ES2566392T3 - Vacunas basadas en Listeria y basadas en LLO - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una proteína de listeriolisina (LLO) fusionado a un fragmento de un antígeno de Her-2, en donde el fragmento del antígeno de Her-2 consiste en los aminoácidos 303-501 o 479-655 de la sec. con núm. de ident.: 40, o los aminoácidos 303-501 o 479-652 de la sec. con núm. de ident.: 43, o una secuencia de aminoácidos más de 97 % idéntica a ella, en donde dicha LLO comprende una secuencia PEST, y en donde dicho polipéptido recombinante es capaz de inducir la regresión de las células tumorales establecidas que expresan Her-2.
Description
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DESCRIPCION
Vacunas basadas en Listeria y basadas en LLO Campo de la invencion
La presente invencion proporciona peptidos recombinantes que comprenden un fragmento de la protema N-terminal de listeriolisina (LLO) fusionado a un fragmento de la protema Her-2, la cepa de Listeria recombinante que comprende la misma, y su uso en el tratamiento de tumores que expresan Her-2.
Antecedentes de la invencion
Her-2/neu (denominada de ahora en adelante como "Her-2") es una glicoprotema de 185 kDa que es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento epidermico (EGFR) de tirosina cinasas, y consiste de un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular conocido por estar involucrado en la senalizacion celular (Bargmann CI y otros, Nature 3l9: 226, 1986; King CR y otros, Science 229: 974, 1985). Esta se sobreexpresa en el 25 al 40 % de todos los canceres de mama y ademas, se sobreexpresa en muchos canceres de ovarios, pulmon, pancreas, y tracto gastrointestinal. La sobreexpresion de Her-2 se asocia con un crecimiento celular y senalizacion descontrolados, los cuales contribuyen al desarrollo de los tumores. Los pacientes con canceres que sobreexpresan Her-2 exhiben la tolerancia aun con respuestas humorales, de celulas T CD8+, y celulas T cD4+ detectables dirigidas contra Her-2.
La Listeria monocytogenes es un patogeno intracelular que infecta fundamentalmente a las celulas presentadoras de antigenos y se ha adaptado a la vida en el citoplasma de estas celulas. Las celulas huespedes, tales como los macrofagos, fagocitan activamente L. monocytogenes y la mayor parte de las bacterias se degradan en el fagolisosoma. Algunas de las bacterias escapan al citosol del huesped al perforar la membrana fagosomal mediante la accion de una hemolisina, la listeriolisina O (LLO). Una vez en el citosol, L. monocytogenespuede polimerizar la actina del huesped y pasa directamente de celula a celula, asf evade adicionalmente al sistema inmune del huesped y resulta en una respuesta despreciable de los anticuerpos a la L. monocytogenes.
Breve descripcion de la invencion
Esta invencion proporciona un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema de listeriolisina (LLO) fusionada a un fragmento de un antfgeno de Her-2, en donde el fragmento del antfgeno de Her-2 consiste en los aminoacidos 303-501 o 479-655 de la sec. con num. de ident.: 40, o los aminoacidos 303-501 o 479652 de la sec. con num. de ident.: 43, o una secuencia de aminoacidos mas de 97 % identica a estas, en donde dicha LLO comprende una secuencia PEST, y en donde dicho polipeptido recombinante es capaz de inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
En una modalidad, las celulas T CD8+median la regresion de las celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
En una modalidad, una respuesta inmune a un epftopo subdominante de Her-2 de celulas T CD8+media la regresion de las celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
La invencion proporciona, ademas, una molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante; una forma recombinante de Listeria que comprende la molecula de nucleotidos; y una cepa recombinante de L. monocytogenes que expresa el polipeptido recombinante.
La invencion proporciona, ademas, una vacuna que comprende el polipeptido recombinante, o que comprende una molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante, o que comprende la Listeria recombinante.
La invencion proporciona, ademas, el polipeptido recombinante, o una forma recombinante de Listeria que comprende el polipeptido recombinante, para su uso como un medicamento.
Adicionalmente, la invencion tambien proporciona el uso del polipeptido recombinante, o la molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante, o la Listeria recombinante, para la preparacion de una composicion farmaceutica para inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2 en un sujeto. La invencion proporciona, ademas, el polipeptido recombinante, o la molecula de nucleotidos, o la Listeria recombinante para usar en la induccion de la regresion de un tumor establecido que expresa Her-2 en un sujeto.
El nucleotido recombinante o polipeptido recombinante pueden estar presentes en la composicion farmaceutica en forma de una Listeria recombinante que comprende dicho nucleotido recombinante o dicho polipeptido recombinante.
En una modalidad, la composicion farmaceutica induce una respuesta inmune mediada por celulas T CD8+ contra
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celulas tumorales que expresan Her-2. En una modalidad, la respuesta immune puede comprender una respuesta immune a un epftopo subdominante de la protema Her-2.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Representacion esquematica de pGG55, usado para construir las vacunas de Lm-A-LLO-HER-2.
Figura 2. La Listeria monocytogenes recombinante es capaz de secretar cada uno de los fragmentos de Her-2 como una protema de fusion ALLO. (A) Mapa de los fragmentos de Her-2 de rata. (B) Confirmacion de la secrecion de los peptidos de fusion por transferencia de tipo Western. Marcador (lmea 1), Lm-ALLO-E7 (lmea 2), Lm-ALLO-ECI (lmea 3), Lm-ALLO-EC2 (lmea 4), Lm-ALLO-EC3 (lmea 5), Lm-ALLO-ICI (lmea 6), y Lm-ALLO-IC2 (lmea 7).
Figura 3. Cada vacuna de Lm-ALLO-Her-2 induce la detencion del crecimiento del tumor en tumores NT-2 establecidos. Cada punto de dato representa el promedio de los diametros mas corto y mas largo de la superficie tumoral de un raton en un momento dado. Los ratones se sacrificaron cuando el promedio del diametro tumoral alcanzo 2,0 cm; las mediciones de los tumores se muestran solamente para los ratones sobrevivientes en un momento dado. Se muestran las figuras representativas de dos experimentos. (A) Lm-ALLO-ECI, Lm-ALLO-EC2, y Lm-ALLO-EC3; (B) Lm-ALLO-ICI, y Lm-ALLO-IC2.
Figura 4. Las celulas T CD8+ participan en la estasis del tumor inducida por Her-2. Las mediciones de los tumores se muestran solamente para los ratones sobrevivientes en un momento dado. (A) Lm-ALLO-ECI, Lm-ALLO-EC2, y Lm- ALLO-EC3 con reduccion o no de celulas T CD8+. (B) Lm-ALLO-ICI y Lm-ALLO-IC2 con reduccion o no de las celulas T CD8+.
Figura 5. Lm-ALLO-EC2 induce un aumento de tres veces en las celulas T CD8+ tetramero+. Los ratones FVB/N se inmunizaron con Lm-ALLO-EC2 o PBS. Posteriormente, los esplenocitos se tineron con un tetramero H-2q Her-2, anti-CD8, y anti-CD62L.
Figura 6. Cada uno de los constructos de vacuna Lm-ALLO-Her-2 induce niveles similares de actividad CTL anti- Her-2. A. 3T3 silvestre (control negativo). B. 3T3-neu (Her-2 de longitud completa). Los resultados se muestran como la media de cultivos triplicados, y son representativos de 5 experimentos.
Figura 7. La entrega por LM y la fusion a ALLO aumenta la respuesta inmune antitumoral de las vacunas Her-2. Se representa el diametro tumoral promedio para cada raton Las mediciones de los tumores se muestran solamente para los ratones sobrevivientes en un momento dado. (A) Lm-ALLO-ECI vs. pcADN ALLO-EC1 + GM-CSF, (B) pcADN EC1 + GM-CSF vs. pcADN ALLO-EC1 + GM-CSF, (C) pcADN neu + GM-CSF vs. pcADN ALLO-neu + GM- CSF, (D) pcADN ALLO-neu + GM-CSF vs. pcADN ALLO-EC1 + GM-CSF, y (E) pcADN neu + GM-CSF vs. pcADN EC1 + GM-CSF.
Figura 8. La vacuna Lm-ALLO-Her-2 ralentiza el crecimiento de los tumores de rata establecidos que expresan Her-2 en ratones transgenicos para Her-2/neu de rata, en los que el Her-2 de rata se expresa como un antfgeno propio.
Figura 9. Las vacunas LLO-Her-2 controlan el crecimiento espontaneo de tumores en ratones transgenicos Her- 2/neu.
Figura 10. Representacion esquematica de los fragmentos de Her-2 usados para crear las vacunas LLO-Her-2 humana.
Descripcion detallada de la invencion
Esta invencion proporciona un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema de listeriolisina (LLO) fusionado a un fragmento de un antfgeno de Her-2, en donde el fragmento del antfgeno de Her-2 consiste en los aminoacidos 303-501 o 479-655 de la sec. con num. de ident.: 40, o los aminoacidos 303-501 o 479652 de la sec. con num. de ident.: 43, o una secuencia de aminoacidos mas de 97 % identica a ellas, en donde dicha LLO comprende una secuencia PEST, y en donde dicho polipeptido recombinante es capaz de inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
En una modalidad, las celulas T CD8+median la regresion de las celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
En una modalidad, una respuesta inmune a un epftopo subdominante de Her-2 de celulas T CD8+media la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
La invencion proporciona, ademas, una molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante; una forma recombinante de Listeria que comprende la molecula de nucleotidos; y una cepa recombinante de L. monocytogenes que expresa el polipeptido recombinante.
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La invencion proporciona, ademas, una vacuna que comprende el polipeptido recombinante, o que comprende una molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante, o que comprende la Listeria recombinante
La invencion proporciona, ademas, el polipeptido recombinante, o una forma recombinante de Listeria que comprende el polipeptido recombinante, para su uso como un medicamento.
Adicionalmente, la invencion proporciona tambien el uso del polipeptido recombinante, o la molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante, o la Listeria recombinante, para la preparacion de una composicion farmaceutica para inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2 en un sujeto. La invencion proporciona, ademas, el polipeptido recombinante, o la molecula de nucleotidos, o la Listeria recombinante para usar en la induccion de la regresion de un tumor establecido que expresa Her-2 en un sujeto.
El nucleotido recombinante o polipeptido recombinante puede estar presente en la composicion farmaceutica en forma de una Listeria recombinante que comprende dicho nucleotido recombinante o dicho polipeptido recombinante.
En una modalidad, la composicion farmaceutica induce una respuesta inmune mediada por celulas T CD8+ contra celulas tumorales que expresan Her-2. En una modalidad, la respuesta inmune puede comprender una respuesta inmune a un epftopo subdominante de la protema Her-2.
Como se proporcionan en la presente descripcion, los resultados de la presente invencion demuestran que las composiciones de la presente invencion tienen utilidad para inducir la formacion de celulas T espedficas por el antigeno (por ejemplo, celulas T citotoxicas) que reconocen y destruyen las celulas tumorales, y de ese modo detienen el crecimiento de y reducen las celulas tumorales y tratan el cancer resultante (Ejemplos de la presente descripcion).
En otra modalidad, la presente invencion proporciona un polipeptido recombinante que comprende un fragmento de una protema Her-2 cuyo fragmento consiste en los AA 303-501 de ella, o los AA 479-655 de ella, o una secuencia de aminoacidos mas de 97 % identica a ella.
En una modalidad, el fragmento de protema Her-2 es un fragmento de protema Her-2 humano. En otra modalidad, el fragmento de protema Her-2 es un fragmento de protema Her-2 de rata. En otra modalidad, el fragmento de protema Her-2 es un homologo de un fragmento de protema Her-2.
En una modalidad, la protema Her-2 es una protema Her-2 de rata que tiene la secuencia:
MIIMELAAWCRWGFLLALLPPGIAGTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQG
NLELTYVPANASLSFLQDIQEVQGYMLIAHNQVKRVPLQRLRIVRGTQLFEDKYALAVLDNRD
PQDNVAASTPGRTPEGLRELQLRSLTEILKGGVLIRGNPQLCYQDMVLWKDVFRKNNQLAPV
D1DTNRSRACPPCAPACKDNHCWGESPEDCQILTGTICTSGCARCKGRLPTDCCHEQCAAGCT
GPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMHNPEGRYTFGASCVTTCPYNYLSTEV
GSCTLVCPPNNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEKLRGARAITSDNVQEFDGCKKI
FGSLAFLPESFDGDPSSG1APLRPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLRDLSVFQNLRIIRGRILH
DGAYSLTLQGLG1HSLGLRSLRELGSGLALIHRNAHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHSGNRJP
EEDCGLEGLVCNSLCAHGHCWGPGPTQCVNCSHFLRGQECVEECRVWKGLPREYVSDKRCL
PCHPECQPQNSSETCFGSEADQCAACAHYKDSSSCVARCPSGVKPDLSYMPIWKYPDEEGICQ
PCPINCTHSCVDLDERGCP AEQRASPWFIIATVEGVL.LFLILVWVGILIKRRRQKJRKYTMRRL
LQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIK
VLRENTSPKANKEILDEA YVMAG V G SP YVSRLLGICLTSTV QL VT QLMP YGCLLDHVREHRG
RLGSQDLLNWCVQIAK.GMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEY
HADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGE
RLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFWIQNEDLGPSSPMDST
FYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFSPDPTPGTGSTAHRRHRSSSTRSGGGELTLGLEPS
EEGPPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLAMGVTKGLQSLSPHDLSPLQRYSEDPTLPLPPETDGYVAP
LACSPQPEYVNQSEVQPQPPLTPEGPLPPVRPAGATLERPKTLSPGKNGWKDVFAFGGAVEN
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PSNFEGTPTAENPEYLGLDVPV (sec. con num. de ident.: 40). La sec. con num. de ident.: 40 se uso para crear los fragmented en el Ejemplo 1. En otra modalidad, la protema Her-2 es codificada por la secuencia de acido nucleico que se expone en la sec. con num. de ident.: 41.
En otra modalidad, la protema Her-2 es una protema Her-2 humana que tiene la secuencia:
Mr: ] AALCRWGLLL ALLPPG AASTQ VCTGTDM K LRLP ASPHTHLDMLRHL VQGCQWQGNL ELTYJ^TNASLSFLQDIQEVQaYVUAKNQVRQVPLQRlRJVRGTQLFEDNYALAVLDNGDP L NNTTPVTG A SPG GLREL QLRSLTEILKGGVXIQRM PQLCYQ DTILWKDIFHKMN Q LALT LID TNRSEIACHPCSPMCK.G SRC W GESSEDCQSLTEtT VCAGGCA FtCKGPLPIDCGHEQCAAGC'L GPKHSDCLACLHFKHSaiCELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPVMYl^liJ VGSCTLVCPLHNQEyTa£dGtQRCEKCSKPCaRVcYGLGM£HLREVRAVTSANIQEFAGCK:
K.J FGSLAFLPESFDQ DP AS* P AruQPeQLQ VFETLEEITG YLYIS A WKDSLPDLSVFQPJLQVJR GRJLKNGAYSLTLQGUjiSWLGLRSLRELGSGLALJHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALL KTAMRPEDECVGEGLACFfQLCAWJHCWGPGPTQCVKCSQFLRCQECVEECRVLQGLPItEY VNARHCLPCHPJECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKJ>DL9YMP]WK:
fpdeegaoqpcpincthscvdlpdkgcpae<jfaspltstjsawgellvwlgwfgil]krrq
Q K IRK VTMR R t .1 jQFTEl VEPLTPSG AMPNQAQMIULKEIE LRK VKVLGSG AFGT VYKGIWIP DGENVKJPVAlKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTV'QLVTQLtftPY G C LLDHVREJSTRGRLGS Q DLU'JWCMQIAKGMSYLE DVRLV HRDL AAREATVK S PNHVKJ T D FGT.ARJ T DmFTEYHADGGKVPIK WMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPY DG1PAREIF DLLEKGERLPQPPICTID VYM1M VKCWMIDSECRPRFREL VSEFSRM^ RDPQRF WIQNEDLGPA SP11JSTFYRSLLE DDDMGDL\T)AEEY L VPQQGFFCPDP APG AG GMVHHRH RSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEE APBSFL APSEGAG 5D VFDGDLGMG AA KGlOSLPTHDPSl’i
qrysedptvtlpsetdgyvapltcspqpeyvnqpdvrpqppspregplpaarpagatlerpkt
[ SPGKNGWKDVFAF'GGA VENPE YLTPQGG AAPQPHPRP AFSPA FDNLYY W DQDPPERG A P PSTFKGTPTAENPEYLGLDVPv(Sec, con num, de ident.:43)
La sec. con num. de ident.: 43 se usa para crear los fragmented en el Ejemplo 10. En otra modalidad, la protema Her-2 es codificada por la secuencia de acido nucleico que se expone en la sec. con num. de ident.: 44.
En otras modalidades, la protema Her-2 tiene una secuencia que se expone en el Num. de acceso al GenBank NM_004448 oNM_001005862. Estas protemas Her-2 tienen regiones transmembrana (TM) que abarcan los AA 653675 y 623-645, respectivamente. La protema Her-2 humana que se expone en la sec. con num. de ident.: 43 tiene una region TM que abarca 653-676. Asf, en otra modalidad, la generacion de fragmentos de Her-2 que corresponden a aquellos de la presente invencion a partir de variaciones de la sec. con num. de ident.: 40, tales como estos, requiere ajustes del numero de residuos que definen el fragmento, como se describe mas abajo.
En otras modalidades, la protema Her-2 es una protema denominada como "HER-2/neu," "Erbb2," "v-erb-b2," "c-erb- b2," "neu," o "cNeu."
En otra modalidad, el fragmento de una protema Her-2 de las composiciones y usos medicos de la presente invencion consiste en los AA 303-501 (EC2; sec. con num. de ident.: 36) de la protema Her-2, o una secuencia mas de 97 % identica a ella. En otra modalidad, el fragmento consiste en los AA 479-655 (EC3; sec. con num. de ident.: 37) de la protema Her-2, o una secuencia mayor de 97 % identica a ella.
Los numeros e intervalos de los AA enumerados anteriormente se basan en la secuencia de Her-2 de rata, para la cual el dominio TM abarca los residuos 656-689. En otra modalidad, las regiones correspondientes de otras protemas Her-2 (por ejemplo, protemas Her-2 de otras especies) se determinan por alineamiento de los dominios
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TM de las otras protemas Her-2 y el ajuste de los intervalos de los AA. Por ejemplo, para la variante 2 del transcrito de Her-2 humano, Num. de acceso al GenBank NM_001005862, las regiones TM abarcan los AA 623-645. Asf, en esta modalidad, la region de esta protema que corresponde a EC3 es aproximadamente los AA 446-622, determinada al sustraer 33 de los numeros de los AA lo que explica la diferencia de 33 AA en el borde extracelular del dominio TM. Similarmente, la region de esta protema correspondiente a IC es 646-1037, determinada al sustraer 44 de los numeros lo que explica la diferencia de 44 AA en el borde intracelular del dominio TM. Las regiones correspondientes de otras protemas Her-2 pueden determinarse por alineamiento con los extremos de la protema.
En otra modalidad, el fragmento de una protema Her-2 de las composiciones y los usos medicos de la presente invencion no incluyen un dominio TM de este. En una modalidad, la omision del TM permite al fragmento de Her-2 expresarse exitosamente en Listeria, debido a la alta hidrofobicidad del TM.
"No incluye" se refiere, en una modalidad, a que no incluye mas de 1 aminoacido (AA) de la secuencia senal o dominio Tm. En otra modalidad, el termino se refiere a que no incluye mas de 2 AA. En otras modalidades, el termino se refiere a que no incluye mas de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, o 30 AA de la secuencia. En otra modalidad, no se incluye ninguna secuencia. En otra modalidad, no se incluye la mayona de la
secuencia. En otras modalidades, no se incluyen al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 AA de la
secuencia.
En una modalidad, el fragmento N-terminal de LLO usado en las composiciones y usos medicos de la presente invencion, es de una LLO de Listeria. En una modalidad, la Listeria de la que se deriva la LLO es Listeria
monocytogenes (LM). En otra modalidad, la Listeria es Listeria ivanovii. En otra modalidad, la Listeria es Listeria
welshimeri. En otra modalidad, la Listeria es Listeria seeligeri. En otra modalidad, la protema LLO es una protema LLO que no es de Listeria.
En otra modalidad, la protema LLO tiene la secuencia:
MKKIMLWITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYI
QGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIWEKKKKSINQNNADIQWNAISSLT
YPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIWKNATKSNVNNAVNTLV
ERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQL1AKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQE
EVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLST
NSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNUKNSSFKAV1YGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILK
KGATFNRETPGVPIAYTTNFLRDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNIS
WDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRT
VIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKY SNKVDNPIE
(Num. de acceso al GenBank P13128; sec. con num. de ident.: 34; la secuencia de acido nucleico se expone en el Num. de acceso al GenBank X15127; sec. con num. de ident.: 33). Los primeros 25 aminoacidos de la proprotema correspondientes a esta secuencia son la secuencia senal y se escinden de LLO cuando se secreta por la bacteria. Asf, en esta modalidad, la protema LLO activa de longitud completa tiene 504 residuos de largo. En otras modalidades, la protema LLO tiene una secuencia que se expone en Num. de acceso al GenBank DQ054588, DQ054589, AY878649, U25452, o U25452. En otra modalidad, la protema LLO es un homologo de una protema LLO.
En otra modalidad, "LLO truncada" o "ALLO" se refiere a un fragmento de LLO que comprende el dominio similar a PEST. En otra modalidad, los terminos se refieren a un fragmento de LLO que no contiene el dominio de activacion en el amino terminal y no incluye la cistina 484. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste de una secuencia PEST. En otra modalidad, el fragmento de LLO comprende una secuencia PEST. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste de aproximadamente los primeros 441 aminoacidos de la protema LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO es una forma no hemolftica de la protema LLO.
En una modalidad, el dominio similar a PEST mencionado anteriormente tiene la secuencia que se expone en sec. con num. de ident.: 42. En otra modalidad, el dominio similar a PEST es cualquier otro dominio similar a PEST conocido en la tecnica.
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En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-25. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-50. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-75. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-100. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-125. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-150. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1175. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-200. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-225. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-250. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-275. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-300. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-325. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-350. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-375. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-400. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los residuos 1-425.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende un polipeptido recombinante de la presente invencion.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una molecula de nucleotidos que codifica un polipeptido recombinante de la presente invencion. En otra modalidad, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende la molecula de nucleotidos.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una composicion inmunogenica que comprende una molecula de nucleotidos o un polipeptido recombinante de la presente invencion.
Ademas, se describe un vector que comprende una molecula de nucleotidos o polipeptido recombinante de la presente invencion.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una forma recombinante de Listeria que comprende una molecula de nucleotidos de la presente invencion.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una vacuna que comprende una forma recombinante de Listeria de la presente invencion.
Ademas, se describe un cultivo de una forma recombinante de Listeria de la presente invencion.
En otra modalidad, la Listeria de los metodos y composiciones de la presente invencion es L. monocytogenes (LM). En otra modalidad, la Listeria es Listeria ivanovii. En otra modalidad, la Listeria es Listeria welshimeri. En otra modalidad, la Listeria es Listeria seeligeri.
En la presente descripcion se describe que la presente invencion actua por la induccion de una respuesta inmune anti-Her-2 en un sujeto.
En una modalidad, la protema de fusion de las composiciones de la presente invencion comprende una secuencia senal LLO de LLO. En otra modalidad, las dos moleculas de la protema (el fragmento de LLO y el antfgeno de Her-2) de unen directamente. En otra modalidad, las dos moleculas se unen por un peptido espaciador corto, que consiste de uno o mas aminoacidos. En una modalidad, el espaciador no tiene otra actividad biologica espedfica que unir las protemas o preservar alguna distancia minima u otra relacion espacial entre ellas. En otra modalidad, los aminoacidos constituyentes del espaciador se seleccionan para influenciar alguna propiedad de la molecula tal como el plegado, la carga neta, o la hidrofobicidad.
Como de describe en la presente descripcion, administrar a un sujeto un nucleotido recombinante que codifica un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada a un fragmento de la protema Her-2, de la invencion, induce una respuesta inmune anti-Her-2 en el sujeto.
En una modalidad, un polipeptido recombinante o un nucleotido recombinante de la presente invencion puede administrarse con una forma recombinante de Listeria que comprende el nucleotido recombinante o expresa el polipeptido recombinante. En otra modalidad, puede administrarse con un vector bacteriano diferente, o con un vector viral, o con una vacuna de ADN (por ejemplo, una vacuna de ADN desnudo). En otra modalidad, el polipeptido recombinante de la presente invencion puede producirse por via recombinante, y despues administrarse a un sujeto.
En otra modalidad, la respuesta inmune provocada por las composiciones de la presente invencion comprende una respuesta mediada por celulas T CD8+. En otra modalidad, la respuesta inmune consiste fundamentalmente de una
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respuesta mediada por celulas T CD8+. En otra modalidad, el unico componente detectable de la respuesta inmune es una respuesta mediada por celulas T CD8+.
En otra modalidad, la respuesta inmune provocada por las composiciones de la presente invencion comprende una respuesta mediada por celulas T CD4+. En otra modalidad, la respuesta inmune consiste fundamentalmente de una respuesta mediada por celulas T CD4+. En otra modalidad, el unico componente detectable de la respuesta inmune es una respuesta mediada por celulas T CD4+. En otra modalidad, la respuesta mediada por celulas T CD4+ se acompana de una respuesta de anticuerpos medible contra el antfgeno. En otra modalidad, la respuesta mediada por celulas T CD4+ no se acompana de una respuesta de anticuerpos medible contra el antigeno.
En otra modalidad, la respuesta inmune provocada por las composiciones de la presente invencion comprende una respuesta inmune a un epftopo subdominante del antfgeno. En una modalidad, la respuesta inmune no comprende una respuesta inmune a un epftopo subdominante. En una modalidad, la respuesta inmune consiste fundamentalmente de una respuesta inmune a un epftopo subdominante. En otra modalidad, el unico componente medible de la respuesta es una respuesta inmune a un epftopo subdominante.
Los metodos para medir las respuestas inmunes se conocen bien en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, medir la supresion del crecimiento tumoral (Ejemplos 2, 5, 8, y 9 de la presente descripcion), citometna de flujo (FACS; Ejemplo 3), ensayos de lisis de celulas objetivo (por ejemplo, ensayo de liberacion de cromo; Ejemplos 4 y 6), el uso de tetrameros, y otros.
Ademas, en la presente descripcion se describe un metodo para impedir el crecimiento de un tumor que expresa Her-2 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada a la protema Her-2 o un fragmento de ella o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante, o una forma recombinante de Listeria que comprende el nucleotido recombinante, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa Her-2, y de ese modo impide el crecimiento de un tumor que expresa Her-2 en un sujeto.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona un polipeptido recombinante de la invencion que comprende el fragmento N-terminal de una protema LLO fusionado a un fragmento de la protema Her-2, o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante, para usar en la reduccion de un tumor que expresa Her-2 en un sujeto, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa Her-2, y de ese modo reduce el tumor que expresa Her-2 en un sujeto.
Ademas, en la presente descripcion se describe un metodo para romper la tolerancia inmune de un sujeto a un tumor que expresa Her-2, que comprende administrar al sujeto un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada a la protema Her-2 o un fragmento de ella o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante, o una forma recombinante de Listeria que comprende el nucleotido recombinante, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa Her-2, y de ese modo impide el crecimiento de un tumor que expresa Her-2 en un sujeto.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una forma recombinante de Listeria que comprende un nucleotido recombinante, el nucleotido recombinante codifica el polipeptido de la invencion, para usar en la reduccion de un tumor que expresa Her-2 en un sujeto, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa Her-2, y de ese modo reduce el tumor que expresa Her-2 en un sujeto.
En la presente descripcion se menciona, ademas, que la presente invencion proporciona un metodo para mejorar la antigenicidad de una protema Her-2, por la fusion de un nucleotido que codifica un fragmento N-terminal de una protema LLO a un nucleotido que codifica el fragmento de la protema Her-2 para crear un nucleotido recombinante con antigenicidad mejorada de una protema Her-2.
En otra modalidad, la respuesta inmune anti-Her-2 provocada por las composiciones de la presente invencion comprende una primera respuesta inmune contra un epftopo de la protema Her-2 que esta presente en el fragmento y una segunda respuesta inmune a un epftopo de la protema Her-2 que no esta presente en el fragmento, como detalla mas aun la presente descripcion mas abajo.
En la presente descripcion se describe un metodo para romper la tolerancia inmune de un sujeto a un tumor que expresa el antfgeno, que comprende administrar a un sujeto un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada a un fragmento del antfgeno o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante, en donde el antfgeno tiene uno o mas epftopos dominantes de las celulas T CD8+ y en donde el fragmento no contiene ninguno de los epftopos dominantes de las celulas T CD8+, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa el antfgeno, y de este modo rompe la tolerancia inmunologica de un sujeto a un tumor que expresa el antfgeno.
Ademas. en la presente descripcion se describe un metodo para romper la tolerancia inmune de un sujeto a un
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tumor que expresa el antigeno, que comprende administrar al sujeto una forma recombinante de Listeria que comprende un nucleotido recombinante, el nucleotido recombinante codifica un fragmento del antigeno, en donde el antfgeno tiene uno o mas epftopos dominantes de las celulas T CD8+ y en donde el fragmento no contiene ninguno de los epftopos dominantes de las celulas T CD8+, por medio de lo cual el sujeto monta una respuesta inmune contra el tumor que expresa el antigeno, y de ese modo rompe la tolerancia inmunologica de un sujeto a un tumor que expresa el antigeno.
Ademas En la presente descripcion se describe un metodo para identificar un epftopo de celulas T CD8+ de un antfgeno, que comprende las etapas de (a) fundir una molecula de nucleotido que codifica el antfgeno a una molecula de nucleotido que codifica un fragmento N-terminal de una protema LLO, de ese modo crear un nucleotido recombinante y una protema de fusion LLO-antfgeno; (b) administrar la fusion LLO-antfgeno a un sujeto; (c) aislar las celulas T CD8+ del sujeto; y (d) determinar el epftopo reconocido por las celulas T CD8+; y de ese modo identificar un epftopo de celula T CD8+ de un antfgeno. En una modalidad, el epftopo de las celulas T CD8+ es un epftopo subdominante.
"Epftopo dominante de la celula T CD8+", en una modalidad, se refiere a un epftopo que reconocen mas del 30 % de las celulas T CD8+espedficas por el antfgeno que se provocan por la vacunacion, infeccion, o un crecimiento maligno con una protema o un patogeno o celula de cancer que contiene la protema. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 35% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno que se provocan de ese modo. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 40 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 45% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 50 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 55% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 60 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 65% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 70 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 75 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 80 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 85 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 90 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 95% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 96% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 97% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 98% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno.
"Epftopo subdominante de la celula T CD8+", en una modalidad, se refiere a un epftopo que reconocen menos del 30 % de las celulas T CD8+espedficas por el antfgeno que se provocan por la vacunacion, infeccion, o crecimiento maligno con una protema o un patogeno o celula de cancer que contiene la protema. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 28 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 26 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 24 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 22 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 20 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 18% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 16 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 14 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 12 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 10 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 8 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 6% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 5% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por mas del 4% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 3% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 2 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 1% de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno. En otra modalidad, el termino se refiere a un epftopo reconocido por menos del 0,5 % de las celulas T CD8+ espedficas por el antfgeno.
En otra modalidad, el "epftopo subdominante" se refiere a un epftopo que no se revela por otros metodos de vacunacion. Por ejemplo, Ercolini y otros (J Immunol 2003, 170: 4273-4280) vacunaron sujetos con ambas celulas
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tumorales que expresan neu transfectadas con GM-CSF y vaccinia recombinante que expresa Her-2, todavfa encontraron un unico epftopo dominante, los AA 420-429. En contraste, el uso de las fusiones ALLO-Her-2 en los experimented descritos en la presente descripcion revelaron epftopos adicionales ademas de los AA 420-429. La entrega de las fusiones con LM recombinante revela todavfa mas epftopos.
En otra modalidad, el epftopo dominante o epftopo subdominante es dominante o subdominante, respectivamente, en el sujeto que se trata. En otra modalidad, el epftopo dominante o epftopo subdominante es dominante o subdominante en una poblacion que se trata.
En la presente descripcion se describe un metodo para romper la tolerancia inmune de un sujeto a un tumor que expresa el antigeno, en donde el antfgeno se expresa a un nivel detectable en una celula no tumoral del sujeto, que comprende administrar a un sujeto un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada al antigeno o fusionada a un fragmento de este o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante o una forma recombinante de Listeria que comprende el nucleotido recombinante, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa el antfgeno, y de este modo rompe la tolerancia inmunologica de un sujeto a un tumor que expresa el antigeno.
"Niveles detectables" se refiere, en una modalidad, a un nivel detectable por un ensayo estandar. En una modalidad, el ensayo es un ensayo inmunologico. En una modalidad, el ensayo es un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). En otra modalidad, el ensayo es transferencia de tipo Western (Ejemplo 1). En otra modalidad, el ensayo es FACS (Ejemplo 3). En otra modalidad, un nivel detectable se determina en relacion al nivel de fondo del ensayo particular. Los metodos para realizar cada una de estas tecnicas se conocen bien por aquellos con experiencia en la tecnica.
El antigeno, en una modalidad, se expresa a un nivel detectable en una celula no tumoral del sujeto. En otra modalidad, el antigeno se expresa a un nivel detectable en al menos un cierto porcentaje (por ejemplo, 0,01 %, 0,03 %, 0,1 %, 0,3 %, 1 %, 2 %, 3 %, o 5 %) de celulas no tumorales del sujeto. En una modalidad, "celula no tumoral" se refiere a una celula fuera del cuerpo del tumor. En otra modalidad, "celula no tumoral" se refiere a una celula no maligna. En otra modalidad, "celula no tumoral" se refiere a una celula no transformada. En otra modalidad, la celula no tumoral es una celula somatica. En otra modalidad, la celula no tumoral es una celula germinal.
Ademas, en la presente descripcion se describe un metodo para inducir una respuesta inmune a un primer epftopo de un antfgeno, en un animal que expresa el antfgeno en un tumor o un agente infeccioso, por la vacunacion del animal con una vacuna que comprende LLO fusionada a un fragmento del antfgeno o una Listeria recombinante que expresa un fragmento del antfgeno, en donde el fragmento usado en la vacunacion no incluye el primer epftopo. En su lugar, el fragmento contiene un segundo epftopo del mismo antfgeno, contra el cual el animal monta una respuesta inmune. Una respuesta inmune continua contra el tumor o agente infeccioso resulta en el reconocimiento del primer epftopo por extension de epftopos, como se muestra en la presente descripcion.
La respuesta inmune al primer epftopo puede iniciarse al menos 2 semanas despues de la etapa de administracion o despues de la conclusion de la etapa de administracion. En otra modalidad, el marco de tiempo es 1 semana, o 10 dfas o 17 dfas o 3 semanas o 4 semanas.
Como se proporciona en la presente descripcion, los resultados de la presente invencion, ademas, demostraron que la vacunacion con la LM que expresa el antfgeno recombinante induce extension de epftopos. En otra modalidad, la vacunacion con fusiones LLO-antfgeno, aun fuera del contexto de LM, induce tambien la extension de epftopos.
Ademas, en la presente descripcion se describe un metodo para impedir el crecimiento de un tumor que expresa un antfgeno en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema LLO fusionada a un fragmento del antfgeno o un nucleotido recombinante que codifica el polipeptido recombinante o una forma recombinante de Listeria que comprende el nucleotido recombinante, en donde el antfgeno tiene uno o mas epftopos dominantes de celulas T CD8+ y en donde el fragmento no contiene ningun epftopo dominante de celulas T CD8+, por lo cual el sujeto desarrolla una respuesta inmune contra el tumor que expresa el antfgeno, y de este modo impide el crecimiento de un tumor que expresa un antfgeno en un sujeto.
En esta invencion, el antfgeno es una protema Her-2.
En otra modalidad, la presente invencion actua por la supresion de la formacion de tumores en el huesped. En otra modalidad, la presente invencion actua por la induccion de la formacion de celulas T CD8+que infiltran el tumor en un huesped que tiene cancer. En otra modalidad, la presente invencion actua por la induccion de la formacion de celulas T citotoxicas en un huesped que tiene cancer.
En una modalidad de la presente invencion, la composicion es para la administracion de las celulas del sujeto ex vivo; en otra modalidad, la composicion es para la administracion de las celulas de un donante ex vivo; en otra modalidad, la composicion es para administrarse a las celulas del donante in vivo, despues, transferirse al sujeto.
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En una modalidad, el cancer tratado por una composicion de la presente invencion es cancer de mama. En otra modalidad, el cancer es un melanoma. En otra modalidad, el cancer es cancer de pancreas. En otra modalidad, el cancer es cancer de ovario. En otra modalidad, el cancer es cancer gastrico. En otra modalidad, el cancer es cancer una lesion carcinomatosa del pancreas. En otra modalidad, el cancer es el adenocarcinoma pulmonar. En otra modalidad, el cancer es el adenocarcinoma colorrectal. En otra modalidad, el cancer es el adenocarcinoma pulmonar escamoso. En otra modalidad, el cancer es adenocarcinoma gastrico. En otra modalidad, el cancer es un neoplasma epitelial de la superficie del ovario (por ejemplo, una variedad benigna, proliferativa o maligna de este). En otra modalidad, el cancer es un carcinoma de celulas escamosas de la cavidad oral. En otra modalidad, el cancer es carcinoma de pulmon de celulas no pequenas. En otra modalidad, el cancer es un carcinoma del endometrio. En otra modalidad, el cancer es un cancer de vejiga. En otra modalidad, el cancer es un cancer de una cabeza y cuello. En otra modalidad, el cancer es un carcinoma de prostata.
En otra modalidad de la presente invencion, el sujeto monta una respuesta inmune contra el tumor que expresa el antigeno o el antigeno objetivo, de ese modo media los efectos antitumorales.
En otra modalidad, la presente invencion proporciona una composicion inmunogenica para usar en el tratamiento del cancer, composicion que comprende una fusion de una LLO truncada a una protema Her-2. En otra modalidad, la composicion inmunogenica comprende una cepa de Listeria que expresa la fusion.
En una modalidad, un protocolo de tratamiento de la presente invencion es terapeutico.
Ademas, en la presente descripcion se describe que el protocolo de tratamiento puede ser profilactico. Se describe que las vacunas de la presente invencion pueden usarse para proteger a personas en riesgo de cancer debido a la genetica familiar u otras circunstancias que los predisponen a ciertos tipos de canceres , por ejemplo, cancer cervical en mujeres cuyos esposos tienen el virus del papiloma. En otra modalidad, las vacunas se usan como una inmunoterapia de cancer despues de la reduccion del crecimiento tumoral por cirugfa, quimioterapia convencional o tratamiento por radiaciones. Despues de tales tratamientos, las vacunas de la presente invencion pueden administrarse de manera tal que la respuesta CTL al antfgeno tumoral de la vacuna destruya las metastasis remanentes y prolongue la remision del cancer. En otra modalidad, las vacunas de la presente invencion se usan para provocar la regresion de tumores previamente establecidos y matar las celulas tumorales existentes.
Varias modalidades de intervalos de dosificacion se contemplan por esta invencion. En una modalidad, en el caso de vectores de vacuna, la dosificacion esta en el intervalo de 0,001 LDso/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,002 LDso/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,003 LDso/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,004 LDso/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,006 LDs0/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,008 LD50/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,01 LDs0/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,02
LD50/dosis. En otra modalidad la dosificacion es 0,03 LDs0/dosis. En una modalidad, la dosificacion es 0,04
LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,06 LDs0/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,08 LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,1 LDs0/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,15
LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,2 LDs0/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,25
LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,3 LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,4 LD50/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 0,5 LD50/dosis.
En otra modalidad, la dosificacion es 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 4 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 107 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 4 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 108 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 5 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 5 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 1010 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 109 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 5 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 x 1011 bacteria/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 x 1011 bacteria/dosis.
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En otra modalidad, en el caso de polipeptidos recombinantes, la dosificacion es 1 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1,5 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 2 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 3 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 4 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 6 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 8 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 10 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 15 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 20 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 30 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 40 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 60 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 80 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 100 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 150 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 200 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 300 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 400 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 600 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 800 mg/dosis. En otra modalidad, la dosificacion es 1000 mg/dosis.
En una modalidad, una vacuna o composicion inmunogenica de la presente invencion se administra sola a un sujeto. En otra modalidad, la vacuna o composicion inmunogenica se administra junto con otra terapia de cancer.
La Listeria recombinante de las composiciones de la presente invencion, en una modalidad, se transforma establemente con un constructo que codifica la protema de fusion LLO-antigeno de Her2. En una modalidad, el constructo contiene un polienlazador para facilitar la subclonacion adicional. Se conocen varias tecnicas para producir Listeria recombinante.
En una modalidad, el constructo o genes heterologos se integran en el cromosoma de la Listeria por medio del uso de recombinacion homologa. Las tecnicas para la recombinacion homologa se conocen bien en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en Baloglu S, Boyle SM, y otros, Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein. Vet Microbiol 2005, 109(1-2): 11-7; y Jiang LL, SongHH, y otros, Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2005, 37(1): 19-24. En otra modalidad, la recombinacion homologa se realiza como se describe en la patente de Estados Unidos num. 6.855.320. En este caso, una cepa de LM recombinante que expresa E7 se hizo por la integracion cromosomal del gen E7 bajo el control del promotor hly y con la inclusion de la secuencia senal hly para garantizar la secrecion del producto del gen, lo que produce el recombinante denominado como Lm-AZ/E7. En otra modalidad, se usa un plasmido sensible a la temperatura para seleccionar los recombinantes.
En otra modalidad, el constructo o genes heterologos se integran en el cromosoma de la Listeria por medio del uso de la insercion por transposon. Las tecnicas para la insercion por transposon se conocen bien en la tecnica, y se describen, inter alia, por Sun y otros (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778) en la construccion de DP-L967. La mutagenesis por transposon tiene la ventaja, en otra modalidad, de que puede formarse una mutante por insercion genomica estable, pero la desventaja de que la posicion en el genoma donde se inserta el gen foraneo es desconocida.
En otra modalidad, el constructo o gen heterologo se integra en el cromosoma de la Listeria por medio del uso de sitios de integracion de fagos (Lauer P, Chow MY y otros, Construction, characterization, and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002;184(15): 4177-86). En ciertas modalidades de este metodo, se usa un gen de integrasa y un sitio de union de un bacteriofago (por ejemplo, U153 o listeriofago PSA) para integrar el gen heterologo en el sitio de union correspondiente, que puede ser cualquier sitio adecuado en el genoma (por ejemplo, comK o el extremo 3' del gen de ARNt de Arg). En otra modalidad, profagos endogenos se curan a del sitio de union que se uso antes de la integracion del constructo o gen heterologo. En otra modalidad, este metodo resulta en integrantes de una sola copia.
En otra modalidad, el constructo se transporta por la cepa de Listeria en un plasmido. La clonacion del gen en un vector que contiene prfA y el uso de este plasmido para complementar un mutante de Listeria prfA(-) se ha usado para construir DP-L2028. DP-L2028 es la cepa de influenza que expresa NP usada en los experimentos de proteccion del tumor. Un vector LM que expresa una protema de fusion que expresa E7 ademas se construyo mediante esta tecnica. Lm-GG/E7 se hizo por la complementacion de un mutante de delecion prfA con un plasmido que contiene una copia del gen prfA y una copia de E7 fusionada a una forma del gen (hly) de LLO truncada para eliminar la actividad hemolttica de la enzima, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Num. 6.565.852. La LLO funcional se mantiene por el organismo mediante la copia cromosomal endogena de hly.
En otras modalidades, se toma uno de varios enfoques para expresar el antfgeno tumoral en Listeria. En una modalidad, se genera una protema de fusion del antfgeno tumoral seleccionado y una protema de Listeria, tal como PI-PLC, o un constructo que codifica la misma. En otra modalidad, una secuencia senal de una protema de Listeria secretada, tal como hemolisina o fosfolipasa, se funde al gen que codifica el antfgeno. En otra modalidad, el constructo se encuentra en la cepa de Listeria de forma episomal. En otra modalidad, el antfgeno se expresa a partir de un vector hospedado por la cepa de Listeria recombinante.
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En otras modalidades, uno de varios promotores se usa para expresar el antfgeno o protema de fusion que contiene el mismo. En una modalidad, se usa un promotor de LM, por ejemplo, promotores para los genes hly, acta, pica, plcB y mpl, que codifican las protemas de Listeria hemolisina, act A, fosfolipasa espedfica por fosfotidilinositol, fosfolipasa C, y metaloproteasa, respectivamente.
Los paneles de antigenos son, en una modalidad, utiles en la inmunoterapia del cancer para compensar el hecho de que variantes del tumor que pierden el antigeno pueden crecer bajo la presion del sistema inmune (Zhang y otros, Clin cancer Res 1998 4: 2669; Kawashima y otros, Hum Immunol l998 59: 1).
En otra modalidad, las composiciones de la presente invencion usan un homologo de la secuencia de Her-2 o LLO de la presente invencion (por ejemplo, sec. con num. de ident.: 33, 34, 40, 41,43, y 44). Los terminos "homologfa," "homologo" etc, cuando hacen referencia a cualquier protema o peptido, se refieren en una modalidad, a un porcentaje de residuos de aminoacido en la secuencia candidata que son identicos a los residuos de un polipeptido nativo correspondiente, despues de alinear las secuencias e introducir las brechas, si fuera necesario, para alcanzar el maximo porcentaje de homologfa, y sin considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la secuencia de identidad. Los metodos y programas informaticos para el alineamiento se conocen bien en la tecnica.
En esta invencion, "homologfa" se refiere a la identidad de una secuencia seleccionada de las sec. con num. de ident.: 33, 34, 40, 41, 43, y 44 de mas del 97 %. En otra modalidad, la identidad es mayor que 98 % o mayor que 99 %. En otra modalidad, la identidad es 100 %.
La homologfa de la protema y/o el peptido por cualquier secuencia de aminoacidos enumerado en la presente descripcion se determina, en una modalidad, por metodos bien descritos en la tecnica, lo que incluye el analisis por inmunorevelado, o mediante analisis por algoritmos matematicos de las secuencias de aminoacidos, por medio de cualquier numero de paquetes de programas disponibles, mediante metodos establecidos. Algunos de estos paquetes pueden incluir paquetes fAsTA, BLAST, MPsrch o Scanps, y pueden emplear el uso de algoritmos de Smith y Waterman, y/o alineamientos globales/locales o BLOCKS para el analisis, por ejemplo.
La homologfa puede determinarse mediante la determinacion de la hibridacion de la secuencia candidata, cuyos metodos se describen bien en la tecnica (ver, por ejemplo, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook y otros, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y). Por ejemplo, los metodos de hibridacion pueden llevarse a cabo bajo condiciones moderadas a severas, al complemento de un ADN que codifica un peptido de caspasa nativa. Las condiciones de hibridacion son, por ejemplo, la incubacion durante la noche a 42 °C en una solucion que comprende: 10-20 % formamida, 5 X SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato trisodico), 50 mM fosfato sodico (pH 7. 6), 5 X solucion de Denhardt, 10 % sulfato de dextrano, y 20 pg/ml ADN de salmon desnaturalizado, cortado.
En una modalidad de la presente invencion, "acidos nucleicos" se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azucar-fosfato. El termino incluye, en una modalidad, ADN y ARN. "Nucleotidos" se refiere, en una modalidad, a las unidades monomerica de polfmeros de acidos nucleicos. El ARN puede estar, en una modalidad, en forma de un ARNt (ARN de transferencia), ARNnp (ARN nuclear pequeno), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN anti-sentido, ARN inhibidor pequeno (ARNip), micro aRn (miARN) y ribozimas. El uso de ARNip y miARN se ha descrito (Caudy AA y otros, Genes & Devel 16: 2491-96 y las referencias se citan en ellas). El ADN puede estar en forma de ADN de plasmido, ADN viral, ADN lineal, o ADN cromosomal o derivados de estos grupos. Adicionalmente, estas formas de ADN y ARN pueden ser de simple, doble, triple o cuadruple cadena. El termino ademas incluye, en otra modalidad, acidos nucleicos artificiales que pueden contener otros tipos de esqueletos pero las mismas bases. En una modalidad, el acido nucleico artificial es un PAN (peptido acido nucleico.). Los PAN contienen esqueletos de peptidos y bases nucleotidicas y son capaces de unirse, en una modalidad, a ambas moleculas de ADN y ARN. En otra modalidad, el nucleotido es oxetano modificado. En otra modalidad, el nucleotido se modifica para el reemplazo de uno o mas enlaces fosfodiester con un enlace fosforotioato. En otra modalidad, el acido nucleico artificial contiene cualquier otra variante del esqueleto fosfato de acidos nucleicos nativos conocidos en la tecnica. El uso de acidos nucleicos de fosfotiorato y PAN se conoce por aquellos con experiencia en la tecnica, y se describe en, por ejemplo, Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; y Raz NK y otros Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. La produccion y uso de acidos nucleicos se conoce por los expertos en la tecnica y se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed.
Los terminos "poner en contacto" o "administrar," en una modalidad, se refieren a poner en contacto directamente la celula de cancer o tumor con una composicion de la presente invencion. En otra modalidad, los terminos se refieren a poner en contacto indirectamente la celula de cancer o tumor con una composicion de la presente invencion. En otra modalidad, la presente invencion incluye tratamientos en los cuales el sujeto se pone en contacto con una composicion de la presente invencion despues de lo que la composicion se pone en contacto con la celula de cancer
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o tumor por difusion o por cualquier otro proceso de transporte activo o de transporte pasivo conocido en la tecnica por el cual los compuestos circulan dentro del cuerpo.
Composiciones farmaceuticas
En otra modalidad, las composiciones farmaceuticas que contienen vacunas y las composiciones de la presente invencion pueden formularse para administrate a un sujeto por cualquier ruta conocida por una persona con experiencia en la tecnica, tal como por via parenteral, paracanceral, transmucosa, transdermica, intramuscular, intravenosa, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal, intravaginal o intratumoral.
En otra modalidad de la presente invencion, las vacunas o composiciones son para administrar por via oral, y por lo tanto se formulan de una manera adecuada para la administracion oral, es decir, como una preparacion solida o lfquida. Las formulaciones orales solidas adecuadas incluyen tabletas, capsulas, pfldoras, granulos, bolitas y similares. Las formulaciones orales lfquidas adecuadas incluyen, soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En otra modalidad de la presente invencion, el ingrediente activo se formula en una capsula. De acuerdo con esta modalidad, las composiciones de la presente invencion comprenden, ademas del compuesto activo y el portador o diluyente inerte, una capsula de gelatina dura.
En otra modalidad, las vacunas o composiciones se administran por inyeccion intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparacion lfquida. Las formulaciones lfquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las composiciones farmaceuticas son para administrar por via intravenosa y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administracion intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmaceuticas son para administrar por via intraarterial y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administracion intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmaceuticas son para administrar por via intramuscular y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administracion intramuscular.
En una modalidad, el termino "tratar" se refiere a curar una enfermedad. En otra modalidad, "tratar" se refiere a prevenir una enfermedad. En otra modalidad, "tratar" se refiere a reducir la incidencia de una enfermedad. En otra modalidad, "tratar" se refiere a mejorar los smtomas de una enfermedad. En otra modalidad, "tratar" se refiere a inducir la remision. En otra modalidad, "tratar" se refiere a ralentizar la progresion de una enfermedad. Los terminos "reducir", "suprimir" e "inhibir" se refieren en otra modalidad a la disminuir o reducir.
Dado que los siguientes ejemplos no se relacionan a un polipeptido recombinante que comprende el fragmento N- terminal de la protema LLO fusionado a un fragmento de un antigeno de Her-2, para inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2, estos son ejemplos comparativos.
SECCION DE DETALLES EXPERIMENTALES
EJEMPLO 1
GENERACION DE CEPAS DE L. MONOCYTOGENES QUE SECRETAN FRAGMENTOS DE LLO FUSIONADOS A FRAGMENTOS DE HER-2
MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Subclonacion
pGG-55, el esqueleto del constructo Her-2 de Listeria usado en los Ejemplos, se creo a partir de pAM401. pAM401, un vector lanzadera capaz de replicarse tanto en bacterias gram+ como gram-, contiene un gen de resistencia a cloranfenicol de gram+ y un gen de resistencia a tetraciclina de gram- (Wirth, R y otros, J Bacteriol, 165: 831, 1986). Para producir pGG-55, un gen de fusion hly- HPV 16 E7 (que incluye el promotor hly y la porcion de hly que codifica los primeros 441 aminoacidos de LLO; denominada mas abajo como "ALLO") y el gen del factor de transcripcion pluripotente, prfa (factor regulatorio positivo de la expresion de listeriolisina ) se clonaron en pAM401 (Figura 1).
Cada cepa de L. monocytogenes (LM) Lm-ALLO-EC1, Lm-ALLO-EC2, Lm-ALLO-EC3, Lm-ALLO-IC1, y Lm-ALLO- IC2 contiene un plasmido que expresa un fragmento de Her-2 de rata fusionado al gen Listerial hly. Los siguientes fragmentos superpuestos de los dominios extracelular e intracelular de Her-2 se clonan en el plasmido pGG-55: pares de bases (pb) 74-994, (Lm-ALLO-EC1; que corresponden a los AA 20-326 de Her-2), 923-1519 (Lm-ALLO- EC2; que corresponden a los AA 303-501), 1451-1981 (Lm-ALLO-EC3; que corresponden a los AA 479-655), 20843259 (Lm-ALLO-IC1; que corresponden a los AA 690-1081), y 3073-3796 (Lm-ALLO-IC2; que corresponden a los AA 1020-1255). Los fragmentos se representan en la Figura 2A. Las LD50 de EC1, EC2, EC3, IC1, y 1C2 fueron 1 x 108, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, y 1 x 108, respectivamente.
Cada fragmento de Her-2 se amplifico por PCR a partir del plasmido pNINA, que contiene el gen Her-2 de rata de
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longitud completa, mediante el uso de los siguientes iniciadores. Los sitios de restriccion (XhoI en el caso de los iniciadores 5' de EC1, IC1, y IC2 ; Spel para los iniciadores 3'; y SalI para los iniciadores 5' de EC2 y EC3) se subrayan, y la secuencia etiqueta FLAG en EC2 y EC3 los iniciadores 3' se indican por cursiva:
EC1: iniciador 5': CACGCGGATGAAATCGATAAGCTCGAGCCCCCCGGAATCGCGGGCAC (sec. con num. de ident.: 1); iniciador 3': CCGGACTAGTGACCTCTTGGTTATTCGGGGGACACACC (sec. con num. de ident.: 2).
EC2: iniciador 5': CCGGGTCGACTGCCCCTACAACTACCTGTCTACG (sec. con num. de ident.: 3); iniciador 3': CCGGACTAGTTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCCCAC TGTGGAGCAGGGCCTG (sec. con num. de ident.: 4);
EC3: iniciador 5': CCGGGTCGACTGCTTTGTACACACTGTACCTTGG (sec. con num. de ident.: 5); iniciador 3': CCGGACTAGTTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCC GGGCTGGCTCTCTGCTCTGC (sec. con num. de ident.: 6);
IC1 : iniciador 5': CCGGCTCGAGTATACGATGCGTAGGCTGCTGCAGG (sec. con num. de ident.: 7); 3' primer: CCGGACTAGTAGCCAGTGGAGATCTGGGGGGCCC (sec. con num. de ident.: 8); |C2: iniciador 5':
CCGGCTCGAGGGTGACCTGGTAGACGCTGAAG (sec. con num. de ident.: 9) Y iniciador 3':
CCGGACTAGTTACAGGTACATCCAGGCCTAGG (sec. con num. de ident.: 10).
Los fragmentos se amplificaron por PCR y se clonaron en el sistema de expresion pCR 2,1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), y despues se cortaron con las enzimas delineadas. El gen E7 se corto del plasmido pGG-55 mediante el uso de Xho I y Spe I, despues el fragmento Her-2 se fusiono y se ligo en el sitio E7 (los extremos digeridos por Sal I son compatibles con los extremos XhoI). XFL-7, una cepa de LM negativa a prfA (Gunn GR y otros, J Immunol 167: 647, 2001) se transfecto con los plasmidos por electroporacion.
Bacterias
Las bacterias se cultivaron en medio de infusion cerebro corazon (BD, Sparks, MD) con 50 pg/ml de cloranfenicol y se congelaron en alfcuotas de 1 ml a -80°C.
Transferencia de tipo Western
Las cepas que expresan ALLO-Her-2 crecieron durante la noche a 37°C en medio Luria-Bertani (LB) con 50 microgramos por mililitro (pg/ml) de cloranfenicol. Los sobrenadantes se precipitaron con TCA y se resuspendieron en amortiguador de muestra 1X LDS (Invitrogen, San Diego, CA). 15 microlitros (pl) de cada muestra se cargaron en un gel 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen, San Diego, CA). Los geles se transfirieron a una membrana Immobilon-P de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA) y se revelaron con un suero policlonal de conejo que reconoce los residuos 1-30 de LLO, seguido por un anticuerpo anti-conejo conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech, UK).
Analisis estadistico
El analisis estadistico se realizo por medio de la prueba de Studen a lo largo de los Ejemplos.
Resultados
Se construyeron cinco cepas de LM recombinantes que expresan y secretan fragmentos superpuestos del gen de Her-2 de rata fusionado a la porcion N-terminal de la protema LLO de L monocytogenes (Figura 2A). La secuencia senal y el dominio de transmembrana de Her-2 no se incluyeron dentro de los fragmentos debido a su hidrofobicidad y la incapacidad de LM de secretar dominios extremadamente hidrofobicos. La secrecion de cada fragmento de Her- 2 se confirmo por transferencia de tipo Western (Figura 2B). Los pesos moleculares de las protemas Lm-ALLO-EC1 Lm-ALLO-EC2 Lm-ALLO-EC3, Lm-ALLO-IC1, y Lm-ALLO-IC2 fueron 83, 70, 68, 92,5, y 74-kDa (kilodalton), respectivamente. Las cepas estaban atenuadas en relacion a la cepa silvestre 10403S, exhibieron virulencias
1 1 Q Q q 1 Q Q
comparables a Lm-ALLO-E7; espedficamente 1x10 , 5x10 , 1x10 , 1x10 , y 1x10 unidades formadoras de colonias (UFC), respectivamente.
EJEMPLO 2
LA VACUNACION CON CONSTRUCTOS LLO-HER-2 DETIENE Y REVIERTE EL CRECIMIENTO DE TUMORES QUE EXPRESAN HER-2
MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Ratones
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Ratones FVB/N hembras de seis a ocho semanas se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Lineas celulares
La lmea celular de tumor NT-2 singenica para FVB/N, derivada de tumores mamarios que se producen espontaneamente en un raton FVB/N transgenico para Her-2 (Reilly RT y otros, Canc Res 60: 3569, 2000), expresa constitutivamente niveles bajos de Her-2 de rata y es tumorigenica en ratones singenicos silvestres. Las celulas NT- 2 se cultivaron en medio RPMI 1640 con 20 % de FCS, 10,2 mM de HEPES, 2 milimolar (mM) de L-glutamina, 100 micromolar (jM) de aminoacidos no esenciales, 1 mM de piruvato sodico, 50 U (unidades)/ml de penicilina G, 50 |jg/ml de estreptomicina, 20 jg/ml de insulina, y 2 jg/ml de gentamicina a 37° C con 5 % de CO2.
Condiciones Experimentales
Ratones FVB/N de 6-8 semanas (n=8) se inyectaron subcutaneamente en el flanco derecho con 2 x 106 celulas tumorales NT-2 en 200 jl de PBS. Siete dfas despues de la inoculacion del tumor, se observaron tumores palpables de 4-5 mm, despues de lo cual los ratones se inyectaron por via intraperitoneal con LM recombinante o PBS en los dfas 7, 14, y 21. El diametro de superficie mas corto y mas largo de los tumores se midio cada 2 dfas con el calibrador. Los ratones se sacrificaron si alcanzaban el punto en el cual el diametro medio del tumor alcanzaba los 20 mm.
Resultados
Las cepas de LM que expresan fusiones ALLO-Her-2 se compararon al PBS y a Lm-ALLO-E7 (controles negativos) por su capacidad de inducir inmunidad contra y la reduccion de tumores compuestos por la lmea tumoral de rata que expresa Her-2, NT-2. Los ratones FVB/N se inyectaron con tumores NT-2, y despues, en los dfas 7, 14, y 21 posteriores a la inoculacion del tumor, se administraron 0,1 LD50 de LM recombinante o PBS. La inyeccion de LM que expresa las fusiones ALLO-Her-2 detuvo el crecimiento tumoral despues de la primera inyeccion (Figuras 2A y B); la detencion del crecimiento tumoral continuo hasta el ultimo momento, mas de nueve semanas despues de la ultima vacunacion con Her-2. Ademas, se observo posteriormente una regresion completa del tumor en tres de 8 de los ratones Lm-ALLO-EC2 y Lm-ALLO-EC3 y 1 de 8 de los ratones Lm-ALLO-EC1 y Lm-ALLO-IC1. Ratones adicionales a los cinco grupos ALLO-Her-2 exhibieron una reduccion en el tamano tumoral. Como se esperaba, los tumores crecieron continuamente en los ratones inyectados con PBS y Lm-ALLO-E7.
Estos descubrimientos demostraron que las fusiones de un fragmento LLO a Her-2 son capaces de provocar inmunidad contra tumores que expresan Her-2. Estos descubrimientos indican, ademas, que la inmunidad provocada (a) es suficientemente fuerte para inducir la regresion completa de mas del 75 % de los tumores que expresan Her-2 establecidos; y (b) dura mas del curso de al menos varios meses.
EJEMPLO 3
LA RESPUESTA INMUNE INDUCIDA POR LA VACUNA LM-LLO-HER-2 INCLUYE CELULAS T CD8+ MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Reduccion de celula T CD8+
Las celulas T CD8+ se redujeron por la inyeccion con 0,5 mg del anticuerpo anti-CD8 2,43 (Sarmiento M y otros, J Immunol 125(6): 2665-72, 1980) en los dfas 6, 7, 8, 11, 14, 17, 20, y 23 despues de la inyeccion del tumor. Las poblaciones de celulas T CD8+ se redujeron en mas del 95 % segun se midio por el analisis de citometna de flujo en el dfa 24.
Analisis citometrico de flujo
Se realizo citometna de flujo de tres colores para CD8 (53-6,7, conjugado a FITC ), ligando CD62 (Mel-14, conjugado a APC) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), y tetramero Her-2 H-2q (conjugado a PE) mediante el uso del citometro de flujo FACSCalibur con el programa CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Los tetrameros, proporcionados por la NIAID Tetramer Core Facility de la Universidad de Emory y el NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, se cargaron con un peptido PDSLRDLSVF espedfico de H-2q. Los esplenocitos se tineron a temperatura ambiente (ta) con el tetramero durante una hora (hr) a la dilucion 1:200, despues a 4° C con los anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L durante 30 minutos (min). El subconjunto CD8+, CD62Linferior se selecciono ("encerro"), y los porcentajes de celulas tetramero+ se compararon mediante el uso del programa FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
Resultados
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Para determinar el tipo de celula T que mediaba las respuestas inmunes anti-Her-2 observadas, las celulas T CD8+ de los ratones FVB/N con tumores NT-2 se redujeron, lo que comenzo 1 d^a antes de la vacunacion con vacunas Lm-ALLO-Her-2, y despues se vacunaron como se describio en el Ejemplo 2. En los ratones CD8+ inyectados, cada una de las vacunas Lm-ALLO-Her-2 perdio eficacia (Figuras 3A y B); mientras que en los ratones no-reducidos, el crecimiento del tumor se controlo, como se observo en el Ejemplo 2.
El analisis de tetrameros se uso a continuacion para confirmar los resultados anteriores. Ratones FVB/N de 6-8 semanas que no portaban tumor se inmunizaron ya sea con PBS o 0,1 LD50 Lm-ALLO-EC2 y se reactivaron 21 dfas mas tarde. Los esplenocitos se recolectaron 5 dfas despues de la reactivacion y se tineron con un tetramero H-2q espedfico por el epftopo definido por los aminoacidos 420-429 (PDSLRDLVF). Se observo un aumento de tres veces en las celulas positivas para el tetramero en los ratones vacunados con Lm-ALLO-EC2 (Figura 5).
Estos resultados muestran que las celulas T CD8+participan en la inmunidad provocada por las vacunas de fusion LLO-Her-2.
EJEMPLO 4
LAS VACUNAS DE FUSION LLO-HER-2 INDUCEN RESPUESTAS INMUNES CONTRA EPITOPOS SUBDOMINANTES DE LAS CELULAS T CD8+
MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Celulas
Las celulas NIH 3T3, una lmea de fibroblastos de raton, se obtuvieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Las NIH 3T3 y todas las celulas derivadas se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % de FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 pM de aminoacidos no esenciales, 1 mM de piruvato sodico, 50 U/ml de penicilina G, y 50 pg/ml de estreptomicina. El medio de cultivo para las lmeas 3T3-neu se complemento con 1 mg/ml de G418. Las celulas se cultivaron a 37° C con 5 % de CO2.
L'meas 3T3-Her-2
En resumen, las celulas 3T3 silvestres se transdujeron con fragmentos superpuestos del gen Her-2 de rata, lo que creo nueve lmeas 3T3 fragmento Her-2, y una lmea 3T3 que expresa el Her-2 de rata de longitud completa. Los fragmentos Her-2 se crearon mediante el uso de los siguientes iniciadores de PCR:
Fragmento 1 (pb 1-508): 5'-CCGGGCCGAATTCGCAATGATC (sec. con num. de ident.: 11) y 3'- CCCCGAATTCCTACTGAGGGTTCCCACGGATCAA (sec. con num. de ident.: 12).
Fragmento 2 (pb 458-886): 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTAGTCTCACAGAGATCCTGAAG (sec. con num. de ident.: 13) y 3'-CCCCGAATTCCTACTCAGGGTTGTGCATGGACTC (sec. con num. de ident.: 14).
Fragmento 3 (pb 836-1294): 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTGCCCTCGTCACCTACAACACA (sec. con num. de ident.: 15) y 3'-CCCCGAATTCCTAGAGGTCACGGAGACTGTCTGG (sec. con num. de ident.: 16).
Fragmento 4 (pb 1244-1675): 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTATCACAGGTTACCTGTACATC (sec. con num. de ident.: 17) y 3'-CCCCGAATTCCTACTTCCATACTCGGCACTCCTC (sec. con num. de ident.: 18).
Fragmento 5 (pb 1607-2077): 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTACCCAGTGTGTCAACTGCAGT (sec. con num. de ident.: 19) y 3'-CCCCGGTACCCTAGATCTTCTGTCTCCTTCGTTT (sec. con num. de ident.: 20).
Fragmento 6 (pb 2009-2476): 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTGGCGTCCTGCTGTTCCTGATC (sec. con num. de ident.: 21) y 3'-CCCCGGTACCCTAACCTCGGTGTTCTCGGACATG (sec. con num. de ident.: 22).
Fragmento 7 (pb 2405-2872), 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTTCCACAGTACAGCTGGTGACA (sec. con num. de ident.: 23) y 3'-CCCCGGTACCCTAGCAGATTGGAGGCTGAGGTAG (sec. con num. de ident.: 24).
Fragmento 8 (pb 2801-3271), 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTGATGGAATCCCAGCCCGGGAG (sec. con num. de ident.: 25) y 3'-CCCCGGTACCCTACCCTTCCGAGGGAGCCAGTGG (sec. con num. de ident.: 26).
Fragmento 9 (pb 3203-3796), 5'-GACATGAAGTTGCGGCTCCCTGAGCTGACACTGGGCCTGGAG (sec. con num. de ident.: 27) y 3'-CCCCGGTACCCTATACAGGTACATCCAGGCCTAG (sec. con num. de ident.: 28).
Fragmentos 1-9 abarcan los aminoacidos 1-165, 148-291,274-426, 410-553, 531-687, 655-820, 797-952, 929-1085;
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1063-1255 de Her-2, respectivamente. Cada fragmento se ligo dentro del vector de transfeccion de mairftferos pcADN3.1, que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV) (Invitrogen, Carlsbad, CA), en el sitio de multiclonacion. Los constructos se transfectaros en las celulas 3T3 mediante el uso de electroporacion. (20 pg/1 x 107 celulas) o Lipofectamina (1,5 pg/3 x 105 celulas; Life Technologies). Se aislaron varios clones para cada fragmento por dilucion limitante. La expresion de los fragmentos Her-2 en los clones se determino por RT-PCR.
Ensayo de liberacion de cromo
Los ratones FVB/N se inmunizaron con 0,1 LD50 de cada una de las vacunas Lm-ALLO-Her-2. Los esplenocitos se recolectaron 9 dfas mas tarde y se cultivaron por cuatro dfas con celulas tumorales NT-2 irradiadas (20.000 rads) en una relacion 100:1 de esplenocitos a celulas tumorales con 20 U/ml de IL-2 (Roche, Indianapolis, IN). Los esplenocitos se usaron despues como celulas efectoras en un ensayo de liberacion de cromo 51estandar. Las celulas objetivo se marcaron con cromo 51 (Cr51) y se cultivaron cuatro por dfas con los esplenocitos a relaciones efector:objetivo de 200:1, 100:1, 50:1, y 25:1 por triplicado. A continuacion de la incubacion, 100 pl de sobrenadante se ensayaron para la liberacion de Cr51. El porcentaje de lisis espedfica se determino como [(conteos experimentales por minuto -conteos espontaneos por minuto)/(conteos totales por minuto - conteos espontaneos por minuto)] x 100. "Conteos totales por minuto" se refiere al numero total de conteos en la poblacion celular objetivo,
me5d1idos al lisar las celulas despues del marcaje y el conteo del marcador. En otras palabras, esta es la cantidad de
Cr maxima que puede liberarse.
Resultados
Los ensayos de CTL se realizaron para confirmar que cada una de las vacunas Lm-ALLO-Her-2 provocan respuestas inmunes de celula T CD8+ anti-Her-2 . Los ratones se vacunaron con cada una de las vacunas de fusion ALLO-Her-2, y los esplenocitos se aislaron y probaron por la capacidad de inducir la lisis, medida por el ensayo de liberacion de Cr51, de celulas 3T3 transducidas con el Her-2 de longitud completa de rata (B), mediante el uso de celulas 3T3 silvestres como un control negativo (A). Cada vacuna indujo una respuesta CTL anti-Her-2 CTL, como se evidencio por los niveles significativos de lisis a las relaciones E:O de 200:1 o 100:1. Los esplenocitos de ratones vacunados con PBS, un control negativo adicional, indujeron solamente niveles de fondo de lisis (Figura 6). Estos descubrimientos proporcionan evidencia adicional de que las vacunas de fusion ALLO-Her-2 inducen respuestas inmunes CTL anti-Her-2.
Para delinear los epftopos reconocidos por los CTL provocados por cada vacuna, se uso un panel de celulas 3T3 que expresan cada uno de los 9 fragmentos de Her-2 como celulas objetivo en el ensayo de lisis descrito anteriormente, a continuacion de la vacunacion con la vacuna de fusion ALLO-Her-2 correspondiente. Cada vacuna provoco una respuesta CTL para al menos un fragmento Her-2. Para varios de los fragmentos Her-2, los niveles de lisis sobre el fondo alcanzaron significacion estadfstica.< 0,05). Basado en una combinacion de resultados negativos y positivos, se delinearon las regiones de Her-2 que contienen epftopos subdominantes (Table 1). Asf, la vacunacion con las vacunas de Lm-ALLO-fragmentos de Her-2 revelaron epftopos subdominantes dentro de la protema Her-2.
Tabla 1 Las regiones de Her-2/neu con epftopos H-2q potenciales, basados en el porcentaje de lisis espedfica en el ensayo de CTL. El porcentaje (lisis espedfica - lisis de fondo de esplenocitos de ratones vacunados con PBS) se muestra para las relaciones E:O de 200:1 y 100:1. Los ensayos se realizaron por triplicado, se muestran los resultados de experimentos representativos. *Indica lisis estadfsticamente significativa por encima del fondo (p < 0,05).
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- Cepa LM
- Region Neu abarcada Porcentaje de lisis espedfica de las celulas objetivo Regiones Neu que contienen un epttopo
- 200:1 100:1
- Lm-ALLO-EC1
- 20-326 3T3-neu-1 14,3* 0,7 20-148
- 3T3-neu-2 0 0
- 3T3-neu-3 6,5* 3,5 291-326
- Lm-ALLO-EC2
- 303-501 3T3-neu-3 10,9* 7,4 303-426
- 3T3-neu-4 23,8* 00 4*. * 410-501
- Lm-ALLO-EC3
- 479-655 3T3-neu-4 1 0
- 3T3-neu-5 34,4* 25,3* 531-655
- Lm-ALLO-IC1
- 690-1081 3T3-neu-6 6,9* 9* 690-797
- 3T3-neu-7 0 2,3
- 3T3-neu-8 18,2* 6,4 952-1081
- Lm-ALLO-IC2
- 1020-1255 3T3-neu-8 10,3* * CM co~ 1020-1085
- 3T3-neu-9 16,5 0 1063-1255
EJEMPLO 5
LA FUSION A LLO Y ENTREGA POR LM MEJORA LA INMUNOGENICIDAD DE HER-2 MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Vacunas de ADN
Las vacunas de ADN se construyeron mediante el uso de pcADN 3.1. Her-2 y el fragmento de EC1 se amplificaron por PCR mediante el uso de los siguientes iniciadores:
Her-2 de longitud total, no fusionado Her-2: 5' CCGGGCTAGCATGGTCATCATGGAGCTGGCCGG (sitio Nhe I subrayado; sec. con num. de ident.: 29) y 3'
CCGGGATATC TTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCATACAGGTACATCCA GGCC (sitio EcoRV site subrayado, etiqueta FLAG en cursiva, codon de terminacion en negrita; sec. con num. de ident.: 30). Los iniciadores 5' anteriores, ademas, se usaron para amplificar EC1 no fusionado, el iniciador 3' para amplificar ALLO - Her-2 de longitud completa.
ALLO-Her-2 de longitud completa: 5'CCGGGTCGACATGGTCATCATGGAGCTGGCCGG sitio (Sal I subrayado; sec. con num. de ident.: 31). Este iniciador se uso ademas para amplificar ALLO-EC1.
EC1 no fusionado: 3' CCGGGATATCTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCAGACCTCTTGGTTAT TCGGGGG (sitio EcoRV subrayado, etiqueta FLAG en cursiva, codon de terminacion en negrita; (sec. con num. de ident.: 32). Este iniciador se uso ademas para amplificar el EC1 no fusionado a ALLO.
Los fragmentos se clonaron en el sitio de multiclonacion de pcADN3.1, y se usaron para transformar Escherichia coli. Las bacterias se cultivaron en medio Luria-Bertani (BD, Sparks, MD) con 50 microgramos por mililitro (pg/ml) de ampicilina.
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Experimentos de regresion del tumor
Los experimentos de regresion del tumor se realizaron como se describio en el Ejemplo 2, excepto que se usaron 7 x 105 celulas NT-2, y las vacunaciones se administraron en los dfas 3, 10, y 18. Las vacunas de ADN (50 |jg de cada pcADN plasmido + y el plasmido GM-CSF o el GM-CSF solo) se administraron por via intramuscular y Lm se administro por via intraperitoneal.
Resultados
Varios factores estuvieron presentes en las vacunas Lm-ALLO-Her-2 que pueden haber contribuido al reconocimiento de epftopos subdominantes: (a) la entrega por LM; (b) la fusion del antfgeno objetivo a ALLO; (c) la ruptura de Her-2 en fragmentos. Para determinar cual o cuales de estos factores contribuyeron al reconocimiento de los epftopos subdominantes, como se evidencio por las respuestas inmunes anti-Her-2 mejoradas, los ratones se vacunaron con (a) pcADN3.1-Her-2 de longitud completa (una vacuna de ADN; "pcADN neu"); (b) pcADN 3.1 ALLO- Her-2 de longitud completa (pcADN LLO-neu); (c) pcADN 3.1-EC1 (pcADN EC1); (d) pcADN 3.1-ALLO-EC1 (pcADN LLO-EC1); o (e) Lm-ALLO-ECI, y se realizo un experimento de regresion del tumor. El GM-CSF se incluyo con las vacunas de ADN por su capacidad para mejorar la eficacia de las vacunas de ADN (McKay PF, Barouch DH y otros, Eur J Immunol 2004 abril;34(4): 1011-20.).
Como se representa en la Figura 7A, el mejor control del crecimiento tumoral se observo con Lm-ALLO-EC1; 2/8 de los ratones nunca desarrollaron tumores palpables; los tumores regresaron completamente en otros dos; y los otros cuatro ratones exhibieron un crecimiento tumoral mas lento (retardado) que los ratones controles falsamente vacunados. En el caso de pcADN ALLO-EC1, un raton nunca desarrollo un tumor, y varios de los otros ratones exhibieron un crecimiento tumoral retardado. La fusion a ALLO mejoro la inmunogenicidad de EC1, como se observo por la comparacion de pcADN EC1 vs. pcADN ALLO-EC1 y pcADN neu vs. pcADN ALLO-neu (Figuras 6B-C); las vacunas en las cuales el antfgeno no estaba fusionado exhibieron tumores que crecieron a la misma velocidad que los controles falsamente vacunados. Un efecto potenciador por la division de Her-2 en fragmentos mas pequenos, en el caso de las fusiones ALLO, se observa por la comparacion de pcADN ALLO-neu vs. pcADN ALLO-EC1, en la cual el ultimo grupo exhibio un control del tumor superior (Figura 7D). No se observo ningun efecto para los antfgenos no fusionados, segun se observa a partir de una comparacion de pcADN neu vs. pcADN EC1 (Figura 7E).
EJEMPLO 6
LAS VACUNAS DE ADN LLO-HER-2 INDUCEN RESPUESTAS INMUNES CONTRA EPITOPOS SUBDOMINANTES DE CELULAS T CD?*
Las respuestas inmunes a las vacunas de ADN se analizaron, ademas, mediante la medicion de la lisis de las celulas 3T3 transducidas con fragmentos Her-2, como se describe en el Ejemplo 4. Las celulas T de ratones vacunados con pcADN 3.1-ALLO-Her-2 o pcADN 3.1-ALLO-EC1 lisaron las celulas a partir de mas grupos de celulas objetivo 3T3-Her-2 de lo que lo hicieron las vacunas de ADN no fusionadas correspondientes (Tabla 2).
Tabla 2.Las regiones de Her-2/neu con epftopos potenciales en base a las vacunaciones de ADN de ratones FVB silvestres. * indica lisis estadfsticamente significativa por encima del fondo (p < 0,05). El porcentaje de lisis espedfica se calculo como % = 100 x ((lisis experimental - lisis espontanea)/(lisis total - lisis espontanea)).
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- Cepa LM
- Region Neu Porcentaje de lisis espedfica de las Regiones Neu que
- abarcada celulas objetivo 200:1 100:1 contienen un epttopo
- pcADN neu + GM- CSF
- 1-1255 3T3-neu-1 17,4* 12,4* 20-148
- 3T3-neu-2 0 0,1
- 3T3-neu-3 0 1,6
- 3T3-neu-4 23,4* 19,5* 410-479
- 3T3-neu-5 0 0,3
- 3T3-neu-6 2,6 0
- 3T3-neu-7 0 0,6
- 3T3-neu-8 0 1,2
- 3T3-neu-9 0 0,1
- pcADN ALLO-neu + GM-CSF
- 1-1255 3T3-neu-1 30,9* 20,5* 20-148
- 3T3-neu-2 0,4 0
- 3T3-neu-3 1,9 1,7
- 3T3-neu-4 31,2* 25,5* 410-501
- 3T3-neu-5 6,4* 6,4 479-531
- 3T3-neu-6 0 0
- 3T3-neu-7 0 2,5
- 3T3-neu-8 0 4
- 3T3-neu-9 21* 15,8* 1085-1255
- pcADN EC1 + GM-CSF
- 1-326 3T3-neu-1 7,8 1,9
- 3T3-neu-2 0 2,1
- 3T3-neu-3 8,5* 0 291-326
- pcADN ALLO-EC1 + GM-CSF
- 1-326 3T3-neu-1 14,6* 8,5* 20-148
- 3T3-neu-2 0 0,5
- 3T3-neu-3 9,9* 5,1 291-326
Asf, la fusion de un fragmento LLO a Her-2 de longitud completa o un fragmento de Her-2 resulto en una ampliacion de las regiones reconocidas por los CTLs. En consecuencia, en base a los resultados de los Ejemplos 5-6, epftopos subdominantes de antfgenos CD8+pueden revelarse ya sea por (a) la expresion por LM; (b) la fusion del antigeno a un fragmento LLO; o (c) la division del antigeno en fragmentos mas pequenos.
EJEMPLO 7
LA VACUNACION CON LLO-HER-2 INDUCE LA EXTENSION DE EPITOPOS. MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES.
FVB/N se inyectan con tumores NT-2, y despues se vacunaron con cada una de las cepas de LM-ALLO-fragmento de Her-2, como se describio en el Ejemplo 2, o con vacunas de ADN ALLO-fragmento de Her-2, como se describio en el Ejemplo 5. Los linfocitos se aislaron de los ganglios linfaticos del sitio tumoral en varios momentos despues de la vacunacion. Los epftopos reconocidos por los linfocitos se determinan por un ensayo de lisis, mediante el uso de celulas 3T3 que expresan cada uno de los 9 fragmentos de Her-2, como se describio en el Ejemplo 4.
Resultados
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La induccion de la regresion del tumor mas de un mes despues de la reactivacion final contrasta con observaciones mediante el uso de otros tipos de vacunas, y sugiere que el numero de celulas T se expande por extension de epftopos. Por ejemplo, las celulas presentadoras de antigeno como las celulas dendrfticas pueden adquirir piezas de las celulas que mueren, viajar a los ganglios linfaticos, y presentar epftopos de Her-2 que no estan presentes en el fragmento de vacuna, lo que resulta en una ampliacion de la respuesta de las celulas T CD8+ contra el Her-2. Para confirmar esta conclusion, los ratones se inyectaron con tumores NT-2, y despues se vacunaron con cada una de las cepas de LM-ALLO-fragmento de Her-2 o vacunas de ADN ALLO-fragmento de Her-2. Los linfocitos se afslan de los ganglios linfaticos del tumor en varios momentos, y se determinan los epftopos reconocidos por los linfocitos. Se observa la aparicion de reactividad a epftopos que no estan presentes en el fragmento de la vacuna. La ampliacion de la respuesta de celulas T correlaciona aproximadamente con la regresion temporal del tumor.
Este resultado demuestra que la vacunacion con LM que expresa el antfgeno recombinante induce la extension de epftopos. Adicionalmente, la vacunacion con fusiones LLO-antigeno, aun fuera del contexto de LM, induce tambien la extension de epftopos.
EJEMPLO 8
LA VACUNACION CON LLO-HER-2 SUPERA LA TOLERANCIA INMUNOLOGICA A UN ANTIGENO PROPIO MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
El Dr. William Muller proporciono los ratones transgenicos para Her-2/neu de rata. Ratones transgenicos HER-2/neu jovenes, vftgenes, que no desarrollaban espontaneamente tumores, se inyectaron con 5 x 104 celulas NT-2. Debido a que el raton transgenico es profundamente tolerante a HER-2/neu, la minima dosis requerida para el crecimiento tumoral en el 100 % de los animales es mucho mas baja que en los ratones silvestres (Reilly RT, Gottlieb MB y otros, Cancer Res. 2000 julio 1;60(13): 3569-76). Las celulas NT-2 se inyectaron en el espacio subcutaneo del flanco. Los ratones recibieron 0,1 LD50 de la vacuna de Listeria cuando se detectaron tumores palpables de 4-5 mm (tfpicamente el dfa 7 despues de la implantacion del tumor) y semanalmente despues de eso, por 4 semanas adicionales.
Resultados
El gen Her-2/neu de rata se diferencia del neu de rata en 5-6 % de los residuos de aminoacidos, y asf es inmunogenico en el raton (Nagata Y, Furugen R y otros, J Immunol. 159: 1336-43). Un raton transgenico que sobreexpresa Her-2/neu de rata bajo el control transcripcional del promotor y potenciador del virus de tumor mamario de raton (VTMR) es inmunologicamente tolerante al Her-2/neu de rata. Estos ratones desarrollan espontaneamente cancer de mama. El promotor VTMR opera tambien en celulas hematopoyeticas, lo que produce ratones profundamente tolerantes a HER-2/neu. Asf, este raton se considera un modelo severo para el cancer de mama humano y en general para tumores que expresan antfgenos, tal como Her-2/neu, que se expresan a bajos niveles en el tejido normal (Muller W. J. (1991) Expression of activated oncogenes in the murine mammary gland: transgenic models for human breast cancer. Canc Metastasis Rev 10: 217-27).
Los ratones transgenicos HER-2/neu de 6-8 semanas se inyectaron con celulas NT-2, y despues se inmunizaron con cada una de las vacunas LM-ALLO-Her-2, o con PBS o ALLO-E7 (controles negativos). Aunque la mayona de los ratones controles tuvieron que sacrificarse al dfa 42 debido a su carga tumoral, el crecimiento tumoral se controlo en todos los ratones vacunados (Figura 8).
Asf, las vacunas de Her-2 basadas en ALM-LLO-Her-2 y Listeria son capaces de romper la tolerancia a antfgenos propios expresados en celulas tumorales, como se evidencio por su habilidad de inducir la regresion de tumores NT- 2 establecidos.
EJEMPLO 9
LAS VACUNAS LLO-HER-2 CONTROLAN EL CRECIMIENTO ESPONTANEO DE TUMORES EN RATONES TRANSGENICOS HER-2/NEU
MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES
Las vacunas de ALM-LLO-Her-2 se administraron en las siguientes cantidades: Lm-LLO-EC1: 1 x 10 A 7 ufc; Lm- Lm-LLO-EC2: 5 x 10 a 7 ufc; LLO-EC3: 1 x 10 A8 ufc; Lm-LLO-IC2: 1 x 10 a 7 ufc; Lm-LLO-IC1: 1 x 10 a 7.
Resultados
Las vacunas de ALM-LLO-Her-2 se evaluaron, ademas, por su capacidad para prevenir el crecimiento tumoral espontaneo en los ratones transgenicos HER-2/neu. Los ratones transgenicos (n=12 por grupo de vacuna) se
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inmunizaron 5 veces con 0,1 LD50 de una de las cepas de vacuna, se comenzo a la edad de 6 semanas y se continuo una vez cada tres semanas. Los ratones se controlaron por la formacion de tumores en las glandulas mamarias. En la semana 35, todos los ratones controles (inmunizados con PBS o Lm-LLO-NY-ESO-1) hadan desarrollado tumores. En contraste, el 92 % del grupo Lm-LLO-ICI estaba libre de tumores, asf como el 50 % de los ratones Lm-LLO-EC2, Lm-LLO-ECI, y Lm-LLO-IC2, y el 25 % de los ratones inmunizados con Lm-LLO-EC3 (Figura 9).
Estos descubrimientos confirman los resultados del Ejemplo previo, que mostro que las vacunas de Her-2 basadas en ALM-LLO-Her-2 y Listeria son capaces de romper la tolerancia a antigenos propios.
EJEMPLO 10
GENERACION DE VACUNAS DE LLO-HER-2 QUE CONTIENEN FRAGMENTOS DE LA PROTEINA HER-2 HUMANA
Una estrategia similar a la usada para Her-2 de rata (Ejemplo 1) se uso para expresar Her-2/neu humana. El gen HER-2 de longitud completa se dividio en cinco fragmentos, que constituyen fragmentos superpuestos del dominio extracelular, (EC-1, EC-2 y EC-3) y el dominio citoplasmatico (IC-1 e IC-2) (Figura 10). Las regiones hidrofobicas no se incluyeron en el constructo. Estas secuencias se diferencian ligeramente de las secuencias de rata debido a pequenas diferencias entre las dos secuencias. Los fragmentos humanos correspondientes a los fragmentos de rata fueron 22-326, 303-501,479-652, 677-1081, y 1020-1255.
Las secuencias HER-2 humanas se aislaron a partir de lmeas de cancer de mama humanas, por ejemplo, SK-BR3 (ATCC) por PCR de transcripcion inversa (RT-PCR) mediante el uso de metodos estandar de biologfa molecular. Por ejemplo, el ARN celular total se aislo mediante el uso del estuche RNeasy Minipreparation® (Qiagen) y se genero un grupo de ADNc (Titan-One-Tube PCR system®, Roche) mediante el uso de un iniciador oligo-dT. Las secuencias de HER-2 de interes se amplificaron espedficamente por la PCR de la segunda etapa mediante el uso de los siguientes iniciadores:
- Constructo
- Iniciador 5' Iniciador 3'
- EC1
- ctcgaggccgcgagcacccaagtg (sec. con num. de ident.: 45) actagtttaatcctctgctgtcacctc (sec. con num. de ident.: 46)
- EC2
- ctcgagtacctttctacggacgtg (sec. con num. de ident.: 47) actagtttactctggccggttggcag (sec. con num. de ident.: 48)
- EC3
- ctcgagacggtgccctgggaccag (sec. con num. de ident.: 49) actagtttagacgatggacgtcagag (sec. con num. de ident.: 50)
- IC1
- ctcgagctgctgcaggaaacggag (sec. con num. de ident.: 51) actagtttaagccccttcggagggtg (sec. con num. de ident.: 52)
- IC2
- ctcgaggctgaggagtatctg (sec. con num. de ident.: 53) actagtttacactggcacgtccagac (sec. con num. de ident.: 54)
Se anaden sitios de restriccion de Xhol (5') y Spel (3') para permitir la clonacion posterior en el vector de la vacuna de Listeria, y se incluye un codon de parada ocre en los iniciadores inversos para terminar la traduccion de la protema de fusion. No hay secuencias Xhol o Spel localizadas en estos fragmentos del gen HER-2 humano. Los productos de la PCR se purifican (estuche Qiaquick® PCR Purification, Qiagen) y se clonaron en el vector intermedio de E. coli pCR2.1TOPO® (Invitrogen). Despues de la transformacion de celulas TOP 10 (Invitrogen), las colonias que contienen plasmido se identifican por PCR mediante el uso de los iniciadores M13directo y M13inverso (Invitrogen). Se cultiva un clon positivo para cada constructo, se prepara el ADN del plasmido (Qiafilter Midipreparation®, Qiagen) y se verifica la secuencia del inserto HER-2/neu por secuenciacion.
Para introducir las secuencias del antfgeno HER-2/neu en el vector de Listeria, pLLO-E7 se digiere completamente con XhoI y parcialmente con Spel, de ese modo se elimina el gen E7. Las secuencias HER-2/neu se digieren con las mismas enzimas, todo lo digerido se separa por electroforesis en gel de agarosa, y las secuencias del vector pLLO- E7 y del inserto HER-2/neu se purifican (Qiaquick). Las secuencias del antfgeno HER-2/neu se ligan en pLLO-E7, y
la mezcla de ligazon se transforma en la cepa de E. coli MB2159 deficiente en racemasa de d-alanina por electroporacion. Las colonias se prueban por PCR para la presencia de la secuencia HER-2/neu y se expanden en medio Luria Broth (LB), y el ADN del plasmido se prepara, y despues la secuencia se verifica por digestion de restriccion con EcoRI, Smal, Ncol o con HindIII que produce un patron de bandas espedfico para cada constructo. 5 Los plasmidos se transforman en la cepa de Listeria Lm(DA-) por electroporacion, y los clones individuales se cultivan en medio LB que contiene 50 pg/ml estreptomicina. La presencia y secuencia del plasmido se verifica nuevamente por analisis de restriccion. La expresion y secrecion de la protema de fusion LLO-HER-2/neu se verifica por transferencia de tipo Western del medio de cultivo precipitado con TCA, mediante el uso de un anticuerpo policlonal espedfico por la secuencia PEST.
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EJEMPLO 11
PRUEBA DE LAS VACUNAS DE LLO-HER-2 QUE CONTIENEN FRAGMENTOS DE LA PROTEINA HER-2 HUMANA.
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Las cepas LLO- Her-2 humanas se prueban para la inmunogenicidad en ratones y en voluntarios humanos. A continuacion, las cepas de vacuna se prueban por su capacidad de proteger ratones contra un reto con celulas tumorales que expresan Her-2 humana, como se describio en los Ejemplos anteriores. Las cepas exitosas se administran a los humanos que tienen tumores humanos que expresan Her-2, y se prueban para su capacidad de 20 inducir la regresion del tumor. Adicionalmente, las cepas se prueban para su capacidad de proteger a los sujetos humanos en riesgo de desarrollar cancer que expresan Her-2, debido a factores geneticos o ambientales. Se encontro que las cepas de vacunas eran inmunogenicas y exhibfan una actividad antitumoral sustancial.
Claims (13)
- 5101520253035404550Reivindicaciones1. Un polipeptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una protema de listeriolisina (LLO) fusionado a un fragmento de un antfgeno de Her-2,en donde el fragmento del antigeno de Her-2 consiste en los aminoacidos 303-501 o 479-655 de la sec. con num. de ident.: 40, o los aminoacidos 303-501 o 479-652 de la sec. con num. de ident.: 43, o una secuencia de aminoacidos mas de 97 % identica a ella, en donde dicha LLO comprende una secuencia PEST, yen donde dicho polipeptido recombinante es capaz de inducir la regresion de las celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
- 2. Una molecula de nucleotidos que codifica el polipeptido recombinante de la reivindicacion 1.
- 3. Una forma recombinante de Listeria que comprende la molecula de nucleotidos de la reivindicacion 2.
- 4. Una vacuna que comprende el polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, la molecula de nucleotidos de la reivindicacion 2, o la Listeria recombinante de la reivindicacion 3.
- 5. Una cepa recombinante de L. monocytogenes que expresa el polipeptido recombinante de la reivindicacion 1.
- 6. Un polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, o una forma recombinante de Listeria que comprende un polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, para su uso como un medicamento.
- 7. El polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, en donde las celulas T CD8+ median la regresion de las celulas tumorales establecidas que expresan Her-2.
- 8. El polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, en donde dicho polipeptido recombinante es capaz de inducir la regresion de celulas tumorales establecidas, mediada por una respuesta inmune a un epftopo subdominante de Her-2 de celulas T CD8+.
- 9. Uso del polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, o el nucleotido de la reivindicacion 2, o la Listeria de la reivindicacion 3, para la preparacion de una composicion farmaceutica para inducir la regresion de celulas tumorales establecidas que expresan Her-2 en un sujeto.
- 10. El uso de la reivindicacion 9, en donde el nucleotido recombinante o el polipeptido recombinante esta presente en la composicion farmaceutica en forma de una Listeria recombinante que comprende dicho nucleotido recombinante o dicho polipeptido recombinante.
- 11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde dicha composicion farmaceutica induce una respuesta inmune mediada por celulas T CD8+-contra las celulas tumorales que expresan Her-2.
- 12. El uso de la reivindicacion 11, en donde la respuesta inmune contra dichas celulas tumorales que expresan Her-2 comprende una respuesta inmune a un epftopo subdominante de la protema Her-2.
- 13. El polipeptido recombinante de la reivindicacion 1, o el nucleotido de la reivindicacion 2, o la Listeria de la reivindicacion 3, para usar en la induccion de la regresion de un tumor establecido que expresa Her-2 en un sujeto.
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