CN111334521B

CN111334521B - 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

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Publication number: CN111334521B
Application number: CN201811549430.3A
Authority: CN
Inventors: 关剑; 薛亚东; 代楠; 赵勇刚
Original assignee: Suzhou Royaltech Med Co ltd; Shanghai Ruotai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Royaltech Med Co ltd; Shanghai Ruotai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN111334521A

Abstract

本公开涉及一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法。具体来说，本公开的方法包括将重组核酸分子插入质粒或表达载体中从而构建重组质粒或重组表达载体的步骤。本公开的方法进一步包括将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中的步骤。本公开的方法既可提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达，又能促进或维持非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的功效，进一步提高非整合减毒李斯特菌疫苗在临床应用中的价值。

Description

一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

技术领域

本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种提高菌株的蛋白质表达的方法。更具体来说，本公开提供一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种常见食源性肠道病原菌，类属革兰氏阳性、短杆状、无芽孢、兼性厌氧胞内寄生菌[1]。单增李斯特菌可通过直接或内化作用被抗原提呈细胞吞噬，引起产生MHCⅡ途径介导的CD4+T细胞免疫反应和MHCI途径介导的CD8+T细胞免疫反应[2]。此外，单增李斯特菌亦可借助自身内化素蛋白(InlA)和粘附蛋白(LAP)与宿主上皮细胞相互作用，使其进入血液循环系统而引起产生细胞免疫反应[3]。

基于单增李斯特菌特有的免疫和繁殖特性，利用减毒LM菌株为载体，将人乳头瘤病毒HPV16E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、黑色素瘤相关抗原HMW-MAA、前列腺特异抗原PSA、间皮素(mesothelin)、抑癌蛋白P53等不同特异性病毒抗原或肿瘤抗原为目的的特异性核酸片段插入李斯特菌中，制备李斯特菌疫苗，促使李斯特菌能在宿主细胞内表达特异性抗原蛋白，通过MCHI和MCHⅡ途径，特异性激活CD4+和CD8+T细胞免疫反应，可以达到治疗肿瘤的作用。当前，国际社会以人乳头瘤病毒HPV16E7为代表的部分李斯特菌疫苗已进入临床试验阶段。

将李斯特菌更安全性的应用于临床，一般需以减毒的李斯特菌作为基础载体。整合性构建的李斯特菌疫苗，构建周期长，整合筛选流程复杂繁琐，构建成本较高。由于非整合李斯特菌可通过构建表达质粒以表达目的抗原蛋白，在李斯特菌疫苗构建方式中，其具有周期短、流程简单快捷、筛选方便、临床应用安全性高和成本低等特点，是一种独特的疫苗构建方式。但在非整合疫苗构建过程中，仍会存在目的抗原蛋白表达水平低甚至不表达，以及表达抗原蛋白性质不稳定、功效应用价值低等缺点[4]，所以急需探索一种新方法以提高非整合李斯特菌目的抗原蛋白的表达而生物活性不受抑制。

为增强非整合细菌抗原蛋白的表达，通常会在表达融合蛋白中设计和添加一组蛋白连接肽(Linker)，以促进或维持抗原蛋白的表达和生物活性[5]。但是，蛋白连接肽的成分和组成会影响目的抗原蛋白的表达甚至生物活性，一般选择Ala、Gly、Thr或Ser为成分的低疏水性和低电荷效应的柔性蛋白作为蛋白连接肽的基本成分，以期增强目的抗原蛋白的表达而生物活性不会受到抑制[6]。

由于现有方案中仍然存在以上问题，因此，需要提供一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法，进而解决目的抗原蛋白表达水平低甚至不表达、以及表达蛋白抗原性质不稳定、生物活性差等问题。

现有技术文献

[1]Laurel L.Lenz,William A.Huang,Chenghui Zhou,et al.Stableintegration vector for nutrient broth-based selection of attenuated Listeriamonocytogenes strains with recombinant antigen expression[J].Clinical andVaccine Immunology,2008,15(9):1414-1419.

[2]Anu Wallecha,Kyla D.Carroll,Paulo C.Maciag,et al.Multiple EffectorMechanisms Induced by Recombinant Listeria monocytogenes AnticancerImmunotherapeutics[J].Advances in Applied Microbiology,2009,66:1-27.

[3]Rishi Drolia,Shivendra Tenguria,Abigail C.Durkes,et al.ListeriaAdhesion Protein Induces Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction forBacterial Translocation.Cell Host&Microbe,2018,23(14):470-484.

[4]Jianhua Zhang,Jun Yun,Zhigang Shang,et al.Design and optimizationof a linker for fusion protein construction.Progress in Natural Science,2009(19):1197-1200.

[5]Fang Min,Jiang Xin,Yang Zhi,et al.Effects of interlinker sequenceson the biological properties of bispecific single-chain antibodies[J].ChinSci Bull,2003,48(21):2277-2283.

[6]李剑芳,王春娟,邬敏辰.连接肽的设计及在融合蛋白中的应用[J].食品与生物技术学报,2015,34(11):1121-1127.

发明内容

发明要解决的问题

基于现有技术中存在的缺陷，本公开在非整合减毒李斯特菌中设计低疏水性和低电荷效应的柔性蛋白连接肽，探索蛋白连接肽最佳组合，既可提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达，又能促进或维持非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的功效，进一步提高非整合减毒李斯特菌疫苗在临床应用中价值。

用于解决问题的方案

本公开涉及的技术方案如下。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1)将重组核酸分子插入质粒或表达载体中，构建重组质粒或重组表达载体；

(2)利用所述重组质粒或重组表达载体表达所述外源抗原蛋白；

其中，所述重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原和蛋白连接肽，所述重组的核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:2所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其进一步包括以下步骤：

将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：2所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:4所示的多肽。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述蛋白连接肽连接至所述异源性抗原；可选的，所述异源性抗原的两端均连接有蛋白连接肽。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述蛋白连接肽由基本柔性单元组成，所述蛋白连接肽中所述基本柔性单元的数量为1个以上，优选地，所述基本柔性单元的数量为1、2、3、4或5个，更优选地，所述基本柔性单元的数量为2个。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中，所述基本柔性单元由Gly和Ser组成，优选地，所述基本柔性单元为GGGGS。

在一个技术方案中，本公开提供一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其中所述第一启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。

在一个技术方案中，本公开提供根据上述表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法得到的外源抗原蛋白。

在一个技术方案中，本公开提供上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物在制备用于杀死细胞的药物中的应用；优选的，所述细胞选自肿瘤细胞；更优选的，所述肿瘤细胞选自癌细胞。

在一个技术方案中，本公开提供上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物在制备用于治疗或预防肿瘤患者的药物中的应用。

在一个技术方案中，本公开提供—种缓慢持续杀伤细胞的方法，包括将所述细胞与上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物接触。

在一个技术方案中，本公开提供—种缓慢持续杀伤细胞的方法，其中，优选的，所述细胞选自肿瘤细胞；更优选的，所述肿瘤细胞选自癌细胞。

在一个技术方案中，本公开提供—种缓慢持续杀伤细胞的方法，其中将上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物施用至患者体内。

在一个技术方案中，本公开提供—种缓慢持续杀伤细胞的方法，其中，上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；可选的，所述系统性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。

在一个技术方案中，本公开提供—种缓慢持续杀伤细胞的方法，所述方法进一步包括施用第二抗癌疗法；优选的，所述第二种抗癌疗法可以是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或上述疗法的一种或多种的组合。

在一个技术方案中，本公开提供一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包含对受试者施用上述外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物。

发明的效果

在一个技术方案中，本公开将抗原目的基因插入到pAM401质粒上，通过瞬时电转染非整合至减毒李斯特菌，整个制备过程简单快捷、周期短、筛选方便、成本低等，并且外源抗原蛋白在正常培养条件下即可表达分泌。

在一个技术方案中，本公开设计和筛选出最佳蛋白连接肽，既可提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达，又能维持或促进非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的免疫功效，提高非整合减毒李斯特菌疫苗在临床应用中的价值。

在一个技术方案中，本公开采用的技术方案中不同长度的(G4S)n蛋白连接肽对非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达存在显著性影响。1个长度、2个长度、3个长度和4个长度的(G4S)n蛋白连接肽可促进外源抗原蛋白的表达，并呈现先递增后递减的趋势，其中，2个长度的(G4S)₂蛋白连接肽促进表达作用最强，可提高外源抗原蛋白表达量的7.38倍。

附图说明

图1所示的是PAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆质粒线性结构示意图。

图2所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种分子鉴定结果。其中，采用pAM-LLO-F/R特异引物，分子鉴定LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原多肽核苷酸序列，理论目的外源抗原多肽核苷酸序列大小(bp)：核苷酸序列(G4S)0-OVA28:132bp，核苷酸序列(G4S)1-OVA28:162bp，核苷酸序列(G4S)2-OVA28:192bp，核苷酸序列(G4S)3-OVA28:222bp，核苷酸序列(G4S)4-OVA28:252bp，核苷酸序列(G4S)5-OVA28:282bp。

图3所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28菌落总数。其中，p>0.05，不存在显著差异，单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey’s post-hoc Test事后检测。

图4所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝0、1、2)外源抗原蛋白表达蛋白质印记(Western Blot)结果。

图5所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝0、3、4)外源抗原蛋白表达蛋白质印记结果。

图6所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝0、5)外源抗原蛋白表达蛋白质印记结果

图7所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白相对表达量。其中，当与对照LM-LLO-OVA28比较时，*p<0.05，**0.05<p<0.01，***p<0.001；单因素方差分析和Tukey’spost-hoc Test事后检测。

图8所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白实际相对表达量。其中，当与对照LM-LLO-OVA28比较时，***p<0.001；当与对照LM-LLO-(G4S)2-OVA28比较时，**0.05<p<0.01,***p<0.001；单因素方差分析和Tukey’s post-hoc Test事后检测。

图9所示的是在正常小鼠中的LM-LLO-(G4S)n-OVA28Elispot免疫功效检测。其中，OT-1显示OVA转基因C57BL/6小鼠，为阳性对照；LLO显示构建的非整合减毒李斯特菌空载疫苗LM-pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆，为阴性对照。

图10所示的是在荷瘤小鼠中的LM-LLO-(G4S)n-OVA28Elispot免疫功效检测。其中，OT-1显示OVA转基因C57BL/6小鼠，为阳性对照；LLO显示构建的非整合减毒李斯特菌空载疫苗LM-pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆，为阴性对照。

图11所示的是在荷瘤小鼠，LM-LLO-(G4S)n-OVA28Elispot特异性T细胞抗原反应斑点计数。

图12所示的是LM-LLO-(G4S)n-OVA28免疫治疗，荷瘤小鼠肿瘤生长曲线。其中，LM-LLO显示构建的非整合减毒李斯特菌空载疫苗LM-pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆，为阴性对照。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

本公开中的术语“蛋白连接肽(linker)”是指构建融合蛋白中用于将蛋白质相连接的肽片段，例如，蛋白连接肽可用于连接融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，进一步地，蛋白连接肽可以连接在融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原的两端。蛋白连接肽的长度不作限制。例如，蛋白连接肽的长度可以为5的倍数，例如，蛋白连接肽可为5、10、15、20、25个氨基酸长度的蛋白连接肽。

本公开中的术语“基本柔性单元”是指蛋白连接肽的基本成分，例如柔性蛋白，进一步地，例如低疏水性和低电荷效应的柔性蛋白。所述柔性蛋白可以由天然或合成氨基酸残基组成，其成分的实例包括但不限于Ala、Gly、Thr或Ser。

当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。

本公开中的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。

本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。

本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的疫苗给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。

本公开中的术语“OVA”是指鸡卵白蛋白(Ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kD。

本公开中的术语“Phly”是编码LLO(溶菌素，Listeriolysion O)基因的启动子。

本公开中的术语“疫苗”是将病原微生物(如细菌等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防疾病的免疫制剂。

在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的菌株和/或巨噬细胞或含者有其的药物组合物(以下也称为“本发明的药物组合物”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。

在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本发明的药物组合物等，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。

本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。

本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。

本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。

本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

本公开中的术语“骨髓诱导巨噬细胞”，也被称为“骨髓来源的巨噬细胞”(BoneMarrow-derived Macrophage，BMDM)，是骨髓细胞在特定生长因子的刺激及诱导下得到的原代细胞。

本公开中的术语“Elispot”，全名为酶联免疫斑点检测(Enzyme-linkedImmunospot Assay)，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。其能够在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。

本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。

技术方案

在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：

SEQ ID NO:1所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO₅₂₉)

SEQ ID NO:2所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO₅₂₉)

SEQ ID NO:3所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO₅₄₀)

SEQ ID NO:4所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO₅₄₀)

SEQ ID NO:5所示的是OVA₂₈的未优化的核苷酸序列

SEQ ID NO:6所示的是OVA₂₈优化后的核苷酸序列

SEQ ID NO:7所示的是OVA₂₈优化后的氨基酸序列

SEQ ID NO:8所示的是5’端同源核苷酸序列

SEQ ID NO:9所示的是3’端同源核苷酸序列

SEQ ID NO:10所示的是OVA₂₈和蛋白连接肽((G4S)n，n＝1)相连的氨基酸序列

SEQ ID NO:11所示的是OVA₂₈和蛋白连接肽((G4S)n，n＝2)相连的氨基酸序列

SEQ ID NO:12所示的是OVA₂₈和蛋白连接肽((G4S)n，n＝3)相连的氨基酸序列

SEQ ID NO:13所示的是OVA₂₈和蛋白连接肽((G4S)n，n＝4)相连的氨基酸序列

SEQ ID NO:14所示的是OVA₂₈和蛋白连接肽((G4S)n，n＝5)相连的氨基酸序列

在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽和如SEQID NO:2所示的氨基酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(包括这些数值之间所有范围和百分数)的氨基酸同一性的李斯特菌溶血素(LLO)多肽。上述李斯特菌溶血素(LLO)多肽具有特定百分数的同一性指的是，李斯特菌溶血素(LLO)多肽存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变。

在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:4所示的多肽。

在本公开的一个实施方案中，所述蛋白连接肽连接至所述异源性抗原；可选的，所述异源性抗原的两端均连接有蛋白连接肽。所述蛋白连接肽由基本柔性单元组成，蛋白连接肽中基本柔性单元的数量为1个以上，优选地，基本柔性单元的数量为1、2、3、4或5个，更优选地，所述基本柔性单元的数量为2个。在本公开的一个实施方案中，基本柔性单元由Gly和Ser组成，优选地，基本柔性单元为GGGGS(简写为(G4S)n，其中n为0以上的整数)。

在本公开的一个实施方案中，本公开采用的技术方案中不同长度的(G4S)n蛋白连接肽对非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达存在显著性影响。1个长度、2个长度、3个长度和4个长度的(G4S)n蛋白连接肽可促进外源抗原蛋白的表达，并呈现先递增后递减的趋势，其中，2个长度的(G4S)₂蛋白连接肽促进表达作用最强，可提高外源抗原蛋白表达量的7.38倍。

在本公开的一个实施方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括用适于诱导针对目标癌细胞的免疫反应的异源性抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。在一个实施例中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetalantigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA 125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testes antigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPV E6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本公开的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。在另一个实施例中，所述异源性抗原选自非肿瘤抗原。例如，非肿瘤抗原选自OVA。

可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。

用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。

本公开的方法可进一步包括施用第二种抗癌疗法，例如第二种治疗病毒。在其他方面，第二种抗癌疗法为化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂、手术等。

另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。

另一方面，本发明的药物组合物除了含有本发明的菌株和/或巨噬细胞以外，还可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指：适合于针对免疫疾病的药物组合物的任意载体(脂质体、脂质囊泡、胶束等)、稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、储存剂、表面活性剂、着色剂、着香剂或甜味剂。

本发明的药物组合物等可以采取注射剂、冷冻干燥品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆剂、栓剂、巴布剂、软膏剂、霜剂、滴眼剂等剂型。注射剂等液体制剂可以是在使用前用生理盐水等进行溶解的使用时制备用粉末(例如冷冻干燥粉末)的方式。

本公开的另一个实施方案涉及杀死增生性细胞的方法，该方法包括将该细胞与本公开所述的分离的疫苗组合物接触。

本公开的另一个实施方案涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本公开所述的疫苗组合物。

在本公开的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。施用可为口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔或经直肠施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等施用方式。

本公开的一个实施方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。

本公开的另一个实施方案，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:2所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。可选的，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ IDNO:2所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529位氨基酸位点之前。在一个实施例中，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:2所示的李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第523位和第524位氨基酸之间。

本公开的另一个实施方案中，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:4所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。在一个实施例中，本公开的编码异源性抗原的氨基酸序列可以替换如SEQ ID NO:4所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第533位至第534位氨基酸序列。

本公开的另一个实施方案中，异源性抗原为鸡卵白蛋白(OVA)。在一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为2-40个氨基酸；在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为5-35个氨基酸；在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为8-28个氨基酸。在一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA_248-275(即本公开中的OVA₂₈)，在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA_258-265。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

除非有明确的具体相反表述，否则本公开的所有实施例涉及的技术方案中，OVA的插入位点均位于相对于如SEQ ID NO:2所示的野生型LLO多肽的氨基酸序列的第523位和第524位氨基酸之间。

除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。

本公开采用的主要试剂如下：Ezmax One-Step Cloning kit(吐露港生物公司，上海)，Q5保真酶(NEB，美国)，PstI-HF限制性内切酶(NEB,美国)，Mouse IFN-γELISPOT Set(551083,BD,美国)。

实施例1：外源抗原多肽质粒的构建和保藏

如图1，采用能在李斯特菌中稳定复制和表达的pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆质粒，该质粒存在一个PstI酶切位点，可将外源抗原基因插入该质粒序列，并在Phly启动子作用下，启动LLO基因的转录翻译，在LLO信号肽(LLO_1-28)的协助引导下，将包含目的抗原多肽的融合蛋白分泌到胞外。

示例性的，本公开构建质粒pAM401-Phly-LLO_1-28-BamHI-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆的方法如下：在质粒pAM401-Phly-LLO_1-28-BamHI基础上，以BamHI为酶切位点，将基因合成的BamHI-LLO_22-529-His₆-BamHI序列通过酶切酶连反应构建在该载体上，得到pAM401-Phly-LLO_1-28-BamHI-LLO_22-529-His₆-BamHI，为添加外源基因插入位点，选择在LLO_523-524位置设计上下游引物，通过PCR反应，在LLO₅₂₃和LLO₅₂₄之间插入PstI酶切位点。

使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pAM401-phly-LLO_1-28-BamHI-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆载体(简称PstI载体质粒)上的PstI位点，其同源序列为：5’端同源序列(CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:11)；3’端同源序列(CTGCAGGTAGATAATCCAATCGAA，SEQ ID NO:12)

主要步骤如下：

PstI载体质粒20μl PstI单酶切体系：

PstI质粒	2μg
		PstI限制性内切酶	2μl
10x NEB缓冲液3.1	2μl
		去离子水	补齐至20μl

37℃水浴锅，反应10min。

将酶切产物进行DNA回收纯化，即酶切线性化PstI载体

由以下(1)-(5)组份，得到同源重组20μl体系：

(1)酶切线性化的PstI载体

(2)外源PCR片段，两端含同源序列

(3)5x缓冲液：4μl

(4)反应酶：2μl

(5)ddH₂O：补齐至20μl

37℃水浴30分钟后转化E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。

选择以Gly和Ser为最基本的组成成分，设计低疏水性和低电荷效应的基本柔性单元(GGGGS)(简写为G4S)，将不同长度的柔性单元(G4S)n连接到LLO_22-523与外源抗原肽(OVA28)及外源抗原肽(OVA28)与LLO_524-529间。

将携带不同长度蛋白连接肽(G4S)n-OVA28-(G4S)n的抗原多肽(简写：(G4S)n-OVA28)，如表1所示，将多肽序列优化后化学合成目的基因。然后采用PstI-HF限制性内切酶将质粒PstI位点单酶切，通过Ezmax One-Step Cloningkit(吐露港生物公司，上海)将优化后的目的基因片段插入到pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-PstI-LLO_524-529-His₆质粒中，构建携带外源抗原多肽(OVA28)的pAM401-Phly-LLO_1-28-LLO_22-523-(G4S)n-OVA28-(G4S)n-LLO_524-529-His₆质粒(简写：pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28)。

表1

通过热击法将构建好的pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28质粒转染至大肠杆菌，甘油-80℃长期保菌。

实施例2：非整合性构建携带外源抗原多肽质粒的减毒李斯特疫苗菌种

采用LM 10403SΔact减毒李斯特菌(前述菌株的构建方法可以示例性的参考下述文献：Shen H et.al.，PNAS，92(9):3987-91，1995)作为基本构建菌株，将构建好的pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28质粒抽提和测序比对。将构建正确的质粒，采用改良的瞬时电转染技术转染至LM 10403SΔact，然后涂布于氯霉素(CmR)抗性BHI固体培养基，37℃倒置培养，制备非整合减毒LM-pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种(简称：LM-LLO-(G4S)n-OVA28)。

实施例3：非整合减毒李斯特菌疫苗的分子鉴定和菌落计数

在制备的非整合减毒LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种固体培养基上，随机挑选五个完整单菌落至CmR抗性BHI液体培养基，37℃培养19h。

为进步鉴定和验证非整合减毒李斯特菌疫苗的正确性，取1μl菌液，采用Q5保真酶(NEB,美国)和特异性引物pAM-LLO(F:CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG(SEQ ID NO:8),R:TTCGATTGGATTATCTA CCTGCAG(SEQ ID NO:9)分子鉴定。

在10ml摇菌管中抽取100μl菌液，梯度逐步稀释和涂布至CmR抗性BHI固体培养基中，倒置培养，待菌落长出后计菌落总数(CFU)。

实施例4：非整合减毒李斯特菌疫苗外源蛋白的表达和检测

由于构建的非整合减毒LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗，自身存在Phly强启动子和LLO信号肽，外源蛋白的表达和分泌不需特殊诱导手段，仅37℃正常培养即可将外源蛋白分泌到BHI液体培养基，且分泌的外源蛋白性质稳定。

低温条件下，将上述菌液5000rpm/15min，取上清加蛋白浓缩液，-20℃过夜，然后4℃离心15000rpm/30min，预冷丙酮洗涤3次，通风橱干燥。干燥蛋白加SDS-PAGE上样缓冲液(SDS-PAGE Loading Buffer)溶解，沸水浴5-10min，冷却室温，采用HRP标记的Anti-His抗体进行蛋白质印记分析，检测蛋白表达量。

实施例5：非整合减毒李斯特菌疫苗免疫功效检测

将上述离心沉淀的非整合减毒李斯特菌疫苗，用预冷PBS洗涤2次，用含PBS重悬，分装，-80℃保藏。

将1×10⁶CFU LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝0、1、2、3、4、5)疫苗尾静脉注射至正常C57小鼠，疫苗注射第7d取外周血和制备外周血单个核细胞(PBMC)，进行Elispot，体外单细胞水平检测(G4S)n蛋白连接肽对外源抗原肽功效的影响。

为进一步检测(G4S)n蛋白连接肽对外源抗原肽功效的影响，建立EG7-OVA/C57小鼠肿瘤模型，将1×10⁷CFU LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝0、1、2、3、4、5)疫苗尾静脉注射至荷瘤小鼠，疫苗注射第21d取外周血和制备PBMC，进行Elispot,并定期测定荷瘤小鼠肿瘤大小。通过体外Elispot和肿瘤抑制生长情况综合评价(G4S)n蛋白连接肽对外源抗原肽功效的影响。

实施例6：LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种分子鉴定

结合LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种分子鉴定结果(图2)，为验证构建的非整合减毒李斯特菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种核酸序列的正确性，对疫苗菌种进行分子鉴定。

具体过程：根据Q5保真酶(NEB，美国)试剂说明，采用特异性引物pAM-LLO-F/R，进行疫苗菌种目的核苷酸序列PCR，然后1％琼脂糖凝胶电泳。

实验结果显示，通过非整合方式构建的减毒李斯特菌疫苗菌种LM-LLO-(G4S)n-OVA28，其目的扩增核苷酸序列与理论目的核酸序列大小相同，构建了核酸序列正确的非整合减毒李斯特菌LM-pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种。

实施例7：LM-LLO-(G4S)n-OVA28液体培养和菌落计数

结合LM-LLO-(G4S)n-OVA28菌落总数(图3)，由于构建的非整合减毒李斯特菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28，其质粒自身存在强启动子和信号肽，在普通条件下，活菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28即可分泌抗原蛋白至液体培养基中。

相对准确的定量液体培养基中的LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白的表达量，首先需要对BHI液体培养基中活菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28数量进行定量。

具体过程：在LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗菌种固体培养基上，每种疫苗随机挑取五个完整单菌落至10ml CmR抗性BHI液体培养基，220rpm 37℃培养19h。分子鉴定正确后，在每10ml摇菌管中抽取100μl菌液，10倍梯度逐步稀释和涂布至CmR抗性BHI固体培养基中，37℃倒置培养，待菌落长出后计菌落总数(CFU)。在p＝0.05置信水平，采用Orgin8.0对LM-LLO-(G4S)n-OVA28每种疫苗不同CFU进行单因素方差分析和Tukey’spost-hoc Test事后检测(one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc Test at p＝0.05)。

实验结果显示，完整的单菌落在10ml BHI液体培养基中培养19h，菌落总数约为10¹¹CFU，通过在置信水平p＝0.05的单因素方差分析和Tukey’spost-hoc Test事后检测，发现各组间LM-LLO-(G4S)n-OVA28菌落总数不存在显著性差异。

实施例8：LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白的表达和定量检测

结合图4、图5、图6和图7，由于构建的非整合减毒李斯特菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28自身存在强启动子和信号肽，在37℃普通条件下，活菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28即可分泌抗原蛋白至BHI液体培养基中。

具体过程：将菌落计数后的菌液5000rpm/15min，取上清8mL加3倍体积蛋白浓缩，-20℃过夜处理，4℃离心15000rpm/30min，预冷丙酮洗涤3次，通风橱干燥处理，SDS-PAGE上样缓冲液溶解制备成Western蛋白样品。采用HRP标记Anti-His抗体和按照Western步骤方法，进行蛋白质印记分析。

Western结果采用Image Lab进行定量分析，以LM-LLO-OVA28表达分泌的外源抗原蛋白为定量标准，进行LM-LLO-(G4S)n-OVA28(n＝1、2、3、4、5)表达外源抗原蛋白的归一化定量处理。

实验结果显示，不同长度的(G4S)n蛋白连接肽对非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达存在影响。通过单因素方差分析和Tukey’s post-hoc Test事后检测，发现没有(G4S)n蛋白连接肽的外源蛋白表达量与1个长度(G4S)n蛋白连接肽、2个长度(G4S)n蛋白连接肽和3个长度(G4S)n蛋白连接肽存在不同置信水平的显著性差异，并有促进外源抗原蛋白表达的作用。

另外，结合实施例7(图3)，根据LM-LLO-(G4S)n-OVA28菌落总数和LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗外源抗原蛋白表达量，可推测分析出单位数量活菌LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗实际外源抗原蛋白表达量，如图8所示。在图8中，分别以LM-LLO-OVA28和LM-LLO-(G4S)2-OVA28为比对标准，进行不同置信水平单因素方差分析和Tukey’s post-hoc Test事后检测，结果发现不同长度(G4S)n蛋白连接肽对非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达存在显著性影响。1个长度、2个长度、3个长度和4个长度的(G4S)n蛋白连接肽可促进外源抗原蛋白的表达，并呈现先递增后递减的趋势，其中，2个长度的(G4S)₂蛋白连接肽促进表达作用最强，可提高外源抗原蛋白表达量的7.38倍。

实施例9：在正常小鼠中，LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗免疫功效检测

不同长度(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白表达影响不同。结合图9，同剂量的LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗尾静脉注射正常小鼠，进行Elispot，探究不同长度(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28免疫功效的影响。

具体过程：将制备好的LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗，按照1×10⁶CFU剂量尾静脉注射正常小鼠(八周龄，雌性，C57BL/6)，每组三只，其中取2只小鼠尾静脉注射1×10⁶CFU LM-LLO为阴性对照。尾静脉注射第7d，每只小鼠尾静脉采血3滴和制备成PBMC，按照Mouse IFN-γELISPOT Set(551083,BD,美国)操作说明，在单细胞水平上检测抗原特异性T细胞反应。

尾静脉注射同剂量LM-LLO-(G4S)n-OVA28活菌疫苗，Elispot实验结果显示，在正常小鼠中，虽每组LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗均可激活机体产生特异性抗原免疫反应，但不同长度(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白功效影响不同，1个长度(G4S)n蛋白连接肽、2个长度(G4S)n蛋白连接肽和3个长度(G4S)n蛋白连接肽可促进LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白的免疫功效，但2长度(G4S)n蛋白连接肽促进LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白功效最强，Elispot反应最强烈。

实施例10：在荷瘤小鼠中，LM-pAM401-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗免疫功效检测

在正常小鼠中，体外Elispot药效实验结果表明，不同长度(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白功效影响不同。为进一步验证在荷瘤小鼠中，(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白功效的影响，建立EG7-OVA/C57小鼠肿瘤模型，探究在荷瘤小鼠中，(G4S)n蛋白连接肽对LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白免疫功效的影响。

结合图10、图11和图12，不同长度(G4S)n蛋白连接肽影响LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗免疫功效，但在1×10⁷CFU剂量水平上，不同LM-LLO-(G4S)n-OVA28仍具有消除肿瘤的作用。Elispot免疫药效检测显示，其中(G4S)2蛋白连接肽能明显促进LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白的药效活性。

具体过程：EG7-OVA细胞培养，在正常小鼠(八周龄，雌性，C57BL/6)皮下接种EG7-OVA细胞，建立EG7-OVA/C57小鼠肿瘤模型。待肿瘤长到一定大小后，将制备好的LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗，按照1×10⁷CFU剂量尾静脉注射至荷瘤小鼠，每组三只，共7组，其中一组荷瘤小鼠尾静脉注射1×10⁷CFU LM-LLO为阴性对照。免疫注射第21d，小鼠尾静脉采血3滴和制备成PBMC，按照Mouse IFN-γELISPOT Set(551083,BD,美国)操作说明，单细胞水平上检测抗原特异性T细胞反应，并定期测定每组荷瘤小鼠肿瘤生长情况。

在荷瘤小鼠中，尾静脉注射同剂量LM-LLO-(G4S)n-OVA28活菌疫苗，免疫治疗第21d，Elispot结果显示，不同LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗在荷瘤小鼠产生强烈的特异性抗原免疫反应，其中LM-LLO-(G4S)2-OVA28免疫反应最为强烈，即2个长度(G4S)蛋白连接肽能明显促进LM-LLO-(G4S)n-OVA28外源抗原蛋白药效活性。

从小鼠肿瘤模型建立到荷瘤小鼠肿瘤消除，进行了为期20天的肿瘤生长曲线测定，测定结果显示，不同长度(G4S)n构建的LM-LLO-(G4S)n-OVA28疫苗都具有消除肿瘤的作用。如前所述，经Elispot检测显示，LM-LLO-(G4S)2-OVA28的特异性免疫反应最为强烈，提示其潜在的更强免疫效果。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 上海若泰医药科技有限公司

苏州若泰医药科技有限公司

<120> 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1587

<212> DNA

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 1

atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60

caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120

ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180

atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240

gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300

gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360

atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420

caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480

atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540

gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600

agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660

tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720

gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780

aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840

gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900

caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960

gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020

tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080

ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140

ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200

aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260

atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320

gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag 1380

ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg cctggtaacg cgagaaatat taatgtttac 1440

gctaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500

ttaccacttg tgaaaaatag aaatatctcc atctggggca ccacgcttta tccgaaatat 1560

agtaataaag tagataatcc aatcgaa 1587

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 2

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys

20 25 30

Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser

35 40 45

Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr

50 55 60

Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly

65 70 75 80

Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn

85 90 95

Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn

100 105 110

Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly

115 120 125

Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val

130 135 140

Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly

145 150 155 160

Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser

165 170 175

Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys

180 185 190

Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp

195 200 205

Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala

210 215 220

Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser

225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr

245 250 255

Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys

260 265 270

Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn

275 280 285

Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu

290 295 300

Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp

305 310 315 320

Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn

325 330 335

Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala

340 345 350

Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp

355 360 365

Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro

370 375 380

Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile

385 390 395 400

Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp

405 410 415

Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn

420 425 430

Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val

435 440 445

Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe

450 455 460

Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr

465 470 475 480

Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile

485 490 495

Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp

500 505 510

Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile

515 520 525

Glu

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 3

atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60

caaactgaag caaaggatgc atcggatcct actgaagcaa aggatgcatc tgcattcaat 120

aaagaaaatt caatttcatc catggcacca ccagcatctc cgcctgcaag tcctaagacg 180

ccaatcgaaa agaaacacgc ggatgaaatc gataagtata tacaaggatt ggattacaat 240

aaaaacaatg tattagtata ccacggagat gcagtgacaa atgtgccgcc aagaaaaggt 300

tacaaagatg gaaatgaata tattgttgtg gagaaaaaga agaaatccat caatcaaaat 360

aatgcagaca ttcaagttgt gaatgcaatt tcgagcctaa cctatccagg tgctctcgta 420

aaagcgaatt cggaattagt agaaaatcaa ccagatgttc tccctgtaaa acgtgattca 480

ttaacactca gcattgattt gccaggtatg actaatcaag acaataaaat cgttgtaaaa 540

aatgccacta aatcaaacgt taacaacgca gtaaatacat tagtggaaag atggaatgaa 600

aaatatgctc aagcttatcc aaatgtaagt gcaaaaattg attatgatga cgaaatggct 660

tacagtgaat cacaattaat tgcgaaattt ggtacagcat ttaaagctgt aaataatagc 720

ttgaatgtaa acttcggcgc aatcagtgaa gggaaaatgc aagaagaagt cattagtttt 780

aaacaaattt actataacgt gaatgttaat gaacctacaa gaccttccag atttttcggc 840

aaagctgtta ctaaagagca gttgcaagcg cttggagtga atgcagaaaa tcctcctgca 900

tatatctcaa gtgtggcgta tggccgtcaa gtttatttga aattatcaac taattcccat 960

agtactaaag taaaagctgc ttttgatgct gccgtaagcg gaaaatctgt ctcaggtgat 1020

gtagaactaa caaatatcat caaaaattct tccttcaaag ccgtaattta cggaggttcc 1080

gcaaaagatg aagttcaaat catcgacggc aacctcggag acttacgcga tattttgaaa 1140

aaaggcgcta cttttaatcg agaaacacca ggagttccca ttgcttatac aacaaacttc 1200

ctaaaagaca atgaattagc tgttattaaa aacaactcag aatatattga aacaacttca 1260

aaagcttata cagatggaaa aattaacatc gatcactctg gaggatacgt tgctcaattc 1320

aacatttctt gggatgaagt aaattatgat cctgaaggta acgaaattgt tcaacataaa 1380

aactggagcg aaaacaataa aagcaagcta gctcatttca catcgtccat ctatttgcca 1440

ggtaacgcga gaaatattaa tgtttacgct aaagaatgca ctggtttagc ttgggaatgg 1500

tggagaacgg taattgatga ccggaactta ccacttgtga aaaatagaaa tatctccatc 1560

tggggcacca cgctttatcc gaaatatagt aataaactgc aggtagataa tccaatcgaa 1620

<210> 4

<211> 540

<212> PRT

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 4

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu

20 25 30

Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met

35 40 45

Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys

50 55 60

Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro

85 90 95

Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys

100 105 110

Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln Val Val Asn

115 120 125

Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser

130 135 140

Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys

165 170 175

Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn Ala Val Asn

180 185 190

Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn

195 200 205

Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser

210 215 220

Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser

225 230 235 240

Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu

245 250 255

Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro

260 265 270

Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu

275 280 285

Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser

290 295 300

Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr Asn Ser His

305 310 315 320

Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser

325 330 335

Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe

340 345 350

Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile

355 360 365

Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr

370 375 380

Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe

385 390 395 400

Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile

405 410 415

Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile Asn Ile Asp His

420 425 430

Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn

435 440 445

Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys Asn Trp Ser Glu

450 455 460

Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro

465 470 475 480

Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu

485 490 495

Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu

500 505 510

Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys

515 520 525

Tyr Ser Asn Lys Leu Gln Val Asp Asn Pro Ile Glu

530 535 540

<210> 5

<211> 84

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 5

gatgaagtct caggccttga gcagcttgag agtataatca actttgaaaa actgactgaa 60

tggaccagtt ctaatgttat ggaa 84

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 6

gatgaagtga gcggcctgga gcagctggag agcattatca acttcgaaaa actgaccgag 60

tggaccagca gcaatgtgat ggaa 84

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 7

Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu

1 5 10 15

Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu

20 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgaaatata gtaataaact gcag 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgcaggtag ataatccaat cgaa 24

<210> 10

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser

1 5 10 15

Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met

20 25 30

Glu Gly Gly Gly Gly Ser

35

<210> 11

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu

1 5 10 15

Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr

20 25 30

Ser Ser Asn Val Met Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

<210> 12

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

1 5 10 15

Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys

20 25 30

Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

50 55

<210> 13

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile

20 25 30

Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser

65

<210> 14

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu

20 25 30

Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser

35 40 45

Ser Asn Val Met Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75

Claims

1.一种表达非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1) 将重组核酸分子插入质粒或表达载体中，构建重组质粒或重组表达载体；

(2) 将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中，利用所述重组质粒或重组表达载体表达所述外源抗原蛋白；

其中，所述重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素LLO多肽的异源性抗原和蛋白连接肽，所述重组的核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素LLO多肽选自：如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

所述异源性抗原替换如SEQ ID NO:4所示的衍生李斯特菌溶血素LLO多肽的第533位至第534位氨基酸序列；

所述异源性抗原的两端均连接有蛋白连接肽，所述蛋白连接肽由基本柔性单元组成，所述蛋白连接肽中所述基本柔性单元的数量为1、3或4个；

所述李斯特菌为非整合型李斯特菌Lm 10403SΔactA，Lm 10403SΔactA是Lm 10403S中缺失actA基因的减毒李斯特菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基本柔性单元为GGGGS。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一启动子序列选自编码Phly基因的序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述代谢产物选自次级代谢产物。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法得到的外源抗原蛋白。

11.根据权利要求10所述的外源抗原蛋白或包含所述外源抗原蛋白的组合物在制备用于杀死细胞的药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述细胞选自肿瘤细胞。

13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述肿瘤细胞选自癌细胞。