CN111349645B - 一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法。具体来说，本公开的方法包括将重组核酸分子插入质粒或表达载体中来构建重组质粒或重组表达载体的步骤，以及将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中来得到重组李斯特菌的步骤。本公开的方法通过对载体上LLO进行不同程度缺失突变，检测突变后疫苗的表达、溶血性及抗肿瘤效应，获得优化疫苗载体，进一步提高李斯特菌疫苗安全性。

Description

一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法
技术领域
本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种提高疫苗安全性的方法。更具体来说，本公开提供一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种革兰氏阳性的胞内寄生菌[1]，可在上皮细胞、单核细胞及吞噬细胞等内存活并繁殖。由于其独特的侵染过程因此能够同时诱导炎症反应和激活MHC I型和II型抗原呈递途径的组合，使得李斯特菌成为一个具有很大应用前景的疫苗载体[2-4]。
单增李斯特菌溶血素LLO(Listeriolysin O)是单增李斯特菌对数生长后期分泌的一种外毒素，隶属于胆固醇细胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysins-CDCs)。LLO由hly基因编码，分子量约为58kDa。单增李斯特菌已进化出多种相互协同作用的毒力因子，这些毒力因子可破坏宿主细胞的功能以逃避免疫系统攻击。LLO在单增李斯特菌从吞噬泡内逃逸至细胞质中至关重要，同时LLO在细菌侵袭入细胞的过程中也发挥作用，并且可介导宿主细胞凋亡等过程[5]。在结构上，LLO的N端有一个信号肽，并且N端含有的由27个氨基酸组成的PEST-like区域，LM通过该区域对LLO进行精确调控，以免LLO裂解宿主细胞，使得菌体暴露在宿主细胞免疫系统的监控下。LLO的中间有两个跨膜区TMH1和TMH2，在跨膜区有一个酸性结构域，这个酸性结构域起pH感受器的作用，因此LLO的活性是由pH调节的，在酸性pH条件下才会形成35nm的孔。C端还含有一个保守的胆固醇结合区域，当细菌处于吞噬体内酸性环境(pH约5.5)时，LLO由前体蛋白成熟并开始发挥对吞噬体特异性的膜穿孔活性[6]。相比CDCs家族其他成员，LLO独特的选择膜穿孔活性使得LM进入宿主细胞质，发生细胞毒作用[7]。
由于LLO独特的生物学功能，被广泛应用于疫苗和抗肿瘤药物中，如在携带蛋白质或DNA的脂质体载体疫苗、减毒疫苗、亚单位及DNA疫苗中均有涉及[8-11]。同样，在李斯特菌疫苗中，也往往使用LLO带动外源抗原的表达[12-15]。然而，由于LLO是一种溶血素，如能对LLO进行缺失突变改造，在保证外源抗原的表达同时提高安全性，对其之后在临床上肿瘤免疫治疗具有重要的意义。
现有李斯特菌疫苗往往采取LLO融合外源抗原实现外源抗原的表达，进而激活抗原特异性的免疫反应，然而LLO潜在的毒副作用使得李斯特菌疫苗的应用存在安全隐患。因此急需找到既降低LLO毒性又确保不影响外源抗原表达进而实现抗肿瘤效应的方法。
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发明内容
发明要解决的问题
本公开通过对非整合李斯特菌疫苗载体上LLO进行不同程度缺失突变改造，通过对比获得既保证抗肿瘤特性同时提高安全性的疫苗载体，解决了LLO本身的毒性问题，使得李斯特菌疫苗安全性进一步提高，为非整合减毒李斯特菌疫苗临床应用奠定基础。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其包括以下步骤：
(1)将重组核酸分子插入质粒或表达载体中，构建重组质粒或重组表达载体；
(2)将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中，得到重组李斯特菌；
其中，所述重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组的核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:2所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，所述重组核酸分子还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；
其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:20所示的序列的核苷酸序列；可选的，所述连接序列包含如SEQID NO:20所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，和所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一个技术方案中，本公开提供一种制备重组李斯特菌的方法，其中，所述启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。
在一个技术方案中，本公开提供根据上述制备重组李斯特菌的方法得到的重组李斯特菌。
在一个技术方案中，本公开提供一种预防或治疗性疫苗，其中，所述疫苗包含预防或治疗有效量的，根据权利要求8所述的重组李斯特菌。
在一个技术方案中本公开提供一种预防或治疗性疫苗，其中，所述疫苗还包含免疫刺激剂；可选的，所述免疫刺激剂选自佐剂。
在一个技术方案中，本公开提供上述重组李斯特菌或包含所述重组李斯特菌的组合物、或者上述预防或治疗性疫苗在制备用于杀死细胞的药物中的应用；优选的，所述细胞选自肿瘤细胞；更优选的，所述肿瘤细胞选自癌细胞。
发明的效果
通过在分子层面上构建LLO不同程度截短的质粒并连接OVA28抗原肽进行验证，通过电转化获得相应的LM疫苗，检测LLO不同程度截短对外源蛋白表达的影响。通过His标签纯化蛋白使用溶血实验验证不同程度截短蛋白的安全性，并通过肿瘤模型验证LLO不同程度截短疫苗的抗肿瘤效应。获得既保证抗肿瘤效应同时又提高安全性的疫苗载体，为后续非整合减毒李斯特菌疫苗临床应用得到保障。
附图说明
图1所示的是李斯特菌表达抗原基因的质粒图谱。
图2所示的是LLO不同程度截短载体质粒示意图。
图3所示的是LLO不同程度截短载体连接OVA28抗原肽质粒示意图。
图4所示的是菌落PCR检测LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗目的序列。其中，M：500bp DNA条带参照物；泳道(Line)1-3：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO50-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；泳道4-6：Lm10403S△actA(pAM401-hly-LLO100-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；泳道7-9：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO150-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；泳道10-12：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO200-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；泳道13-15：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO267-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；泳道16-18：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)PCR产物；
图5所示的是Dot blot筛选高表达李斯特菌菌株。其中，A：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO50-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；B：Lm10403S△actA(pAM401-hly-LLO100-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；C：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO150-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；D：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO200-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；E：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO267-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；F：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)1-5号菌株1ml上清蛋白浓缩样品；
图6所示的是蛋白印迹分析(western blot)筛选高表达减毒李斯特菌菌株。其中M：250KDa蛋白梯状标注参照物；泳道1-2：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO50-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；泳道3-4：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO100-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；泳道5-6：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO150-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；Line 7-8：Lm10403S△actA(pAM401-hly-LLO200-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；泳道9-10：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO267-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；Line 11-12：Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白浓缩样品；
图7所示的是溶血实验检测LLO不同程度截短蛋白的溶血活性。
图8所示的是LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗的抗肿瘤功效检测。
图9所示的是疫苗注射后第7天Elispot功能学检测。
图10所示的是Elispot斑点统计分析。
图11所示的是EG7肿瘤模型第30天肿瘤大小解剖观察结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
本公开中的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。
本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的疫苗给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
本公开中的术语“OVA”是指鸡卵白蛋白(Ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kD。
本公开中的术语“Phly”是编码LLO(溶菌素，Listeriolysion O)基因的启动子。
本公开中的术语“疫苗”是将病原微生物(如细菌等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防疾病的免疫制剂。
在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的菌株和/或巨噬细胞或含者有其的药物组合物(以下也称为“本发明的药物组合物”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本发明的药物组合物等，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本公开中的术语“Elispot”，全名为酶联免疫斑点检测(Enzyme-linkedImmunospot Assay)，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。其能够在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。
本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
技术方案
在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
SEQ ID NO:1所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO529)
SEQ ID NO:2所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO529)
SEQ ID NO:3所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO540)
SEQ ID NO:4所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO540)
SEQ ID NO:5所示的是LLO267的核苷酸序列
SEQ ID NO:6所示的是LLO267的氨基酸序列
SEQ ID NO:7所示的是LLO200的核苷酸序列
SEQ ID NO:8所示的是LLO200的氨基酸序列
SEQ ID NO:9所示的是LLO150的核苷酸序列
SEQ ID NO:10所示的是LLO150的氨基酸序列
SEQ ID NO:11所示的是LLO100的核苷酸序列
SEQ ID NO:12所示的是LLO100的氨基酸序列
SEQ ID NO:13所示的是LLO50的核苷酸序列
SEQ ID NO:14所示的是LLO50的氨基酸序列
SEQ ID NO:15所示的是OVA28的未优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:16所示的是OVA28优化后的核苷酸序列
SEQ ID NO:17所示的是OVA28优化后的氨基酸序列
SEQ ID NO:18所示的是5’端同源核苷酸序列
SEQ ID NO:19所示的是3’端同源核苷酸序列
SEQ ID NO:20所示的是连接序列的氨基酸序列
SEQ ID NO:21所示的是OVA28和连接序列相连的氨基酸序列
在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示的多肽，优选的，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的多肽。
在本公开的一个实施方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括用适于诱导针对目标癌细胞的免疫反应的异源性抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。在一个实施例中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetalantigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testes antigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPV E6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本公开的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。在另一个实施例中，所述异源性抗原选自非肿瘤抗原。例如，非肿瘤抗原选自OVA。
可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。
用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。
本公开的方法可进一步包括施用第二种抗癌疗法，例如第二种治疗病毒。在其他方面，第二种抗癌疗法为化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂、手术等。
另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
另一方面，本发明的药物组合物除了含有本发明的菌株和/或巨噬细胞以外，还可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指：适合于针对免疫疾病的药物组合物的任意载体(脂质体、脂质囊泡、胶束等)、稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、储存剂、表面活性剂、着色剂、着香剂或甜味剂。
本发明的药物组合物等可以采取注射剂、冷冻干燥品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆剂、栓剂、巴布剂、软膏剂、霜剂、滴眼剂等剂型。注射剂等液体制剂可以是在使用前用生理盐水等进行溶解的使用时制备用粉末(例如冷冻干燥粉末)的方式。
本公开的另一个实施方案涉及杀死增生性细胞的方法，该方法包括将该细胞与本公开所述的分离的疫苗组合物接触。
本公开的另一个实施方案涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本公开所述的疫苗组合物。
在本公开的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。施用可为口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔或经直肠施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等施用方式。
本公开的一个实施方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。
本公开的另一个实施方案，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:2所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。可选的，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ IDNO:2所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529位氨基酸位点之前。在一个实施例中，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:2所示的李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第523位和第524位氨基酸之间。
本公开的另一个实施方案中，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:4所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。在一个实施例中，本公开的编码异源性抗原的氨基酸序列可以替换如SEQ ID NO:4所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第533位至第534位氨基酸序列。
本公开的另一个实施方案中，异源性抗原为鸡卵白蛋白(OVA)。在一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为2-40个氨基酸；在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为5-35个氨基酸；在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为8-28个氨基酸。在一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA248-275(即本公开中的OVA28)，在另一个实施方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA258-265。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有明确的具体相反表述，否则本公开的所有实施例涉及的技术方案中，OVA的插入位点均位于相对于如SEQ ID NO:2所示的野生型LLO多肽的氨基酸序列的第523位和第524位氨基酸之间。
除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
本公开采用的主要试剂如下：PstI-HF限制性内切酶(NEB,美国)，His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天，产品货号P2226)，BDTM ELISPOT Mouse IFN-γELISPOT Set(产品货号551083,BD,美国)。
实施例1：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌菌株及LLO不同程度截短载体的 构建
本研究中用做疫苗的菌株采用的是Lm 10403SΔactA(前述菌株的构建方法可以示例性的参考下述文献：Shen H et.al.，PNAS，92(9):3987-91，1995)，该菌缺失actA基因，使得侵染宿主细胞的菌体不能通过其特有的肌动蛋白尾向临近细胞传播扩散，从而大大减弱其毒性及致病性。相比野生型菌株Lm10403S(LD50为1x 104)，Lm-ΔactA的LD50为0.5-1x108，被证明是高度减毒的。
本研究用做表达抗原基因的质粒基本构成如下：(如图1所示)
(1)维持质粒复制稳定的基本序列：pAM401；
(2)转录抗原基因的启动子：Phly，即Lm染色体上毒力岛LLO的启动子；
(3)表达分泌抗原蛋白到李斯特菌外的信号肽序列：LLO signal peptide(LLO1-28aa)及LLO全长基因，用于增加外源蛋白的表达量；
(4)李斯特菌属于原核细胞，而通常需要用作肿瘤疫苗的抗原肽属于真核细胞，需要进行相应密码子优化方能在原核细胞中表达真核细胞蛋白。示例性的，本公开使用如SEQID NO:16所示的优化序列；
(5)检测分泌蛋白的标签序列：Flag tag或His tag；
(6)用于抗原肽插入的酶切位点：PstI；
对LLO540进行不同程度的缺失突变，分别为LLO50、LLO100、LLO150、LLO200、LLO267、LLO540及其连接OVA28的载体(LLO50-OVA28、LLO100-OVA28、LLO150-OVA28、LLO200-OVA28、LLO267-OVA28、LLO540-OVA28)(图2-图3)
主要实验步骤：
1、以pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His6为模板建立PCR体系，进行缺失突变，体系建立如下：
Q5高保真酶2x mix 5μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
水 3μl
2、1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物跑胶，并对目的条带进行胶回收
3、建立KLD连接体系，使回收的PCR产物进行自连成环，体系如下：
PCR产物 8μl
10x KLD酶mix 2μl
2x KLD反应buffer 10μl
4、将KLD反应产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂平板培养单菌落
5、挑斑送测序进行缺失突变序列比对，获得正确缺失突变的质粒菌株
6、抗原肽OVA28的连接步骤参考实施例2
实施例2：抗原肽质粒的构建
示例性的，本公开构建质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His6的方法如下：在质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI基础上，以BamHI为酶切位点，将基因合成的BamHI-LLO22-529-His6-BamHI序列通过酶切酶连反应构建在该载体上，得到pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-529-His6-BamHI，为添加外源基因插入位点，选择在LLO523-524位置设计上下游引物，通过PCR反应，在LLO523和LLO524之间插入PstI酶切位点。
构建李斯特菌疫苗质粒需要将抗原基因插入到质粒载体中，载体上已设计有酶切位点，目的抗原的基因序列通过公司进行基因密码子优化后合成。
例如OVA28密码子优化过程：
小鼠OVA28核酸序列(SEQ ID NO:15)：
GATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTT GAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAA
进行大肠杆菌密码子优化后OVA28核酸序列(SEQ ID NO:16)：
GATGAAGTGAGCGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATTATCAACTTC GAAAAACTGACCGAGTGGACCAGCAGCAATGTGATGGAA
示例性的，我们使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pAM401-phly-LLO1-28-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His载体(简称PstI载体质粒)上PstI位点，同源序列为：5’端同源序列(CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:18)；3’端同源序列(CTGCAGGTAGATAATCCAATCGAA，SEQ ID NO:19)
主要步骤如下：
PstI载体质粒20μl PstI单酶切体系：
PstI质粒 2μg
PstI限制性内切酶(NEB) 2μl
10x NEBuffer 3.1 2μl
去离子水 补齐至20μl
37℃水浴锅，反应30min。
将酶切产物进行DNA回收纯化，即酶切线性化PstI载体
37℃水浴30分钟，立即置于冰上5分钟，全部转化100μl E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。
实施例3：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌的制备
测序验证正确的质粒通过电转化技术，转化到减毒李斯特菌株中，挑选单克隆进行后续质粒及表达验证。
电转化具体步骤：
(1)电转化感受态的制备
a)过夜培养的李斯特菌转接到BHI培养基中，37℃振荡培养至OD600值0.1-0.5；
b)加入PNG继续培养约两个小时，到OD600到0.1-1.8；
c)冰浴10分钟后，5000g离心收集菌体；
d)用200ml甘油重悬菌体，洗两次；
e)用45ml甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，37℃水浴20分钟；
f)在4℃环境下，5000g离心收集菌体，再用20ml甘油洗涤菌体一次；
g)用甘油重悬菌体，50μl/管分装保存。
(2)确定最适电转化条件：
a)取一管感受态细胞，用手心化冻，置于冰上；
b)将待转的质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。
c)上述混合体系加入预冷的1mm电转杯中，进行电击处理；
d)立即加入BHI培养基，混匀，取出到EP管中；
e)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养，挑取单菌落验证。
实施例4：李斯特菌疫苗的制备、cfu浓度测定
将约107cfu李斯特菌初始培养物加入10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心收集菌体，等体积的PBS洗涤菌体两次，用1/10体积PBS重悬菌体，分装，-80℃保存。
CFU统计方法：用PBS或培养基按照10倍梯度稀释菌体，梯度稀释时只能从上一个梯度稀释到下一个梯度，并且通过震荡充分混匀。分别取10-5、10-6、10-7、10-8浓度各100μl涂布BHI平板，计数菌落数。如10-8浓度长出菌落数为N，则cfu＝N x 10x 108个/ml。最终通过10-6、10-7、10-8算出菌落数进行平均即为样品CFU。
实施例5：Dot-Blotting检测减毒李斯特菌上清中分泌外源蛋白表达量
挑取平板单菌落加入至10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用30μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将30μl样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次，每次5min。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
实施例6：蛋白质印记分析检测减毒李斯特菌外源蛋白表达
挑取平板单菌落加入至10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清10ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用200μl蛋白上样缓冲液溶解沉淀，煮沸变性后-80℃保存。
分别配置10％的分离胶和4％的浓缩胶，每孔上样20μl，80v电泳样品跑至浓缩胶分离胶交接处改为120v。待电泳完成后，取分离胶，将滤纸和0.22μm PVDF膜(预先甲醇中激活)剪成与胶同样大小，进行转膜冰浴。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次。在PVDF膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
实施例7：溶血实验
5％的C57小鼠红细胞的配制：在EP管中加入50μl EDTA，采用眼球取血的方法获取C57小鼠血，1000rpm，4℃离心10min，去掉上清和白细胞层。加入生理盐水轻轻重悬红细胞，1000rpm，4℃离心10min，去掉上清。重复加入生理盐水重悬，离心并去掉上清液。将红细胞和生理盐水以1:20混匀，配制成5％的小鼠血红细胞-生理盐水悬液。
溶血活性测定：将李斯特菌中表达纯化的蛋白各取0.5μg与150μl PBS在37℃中静置培养10min，然后加入150μl 5％的小鼠血红细胞-生理盐水悬液，37℃静置培养1h后，12000rpm离心1min，取上清在550nm处测吸光值。用PBS为阴性对照，以2％的Triton X-100为阳性对照，震荡后离心1min，分别取上清在550nm处测吸光值。
实施例8：LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗的分子鉴定
将构建的LLO不同程度截短并连接OVA28的载体质粒电转化至LM感受态中，将菌体涂布BHI氯霉素平板，37℃培养箱倒置培养后待长出单菌落，对各组单菌落进行菌落PCR验证，体系如下：
2xQ5mix酶 5μl
上游引物 0.5μl
下游引物 0.5μl
去离子水 4μl
上下游检测引物设计为PstI位点前后位置，特异性PCR获得(G4S2)-OVA28-(G4S)2目的条带。上游引物序列5’-3’：CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:18；下游引物序列5’-3’：TTCGATTGGATTATCTACCTGCAG，SEQ ID NO:19
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图4所示，实验各组均出现明显符合实际大小(240bp)的目的产物。表明质粒已电转化至LM感受态中，可用于疫苗制备。
实施例9：LLO不同程度截短对非整合减毒李斯特菌疫苗表达的影响
为了制备LLO不同程度截短的LM-OVA28疫苗以及获得高表达的非整合型李斯特菌菌株。我们通过培养不同单菌落进行上清蛋白沉淀通过Dot blot实验初步筛选，具体过程：分别挑取以上平板上单菌落(1-5号)加入至含氯霉素抗性BHI培养液中，摇床摇培14-16h，离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的TCA/丙酮溶液混匀，沉淀过夜。15000rpm离心收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
实验结果如图5，其中Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO50-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO50-OVA28)的2号和5号菌落，Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO100-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO100-OVA28)的1号和4号菌落，Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO150-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO150-OVA28)的1号和4号菌落，Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO200-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO200-OVA28)的2号和3号菌落，Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO267-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO267-OVA28)的3号和4号菌落，Lm 10403S△actA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)(简称LM-LLO540-OVA28)的1号和2号菌落表达较高。
接下来我们通过蛋白质印记分析实验进一步准确检测表达情况。具体过程：分别挑取LM-LLO50-OVA28的2号和5号菌落、LM-LLO100-OVA28的1号和4号菌落、LM-LLO150-OVA28的1号和4号菌落、LM-LLO200-OVA28的2号和3号菌落、LM-LLO267-OVA28的3号和4号菌落、LM-LLO540-OVA28的1号和2号菌落加入至含氯霉素抗性BHI培养液中，摇床培养14-16h，随后4500rpm离心沉淀菌体。取上清10ml以TCA/丙酮溶液混匀，沉淀过夜。15000rpm离心收集沉淀蛋白，预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用蛋白上样缓冲液溶解沉淀，煮沸变性后保存。
分别配制10％的分离胶和4％的浓缩胶，每孔上样20μl，80v电泳样品跑至浓缩胶分离胶交接处改为120v。待电泳完成后，取分离胶，将滤纸和0.22um PVDF膜(预先甲醇中激活)剪成与胶同样大小，进行转膜冰浴。5％脱脂牛奶TBST封闭，TBST洗涤3次。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育，TBST洗涤3次。在PVDF膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
实验结果如图6，LM-LLO540-OVA28、LM-LLO267-OVA28、LM-LLO200-OVA28表达最高，接下来随LLO的截短增加而表达降低。表明LLO的截短会影响外源抗原蛋白的表达，LLO不宜截短至200以下。
实施例10：LLO不同程度截短目的蛋白溶血性检测
首先，使用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天，产品货号P2226)对过夜培养的40ml各组菌液上清中LLO-His融合蛋白进行分离纯化，具体方法参照试剂盒说明书，从而获得LLO不同程度截短的融合蛋白样品。
溶血实验以PBS为NC对照，以Triton x-100为阳性对照，每管0.5ml 5％C57小鼠红细胞，实验各组添加蛋白各0.5μg以上(LLO540、LLO267、LLO200、LLO150、LLO100、LLO50)，并以各组未纯化的上清为实验组对照，同时添加洗脱液对照组(镍柱纯化最后使用洗脱液洗脱柱上his蛋白)。
实验结果如图7，Triton x-100阳性对照组出现明显溶血，而加入纯化后蛋白的实验各组均和PBS组一样，未出现明显溶血情况。同时各组上清液对照组，因本身李斯特菌所表达的野生型LLO而均出现明显溶血情况，其中BHI培养基成分不会造成溶血。以上各组实验均同时进行在550处进行吸光度分析，将Triton x-100阳性对照组吸光度设为100％溶血，以此计算出各组相对溶血活性。统计分析表明与上述溶血情况所述的结论一致。
溶血实验表明本方法下构建的非整合减毒李斯特菌所表达的目的蛋白均不具有溶血活性，因此本方法下制备的非整合减毒李斯特菌疫苗在安全上得到进一步提高。
实施例11：LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗在EG7肿瘤模型中抗肿瘤功效检测
为进一步验证非整合李斯特菌不同程度截短疫苗的抗肿瘤作用，我们先用EG7-OVA皮下接种C57小鼠产生肿瘤，再用相应肿瘤疫苗治疗，检测抗肿瘤效果。细胞接种量为2x106，接种后第6天开始进行肿瘤测量，并将35只小鼠进行肿瘤大小均一分成七组(PBS对照组、LM-LLO50-OVA28实验组、LM-LLO100-OVA28实验组、LM-LLO150-OVA28实验组、LM-LLO200-OVA28实验组、LM-LLO267-OVA28实验组及LM-LLO540-OVA28实验组)，保证组间均一性，第9天进行七组肿瘤疫苗的尾静脉注射，注射剂量为1x105cfu/100μl并持续跟踪测量。
实验结果如图8，PBS对照组肿瘤持续增长，而LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗实验各组肿瘤均在第14天开始下降，并逐渐消除肿瘤。在第30天对模型小鼠进行二氧化碳窒息颈椎脱臼法处死，取小鼠皮下EG7肿瘤，拍照观察结果如图11，图中三角▲代表肿瘤小于2mm无法取出、星号*代表肿瘤完全消除。表明LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗实验各组均能实现EG7肿瘤模型的抗肿瘤效应。
为进一步从功能学检测对EG7肿瘤模型小鼠体内肿瘤特异性免疫反应的激活情况，我们通过Elispot实验进行验证。我们在疫苗注射后第7天通过尾静脉取血5-7滴，裂红后PBS洗两次获得外周血单个核细胞，最终分别使用100μl的1640完全培养基重悬细胞加入Elispot预处理孔板中。随后通过在Elispot孔板中加入10ng/μl OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生INF-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况(具体Elispot实验流程参照BDTM ELISPOT Mouse IFN-γELISPOT Set说明书，产品货号551083)。
Elispot实验结果如图9，LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗实验各组均呈现较强Elispot反应，通过斑点统计分析，结果如图10，LM-LLO540-OVA28、LM-LLO267-OVA28、LM-LLO200-OVA28实验组的Elispot反应稍强于LM-LLO150-OVA28、LM-LLO100-OVA28、LM-LLO50-OVA28实验组。表明LLO不同程度截短LM-OVA28疫苗实验各组均能激活小鼠体内OVA28特异性免疫应答。结合实施例9的结果，表明表达越高其引起的特异性反应越强，预期可获得的抗肿瘤效果越好。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海若泰医药科技有限公司
苏州若泰医药科技有限公司
<120> 一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1587
<212> DNA
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 1
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag 1380
ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg cctggtaacg cgagaaatat taatgtttac 1440
gctaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500
ttaccacttg tgaaaaatag aaatatctcc atctggggca ccacgcttta tccgaaatat 1560
agtaataaag tagataatcc aatcgaa 1587
<210> 2
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 2
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Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
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Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
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Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
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Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
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Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
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Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
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Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
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Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
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Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
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Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
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Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 3
<211> 1620
<212> DNA
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
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caaactgaag caaaggatgc atcggatcct actgaagcaa aggatgcatc tgcattcaat 120
aaagaaaatt caatttcatc catggcacca ccagcatctc cgcctgcaag tcctaagacg 180
ccaatcgaaa agaaacacgc ggatgaaatc gataagtata tacaaggatt ggattacaat 240
aaaaacaatg tattagtata ccacggagat gcagtgacaa atgtgccgcc aagaaaaggt 300
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aatgcagaca ttcaagttgt gaatgcaatt tcgagcctaa cctatccagg tgctctcgta 420
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ttaacactca gcattgattt gccaggtatg actaatcaag acaataaaat cgttgtaaaa 540
aatgccacta aatcaaacgt taacaacgca gtaaatacat tagtggaaag atggaatgaa 600
aaatatgctc aagcttatcc aaatgtaagt gcaaaaattg attatgatga cgaaatggct 660
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<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 4
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu
20 25 30
Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys
50 55 60
Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro
85 90 95
Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys
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Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln Val Val Asn
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Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser
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Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser
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Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys
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Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn Ala Val Asn
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Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn
195 200 205
Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser
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Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser
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Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu
245 250 255
Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro
260 265 270
Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu
275 280 285
Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser
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Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr Asn Ser His
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Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser
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Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr
370 375 380
Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe
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Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn
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Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys Asn Trp Ser Glu
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Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro
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<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
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<211> 290
<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 6
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Ile Glu
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<212> DNA
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
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<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 10
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Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn Ala Val Asn
180 185 190
Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Leu
195 200 205
Gln Val Asp Asn Pro Ile Glu
210 215
<210> 11
<211> 495
<212> DNA
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 11
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atcggatcct actgaagcaa aggatgcatc tgcattcaat 120
aaagaaaatt caatttcatc catggcacca ccagcatctc cgcctgcaag tcctaagacg 180
ccaatcgaaa agaaacacgc ggatgaaatc gataagtata tacaaggatt ggattacaat 240
aaaaacaatg tattagtata ccacggagat gcagtgacaa atgtgccgcc aagaaaaggt 300
tacaaagatg gaaatgaata tattgttgtg gagaaaaaga agaaatccat caatcaaaat 360
aatgcagaca ttcaagttgt gaatgcaatt tcgagcctaa cctatccagg tgctctcgta 420
aaagcgaatt cggaattagt agaaaatcaa ccaccgaaat atagtaataa actgcaggta 480
gataatccaa tcgaa 495
<210> 12
<211> 165
<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 12
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu
20 25 30
Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys
50 55 60
Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro
85 90 95
Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys
100 105 110
Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln Val Val Asn
115 120 125
Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser
130 135 140
Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Leu Gln Val
145 150 155 160
Asp Asn Pro Ile Glu
165
<210> 13
<211> 345
<212> DNA
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 13
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atcggatcct actgaagcaa aggatgcatc tgcattcaat 120
aaagaaaatt caatttcatc catggcacca ccagcatctc cgcctgcaag tcctaagacg 180
ccaatcgaaa agaaacacgc ggatgaaatc gataagtata tacaaggatt ggattacaat 240
aaaaacaatg tattagtata ccacggagat gcagtgacaa atgtgccgcc aagaaaaggt 300
tacccgaaat atagtaataa actgcaggta gataatccaa tcgaa 345
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<400> 14
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu
20 25 30
Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys
50 55 60
Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro
85 90 95
Pro Arg Lys Gly Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Leu Gln Val Asp Asn
100 105 110
Pro Ile Glu
115
<210> 15
<211> 84
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 15
gatgaagtct caggccttga gcagcttgag agtataatca actttgaaaa actgactgaa 60
tggaccagtt ctaatgttat ggaa 84
<210> 16
<211> 84
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 16
gatgaagtga gcggcctgga gcagctggag agcattatca acttcgaaaa actgaccgag 60
tggaccagca gcaatgtgat ggaa 84
<210> 17
<211> 28
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 17
Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu
1 5 10 15
Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu
20 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgaaatata gtaataaact gcag 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgcaggtag ataatccaat cgaa 24
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu
1 5 10 15
Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr
20 25 30
Ser Ser Asn Val Met Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45

Claims (21)

1.一种制备重组李斯特菌的方法，其包括以下步骤：
(1)将重组核酸分子插入质粒或表达载体中，构建重组质粒或重组表达载体；
(2)将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中，得到重组李斯特菌；
其中，所述重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组的核酸分子还包含启动子；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列选自：如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组核酸分子的核苷酸序列还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:20所示的序列的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述连接序列编码的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:20所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。
11.根据权利要求6或9所述的方法，其中，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
12.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中，所述启动子序列选自编码Phly基因的序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述重组核酸分子的核苷酸序列还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述代谢产物选自次级代谢产物。
15.根据权利要求1-10任一项所述的方法得到的重组李斯特菌。
16.一种预防或治疗性疫苗，其中，所述疫苗包含预防或治疗有效量的，根据权利要求15所述的重组李斯特菌。
17.根据权利要求16所述的预防或治疗性疫苗，其中，所述疫苗还包含免疫刺激剂。
18.根据权利要求17所述的预防或治疗性疫苗，其中，所述免疫刺激剂选自佐剂。
19.根据权利要求15所述的重组李斯特菌或包含所述重组李斯特菌的组合物、或者根据权利要求16或17所述的预防或治疗性疫苗在制备用于杀死细胞的药物中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，所述细胞选自肿瘤细胞。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述肿瘤细胞选自癌细胞。
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Denomination of invention: A method to improve the safety of non integrated attenuated Listeria vaccine

Effective date of registration: 20230516

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Pledgee: China Construction Bank Suzhou Industrial Park sub branch

Pledgor: SUZHOU ROYALTECH MED Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980040789

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