CN114181881A - 基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，旨在提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用。该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除hly基因中第251‑255位氨基酸后获得。本发明提供了含有该减毒单核细胞增多性李斯特菌的减毒菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的单増李斯特菌的减毒株可作为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病的免疫治疗或免疫佐剂。由于是在李斯特菌基因组上进行敲除修饰，不含抗性质粒等生物标记，符合生物安全，且不影响李斯特菌体外生长。

Description

基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种单核细胞增多性李斯特菌，具体来说是一种新型的单核细胞增多性李斯特菌，因毒力致弱，可用于递送表达外源抗原，用作免疫疗法的活疫苗载体。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性胞内寄生病原菌。李斯特菌有着极强的生存能力且广泛分布于各种环境中，能够在许多不同的环境中持续生存，极易感染免疫力低下的人群，造成细菌性败血症、胃肠炎、脑膜炎以及流产等李斯特菌病。

近年来，科研界通过对李斯特菌的研究发现，其可作为一种有前景的疫苗载体，呈递肿瘤相关抗原，并且在人乳头瘤病毒、前列腺癌、黑色素瘤、转移性乳腺癌等方面都有着不错的成效。减毒活载体疫苗的特点是能引起较强的免疫反应，由于单増李斯特菌能在巨噬细胞内增殖，其能够更好的递呈抗原。除此之外，已知单増李斯特菌LLO能够增强抗原的特异性免疫反应。

但是，传统的减毒策略主要是毒力基因的敲除、质粒回补等，存在对机体安全性不够、免疫原性低、抗原呈递效率不高等局限性。因此，本发明的减毒策略以及获得的减毒活载体疫苗致力于有效解决传统疫苗面临的技术缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

提供一种基于氨基酸改造的新型减毒单核细胞增多性李斯特菌，该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除hly基因(编码溶血素LLO蛋白)中第251-255位氨基酸(FKQIY)后获得。

本发明进一步提供了一种减毒菌株，含有前述的减毒单核细胞增多性李斯特菌；该减毒菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为单核增生李斯特氏菌，Listeria monocytogenes.LAPD5155；保藏编号为CGMCC NO：23599。

本发明还提供了前述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗外源抗原递呈载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。因毒力致弱，可作为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病的免疫防治。

本发明进一步提供了前述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒pSL2424；

(2)以单増李斯特菌野生株制备WT感受态细胞；

(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)以单増李斯特菌野生株与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

作为优选方案，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)以单増李斯特菌野生株的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取hly基因中的第87-250位氨基酸作为上游同源臂、选取hly基因中的第256-422位氨基酸作为下游同源臂；设计引物扩增上游同源臂和下游同源臂，条带大小分别为501bp和499bp，作为片段A和片段B；

(1.2)利用重叠PCR技术(SOE-PCR)将两个片段连在一起，获得A-B目的片段；

(1.3)以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2424。

作为优选方案，所述步骤(2)具体包括：

将单増李斯特菌野生株接种于新鲜无菌的BHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀ nm值为0.18-0.25；加入青霉素G，使其终浓度为20μg/mL，37℃振荡培养2h；离心后收集菌体，加入适量洗涤缓冲液，洗涤两次；离心弃上清，向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体以获得感受态细胞；分装，置于-80℃冰箱备用。

作为优选方案，所述步骤(3)具体包括：

将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的含0.5M蔗糖的BHI液体培养基，充分混匀，置30℃恒温培养箱2-3h；离心，将上清重悬菌液均匀涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置37℃培养，得到单克隆菌落。

作为优选方案，所述步骤(4)具体包括：

挑取步骤(3)中经电转化获得的单克隆菌落，在氯霉素抗性的BHI液体培养基扩大培养，进行PCR验证；将阳性菌株置于42℃进行同源重组，以及30℃连续传代丢失质粒，最后进行PCR筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌；将测序正确的菌液和60％甘油体积比1:1混合，置-80℃冰箱保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明以单増李斯特菌野生株(WT)为背景，利用同源重组技术、基础分子克隆试验操作和生物信息学等手段构建李斯特菌hly基因(编码溶血素LLO蛋白)敲除第251-255位氨基酸后获得的减毒菌株，所述的减毒株内不含任何抗性质粒等生物标记，符合生物安全要求，更适合用于外源抗原递呈载体疫苗的研发，可用于肿瘤或传染病的免疫治疗和防治。所述减毒株在李斯特菌基因组原位上进行敲除，可消除在免疫过程中质粒丢失的情况，减毒株更加稳定，在此基础上，当携带外源基因时，也能够更稳定的表达。试验表明，LAPD5155相较于野生株在小鼠肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低；在小鼠存活试验中，LAPD5155的致死率明显下降。

2、本发明的单増李斯特菌的减毒株可作为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病的免疫治疗或免疫佐剂；将hly基因第251-255位氨基酸(FKQIY)敲除使该细菌毒力大大降低，但仍保留了较为完整的免疫原性。

3、由于是在李斯特菌基因组上进行敲除修饰，不含抗性质粒等生物标记，符合生物安全，且不影响李斯特菌体外生长。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明构建的单増李斯特菌同源重组质粒(pSL2424)图谱，包含上下游同源臂501bp和499bp的重组片段；还包含氯霉素抗性基因cat；

图2为WT与该减毒株感染ICR小鼠后的小鼠存活曲线；

图3为WT与该减毒株在ICR小鼠肝脾的细菌载量比。

具体实施方式

下面结合附图，对发明的实施例进行详细的描述。

首先介绍本发明实施例中所使用的菌株、试剂与仪器：

单増李斯特菌野生株(本发明中简称WT株)的菌株购自ATCC标准菌株，社会公众可根据其规定自行获取。

本发明所述减毒单核细胞增多性李斯特菌，是以上述单増李斯特菌野生株为背景，对其hly基因敲除第251-255位氨基酸基因后获得。含有该减毒单核细胞增多性李斯特菌的减毒菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为单核细胞增多性李斯特菌，Listeria monocytogenes LAPD5155；保藏编号为CGMCC NO：23599。保藏机构地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101。

主要试剂：

LB培养基、琼脂糖H、agar均购于上海生工生物工程公司，BHI培养基购自英国Oxoid公司，PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自惠晶生物科技，质粒提取试剂盒、细胞总RNA提取试剂盒均购自天根生化各级有限公司，PCR相关试剂购自南京诺唯赞，DNA连接酶(Ligation high ver.2)购自TOYOBO，限制性内切酶购自NEB，氨苄霉素和卡那霉素购自Sangon，反转录试剂盒购自TOYOBO，DMEM、FBS、PBS、蛋白maker均购自赛默飞。

主要仪器：

摇床(HZ-9211K)、涡旋振荡器(ZEALWAY GI541)、多功能酶标仪(BioTekSynergyTM H1)、梯度PCR仪(Eppendorf)、凝胶成像系统(UVP)、金属浴(Thermo)、生物安全柜(BSC-II)、电击转化仪(BTX ECM 630)、蛋白电泳仪(BIORAD)、细胞二氧化碳培养箱(Thermo)。

实施例1减毒疫苗载体的构建

1、构建重组质粒

以单增李斯特菌标准菌株基因组(GenBank序列号为NC_003210.1)为模板，使用Snapgene软件选取hly基因中的第87-250位氨基酸作为上游同源臂、选取hly基因中的第256-422位氨基酸作为下游同源臂。利用PCR扩增分别含酶切位点BamH I和Pst I的片段A(501bp，扩增引物为P2和P3)和片段B(499bp，扩增引物为P4和P5)。在此基础上，利用重叠PCR技术(SOE-PCR)扩增得到“A-B”的目的片段(如SEQ ID NO.1所示)。以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2424，测序验证正确后保存于-20℃。

相关引物见表1：

表1重组质粒pSL2424构建所需引物

注：P1为李斯特菌基因组上距离片段A上游589bp用于验证重组质粒的引物；P2为扩增片段A的上游引物；P3为扩增片段A的下游引物；P4为扩增片段B的上游引物；P5为扩增片段B的下游引物。

具体操作：用P2和P3引物扩增A片段，用P4和P5扩增B片段，通过SOE-PCR技术将两个片段连在一起获得“A-B”的目的片段，用BamH I和Pst I限制性核酸内切酶对目的片段和载体(pKSV7)进行双酶切，按照试剂盒说明书进行酶切产物纯化。将7μL目的片段、3μL载体和10μL DNA连接酶混合后置于16℃金属浴进行酶连，得到重组质粒pSL2424(构建图谱如图1所示)。

2、WT感受态细胞的制备

在无菌超净工作台中挑取李斯特菌野生株(WT)单菌落至5mL BHI培养基中，放置于37℃恒温摇床培养箱过夜培养。取1mL过夜培养的菌液，转接至100mL灭菌的BHI(含有0.5M蔗糖)液体培养基中，37℃振荡培养至OD600 nm值为0.18-0.25。加入青霉素G到100mL培养基中，使青霉素G终浓度为20μg/mL，37℃继续振荡培养2h。3500rpm，10min，4℃离心收集菌体，弃上清，用适量预冷的缓冲液(含1mM HEPES和0.5M蔗糖)洗涤两次；离心，弃上清后向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体以获得感受态细胞；分装，置-80℃冰箱备用。

3、电转

将1.5μg重组质粒(pSL2424)通过电转仪电转入上述制备的感受态细胞中(电转设置条件为2.5KV、200Ω、25μF)。电转后，迅速加入1mL预热的BHI液体培养基(含0.5M蔗糖)，充分混匀后移至新的1.5mL EP管中，置于30℃恒温培养箱中静置培养2-3h。离心(3500rpm，15min)，留100μL上清重悬菌液均匀涂布于含氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置37℃恒温培养箱培养24-48h，得单克隆菌落。

4、同源重组及筛选验证

挑取上述步骤获得的单克隆落，接种于BHI液体培养基(氯霉素抗性)中，置37℃振荡过夜培养。用P2和P5引物进行菌液PCR验证，约在1000bp处有明显条带认定为含重组质粒的克隆，电转成功。将对应克隆接种于BHI液体培养基(氯霉素抗性)中置于42℃条件下传代培养进行同源重组，每传5代菌液，用50％甘油保菌并在BHI(含氯霉素抗性)固体平板上划线，用P1和P5引物进行菌落PCR验证，送测序后结果比对显示正确(认定为同源重组整合成功)。将筛选出的阳性单克隆接种于BHI液体培养基(不含抗性)中于30℃条件下继续传代丢掉同源重组后的质粒传5代菌液，用60％甘油保菌并在BHI固体平板上划线，放置于37℃培养箱静置培养，挑取单克隆进行抗性筛选获得无抗性的克隆(质粒已丢失)，最后经基因测序验证正确后获得减毒单増李斯特菌，将菌液和60％甘油体积比1:1混合并冻存于-80℃冰箱。

实施例2减毒株感染生物学分析

1、小鼠脏器增殖试验

将单增李斯特菌通过腹腔注射方式感染18-22g ICR雌性小鼠(感染量约为10⁶CFU)，分别在感染24和48h后分离小鼠肝脏和脾脏，加入10mM PBS(pH 7.4)充分研磨后倍比稀释至合适浓度，点板并放置37℃培养24h后进行细菌菌落计数，结果以log₁₀CFU呈现。如图2所示，与WT相比，LAPD5155在小鼠肝脏(Liver)、脾脏(Spleen)中的定殖能力显著下降。

2、半数致死量比较

将单增李斯特菌通过腹腔注射方式感染18-22g ICR雌性小鼠(感染量约为10⁶CFU)，自感染细菌日起，每12h观察一次小鼠存活情况并记载统计，共观察7天，结果以log₁₀CFU呈现。如图3所示，感染LAPD5155后的小鼠在7d内具有100％的存活率，即LAPD5155对小鼠致病力高度减弱，进一步证明LAPD5155的毒力降低，具有良好的生物安全性，可以成为外源抗原递送活载体用于肿瘤等疾病免疫治疗的候选菌株。

以上试验表明，与单増李斯特菌野生株相比，本发明获得的减毒菌株相较于野生株，李斯特菌在小鼠肝脏和脾脏中的定殖李斯特菌数量显著降低；在小鼠存活试验中，LAPD5155的致死率明显下降。基于上述特性，本发明的减毒菌株可以用作活疫苗抗原递呈载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 基于氨基酸改造的新型减毒单增李斯特菌构建方法及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acaaatgtgc cgccaagaaa aggttacaaa gatggaaatg aatatattgt tgtggagaaa 60

aagaagaaat ccatcaatca aaataatgca gacattcaag ttgtgaatgc aatttcgagc 120

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tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc ttggagtgaa tgcagaaaat 600

cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag tttatttgaa attatcaact 660

aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg ccgtaagcgg aaaatctgtc 720

tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt ccttcaaagc cgtaatttac 780

ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca acctcggaga cttacgcgat 840

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acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg a 1001

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagttacag agttctttat tggcttattc cagtt 35

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca caaatgtgcc gccaagaaaa g 31

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcaagaaga agtcattagt tataacgtga atgttaatga acctacaaga cc 52

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgcagt cgatgttaat ttttccatct gtataagctt ttgaagt 47

Claims (8)

1.一种基于氨基酸改造的新型减毒单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除编码溶血素LLO蛋白的hly基因中第251-255位氨基酸后获得。

2.一种减毒菌株，其特征在于，含有权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌；该减毒菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单核增生李斯特氏菌，Listeria monocytogenes.LAPD5155；保藏编号为CGMCC NO：23599。

3.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗外源抗原递呈载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。

4.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建重组质粒pSL2424；

(2)以单増李斯特菌野生株制备WT感受态细胞；

(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；

(4)以单増李斯特菌野生株与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)以单増李斯特菌野生株的hly基因为模板，使用Snapgene软件选取hly基因中的第87-250位氨基酸作为上游同源臂、选取hly基因中的第256-422位氨基酸作为下游同源臂；设计引物扩增上游同源臂和下游同源臂，条带大小分别为501bp和499bp，作为片段A和片段B；

(1.2)利用重叠PCR技术将两个片段连在一起，获得A-B目的片段；

(1.3)以BamH I和Pst I为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得重组质粒pSL2424。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

将单増李斯特菌野生株接种于新鲜无菌的BHI液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀ nm值为0.18-0.25；加入青霉素G，使其终浓度为20μg/mL，37℃振荡培养2h；离心后收集菌体，加入适量洗涤缓冲液，洗涤两次；离心弃上清，向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体以获得感受态细胞；分装，置于-80℃冰箱备用。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：

将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的含0.5M蔗糖的BHI液体培养基，充分混匀，置30℃恒温培养箱2-3h；离心，将上清重悬菌液均匀涂布于氯霉素抗性的BHI固体培养基中，置37℃培养，得到单克隆菌落。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：

挑取步骤(3)中经电转化获得的单克隆菌落，在氯霉素抗性的BHI液体培养基扩大培养，进行PCR验证；将阳性菌株置于42℃进行同源重组，以及30℃连续传代丢失质粒，最后进行PCR筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌；将测序正确的菌液和60％甘油体积比1:1混合，置-80℃冰箱保存。

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