JP2015511602A - リステリアワクチン処理後のサプレッサー細胞機能抑制 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図35
Description
ggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagactagttctagatttatcacgtacccatttccccgcatcttttatttttttaaatactttagggaaaaatggtttttgatttgcttttaaaggttgtggtgtagactcgtctgctgactgcatgctagaatctaagtcactttcagaagcatccacaactgactctttcgccacttttctcttatttgcttttgttggtttatctggataagtaaggctttcaagctcactatccgacgacgctatggcttttcttctttttttaatttccgctgcgctatccgatgacagacctggatgacgacgctccacttgcagagttggtcggtcgactcctgaagcctcttcatttatagccacatttcctgtttgctcaccgttgttattattgttattcggacctttctctgcttttgctttcaacattgctattaggtctgctttgttcgtatttttcactttattcgatttttctagttcctcaatatcacgtgaacttacttcacgtgcagtttcgtatcttggtcccgtatttacctcgcttggctgctcttctgttttttcttcttcccattcatctgtgtttagactggaatcttcgctatctgtcgctgcaaatattatgtcggggttaatcgtaatgcagttggcagtaatgaaaactaccatcatcgcacgcataaatctgtttaatcccacttatactccctcctcgtgatacgctaatacaacctttttagaacaaggaaaattcggccttcattttcactaatttgttccgttaaaaattggattagcagttagttatcttcttaattagctaatataagaaaaaatattcatgaattattttaagaatatcacttggagaattaatttttctctaacatttgttaatcagttaaccccaactgcttcccaagcttcacccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaa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ggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcacggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaat(配列番号1)
(配列番号2)
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgag(配列番号5)の(配列番号5)で示される以下の核酸配列によりコードされる。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDL(配列番号6)の配列番号6の配列を有する。この配列に対応するタンパク質の最初の25個のアミノ酸は、シグナル配列であり、細菌により分泌されるときに、LLOから切断される。従って、本実施形態では、完全長活性LLOタンパク質は、504残基長である。別の実施形態では、LLOタンパク質は、ジェンバンク受入番号DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452、またはU25452で規定される配列を有する。別の実施形態では、LLOタンパク質は、LLOタンパク質の変異体である。別の実施形態では、LLOタンパク質は、LLOタンパク質の同族体である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAGAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAACAACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCAGCTATACAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAAACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAACCAACAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCGGGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAATGCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAACGGGAGAGGCGGTAGACCA(配列番号8)の配列を含む組換えヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号8で示される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のActAをコードするヌクレオチドは、配列番号8で示される配列を含む。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号8の同族体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号8の変異体である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号8の断片である。別の実施形態では、ActAをコードするヌクレオチドは、配列番号8のアイソフォームである。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
別の実施形態では、ActA断片は、配列番号10で示される配列を含む。別の実施形態では、ActA断片は、当技術分野で既知の他のいずれかのActA断片である。それぞれの可能な形態は、本発明の別の実施形態となる。
実施例1:LLO−抗原融合体が抗腫瘍免疫を誘導
材料および実験方法(実施例1〜2)
細胞株
C57BL/6同系TC−1腫瘍をHPV−16E6およびE7で不死化し、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換した。T.C.Wu(ジョンホプキンズ大学医学部、Baltimore、MD)から入手したTC−1は、低レベルのHPV−16E6およびE7を発現している高度に腫瘍原性の肺上皮細胞であり、c−Ha−ras癌遺伝子で形質転換された。RPMI1640、10%FCS、2mM Lグルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、100μM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、50ミクロモル(mcM)2−ME、400マイクログラム(mcg)/ml G418、および10%National Collection Type Culture−109培地中、10%CO2下、37℃でTC−1を増殖させた。C3は、HPV16の全ゲノムで不死化された、C57BL/6マウス由来のマウス胚細胞で、pEJ−rasで形質導入された。EL−4/E7は、レトロウイルスを使用してE7で形質導入された胸腺腫EL−4である。
使用するリステリア株は、Lm−LLO−E7(エピソーム発現系のhly−E7融合遺伝子;図1A)、Lm−E7(リステリアゲノム中に組み込まれた単回コピーE7遺伝子カセット)、Lm−LLO−NP(「DP−L2028」;エピソーム発現系のhly−NP融合遺伝子)、およびLm−Gag(「ZY−18」;染色体中に組み込まれた単回コピーHIV−1Gag遺伝子カセット)とした。E7を、プライマー5’−GGCTCGAGCATGGAGATACACC−3’(配列番号24;XhoI部位を下線で示す)および5’−GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA−3’(配列番号25;SpeI部位を下線で示す)を使用してPCR増幅し、pCR2.1(Invitrogen、San Diego、CA)に連結した。E7をXhoI/SpeI消化によりpCR2.1から切り出し、pGG−55に連結した。hly−E7融合遺伝子および多機能性転写因子prfAを多コピーシャトルプラスミドのpAM401(Wirth R et al、J Bacteriol、165:831、1986)に挿入し、pGG−55を生成した。hlyプロモーターは、hly遺伝子産物の最初の441AA(溶血性C末端が欠けており、以降で「ΔLLO」と呼ばれる)の発現を推進する。この産物は、XhoI部位でE7遺伝子に連結されて、LLO−E7として転写され、分泌されるhly−E7融合遺伝子を生ずる。リステリアprfA陰性株のXFL−7(ペンシルベニア大学のDr.Hao Shenから入手)をインビボでのプラスミド保持のために選択されるpGG−55で形質転換した(図1A〜B)。プライマー5’−GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC−3’(配列番号26;NheI部位を下線で示す)および5’−CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC−3’(配列番号27;XhoI部位を下線で示す)を使用してhlyプロモーターおよび遺伝子断片を生成した。プライマー5’−GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT−3’(配列番号28;XbaI部位を下線で示す)および5’−CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG−3’(配列番号29;SalI部位を下線で示す)を使用してprfA遺伝子をPCR増幅した。E7の発現およびLMゲノムのorfZドメイン中への分泌を推進するhlyプロモーターおよびシグナル配列を含む発現カセットを導入してLm−E7を生成した。プライマー5’−GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC−3’(配列番号30;BamHI部位を下線で示す)および5’−GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG−3’(配列番号31;XbaI部位を下線で示す)を使用してE7をPCR増幅した。その後、E7をpZY−21シャトルベクターに連結した。LM株10403Sを得られたプラスミドのpZY−21−E7で形質転換した。このプラスミドは、LMゲノムのorfX、Y、Zドメインに対応する1.6−kb配列の中央に挿入された発現カセットを含む。相同性ドメインは、相同組換えによるE7遺伝子カセットのorfZドメインへの挿入を許容する。クローンをE7遺伝子カセットのorfZドメインへの組込みのために選別した。クロラムフェニコール(20μg/ml)を含む場合(Lm−LLO−E7およびLm−LLO−NP)、または含まない場合(Lm−E7およびZY−18)について、ブレインハートインフュージョン培地中で細菌を増殖した。細菌の一定分量を−80℃で凍結した。発現をウェスタンブロッティングで確認した(図2)。
リステリア株をLuria−Bertoni培地中、37℃で増殖させ、600nmで測定時の同一光学密度で採取した。上清をTCA沈殿させ、1×の0.1N NaOH補充試料緩衝液中に再懸濁した。同量のそれぞれの細胞沈殿物またはそれぞれのTCA沈殿後の上清を4〜20%トリスグリシンSDS−PAGEゲル(NOVEX、San Diego、CA)に添加した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗E7モノクローナル抗体(mAb)(Zymed Laboratories、South San Francisco、CA)でプローブした後、HRP標識抗マウス二次Ab(Amersham Pharmacia Biotech、Little Chalfont、U.K.)と共にインキュベートし、Amersham ECL検出試薬で展開し、Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)に露光した。
最小および最大表面積径を計るキャリパを使用して腫瘍を1日おきに測定した。これらの2つの測定値の平均を種々の時点で平均腫瘍径(ミリメートル)としてプロットした。腫瘍径が20mmに達するとマウスを屠殺した。それぞれの時点の生存マウスのみの腫瘍測定値が示される。
6〜8週齢のC57BL/6マウス(Charles River)の左脇腹に、2×105TC−1細胞を皮下注射した。腫瘍接種の1週間後、腫瘍が直径4〜5mmの触知可能サイズに達した。その後、7および14日目に、8匹のマウス群を0.1LD50i.p.Lm−LLO−E7(107CFU)、Lm−E7(106CFU)、Lm−LLO−NP(107CFU)、またはLm−Gag(5×105CFU)で免疫化処理した。
6〜8週齢のC57BL/6マウスを0.1 LD50のLm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagでi.p.免疫した。接種の10日後、脾臓を採取した。脾細胞を照射TC−1細胞と共に(100:1、脾細胞:TC−1)フィーダー細胞として培養し、インビトロで5日間刺激後、次記の標的を使用して標準51Cr放出アッセイに使用した:E7H−2bペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号32)を適用したEL−4、EL−4/E7、またはEL−4。E:T細胞比を80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、および2.5:1とし、それぞれを3通り作成した。37℃で4時間インキュベーション後、細胞を沈殿させ、各ウエルから50μlの上清を採取した。試料をWallac1450シンチレーションカウンター(Gaithersburg、MD)で評価した。特異的溶解パーセントを、[(実験カウント/分(cpm)−自然発生cpm)/(合計cpm−自然発生cpm)]×100として測定した。
C57BL/6マウスを0.1LD50のLm−LLO−E7、Lm−E7、Lm−LLO−NP、またはLm−Gagで免疫し、20日後、これらの1LD50のi.p.注射で追加免疫した。追加免疫の6日後、免疫および無処理マウスから脾臓を採取した。E7抗原供給源としての2.5×104、1.25×104、6×103、3×103照射TC−1細胞/ウエルと共に、またはTC−1細胞なしで、または10μg/ml Con Aと共に、平底96ウエルプレートで5×105/ウエルの脾細胞を培養した。45時間後、細胞に0.5μCi[3H]チミジン/ウエルを適用した。18時間後、Tomtecハーベスター96(Orange、CT)を使用してプレートの細胞を収集し、Wallac 1450シンチレーションカウンターで増殖状態を評価した。cpmの変化を、実験cpm−抗原なしの場合のcpm、として計算した。
C57BL/6マウスを0.1LD50Lm−LLO−E7またはLm−E7で静脈内(i.v.)免疫し、30日後、追加免疫した。CD8(53−6.7、PE標識)、CD62リガンド(CD62L;MEL−14、APC標識)、およびE7H−2Dbテトラマーに対し、CellQuest(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson、Mountain View、CA)を備えたFACSCalibur(登録商標)フローサイトメーターを使用して、三色フローサイトメトリーを行った。E7ペプチド(RAHYNIVTF)(配列番号32)または対照(HIV−Gag)ペプチドを保持したH−2Dbテトラマーを使用して追加免疫の5日後に採取した脾細胞を室温(rt)で染色した。テトラマーは1/200希釈で使用した。テトラマーは、Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic、Rochester、MN)ならびにNIAID Tetramer Core FacilityおよびNIH AIDS Research and Reference Reagent Programより提供を受けた。テトラマー+、CD8+、CD62Llow細胞を分析した。
24匹のC57BL/6マウスに5×105B16F0−Ova細胞を接種した。3、10および17日目に、8マウスからなる群を0.1LD50Lm−OVA(106cfu)、Lm−LLO−OVA(108cfu)で免疫し、8匹の動物を未処理で残した。
腫瘍径の比較のために、それぞれの群に対し腫瘍サイズの平均とSDを測定し、スチューデントt−検定により統計的有意性を決定した。p≦0.05を優位であると判断した。
Lm−E7およびLm−LLO−E7の能力のTC−1増殖に与える影響に関し比較した。C57BL/6マウスの左脇腹に皮下腫瘍を樹立した。7日後、腫瘍が触知できるサイズ(4−5mm)に達した。マウスを、7および14日目に、0.1 LD50Lm−E7、Lm−LLO−E7、または、対照としてLm−GagおよびLm−LLO−NPでワクチン接種した。Lm−LLO−E7は、75%の樹立TC−1腫瘍の完全縮小を誘導したが、一方、腫瘍増殖は、群中の他の2匹のマウスで制御された(図3)。対照的に、Lm−E7およびLm−Gagによる免疫化は、腫瘍縮小を誘導しなかった。この実験は複数回繰り返され、常に全く類似の結果であった。さらに、異なる免疫化プロトコル下でのLm−LLO−E7に対しても類似の結果が得られた。別の実験では、単回免疫化により、樹立された5mmのTC−1腫瘍マウスの治癒が可能であった。
Lm−LLO−E7を含むLm−E7によるT細胞の誘導を測定するために、免疫マウスの抗原特異的免疫能の尺度であるE7特異的増殖応答を測定した。20:1、40:1、80:1、および160:1の細胞:TC−1比でE7源として照射TC−1細胞に暴露した場合、Lm−LLO−E7免疫マウス由来脾細胞は増殖した(図4)。逆に、Lm−E7およびrLm対照免疫マウス由来の脾細胞は、バックグラウンドレベルの増殖を示すのみであった。
材料と実験方法
Lm−ActA−E7の作成
Lm−ActA−E7は、LMの組換え株であり、短縮型のactAタンパク質に融合されたE7タンパク質を発現するプラスミドを含む。Lm−actA−E7は、pDP−2028の修飾により作成されたプラスミドベクターpDD−1をリステリア中に導入することにより生成される。pDD−1は、310bpのhlyプロモーターおよびhlyシグナル配列(ss)のコピーを発現する発現カセットを含み、このカセットは、ActA−E7;4つのPEST配列(配列番号11)を含む1170bpのactA遺伝子(分子の最初の390AA(配列番号10)からなる短縮ActAポリペプチド);300bpのHPVE7遺伝子;1019bpのprfA遺伝子(病原性遺伝子の発現を制御する);および形質転換細菌クローンの選択のためのCAT遺伝子(クロラムフェニコール耐性遺伝子)の発現と分泌を促進する(Sewell et al.(2004)、Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.、130:92−97)。
Lm−ActA−E7がActA−E7(約64kD)を分泌することを検証するために、リステリア株をLuria−Bertoni(LB)培地中、37℃で増殖させた。培養液上清からトリクロロ酢酸(TCA)でタンパク質を沈殿させ、0.1Nナトリウム水酸化物を含む1×試料緩衝液に再懸濁した。同量の各TCA沈殿上清を4%〜20%のトリスグリシンナトリウムドデシル硫酸塩−ポリアクリルアミドゲル(NOVEX、San Diego、Calif)に添加した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、1:2500抗E7モノクローナル抗体(Zymed Laboratories、South San Francisco、Calif)、続けて、1:5000西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(Amersham Pharmacia Biotech、Little Chalfont、England)でプローブした。ブロットをAmersham増強化学ルミネッセンス検出試薬で展開し、オートラジオグラフィーフィルム(Amersham)に露光した(図5A)。
Lm−PEST−E7は、hly遺伝子のプロモーターおよびPEST配列、特に、LLOの最初の50AAのみを含むことを除いて、Lm−LLO−E7と同じである。Lm−PEST−E7を生成するために、SOE(重複伸張による遺伝子スプライシング)PCR技術を使用して、hlyプロモーターPEST領域を完全長E7遺伝子に融合した。E7遺伝子およびhly−PEST遺伝子断片をLLOの最初の441AAを含むプラスミドpGG−55から増幅し、通常のPCR技術により一緒にスプライシングした。最終プラスミド:pVS16.5を生成するために、hly−PEST−E7断片およびprfA遺伝子を、インビトロ選択のためにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドpAM401にサブクローンニングし、生成したプラスミドをXFL−7の形質転換に使用した。
Lm−ActA−E7の誘導と、Lm−LLO−E7の誘導による抗腫瘍免疫を比較するために、2×105TC−1腫瘍細胞をマウスの皮下に移植し、触知可能なサイズ(約5ミリメートル[mm])まで増殖させた。マウスを、7および14日目に、1LD50のLm−ActA−E7(5×108CFU)、(十字)Lm−LLO−E7(108CFU)(正方形)またはLm−E7(106CFU)(円)でi.p.免疫した。26日目まで、Lm−LLO−E7およびLm−ActA−E7の全動物は、無腫瘍のままであったが、一方、全無処理動物(三角形)およびLm−E7で免疫された動物は、大きな腫瘍に増殖した(図5B)。このように、ActA−E7融合体のワクチン接種は腫瘍縮小を引き起こした。
材料および実験方法
燐酸塩緩衝食塩水(PBS)中の100mclの2×105TC−1腫瘍細胞および400mclのMATRIGEL(登録商標)(BD Biosciences、Franklin Lakes、N.J.)を含む500mcl(マイクロリットル)のMATRIGEL(登録商標)を12匹のC57BL/6マウス(n=3)の左脇腹の皮下に移植した。7、14および21日目にマウスに腹腔内免疫し、28日目に脾臓および腫瘍を採取した。腫瘍MATRIGELをマウスから取り出し、氷上に置いた2ミリリットル(ml)のRP10培地を含むチューブ中、4℃で一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子で切り刻んで2mmのブロックにし、3mlの酵素混合物(PBS中の0.2mg/mlコラゲナーゼ−P、1mg/mlのDNアーゼ−1)と共に37℃で1時間インキュベートした。組織懸濁液をナイロンメッシュを通して濾過し、テトラマーおよびIFNガンマ染色のためにPBS中の5%ウシ胎仔血清+0.05%のNaN3で洗浄した。
Lm−ActA−E7の抗原特異的免疫を増大させる能力を分析するために、マウスにTC−1腫瘍細胞を移植し、Lm−LLO−E7(1×107CFU)、Lm−E7(1×106CFU)、もしくはLm−ActA−E7(2×108CFU)で免役化処理するか、または処理しなかった(無処理)。Lm−LLO−E7およびLm−ActA−E7群由来のマウスの腫瘍は、Lm−E7または無処理マウスより高いパーセンテージのIFNガンマ分泌CD8+T細胞(図7A)およびテトラマー特異的CD8+細胞(図7B)を含んでいた。
細菌株、形質転換および選択
大腸菌株MB2159を標準的プロトコルによる形質転換に使用した。細菌細胞をH2Oで洗浄することにより電気穿孔用の準備を行った。
plcA遺伝子の公開された配列(Mengaud et al.、Infect.Immun.198957、3695−3701)を使用して、染色体DNA由来の遺伝子をPCR増幅した。その後、増幅産物をSalI−およびXbaI−生成DNA末端を使用してpAM401に連結し、pDP1462を生成した。
以前記載(Camilli et al.、J.Bacteriol.1990、172、3738−3744)のように生成したSLCC5764のTn917−LTV3バンクから低減されたレシチナーゼ(PC−PLC)を有する変異体としてL.モノサイトゲネス株DP−L1387を単離した。以前記載(Sun et al.、Infect.Immun.1990 58、3770−3778)のように、Tn917−LTV3挿入部位を、1つのトランスポゾン染色体のDNA接合部をシーケンシングすることにより決定した。以前記載(Camilli et al.、同上)のように、L.モノサイトゲネスをプラスミドDNAで形質転換した。1mlの培地当たり10μgのクロラムフェニコールの存在下、L.モノサイトゲネス中でのpAM401、pKSV7、およびそれらの誘導体の維持のための選択圧を加えた。さらに、pKSV7誘導体の維持には、グラム陽性細菌中でのプラスミド複製に許容される温度の30℃下の増殖が必要である。
染色体遺伝子と、元の850−bpdal遺伝子PCR産物の5′末端由来の450−bp断片と、dal遺伝子PCR産物の3′末端由来の450−bp断片との間にエリスロマイシン耐性遺伝子を保持する温度感受性シャトルプラスミドpKSV7(Smith K et al、Biochimie.1992 Jul−Aug;74(7−8):705−11)との間での二重対立遺伝子交換によりdal遺伝子を最初に不活化した。その後、所望の欠失周辺のインタクト遺伝子の5′および3′末端(遺伝子の上流および下流配列を含む)由来の相同性領域を保持するpKSV7との類似の交換反応によりの82%の範囲にわたるdal遺伝子を欠失した変異体を生成した。PCR分析を使用してこの染色体の欠失構造を確認した。
標準的方法に従って大腸菌を培養した。リステリアを、250rpm振盪下、LB培地(Difco、Detroit、MI)+50μg/mlストレプトマイシン中、37℃で増殖させ、指数増殖期中に採取した。Lm−LLOE7に対しては、培地に37μg/mlクロラムフェニコールを加えた。増殖動速度を測定値するために、細菌を10mlのLB+抗生物質中で16時間増殖させた。OD600nmを測定し、株間で培養密度を正規化した。LB+適切な抗生物質および該当する場合にはD−アラニンを加えて、培養液を1:50に希釈した。
1×108CFUをC57BL/6マウスの腹腔内(i.p.)に注射した。3日目に、脾臓を単離し、PBS中でホモジナイズした。適用可能な場合には抗生物質を含むLBプレート上に一定分量の脾臓懸濁液を蒔いて培養した。いくつかのコロニーを増殖させ、混合して注入用ストックを形成した。
p60−dalカセットの作成。
抗生物質耐性遺伝子不含ベクターの作成の最初のステップは、短縮p60プロモーターのdal遺伝子への融合体の作成であった。LMアラニンラセマーゼ(dal)遺伝子(順方向プライマー:5’−CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC−3’;配列番号41)(逆方向プライマー:5’−GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG−3’;配列番号42)および最小p60プロモーター配列(順方向プライマー:5’−TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC−3’; 配列番号43)(逆方向プライマー:5’−GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC−3’;配列番号44)をLM株10403SのゲノムからPCR増幅によって単離した。その後のスプライス重複伸張(SOE)−PCRによるp60とdalの融合のために、プライマーは、PacI部位をp60配列の上流に、NheI部位をdal配列の下流に(太字:制限酵素部位)に、さらに重複dal配列(最初の18bp)をp60プロモーターの下流に導入した。短縮p60プロモーターの配列は:CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(配列番号45)(Kohler et al、J Bacteriol 173:4668−74、1991)であった。SOE−PCRを使用して、p60およびdal PCR産物を融合し、クローニングベクターpCR2.1(Invitrogen、La Jolla、CA)に挿入した。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子をpGG55から除去、およびp60−dalカセットを導入するためのその後のクローニング法では、グラム陽性複製領域の除去が散発的に発生した(oriRep;Brantl et al、Nucleic Acid Res 18:4783−4790、1990)。グラム陽性oriRepを再導入するために、NarI/EheI部位を配列(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG、配列番号46)の上流に追加する5’−プライマー、およびNheI部位を配列(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG、配列番号47)の下流に追加する3’−プライマーを使用してoriRepをpGG55からPCR増幅した。PCR産物をクローニングベクターpCR2.1に挿入し、配列を確認した。
Masterpure(登録商標)全DNAキット(Epicentre、Madison、WI)を使用して全リステリアDNAを調製した。25mlのLuria−Bertoniブロス(LB)中、250rpmの振盪下、37℃で24時間リステリアを培養した。細菌細胞を遠心分離により沈殿させ、5mg/mlのリゾチーム補充PBS中に再懸濁し、37℃で20分間、インキュベートした後、DNAを単離した。
プラスミド標的としてE7を含むTaqmanプライマープローブセット(Applied Biosystems、Foster City、CA)をABI PrimerExpressソフトウェア(Applied Biosystems)を用い、リステリアゲノム標的として下記のプライマーを使用して設計した:5’−GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG−3’(配列番号52);5’−TGCCCATTAACAGGTCTTCCA−3’(配列番号53);5’−FAM−TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC−TAMRA−3’(配列番号54)および1コピー遺伝子plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG−3’(配列番号55)、5’−GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC−3’(配列番号56);5’−TET−TTAATGTCCATGTTATGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA−TAMRA−3’;配列番号57)。
細菌を、Luria Bertani(LB)培地+/−100マイクログラム(μg)/ml D−アラニンおよび/または37μg/mlクロラムフェニコール中、37℃、250rpm振盪下で増殖させた。OD600nm測定値に基づいて全ての株で同じになるように出発接種菌を調節した。
4×109CFUのリステリアを解凍し、遠心分離(1分、14000rpm)で沈殿させ、1Mシステインを含む100μl PBS、pH5.5中に再懸濁した。細菌を1:2系列希釈し、分泌LLOを活性化するために37℃で45分間インキュベートした。脱繊維素全ヒツジ血液(Cedarlane、Hornby、Ontario、Canada)を5倍量のPBSで2回、6倍量のPBS−システインで3〜4回、上清が透明なままになるまで洗浄し、洗浄ステップの間に3000×gで8分間細胞を沈殿させて、再懸濁して最終濃度のPBS−システイン中10%(v/v)とした。100μlの10%洗浄血液細胞を100μlのリステリア懸濁液と混合し、37℃でさらに45分間インキュベートした。次に、非溶解血液細胞を遠心分離(10分、1000×g)で沈殿させた。100μlの上清を新規プレートに移し、OD530nmを測定し、試料希釈に対しプロットした。
105TC−1(ATCC、Manassas、VA)をC57BL/6マウス(n=8)の皮下に移植し、約7日間増殖させた後、腫瘍が触知可能となった。TC−1は、HPV E6およびE7で不死化され、活性化rasで形質転換された皮下移植時に腫瘍を形成するC57BL/6上皮細胞系統である。マウスを腫瘍細胞移植後7および14日目に0.1LD50の適切なリステリア株で免疫した。また、非免疫対照群(無処理)も含めた。腫瘍増殖を電子キャリパで測定した。
株Lmdaldat(Lmdd)は、病原性因子:ActAの不可逆的欠失により弱毒化された。下流遺伝子の発現に対しどのような極性効果も与えないようにLmdaldat(Lmdd)バックグラウンド中のactAのインフレーム欠失が形成された。LmdaldatΔactAは、ActAのN末端の最初の19アミノ酸およびC末端の28アミノ酸残基を含み、591アミノ酸を欠失している。染色体スポット中の遺伝子の欠失は、actA欠失領域外にアニーリングするプライマーを使用して確認した。これらは、図12に示すプライマー3(Adv305−tgggatggccaagaaattc)(配列番号58)および4(Adv304−ctaccatgtcttccgttgcttg)(配列番号59)である。LmddおよびLm−ddΔactAから単離された染色体のDNAに対しPCR分析を行った。2つの異なるセットのプライマー対1、2および3、4で増幅後のDNA断片のLm−dd染色体DNA中のサイズは、3.0Kbおよび3.4Kbであると予測された。しかし、Lm−ddΔactAに対しては、プライマー対1、2および3、4を使ったPCRの予測サイズは、1.2Kbおよび1.6Kbであった。従って、図12のPCR分析で、株:Lm−ddΔactA中のactAの1.8kb領域が欠失したことが確認される。また、PCR産物に対しDNAシーケンシングを行い、株:Lm−ddΔactA中のactA含有領域の欠失が確認された(図13)。
(配列番号60)。
RAW264.7などのマクロファージを、Lm prfA−(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actA ΔinlCおよびLm dal dat ΔinlCなどの異なるリステリア骨格に感染させ、上清を異なる時点で採取し、異なるELISAベースキットを使用して種々のサイトカインのレベルを定量した。定量したサイトカインには、IFN−g、TNF−αおよびIL−6が含まれる。
サイトカイン産生および好中球の補充をインビボで測定するために、別々の108CFUのLm prfA−(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actA ΔinlCおよびLm dal dat ΔinlC、リステリア対照または等容量の食塩水をC57BL/6マウスの腹腔内に注射した。12時間後、マウスを屠殺し、腹腔を2mLのPBSで洗浄した。増殖培地上での平板培養、およびMIP−1a、KC、MCPなどの炎症促進性サイトカインの分析後、腹腔洗浄液の細菌量を調べた。Gr−1、CD11bおよびF4/80などのマーカーで染色後、フローサイトメトリーを使用して、好中球およびマクロファージの数を測定し、さらに、CellQuestソフトウェアを使用してこれらの集団を定量した。
このアッセイは、骨髄由来マクロファージまたは樹状細胞のinlC欠失株への感染後、好中球の遊走の増加があるか否かを測定するために行われる。骨髄由来マクロファージまたは樹状細胞は、C57BL/6などのマウスから単離され、inlC欠失変異体または対照リステリアに感染させられる。トランスウェルアッセイは、感染細胞を使用してCorning Costarトランスウェルプレートにより設定される。アッセイは、最初、3、5、または8ミクロン気孔トランスウエルプレートを使用して標準に合わせられる。好中球遊走を試験するために、チャンバー中のプレートの底に感染APCを、ウエルの上部に好中球を播種した。異なる時点で細胞を計数して、底部に遊走した好中球の数を測定した。
inlC変異体の治療有効性を測定するために、ヒト前立腺特異的抗原(PSA)を概念実証としての腫瘍抗原として使用する。骨格Lm dal dat actA inlCは、LmddAinlC142を生ずるヒトPSA用の発現カセットを含むプラスミド:pAdv142で形質転換される。株LmddAinlC142は、融合タンパク質:tLLO−PSAの発現および分泌で特徴付けられる。さらに、株LmddAinlC142は、マウス中、インビボで2回継代培養され、2回のインビボ継代後に得られたコロニーの融合タンパク質:tLLO−PSAの発現および分泌が検査される。2回目のインビボ継代後得られたコロニーからワクチン作業ストックが調製され、治療効果および免疫原性の評価に使用される。
LmddA、LmddAΔactA、LmddAΔPlcA、LmddAΔPlcB、LmddAΔprfA、LmddAinlC142、LmddA142および他の対照株の腫瘍微小環境中で免疫細胞の浸潤を引き起こす能力が測定される。この調査では、0日目に、1×106TPSA23腫瘍細胞がマウスに接種され、7、14および21日目に、108CFUのLmddAinlC142、LmddA142および他の対照株でワクチン接種される。28日目に腫瘍を採取し、さらに、Gr−1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1およびCD62Lなどの異なる細胞表面マーカーで染色するための処理を行う。これらのマーカーを使用して調べられる異なる細胞集団には、マクロファージ(CD11b+)、NK細胞(NK1.1+)、好中球(Gr−1+CD11b+)、ミエロイド由来サプレッサー細胞(MDSC)(Gr−1+CD11b+)、制御性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+)およびエフェクターT細胞(CD8+CD3+CD62Llow)が含まれる。さらに、エフェクターT細胞は、IFN−g、TNF−aおよびIL−2などのエフェクターサイトカインを産生するその機能的能力により特徴付けられる。腫瘍内制御性T細胞およびMDSCの、T細胞増殖性の抑制を引き起こす能力に関し試験を行う。
実施例5:抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素を含むプラスミドがインビトロおよびインビボの両方で大腸菌およびLM中に保持される
抗生物質耐性遺伝子を使用しないでLM中のプラスミドの保持を媒介するために、D−アラニンラセマーゼベースの栄養要求株補完系を利用した。大腸菌株MB2159は、D−アラニンラセマーゼを合成できないalr(−)/dadX(−)欠損変異体である。リステリア株Lmdal(−)/dat(−)(Lmdd)は、dalおよびdat遺伝子の部分的欠失に起因して、同様に、D−アラニンラセマーゼを合成できない。大腸菌リステリアシャトルベクターpAM401をベースにしたプラスミドpGG55は、リステリアp60プロモーターの制御下で、両方のCAT遺伝子の除去およびそれらのp60−dal発現カセットによる置換により改変され、pTV3を生成した(図9)。DNAをいくつかのコロニーから精製した。
病原性はLLO機能に関連しているので、Lmdd−TV3とLm−LLOE7との間の溶血性溶解活性を比較した。このアッセイは、赤血球の溶解によりLLO機能を試験するもので、培養液上清、精製LLOまたは細菌細胞を使用して行うことができる。Lmdd−TV3は、Lm−LLOE7より高い溶血性溶解活性を示した。
代謝酵素含有プラスミドの癌ワクチンとしての有効性を腫瘍縮小モデルで測定した。HPVワクチン開発用として十分に特徴が明らかにされ、Lmdd−TV3またはLm−LLOE7で免疫化後の類似サイズの樹立腫瘍縮小の対照比較を可能とするTC−1細胞株モデルを使用した。2つの別々の実験では、Lmdd−TV3およびLm−LLOE7によるマウスの免疫化は、ワクチン接種群間で統計的に有意差のない(p<0.05)類似の腫瘍縮小を生じた(図14)。全免疫マウスは、63日後でもまだ生存していたが、一方、非免疫マウスは、それらの腫瘍が20mm直径に達すると屠殺しなければならなかった。治癒マウスは、実験の終了まで無腫瘍のままで残った。
inlC欠失変異体は、感染部位への好中球および白血球の浸潤を生ずるMIP−1a、KC(IL−8のマウス相同体)、MCPなどの極めて高いレベルのケモカインを生成する。従って、異なるリステリア株が腹腔内に投与される場合、inlC変異体は、これらのサイトカインおよびケモカインの産生の増加を示し、これらは、注射の12時間後に得られた腹水中の好中球およびマクロファージを引きつける。さらに、inlC欠失変異体は、対照株に比べて極めて高いレベルの炎症性サイトカインを生成する。
inlC欠失変異体に感染したマクロファージは、他の対照株と比較した場合、種々の時点で、好中球の遊走の顕著な増加を示す。この実験の結果は、感染中の好中球などの免疫細胞を引きつけるこの株の能力を強く裏付ける。
LmddA142およびLmddAinlC142の両方を使った抗腫瘍調査の結果は、相互に極めて類似しており、腫瘍の治療的縮小が観察される。さらに、高レベルの自然応答および炎症促進性サイトカインの分泌の増加を生ずるする能力のために、2用量のLmddAinlC142は、3用量の株LmddA142に相当する。
Invitrogen(Carlsbad、CA)でオリゴヌクレオチドを合成し、Genewiz Inc、South Plainfield NJでDNAシーケンシングを行った。フローサイトメトリー試薬をBecton Dickinson Biosciences(BD、San Diego、CA)から購入した。特に示さない限り、細胞培地、栄養補助剤および全ての他の試薬をSigma(St.Louise、MO)から入手した。EZbiolabs(Westfield、IN)でHer2/neuHLA−A2ペプチドを合成した。完全RPMI1640(C−RPMI)培地には、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、および1mMピルビン酸ナトリウム塩、10%ウシ胎仔血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、ヘペス(25mM)を含めた。ポリクローナル抗LLO抗体については、前に記載した。抗Her2/neu抗体はSigmaから購入した。
全ての動物実験をペンシルバニア大学またはラトガース大学のIACUCによる承認プロトコルに従って行った。FVB/NマウスをJackson laboratories(Bar Harbor、ME)から購入した。ラットHer2/neu腫瘍タンパク質を過剰発現するFVB/N Her2/neu遺伝子導入マウスを、ペンシルバニア大学の動物ケア施設に収容、飼育した。高レベルのラットHer2/neuタンパク質を発現するNT−2腫瘍細胞株をこれらのマウスの自然乳房腫瘍から得て、前に記載のように増殖させた。DHFR−G8(3T3/neu)細胞をATCCから入手し、ATCCの推奨方法に従って増殖させた。EMT6−Luc細胞株はDr.John Ohlfest(ミネソタ大学、MN)からいただいた贈呈品であるが、これを完全C−RPMI培地中で増殖させた。生物発光作業は、小動物イメージング施設(SAIF)のガイダンスに従いペンシルバニア大学(Philadelphia、PA)で行った。
Her2/neu−pGEM7Zは、ペンシルバニア大学のDr.Mark Greeneにより提供いただいたが、これはpGEM7Zプラスミド(Promega、Madison WI)に挿入された完全長ヒトHer2/neu(hHer2)遺伝子を含んでいた。hHer−2/neuの3種のセグメント、すなわち、EC1、EC2、およびIC1を、pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)および表1に示すオリゴを使用してPCRで増幅するためのテンプレートとしてこのプラスミドを使用した。
3〜5匹のFVB/Nマウス群を、1×108コロニー形成単位(CFU)のLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、Lm−hHer2ICIまたはLm対照(無関係の抗原を発現している)で1週間おきに3回免疫するか、または無処理で残した。NT−2細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り外し、マイトマイシンC(血清不含C−RPMI培地中の250mg/ml)を使用して37℃で45分間処理した。5回の洗浄後、それらを免疫または無処理動物から採取した脾細胞と共に、1:5(刺激物質:レスポンダー)比率、5%CO2下、37℃で5日間共インキュベートした。ユーロピウム標識3T3/neu(DHFR−G8)細胞を標的として使い、以前記載の方法に従って標準的細胞傷害性アッセイを行った。4時間のインキュベーション後、分光光度計(PerkinElmer、Victor2)を使用して、死滅させた標的細胞から放出されたユーロピウムを590nmで測定した。特異的溶解パーセントを、
(実験群の溶解−自然溶解)/(最大溶解−自然溶解)
として定義した。
3〜5匹のFVB/NまたはHLA−A2遺伝子導入マウス群を、1×108(CFU)のADXS31−164:陰性リステリア対照(無関係の抗原を発現している)で1週間おきに3回免疫するか、または無処理で残した。最後の免疫の1週間後、FVB/Nマウス由来の脾細胞を単離し、24ウエルプレートを用い、5×106細胞/ウエル、C−RPMI培地中のマイトマイシンC処理NT−2細胞の存在下で共培養した。HLA−A2遺伝子導入マウス由来の脾細胞を、大腸菌中で産生され、ニッケルベース親和性クロマトグラフィーシステムで精製された、1μMのHLA−A2特異的ペプチドまたは1μg/mlの組換えHis−タグChHer2タンパク質の存在下でインキュベートした。24または72時間後、上清由来試料を得た後、マウスIFN−γ酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)キットを使用して、製造業者の推奨法に従いインターフェロン−g(IFN−g)の存在に関する試験を行った。
6週齢のFVB/NラットHer2/neu遺伝子導入マウス(9〜14匹/群)を、5×108CFUのLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164またはLm対照で6回免疫した。それらのマウスの自然乳房腫瘍の出現を週2回観察し、電子キャリパを使用して52週まで測定した。腫瘍が平均直径で1cm2のサイズに達すると、生育した腫瘍を摘出し、−20℃でRNAlater中に保存した。Her2/neuタンパク質中の変異がこれらの腫瘍の生育に与える影響を測定するために、ゲノムDNA単離キットを使用してゲノムDNAを抽出し、配列決定した。
マウスの皮下に(s.c.)1×106NT−2細胞を移植した。7、14および21日目に、1×108CFUのADXS31−164、LmddA対照でマウスを免疫するか、または無処理で残した。28日目に腫瘍および脾臓を抽出し、FACS分析によりCD3+/CD4+/FoxP3+Tregの存在に関する試験を行った。簡単に説明すると、C−RPMI培地中の2枚のガラススライドの間で脾臓をホモジナイズすることにより脾細胞を単離した。腫瘍を無菌のカミソリの刃を使用して刻み、PBS中のDNアーゼ(12U/ml)およびコラゲナーゼ(2mg/ml)含有緩衝液で消化した。室温で攪拌しながら60分間インキュベーションを行った後、細胞を激しいピペット操作により分離した。赤血球をRBC溶解緩衝液で溶解し、続いて、10%FBS含有完全RPMI−1640培地で数回洗浄した。ナイロンメッシュを通して濾過後、腫瘍細胞および脾細胞をFACS緩衝液(2%FBS/PBS)に再懸濁し、抗CD3−PerCP−Cy5.5、CD4−FITC、CD25−APC抗体で染色し、続けて透過処理し、抗Foxp3−PEで染色した。4色FACScalibur(BD)を使用してフローサイトメトリー分析を行い、データをquestsoftware(BD)を使用して分析した。
生存データ用にログランク検定、カイ二乗検定を使用し、CTLおよびELISAアッセイ用にスチューデントt−検定を使用し、アッセイを3回繰り返した。これらの解析では、0.05未満のp値(*で標識)を統計的に有意であると見なした。全ての統計解析をプリズムソフトウェア、V.4.0a(2006)またはSPSSソフトウェア、V.15.0(2006)で行った。別段の記載がない限り、全てのFVB/NラットHer2/neu遺伝子導入調査に対しては、8〜14匹のマウス/群を使用し、全ての野性型FVB/N調査に対しては、少なくとも8匹のマウス/群を使用した。Her2/neu遺伝子導入マウスモデルの長期腫瘍試験を除いて、全ての調査を少なくとも1回繰り返した。
実施例11:Her−2断片に融合したLLO断片を分泌するL.モノサイトゲネス株の生成:ADXS31−164の作成
キメラHer2/neu遺伝子(ChHer2)の作成は前に記載した。簡単に述べると、Her2/neuタンパク質の2つの細胞外断片(aa40〜170およびaa359〜433)および1つの細胞内断片(aa678〜808)の重複伸長による遺伝子スプライシングPCR法による直接融合法を使用してChHer2遺伝子を生成した。キメラタンパク質は、既知のヒトMHCクラスIタンパク質の大部分のエピトープを含む。プラスミド:pAdv138(Lm−LLO−ChHer2の作成に使われる)からChHer2遺伝子を切り出し、LmddAシャトルプラスミドに挿入し、プラスミドpAdv164を得る(図15A)。これらの2つのプラスミド骨格の間には2つの大きな差異がある。1)pAdv138は、組換え細菌のインビトロでの選択のためにクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を使う一方で、pAdv164は、枯草菌由来のD−アラニンラセマーゼ遺伝子(dal)を持ち、これは、dal−dat遺伝子を欠くLmddA株中のインビトロでの選択用およびインビボでのプラスミド保持用に代謝補完経路を使う。このワクチンプラットホームは、操作リステリアワクチン株の抗生物質耐性に関するFDAの懸念に対処するために設計・開発された。2)Lmdd株のインビボでの補完に必要ではないので、pAdv138とは異なり、pAdv164は、プラスミド中にprfA遺伝子のコピーを持たない(下記配列および図15A参照)。また、LmddAワクチン株は、actA遺伝子(リステリアの細胞内移動および細胞から細胞への伝染の原因となる)が欠失し、そのため、この骨格由来の組換えワクチン株は、その親株のLmdd由来のワクチン株よりも病原性が100倍少ない。また、LmddAベースワクチン剤は、LmddAベースワクチン剤よりもはるかに速く(48時間未満に)免疫マウスの脾臓から排出される。約104KDのバンドがウェスタンブロット分析を使用して抗LLO抗体により検出されたので、この株からの融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現および分泌は、インビトロ増殖の8時間後のTCA沈殿細胞培養液上清中のLm−LLO−ChHer2の発現および分泌と同等であった(図15B)。tLLOのみを発現しているリステリア骨格株を陰性対照として使った。
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抗Her2/neu特異的細胞傷害性T細胞の生成の観点からADXS31−164の免疫特性を標準的CTLアッセイによりLm−LLO−ChHer2ワクチンの特性と比較した。両ワクチン剤は、強力に誘発するが、3T3/neu標的細胞によって発現するHer2/neu抗原に対する細胞傷害性T細胞応答は同等である。従って、LLOに融合したHer2の細胞内断片のみを発現しているリステリアで免役されたマウスは、より多くのMHCクラスIエピトープを含むキメラより低い溶菌活性を示した。無処理の動物または無関係のリステリアワクチンを注射されたマウスではCTL活性は検出されなかった(図16A)。また、ADXS31−164は、野性型FVB/Nマウス由来の脾細胞によりIFN−γの分泌を刺激することが可能であった(図16B)。このことは、高レベルのHer2/neu抗原を発現するマイトマイシンC処理NT−2細胞と共培養されたこれらの細胞培養液上清中で検出された(図19C)。
20〜25週齢で増殖が遅い自然乳房腫瘍を発症するHer2/neu遺伝子導入動物中のADXS31−164の抗腫瘍効果を、Lm−LLO−ChHer2と比較した。無関係のリステリア対照ワクチンで免疫された全ての動物は、21〜25週以内に乳房腫瘍を発症し、33週の前に屠殺された。対照的に、リステリア−Her2/neu組換えワクチン剤は、乳房腫瘍の形成の遅延を生じた。45週目では、Lm−LLO−ChHer2で免役されたマウスの場合の25%に比べて、50%超のADXS31−164ワクチン接種マウス(9匹の内の5匹)がその時点でも無腫瘍であった。52週目には、ADXS31−164で免疫の8匹のマウスの内の2匹がその時点でも無腫瘍のまま残り、一方、他の実験群の全てのマウスは、既に疾患で死亡してしまった(図17)。これらの結果は、ADXS31−164は、より弱毒化されているにも関わらず、Her2/neu遺伝子導入動物の自然乳房腫瘍の発症の防止の点でLm−LLO−ChHer2より効果的であることを示している。
Her2/neuのMHCクラスIエピトープの変異は、小断片ワクチン剤またはトラスツズマブ(ハーセプチン)(Her2/neuの細胞外ドメイン中のエピトープを標的とするモノクローナル抗体)で免疫時に腫瘍成長を引き起こすと考えられてきた。これを確かめるために、ゲノム材料を遺伝子導入動物の生育腫瘍から抽出し、キメラまたは対照ワクチン剤で免役された腫瘍中の対応するneu遺伝子の断片を配列決定した。どのワクチン接種腫瘍試料のHer−2/neu遺伝子内にも変異は観察されず、別の生育機序を示唆している(データは示さず)。
ADXS31−164の脾臓および腫瘍中の制御性T細胞の発生頻度に与える影響を明らかにするために、マウスにNT−2腫瘍細胞を移植した。3回の免疫後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Tregの染色を行った。Tregは、CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞として定義されたが、別々に分析した場合、FoxP3またはCD25マーカーを使用しても同様の結果が得られた。結果は、無関係のリステリアワクチンまたは無処理動物に比べて、ADXS31−164による免疫は脾臓中のTregの発生頻度に対し影響を与えないことを示した(See図18)。対照的に、リステリアワクチン剤による免疫は、腫瘍中のTregの存在に対しかなりの影響を生じた(図19A)。無処理腫瘍の全CD3+T細胞の平均19.0%がTregであったが、この発生頻度は、無関係のワクチンでは4.2%に、ADXS31−164では3.4%に減少し、腫瘍内Tregの発生頻度は5倍の減少であった(図19B)。いずれかのLmddAワクチン剤で処理したマウス中の腫瘍内Tregの発生頻度の減少の原因を腫瘍サイズの差異に帰することはできなかった。代表的実験では、ADXS31−164で免役されたマウス由来の腫瘍径[6.71±0.43、n=5]は、未処理マウス由来の腫瘍径(平均径(mm)±SD=8.69±0.98、n=5、p<0.01)または無関係のワクチンで処理した腫瘍径(8.41±1.47、n=5、p=0.04)よりもかなり小さいが、一方、これらの後者の2群の比較は、腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった(p=0.73)。LmddAワクチン剤で処理した腫瘍中のより低いTreg発生頻度は、腫瘍内CD8/Treg比率の増加を生じ、LmddAワクチン剤で免疫後に、より好ましい腫瘍微小環境を得ることができることを示唆している。しかし、標的抗原HER2/neu(ADXS31−164)を発現しているワクチンのみが、腫瘍増殖を低減でき、このことは、Tregの減少は、腫瘍中の抗原特異的応答の存在下でのみ効果があることを示す。
actAプロモーター領域およびActAのN末端の1〜233アミノ酸に対応するDNAを、リステリアゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマー:ActA−F−5’−atcccgggtgaagcttgggaagcagttggg−3’(XmaI)(配列番号77)およびActA−R−attctagatttatcacgtacccatttccccgc(XbaI)(配列番号78)を使用して増幅した。クローニングに使用した制限酵素部位を下線で示す。XmaI/XbaIセグメントをプラスミドpNEB193中に挿入し、pNEB193−ActAを形成した。さらに、キメラHer2の抗原2を、プライマー:Ch−Her2−F−5’−attctagaacccacctggacatgctccgccac−3’(XbaI)(配列番号79)およびCh−Her2−R−5’−gtcgacactagtctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggc−3’(RE部位−SalI−SpeI−SacI−BglII)(配列番号80)を使用してPCR増幅した。Ch−Her2のXbaIおよびSalI断片をプラスミドpNEB193−ActA中に挿入し、pNEB193−ActA−Ch−Her2プラスミドを作成した。HisタグDNA配列をSacIとSpeI制限酵素部位との間のCh−Her2逆方向プライマー配列中に含めている。XmaI/SpeI制限pAdv134中にクローニングしてデュアルプラスミドを作成するために、プラスミドpNEB193−ActA−Ch−Her2からtActA−Ch−Her2−Hisに対応するXmaI/SpeI断片を切り出した。
MDSCおよびTreg機能
腫瘍を、腫瘍モデルに応じてマウスの側腹部または生理的部位に移植した。7日後、マウスにワクチン接種したが、初回のワクチン接種日は、使われる腫瘍モデルに依存する。次いで、ワクチン投与1週後、マウスに追加免疫ワクチンを投与した。
ELISAによるサイトカイン分析に対しては、脾細胞を採取し、培地、SEAまたはconA(陽性対照として)の存在下、1.5百万細胞/ウエルを48ウエルプレートに播種した。72時間のインキュベーション後、上清を採取し、ELISA(BD)によりサイトカインレベルを分析した。抗原特異的IFN−γELISpotに対しては、脾細胞を採取し、培地、特異的CTLペプチド、無関係のペプチド、特異的ヘルパーペプチドまたはconA(陽性対照として)の存在下、300Kおよび150K細胞/ウエルをIFN−γELISpotプレートに播種した。20時間のインキュベーション後、ELISpots(BD)を行い、Immunospotanalyzer(C.T.L.)でスポットを計数した。スポットの数/百万脾細胞を図表化した。
実施例17:リステリアワクチン処理後のサプレッサー細胞機能
0日目に、腫瘍をマウスに移植した。7日目に、マウスをLmdda−E7またはLmddA−PSAでワクチン接種した。14日目に、腫瘍を採取し、ワクチン接種および無処理分に対し浸潤MDSCおよびTregの数とパーセンテージを測定した。リステリア処理マウスの腫瘍中でMDSCおよびTregの両方のパーセンテージ、ならびにMDSCの絶対数の減少があり、一方、同じ効果は、脾臓または流入領域リンパ節(TLDN)中では観察されないことが明らかになった(図21)。
非特異的に活性化した無処理マウス細胞を含むTPSA23腫瘍、および特異的に活性化した細胞(PSA、CA9、PMA/イオノマイシン)から単離した単球性および顆粒球性MDSCを使用して、サプレッサーアッセイを行った。結果は、Lmワクチン接種群由来細胞から単離したMDSCが、無処理マウスの腫瘍由来MDSCに比べて、活性化したT細胞の分裂を抑制する能力を弱めることを示した(図22と24のLm−LLO−PSAおよびLm−LLO−処理群を参照されたい。図の右側パネルは、左側パネルのデータを統合した細胞分裂データを示す)。さらに、MDSCが存在せず、細胞が刺激されず/活性化された場合の非処理マウス由来のTレスポンダー細胞は、それらの親(休止)状態(図22と24)のままであり、一方、PMAまたはイオノマイシンで刺激されたT細胞は、複製することが観察された(図22と24)。さらに、Gr+Ly6G+およびGrdimLy6G−MDSCの両方で、リステリアワクチン剤で処理後の抑制作用が少ないことが認められた。活性化PSA特異的T細胞および非特異的(PMA/イオノマイシン刺激された)T細胞の両方の分裂を抑制するそれらの能力の低下についても同じことが言える。
リステリア処理後、TPSA23腫瘍から単離されたTregを使用してサプレッサーアッセイを行った。リステリアで処理後、腫瘍由来Tregの抑制能力の低下が認められた(図26)が、しかし、脾臓Tregは、まだ抑制的であることが認められた(図27)。
4T1腫瘍を使用して上記と同じ実験を行い、同じ観察結果、すなわち、MDSCはリステリアワクチン接種後、抑制力が低下すること(図29と31)、リステリアは、脾臓単球性MDSCに対しては特異的効果がないこと(図30と32)、リステリアワクチン接種後、4T1腫瘍由来のTregの抑制能力が低下すること、(図33)、およびリステリアは、脾臓Tregの抑制能力に対し効果を示さないこと(図34)が得られた。
LLOプラスミドは、TAAまたは無関係の抗原を含むリステリアワクチン剤と類似の結果を示す(図35)。これは、顆粒球性MDSCの抑制能力の変化はtLLOの過剰発現が原因であり、相手の融合抗原とは無関係であることを意味する。また、空のプラスミド構築物単独でも、MDSCの抑制能力の変化につながるが、プラスミド上に短縮LLOを含むワクチン剤のいずれかと正確に同じレベルではない。平均3回の独立した実験は、空のプラスミドとtLLOを含む他のプラスミド(腫瘍抗原を含んでも、含まなくても)との間の抑制の差は、かなり大きいことを示す。抗原特異的または非特異的に刺激されたレスポンダーT細胞が使われたかどうかという事実に関係なく、MDSC抑制能力の減少は同等である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において、浸潤Tリンパ球/サプレッサー細胞比率を増大させるための方法であって、上記対象に弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を投与するステップを含む方法。
(項目2)
上記浸潤Tリンパ球がCD8 + T細胞またはCD4 + T細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記サプレッサー細胞が制御性T細胞(Treg)または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、項目1〜2のいずれか1項に記載の方法。
(項目4)
上記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性PEST含有ポリペプチドである、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
上記リステリアが、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをそれぞれコードする第1の読み枠および少なくとも第2の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記第1のポリペプチドおよび上記第2のポリペプチドが、内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
上記核酸が第3のポリペプチドをコードする第3の読み枠をさらに含み、上記第3のポリペプチドが、内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
上記第1の異種抗原、上記第2の異種抗原、または上記第3の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、項目1〜3または5〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
上記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、上記代謝酵素が、上記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
上記追加の読み枠によりコードされる上記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素である、項目8に記載の方法。
(項目10)
上記リステリアが、第2の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
上記代謝酵素がD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目10に記載の方法。
(項目12)
上記組換えリステリアが、ゲノムActA遺伝子、PlcA遺伝子、PrfA遺伝子またはPlcB遺伝子の変異または欠失を含む、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
上記核酸分子が上記リステリアゲノム中に組み込まれる、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
上記核酸分子が、抗生物質による選択のない場合に、上記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
上記PEST含有ポリペプチドが、N末端短縮LLOポリペプチド、N末端ActAポリペプチド、もしくはPESTペプチド、またはそれらの機能性断片である、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
上記第1抗原、上記第2抗原または上記第3抗原が、局所組織環境に関連し(これはさらに癌の発生または転移に関連する)、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、項目1〜3または5〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
上記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または上記疾患が全身性である、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
上記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
上記呼吸または炎症性疾患が喘息である、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
腫瘍部位の上記サプレッサー細胞の数を減少させることが、上記腫瘍を有する上記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
上記対象がヒトである、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させるための方法であって、弱毒生リステリアワクチン株を上記対象に投与するステップを含む方法。
(項目23)
上記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性PEST含有ポリペプチドである、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記リステリアが、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをそれぞれコードする第1の読み枠および少なくとも第2の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、上記第1のポリペプチドおよび上記第2のポリペプチドが内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、項目22に記載の方法。
(項目25)
上記核酸が、第3のポリペプチドをコードする第3の読み枠をさらに含み、上記第3のポリペプチドが内在性PEST含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
上記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、上記代謝酵素が、上記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、項目22〜25に記載の方法。
(項目27)
上記追加の読み枠によりコードされる上記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素である、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記リステリアが、第2の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、項目22〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
上記代謝酵素がD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記組換えリステリアが、ゲノムActA遺伝子、PlcA遺伝子、PrfA遺伝子またはPlcB遺伝子の変異または欠失を含む、項目22〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
上記核酸分子が、上記リステリアゲノムに組み込まれる、項目22〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
上記核酸分子が、抗生物質による選択がない場合には、上記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、項目22〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
上記対象がヒトである、項目22〜32のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
上記PEST含有ポリペプチドが、N末端短縮LLOポリペプチド、N末端ActAポリペプチド、もしくはPESTペプチド、またはそれらの機能性断片である、項目22〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
上記第1、上記第2または上記第3の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、項目22または24〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
上記第1、上記第2または上記第3の抗原が、局所組織環境に関連し、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し(これはさらに癌の発生または転移に関連する)、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、項目22または24〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
上記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または上記疾患が全身性である、項目22〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
上記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、項目22〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
上記呼吸または炎症性疾患が喘息である、項目38に記載の方法。
(項目40)
腫瘍部位の上記サプレッサー細胞の数を減少させることが、上記腫瘍を有する上記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、項目22〜39のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
上記サプレッサー細胞が制御性T細胞(Treg)である、項目22〜40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
上記サプレッサー細胞が骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、項目22〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
上記サプレッサー細胞が対象の抗腫瘍T細胞応答を抑制する、項目22〜42のいずれか1項に記載の方法。
Claims (43)
- 疾患に罹患している対象または対象の疾患部位において、浸潤Tリンパ球/サプレッサー細胞比率を増大させるための方法であって、前記対象に弱毒生リステリアワクチン株を含む組成物を投与するステップを含む方法。
- 前記浸潤Tリンパ球がCD8+T細胞またはCD4+T細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記サプレッサー細胞が制御性T細胞(Treg)または骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性PEST含有ポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リステリアが、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをそれぞれコードする第1の読み枠および少なくとも第2の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが、内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸が第3のポリペプチドをコードする第3の読み枠をさらに含み、前記第3のポリペプチドが、内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第1の異種抗原、前記第2の異種抗原、または前記第3の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、請求項1〜3または5〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、前記代謝酵素が、前記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記追加の読み枠によりコードされる前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素である、請求項8に記載の方法。
- 前記リステリアが、第2の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝酵素がD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項10に記載の方法。
- 前記組換えリステリアが、ゲノムActA遺伝子、PlcA遺伝子、PrfA遺伝子またはPlcB遺伝子の変異または欠失を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が前記リステリアゲノム中に組み込まれる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、抗生物質による選択のない場合に、前記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PEST含有ポリペプチドが、N末端短縮LLOポリペプチド、N末端ActAポリペプチド、もしくはPESTペプチド、またはそれらの機能性断片である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1抗原、前記第2抗原または前記第3抗原が、局所組織環境に関連し(これはさらに癌の発生または転移に関連する)、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、請求項1〜3または5〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または前記疾患が全身性である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記呼吸または炎症性疾患が喘息である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 腫瘍部位の前記サプレッサー細胞の数を減少させることが、前記腫瘍を有する前記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 対象の疾患のサプレッサー細胞の割合を減少させるための方法であって、弱毒生リステリアワクチン株を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 前記リステリアが、ポリペプチドまたはそれらの機能性断片をそれぞれコードする読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記ポリペプチドまたはそれらの機能性断片が内在性PEST含有ポリペプチドである、請求項22に記載の方法。
- 前記リステリアが、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをそれぞれコードする第1の読み枠および少なくとも第2の読み枠を含む組換え核酸配列を含み、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが内在性PEST含有ポリペプチドに融合した異種抗原またはそれらの機能性断片をそれぞれ含む、請求項22に記載の方法。
- 前記核酸が、第3のポリペプチドをコードする第3の読み枠をさらに含み、前記第3のポリペプチドが内在性PEST含有ポリペプチドに縮合した異種抗原またはそれらの機能性断片を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記核酸分子が、代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含み、前記代謝酵素が、前記組換えリステリア株の染色体が欠失している内在性遺伝子を補完する、請求項22〜25に記載の方法。
- 前記追加の読み枠によりコードされる前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素である、請求項26に記載の方法。
- 前記リステリアが、第2の代謝酵素をコードする追加の読み枠をさらに含む、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝酵素がD−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項28に記載の方法。
- 前記組換えリステリアが、ゲノムActA遺伝子、PlcA遺伝子、PrfA遺伝子またはPlcB遺伝子の変異または欠失を含む、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項22〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、抗生物質による選択がない場合には、前記組換えリステリアワクチン株中で安定に維持されるプラスミド中に存在する、請求項22〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項22〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PEST含有ポリペプチドが、N末端短縮LLOポリペプチド、N末端ActAポリペプチド、もしくはPESTペプチド、またはそれらの機能性断片である、請求項22〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1、前記第2または前記第3の異種抗原またはそれらの機能性断片が、感染性病原体、または腫瘍細胞によって発現されるか、またはこれに由来する、請求項22または24〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1、前記第2または前記第3の抗原が、局所組織環境に関連し、腫瘍回避または癌に対する抵抗性に関連し(これはさらに癌の発生または転移に関連する)、血管新生抗原であり、または宿主のアレルギー性、炎症性反応を引き起こすアレルゲンである、請求項22または24〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が特異的疾患部位に限局しているか、または前記疾患が全身性である、請求項22〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、感染症、呼吸疾患もしくは炎症性疾患、または癌もしくは腫瘍である、請求項22〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記呼吸または炎症性疾患が喘息である、請求項38に記載の方法。
- 腫瘍部位の前記サプレッサー細胞の数を減少させることが、前記腫瘍を有する前記対象の抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項22〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サプレッサー細胞が制御性T細胞(Treg)である、請求項22〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サプレッサー細胞が骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)である、請求項22〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サプレッサー細胞が対象の抗腫瘍T細胞応答を抑制する、請求項22〜42のいずれか1項に記載の方法。
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