JP2010500879A - Ｈｍｗ−ｍａａ及びその断片を含む組成物、及びその使用方法 - Google Patents

Ｈｍｗ−ｍａａ及びその断片を含む組成物、及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】高分子量メラノーマ関連抗原（High Molecular Weight Melanoma-Associated Antigen：ＨＭＷ−ＭＡＡ）の断片を含む組換え型ポリペプチドを提供する
【解決手段】本発明に係る組換え型ポリペプチドは、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、又はＰＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体から選択された非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドに連結したＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含むことを特徴とする。また、本発明は、組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株であって、前記組換え型ポリペプチドがＨＭＷ−ＭＡＡの断片（「ＨＭＷ−ＭＡＡ断片」）を含むことを特徴とする組換え型リステリア株を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、高分子量メラノーマ関連抗原（High Molecular Weight Melanoma-Associated Antigen：ＨＭＷ−ＭＡＡ）の断片を含む組換え型ポリペプチド、それを含む組換え型リステリア株、それらの投与を含む免疫応答を誘導する方法、並びに、腫瘍を治療する及び腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。
メラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（melanoma chondroitin sulfate proteoglycan：ＭＣＳＰ）とも呼ばれているＨＭＷ−ＭＡＡは、残基数が２３２２個の膜貫通型タンパクである。ＨＭＷ−ＭＡＡは、外科的に除去した良性母斑及びメラノーマ病巣の９０％以上で発現する。また、基底細胞癌や神経堤起原腫瘍（例えば、星細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、及び肉腫）、小児白血病、小葉乳癌病巣においても発現する。
例えばＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍などの様々な腫瘍の治療に加え、とりわけ、危険性の高い様々な癌を防止する方法が当該技術分野では至急に必要とされている。
本発明は、ある実施形態では、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）の断片を含む組換え型ポリペプチド、それを含む組換え型リステリア株、及びそれらの投与を含む免疫応答を誘導する方法並びに腫瘍を治療及び成長阻害する方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株であって、前記組換え型ポリペプチドがＨＭＷ−ＭＡＡの断片（「ＨＭＷ−ＭＡＡ断片」）を含むことを特徴とする組換え型リステリア株を提供する。
他の実施形態では、本発明は、組換え型ポリペプチドであって、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、及びＰＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体から選択された非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドに作動可能に連結されたＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含むことを特徴とする組換え型ポリペプチドを提供する。
ある実施形態では、本発明は、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドであって、前記断片が該断片が由来する前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の約３６０〜５５４のアミノ酸（ＡＡ）から成ることを特徴とする組換え型ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記断片は、約７０１〜１１３０のＡＡから成る。他の実施形態では、前記断片は、約２１６０〜２２５８のＡＡから成る。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型リステリア株及び補助剤を含むワクチンを提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含むワクチンを提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードする組換え型ワクチンベクターを提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍の進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍を治療する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。
各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍の進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍を治療する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ｐＧＧ５５に基づくプラスミドへのＨＭＷ−ＭＡＡのクローニングを示す図である。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡは、ｐｒｆＡ−株であるＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することで作成した。ｐＧＧ−５５は、非溶血性のＬＬＯ−Ｅ７融合遺伝子及びプラスミドを保持しているものを選択するためのｐｒｆＡ遺伝子の発現を駆動するｈｌｙプロモータを有する。ＸＦＬ−７は、生存するためにこのプラスミドを保持する必要がある。 ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトが発現されていることを示す図である。ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ Ａ、Ｂ、及びＣのプラスミドで形質転換されたＬＭ株から上清を採取した。抗ＰＥＳＴプローブにより、３つの全ての株が予想されたサイズの融合タンパク質（ＬＬＯは４８Ｋｄａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａは７５Ｋｄａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂは９８Ｋｄａ、及びＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃは６２Ｋｄａ）を生成したことが判明した。 ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトが発現されていることを示す図である。ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ Ａ、Ｂ、及びＣのプラスミドで形質転換されたＬＭ株から上清を採取した。抗ＬＬＯプローブにより、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ、及び１０４０３Ｓ対照のＬＬＯバンドが示された。 ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを発現するリステリア株が、野生型Ｌｍと同様の培地増殖を示すことを示す図である。 ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを発現するリステリア株が、野生型Ｌｍと同様の病原性及び細胞内増殖を示すことを示す図である。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍによって腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍でさえ）の増殖が防止されることを示す図である。腫瘍サイズの測定から分かるように、１０８ｃｆｕのＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣによってＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ腫瘍の増殖が無処置のものと比べて著しく阻害される。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍによって腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍でさえ）の増殖が防止されることを示す図である。腫瘍容積の測定から分かるように、１０８ｃｆｕのＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣによってＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ腫瘍の増殖が無処置のものと比べて著しく阻害される。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍによって腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍でさえ）の増殖が防止されることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ腫瘍細胞を接種したところ、３つの全てのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ株に関して、腫瘍の径に対して同様な効果が見られた。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍによって腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍でさえ）の増殖が防止されることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を接種したところ、３つの全てのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ株に関して、腫瘍の径に対して同様な効果が見られた。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍによって腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍でさえ）の増殖が防止されることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を接種したところ、３つの全てのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ株に関して、腫瘍の容積に対して同様な効果が見られた。 ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＢ１６Ｆ１０マウス腫瘍細胞クローンの選択を示す図である。 Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトが抗原特異的免疫応答を引き起こし、それによって腫瘍増殖が阻害されたことを示す図である。 ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞をインビボで欠失させると、ＬＭ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチンの効果が無くなることを示す図である。 Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃをワクチン接種したマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞がインビボでＢ１６Ｆ１０ＨＭＷ−ＭＡＡ腫瘍の増殖を阻害したことを示す図である。 Ｂ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ腫瘍を排除したＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃをワクチン接種したマウスが同じ腫瘍による２回目のチャレンジに対しても保護されたことを示す図である。 ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスをＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ及びＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫処理すると、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片Ｂ及び断片Ｃの２つの特徴付けられたＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープにに対して検出可能な免疫応答が誘導されることを示す図である。 ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスをＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ及びＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫処理すると、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片Ｂ及び断片Ｃの２つの特徴付けられたＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープにに対して検出可能な免疫応答が誘導されることを示す図である。 ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ及び野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで１回免疫処置した後に、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片ＣのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドでＴ細胞を刺激すると、Ｔ細胞によってＩＦＮ−γが分泌されることを示す図である。 ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ及び野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで１回免疫処置した後に、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片ＣのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドでＴ細胞を刺激すると、Ｔ細胞によってＩＦＮ−γが分泌されることを示す図である。 異なる形態のＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質を発現するワクシニアウイルス・コンストラクト描写した図である。 ＴＣ−Ｉ細胞を投与し、その後に組換え型リステリアワクチン（無処置、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７）を投与したマウスの脾臓及び腫瘍におけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導及び浸潤を示す図である。 Ａ：ＰＥＳＴ領域を含むリステリア・コンストラクトによって腫瘍がさらに退縮することを示す図である。Ｂ：リステリアワクチンで処理されたマウスの腫瘍平均サイズを示す図である。 ＰＥＳＴ領域を含むリステリア・コンストラクトが脾臓においてより高率のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。Ａは、１つの代表的な実験のデータである。Ｂは、３実験のデータの平均及び標準誤差を示すものである。 ＰＥＳＴ領域を含むリステリア・コンストラクトが腫瘍においてより高率のＥ７特異的リンパ球を誘導することを示す図である。Ａは、１つの代表的な実験のデータである。Ｂは、３実験のデータの平均及び標準誤差を示すものである。 異なる形態のＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質を発現するワクシナウイルスを描写した図である。 ＶａｃＬＬＯＥ７が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて２×１０５のＴＣ−１細胞によって確立した腫瘍の退縮を長期に渡って誘導することを示す図である。マウスを腫瘍でチャレンジさせ、１１日後及び１８日後に１マウス当たりに１０７ＰＦＵのＶａｃＬＬＯＥ７、ＶａｃＳｉｇＥ７ＬＡＭＰ−１、若しくはＶａｃＥ７を腹腔内注射した、或いは何の処理も行わなかった（無処置）。各処置群当たり８匹のマウスを使用した。各腫瘍に関する代表値（cross section）（２つの測定値の平均）を、表示した腫瘍接種後の日数に対して示した。
本発明は、ある実施形態では、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）の断片を含む組換え型ポリペプチド、それを含む組換え型リステリア株、及びそれらの投与を含む免疫応答を誘導する方法並びに腫瘍を治療及び成長阻害する方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株であって、前記組換え型ポリペプチドがＨＭＷ−ＭＡＡの断片（「ＨＭＷ−ＭＡＡ断片」）を含むことを特徴とする組換え型リステリア株を提供する。他の実施形態では、本発明に係る組換え型リステリア株は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを発現する。他の実施形態では、本発明に係る組換え型リステリア株は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードする単離核酸を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、組換え型ポリペプチドであって、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、及びＰＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体から選択された非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドに作動可能に連結されたＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドを提供する。ある実施形態では、当該技術分野で公知の分析及び手段を用いて実証されるように、断片は完全長ペプチドと同一又は同様の性質又は機能を有する。本発明の完全長ペプチド及びタンパク質の性質及び機能の詳細は後述する。
他の実施形態では、本発明は、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドであって、前記断片が該断片が由来する前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の約３６０〜５５４のアミノ酸（ＡＡ）から成ることを特徴とする組換え型ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、前記断片は、約７０１〜１１３０のＡＡから成る。他の実施形態では、前記断片は、配列番号２１〜２３から選択される。他の実施形態では、前記断片は、約２１６０〜２２５８のＡＡから成る。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドを提供する。
他の実施形態では、本発明は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドを提供する。
他の実施形態では、本発明は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む組換え型ポリペプチドを提供する。
他の実施形態では、本発明に係る組換え型ポリペプチドは、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドをさらに含む。他の実施形態では、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、前記断片の免疫原性を強化する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
前記非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、他の実施形態では、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチドである。他の実施形態では、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、ＡｃｔＡオリゴペプチドである。他の実施形態では、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、ＰＥＳＴ様オリゴペプチドである。本明細書に記載するように、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列及びその断片は、抗原の細胞媒介性の免疫原性を高める。ある実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列及びその断片への融合は、様々な発現系で抗原の細胞媒介性の免疫原性を高める。ある実施形態では、前記発現系は、ウイルスに起因するものであり、他の実施形態では、前記発現系は細菌に起因するものである。他の実施形態では、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、当該技術分野で公知のその他のあらゆる免疫原性非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明による方法及び組成物のＬＬＯオリゴペプチドは、他の実施形態では、非溶血性ＬＬＯオリゴペプチドである。他の実施形態では、前記オリゴペプチドは、ＬＬＯ断片である。他の実施形態では、前記オリゴペプチドは、ＬＬＯ完全タンパク質である。他の実施形態では、前記オリゴペプチドは、当該技術分野で公知のあらゆるＬＬＯタンパク質又はその断面である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、化学的処理によって、非溶血性にされる。他の実施形態では、前記化学的処理は、グルタルアルデヒドによる処理を含む。他の実施形態では、前記化学的処理は、同様に作用する化合物による処理を含む。他の実施形態では、前記化学的処理は、当該技術分野で公知の任意の化合物による処理を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のワクチンを構成するのに利用される前記ＬＬＯタンパク質は、次の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱｌＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮｉｉＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦｒＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＥ）ＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲ ＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（遺伝子銀行アクセス番号Ｐ１３１２８；配列番号１；遺伝子銀行アクセス番号Ｘ１５１２７に規定された核酸配列）。ある実施形態では、この配列に相当する前駆タンパク質における最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌から分泌された場合はＬＬＯから切断される。したがって、本発明によれば、完全長の活性ＬＬＯタンパク質は、５０４残基の長さである。他の実施形態では、上記の配列は、本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片のソースとして使用される。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物に用いられるＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号１に記載した配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号１に記載した配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号１に記載した配列の断片である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号１に記載した配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ある実施形態では、イソ型は、他のペプチド又はタンパク質と同一の機能、及び類似する又は同一の配列を有するが、異なる遺伝子の産物であるペプチド又はタンパク質である。ある実施形態では、変異体は、他のペプチド又はタンパク質とはわずかに異なるペプチド又はタンパク質である。
他の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片が、本発明に係る方法及び組成物に用いられる。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、Ｎ末端断片である。他の実施形態では、前記Ｎ末端ＬＬＯ断片は、次の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＮＴＬＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＯＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号２）。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号２に記載した配列を含む。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号２に記載した配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号２に記載した配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号２に記載した配列の断片である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号２に記載した配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は次の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＥＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＥＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号３）。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号３に記載した配列を含む。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号３に記載した配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号３に記載した配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号３に記載した配列の断片である。他の実施形態では、前記ＬＬＯのＡＡ配列は、配列番号３に記載した配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における前記ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様ドメインを含む。他の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片は、本発明に係る組成物の一部として又は本発明に係る方法において使用される。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、カルボキシ末端において活性化ドメインを含まない。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含まない。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、非溶血性断片である。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失又は突然変異によって非溶血性にされる。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失又は突然変異によって非溶血性にされる。他の実施形態では、ＬＬＯ配列は、他の位置の欠失又は突然変異によって非溶血性にされる。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、前記ＬＬＯタンパク質のおおよそ最初から４４１番目のＡＡから成る。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、前記５２９ＡＡ完全長ＬＬＯタンパク質のおおよそ最初から４００〜４４１番目のＡＡから成る。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、本明細書中に説明したＬＬＯタンパク質のＡＡ１〜４４１番目に相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの最初の約４２０ＡＡから成る。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、本明細書中に説明したＬＬＯタンパク質のＡＡ１〜４２０番目に相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの約２０〜４４２ＡＡから成る。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、本明細書中に説明したＬＬＯタンパク質のＡＡ２０〜４４２番目に相当する。他の実施形態では、システイン４８４を含む活性化ドメインを有さない、及び特にシステイン４８４を含まない任意のΔＬＬＯは、本発明の方法及び組成物に適している。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４００ＡＡに相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の３００ＡＡに相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の２００ＡＡに相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の１００ＡＡに相当する。他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の５０ＡＡに相当し、ある実施形態では、１つ以上のＰＥＳＴ様配列を含む。
他の実施形態では、前記ＬＬＯ断片は、上記のＡＡ範囲の１つと相同するＬＬＯタンパク質の残基を含む。この残基数は、他の実施形態では、上記に列挙した残基数と正確に対応させる必要はない（例えば、ここで使用されるＬＬＯタンパク質に対して、相同するＬＬＯタンパク質が挿入又は欠失を有する場合）。
各ＬＬＯタンパク質及びＬＬＯ断片は、本発明の異なる実施形態を示す。
他の実施形態では、他の種に由来するＬＬＯの相同体は、非ＨＭＷ−ＭＡＡとして使用される公知のリシン又はその断片を含む。
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片が、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片と融合される。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡタンパク質の断片は、次の配列を有する。
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号４）。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物におけるＡｃｔＡのＡＡ配列は、配列番号４に記載した配列を含む。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡのＡＡ配列は、配列番号４に記載した配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡのＡＡ配列は、配列番号４に記載した配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡのＡＡ配列は、配列番号４に記載した配列の断片である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡのＡＡ配列は、配列番号４に記載した配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ＡｃｔＡ断片は、次の配列を有する組換え型ヌクレオチドによってエンコードされる。
ＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＴＡＣＧＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＣＧＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡ（配列番号５）。他の実施形態では、前記組換え型ヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列を含む。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡをエンコードしている本発明に係るヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列を含む。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡをエンコードしているヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡをエンコードしているヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡをエンコードしているヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列の断片である。他の実施形態では、前記ＡｃｔＡをエンコードしているヌクレオチドは、配列番号５に記載した配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ＡｃｔＡ断片は、当該技術分野で公知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。他の実施形態では、本発明の組換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をエンコードする任意の他の配列を含む。他の実施形態では、前記組換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の全体をエンコードする任意の他の配列を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列が、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片と融合される。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、次の配列を有する。ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号６）。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号７）である。他の実施形態では、本明細書中に列挙したＰＥＳＴ様ＡＡ配列の１つを含む任意のＬＬＯ配列への抗原の融合は、ＨＭＷ−ＭＡＡに対する細胞性免疫を高める。
他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、リステリアＡｃｔＡタンパク質に由来するＰＥＳＴ様配列である。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、次の配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号８）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号９）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号１０）、又はＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号１１）である。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、ｌｓｏ遺伝子によってエンコードされたリステリア・シリゲリ（Listeria seeligeri）細胞溶解素に由来する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、RSEVTISPAETPESPPATP（配列番号１２）である。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、レンサ球菌属のストレプトリジンＯタンパク質に由来する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、化膿レンサ球菌のストレプトリジンＯに由来する（例えば、ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１３）のＡＡ３５〜５１）。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・イクイシミリス（Streptococcus equisimilis）のストレプトリジンＯに由来する（例えば、ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１４）のＡＡ３８〜５４）。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、配列番号８〜１４から選択される配列を有する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、配列番号６〜１４から選択される配列を有する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する他のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。
ＰＥＳＴ様配列の同定は当該技術分野で公知であり、例えば、「Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis（Science 1986; 234(4774):364-8）」（Rogers Sら）や、「PEST sequences and regulation by proteolysis（Trends Biochem Sci 1996; 21(7):267-71）」（Rechsteiner Mら）に開示されている。「ＰＥＳＴ様配列」は、他の実施形態では、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）残基に富む領域を意味する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、いくつかの陽性荷電アミノ酸を含む１つ以上のクラスターの側面に配置される。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、それを含んでいるタンパク質の急速な細胞内分解を仲介する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、Rogersらが開示したアルゴリズムに適合する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、Rechsteinerらが開示したアルゴリズムに適合する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、１つ以上の内部のリン酸化反応部位を含み、その部位でのリン酸化反応はタンパク質分解に先行して行われる。
ある実施形態では、原核生物の前記ＰＥＳＴ様配列は、例えば、「Rechsteiner and Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21 :267-271 ) for LM」及び「Rogers S et al (Science 1986; 234(4774):364-8)」に開示されている方法に従って同定される。また、他の原核生物に由来するＰＥＳＴ様ＡＡ配列も、この方法に基づいて同定することができる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列を含むことが期待される他の原核生物は、これに限定するものではないが、他のリステリア種である。ある実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、Rogersらが開示したアルゴリズムに適合する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、Rechsteinerらが開示したアルゴリズムに適合する。他の実施形態では、前記ＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ発見プログラムを使用して同定される。
他の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特定のタンパク質内に正電荷のＡＡであるＲ、Ｈ、及びＫをスキャンすることによって行われる。正電荷のＡＡに挟まれた全てのＡＡはカウントされ、ＡＡの数がウインドウサイズ・パラメータ（window size parameter）と等しい又はそれよりも高いモチーフのみがさらに調べられる。他の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤ若しくはＥ、及び少なくとも１つのＳ若しくはＴを含むべきである。
他の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの性質は、重要なＡＡの局所的な濃縮並びにモチーフの疎水性に基づいた得点パラメータ（scoring parameter）を利用した方法によって改善される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、及びＴは、重量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、Ｄ若しくはＥを１、Ｐを１、及びＳ若しくはＴを１として補正する。他の実施形態では、疎水性の計算は、原則としてKyte及びR F. Doolittle（Kyte, J and Dootlittle, RF. J. MoI. Biol. 157, 105（1982））の方法に従って行われる。簡単に計算するために、Kyte-Doolittleハイドロパシー指標（hydropathy index）（本来、−４．５（アルギニン）から＋４．５（イソロイシン）の範囲にある）は、下記の線形変換を用いて正の整数に変換される。それにより、０（アルギニン）から９０（イソロイシン）の値が算出される。
ハイドロパシー指標＝１０＊Kyte-Doolittleハイドロパシー指標＋４５
他の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの疎水性ポテンシャルは、それぞれのＡＡ種のモルパーセントと疎水性指標との積を合計すことによって計算する。所望のＰＥＳＴスコアは、下記の式で示すように、局所的な濃縮及び疎水性の特性の両方を用いることで得られる。
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指標
他の実施形態では、「ＰＥＳＴ様配列」又は「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」は、上記のアルゴリズムを用いて得られたスコアが少なくとも＋５であるペプチドを意味する。他の実施形態では、この用語は、少なくとも６のスコアを有するペプチドを意味する。他の実施形態では、前記ペプチドは、少なくとも７のスコアを有する。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも８である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも９である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１０である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１１である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１２である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１３である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１４である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１５である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１６である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１７である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１８である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも１９である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２０である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２１である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２２である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２３である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２４である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２５である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２６である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２７である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２８である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも２９である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも３０である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも３２である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも３５である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも３８である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも４０である。他の実施形態では、前記スコアは少なくとも４５である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で公知の他の任意の方法又はアルゴリズム（CaSPredictor（Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. 2005 Jun;21 Suppl l :il69-76））を使用することによって特定される。
ＰＥＳＴ指標は、適切な長さのそれぞれのストレッチ（例えば、３０〜３５ＡＡのストレッチ）に関して計算される。その際、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、若しくはＧｌｎに対して１の値が割り当てられる。それぞれのＰＥＳＴ残基の係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれの係数値は０である。
ＰＥＳＴ様配列を特定する各方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で公知の他の任意のＰＥＳＴ様配列である。各ＰＥＳＴ様配列及びその種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
「ＰＥＳＴ様配列への融合」は、他の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むタンパク質の断片への融合を意味する。他の実施形態は、前記タンパク質の断片は、ＰＥＳＴ様配列以外の周辺配列を含む。他の実施形態では、前記タンパク質の断片は、ＰＥＳＴ様配列から構成される。したがって、他の実施形態では、「融合」は、２つのペプチド若しくはタンパク質の断片をそれぞれの末端で連結すること、又はあるペプチド若しくはタンパク質の断片を他のペプチド若しくはタンパク質の断片に挿入することを意味する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物のＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、非ＨＭＷ−ＭＡＡのＡＡ配列に融合される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、非ＨＭＷ−ＭＡＡのＡＡ配列内に挿入される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ由来ペプチドは、ＬＬＯ断片、ＡｃｔＡタンパク質若しくは断片、又はＰＥＳＴ様配列に組み込まれる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、適切な配列をサブクローンし、その後、得られたヌクレオチドを発現させる方法で調整される。他の実施形態は、サブ配列をクローンし、適切なサブ配列を適切な制限酵素を用いて切断する。他の実施形態では、次に断片を連結して目的のＤＮＡ配列を作成する。他の実施形態では、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を用いて作成される。最初、天然型ＤＮＡの断片の両側における新末端のそれぞれを別々に増幅する。増幅された一方の配列の５´末端はペプチドリンカーをエンコードし、増幅された他方の配列もペプチドリンカーをもエンコードする。第１の断片の５´末端が第２の断片の３´末端に相補するため、３回目のＰＣＲでは、２つの断片（部分精製の後（例えば、ＬＭＰアガロースで））を重ならせた１つの鋳型として使用することができる。増幅された配列は、コドン、オープニングサイトのカルボキシル側の部分（アミノ配列を形成している）、リンカー、オープニングサイトのアミノ側の配列（カルボキシル配列を形成している）を含むようになる。次に、インサートはプラスミドに連結される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が異種タンパク質内に挿入されたタンパク質を作成するのに同様な方法が用いられる。
ある実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片（Ａ、Ｂ、若しくはＣなど）に融合したＬＬＯ配列、又はＨＭＷ−ＭＡＡ断片を発現するリステリアを使用したところ、このペプチドに対する免疫反応が増大し（実施例５）、抗腫瘍免疫が得られ（実施例４及び５）、並びにペプチド特異的ＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋細胞が生成された（実施例５）。ある実施形態では、ＨＰＶ Ｅ７などのペプチドに融合したＡｃｔＡ、ＬＬＯ及び／又はＰＥＳＴ様配列使用したところ、このペプチドに対する免疫応答が増大し、抗腫瘍免疫が得られ、ペプチド特異的ＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋細胞が生成された（実施例６及び７）。また、この融合ペプチドが非リステリアベルターで発現された場合でも同様な効果が得られた（実施例８）。
他の実施形態では、本発明の組換え型ポリペプチドは、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片を含んでいる第１のポリペプチドを、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドを含んでいる第２のポリペプチドに化学的に結合させるステップを含む方法により作成される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドを含んでいる第２のポリペプチドに結合される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片を含むペプチドが、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドに結合される。他の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドに結合される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明のＨＭＷ−ＭＡＡ断片が由来する前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、他の実施形態では、ヒトのＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、マウスのタンパク質である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、ラットのタンパク質である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、霊長類のタンパク質である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、当該技術分野で公知の他の生物種のタンパク質である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、メラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）である。他の実施形態では、ＡＮ２タンパク質が、本発明に係る方法及び組成物において用いられる。他の実施形態では、ＮＧ２タンパク質が、本発明に係る方法及び組成物において用いられる。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物において用いられるＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、次の配列を有する。
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他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物において用いられるＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、次の配列によりエンコードされる。
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他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物において用いられるＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、ＮＭ＿００１８９７及びＸ９６７５３から選択されるアクセス番号を有する遺伝子銀行エントリーに規定されているＡＡ配列を有する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されているヌクレオチド配列にエンコードされている。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されている配列を含む。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されている配列の相同体である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されている配列の変異体である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されている配列の断片である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記の遺伝子銀行エントリーの１つに規定されている配列のイソ型である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に使用されるＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、他の実施形態では、ＡＡ３６０〜５５４を含む。他の実施形態では、前記断片は、本質的にＡＡ３６０〜５５４から成る。他の実施形態では、前記断片は、ＡＡ３６０〜５５４から成る。他の実施形態では、前記断片は、ＡＡ７０１〜１１３０を含む。他の実施形態では、前記断片は、本質的にＡＡ７０１〜１１３０から成る。他の実施形態では、前記断片は、ＡＡ７０１〜１１３０から成る。他の実施形態では、前記断片は、ＡＡ２１６０〜２２５８から成る。他の実施形態では、前記断片は、本質的にＡＡ２１６０〜２２５８から成る。他の実施形態では、前記断片は、ＡＡ２１６０〜２２５８から成る。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書中で説明したいずれかの形態又は実施形態の、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含む。ある実施形態では、本発明のいずれかのポリペプチドは、本明細書中で説明したいずれかの形態又は実施形態の、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片から成る。ある実施形態では、本発明の組成物は、本明細書中で説明したいずれかの形態又は実施形態の、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片から本質的に成るであろう。ある実施形態では、「含む（comprise）」という用語は、例えば、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片、又はＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質及び非ＨＭＷ−ＭＡＡポリペプチドの断片などの前記した活性物質を含有すること、並びに、製薬業界で公知の他の活性物質、薬学的に許容される担体、賦形剤、軟化剤、安定剤などを含有することを意味する。ある実施形態では、「から本質的に成る」という用語は、組成物が、ここで記載した活性成分を唯一の活性成分として含むが、安定化、保存などのために他の化合物（活性成分の治療効果に直接関与しない）をも含み得ることを意味する。ある実施形態では、「から本質的に成る」という用語は、組成物が前記活性成分の放出を促進する要素を含むことを意味する。ある実施形態では、「から成る」という用語は、組成物が前記活性成分と薬学的に許容される単体又は賦形剤を含むことを意味する。
他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約９８個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約１９４個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約４３０個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約９８〜１９４個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約１９４〜４３０個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、約９８〜４３０個のアミノ酸（ＡＡ）である。
他の実施形態では、本発明に係るＨＭＷ−ＭＡＡ断片の長さは、少なくとも８個のアミノ酸（ＡＡ）である。他の実施形態では、前記長さは、８ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも９ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、９ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１１ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１１ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１２ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１２ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１４ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１４ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１６ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１６ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１８ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１８ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも２０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも２５ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２５ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも３０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、３０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも４０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、４０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、５０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、７０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１００ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、１５０ＡＡよりも大きい。他の実施形態では、前記長さは、少なくとも２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、２００ＡＡよりも大きい。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記長さは、約８〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約８〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約９〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１１〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１２〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１５〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約２０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約３０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約４０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜７０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約５０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜１００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約７０〜５００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜１５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜２００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜２５０ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜３００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜４００ＡＡである。他の実施形態では、前記長さは、約１００〜５００ＡＡである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
各ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質及びその各断片は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の組換え型ポリペプチドは、シグナル配列を含む。他の実施形態では、前記シグナル配列は、前記ワクチンベクターを構成するのに使用される有機体に由来する。他の実施形態では、前記シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列である。他の実施形態では、前記シグナル配列は、ＡｃｔＡシグナル配列である。他の実施形態では、前記シグナル配列は、リステリアシグナル配列である。他の実施形態では、前記シグナル配列は、当該技術分野で公知の任意のリステリアシグナル配列である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
「ペプチド」及び「組換え型ペプチド」は、他の実施形態では、任意の長さのペプチド又はポリペプチドを意味する。他の実施形態では、本発明に係るペプチド又は組換え型ペプチドは、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片に関して上記に記載した長さのうちの１つのものを有する。各可能な形態は、本発明の別個の形態に相当する。他の実施形態では、「ペプチド」という用語は、天然型ペプチド（分解産物、合成ペプチド、若しくは組換え型ペプチド）、及び／又はペプチド類似体であるペプトイド及びセミペプトイドなどの模倣ペプチド（通常は、合成的に合成されたペプチド）を意味する。このペプチド類似体は、例えば、ペプチドが体内でより安定するよう、又は細胞により容易に浸透できるようにするために修飾されている場合がある。これらの修飾には、それらに限定されるわけではないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、バックボーン修飾、及び残基修飾が含まれる。前記ペプチド結合修飾には、それらに限定されるわけではないが、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、又はＣＦ＝ＣＨが含まれる。模倣ペプチドを作成する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Quantitative Drug Design, CA. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)」に記載されている（この参照により本明細書に組み込まれるものとする）。この点に関する詳細を下記に記載する。
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキルであり、例えば、メチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン性二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、天然状態において炭素原子上に存在する「通常の」側鎖である）によって置換することができる。
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った任意の結合部において生じ、同時に複数（２〜３）生じることさえある。天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅは、例えばＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環状のメチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、又は及び／又ｏ−メチル−Ｔｙｒなどの人工の非天然酸に置換され得る。
上記に加えて、本発明のペプチドは、１つ以上の修飾されたアミノ酸、又は１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合炭水化物など）も含み得る。
ある実施形態では、「アミノ酸」という用語は、２０個の自然発生的アミノ酸を含むと理解されたい。これらのアミノ酸は多くの場合はインビボで翻訳後に修飾され、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホスレオニンを含む。そして、他の異常アミノ酸は、これに限定するものではないが、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチンを含む。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方を含み得る。
本発明のペプチド又タンパク質は、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom and Winter, J. MoI. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol. 222:581 (1991)）を含む当該技術分野で公知の任意の技術により作成し得る。
ある実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語を同じ意味で使用され、これに限定するものではないが、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列などの分子を意味する。また、この用語は、任意の既知の、ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基類似体を含む配列を意味し得る。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型リステリア株を含むワクチンを提供する。ある実施形態では、前記ワクチンは、アジュバントをさらに含む。ある実施形態では、前記ワクチンは、サイトカイン、ケモカイン又はそれらの組み合わせをさらに含む。ある実施形態では、ワクチンは、抗原又はポリペプチドに対する免疫応答を誘導する組成物であり、その組成物に曝すことにより、その組成物に含まれる抗原又はポリペプチドに対する免疫応答を引き起こす。他の実施形態では、前記ワクチン又は組成物は、ＡＰＣをさらに含む。ＡＰＣはある実施形態では、自己由来のものであり、他の実施形態では、対象に対して同種異系のものである。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドとアジュバントとを含むワクチンを提供する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物に利用される免疫原性組成物は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードする組換え型ワクチンベクターを含む。他の実施形態では、前記免疫原性組成物は、本発明に係る組換え型ペプチドをエンコードするプラスミドを含む。他の実施形態では、前記免疫原性組成物は、アジュバントを含む。他の実施形態では、本発明に係るベクターは、ワクチン組成物の一部として投与され得る。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法及び組成物における前記免疫原性組成物は、他の実施形態では、組換え型ワクチンベクターを含む。他の実施形態では、前記組換え型ワクチンベクターは、本発明に係る組換え型ペプチドを含む。他の実施形態では、前記組換え型ワクチンベクターは、本発明に係る単離された核酸を含む。他の実施形態では、前記組換え型ワクチンベクターは、本発明に係る組換え型ペプチドをエンコードしている単離された核酸を含む。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、本発明の組換え型ポリペプチドをエンコードしている組換え型ワクチンベクターを含む。他の実施形態では、本発明は、本発明の組換え型ポリペプチドを含有している組換え型ワクチンベクターを含む。他の実施形態では、前記発現ベクターはプラスミドである組換え型ベクターを構成及び使用する方法は当該技術分野では公知であり、例えば、「Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)」や、「Brent et al. (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).」に開示されている。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ベクターは、細胞内病原体である。他の実施形態では、前記ベクターは、細胞質病原体に由来する。他の実施形態では、前記ベクターは、細胞内病原体に由来する。他の実施形態では、前記細胞内病原体は、主に細胞性免疫応答を誘導する。他の実施形態では、前記ベクターは、サルモネラ菌株由来である。他の実施形態では、前記ベクターは、ＢＣＧ菌株である。他の実施形態では、対象の免疫応答を上方制御するために、本発明に係るベクターで形質導入された樹枝状細胞が対象に投与される。この上方制御は、ある実施形態では、ＣＴＬ活性を上方制御することによって達成される。
他の実施形態では、前記組換え型ワクチンベクターは、主にＴｈ１型免疫応答を誘導する。
本発明に係る方法及び組成物における免疫原性組成物は、ある実施形態では、主にＴｈ１型免疫応答を補助するアジュバントを含む。他の実施形態では、前記アジュバントは、主にＴｈ１媒介免疫応答を補助する。他の実施形態では、前記アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答を補助する。他の実施形態では、前記アジュバントは、Ｔｈ１媒介免疫応答を補助する。他の実施形態では、前記アジュバントは、抗体性免疫応答よりも、細胞媒介免疫応答を補助する。他の実施形態では、前記アジュバントは、当該技術分野で公知の任意のその他の種類のアジュバントである。他の実施形態では、前記免疫原性組成物は、標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘導する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記アジュバントは、ＭＰＬである。他の実施形態では、前記アジュバントは、ＱＳ２１である。他の実施形態では、前記補助剤は、ＴＬＲアゴニストである。他の実施形態では、前記アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストである。他の実施形態では、前記アジュバントは、ＴＬＲ９アゴニストである。他の実施形態では、前記アジュバントは、Resiquimod（登録商標）である。他の実施形態では、前記アジュバントは、イミキモド（imiquimod）である。他の実施形態では、前記アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、前記アジュバントは、サイトカイン又はそれをエンコードする核酸である。他の実施形態では、前記アジュバントは、ケモカイン又はそれをエンコードする核酸である。他の実施形態では、前記アジュバントは、ＩＬ−１２又はそれをエンコードする核酸である。他の実施形態では、前記補助剤は、ＩＬ−６又はそれをエンコードする核酸である。他の実施形態では、前記アジュバントは、リポ多糖体である。他の実施形態では、前記アジュバントは、「Fundamental Immunology, 5th ed (August 2003): William E. Paul (Editor); Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Chapter 43: Vaccines, GJV Nossal,」に開示されている（この参照により本明細書に組み込まれるものとする）。他の実施形態では、前記アジュバントは、当該技術分野で公知の任意のその他のアジュバントである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ある実施形態では、「主としてＴｈ１型の免疫応答」は、ＩＦＮ−ガンマが分泌される免疫応答を意味する。他の実施形態では、それは、腫瘍壊死因子βが分泌される免疫応答を意味する。他の実施形態では、それは、ＩＬ−２が分泌される免疫応答を意味する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記ベクターは、サルモネラ菌種、赤痢菌種、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトゲネス（その実施形態は実施例２で例示する）、大腸菌、及びストレプトコッカス・ゴルドニから選択される。他の実施形態では、前記融合タンパク質は、食胞リソソーム融合を免れ、細胞の細胞質内で生存するように改変された組換え型細菌ベクターにより送達される。他の実施形態では、前記ベクターは、ウイルスベクターである。他の実施形態では、前記ベクターは、ワクチニア（その実施形態は実施例８で例示する）、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、改変されたワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスから選択される。他の実施形態では、前記ベクターは、裸のＤＮＡベクターである。他の実施形態では、前記ベクターは、当該技術分野で公知の任意の他のベクターである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている単離された核酸を提供する。ある実施形態では、前記単離された核酸は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている核酸と少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含む。ある実施形態では、前記単離された核酸は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている核酸と少なくとも９０％の相同性を共有する配列を含む。ある実施形態では、前記単離された核酸は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている核酸と少なくとも９５％の相同性を共有する配列を含む。ある実施形態では、前記単離された核酸は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている核酸と少なくとも９７％の相同性を共有する配列を含む。ある実施形態では、前記単離された核酸は、本発明に係る組換え型ポリペプチドをエンコードしている核酸と少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ヌクレオチド分子とアジュバントとを含むワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ヌクレオチド分子を含むワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ヌクレオチド分子をエンコードするワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組換え型ワクチンベクターを提供する。他の実施形態では、前記発現ベクターはプラスミドである。組換え型ベクターを構成及び利用する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、Sambrookらによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001」やBrentらによる「 Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons, New York, 2003）」に記載されている。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ペプチドワクチンを作成する方法は当該技術分野では公知であり、例えば、「EP1408048, United States Patent Application Number 20070154953, and OGASAWARA et al (Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 8995-8999, October 1992) 」に記載されている。ある実施形態では、ペプチド創製技術は、高い免疫原性を有する抗原を作成するのに使用される。ペプチド創製技術は当該技術分野では公知であり、例えば、米国特許第６７７３９００号明細書に開示されている。
ある実施形態では、ワクチンは、抗原又はポリペプチドに対する免疫応答を誘導する組成物であり、その組成物に曝すことにより、その組成物に含まれる抗原又はポリペプチドに対する免疫応答を引き起こす。
他の実施形態では、本発明は、本発明の組換え型ヌクレオチド分子を含む組換え型リステリア株を提供する。
本発明に係る方法及び組成物における前記組換え型リステリア株は、他の実施形態では、組換え型リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、組換え型リステリア・シリゲリ（Listeria seeligeri）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、組換え型リステリア・グレイ（Listeria grayi）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、組換え型リステリア・イバノビ（Listeria ivanovii）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、組換え型リステリア・ムライ（Listeria murrayi）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、組換え型リステリア・ウエルシュメリ（Listeria welshimeri）株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、当該技術分野で公知の任意の組換え型株である。ある実施形態では、前記リステリア株は、ＬＬＯ配列を含有するリステリア株であり、他の実施形態では、前記リステリア株は、ＡｃｔＡ配列を含有するリステリア株であり、他の実施形態では、前記リステリア株は、ＰＥＳＴ様配列を含有するリステリア株である。
他の実施形態では、リステリア株は、１つの遺伝子の欠失により弱毒化される。他の実施形態では、リステリア株は、２つ以上の遺伝子の欠失により弱毒化される。他の実施形態では、リステリア株は、１つの遺伝子の欠失又は不活性化により弱毒化される。他の実施形態では、リステリア株は、２つ以上の遺伝子の欠失又は不活性化によって弱毒化される。
他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｈｌｙである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ａｃｔＡである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｐｌｃＡである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｐｌｃＢである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｍｐｌである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｉｎｌＡである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｉｎｌＢである。他の実施形態では、突然変異した前記遺伝子は、ｂｓｈである。
他の実施形態では、前記リステリア株は、栄養要求性変異株である。他の実施形態では、前記リステリア株は、ビタミン合成遺伝子をエンコードしている遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、パントテン酸合成遺伝子をエンコードしている遺伝子を欠いている。
他の実施形態では、前記リステリア株は、ＡＡ代謝酵素を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、Ｄ-グルタミン酸合成酵素遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、ｄａｔ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、ｄａｌ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、ｄｇａ遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記遺伝子は、ビタミンＢ１２非依存性メチオニンシンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｒｐＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｒｐＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｒｐＥである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｓｎＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｇｌｔＤである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｇｌｔＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｌｅｕＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｇＧである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｈｒＣである。他の実施形態では、前記リステリア株は、上記した１つ以上の遺伝子を欠いている。
他の実施形態では、前記リステリア株は、合成酵素遺伝子を欠いている。他の実施形態では、前記遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｆｏｌＰである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ジヒドロウリジン合成ファミリータンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｓｐＤである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｓｐＦである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｈｉｓＦである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｈｉｓＨである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｆｌｉＩである。他の実施形態では、前記遺伝子は、リボソーム大サブユニット・プソイドウリジンシンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｓｐＤである。他の実施形態では、前記遺伝子は、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃｏｂＳである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃｏｂＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃｂｉＤである。
他の実施形態では、前記遺伝子は、ウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃｏｂＱである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｕｐｐＳである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｒｕＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｄｘｓである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｍｖａＳである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｄａｐＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｓｐＧである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｆｏｌＣである。他の実施形態では、前記遺伝子は、クエン酸シンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｇＪである。他の実施形態では、前記遺伝子は、３−デオキシ−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｍｅｎＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、メナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ホスホリボシルホルミルグリシンアミドシンターゼＩ又はＩＩである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキサミドシンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃａｒＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｃａｒＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｈｙＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｍｇｓＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｏＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｈｅｐＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｒｌｕＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｌｖＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｉｌｖＮである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｌｓＳである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｆａｂＦである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｆａｂＨである。他の実施形態では、前記遺伝子は、プソイドウリジンシンターゼである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｐｙｒＧである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｔｒｕＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ｐａｂＢである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）である。
他の実施形態では、前記遺伝子は、ｐｈｏＰである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｏＡである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｏＣである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ａｒｏＤである。他の実施形態では、前記遺伝子はｐｌｃＢである。
他の実施形態では、前記リステリア株は、ペプチドトランスポーターを欠いている。他の実施形態では、前記遺伝子は、ＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ−結合／パーミアーゼタンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子は、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド−結合／パーミアーゼタンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子は、亜鉛ＡＢＣトランスポーター／亜鉛−結合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子は、糖ＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、リン酸トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ＺＩＰ亜鉛トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、硫酸トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、プロトン依存性のオリゴペプチドトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、マグネシウムトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ギ酸塩／亜硝酸塩トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、スペルミジン／プトレッシンＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、Ｎａ／Ｐｉコトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、砂糖リン酸トランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、グルタミンＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、ＭＦ（major facilitator）ファミリートランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、モリブデンＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、テイコ酸ＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、コバルトＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、アンモニウムＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、アミノ酸ＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、細胞分裂ＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、マグネシウムＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、鉄化合物ＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーターである。他の実施形態では、前記遺伝子は、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。
他の実施形態では、前記遺伝子は、上記のタンパク質の１つのサブユニットである。
他の実施形態では、本発明に係る組換え型リステリア株は、動物ホストにより継体される。他の実施形態では、前記継体は、前記株のワクチンベクターとしての効率を最大化する。他の実施形態では、前記継体は、前記リステリア株の免疫原性を安定化させる。他の実施形態では、前記継体は、前記リステリア株の毒性を安定化させる。他の実施形態では、前記継体は、前記リステリア株における不安定な亜株を除去する。他の実施形態では、前記継体は、前記リステリア株における不安定な亜株の罹患率を減少させる。他の実施形態では、前記継体は、前記株を弱体化させる。他の実施形態では、前記継体は、前記株を弱毒化させる。組換え型リステリア株を動物ホストにより継体する方法は当該技術分野では公知のであり、例えば、米国特許出願第１０／５４１，６１４号明細書に開示されている。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
各リステリア株及びその種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の組換え型リステリア株は、抗原又はＬＬＯ−抗原融合体をエンコードする構造体により安定的に形質転換される。ある実施形態では、前記構造体は、さらなるサブクローニングを容易にするためのポリリンカーを含む。組換え型リステリア株を作成するためのいくつかの技術は既知である。各技術は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記構造体又は異種遺伝子は、相同的組み換えを使用して、リステリア染色体内に組み入れられる。相同的組み換えの方法は当該技術分野では公知であり、例えば、「Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J, and Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766 - 4774. 1995」、「Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K and Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge Vaccine 19: 1435-45, 2001」、「Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D, and Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of SIV239 viral replication. Virology. 333: 88-101 , 2005.」に記載されている。他の実施形態では、相同的組み換えは、米国特許第６，８５５，３２０号明細書に開示されているようにして実施される。他の実施形態では、前記組み換え体を選択するのに、温度感受性プラスミドが使用される。各技術は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記構造体又は異種遺伝子は、トランスポゾン挿入を使用して、リステリア染色体内に組み入れられる。トランスポゾン挿入の技術は当該技術分野では公知であり、とりわけ、Sunらによる「construction of DP-L967（Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778）」に記載されている。他の実施形態では、トランスポゾン突然変異生成は、安定的なゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有する。他の実施形態では、前記ゲノム内における外来遺伝子がトランスポゾン突然変異生成によって挿入されている位置は、未知である。
他の実施形態では、前記構造体又は異種遺伝子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリア染色体内に組み入れられる（Lauer P, Chow MY et al, Construction, characterization, and use of two LM site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002;184(15): 4177-86）。他の実施形態では、インテグラ−ゼ遺伝子及びバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３又はＰＳＡリステリオファージ）の結合部位を使用して異種遺伝子が対応する結合部位に挿入される。この部位は、ゲノム上の如何なる適切な部位であり得る（例えば、ｃｏｍＫ又はａｒｇのｔＲＮＡ遺伝子３´末端）。他の実施形態では、前記構造体又は異種遺伝子の組み込みに使用された結合部位から内在のプロファージが取り除かれる。他の実施形態では、この方法により、シングルコピーのインテグラントができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記構造体は、リステリア株によってプラスミド上で保持される。抗原融合タンパク質を発現するＬＭベクターは、この技術によって構成される。本明細書に記載したように、Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７は、ｐｒｆＡ欠失変異体を、ｐｒｆＡ遺伝子のコピー、及び溶血作用を除去するために切断された形態のＬＬＯ（ｈｌｙ）遺伝子に融合したＥ７遺伝子のコピーを含むプラスミドで補完することによって作成された。機能的ＬＬＯは、ｈｌｙの内在性染色体コピーを介して有機体によって維持される。他の実施形態では、前記プラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。他の実施形態では、前記プラスミドは、形質転換されたリステリア株のゲノム上で欠失している毒性因子コード遺伝子を含む。他の実施形態では、前記毒性因子は、ｐｒｆＡである。他の実施形態では、前記毒性因子は、ＬＬＯである。他の実施形態では、前記毒性因子は、ＡｃｔＡである。
他の実施形態では、前記毒性因子は、弱める対象として上記に列挙したいずれかの遺伝子である。他の実施形態では、前記毒性因子は、当該技術分野で公知の他の毒性因子である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明の組換え型ペプチドは、例えばＰＩ−ＰＬＣなどのリステリアタンパク質、又はそれをエンコードする構造体に融合される。他の実施形態では、分泌されたリステリアタンパク質（例えば、溶血素、ＡｃｔＡ、又はホスホリパーゼ）のシグナル配列は、抗原をエンコードする遺伝子に融合される。他の実施形態では、換え型ワクチンベクターのシグナル配列が使用される。他の実施形態では、組換え型ワクチンベクターの機能的シグナル配列が使用される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記構造体は、エピソームの形態でリステリア株に含まれる。他の実施形態では、前記外来抗原は、組換え型リステリア株が保有するベクターから発現される。
リステリアにおける各発現方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、対象には自身の同種異系細胞が投与され、ある実施形態では、抗原に対する免疫応答を誘起する。他の実施形態では、本発明に係る組成物及び方法は、刺激性サイトカイン（ある実施形態では、Ｔｈ１サイトカインであり、ある実施形態では、ＩＦＮガンマである）の発現をもたらす。ある実施形態では、刺激性サイトカインの発現は、本発明に係る組成物及び方法の抗腫瘍効果に貢献する。他の実施形態では、本発明に係る組成物及び方法は、ガンマデルタＴ細胞の発現をもたらす。
他の実施形態では、本発明は、非特異性の抗腫瘍反応を誘導するための組成物及び方法を提供する。ある実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドなどのメラノーマ抗原で免疫を与えると、その抗原を発現しない種類のメラノーマに対しても保護される（実施例４）。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。ここに記載するように、例えば腫瘍成長の抑制、四量体染色、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞数の測定、ＦＡＣＳ及びクロム遊離分析などの複数の証拠によって示されるように、本発明に係るワクチンは抗原特異的免疫応答を誘導する。
他の実施形態では、本発明は、対象の周皮細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の成長を阻害する及び／又は遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍を治療する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の１つ以上の腫瘍細胞を溶解させる方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、腫瘍溶解は、細胞毒性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球、又はそれらの組み合わせに起因する（ある実施形態では、腫瘍特異的である）。
ある実施形態では、本発明に係る方法は、上述した疾病、疾患、症状、又はアレルギー若しくは喘息に関連する副作用の治療、阻害、抑制、抑止、又は防止するのに使用される。ある実施形態では、「治療」は、対象の目的とする病状又は疾患を防止又は低減させる、治療処置及び予防方法又は予防対策の両方を意味する。したがって、ある実施形態では、治療は、疾病、疾患、病状又はそれらの組み合わせに関連する症状に対しての、直接的な影響、治癒、抑制、抑止、防止、重症度の低減、発病の遅延、症状の低減を含む。したがって、ある実施形態では、「治療」は、とりわけ、進行の遅延、寛解促進、寛解誘導、寛解増大、迅速な回復、効果の増大、又は他の治療への耐性の減少、或いはそれらの組み合わせを意味する。ある実施形態では、「防止」又は「阻害」は、とりわけ、症状の発症の遅延、疾病の再発の防止、再発の発生の回数又は頻度の減少、病状発生間の潜在時間の増加、或いはそれらの組み合わせを意味する。ある実施形態では、「抑制」又は「抑止」は、とりわけ、病状の重症度の低減、急性発作の重症度の低減、症状の回数の減少、疾患関連症状の発生率の低減、症状の潜在時間の減少、症状の改善、二次的症状の減少、二次的感染の減少、対象生存の延長、或いはそれらの組み合わせを意味する。
ある実施形態では、症状は一次的である。一方、他の実施形態では、症状は二次的である。ある実施形態では、「一次的」は、特定の疾病又は疾患の結果として直接的に生じた症状を意味する。一方、ある実施形態では、「二次的」は、一次要因に由来する症状を意味する。ある実施形態では、本発明に使用される化合物は、アレルギー又は喘息に関連する一次的な症状又は二次的な合併症を治療する。他の実施形態では、「症状」は、疾病又は病態の任意の兆候であり得る。
本明細書に記載したように、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するリステリア株は、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍の成長を抑制した。これらの結果は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答が、固形腫瘍の血管新生を抑制し、食い止め、それ故に、固形腫瘍の成長を抑制することを示す。本発明の抗ＨＭＷ−ＭＡＡワクチンは、ＨＭＷ−ＭＡＡとそのマウス相同体、すなわち、マウスコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（「ＡＮ２」）との不完全な同一性（８０％）にも関わらず、これらの効果を発揮することができる。この実施形態では、本発明に係る抗ＨＭＷ−ＭＡＡワクチンは、そのＨＭＷ−ＭＡＡの発現に関わらず、あらゆる固形腫瘍に対するワクチン接種に効果的である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系内に存在する。
各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法及び組成物が標的とする固形腫瘍は、他の実施形態では、メラノーマである。他の実施形態では、前記腫瘍は、肉腫である。他の実施形態では、前記腫瘍は、癌腫である。他の実施形態では、前記腫瘍は、中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。他の実施形態では、前記腫瘍は、神経膠腫である。他の実施形態では、前記腫瘍は、胚細胞腫瘍である。他の実施形態では、前記腫瘍は、絨毛腫である。
他の実施形態では、前記腫瘍は、膵臓癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、卵巣癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、胃癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、前記膵臓癌の病巣である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肺腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、結腸直腸腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、卵巣癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肺扁平腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、胃腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、卵巣表面の上皮性新生物（例えば、それらの良性、増殖性、又は悪性の種類のもの）である。他の実施形態では、前記腫瘍は、口腔扁平細胞癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、非小細胞肺癌である。 他の実施形態では、前記腫瘍は、子宮内膜癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、膀胱癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、頭頸部癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、前立腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、非小細胞肺癌（a non-small cell lung cancer：ＮＳＣＬＣ）である。他の実施形態では、前記腫瘍は、ウィルムス腫瘍である。他の実施形態では、前記腫瘍は、線維形成性小円形細胞腫瘍である。他の実施形態では、前記腫瘍は、結腸癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、卵巣癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、子宮癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、甲状腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肝細胞癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、甲状腺癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肝臓癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、腎臓癌である。他の実施形態では、前記腫瘍は、カポジ腫瘍（kaposis）である。他の実施形態では、前記腫瘍は、肉腫である。他の実施形態では、前記腫瘍は、他の癌腫又は肉腫である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
ある実施形態では、本発明は、癌になりやすい固体群又は癌になる危険性が高い個体群における癌を予防するための組成物及び方法を提供する。ある実施形態では、前記個体群は、遺伝性乳癌（ｂｒｃａｌ）又は２遺伝子変異を有する女性（ある実施形態では、乳癌になりやすい）。
上記の癌の各種類は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。ここに記載するように、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するリステリア株は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導し、ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍の成長を抑制した。
本発明に係る方法及び組成物が標的とする前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、他の実施形態では、基底細胞癌である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、神経堤起原の腫瘍である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、星状細胞腫である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、神経膠腫である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、神経芽細胞腫である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、肉腫である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、小児白血病である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、小葉乳癌病巣である。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、メラノーマである。
他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍は、任意のその他のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の周皮細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。ここに記載するように、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するリステリア株は、固形腫瘍（ＨＭＷ−ＭＡＡを発現したかったものでさえ）の成長を抑制した。これらの結果は、腫瘍−血管新生に関連する周皮細胞に対する免疫応答の誘導により、血管新生が抑制されることを示すものである。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現固形腫瘍の成長を阻害する及び／又は進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現固形腫瘍の治療する方法であって、本発明に係る組換え型リステリア株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法に使用される本発明に係る組換え型リステリア株は、他の実施形態では、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む。他の実施形態では、前記組換え型リステリア株は、本発明に係る組換え型ヌクレオチド分子を含む。他の実施形態では、前記組換え型リステリア株は、上記に説明又は列挙した組換え型リステリア株である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の周皮細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍の成長を阻害する及び／又は進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象の固形腫瘍を治療する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、本発明は、対象の固形腫瘍の血管新生を阻害する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記固形腫瘍の周皮細胞に対する前記対象の免疫応答が高まる。他の実施形態では、前記周皮細胞は、前記固形腫瘍の血管系に存在する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍の成長を阻害する及び／又は進行を遅延させる方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、対象のＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍を治療する方法であって、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する前記対象の免疫応答が高まる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、上記に説明したいずれかの方法の前記組換え型ポリペプチドは、本発明に係る組成物の組換え型ポリペプチドのいずれかの特性を有する。各特性は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法の他の実施形態では、本発明に係る組換え型リステリア株を含むワクチンが投与される。他の実施形態では、本発明に係る組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物が投与される。他の実施形態では、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含むワクチンが投与される。他の実施形態では、本発明に係る組換え型ポリペプチドを含む免疫原性組成物が投与される。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物における標的とする周皮細胞は、活性化した周皮細胞である。他の実施形態では、前記標的とする周皮細胞は、当該技術分野で公知の任意のその他の種類の周皮細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法及び組成物の方法又は免疫原性組成物は、細胞性免疫応答を誘導する。他の実施形態では、前記免疫原性組成物は、主に細胞媒介免疫応答を誘導する。他の実施形態では、前記免疫原性組成物は、主にＴｈ１型免疫応答を誘導する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明に係る方法により誘導される前記免疫応答は、細胞媒介免疫応答である。他の実施形態では、前記免疫応答は、Ｔ細胞媒介免疫応答である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法により誘導される前記免疫応答は、他の実施形態では、ＣＴＬを含む。他の実施形態では、Ｔ細胞媒介免疫応答に関わるＴ細胞は、ＣＴＬである。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、前記Ｔ細胞媒介免疫応答は、Ｔヘルパー細胞を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞媒介免疫応答に関わる前記Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明に係る方法の他の実施形態では、対象は、本発明に係る免疫原性組成物、ベクター又は組換え型ペプチドによって免疫される。他の実施形態では、対象は、本発明に係る免疫原性組成物、ベクター又は組換え型ペプチドと接触させられる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、癌細胞の細胞外マトリックスへの付着を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記癌細胞は、メラノーマ細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍の転移を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記腫瘍は、メラノーマ腫瘍である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、癌細胞の遊走を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記癌細胞は、メラノーマ細胞である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍内の細胞増殖を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記腫瘍は、メラノーマ腫瘍である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍の侵襲性を減少させる方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記腫瘍は、メラノーマ腫瘍である。他の実施形態では、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答は、ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＭＴ３−ＭＭＰ（膜型メタロプロテアーゼ）複合体の形成を抑制する。他の実施形態では、これらの複合体の形成を抑制することにより、メラノーマ細胞によるＩ型コラーゲンの分解を阻害する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍の近傍におけるプラスミノーゲンのプラスミンへの変化を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記腫瘍は、メラノーマ腫瘍である。他の実施形態では、プラスミン放出を抑制することにより、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を抑制することができる。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、腫瘍の近傍におけるアンギオスタチンの離脱（sequestration）を抑制する方法であって、本発明に係る方法により抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、前記腫瘍は、メラノーマ腫瘍である。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で列挙されたペプチドと相同する。「相同」、「相同性」などの用語は、任意のタンパク質又はペプチドに関して用いられる際は、ある実施形態では、候補配列において、対応する天然ポリペプチドの残基と一致するアミノ酸のパーセンテージを意味する。なお、この相同性は、候補配列を一列に整列させ、相同性のパーセンテージが最大になるように必要に応じてギャップを導入して求める。その際、同類置換の残基を、対応するものと同一とは見なさない。整列させるための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野では公知である。
相同性は、他の実施形態では、配列アライメント用のコンピュータアルゴリズムを用いて、当該技術分野で公知の方法により決定される。例えば、核酸配列の相同性を分析するためのコンピュータアルゴリズムとしては、入手可能なあらゆるソフトウエアパッケージの利用を含み、そのようなフトウエアパッケージとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（BLAST Enhanced Alignment Utility）、ＧＥＮＰＥＰＴ、及びＴＲＥＭＢＬパッケージがある。
他の実施形態では、「相同（homology、homologous）」は、配列番号１〜１４から選択される非ＨＭＷ−ＭＡＡ配列との一致が７０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が７２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が７５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が７８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８３％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８７％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が８８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９３％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９６％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９７％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が９９％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１〜１４から選択される配列との一致が１００％を越えることを意味する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、「相同（homology、homologous）」は、配列番号１５〜１６から選択されるＨＭＷ−ＭＡＡ配列との一致が７０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が７２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が７５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が７８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８３％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８７％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が８８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９０％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９２％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９３％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９５％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９６％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９７％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９８％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が９９％を越えることを意味する。他の実施形態では、「相同」は、配列番号１５〜１６から選択される配列との一致が１００％を越えることを意味する。各可能な形態は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの測定により判断される。この方法は、当該技術分野では公知である。例えば、「Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1985)」、「Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.」、及び「Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y」を参照されたい。他の実施形態では、ハイブリダイゼーション方法は、天然カスパーゼペプチドをエンドードするＤＮＡの補完物（complement）に対して、穏やかな条件から厳密な条件下で実施される。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば、１０〜２０％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性及びせん断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液内で、４２℃で一晩培養するものがある。
他の実施形態では、本明細書に列記したＡＡ配列についてのタンパク質及び／又はペプチドの相同性は、イムノブロット解析や様々なソフトウエアパッケージを用いたコンピュータアルゴリズム解析などの当該技術分野で公知の方法を確立された手法に従って行うことで測定する。これらのパッケージとして、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、又はＳｃａｎｐｓがある。これらのソフトウエアは、他の実施形態では、分析のためにスミス・ウォーターマンアルゴリズム、及び／又はグローバル／ローカル又はＢＬＯＣＫＳアラインメントを利用する。相同を測定するための各方法は、本発明の別個の実施形態に相当する。
本発明の他の実施形態では、「核酸」又は「ヌクレオチド」は、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩が組み合わさった鎖を意味する。この用語は、ある実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、核酸ポリマーのモノマー単位である。ＲＮＡは、ある実施形態では、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びリボザイムの形態である。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの使用は、「Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96 and references cited therein」に記載されている。ＤＮＡは、他の実施形態では、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡ、或いはそれらの誘導体の形態であり得る。さらに、これらの形態のＤＮＡ及びＲＮＡは、単鎖、二重鎖、三重鎖、又は四重鎖であり得る。また、他の実施形態では、この用語は、同一の塩基を含むが、他の型のバックボーンを含む人工核酸を含む。ある実施形態では、前記人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチドのバックボーンとヌクレオチド塩基を含み、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方に結合可能である。他の実施形態では、前記ヌクレオチドは、オキセタンで修飾される。他の実施形態では、前記ヌクレオチドは、１つ以上のリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換することにより修飾される。他の実施形態では、前記人工核酸は、当該技術分野で既知の天然核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含む。ホスホチオレート核酸及びＰＮＡの使用は当業者には既知であり、例えば、「Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57」や「Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84」に記載されている。核酸の作成及び使用は、当業者には既知であり、例えば、「Molecular Cloning, (2001 ), Sambrook and Russell, eds.」や「Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed」に記載されている。各核酸の派生物は、本発明の別個の実施形態に相当する。
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る方法を実施するのに使用される単数又は複数の組成物を含むキットを提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明に係る組成物、器具又は装置を含むキットを提供する。
医薬組成物及び投与方法
「医薬組成物」は、他の実施形態では、治療に有効な量の活性成分（すなわち、組換え型ペプチド又はそれを含む若しくはエンコードするベクター）を、薬学的に許容される担体又は希釈液と共に含んでいる組成物である。「有効な量」は、他の実施形態では、投与条件及び投薬計画において治療効果を与える量を意味する。
前記活性成分を含んでいる前記医薬組成物は、他の実施形態では、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腹膜内投与、脳室内投与、脳内投与、膣内投与又は腫瘍内投与などの当業者に周知の方法によって対象に投与することができる。
本発明に係る方法及び組成物の他の実施形態では、経口投与に適した形態（すなわち、固形又は液体製剤）に製剤化され、経口投与される。適切な経口用固形製剤としては、錠剤、カプセル、ピル、顆粒、ペレットなどがある。また、適切な経口用液体製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などがある。本発明の他の実施形態では、前記活性成分はカプセル製剤化される。この実施形態では、本発明に係る組成物は、前記活性成分及び不活性担体（又は希釈液）に加えて、硬ゲル化カプセルを含む。
他の実施形態では、前記医薬組成物は、液体製剤の静脈内注射、動脈内注射又は筋肉内注射によって投与される。適切な液体製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などがある。他の実施形態では、前記医薬組成物は、静脈内投与に適した形態に製剤化され、静脈内に投与される。他の実施形態では、前記医薬組成物は、動脈内投与に適した形態に製剤化され、動脈内に投与される。他の実施形態では、前記医薬組成物は、筋肉内投与に適した形態に製剤化され、筋肉内に投与される。
さらに、他の実施形態では、前記医薬組成物は、局所投与に適した形態に製剤化され、体の表面に局所的に投与される。適切な局所性製剤としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、液滴などがある。局所的に投与するために、前記組換え型ペプチド又はベクターは、薬学的担体を用いて又は用いることなく、生理学的に認容される希釈液と共に、水溶液、懸濁液又は乳状液として製剤化され塗布される。
他の実施形態では、前記活性成分は、小胞（例えば、リポソーム）に含まれた状態で送達される。
他の実施形態では、本発明の方法に使用される担体又は希釈剤としては、これらに限定されるものではないが、ガム、デンプン（例えば、コーンのデンプン、予めゲル化されたデンプン）、糖（例えば、乳糖、マンニトール、ショ糖、ブドウ糖）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、滑石、又はこれらの混合物がある。
他の実施形態では、液体製剤用の薬学的に許容される担体としては、水溶性若しくは非水性の溶液、懸濁液、乳濁液、又は油がある。非水溶媒の例としては、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、及び注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）がある。水溶性担体としては、水、アルコール性／水溶性の溶液、乳濁液、又は懸濁液（生理食塩水及び緩衝培地を含む）がある。油の例としては、動物性油、植物性油、又は合成油がある（例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ひまわり油、魚肝油、他の魚油、又は牛乳若しくは卵の脂質）。
他の実施形態では、非経口媒体（皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、又は筋肉内注射用）としては、塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガーオイル及び固定油がある。経静脈媒体としては、液体及び栄養補充薬、電解質補充薬（例えば、リンガー・デキストロースに基づくもの）などがある。一例としては、界面活性剤及び他の薬学的に許容されるアジュバントを添加した又は添加しない、水や油などの無菌液がある。一般的に、水、生理食塩水、水溶性デキストロースや関連糖液、及びグリコール（例えば、プロピレン・グリコールやポリエチレン・グリコール）は、液体担体として適している（特に、注射用溶液として適している）。油の例としては、動物性油、植物性油、又は合成起源の油がある（例えば、ピーナッツ油、大豆油、オリーブ油、ひまわり油、魚肝油、他の魚油、又は牛乳若しくは卵の脂質）。
ある実施形態では、本明細書に記載された前記医薬組成物は、投与後に前記活性成分を長期間に渡って放出する制御放出組成物である。制御又は持続放出組成物としては、脂溶性の持続性製剤（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）がある。他の実施形態では、前記医薬組成物は、投与後に全ての前記活性成分を直ちに放出する即放組成物である。
実験の詳細の項
実施例１：ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクト及びそれを発現するリステリア菌株の構築
ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを次のように作製した。
グラム陰性及びグラム陽性の両方の細菌において複製できるシャトルベクターであるｐＡＭ４０１から、ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトの前駆体であるｐＧＧ−５５を作製した（Wirth R et al, J Bacterid, 165: 831, 1986）。ｐＡＭ４０１は、グラム陽性クロラムフェニコール耐性遺伝子及びグラム陰性テトラサイクリン耐性決定因子を含む。ｐＧＧ−５５では、ｈｌｙプロモーターは、ｈｌｙ遺伝子産物（溶血性Ｃ末端を欠き、配列番号３に記載の配列を有する）の最初の４４１ＡＡの発現を駆動する。ｈｌｙ遺伝子産物は、Ｘｈｏｌ部位でＥ７遺伝子に連結しており、それによって、ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子が得られる。この融合遺伝子は、転写されてＬＬＯ−Ｅ７として分泌される。
ｐＧＧ−５５の生成：リステリオリシン断片とＥ７との融合物（「ＬＬＯ−Ｅ７」）及び多能性の転写因子ｐｒｆＡを次のようにｐＡＭ４０１にサブクローニングした。ＬＬＯの最初の４２０ＡＡをコードするＤＮＡ断片及びそのプロモーター並びに上流調節配列を、ＬＭのゲノムＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９に結合させた。用いたＰＣＲプライマーは、５´−ＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴ−３´（配列番号１７）及び５´−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣ−３´（配列番号１８）であった。プライマー５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（配列番号１９；Ｘｈｏｌ部位に下線を引いている）及び５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（配列番号２０；Ｓｐｅｌ部位に下線を引いている）を用いてＰＣＲ法によってＥ７を増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, San Diego, CA）に結合させた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏｌ/Ｓｐｅｌで消化してＥ７を切り離し、その後、インフレーム翻訳融合物としてｐＵＣ１９−ｈｌｙの溶血素遺伝子断片の下流に結合させた。その後、融合物をｐＡＭ４０１のマルチリンカーにサブクローニングした。その後、得られたプラスミドのＳａｌｌ部位にｐｒｆＡ遺伝子をサブクローニングし、ｐＧＧ−５５を得た（図１）。
ｐＧＧ−５５からｐＧＧ３４Ａ、Ｂ、及びＣを次のように作製した。
ＨＭＷ−ＭＡＡ断片Ａ、Ｂ、Ｃ（それぞれＡＡ３６０〜５５５、７０１〜１１３０、２１６０〜２２５８をコードする。図１参照）は、次の配列を有する。
ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａ：
ｔｔｃａａｔｇｇｃｃａｇａｇｇｃｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇｇｇａａｇｃｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃｇｃａａｃａｔｇｇｃａｇｃｃｇｇｃｔｇｃａｇｇｃｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｔａｔｇａｇｇａｃｇａｔｇｃｃｔａｔｇｇａｃａｔｔａｔｇａａｇｃｔｔｔｃｔｃｃａｃｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔｇａｇｇｃｔｔｇｇｃｃａｇｃｃａｔｇｇａｇｃｔｇｃｃｔｇａｇｃｃａｔｇｃｇｔｇｃｃｔｇａｇｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｃｃａａｔｔｔｃａｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｇａｃｔａｔｃａｇｃｃｃａｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃｇａｇｇｇｇｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｇｃｔｔｇａｇｔｇｇａｇｇｃａｔｇｔｇｃａｇｃｃｃａｃｇｃｔｇｇａｃｃｔｇａｔｇｇａｇｇｃｔｇａｇｃｔｇｃｇｃａａａｔｃｃｃａｇｇｔｇｃｔｇｔｔｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃｇａｇｇｇｇｃａｃｇｃｃａｔｇｇｃｇａｇｃｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃａｔｃｃｃｇｇｇａｇｃｃｃａｇｇｃａｃｇａａａａａｔｇｔｔｃａｃｃｃｔｃｃｔｇｇａｃｇｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａａｇｇｃｃｃｇｃｔｔｃａｔｃｃａｃｇａｔｇｇｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃｃｔｃｃｇａｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｇｇｔｇｔｃｇｇｔｇａｃｇｇｃｔｃｇｇｇｔｇｃｃｃａｔｇｃｃｃｔｃａｔｇｃｃｔｔｃｇｇａｇｇｇｇｃｃａａａｃａｔａｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃａｔｃｃａｇｇｔｃａａｃｃｃｔｇｔｃａａｔｇａｃｃｃａｃｃｃｃａｃ（配列番号２１）。
ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ：
ｇｔｃｃｇｃｇｔｃａｃｔｇｇｇｇｃｃｃｔｇｃａｇｔｔｔｇｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇａａａｃａｃｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｇｇｇｔｇｃｔｇａｇｔｇｇｔｇｇｇｃｃａｃａｃａｇｇｃｇｔｔｃｃａｃｃａｇｃｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｃａｇｇｇｃｃｇｃｇｔｇａｇｇｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｔｇａｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｇｃｔｔａｃｇａｃａｃｃｇｔｇｇａｇａａｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｔｇｇｇｃｃａｇｇａｇａｔｃｃｔｇａｇｃａａｔｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｃａｇｔｇａｃｃａｔｃｃａｇａｇａｇｃｃａｃｔｇｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｇｃｇｇｃｔｇｇａｇｃｃａｃｔｇｃａｃａｃｔｃａｇａａｃａｃｃｃａｇｃａｇｇａｇａｃｃｃｔｃａｃｃａｃａｇｃｃｃａｃｃｔｇｇａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇｇａｇｇａｇｇｃａｇｇｃｃｃａａｇｃｃｃｃｃｃａａｃｃｔｔｃｃａｔｔａｔｇａｇｇｔｇｇｔｔｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇａａａｇｇｃａａｃｃｔｔｃａａｃｔａｃａｇｇｇｃａｃａａｇｇｃｔｇｔｃａｇａｔｇｇｃｃａｇｇｇｃｔｔｃａｃｃｃａｇｇａｔｇａｃａｔａｃａｇｇｃｔｇｇｃｃｇｇｇｔｇａｃｃｔａｔｇｇｇｇｃｃａｃａｇｃａｃｇｔｇｃｃｔｃａｇａｇｇｃａｇｔｃｇａｇｇａｃａｃｃｔｔｃｃｇｔｔｔｃｃｇｔｇｔｃａｃａｇｃｔｃｃａｃｃａｔａｔｔｔｃｔｃｃｃｃａｃｔｃｔａｔａｃｃｔｔｃｃｃｃａｔｃｃａｃａｔｔｇｇｔｇｇｔｇａｃｃｃａｇａｔｇｃｇｃｃｔｇｔｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｇｔｇｇｔｇｃｃｔｇａｇｇｇｔｇｇｔｇａｇｇｇｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｃｔｇａｃｃａｃｃｔｃｔｔｔｇｔｃａａｇａｇｔｃｔｃａａｃａｇｔｇｃｃａｇｃｔａｃｃｔｃｔａｔｇａｇｇｔｃａｔｇｇａｇｃｇｇｃｃｃｃｇｃｃａｔｇｇｇａｇｇｔｔｇｇｃｔｔｇｇｃｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｇａｃａａｇａｃｃａｃｔａｔｇｇｔｇａｃａｔｃｃｔｔｃａｃｃａａｔｇａａｇａｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔｇｇｃｃｇｇｃｔｇｇｔｃｔａｃｃａｇｃａｔｇａｔｇａｃｔｃｃｇａｇａｃｃａｃａｇａａｇａｔｇａｔａｔｃｃｃａｔｔｔｇｔｔｇｃｔａｃｃｃｇｃｃａｇｇｇｃｇａｇａｇｃａｇｔｇｇｔｇａｃａｔｇｇｃｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｔａｃｇｇｇｇｔｇｔｃｔｔｃｃｇａｇｔｇｇｃｃａｔｃｃａｇｃｃｃｇｔｇａａｔｇａｃｃａｃｇｃｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａｃｃａｔｃａｇｃｃｇｇａｔｃｔｔｃｃａｔｇｔｇｇｃｃｃｇｇｇｇｔｇｇｇｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃｔｇａｃｔａｃａｇａｃｇａｃｇｔｇｇｃｃｔｔｃａｇｃｇａｔｇｃｔｇａｃｔｃｇｇｇｃｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃｔｔａｃｃｃｇｃａａｇｇａｃｃｔｃｃｔｃｔｔｔｇｇｃａｇｔａｔｃｇｔｇｇｃｃｇｔａｇａｔｇａｇｃｃｃａｃｇｃｇｇｃｃｃａｔｃｔａｃｃｇｃｔｔｃａｃｃｃａｇｇａｇｇａｃｃｔｃａｇｇａａｇａｇｇｃｇａｇｔａｃｔｇｔｔｃｇｔｇｃａｃｔｃａｇｇｇｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｇａｔｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇｔｇｔｃｃｇａｃｇｇｇｃａａｃａｃｃａｇｇｃｃａｃｔｇｃｇｃｔｇｃｔｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｃｃｔｃｇｇａａｃｃｃｔａｃｃｔｃｃｇｔｇｔｇｇｃｃ（配列番号２２）。
ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ：
ｇｃｃａｃｔｇａｇｃｃｔｔａｃａａｔｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇｇｃｃｃｔｇｃｔｃａｇｔｇｔｃｃｃｃｇａｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇａｃｇｇａａｇｃａｇｇｇａａｇｃｃａｇａｇａｇｃａｇｃａｃｃｃｃｃａｃａｇｇｃｇａｇｃｃａｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｃａｔｃｃａｇｃｃｃｔｇａｇｃｃｃｇｃｔｇｔｇｇｃｃａａｇｇｇａｇｇｃｔｔｃｃｔｇａｇｃｔｔｃｃｔｔｇａｇｇｃｃａａｃａｔｇｔｔｃａｇｃｇｔｃａｔｃａｔｃｃｃｃａｔｇｔｇｃｃｔｇｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｇｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔａｃｃｔｃｃｇａａａａｃｇｃａａｃａａｇａｃｇｇｇｃａａｇｃａｔｇａｃｇｔｃｃａｇ（配列番号２３）。
次のプライマーを用いて断片を増幅した。フォワードプライマー内のＸｈｏｌ部位及び、リバースプライマー内のＸｍａｌ部位（Ａ及びＣ）又はＳｐｅｌ部位（Ｂ）に下線を引いている。
断片Ａ：フォワードプライマーＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧ（配列番号２４）。
リバース：ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣ（配列番号２５）。
断片Ｂ：フォワード：ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧ（配列番号２６）。
リバース：ＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＡＧＧＧＴＴＣ（配列番号２７）。
断片Ｃ：フォワード：ＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＣ（配列番号２８）。
リバース：ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＣＧ（配列番号２９）。
次に、ｈｌｙ配列の末端にあるＸｈｏｌ部位及びその遺伝子の後にあるＸｍａｌ又はＳｐｅｌ部位を用いて、断片Ａ〜ＣをｐＧＧ−５５にサブクローニングした。
その後、リステリアのｐｒｆＡ陰性株であるＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のハオ・シェン博士（Dr. Hao Shen）から調達した）をｐＧＧ３４Ａ、Ｂ、及びＣで形質転換し、インビボでこれらのプラスミドを保持するものを選択した。
実施例２：ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトはリステリア内で発現される
材料及び実験方法
細菌の培養及び採取
ＬＬＯに融合したＨＭＷ−ＭＡＡ断片Ａ、Ｂ、及びＣを発現する組換えリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）を、ストレプトマイシン（２５０ｕｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５ｕｇ／ｍｌ）が添加されたＢＨＩ培地内で一晩増殖させた。内在性ＬＬＯの誘導のために、０．２％のチャコールの存在下で細菌を培養した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して培養上清を除去し、タンパク質を沈澱させるために１．３５ミリリットル（ｍｌ）の上清を０．１５ｍｌの１００％ＴＣＡと混合した。氷上で１時間インキュベートした後、溶液を１４０００ｒｐｍで１０分間回転させた。沈殿物を４５マイクロリットル（ｍｃＬ）の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディングバッファ中に再懸濁し、５ｍｃＬの１Ｍ ＤＴＴを加え、試料を７５℃で５分間加熱した。各ウェル内に５〜１０ｍｃＬのタンパク質をローディングし、ＭＯＰＳ緩衝液を用いて２００Ｖで５０分間泳動させた。
ＰＶＤＦ膜に転写した後、ＬＬＯタンパク質におけるＰＥＳＴ配列を認識するウサギ抗ＰＥＳＴポリクローナル抗体（１：３０００）または内在性ＬＬＯのみを認識するＢ３−１９モノクローナル抗体のいずれかと共に膜をインキュベートし、次にＨＲＰに結合した抗ウサギ抗体を用いてインキュベートした。SuperSignal（登録商標）ウエストピコ化学発光基質（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate）（Pierce, Rockford, IL）を用いて、シグナルを検出した。
結果
ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトがリステリア菌内で発現されることができるか否かを判定するために、ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ Ａ、Ｂ及びＣプラスミドで形質転換されたＬＭ菌株から上清を採取し、融合タンパク質の存在を検査した。抗ＰＥＳＴ抗体でプローブしたところ、３つの菌株全てが予想されたサイズの融合タンパク質（ＬＬＯは４８Ｋｄａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａは７５Ｋｄａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂは９８Ｋｄａ、ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃは６２Ｋｄａ；図２Ａ）を生成したことがわかった。抗ＬＬＯ抗体によって、３つの菌株全て及び対照においてＬＬＯの５８Ｋｄａのバンドが示された（図２Ｂ）。
このように、ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトは、リステリア菌内で発現される。
実施例３：ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを発現するリステリア菌株は細胞に感染し、その中で増殖する
材料及び実験方法
細胞感染アッセイ
マウスのマクロファージ様のＪ７７４細胞を、ＭＯＩ（感染多重度）１で感染させた。１時間のインキュベーション後、ゲンタマイシンを加えて細胞外リステリア菌を殺し、２時間毎に、Ｊ７７４細胞を水で溶解し、溶解産物の一連の希釈物を、ストレプトマイシン（２５０マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５ｍｃｇ／ｍｌ）が添加されたＢＨＩプレート上に蒔くことによって細胞内リステリア菌を回収した。回収したコロニーの数を数え、Ｊ７７４細胞内のリステリア菌の数を測定した。
結果
ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを発現するリステリア菌株の増殖特性及び毒性を判定するために、実施例２のリステリア菌株のＢＨＩ培地における増殖速度を測定した。各菌株は、野生型（１０４３Ｓ）リステリア菌に非常によく似たキネティクスで増殖した（図３Ａ）。次に、Ｊ７７４細胞をリステリア菌株と共にインキュベートし、細胞内増殖を測定した。各菌株の細胞内増殖は、野生型のものと非常によく似ていた（図３Ｂ）。
したがって、ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトを発現するリステリア菌株は、培地内における増殖能力、細胞への感染能力、細胞内での増殖能力を維持する。
実施例４：ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍをワクチン接種すると、Ｂ１６Ｆ０−ＯＶＡ腫瘍の増殖が遅れる
材料及び実験方法
腫瘍増殖の測定
１日おきに測径器で腫瘍の表面の最短径及び最長径を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを屠殺した。各時点における腫瘍の測定値は、生きたマウスのみに関するものである。
結果
３２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群当たりｎ＝８）に５×１０５個のＢ１６Ｆ０−ＯＶＡを接種した。３、１０、１７日目に、Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１×１０８ｃｆｕ；陽性対照）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（１×１０８ｃｆｕ）の３つのコンストラクトのうちの１つでマウスに免疫した。腫瘍細胞がＨＭＷ−ＭＡＡを発現しないもかかわらず、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃのワクチン接種によって腫瘍増殖が有意に遅れたが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡをワクチン接種したときほどではなかった（図４Ａ〜Ｂ）。他の実験でも、３つのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ株全てに同様の結果が観察された（Ａ及びＣはそれぞれ２．５×１０７ｃｆｕ、Ｂは１×１０８ｃｆｕ。図４Ｃを参照）。
ＲＥＮＣＡ細胞を用いて同様の実験を行った。４０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝８）に２×１０５個のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を接種した。３、１０、１７日目に、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａ、Ｂ若しくはＣ（Ａ及びＣはそれぞれ２．５×１０７ｃｆｕ、Ｂは１×１０８ｃｆｕ）又はＧＧＥ７（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７；１×１０８ｃｆｕ）の４つのコンストラクトの内の１つでマウスを免疫し、或いはワクチン未接種（未処置）のままにしておいた。３つのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ菌株全てが腫瘍増殖を遅らせた。その中で、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃが最大の効果を示した（図４Ｄ〜４Ｅ）。
したがって、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍをワクチン接種すると、例え腫瘍細胞がＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない場合でも、腫瘍の増殖が遅れる。
実施例５：ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するＬｍをワクチン接種すると、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞によってＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ腫瘍増殖が遅れる
材料及び実験方法
Ｂ１６及びＢ１６Ｆ１０マウス腫瘍細胞株がＨＭＷ−ＭＡＡを発現するようにするための操作：
ＣＶＭプロモーターの制御下で発現する完全長ＨＭＷ−ＭＡＡのｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１−ＨＭＷ−ＭＡＡプラスミドをＢ１６Ｆ１０細胞に形質移入した。安定的に形質移入された細胞をＧ４１８抗生物質への耐性によって選択し、その後、限界希釈法によって単一細胞からクローンを増殖させた。選択されたクローンは、ＨＭＷ−ＭＡＡ特異モノクローナル抗体ＶＴ８０．１２を用いてフローサイトメトリーによってＨＭＷ−ＭＡＡの発現に関して検査した。フローサイトメトリーの結果に基づき、更なる実験のためにＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡクローン７を選択した（図５）。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の枯渇
３２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣＭＶ７を接種した。３、１０、１７日目に、未処置対照群を除いて、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（２．５×１０７ｃｆｕ）でマウスに免疫した。ＣＤ４及びＣＤ８を枯渇させるために、１、２、６、９日目に５００μｇのＧＫ１．５及び２．４３と対照抗体Ｇ１を腹腔内投与した。ＣＤ２５を枯渇させるために、０、２日目に５００μｇのＣＰ６１を腹腔内投与した。
Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ又はＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣによるＨＬＡ Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスの免疫：
ＨＬＡ Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスは、ヒトＡ*０２０１対立遺伝子のα１及びα２ドメイン並びにマウスＨ−２ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから構成されるキメラのクラスＩ分子を発現する。１．０×１０８ｃｆｕのＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ又は２．５×１０７ｃｆｕのＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣのいずれかでＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスを免疫した。９日後、モネンシンの存在下で５時間、インビトロで、ペプチドＢ１（ＩＬＳＮＬＳＦＰＶ、配列番号４３、ＨＭＷ−ＭＡＡ７６９−７７７に対応する）、ペプチドＢ２（ＬＬＦＧＳＩＶＡＶ、配列番号４４、ＨＭＷ−ＭＡＡ１０６３−１０７１に対応する）又はペプチドＣ（ＬＩＬＰＬＬＦＹＬ、配列番号４５、ＨＭＷ−ＭＡＡ２２３８−２２４６に対応する）で脾細胞を刺激した。ＣＤ８＋−ＣＤ６２Ｌ低で細胞をゲートし、細胞内ＩＦＮ−γ染色を測定した。
別の実験では、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ又はＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃのいずれかでマウスを２回免疫した（０日目及び２日目）。１４日目に脾細胞を採取してＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡの断片Ｂ１またはＣでのインビトロ刺激に用いた。ＩＦＮ−γElispotを用いてＩＦＮ−γレベルを測定した。
結果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たりｎ＝８）に２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ／ＣＭＶ７を接種した。３、１０、１７日目に、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ａ（２．５×１０７ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ（１×１０８ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（２．５×１０７ｃｆｕ）の３つのコンストラクトのうちの１つでマウスを免疫した。対照群をＬｍ−ＧＧＥ７（１×１０８ｃｆｕ）でワクチン接種した。３つのＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクト全てが、有意な抗腫瘍効果を示した（図６）。
Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡの抗腫瘍効果におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の役割を評価するために、Ｂ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ／ＣＭＶ７Ｂを接種したＣ５７ＢＬ／６マウス内のＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞を枯渇させ、３、１０、１７日目にＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（２．５×１０７ｃｆｕ）で免疫した。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋を枯渇させたところ、ＬＭ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチンの効果が無効となった（図７）。
各処置群からのマウスの脾臓からＣＤ８＋Ｔ細胞（マウス１匹当たり２×１０６個の細胞）を精製し、Ｂ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ腫瘍細胞（マウス１匹当たり２×１０５個）と混合し、その後、マウス（１群当たり８匹）に皮下注射した。マウスを２８日間観察し、２日毎に腫瘍増殖を調べた。Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでワクチン接種したマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボでＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ腫瘍の増殖を阻害した（図８）。
上記のように２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣＭＶ７を接種し、且つＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃをワクチン接種し、７週間後に腫瘍なしのままであったマウスを、最初の腫瘍注射から７週間後に、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ細胞で再チャレンジさせた。ワクチン接種したマウスは、Ｂ１６Ｆ１０−ＨＭＷ−ＭＡＡ／ＣＭＶ７腫瘍細胞による第２のチャレンジから保護された（図９）。
Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ及びＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣでＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスを免疫すると、１回（図１０Ａ）または２回の免疫処理（図１０Ｂ）後とも、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片Ｂ及び断片Ｃの２つの特徴付けられたＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対する検出可能な免疫反応が誘発される。
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂマウス及び野生型Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｂ又はＬｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで１回免疫し、断片ＣのＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドで刺激されたＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を、ＩＦＮ−γエリスポットを用いて測定した。Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫され、且つペプチドＣで刺激されたＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂ遺伝子導入マウスでは、刺激されなかった遺伝子導入マウスと比べても、ペプチドＣで刺激された非遺伝子導入マウスと比べても、並びに免疫されなかった遺伝子導入マウス及び対照マウスと比べても増加した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
したがって、Ｌｍ−ＨＭＷＭＡＡコンストラクトは、腫瘍増殖を遅らせる抗原特異的免疫反応を誘発する。その上、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡコンストラクトは、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現しない腫瘍に対してすら抗腫瘍活性を引き起こす。
実施例６：Ｅ７とＬＬＯまたはＡｃｔＡとの融合物は、Ｅ７特異的免疫を高め、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８ ＋ 細胞を産出する
材料及び実験方法
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、プラスミドベクターｐＤＤ−１を導入することによって得られた。ｐＤＤ−１は、ＬＭを有するようにｐＤＰ−２０２８を改変することで構築した。ｐＤＤ−１は、ａｃｔＡ−Ｅ７の発現及び分泌を駆動する３１０ｂｐのｈｌｙプロモーター及びｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセットと、４つのＰＥＳＴ配列（配列番号５）を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（短縮されたＡｃｔＡポリペプチドは、分子の最初の３９０ＡＡからなる，配列番号４）と、３００ｂｐのＨＰＶ Ｅ７遺伝子と、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（ビルレンス遺伝子の発現を制御する）と、形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）とを含む。
ｐＤＤ−１は、ｐＤＰ２０２８（ΔＬＬＯ−ＮＰをコードする）から作成した。一方、ｐＤＰ２０２８は、次のように作成した。
ｐＤＰｌ６５９の構築：ＬＬＯの最初の４２０ＡＡをコードするＤＮＡ断片及びそのプロモーター並びに上流調節配列を、ＬＭゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９に連結した。用いたＰＣＲプライマーは、５´−ＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴ−３´（配列番号３０）及び５´−ＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣＣ−３´（配列番号３１）であった。ＮＰをコードするＤＮＡ断片ＮＰは、線状化したプラスミドｐＡＰＲ５０１（ニューヨークのマウント・シナイ医科大学のピーター博士（Dr. Peter Palese）から入手）から同様にＰＣＲ増幅し、その後、インフレーム翻訳融合体として溶血素遺伝子断片のｐＵＣ１９下流に結合させた。用いたＰＣＲプライマーは、５´−ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧ−３´（配列番号３２）及び５´−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴ ＡＡＴ−３´（配列番号３３）であった。その後、この融合体をｐＡＭ４０１のＳａｌｌ部位及びＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。ｐｒｆＡ遺伝子をｐＤＰｌ６５９のＳａｌＩ部位にサブクローニングすることによって、プラスミドｐＤＰ２０２８を構築した。
次のようにｐＤＰ−２０２８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）からｐＤＤ−１を作製した。
ｐＧＧ−５５から、プライマー５´−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（Ｘｂａ Ｉ部位に下線を引いている、配列番号３４）及びプライマー５´−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−３´（ＮｏｔＩ部位に下線を引いている。最初の１８個のヌクレオチドは、ＡｃｔＡ遺伝子と重複する、配列番号３５）を用いて、ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）及び遺伝子断片（４４１ＡＡ）をＰＣＲ増幅した。プライマー５´−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３´（ＮｏｔＩ部位に下線を引いている、配列番号３６）及びプライマー５´−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３´（Ｘｈｏｌ部位に下線を引いている、配列番号３７）を用いて、ＬＭ１０４０３野生型ゲノムからＡｃｔＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー５´−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３´（Ｘｈｏｌ部位に下線を引いている、配列番号３８）及びプライマー５´−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（Ｘｍａｌ部位に下線を引いている、配列番号３９）を用いて、ｐＧＧ−５５からＥ７遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー５´−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（Ｘｍａｌ部位に下線を引いている、配列番号４０）及びプライマー５´−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（Ｓａｌｌ部位に下線を引いている、配列番号４１）を用いて、ＬＭ１０４０３野生型ゲノムからｐｒｆＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３４）及び下流ａｃｔＡプライマー（配列番号３７）を用いて、精製したｐＨｌｙ及びａｃｔＡのＤＮＡからｈｌｙプロモータ−ａｃｔＡ融合遺伝子（ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ）をＰＣＲ産出／増幅した。
上流Ｅ７プライマー（配列番号３８）及び下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４１）を用いて、精製したＥ７及びｐｒｆＡのＤＮＡから、ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合したＥ７遺伝子をＰＣＲ産出／増幅した。
Ｅ７−ｐｒｆＡ融合産物に融合したｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合産物を、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３４）及び下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号４１）を用いて、精製したｐＨｌｙ−ａｃｔＡ及びＥ７−ｐｒｆＡのＤＮＡの融合産物からＰＣＲ産出／増幅させ、ｐＣＲＩＩに結合させた（Invitrogen, La Jolla, Calif.）。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０´Ｆ、Invitrogen, La Jolla, Calif.）をｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解及び単離の後、プラスミドを、ＢａｍＨＩ（予測される断片サイズは７７０及び６４００ｂｐ）及びＢｓｔＸＩを用いた（得られる断片の予測サイズは２８００及び３９００ｂｐ）制限解析によりスクリーニングし、さらに上記の上流ｐＨｌｙプライマー及び下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマーを用いたＰＣＲによってスクリーニングした。
ＸｂａＩ／ＳａｌＩによる消化を用いてｐＣＲＩＩからｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−ＰｒｆＡのＤＮＡインサートを切除し、ＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化したｐＤＰ−２０２８に連結した。発現系ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７でＴＯＰ１０´Ｆコンピテント大腸菌（Invitrogen, La Jolla, Calif.）を形質転換した後、上記の上流ｐＨｌｙプライマー及び下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマーを用いたＰＣＲ解析によってクロラムフェニコール耐性クローンをスクリーニングした。ｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を含むクローンを増幅し、ミディプレップ（midiprep）ＤＮＡを単離した（Promega, Madison, Wis）。ＸＦＬ−７をｐＨｌｙ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で形質転換し、インビボでこのプラスミドを保持するクローンを選択した。２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）のクロラムフェニコールを含むブレインハートインフュージョン培地（Difco, Detroit, Mich）にて３７℃でクローンを増殖させた。細菌をアリコートに分けて−８０℃で凍結させた。
インビボ実験：
２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を含む１００ｍｃＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と４００ｍｃＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）とを含む５００ｍｃＬのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を、１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）の左脇腹に皮下移植した。７、１４、２１日目にマウスに腹腔内で免疫処置を施し、２８日目に脾臓及び腫瘍を採取した。マウスから腫瘍マトリゲルを取り除き、４℃で一晩、２ｍｌのＲＰ１０培地を含有するチューブ内で、氷上でインキュベートした。鉗子を用いて腫瘍を細かく分け、２ｍｍの塊に切り分け、３ｍｌの酵素混合液（０．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ−Ｐ及び１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ−１含有ＰＢＳ）を添加して３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液をナイロンメッシュで濾過し、５％ウシ胎仔血清及び０．０５％のＮａＮ３含有ＰＢＳで洗浄して四量体及びＩＦＮ−γ染色に使用した。
脾細胞及び腫瘍細胞を、１０７細胞／ｍｌの懸濁液の状態でブレフェルジンＡの存在下で１マイクロモル（ｍｃｍ）Ｅ７ペプチドを添加して５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃＬの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４Ｇ２）内で、１時間または一晩、４℃でインキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８及びＣＤ６２Ｌ染色し、透過化処理し、透過化処理キットGolgi-stop（登録商標）又はGolgi-Plug（登録商標）（Pharmingen, San Diego, Calif.）を用いて固定し、ＩＦＮ−γ染色した。２レーザ構成のフローサイトメーターFACSCaliburを用いて５００，０００イベントを取得し、Cellquest Software（Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.）を用いて解析した。活性（ＣＤ６２Ｌ低）ＣＤ８＋Ｔ細胞の内、ＩＦＮ−γを分泌する細胞の割合を計算した。
四量体染色に関しては次のように行った。Ｈ−２Ｄｂ四量体に、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合したＥ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号４２）を取り付け、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合したＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）及びＦＩＴＣに結合したＣＤ８βで４℃で３０分間染色した。脾臓及び腫瘍における四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ低細胞を比較して細胞を解析した。
結果
ＬＬＯ融合体及びＡｃｔＡ融合体の抗原特異免疫力を高める能力を解析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞をインプラントした。マウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）若しくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫処置を施し、あるいは免疫処置を施さなかった（未処置）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群のマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７を投与したマウス又は未処置のマウスよりも高い割合のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２）及び四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図１３）を含んでいた。
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、共に、腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導及び腫瘍退縮において効果がある。よって、ＬＬＯ及びＡｃｔＡの融合体は、本発明の方法及び組成において効果的である。
実施例７：ＰＥＳＴ様の配列へ融合させると、Ｅ７に対する特異的な免疫力が高まる
材料及び実験方法
コンストラクト：
ＬＬＯのプロモーター及びＬＬＯの最初の５０ＡＡのみを含む点を除いてＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同じリステリア菌株であるＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を次のように構築した。
オーバーラップ伸長によるスプライシング（splicing by overlap extension：ＳＯＥ）ＰＣＲによって、ｈｌｙプロモーター及びＰＥＳＴ領域を完全長Ｅ７遺伝子に融合させた。ＬＬＯの最初の４４１個のアミノ酸を含有するプラスミドｐＧＧ−５５からＥ７遺伝子及びｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片を増幅し、従来のＰＣＲ技術によって継ぎ合わせた。ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片であるｐＶＳ１６．５及びＬＭ転写因子ｐｒｆＡを、プラスミドｐＡＭ４０１にサブクローニングした。得られたプラスミドを用いてＸＦＬ−７を形質転換した。
Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯ断片なしにＥ７を分泌する組換え型菌株である。この菌株を形質転換するために用いられるプラスミドには、Ｅ７遺伝子に融合したｈｌｙプロモーターの遺伝子断片とシグナル配列とが含まれる。このコンストラクトは、元のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７は、染色体に組み込まれたコピー数１のＥ７遺伝子を発現した。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されるＥ７抗原の形態以外の点に関しては、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同質遺伝子的である。
クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン（brain heart infusion：ＢＨＩ）培地で組換え型菌株を増殖させた。細菌をアリコートに分けて−８０℃で凍結させた。
結果
ＰＥＳＴ様の配列への融合の抗原性に対する影響を調べるために、ＬＬＯ−ＰＥＳＴ様の配列をＥ７に融合させた。腫瘍退縮調査を、実施例１で述べたように、リステリア菌株発現ＬＬＯ−Ｅ７及びＥ７単独と並行して行った。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ５／８及び３／８の腫瘍退縮をもたらした（図１４）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、１／８のマウスにしか腫瘍退縮をもたらさなかった。ＰＥＳＴ含有コンストラクト（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７又はＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７）を用いて処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを用いて処置した腫瘍と間には、腫瘍サイズに関して統計的に有意な差が見られた（スチューデントｔ−検定）。
脾臓内のワクチンによって産出されたＥ７特異的リンパ球のレベルを比較するために、２１日目に脾臓を採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８及びＥ７／Ｄｂ四量体に対する抗体で染色した。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、脾臓において低レベルのＥ７四量体陽性の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導したが、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７及びＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、それぞれ５倍及び１５倍多い細胞を誘導した（図１５Ａ）。この結果は、３つの個別の実験を通して再現性を示した。したがって、ＰＥＳＴ様配列への融合により、四量体陽性の脾細胞の誘導が増加した。３つの実験から得られたデータの平均及び標準誤差（図１５Ｂ）は、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉを用いた処置よりもＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いた処置によって四量体陽性のＣＤ８＋細胞が有意に増加したことを示している（スチューデントｔ−検定によりＰ＜０．０５）。同様に、腫瘍浸潤性抗原特異ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７及びＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７でワクチン接種したマウスの法がより高かった。この結果は、３つの実験を通して再現性を示した（図１６Ａ〜Ｂ）。四量体陽性のＣＤ８＋ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）の平均値は、Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉよりもＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理したものの方が有意に高かった（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ−検定）。
このように、ＰＥＳＴ様配列は、抗原の免疫原性を増加させる。
実施例８：ＬＬＯへの抗原の融合による免疫原性の強化はリステリア菌ベクターを必要としない
材料及び実験方法
Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐの構築：
ワクシニアのＷＲ菌株をレシピエントとして用い、リステリア菌のプラスミドから融合遺伝子を切り離し、ｐＳＣｌ１のｐ７５プロモーターの制御下に挿入した。このベクターを選択した理由は、このベクターが、ワクシニア・コンストラクトであるＶａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐ及びＶａｃ−Ｅ７に対して用いられるトランスファーベクターであり、それ故にＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７との直接比較ができるためである。このような方法で、３つのワクシニア組換え体全てを同一の早期／後期複合プロモーターｐ７．５の制御下で発現させた。その上、ＳＣｌ１は、ＴＫ選択及びβガラクトシダーゼスクリーニングを基にした組換え型ウイルスプラークの選択を可能にする。図１７は、これらの実験に用いられる様々なワクシニア・コンストラクトを示す。Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐは、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）シグナル配列とＬＡＭＰ−１の細胞質尾部からの配列の間で融合されたＥ７タンパク質を発現した組換えワクシニアウイルスである。
ワクシニアによる遺伝子産物の発現を可能にするために次の改変を行った。すなわち、（ａ）ワクシニアによる初期転写を防止するＴ５ＸＴ配列をＰＣＲによってＬＬＯ−Ｅ７配列の５´部分から取り除き、（ｂ）ＳＣｌ１への最終的なＬＬＯ−Ｅ７の挿入を可能にするためにＰＣＲによってＸｍａｌ制限酵素認識部位を導入した。塩基配列決定法を用いて、これらの改変が、ＬＬＯ−Ｅ７をコードする配列が欠失することなく成功したことを実証した。得られたｐＳＣｌ１−Ｅ７コンストラクトを用いて、野生型ワクシニア菌株ＷＲを感染させたＴＫ−ｖｅ細胞株ＣＶ１を形質移入した。この感染／トランスフェクションステップから得られる細胞溶解物は、３回プラーク精製されたワクシニア組換え体を含む。プラーク精製されたワクシニアによるＬＬＯ−Ｅ７融合産物の発現を、ＬＬＯタンパク質配列に対する抗体を用いてウエスタンブロットにより確認した。ＬＬＯ及びＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を産出するＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７の能力を、それぞれＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスのＬＬＯ（９１−９９）エピトープ及びＥ７（４９−５７）エピトープを用いて判定した。結果をクロム遊離アッセイにおいて確認した。
結果
ＬＬＯへの抗原の融合による免疫原性の強化がリステリア菌ベクターを必要とするか否かを判定するために、Ｅ７を発現するワクシニアベクターを非溶血性の切断型のＬＬＯとの融合タンパク質として構築した。腫瘍拒絶の調査を、上記の例に記載のＴＣ−１を用いて行ったが、腫瘍が直径３ｍｍになったときに処置を開始した（図１８）。７６日目までに、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７処置マウスの５０％は腫瘍なしであったが、Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐマウスは２５％しか腫瘍なしでなかった。他の実験では、ＬＬＯ−抗原融合は、ＳＢＡＳ２または非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合されたＥ７ペプチドよりも免疫原性が高いことが、並列比較において示された。
これらの結果は、（ａ）ＬＬＯ−抗原融合は、リステリア菌との関連でのみならず他の関連でも免疫原性を有すること、（ｂ）ＬＬＯ−抗原融合の免疫原性は、有効であることが知られている他のワクチンアプローチに有利に匹敵することを示している。

Claims (73)

  1. 組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株であって、
    前記組換え型ポリペプチドが、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）タンパク質の断片を含むことを特徴とする組換え型リステリア株。
  2. 請求項１に記載の組換え型リステリア株であって、
    前記組換え型ポリペプチドが、非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドをさらに含み、
    前記非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドが、前記断片の免疫原性を高めることを特徴とする組換え型リステリア株。
  3. 請求項２に記載の組換え型リステリア株であって、
    前記非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドが、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、又はＰＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  4. 請求項１に記載の組換え型リステリア株であって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質が、ヒトＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  5. 請求項１に記載の組換え型リステリア株を含むワクチン。
  6. 請求項５に記載のワクチンであって、
    補助剤、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするワクチン。
  7. 請求項１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  8. 請求項１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、宿主動物を介して継代されたことを特徴とする組換え型リステリア株。
  9. 対象における抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）免疫応答を誘導する組成物の製造のための、請求項１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用。
  10. 対象における固形腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を引き出すようにしたことを特徴とする使用。
  11. 対象における固形腫瘍の発症を遅延させる組成物の製造のための、請求項１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を高め、それにより血管新生を阻害するようにしたことを特徴とする使用。
  12. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象におけるＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫機能を高めることを特徴とする使用。
  13. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現に関連する癌を治療する組成物の製造のための、請求項１に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象におけるＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  14. 組換え型ポリペプチドであって、
    リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、又はＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体から選択された非高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）オリゴペプチドに連結した高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）タンパク質の断片を含むことを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  15. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記組換え型ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド分子を翻訳するステップを含む方法により作成されたことを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  16. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含むポリペプチドを、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡアミノ酸配列を含むポリペプチドに化学的に結合させるステップを含む方法により作成されたことを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  17. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質が、ヒトＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質であることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  18. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片が、９８〜４３０アミノ酸長さであることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  19. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片が、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の３６０〜５５４、７０１〜１１３０及び２１６０〜２２５８のアミノ酸から成る群より選択されることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  20. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片の前記アミノ酸配列が、配列番号２１〜２３から選択されることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  21. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含むワクチン。
  22. 請求項２１に記載のワクチンであって、
    アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするワクチン。
  23. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株。
  24. 請求項２３に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  25. 請求項２３に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、宿主動物を介して継代されたことを特徴とする組換え型リステリア株。
  26. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドをエンコードする核酸配列を含むワクチン。
  27. 請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドをエンコードする配列と、少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含むことを特徴とする単離された核酸。
  28. 請求項２７に記載の核酸を含むワクチン。
  29. 請求項２８に記載のワクチンであって、
    アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするワクチン。
  30. 請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
  31. 請求項２７に記載の核酸分子を含む組換え型リステリア株。
  32. 請求項３１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  33. 請求項３１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、宿主動物を介して継代されたことを特徴とする組換え型リステリア株。
  34. 対象における抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）免疫応答を誘導する組成物の製造のための、請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用。
  35. 対象における抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）免疫応答を誘導する組成物の製造のための、請求項２３に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用。
  36. 対象における固形腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  37. 対象における固形腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項２３に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫機能を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  38. 対象における固形腫瘍の発症を遅延させる組成物の製造のための、請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫機能を高め、それにより血管新生を阻害するようにしたことを特徴とする使用。
  39. 対象における固形腫瘍の発症を遅延させる組成物の製造のための、請求項２３に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を高め、それにより血管新生を阻害するようにしたことを特徴とする使用。
  40. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  41. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項２３に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  42. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現に関連する癌を治療する組成物の製造のための、請求項１４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡを発現する腫瘍に対する免疫応答を向上させるようにしたことを特徴とする使用。
  43. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に関連する癌を治療する組成物の製造のための、請求項２３に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡを発現する腫瘍に対する免疫応答を向上させるようにしたことを特徴とする使用。
  44. 高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）の断片を含む組換え型ポリペプチドであって、
    前記断片が、前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の３６０〜５５４、７０１〜１１３０及び２１６０〜２２５８のアミノ酸から成る群より選択されることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  45. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片の前記アミノ酸配列が、配列番号２１〜２３から選択されることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  46. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドをさらに含み、
    前記非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドが、前記断片の免疫原性を高めることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  47. 請求項４６に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記非ＨＭＷ−ＭＡＡオリゴペプチドが、非溶血性のリステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチド若しくはその相同体、ＡｃｔＡオリゴペプチド若しくはその相同体、及びＰＥＳＴ様オリゴペプチド若しくはその相同体から成る群より選択されることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  48. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記組換え型ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド分子を翻訳するステップを含む方法により作成されたことを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  49. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質の断片を含むポリペプチドを、前記非ＨＭＷ−ＭＡＡアミノ酸配列を含むポリペプチドに化学的に結合させるステップを含む方法により作成されたことを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  50. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドであって、
    前記ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質が、ヒトＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質であることを特徴とする組換え型ポリペプチド。
  51. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含むワクチン。
  52. 請求項５１に記載のワクチンであって、
    アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするワクチン。
  53. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドをエンコードする核酸配列を含むベクター。
  54. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組換え型リステリア株。
  55. 請求項５４に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  56. 請求項５４に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、宿主動物を介して継代されたことを特徴とする組換え型リステリア株。
  57. 請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドをエンコードする核酸配列と、少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含むことを特徴とする単離された核酸。
  58. 請求項５７に記載の核酸分子を含むワクチン。
  59. 請求項５８に記載のワクチンであって、
    アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とするワクチン。
  60. 請求項５７に記載の核酸分子を含むベクター。
  61. 請求項５７に記載の核酸分子を含む組換え型リステリア株。
  62. 請求項６１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、組換え型リステリア・モノサイトゲネス株であることを特徴とする組換え型リステリア株。
  63. 請求項６１に記載の組換え型リステリア株であって、
    当該組換え型リステリア株が、宿主動物を介して継代されたことを特徴とする組換え型リステリア株。
  64. 対象における抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）免疫応答を誘導する組成物の製造のための、請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用。
  65. 対象における抗高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）免疫応答を誘導する組成物の製造のための、請求項５４に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用。
  66. 対象における固形腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を引き出すようにしたことを特徴とする使用。
  67. 対象における固形腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項５４に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫応答を引き出すようにしたことを特徴とする使用。
  68. 対象における固形腫瘍の発症を遅延させる組成物の製造のための、請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫機能を高め、それにより血管新生を阻害するようにしたことを特徴とする使用。
  69. 対象における固形腫瘍の発症を遅延させる組成物の製造のための、請求項５４に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記固形腫瘍の血管系の周皮細胞に対する免疫機能を高め、それにより血管新生を阻害するようにしたことを特徴とする使用。
  70. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  71. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現腫瘍の進行を遅延させる組成物の製造のための、請求項５４に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡ発現腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  72. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現に関連する癌を治療する組成物の製造のための、請求項４４に記載の組換え型ポリペプチドを含む組成物の使用であって、
    対象における前記ＨＭＷ−ＭＡＡを発現する腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
  73. 対象における高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）発現に関連する癌を治療する組成物の製造のための、請求項５４に記載の組換え型リステリア株を含む組成物の使用であって、
    対象におけるＨＭＷ−ＭＡＡを発現する腫瘍に対する免疫応答を高めるようにしたことを特徴とする使用。
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