143(10403S dal(-)dat(-)actA(-)(10403S dal(-)dat(-)actA(-)，klk3融合至染色体中的hly基因)菌株。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的试剂盒，其中所述菌株与佐剂一起施用。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述佐剂包括Montanide ISA 51、GM-CSF、KLH、细胞因子、生长因子、细胞群、QS21、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG、矾、白介素、未甲基化的CpG寡核苷酸、刺糖苷、单磷酰脂质A、脂质体、细菌有丝分裂原、细菌毒素或趋化因子或它们的任何组合。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的试剂盒，其中所述说明规定所述药剂旨在用于治疗通过免疫组织化学(IHC)分析法而检测呈PD-L1表达阳性的前列腺癌患者。
48.根据权利要求40至47中任一项所述的试剂盒，其中所述前列腺癌是转移性去势难治性前列腺癌(mCRPC)。
49.根据权利要求40至48中任一项所述的试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂是抗PD-1单克隆抗体。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述抗PD-1单克隆抗体包含重链和轻链，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
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