CN111088205B - 一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法 - Google Patents
一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程技术领域。一种yoaD、yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次发现了大肠杆菌染色体上的yoaD与yoaE基因敲除后可以提高菌株表达外源GlmS酶的能力，且它们之间具有叠加增效的技术效果，这对于整个氨糖的合成途径有着重要的意义，并且敲除成功后不会留下任何抗性基因残留；两个基因的共缺失后，使得工程菌株表达外源GlmS的能力较原始菌株提高3倍左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)，俗称氨基糖，简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成分，还是糖蛋白的主要组成部分。GlmS是氨糖生产的关键酶蛋白，因此其酶活的提高将对GlcN的生产有至关重要的作用。
中国专利文献CN109929791A(申请号201910301799.0)公开了一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于遗传工程技术领域。以大肠杆菌作为宿主表达，通过敲除大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB基因，获得重组大肠杆菌，并将重组大肠杆菌应用于氨基葡萄糖的生产中，实现了阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径；并通过过量表达氨基葡萄糖合成酶编码基因、氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，加强了氨基葡萄糖的合成途径，从而提高氨基葡萄糖的产量。
yoaD与yoaE是大肠杆菌染色体上的组成性基因，其中，yoaD的基因大小为1599bp，它的作用是能刺激第二信使循环di-gmp的降解,与GGDEF结构域一起，EAL可能参与调节细菌的细胞表面粘附性；yoaE的基因大小为1557bp，它的作用是构成内膜蛋白，调控某些离子的转移，构成内膜蛋白。
由于菌种中调控表达外源GlmS的信号途径十分复杂，因此，寻找影响外源GlmS表达调控的基因，对于提高GlmS表达量，进而提高氨糖的产量具有重要的作用。
发明内容
本发明针对GlmS自然条件下表达量相对较低的现状，提出一种通过yoaD和yoaE基因共缺失的方法，提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法。
本发明技术方案如下：
一种yoaD表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种yoaE表达基因通过负向调控提高重组菌的GlmS酶活力的应用，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述重组菌为重组大肠杆菌。
一种提高重组菌的GlmS酶活力的方法，通过敲除GlmS酶表达菌中的yoaD表达基因和yoaE表达基因制备重组菌实现；所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述方法，步骤如下：
(1)将pKD46质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，构建BL21-pKD46工程菌株；
(2)将yoaD基因上游区的500bp碱基，pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因的下游区500bp碱基利用重叠PCR构建成整合片段-1；
(3)将步骤(2)中的整合片段-1转化进入经过诱导的BL21-pKD46感受态细胞；
(4)利用red同源重组技术分别敲除步骤(3)菌株的染色体上的yoaD基因和yoaE基因，制得BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)；
(5)清除步骤(4)构建的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46工程菌株中的pKD46质粒，制得含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株；
(6)将pCP20质粒转化步骤(5)构建的含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE 工程菌株感受态细胞，制得BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pCP20工程菌株；
(7)清除步骤(6)构建的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pCP20菌株中的pCP20质粒，得到BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株；
(8)构建工程质粒pET-Duet1-glms-gnal，将工程质粒pET-Duet1-glms-gnal转化步骤(7) 制得的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株，制得BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal工程菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，BL21-pKD46工程菌株的构建方法如下：
将pKD46质粒通过化学转化法转化进入BL21(DE3)感受态细胞，在抗性平板上筛选阳性克隆子。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，敲除同源片段的构建方法如下：
分别在yoaD基因的上游区和yoaE基因的下游区选取500bp作为同源臂，随后通过重叠PCR将pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框连接到两个同源臂之间，即构建得到整合片段-1。
根据本发明优选的，所述步骤(3)与步骤(4)中，利用red同源重组基因编辑技术敲除的具体步骤如下：
(i)将BL21-pKD46工程菌株在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素平板上划线，30℃过夜；
(ii)选取阳性克隆子在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，当OD600＝0.2时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为10mM进行诱导培养；当OD600＝0.6时停止诱导并利用氯化钙法制做BL21-pKD46感受态；
(iii)将步骤(2)中构建的敲除同源片段通过化学转化法转化进入BL21-pKD46感受态，并在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素与浓度50μg/mL卡纳抗生素平板上涂板过夜；
(iv)从过夜的平板上挑取单菌落接种于双抗性LB液体培养基中，在30℃培养7～9h；将生长的菌液进行质粒PCR验证，选取条带的菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，清除BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46中pKD46质粒的具体步骤如下：
(i)将BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46菌株接种于含有浓度50μg/mL卡纳抗性的LB液体培养基中42℃过夜培养；
(ii)将过夜培养菌液划线于含有浓度50μg/mL卡纳抗性的平板上37℃培养8-12h；
(iii)将上述(ii)中的单菌落在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素与浓度50μg/mL卡纳抗生素的双抗性平板上以及仅含浓度50μg/mL卡纳抗性的平板上分别点板培养，37℃过夜，挑取能在卡纳抗性平板生长但不能在双抗性平板上生长的单菌落于含有卡纳抗性的LB液体培养基中培养8-12h。
根据本发明优选的，所述步骤(6)中，消除FRT-kan-FRT结构框的具体步骤如下：
(i)将含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株接种于含有双抗性的 LB液体培养基中，当OD600＝0.6时通过氯化钙法制得其感受态；
(ii)将pCP20质粒转化进入含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株感受态，在含有氨苄抗生素的的平板上涂板并置于30℃培养12-16h；
(iii)从上步(ii)中的平板挑取单菌落在含有浓度100μg/mL氨苄抗生素与浓度50μg/mL 卡纳抗生素的双抗性与仅含浓度100μg/mL氨苄抗性的平板上点板，30℃培养过夜；
(iiii)将上步(iii)中的能在氨苄抗性平板生长但不能在卡纳抗性平板生长的单菌落置于无抗性的LB液体培养基中在30℃下培养12h。
根据本发明优选的，所述步骤(7)中，消除pCP20质粒的具体步骤如下：
(i)将步骤(6)中的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pCP20菌株置于于42℃无抗性的LB液体培养基培养12-16h；
(ii)将上步(i)中的菌液在无抗性平板上划线培养12-16h；
(iii)挑取单菌落在无抗生素的LB液体培养基培养12h，随后PCR验证pCP20是否丢失，保留PCR无条带的菌液即为BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(8)中，BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal工程菌株的构建步骤如下：
(i)将步骤(7)中的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE利用氯化钙法制得感受态；
(ii)将工程质粒pET-Duet1-glms-gnal转化上步(i)制得的BL21-ΔyoaD-ΔyoaE菌株感受态细胞，在含有浓度100μg/mL氨苄抗性的平板上涂板过夜；
(iii)挑取阳性克隆子于含有浓度100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基培养12h；
(iiii)保藏PCR验证正确的单菌落菌液即为BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal工程菌株。
上述BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal工程菌株制备GlmS酶的方法，步骤如下：
(a)取重组工程菌BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal接种于LB培养基中，在36～38℃进行活化培养10～14h，制得活化菌株；
(b)将步骤(a)制得的活化菌株接种于种子培养基中，在36～38℃条件下进行种子培养8～12h，制得种子液；
(c)向步骤(b)的种子液中加入IPTG至浓度为1mM，在21～23℃,180～220r/min条件下进行诱导培养10～14h，制得诱导菌液；
(d)将步骤(c)制得的诱导菌液离心，收集菌体，pH为7.0的磷酸缓冲液冲洗后，破碎菌体，制得GlmS酶液。
有益效果
本发明首次发现了大肠杆菌染色体上的yoaD与yoaE基因敲除后可以提高菌株表达外源GlmS酶的能力，且它们之间具有叠加增效的技术效果，这对于整个氨糖的合成途径有着重要的意义，并且敲除成功后不会留下任何抗性基因残留；两个基因的共缺失后，使得工程菌株表达外源GlmS的能力较原始菌株提高3倍左右。
附图说明
图1同源敲除片段的构建流程图；
图2同源敲除片段构建成功电泳图；
图3基因敲除验证电泳图；
图中：(a)泳道1：含有yoaD基因在内的原始基因片段(2090bp)；泳道2：含有yoaD基因在内的原始基因片段(2090bp)；
(b)：泳道1和2：含有yoaD基因与yoaE基因在内的原始基因片段(4116bp)；
(c)：泳道1：yoaD基因敲除后的PCR片段；泳道2：yoaE基因敲除后的PCR片段；泳道3：yoaD基因与yoaE基因敲除后的PCR片段；
图4BL21-ΔmanX-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal工程菌株质粒验证图；
图中：左图、gnal片段验证图；右图、glms片段验证图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
培养基
卡纳抗生素的LB液体培养基(g/L):酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，卡纳抗生素终浓度为50ug/ml，pH6.5；
卡纳抗生素的LB固体培养基(g/L):酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，琼脂20，卡纳抗生素终浓度为50ug/ml，pH6.5；
氨苄抗性的LB液体培养基(g/L):酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，氨苄抗生素终浓度为100ug/ml，pH6.5；
氨苄抗性的LB固体培养基(g/L):酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，琼脂20，氨苄抗生素终浓度为100ug/ml，pH6.5；
双抗性的LB液体培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，卡纳抗生素终浓度为50ug/ml，氨苄抗生素终浓度为100ug/ml，pH6.5；
双抗性的LB固体培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，琼脂20，卡纳抗生素终浓度为50ug/ml，氨苄抗生素终浓度为100ug/ml，pH6.5；
无抗性LB液体培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，pH6.5；
无抗性LB固体培养基(g/L)：酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，琼脂20，pH6.5；
实施例1整合片段-1的构建
(i)寻找yoaD基因上游区500bp碱基与yoaE基因下游区500bp碱基；利用引物yoaD-1 与yoaD-2克隆yoaD基因上游区500bp碱基，利用引物yoaD-3与yoaE-4克隆FRT-kan-FRT片段，利用引物yoaE-5与yoaE-6克隆yoaE基因下游区500bp碱基。
(ii)将yoaD基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT和yoaE基因下游区500bp碱基利用重叠pcr构建获得初步的整合片段-1。
(iii)利用引物yoaD-1与yoaE-6获得完整的整合片段-1。
所述的引物如下：
yoaD-1(上游)：
GGAAGTTGGTTGCCAGGGCG
yoaD-2(下游)：
AGAGAATAGGAACTTCGTTTTTGCATGCGGG
yoaD-3(上游)：
CCCGCATGCAAAAACGAAGTTCCTATTCTCT
yoaE-4(下游)：
CCTCAATTTGGGCGGGAAGTTCCTATACTTT
yoaE-5(上游)：
AAAGTATAGGAACTTCCCGCCCAAATTGAGG
yoaE-6(下游)：
TCACTTGCTACCTCCTTTATTATCGTTAACAC
所述实施例1(i)中yoaD基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT和yoaE基因下游区500bp碱基的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，补加ddH2O 至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
所述实施例1(ii)中初步的整合片段-1重叠pcr扩增体系如下，总体系为25ul：
2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，yoaD基因上游区500bp碱基3μl，FRT-kan-FRT片段 3μl和yoaE基因下游区500bp碱基3μl，补加ddH2O至25ul。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min，7个循环；72℃彻底延伸5min。
所述实施例1(iii)中完整的整合片段-1的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物yoaD-1 2μl，下游引物yoaE-6 2μl，模板(初步的整合片段-1)2μl，补加ddH2O至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
实施例2构建BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株。
将pKD46质粒在42℃水浴中热激90sec进入BL21(DE3)感受态构建工程菌株BL21-pKD46；将BL21-pKD46转化菌液涂布含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板，将平板置于30℃过夜培养；在放置过夜的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养。
将上述BL21-pKD46工程菌株在携带有氨苄的抗生素LB液体培养基中培养，当菌体OD值达到0.2左右时，在菌液中添加诱导剂进行重组酶的表达；当菌体OD值达到0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-pKD46感受态。
将实施例1中的完整的整合片段-1在42℃水浴中热激90sec转化进入BL21-pKD46感受态；涂板过夜在双抗平板上挑取单菌落于双抗抗生素的LB液体培养基中培养12h；单菌落菌液用pcr验证yoaD与yoaE基因是否共缺失，保留拥有理想条带的单菌落培养液即为BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将上述BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)接种于含有卡纳抗生素(50μg/mL)的LB液体培养基中，42℃培养12h后在含有卡纳抗生素的平板上划线并置于37℃培养8h；将上一步的平板单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有卡纳抗生素的平板上37℃培养过夜，挑取仅可以在含有卡纳抗生素的平板上生长的单菌落即为 BL21-ΔyoaD-ΔyoaE(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将BL21-ΔyoaD-ΔyoaE(含有FRT-kan-FRT结构框)工程菌株培养于含有卡纳抗生素的 LB液体培养基，当OD为0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-ΔyoaD-ΔyoaE(含有 FRT-kan-FRT结构框)感受态；在42℃水浴中热激90sec将pCP20质粒转化进入 BL21-ΔyoaD-ΔyoaE(含有FRT-kan-FRT结构框)感受态细胞并在含有氨苄抗生素的平板上涂板培养12h(30℃)；将上一步的单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有氨苄抗生素的平板上，在30℃培养12-16h，挑取仅在氨苄抗生素平板上生长的单菌落即为 BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pCP20工程菌株(此时FRT-kan-FRT结构框已被清除)。
在不含抗生素的LB液体培养基中接种BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-pCP20工程菌株，于42℃培养12h；取菌液划线于无抗性平板37℃培养12h，随后将单菌落点板于含有氨苄抗生素平板与无抗性平板上，挑取仅在无抗性平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌株。
所述实施例2中验证yoaD基因与yoaE基因共缺失的pcr扩增体系如下，总体系为20ul：
2×Taq Max Master Mix 10μl，上游引物yoaD-1 2μl，下游引物yoaE-6 2μl，模板2μl，补加ddH2O至20μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃彻底延伸10min。
实施例3工程质粒pET-Duet1-glms-gnal的构建
(i)利用基因组试剂盒提取Bacillus subtilis 168与Saccharomycescerevisiae S288C的基因组。
(ii)将原始质粒pETDuet-1用Nco1与Hindlll进行酶切后获得pET-Duet1-片段1，利用引物glms-F与glms-R获得glms片段，利用无缝克隆技术将pET-Duet1-片段1与glms片段连接构建成工程质粒pET-Duet1-glms；将pET-Duet1-glms质粒在42℃条件下热激转化至DH5α感受态并涂布于含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板，将平板置于37℃过夜培养；在放置过夜的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养并测序，保留测序正确的DH5α-pET-Duet1-glms菌株。
所述实施例3(ii)中的引物如下：
glms-F(上游)
TAAGAAGGAGATATACCATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG
glms-R(下游)
GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACTCCACAGTAACACTCTTCGCA
所述实施例3(ii)中glms片段的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物glms-F 2μl，下游引物glms-R 2μl，模板 (Bacillus subtilis 168基因组)2μl，补加ddH2O至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，61℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min
(iii)将工程质粒pET-Duet1-glms用Nde1与Xho1进行酶切后获得pET-Duet1-glms-片段1，利用引物gna1-F与gna1-R获得gna1片段，利用无缝克隆技术将pET-Duet1-glms-片段1与gna1片段连接构建成工程质粒pET-Duet1-glms-gna1；将pET-Duet1-glms-gna1质粒在 42℃条件下热激转化至DH5α感受态并涂布于含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板，将平板置于37℃过夜培养；在放置过夜的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养并测序，保留测序正确的DH5α- pET-Duet1-glms-gna1菌株。
所述实施例3(iii)中的引物如下：
gna1-F(上游)
TAAGAAGGAGATATACATATGAGCTTACCCGATGGATTTTA
gna1-R(下游)
TTTCTTTACCAGACTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG
所述实施例3(iii)中gna1片段的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物gna1-F 2μl，下游引物gna1-R 2μl，模板(Saccharomyces cerevisiae S288C基因组)2μl，补加ddH2O至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15min，30个循环；72℃彻底延伸5min
实施例4重组菌BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal的构建
将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal利用化学转化法转化：将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal 在42℃水浴中热激60sec化转至BL21-ΔyoaD-ΔyoaE感受态中。在添加有氨苄抗生素的LB 平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，并且以能够生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出正确条带的转化子进行测序验证，以保证本发明所使用的pET-Duet1-glms-gnal正确的转入BL21-ΔyoaD-ΔyoaE工程菌而未发生任何突变。
实施例5重组菌中Glms蛋白的表达以及酶液的获得
将BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal，BL21-ΔyoaD-glms-gnal，BL21-ΔyoaE-glms-gnal与构建的BL21-glms-gnal工程菌接种于活化培养基中，在37℃进行活化培养12h，制得活化菌株；将制得的活化菌株接种于种子培养基中，在37℃条件下进行种子培养8-12h，利用紫外分光光度计在600nm检测OD约为2-6；在培养的菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，在 22℃,200r/min条件下进行诱导培养12h。将诱导12h后的的菌液进行离心收集菌体，倒去上清后加入10ml磷酸缓冲液(pH为7.0)重悬，再次离心后倒去上清，在菌体中加入5ml磷酸缓冲液(pH为7.0)重悬后利用超声破碎仪破碎菌体获得酶液。
对比例1工程菌株BL21-ΔyoaD-glms-gnal的构建过程
(a)整合片段-2的构建
(i)寻找yoaD基因上游区500bp碱基与yoaD基因下游区500bp碱基；利用引物yoaD-1 与yoaD-2克隆yoaD基因上游区500bp碱基，利用引物yoaD-3与yoaD-4克隆FRT-kan-FRT结构框，利用引物yoaD-5与yoaD-6克隆yoaD基因下游区500bp碱基。
(ii)将yoaD基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT结构框和yoaD基因下游区500bp碱基利用重叠pcr构建获得初步的整合片段-2。
(iii)利用引物yoaD-1与yoaD-6获得完整的整合片段-2。
所述的引物如下：
yoaD-1(上游)：
GGAAGTTGGTTGCCAGGGCG
yoaD-2(下游)：
AGAGAATAGGAACTTCGTTTTTGCATGCGGG
yoaD-3(上游)：
CCCGCATGCAAAAACGAAGTTCCTATTCTCT
yoaD-4(下游)：
CTTTTATCAGCACACGAAGTTCCTATACTTT
yoaD-5(上游)：
AAAGTATAGGAACTTCGTGTGCTGATAAAAG
yoaD-6(下游)：
TTAACGTAACGGCATAATGGGCGTGATATGT
根据本发明所优选的，所述对比例1(a)(i)中yoaD基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT 结构框和yoaD基因下游区500bp碱基的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，补加ddH2O 至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
根据本发明所优选的，所述对比例1(a)(ii)中初步的整合片段-2重叠pcr扩增体系如下，总体系为25ul：
2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，yoaD基因上游区500bp碱基3μl，FRT-kan-FRT片段 3μl和yoaD基因下游区500bp碱基3μl，补加ddH2O至25ul。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min，7个循环；72℃彻底延伸5min。
根据本发明所优选的，所述对比例1(a)(iii)中完整的整合片段-2的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物yoaD-1 2μl，下游引物yoaD-6 2μl，模板(初步的整合片段-2)2μl，补加ddH2O至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
(b)构建BL21-ΔyoaD工程菌株。
将pKD46质粒在42℃水浴中热激90sec进入BL21(DE3)感受态构建工程菌株BL21-pKD46；将BL21-pKD46转化菌液涂布含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板，将平板置于30℃过夜培养；在放置过夜的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养。
将上述BL21-pKD46工程菌株在携带有氨苄的抗生素LB液体培养基中培养，当菌体OD值达到0.2左右时，在菌液中添加诱导剂进行重组酶的表达；当菌体OD值达到0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-pKD46感受态。
将对比例1(a)(iii)中的完整的整合片段-2在42℃水浴中热激90sec转化进入BL21- pKD46感受态；涂板过夜在双抗平板上挑取单菌落于双抗抗生素的LB液体培养基中培养 12h；单菌落菌液用pcr验证yoaD基因是否缺失，保留拥有理想条带的单菌落培养液即为 BL21-ΔyoaD-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将上述BL21-ΔyoaD-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)接种于含有卡纳抗生素(50μg/mL)的LB液体培养基中，42℃培养12h后在含有卡纳抗生素的平板上划线并置于37℃培养8h；将上一步的平板单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有卡纳抗生素的平板上37℃培养过夜，挑取仅可以在含有卡纳抗生素的平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaD菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将BL21-ΔyoaD(含有FRT-kan-FRT结构框)工程菌株培养于含有卡纳抗生素的LB液体培养基，当OD为0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-ΔyoaD(含有FRT-kan-FRT结构框)感受态；在42℃水浴中热激90sec将pCP20质粒转化进入BL21-ΔyoaD(含有 FRT-kan-FRT结构框)感受态细胞并在含有氨苄抗生素的平板上涂板培养12h(30℃)；将上一步的单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有氨苄抗生素的平板上，在30℃培养12-16h，挑取仅在氨苄抗生素平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaD-pCP20工程菌株(此时 FRT-kan-FRT结构框已被清除)。
在不含抗生素的LB液体培养基中接种BL21-ΔyoaD-pCP20工程菌株，于42℃培养12h；取菌液划线于无抗性平板37℃培养12h，随后将单菌落点板于含有氨苄抗生素平板与无抗性平板上，挑取仅在无抗性平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaD工程菌株。
根据本发明所优选的，所述对比例1(b)中验证yoaD基因缺失的pcr扩增体系如下，总体系为20ul：
2×Taq Max Master Mix 10μl，上游引物yoaD-1 2μl，下游引物yoaD-6 2μl，模板2μl，补加ddH2O至20μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃彻底延伸10min。
(c)重组菌BL21-ΔyoaD-glms-gnal的构建
将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal利用化学转化法转化：将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal 在42℃水浴中热激60sec化转至BL21-ΔyoaD感受态中。在添加有氨苄抗生素的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，并且以能够生长的菌液进行pcr验证，将能够扩增出正确条带的转化子进行测序验证，以保证本发明所使用的pET-Duet1-glms-gnal正确的转入BL21-ΔyoaD工程菌而未发生任何突变。
对比例2工程菌株BL21-ΔyoaE-glms-gnal的构建过程
(a)整合片段-3的构建
(i)寻找yoaE基因上游区500bp碱基与yoaE基因下游区500bp碱基；利用引物yoaE-1 与yoaE-2克隆yoaE基因上游区500bp碱基，利用引物yoaE-3与yoaE-4克隆FRT-kan-FRT结构框，利用引物yoaE-5与yoaE-6克隆yoaE基因下游区500bp碱基。
(ii)将yoaE基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因下游区500bp碱基利用重叠pcr构建获得初步的整合片段-3。
(iii)利用引物yoaE-1与yoaE-6获得完整的整合片段-3。
所述的引物如下：
yoaE-1(上游)：
TTACTCATCTTCATCGTGCGCCGGTT
yoaE-2(下游)：
AGAATAGGAACTTCGTGCTGGTGGCGCTG
yoaE-3(上游)：
CAGCGCCACCAGCACGAAGTTCCTATTCT
yoaE-4(下游)：
CCTCAATTTGGGCGGGAAGTTCCTATACTTT
yoaE-5(上游)：
AAAGTATAGGAACTTCCCGCCCAAATTGAGG
yoaE-6(下游)：
TCACTTGCTACCTCCTTTATTATCGTTAACAC
所述对比例2(a)(i)中yoaE基因上游区500bp碱基，FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因下游区500bp碱基的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，补加ddH2O 至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
所述对比例2(a)(ii)中初步的整合片段-3重叠pcr扩增体系如下，总体系为25ul：
2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，yoaE基因上游区500bp碱基3μl，FRT-kan-FRT片段 3μl和yoaE基因下游区500bp碱基3μl，补加ddH2O至25ul。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min，7个循环；72℃彻底延伸5min。
所述对比例2(a)(iii)中完整的整合片段-3的pcr扩增体系如下，总体系为50ul：
2×Phanta Max Master Mix 25μl，上游引物yoaE-1 2μl，下游引物yoaE-6 2μl，模板(初步的整合片段-2)2μl，补加ddH2O至50μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min。
(b)构建BL21-ΔyoaE工程菌株。
将pKD46质粒在42℃水浴中热激90sec进入BL21(DE3)感受态构建工程菌株BL21-pKD46；将BL21-pKD46转化菌液涂布含有氨苄抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板，将平板置于30℃过夜培养；在放置过夜的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养。
将上述BL21-pKD46工程菌株在携带有氨苄的抗生素LB液体培养基中培养，当菌体OD值达到0.2左右时，在菌液中添加诱导剂进行重组酶的表达；当菌体OD值达到0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-pKD46感受态。
将对比例2(a)(iii)中的完整的整合片段-3在42℃水浴中热激90sec转化进入BL21- pKD46感受态；涂板过夜在双抗平板上挑取单菌落于双抗抗生素的LB液体培养基中培养 12h；单菌落菌液用pcr验证yoaE基因是否缺失，保留拥有理想条带的单菌落培养液即为 BL21-ΔyoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将上述BL21-ΔyoaE-pKD46工程菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)接种于含有卡纳抗生素(50μg/mL)的LB液体培养基中，42℃培养12h后在含有卡纳抗生素的平板上划线并置于37℃培养8h；将上一步的平板单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有卡纳抗生素的平板上37℃培养过夜，挑取仅可以在含有卡纳抗生素的平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaE菌株(含有FRT-kan-FRT结构框)。
将BL21-ΔyoaE(含有FRT-kan-FRT结构框)工程菌株培养于含有卡纳抗生素的LB液体培养基，当OD为0.6左右时收集菌体利用氯化钙法制备BL21-ΔyoaE(含有FRT-kan-FRT结构框)感受态；在42℃水浴中热激90sec将pCP20质粒转化进入BL21-ΔyoaE(含有 FRT-kan-FRT结构框)感受态细胞并在含有氨苄抗生素的平板上涂板培养12h(30℃)；将上一步的单菌落点板于含有双抗性平板与仅含有氨苄抗生素的平板上，在30℃培养12-16h，挑取仅在氨苄抗生素平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaE-pCP20工程菌株(此时 FRT-kan-FRT结构框已被清除)。
在不含抗生素的LB液体培养基中接种BL21-ΔyoaE-pCP20工程菌株，于42℃培养12h；取菌液划线于无抗性平板37℃培养12h，随后将单菌落点板于含有氨苄抗生素平板与无抗性平板上，挑取仅在无抗性平板上生长的单菌落即为BL21-ΔyoaE工程菌株。
根据本发明所优选的，所述对比例2(b)中验证yoaE基因缺失的pcr扩增体系如下，总体系为20ul：
2×Taq Max Master Mix 10μl，上游引物yoaE-1 2μl，下游引物yoaE-6 2μl，模板2μl，补加ddH2O至20μl。
所述的目的片段pcr扩增过程如下：
95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃彻底延伸10min。
(c)重组菌BL21-ΔyoaE-glms-gnal的构建
将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal利用化学转化法转化：将重组质粒pET-Duet1-glms-gnal 在42℃水浴中热激60sec化转至BL21-ΔyoaE感受态中。在添加有氨苄抗生素的LB平板上筛选阳性克隆转化子，从平板挑取单一菌落至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，并且以能够生长的菌液进行pcr验证，将能够扩增出正确条带的转化子进行测序验证，以保证本发明所使用的pET-Duet1-glms-gnal正确的转入BL21-ΔyoaE工程菌而未发生任何突变实施例6酶活测定
底物配置方法如下：1mL 100mmol/L PBS(pH7.5)中包括15mmol/L Gln,20mmol/LFru-6-P, 2.5mmol/L EDTA。
酶活定义为：1ml酶液1min内催化底物生成1ug谷氨酸的量作为1个氨糖合成酶活力单位。
计算方法如下：U(ug/ml·min)＝(C·V1/100)/(T·V2/1000)
C:谷氨酸的浓度(mg/dL)
V1:反应总体积(120uL)
V2:反应酶液体积(20uL)
T:反应时间(min)
100为mg/dL转化为ug/uL的系数
1000为uL转化为mL的系数
BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal,BL21-ΔyoaD-glms-gnal,BL21-ΔyoaE-glms-gnal与 BL21-glms-gnal(本实验室构建)在LB液体中诱导后所测得的最高酶活数据见表5。
表5大肠杆菌基因缺失型与未缺失型菌株中GlmS酶活对比表
通过上述实施例和对比例的结果对比，BL21-ΔyoaD-ΔyoaE-glms-gnal的Glms酶活相比于BL21-ΔyoaD-glms-gnal和BL21-ΔyoaE-glms-gnal的酶活都高。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种通过yoaD和yoaE基因共缺失提高大肠杆菌GlmS酶活力的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgcaaaaag cacaacggat cattaaaacc tatcgccgta atcgaatgat tgtttgtacg 60
atttgcgcac tcgttacgct cgcttcgacc ctgagcgtgc gatttatttc acagcgtaac 120
ttaaatcaac aacgggtagt acaattcgcc aatcacgctg tagaggaatt agataaagta 180
ctgcttcccc tacaggcagg tagcgaagtc ttgcttccgc tgattggtct gccctgctct 240
gtcgcccatt tgccattacg taaacaggcg gcaaaactcc aaactgtgcg atccattggc 300
ctggtgcaag acggcacact ctattgctcc agcatttttg gttatcgcaa tgtgcccgtc 360
gtggacattc tggctgaact tcctgcaccg caaccacttt tacgcctgac gatcgaccgt 420
gccctgatta aaggcagtcc ggttttgatt caatggacgc ctgcagcggg cagtagcaat 480
gctggggtca tggagatgat taacatcgac ttactgacgg caatgctcct tgagccacaa 540
ctgccgcaaa tcagtagcgc cagcctgacg gtggacaaac ggcatttgct ctatggtaat 600
gggctggtag attcccttcc gcaacctgaa gacaatgaaa actatcaggt ttcttcgcaa 660
cgctttcctt ttaccattaa cgttaatggt ccgggggcta cggcgctggc atggcactat 720
cttccaacac aattaccgct ggcggtgctg ctaagtttac tggtgggcta catcgcctgg 780
ctggcgaccg cttaccggat gagcttttcc cgcgaaatca atctgggcct ggcgcaacat 840
gagttcgaat tgttctgtca gcctttgctt aatgcgcgca gccagcaatg tattggtgta 900
gagattttgc tgcgctggaa caatccgcgt cagggctgga tttcaccgga tgtgtttatt 960
cctatcgcgg aagaacatca tttaattgtg ccactgaccc gctatgtgat ggcagaaacc 1020
attcgtcagc gccatgtttt cccgatgagt agtcagtttc atgttggcat taacgtcgca 1080
cccagccatt ttcgccgtgg tgtgctgata aaagatctca atcagtactg gtttagcgct 1140
cacccgattc agcaactgat cctcgaaatc accgaacgcg atgccttact ggatgttgat 1200
tatcggattg cccgcgagct acatcgtaaa aacgtcaaac tggcgattga tgacttcggc 1260
accggcaaca gttcattttc ctggcttgaa acattacgtc ctgacgtgct gaaaattgat 1320
aagtcattta ccgcagctat aggttctgac gcggttaact cgacggtgac cgatatcatc 1380
atcgcgctgg ggcaaagact gaatattgaa ctggtggcgg agggcgtgga aacgcaagaa 1440
caggcgaagt atttgcgccg tcatggcgtg catattttgc aagggtattt gtacgcacag 1500
ccgatgccgc tgcgtgattt tcccaaatgg ctggcgggca gccaaccgcc gcccgcccgg 1560
cataatggac atatcacgcc cattatgccg ttacgttaa 1599
<210> 2
<211> 1557
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
ttactcatct tcatcgtgcg ccggttgctc tttaacaatg cgaaccagat caacacgata 60
atcattggct tcaatgatgg tgatatgcag tggccctaca tcaatcacat cgcccacacg 120
gggaatgtga ccatttgccg agatcaccag gcccgcgacc gtcgcgatat catcgtcatc 180
ggcaaggtgc tcaacatcaa gcgcctgctg caaggcatgc aaatctgtac cgccttttac 240
cagccagccg tcaccatcag taatgatttc cggcgtttcg tcagcgtccg ggaattcacc 300
cgcaatggct tccagcacat ccagcggcgt gaccaagcct tgtaccacac caaactcgtt 360
ggtcacgata acaaagctcc cgcgagcgcg acgcagcacg cccagcaggt tgatcggatc 420
gagggtttcc gggacgataa tcgccggaga cgccgaagca atcgccgcca catcaacgcc 480
ctcttccagc gccaccagca gttctttagc acgtacgatt ccgatgattt catccagttc 540
accgcgacat accgggaaca ggctgtgcgg tgaggagagc agctgctcgc ggatttcatc 600
gaccccgaga ttagcgtcaa cccagcttat ttcaccgcgc ggcgtcatga tcccgcgcag 660
agaacgcgac gccagcgtca gtacgccgtt aatcatgtaa cgttcttctt cggcaaatgc 720
accttccggg atcggcatcg gcatcgggtt atcggcatcg tgctgaacat tggcctgacg 780
tttcccgccc atcaaacgca ggatggcatc ggcagtacgc gctcgcagcg gcaaagtcga 840
ctggtgacga ataaagttgc gacgcgcaat ctggttaaac acttcgatga tgatcgagaa 900
gccaatcgcg gcatacaggt aacctttcgg aatgtggaaa ccgaaacctt ctgccaccag 960
actcagacca atcattaaca ggaagctcag acagagcacc accaccgtgg ggtgctggtt 1020
aacgaatcgc gtcagcggtt tggatgccag caacataacc gccatcgcaa tcactaccgc 1080
cgccatcatc accggcagat ggttaaccat ccctactgca gtaattaccg catccaacga 1140
gaagacggcg tcaaggatga caatctgtgt gacgaccacc cagaaactgg cgtagccttt 1200
accgtggccg gaatcatgat cgcggttttc cagccgttca tgcagttcgg ttgttgcttt 1260
gaacagcaag aatatccccc cgaacaacat aatcaggtcg cgtccggaga aggagaaatc 1320
catgacggta aatagcggtt tggtcagcgt gaccatccat gaaatcagcg acagcagccc 1380
cagacgcata atcagcgcca gtgataaccc cagcaaacgc gctttatcgc gttgttttgg 1440
cggcagtttg tcagcaagaa tggcgatgaa gaccaggtta tcgataccca gcacaatttc 1500
gagaacaaca agcgtgagta gccccgccca aattgagggg tccattaaga attccat 1557
Claims (12)
1.一种通过缺失yoaD表达基因提高重组菌表达外源GlmS酶表达水平的应用，所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重组菌为重组大肠杆菌。
2.一种通过缺失yoaE表达基因提高重组菌表达外源GlmS酶表达水平的应用，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述重组菌为重组大肠杆菌。
3.一种提高重组菌表达外源GlmS酶表达水平的方法，通过敲除GlmS酶表达菌中的yoaD表达基因和yoaE表达基因制备重组菌实现；所述yoaD表达基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述yoaE表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述重组菌为重组大肠杆菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将pKD46质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，构建BL21-pKD46工程菌株；
（2）将yoaD基因上游区的500bp碱基，pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框和yoaE基因的下游区500bp碱基利用重叠PCR构建成整合片段-1；
（3）将步骤（2）中的整合片段-1转化进入经过诱导的BL21-pKD46感受态细胞；
（4）利用red同源重组技术分别敲除步骤（3）菌株的染色体上的yoaD基因和yoaE基因，制得含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE- pKD46工程菌株；
（5）清除步骤（4）构建的BL21-△yoaD-△yoaE- pKD46工程菌株中的pKD46质粒，制得含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株；
（6）将pCP20质粒转化步骤（5）构建的含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株感受态细胞，制得BL21-△yoaD-△yoaE-pCP20工程菌株；
（7）清除步骤（6）构建的BL21-△yoaD-△yoaE-pCP20菌株中的pCP20质粒，得到BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株；
（8）构建工程质粒pET-Duet1-glms-gnal，将工程质粒pET-Duet1-glms-gnal转化步骤（7）制得的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株，制得BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal工程菌株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，BL21-pKD46工程菌株的构建方法如下：
将pKD46质粒通过化学转化法转化进入BL21（DE3）感受态细胞，在抗性平板上筛选阳性克隆子。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述整合片段-1的构建方法如下：
分别在yoaD基因的上游区和yoaE基因的下游区选取500bp作为同源臂，随后通过重叠PCR将pKD13质粒中的FRT-kan-FRT结构框连接到两个同源臂之间，即构建得到整合片段-1。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，利用red同源重组技术敲除的具体步骤如下：
（i）将BL21-pKD46工程菌株在含有浓度100µg/mL氨苄抗生素平板上划线，30℃过夜；
（ii）选取阳性克隆子在含有浓度100µg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，当OD600=0.2时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为10 mM进行诱导培养；当OD600=0.6时停止诱导并利用氯化钙法制做BL21-pKD46感受态；
（iii）将步骤（2）中构建的敲除同源片段通过化学转化法转化进入BL21-pKD46感受态，并在含有浓度100µg/mL氨苄抗生素与浓度50µg/mL卡纳抗生素平板上涂板过夜；
（iv）从过夜的平板上挑取单菌落接种于双抗性LB液体培养基中，在30℃培养7～9h；将生长的菌液进行质粒PCR验证，选取条带的菌株。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，清除BL21-△yoaD-△yoaE-pKD46中pKD46质粒的具体步骤如下：
（i）将BL21-△yoaD-△yoaE-pKD46菌株接种于含有浓度50µg/mL卡纳抗性的LB液体培养基中42℃过夜培养；
（ii）将过夜培养菌液划线于含有浓度50µg/mL卡纳抗性的平板上37℃培养8-12h；
（iii）将上述（ii）中的单菌落在含有浓度100µg/mL氨苄抗生素与浓度50µg/mL卡纳抗生素的双抗性平板上以及仅含浓度50µg/mL卡纳抗性的平板上分别点板培养，37℃过夜，挑取能在卡纳抗性平板生长但不能在双抗性平板上生长的单菌落于含有卡纳抗性的LB液体培养基中培养8-12h。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，还包括除FRT-kan-FRT结构框的步骤，具体步骤如下：
（i）将含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株接种于含有双抗性的LB液体培养基中，当OD600=0.6时通过氯化钙法制得其感受态；
（ii）将pCP20质粒转化进入含有FRT-kan-FRT结构框的BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株感受态，在含有氨苄抗生素的平板上涂板并置于30℃培养12-16h；
（iii）从上步（ii）中的平板挑取单菌落在含有浓度100µg/mL氨苄抗生素与浓度50µg/mL卡纳抗生素的双抗性与仅含浓度100µg/mL氨苄抗性的平板上点板，30℃培养过夜；
（iiii）将上步（iii）中的能在氨苄抗性平板生长但不能在卡纳抗性平板生长的单菌落置于无抗性的LB液体培养基中在30℃下培养12h。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，消除pCP20质粒的具体步骤如下：
（i）将步骤（6）中的BL21-△yoaD-△yoaE-pCP20菌株置于42℃无抗性的LB液体培养基培养12-16h；
（ii）将上步（i）中的菌液在无抗性平板上划线培养12-16h；
（iii）挑取单菌落在无抗生素的LB液体培养基培养12h，随后PCR验证pCP20是否丢失，保留PCR无条带的菌液即为BL21-△yoaD-△yoaE工程菌株。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal工程菌株的构建步骤如下：
（i）将步骤（7）中的BL21-△yoaD-△yoaE利用氯化钙法制得感受态；
（ii）将工程质粒pET-Duet1-glms-gnal转化上步（i）制得的BL21-△yoaD-△yoaE菌株感受态细胞，在含有浓度100µg/mL氨苄抗性的平板上涂板过夜；
（iii）挑取阳性克隆子于含有浓度100µg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基培养12h；
（iiii）保藏PCR验证正确的单菌落菌液即为BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal工程菌株。
12.利用权利要求4中制备获得的BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal工程菌株制备GlmS酶的方法，其特征在于，步骤如下：
（a）取重组工程菌BL21-△yoaD-△yoaE-glms-gnal接种于LB培养基中，在36～38℃进行活化培养10～14h，制得活化菌株；
（b）将步骤（a）制得的活化菌株接种于种子培养基中，在36～38℃条件下进行种子培养8～12h，制得种子液；
（c）向步骤（b）的种子液中加入IPTG至浓度为1mM，在21～23℃,180～220r/min条件下进行诱导培养10～14h，制得诱导菌液；
（d）将步骤（c）制得的诱导菌液离心，收集菌体， pH为7.0的磷酸缓冲液冲洗后，破碎菌体，制得GlmS酶液。
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|---|
| Expression and Genetic Activation of Cyclic Di-GMP-Specific Phosphodiesterases in Escherichia coli;Alberto Reinders等;《J Bacteriol.》;20160201;第198卷(第3期);448-462 * |
| More than enzymes that make or break Cyclic Di-GMP—local signaling in the interactome of GGDEF/EAL domain proteins of Escherichia coli;Sarenko O等;《mBio》;20171031;第8卷(第5期);e01639-17 * |
| Systematic Nomenclature for GGDEF and EAL Domain-Containing;Hengge R等;《J Bacteriol》;20160131;第198卷(第1期);7-11 * |
| 高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展;刘佃磊 等;《生物技术通报》;20140331(第3期);36-41 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111088205A (zh) | 2020-05-01 |
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