CN111996171A

CN111996171A - 一种基于特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用

Info

Publication number: CN111996171A
Application number: CN202010922899.8A
Authority: CN
Inventors: 代楠; 张可; 赵勇刚
Original assignee: Shanghai Ruotai Pharmaceutical Technology Co ltd; Suzhou Royaltech Med Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruotai Pharmaceutical Technology Co ltd; Suzhou Royaltech Med Co ltd
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本公开涉及一种基于特异性免疫细胞，特别是基于携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌激活的特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。本公开在体外提取T细胞，通过减毒李斯特菌激活的抗原递呈细胞与T细胞进行共培养，在体外产生具有特定肿瘤抗原肽的T细胞，特异性T细胞回输体内产生肿瘤特异性免疫反应。本公开的技术方案可以可特异性地激活肿瘤特异性T细胞，从而引发一系列抗肿瘤免疫反应，且操作过程无需对自体细胞进行基因改造，靶向性和安全性都有显著提高。

Description

一种基于特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用

技术领域

本公开主要涉及生物技术领域，具体来说，本公开涉及一种肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。更具体的，本公开涉及一种基于携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌激活的特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用。

背景技术

随着对肿瘤的发生发展、机体抗肿瘤免疫应答、肿瘤免疫逃逸及肿瘤微环境等的深入研究和认识，以免疫治疗为基础的肿瘤生物疗法作为一种新兴的现代肿瘤治疗模式，有效地弥补了传统治疗方法的一些缺陷，为肿瘤的治疗提供了新的思路和方向。目前，肿瘤免疫治疗的主要研究方向包括肿瘤疫苗、检查点抑制剂、过继免疫治疗、治疗性抗体等。

细胞的过继免疫治疗(adoptive cell therapy，ACT)是将机体的免疫细胞在体外诱导、修饰、扩增，把筛选出的具有特异高效肿瘤杀伤活性的效应细胞回输到患者体内，以抑制和杀伤肿瘤的一种疗法^[1]，是继手术切除、化疗、放疗的传统方法之后的一种具有良好临床应用前景与疗效的新型抗肿瘤手段。随着新型过继免疫治疗技术的不断发展，具有抗原特异性的T细胞免疫治疗技术显示出其优越性。T细胞的过继免疫治疗主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)的过继性免疫治疗和通过基因修饰T细胞的过继性免疫治疗。

TILs是指从手术切除的肿瘤组织或转移的淋巴结中分离出来的淋巴细胞，这些细胞通过分泌细胞因子，如干扰素、IL-2和肿瘤坏死因子直接裂解肿瘤细胞。TILs虽然在临床上具有强大的细胞增殖能力和杀伤作用，但具有一定的肿瘤类型限制和MHC限制性；且在细胞的取材方面也受到限制，有的肿瘤不能切除，而可切除的肿瘤内淋巴细胞的浸润程度也不同，导致淋巴细胞的抗肿瘤活性也不同，这些都限制了TILs在肿瘤临床治疗中的应用^[2]。

基因修饰T细胞的过继性免疫治疗包括对T细胞受体进行修饰的T细胞(T cellreceptor-gene engineered T cells，TCR-T)治疗，对嵌合抗体受体修饰的T细胞(Chimeric antigen receptor T Cells,CAR-T)治疗。其中，对T细胞受体(T cellreceptor,TCR)进行基因修饰的过继免疫治疗是通过基因转移技术构建肿瘤抗原特异性TCR，通过病毒载体等方法将其转入T细胞，经大量扩增后回输患者从而发挥抗肿瘤效应的一种治疗技术。TCR-T的细胞治疗方法可适用于多种实体肿瘤，在制备过程中只需鉴定出非常少量的具有抗肿瘤活性的细胞作为分离抗原特异性TCR基因的基础。TCR基因一旦被整合到相应的转导载体中，就可包装出病毒后感染患者外周血T细胞并进行大量扩增，用于多种肿瘤类型的治疗^[3]。然而，TCR-T疗法的T细胞识别肿瘤特异性抗原治疗技术的限制性之一是TCR识别特异性抗原的能力具有MHC限制性，如何提高TCR的亲和能力以及扩大适用范围是该方法亟需解决的主要问题^[4-6]。

CAR-T疗法是通过将患者自身血液收集的T细胞进行基因工程处理，从而在其表面表达能够和特异性肿瘤抗原结合的嵌合受体，同时在受体胞内段加上引起T细胞活化的信号传递区域，使得回输的细胞能够通过非MHC限制的方式选择性的靶向和杀伤肿瘤细胞^[7]。CAR-T疗法能够产生大量针对肿瘤抗原的特异性T细胞，且改造的CAR-T细胞识别肿瘤过程中不受MHC的限制，显示出良好的靶向性，不仅能够识别肿瘤表面的蛋白质抗原，也能利用糖蛋白中聚糖和糖脂类抗原，具有更多肿瘤抗原靶点的选择。此外，CAR-T细胞可在体内存活较长时间，持续发挥作用；使用患者自身T细胞构建的CAR-T细胞降低了排异反应风险。然而该方法目前仅适于血液癌，而在实体瘤临床研究上未出现良好效果，且存在细胞因子风暴、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤部位、脱靶杀伤正常组织细胞及其他神经毒性症状^[8-11]。

由于现有细胞的过继免疫疗法存在对肿瘤抗原的亲和力不足，以及细胞因子风暴、脱靶效应等问题，因此，亟需开发一种新的具有肿瘤抗原特异性的T细胞，以解决T细胞免疫治疗中存在的安全性和靶向性的问题。

引用文献：

[1]Gattinoni L,Powell D J,Rosenberg S A,et al.Adoptive immunotherapyfor cancer:building on success[J].Nature reviews.Immunology,2006,6(5):383-393.

[2]Johnson LA,June CH.Driving gene-engineered T cell immunother-apyof cancer[J].Cell Res,2017,27:38-58.

[3]Kieback E,Uckert W.Enhanced T cell receptor gene therapy forcancer[J].Expert opinion on biological therapy[J],2010,10(5):749-762.

[4]Morgan R A,Chinnasamy N,Abate-Daga D,et al.Cancer regression andneurological toxicity following anti-MAGE-A3 TCR gene therapy[J].JImmunother,2013,36(2):133-151.

[5]Robbins P F,Morgan R A,Feldman S A,et al.Tumor regression inpatients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using geneticallyengineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1[J].J Clin Oncol,2011,29(7):917-924.

[6]Parkhurst M R,Yang J C,Langan R C,et al.T cells targeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastatic colorectal cancer butinduce severe transient colitis[J].Mol Ther,2011,19(3):620-626.

[7]Ramos CA,Dotti G.Chimeric antigen receptor(CAR)-engineeredlymphocytes for cancer therapy[J]

,Expert Opin Biol Ther,2011,11(7):855-873.

[8]Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,etal.Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia,2014,371(16):1507-17.

[9]Lee D W,Gardner R,Porter D L,et al.Current concepts in thediagnosis and management of cytokine release syndrome[J].Blood,2014,124(2):188-195.

[10]Cor H.J.Lamers,Klaver Y,Jan W.Gratama,et al.Treatment ofmetastatic renal cell carcinoma(mRCC)with CAIX CAR-engineered T-cells–acompleted study overview[J].Biochemical Society Transactions,2016,44(3):951.

[11]Yeku OO,Brentjens RJ.Armored CAR T-cells:utilizing cytokines andpro-inflammatory ligands to enhance CAR T-cell anti-tumour efficacy[J].Biochem Soc Trans 2016,44(2):412-8.

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术存在的问题，例如：细胞的过继免疫治疗存在T细胞对肿瘤抗原的亲和力有限，靶向性和安全性不足的缺陷。本公开提供了一种以减毒李斯特菌激活的抗原递呈细胞为基础的免疫治疗方法，并在体外提取CD8⁺T细胞，通过抗原递呈细胞与T细胞进行共培养，激活产生特异性T细胞的肿瘤免疫治疗方法。利用体外构建的携带肿瘤特异性抗原或新生抗原的减毒李斯特菌以及抗原递呈细胞的抗原递呈特性，在体外能够迅速获得具有特定肿瘤抗原肽的T细胞，进而回输体内产生肿瘤特异性免疫反应。该方法的优势在于可特异性地激活肿瘤特异性T细胞，从而引发一系列抗肿瘤免疫反应，且操作过程无需对自体细胞进行基因改造，靶向性和安全性都有显著提高。

用于解决问题的方案

(1)一种工程化细胞，所述工程化细胞是将免疫细胞与修饰细胞接触后获得的特异性免疫细胞；其中，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，

所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；

所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体包含所述(i)重组核酸分子的序列；

所述(iv)重组蛋白由所述(i)重组核酸分子编码，或由所述(ii)重组质粒或(iii)重组表达载体表达。

(2)根据(1)所述的工程化细胞，所述具有目标效应活性的细胞选自巨噬细胞、单核细胞和/或树突状细胞；优选地，所述抗原呈递细胞选自骨髓诱导巨噬细胞，和/或骨髓诱导树突状细胞；

所述免疫细胞为T细胞；优选地，所述免疫细胞为CD8⁺T细胞。

(3)根据(1)或(2)所述的工程化细胞，所述(i)重组核酸分子中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。

(4)根据(1)-(3)任一项所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。

(5)根据(4)所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

(6)根据(1)或(2)所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；可选的，所述(i)重组核酸分子中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:10所示的序列的核苷酸序列；优选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。

(7)根据(6)所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，和编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

(8)根据(1)-(7)任一项所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述第一启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。

(9)一种药物组合物，其含有治疗有效量的，根据(1)-(8)中任一项所述的工程化细胞；可选的，所述药物组合物进一步包含第二治疗试剂和/或药学上可接受的载体；优选的，所述第二治疗试剂选自第二抗癌试剂；更优选的，所述第二抗癌试剂选自第二修饰细胞、第二重组李斯特菌、放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂。

(10)(1)-(8)中任一项所述的工程化细胞，或(9)所述药物组合物在制备用于杀死细胞的药物中的应用。

(11)根据(10)所述的应用，其中，所述细胞被包含在患者体内；可选的，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。

(12)(1)-(8)中任一项所述的工程化细胞，或(9)所述药物组合物在如下(a)-(c)至少一种中的应用：

(a)制备用于治疗或预防肿瘤患者的药物；

(b)制备用于缓慢持续杀伤细胞的药物；

(c)制备在受试者中诱导免疫应答的药物。

(13)一种制备工程化细胞的方法，其中，包括将免疫细胞与(1)-(8)任一项所述的修饰细胞共培养，获得所述特异性免疫细胞；可选的，所述方法还包括使用含有细胞因子的培养基重悬所述共培养的细胞。

(14)—种缓慢持续杀伤细胞的方法，包括将所述细胞与(1)-(8)任一项所述的工程化细胞，或(9)所述的药物组合物接触。

(15)根据(14)所述的方法，其中，所述的细胞被包含在患者体内；可选的，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。

(16)根据(15)所述的方法，其将所述细胞与(1)-(8)中任一项所述的工程化细胞，或(9)所述的药物组合物施用至患者体内。

(17)根据(17)所述的方法，其中，(1)-(8)中任一项所述的工程化细胞，或(9)所述的药物组合物可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；可选的，所述系统性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。

(18)根据(16)-(17)任一项所述的方法，所述方法进ー步包括施用第二抗癌疗法；优选的，所述第二种抗癌疗法可以是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或上述疗法的一种或多种的组合。

(19)一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于该方法包含对受试者施用：(1)-(8)中任一项所述的修饰细胞，或(9)所述的药物组合物。

发明的效果

在一个技术方案中，本公开建立的工程化细胞，结合了减毒李斯特菌、抗原呈递细胞以及T细胞的特点，以携带不同类型肿瘤抗原或新生抗原的减毒李斯特菌刺激抗原呈递细胞，获得具有肿瘤抗原呈递特性的修饰细胞，而修饰细胞与T细胞共培养后，诱导产生具有肿瘤抗原特异性的T细胞，当诱导后的T细胞回输到体内时，可直接杀伤肿瘤细胞，显著激活体内抗肿瘤的免疫应答反应。工程化细胞以具有肿瘤抗原呈递特性的修饰细胞与免疫细胞共培养得到，不需要对自体细胞进行基因修饰，靶向性和安全性都有显著提高。

在一个技术方案中，本公开建立的靶向特定肿瘤抗原肽的工程化细胞，在体外可扩增，可以进行冻存和复苏等操作；后续实验中便于控制回输体内的细胞量，以及实现异地回输等，整体过程操作简单方便，条件可控性强，具有可重复性。

在一个技术方案中，本公开建立的以工程化细胞为基础的免疫治疗方法，利用体外构建的减毒李斯特菌携带不同类型肿瘤的抗原以及抗原程度细胞的特点，以携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌刺激抗原呈递细胞后，能够在体外获得提呈特定肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞，通过抗原呈递细胞与T细胞在体外的共培养可大量迅速获得具有肿瘤抗原特异性的T细胞，进而回输至体内有效杀伤肿瘤。本方法不受肿瘤类型的限制，可以通过携带不同抗原肽质粒的减毒李斯特菌进行激活，适应人群广泛，靶向性强。

附图说明

图1所示的是李斯特菌表达抗原基因的质粒图谱；

图2所示的是CD8⁺T与BMDMs，以及CD8⁺T与BMDCs共培养第0天、第3天、第5天、第7天和第9天时细胞形态的普通倒置相差显微镜观察结果(10x)；

图3A-3C所示的是体外检测减毒李斯特菌处理后BMDMs、BMDCs与T细胞共培养后对T细胞抗原特异性的影响结果示意图。其中，图3A显示OT1小鼠细胞未染色的阴性对照组、CD8和OVA四聚体染色的阳性对照组；图3B显示LM-LLO540-OVA28处理后的BMDMs与T细胞共培养后细胞未染色的阴性对照组、CD8和OVA四聚体染色的实验组；图3C显示LM-LLO540-OVA28处理后的BMDCs与T细胞共培养后细胞未染色的阴性对照组、CD8和OVA四聚体染色的实验组；

图4所示的是EG7肿瘤模型细胞治疗后肿瘤生长曲线示意图；

图5所示的是EG7肿瘤模型细胞治疗后荷瘤率梯状图；

图6所示的是细胞治疗后7天ELISPOT反应结果示意图；

图7所示的是细胞治疗后7天ELISPOT反应斑点定量统计柱状图；

图8所示的是EG7肿瘤模型细胞治疗后肿瘤生长曲线示意图；

图9所示的是EG7肿瘤模型细胞治疗后荷瘤率梯状图；

图10所示的是细胞治疗后7天ELISPOT反应结果示意图；

图11所示的是细胞治疗后7天ELISPOT反应斑点定量统计柱状图。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。

本公开中的术语“免疫细胞”是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。目前，单核细胞被认为是巨噬细胞和树突状细胞的前身。根据功能，免疫细胞可分为非特异性免疫细胞、特异性免疫细胞和抗原提呈细胞。其中，非特异性免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞等，特异性免疫细胞包括T细胞和B细胞，抗原提呈细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞等。

本公开中的术语“特异性免疫细胞”是指免疫细胞对重组李斯特菌携带的异源性抗原具有特异性，可激活针对该抗原的免疫应答反应。

本公开中的术语“T细胞”(T lymphocyte)又称T淋巴细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞通过表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)所呈递的抗原。其中，CD8⁺T细胞又称细胞毒性T细胞(CTLs,killer T cells)，是T细胞的一个亚型，负责杀伤被病毒感染的细胞和癌细胞，在对器官移植的免疫排斥中也有参与。CD8⁺T细胞的表面具有CD8蛋白，CD8⁺T细胞通过识别MHC-I所呈递的抗原来分辨正常细胞和应杀伤的异常细胞。

本公开中的术语“骨髓诱导巨噬细胞”，也被称为“骨髓来源的巨噬细胞”(BoneMarrow-derived Macrophage，BMDM)，是骨髓细胞在特定生长因子的刺激及诱导下得到具有DM形态特征的原代细胞。

本公开中的术语“骨髓诱导树突状细胞”，也被称为“骨髓来源的树突状细胞”(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)，是骨髓细胞在特定生长因子的刺激及诱导下得到具有DC形态特征的原代细胞。

本公开中的免疫治疗的方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。

本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。

本公开中的术语“共培养”是指是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖。细胞的共培养体系包括直接共培养体系和间接共培养体系，本公开中的免疫细胞与修饰细胞以直接共培养体系进行共培养，2种细胞之间可直接接触。

本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的免疫细胞给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。

本公开中的术语“OVA”是指鸡卵白蛋白(Ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kD。

本公开中的术语“Phly”是编码LLO(溶菌素，Listeriolysion O)基因的启动子。

在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的菌株和/或巨噬细胞或含者有其的药物组合物(以下也称为“本发明的药物组合物”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。

在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本发明的药物组合物等，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。

本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。

本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。

本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。

“免疫调节剂”还包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等细胞因子。细胞因子对免疫细胞与免疫系统有积极的促进作用，给予机体相关细胞因子有可能达到增强肿瘤患者机体免疫应答与免疫调节的效果。细胞因子还可以与与单克隆抗体进行组合，或与免疫检查点抑制抗体以及免疫原型化疗联合应用，以增强其特异性、减轻不良反应。

本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

本公开中的术语“ELISPOT”，全名为酶联免疫斑点检测(Enzyme-linkedImmunospot Assay)，结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够检测到单个细胞分泌的细胞因子情况。其能够在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。

本公开中的菌株“LM-LLO540”，指的是LM 10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)，也可以表示为LM 10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO540-His)。

本公开中的菌株“LM-LLO540-OVA28”，指的是LM 10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-LLO524-529-His)。

本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。

技术方案

在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：

SEQ ID NO:1所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO529)

SEQ ID NO:2所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO529)

SEQ ID NO:3所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO540)

SEQ ID NO:4所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO540)

SEQ ID NO:5所示的是OVA28的未优化的核苷酸序列

SEQ ID NO:6所示的是OVA28优化后的核苷酸序列

SEQ ID NO:7所示的是OVA28的氨基酸序列

SEQ ID NO:8所示的是5’端同源核苷酸序列

SEQ ID NO:9所示的是3’端同源核苷酸序列

SEQ ID NO:10所示的是连接序列的氨基酸序列

SEQ ID NO:11所示的是OVA28和连接序列相连的氨基酸序列

在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽和如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(包括这些数值之间所有范围和百分数)的氨基酸同一性的李斯特菌溶血素(LLO)多肽。上述李斯特菌溶血素(LLO)多肽具有特定百分数的同一性指的是，李斯特菌溶血素(LLO)多肽存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变。

在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。

在本公开的一个实施方案中，所述修饰细胞具有目标效应活性。在一个实施方式中，修饰细胞具有针对靶细胞上的抗原的目标效应活性。在另一实施方式中，目标效应活性包括但不限于，吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。

在本公开的一个实施方案中，所述工程化细胞是经靶细胞上异源性抗原刺激的特异性免疫细胞，可激活针对表面有异源性抗原的靶细胞的免疫应答反应。在一个实施方式中，所述工程化细胞具有针对肿瘤抗原的抗原特异性。在另一个实施方式中，所述工程化细胞具有针对非肿瘤抗原的抗原特异性。

在本公开的一个技术方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括用适于诱导针对目标癌细胞的免疫反应的异源性抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。在一个实施例中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetalantigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA 125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testes antigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPV E6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本公开的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。在另一个实施例中，所述异源性抗原选自非肿瘤抗原。例如，非肿瘤抗原选自OVA。

可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。

用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。

本公开的方法可进一步包括施用第二种抗癌疗法，例如第二种治疗病毒。在其他方面，第二种抗癌疗法为化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂、手术等。

另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。

另一方面，本发明的药物组合物除了含有本发明的菌株和/或巨噬细胞以外，还可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指：适合于针对免疫疾病的药物组合物的任意载体(脂质体、脂质囊泡、胶束等)、稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、储存剂、表面活性剂、着色剂、着香剂或甜味剂。

本发明的药物组合物等可以采取注射剂、冷冻干燥品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆剂、栓剂、巴布剂、软膏剂、霜剂、滴眼剂等剂型。注射剂等液体制剂可以是在使用前用生理盐水等进行溶解的使用时制备用粉末(例如冷冻干燥粉末)的方式。

本公开的另一个技术方案涉及制备工程化细胞的方法，包括将免疫细胞与修饰细胞共培养，获得所述特异性免疫细胞。

另一方面，免疫细胞与修饰细胞在直接培养体系中进行共培养，两者直接接触，利用修饰细胞的抗原呈递特性使免疫细胞产生抗原特异性。

另一方面，还可以使用含有细胞因子的培养基重悬所述共培养的细胞，以促进免疫细胞的扩增。

本公开的另一个技术方案涉及杀死增生性细胞的方法，该方法包括将该细胞与本公开所述的工程化细胞或药物组合物接触。

本公开的另一个技术方案涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本公开所述的工程化细胞或药物组合物。

在本公开的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。施用可为口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔或经直肠施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等施用方式。

本公开的一个技术方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。

本公开的另一个技术方案，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:1所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。可选的，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ IDNO:1所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529位氨基酸位点之前。在一个实施例中，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第523位和第524位氨基酸之间。

本公开的另一个技术方案中，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:3所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。在一个实施例中，本公开的编码异源性抗原的氨基酸序列可以替换如SEQ ID NO:3所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第533位至第534位氨基酸序列。

本公开的另一个技术方案中，异源性抗原为鸡卵白蛋白(OVA)。在一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为2-40个氨基酸；在另一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为5-35个氨基酸；在另一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为8-28个氨基酸。在一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA248-275(即本公开中的OVA28)。

在一个实施例中，本公开还包括重组至载体(疫苗)中的连接肽。在一个实施例中，所述连接肽的序列选自连接至融合蛋白的(G4S)2序列。在另一个技术方案中，所述融合蛋白的两端均连接有连接肽；可选的，所述连接肽的序列选自(G4S)2序列。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

除非有明确的具体相反表述，否则本公开的所有实施例涉及的技术方案中，OVA的插入位点均位于相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型LLO多肽的氨基酸序列的第523位和第524位氨基酸之间。

除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。

本公开采用的主要试剂如下：质粒小量提取试剂盒(AXYGEN)，胶回收试剂盒(AXYGEN)，Q5 PCR高保真酶(NEB)，T4 DNA ligase(NEB)，Ezmax One-Step克隆试剂盒(tolobio)，Human IFN-γELISPOT Set(BD)，Mouse IFN-γELISPOT Set(BD)，电穿孔仪(Bio-Rad)，1640培养基(Gibco)，Mouse M-CSF(Miltenyi Biotec)，anti-His-HRP(金斯瑞)，WESTERN ECL显色液(BioRad)。

实施例1：减毒李斯特菌的质粒的构建

本公开中采用减毒的李斯特菌作为制备疫苗的载体菌株。示例性的，本公开用做疫苗的菌株采用的是Lm 10403SΔactA(前述菌株的构建方法可以示例性的参考下述文献：Shen H et.al.，PNAS，92(9):3987-91，1995)，该菌缺失actA基因，使得侵染宿主细胞的菌体不能通过其特有的肌动蛋白尾向临近细胞传播扩散，从而大大减弱其毒性及致病性。相比野生型菌株Lm 10403S(LD₅₀为1x 10⁴)，Lm-ΔactA的LD50为0.5x10⁸-1x10⁸，被证明是高度减毒的。同时该菌保留了完整的LLO逃逸出溶酶体的能力，进入宿主细胞胞浆中快速增殖，并表达蛋白激活特异的T细胞免疫应答。

本公开用做表达抗原基因的质粒基本构成如下：

(1)维持质粒复制稳定的基本序列：示例性的，本公开采用了pAM401作为质粒的基本序列；

(2)转录抗原基因的启动子：示例性的，本公开采用了Phly，即Lm染色体上毒力岛LLO的启动子；

(3)表达分泌抗原蛋白到李斯特菌外的信号肽序列：示例性的，本公开采用了LLO信号肽序列，例如LLO1-28所示的序列，及LLO22-529，用于增加外源蛋白的表达量；

(4)李斯特菌属于原核细胞，而通常需要用作肿瘤疫苗的抗原肽属于真核细胞，需要进行相应密码子优化方能在原核细胞中表达真核细胞蛋白。示例性的，本公开采用了如SEQ ID NO:6所示的优化序列；

(5)检测分泌蛋白的标签序列：示例性的，本公开采用了His tag作为标签序列；

(6)用于抗原肽插入的酶切位点：示例性的，本公开采用了PstI作为酶切位点。

示例性的，本公开构建质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His的方法如下：在质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI基础上，以BamHI为酶切位点，将基因合成的BamHI-LLO22-529-His-BamHI序列通过酶切酶连反应构建在该载体上，得到pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-529-His-BamHI，为添加外源基因插入位点，选择在LLO523-524位置设计上下游引物，通过PCR反应，在LLO523和LLO524之间插入PstI酶切位点。

通过上述方法构建的用做表达抗原基因的质粒结构示意图如图1所示。

实施例2：携带抗原肽基因的减毒李斯特菌的质粒的构建

构建减毒李斯特菌疫苗质粒需要将抗原基因插入到质粒载体中，载体上已设计有酶切位点，目的抗原的基因序列通过公司进行基因密码子优化后合成。

可选的，OVA₂₈密码子优化过程如下：

进行相应密码子优化前的小鼠OVA₂₈核苷酸序列(SEQ ID NO:5)：

GATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAA

以大肠杆菌密码子作为偏好密码子进行相应密码子优化后的OVA₂₈核苷酸序列(SEQ ID NO:6)：

GATGAAGTGAGCGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATTATCAACTTCGAAAAACTGACCGAGTGGACCAGCAGCAATGTGATGGAA

使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-540-His载体(简称PstI载体质粒)上的PstI位点，其同源序列为：5’端同源序列(CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:8)；3’端同源序列(CTGCAGGTAGATAATCCAATCGAA，SEQ ID NO:9)

主要步骤如下：

PstI载体质粒20μl PstI单酶切体系：

PstI质粒	2μg
		PstI限制性内切酶	2μl
10x NEB缓冲液3.1	2μl
		去离子水	补齐至20μl

37℃水浴锅，反应10min。

将酶切产物进行DNA回收纯化，即酶切线性化PstI载体

由以下(1)-(5)组份，得到同源重组20μl体系：

(1)酶切线性化的PstI载体

(2)外源PCR片段，两端含同源序列

(3)5x缓冲液：4μl

(4)反应酶：2μl

(5)ddH2O：补齐至20μl

37℃水浴30分钟，立即置于冰上5分钟，全部转化100μl E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。

实施例3：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌的制备

测序验证正确的减毒李斯特菌的质粒通过电转化技术，转化到减毒李斯特菌株中，挑选单克隆进行后续质粒及表达验证。

电转化具体步骤：

(1)电转化感受态的制备

a)过夜培养的李斯特菌以1:50-1:200的比例转接到100-250ml的脑-心浸出液肉汤培养基(BHI)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值0.2-0.25；

b)加入盘尼西林(PNG)至终浓度10μg/ml，继续培养约两个小时，到OD600到0.3-0.9；

c)冰浴10分钟后，5000g离心收集菌体；

d)用200ml 10％甘油重悬菌体，洗涤两次；

e)用45ml 10％甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，终浓度10μg/ml，37℃水浴20分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次；

f)在4℃环境下，5000g离心10分钟收集菌体，再用20ml 10％甘油洗涤菌体一次；

g)用1ml 10％甘油重悬菌体，50μl/管分装保存。

(2)确定最适电转化条件：

a)取一管感受态细胞，用手心化冻，置于冰上；

b)将待转的质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。

c)上述混合体系加入预冷的1mm电转杯中，进行电击处理；所述电击处理条件是电场强度10kV/cm、电阻200Ω、电容25μF、持续时间5-6ms；

d)立即加入BHI培养基，混匀，取出到EP管中，常温静置1小时；

e)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养，挑取单菌落验证。

验证通过的菌株/菌落可以作为携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌。

实施例4：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌外源蛋白表达的改进及检测

经BHI液体培养基37℃培养过夜的李斯特菌，离心去除菌体，上清以3倍体积的10％TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液混匀，-20℃沉淀过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性蛋白后上样，通过蛋白所接的tag，进行Western blot检测蛋白表达量。在一个技术方案中，上述tag可以选自Flag tag或His tag。

实施例5：原代BMDMs和BMDCs培养

取8周龄雌性C57小鼠，CO₂窒息颈椎脱臼法处死，取股骨颈股置于冰育的75％酒精，超净工作台中转移至PBS中，使用灭菌的手术镊和手术剪分离肌肉层，将股骨颈股转移至1640完全培养基中，手术剪剪开两端股骨头，使用注射器吸取1640完全培养基吹打骨腔至泛白。将含细胞的1640完全培养基过滤网，并通过红细胞裂解液裂红后，1500rpm离心收集细胞。使用GM-CSF细胞因子的1640完全培养基重悬细胞培养巨噬细胞，使用含GM-CSF和IL4细胞因子的1640完全培养基重悬细胞培养树突状细胞，按照每只小鼠接种3个10mm细菌培养皿进行培养，分化两天后收集细胞培养液3000rpm离心，培养皿中加入4℃冰冻的PBS进行清洗2遍。继续按照如下操作可分别获得骨髓诱导树突状细胞以及骨髓诱导巨噬细胞：

(1)原培养液离心后取半量上清液加入培养皿中，再取5ml新鲜的含GM-CSF和IL4细胞因子的1640完全培养基到培养皿中，继续5％CO₂ 37℃培养箱进行培养。之后在第4天，第6天每两天半量换液，收集全部细胞培养液，1500rpm离心弃去上半部分的上清液，收集沉淀细胞重悬并加入到培养皿中，再在培养皿中加入5ml新鲜的含有细胞因子的1640完全培养基。第7或8天即获得大量骨髓诱导树突状细胞(Bone marrow-derived dendriticcells，BMDCs)可用于实验。

(2)原培养液离心后取半量上清液加入培养皿中，再取5ml新鲜的含GM-CSF的1640完全培养基到培养皿中，继续5％CO₂ 37℃培养箱进行培养。之后在第4天，第6天每两天半量换液，收集全部细胞培养液，1500rpm离心弃去上半部分的上清液，收集沉淀细胞重悬并加入到培养皿中，再在培养皿中加入5ml新鲜的含有细胞因子的1640完全培养基。第6或7天即获得大量骨髓诱导巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophages，BMDMs)可用于实验。

实施例6：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌处理BMDMs和BMDCs

使用PBS将BMDMs、BMDCs分别洗两次，然后分别加入实施例3得到的减毒李斯特菌的1640完全培养基(不含任何抗生素)，细胞培养箱处理30min，立即使用PBS洗涤三次，并换含5ng/μl庆大霉素的1640完全培养基对胞外减毒李斯特菌进行处理1h，即可用于实验。

实施例7：体外提取CD8⁺T细胞

取C57小鼠，以尾静脉注射将携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌LM-LLO540-OVA28注射至C57小鼠体内，进行小鼠体内免疫建立。七天后分别取小鼠脾脏研磨后过滤网，将收集的细胞进行CD8-PE染料染色，PBS洗两次，将收集到的细胞与anti-PE磁珠共同在冰上孵育，离心收集后过磁力柱，和anti-PE磁珠结合的细胞被吸附在磁力柱上，随后从磁力架上去下磁力柱，收集目的细胞，即CD8⁺T细胞。

实施例8：体外进行BMDMs、BMDCs和CD8+T细胞共培养

将实施例6中用LM-LLO540-OVA28处理的BMDMs、BMDCs分别与实施例7中LM-LLO540-OVA28免疫建立7天后的小鼠中提取得到的CD8⁺T细胞共同进行共培养，使用含IL-2细胞因子的1640完全培养基重悬细胞，每两天进行一次换液，待共培养后收集不同时间点的细胞进行检测。

实验结果如图1所示，图1中分别显示了CD8⁺T与BMDMs，以及CD8⁺T与BMDCs在共培养0天、3天、5天、7天和9天的细胞状态。结合图1可知，CD8⁺T与BMDMs、BMDCs共培养的细胞状态良好，均有细胞聚集物生成。

实施例9：证明BMDMs、BMDCs与CD8⁺T细胞共培养后刺激CD8⁺T细胞产生抗原特异性的现象

通过流式细胞仪检测与BMDMs、BMDCs共培养后具有OVA特异性的CD8⁺T细胞的比例，以验证CD8⁺T细胞被激活产生抗原特异性的现象。具体方法如下：

(1)取OT1小鼠血，裂解红细胞，PBS洗三次后进行CD8和OVA四聚体染色，冰上孵育后PBS洗两次后进行流式检测，以检测OT1小鼠中OVA特异性T细胞的比例。

(2)将BMDMs和CD8⁺T细胞共培养7天时，收集细胞分别进行CD8和OVA四聚体染色，冰上孵育后PBS洗两次后进行流式检测，检测BMDMs和CD8+T细胞共培养后细胞中OVA特异性T细胞的比例。

(3)将BMDCs和CD8⁺T细胞共培养7天时，收集细胞分别进行CD8和OVA四聚体染色，冰上孵育后PBS洗两次后进行流式检测，检测BMDCs和CD8+T细胞共培养后细胞中OVA特异性T细胞的比例。

实验结果如图3A-3C所示，图3A显示OT1小鼠中OVA特异性T细胞的比例为94％，阳性对照组的比例较高，从而验证OVA四聚体流式检测的方法可行。图3B显示BMDMs和CD8⁺T共培养后OVA特异性T细胞的比例约为21％，说明共培养可以提高OVA特异性T细胞比例。图3C显示BMDCs和CD8⁺T共培养后OVA特异性T细胞的比例约为17％，说明共培养可以提高OVA特异性T细胞比例。

实施例10：验证共培养后的T细胞的肿瘤治疗效果

(1)取20只C57小鼠皮下接种EG7-OVA产生肿瘤，再进行细胞治疗，验证抗肿瘤效果。EG7-OVA细胞接种量为2×10⁶，在接种后第6天开始进行肿瘤测量。根据肿瘤大小将20只小鼠均一的分成四组如下：

(2)培养小鼠的巨噬细胞(DM细胞)和树突状细胞(DC细胞)，同时对C57小鼠进行LM-LLO540-OVA28的免疫建立，待单核细胞诱导成熟后加LM-LLO540-OVA28刺激，取LM-LLO540-OVA28免疫小鼠及OT1小鼠的CD8⁺T细胞进行共培养，共培养4天后收集细胞。

(3)于EG7皮下接种后的第6天对四组小鼠进行细胞注射，其中A组小鼠为注射PBS的对照组，B组小鼠为注射C57小鼠CD8⁺T细胞的对照组，C组小鼠注射LM-LLO540-OVA28免疫小鼠的CD8⁺T细胞与LM-LLO540-OVA28刺激后的DC细胞、DM细胞的共培养细胞，D组小鼠注射OT1小鼠的CD8⁺T细胞与LM-LLO540-OVA28刺激后的DC细胞、DM细胞的共培养细胞。持续观察肿瘤大小，肿瘤持续跟踪测量至第28天。

实验结果如图4和图5所示，肿瘤曲线如图4，A组和B组小鼠的肿瘤大小都随时间的增加不断增大，C组和D组的实验组治疗效果基本一致，从10天开始出现肿瘤下降趋势，并随着时间的增加不断缩小。第28天将小鼠安乐死并进行肿瘤解剖，如图5为各组小鼠的肿瘤大小，与所测量的肿瘤生长曲线结果相符。

实施例11：通过ELISPOT实验验证细胞治疗对EG7肿瘤模型小鼠体内，肿瘤特异性免疫反应的激活情况

为进一步从功能学检测本方法下细胞治疗对EG7肿瘤模型小鼠体内肿瘤特异性免疫反应的激活情况，我们通过Elispot实验进行验证。我们在细胞治疗注射后第7天通过尾静脉取血3-7滴，裂解红细胞，PBS洗两次获得外周血单个核细胞，最终分别使用100μl的1640完全培养基重悬细胞加入Elispot预处理孔板中。随后通过在Elispot孔板中加入10ng/μl OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生INF-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况(具体Elispot实验流程参照BD^TM ELISPOTMouse IFN-γELISPOT Set说明书，产品货号551083)。

实验结果如图6和图7所示，A组和B组有少量的Elispot斑点反应，C组和D组均有较强的Elispot反应，表明细胞注射后可激活小鼠免疫系统的OVA特异性免疫应答，证明本方法下细胞治疗有效性。

实施例12：对比验证共培养后的T细胞的肿瘤治疗效果

(1)为对比小鼠树突状细胞和巨噬细胞共培养的T细胞在体内的有效性，取25只C57小鼠皮下接种EG7-OVA产生肿瘤，再进行细胞治疗，验证抗肿瘤效果。EG7-OVA细胞接种量为2×10⁶，在接种后第6天开始进行肿瘤测量。根据肿瘤大小将25只小鼠均一的分成四组如下：

(2)培养小鼠的巨噬细胞和DC细胞，同时对C57小鼠进行LM-LLO540-OVA28的免疫建立，待单核细胞诱导成熟后分别加LM-LLO540和LM-LLO540-OVA28刺激，与LM-LLO540-OVA28免疫小鼠的CD8⁺T细胞进行共培养，共培养6天后收集细胞。

(3)于EG7皮下接种后的第6天对五组小鼠进行细胞注射，持续观察肿瘤大小。肿瘤持续跟踪测量至第28天。

实验结果如图8和图9所示，肿瘤曲线如图8，A组、B组和C组小鼠的肿瘤大小都随时间的增加不断增大，D组和E组的实验治疗效果基本一致，与对照组相比，肿瘤大小有抑制效果。第28天将小鼠安乐死并进行肿瘤解剖，如图9为各组小鼠的肿瘤大小，与所测量的肿瘤生长曲线结果相符，两组实验组小鼠均有部分消瘤现象。

实施例13：通过ELISPOT实验对比验证细胞治疗对EG7肿瘤模型小鼠体内，肿瘤特异性免疫反应的激活情况

实验结果如图10和图11所示，A组、B组和C组有少量的Elispot斑点反应，D组和E组均有较强的Elispot反应，表明细胞注射后可激活小鼠免疫系统的OVA特异性免疫应答，证明本方法下细胞治疗有效性。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州若泰医药科技有限公司

上海若泰医药科技有限公司

<120> 一种基于特异性免疫细胞的肿瘤免疫治疗组合物、制备方法和应用

<130> 6709-2073694I

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 529

<212> PRT

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 1

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys

20 25 30

Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser

35 40 45

Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr

50 55 60

Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly

65 70 75 80

Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn

85 90 95

Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn

100 105 110

Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly

115 120 125

Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val

130 135 140

Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly

145 150 155 160

Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser

165 170 175

Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys

180 185 190

Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp

195 200 205

Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala

210 215 220

Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser

225 230 235 240

Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr

245 250 255

Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys

260 265 270

Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn

275 280 285

Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu

290 295 300

Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp

305 310 315 320

Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn

325 330 335

Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala

340 345 350

Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp

355 360 365

Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro

370 375 380

Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile

385 390 395 400

Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp

405 410 415

Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn

420 425 430

Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val

435 440 445

Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe

450 455 460

Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr

465 470 475 480

Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile

485 490 495

Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp

500 505 510

Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile

515 520 525

Glu

<210> 2

<211> 1587

<212> DNA

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 2

atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60

caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120

ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180

atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240

gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300

gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360

atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420

caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480

atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540

gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600

agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660

tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720

gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780

aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840

gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900

caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960

gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020

tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080

ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140

ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200

aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260

atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320

gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag 1380

ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg cctggtaacg cgagaaatat taatgtttac 1440

gctaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500

ttaccacttg tgaaaaatag aaatatctcc atctggggca ccacgcttta tccgaaatat 1560

agtaataaag tagataatcc aatcgaa 1587

<210> 3

<211> 540

<212> PRT

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 3

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Asp Pro Thr Glu

20 25 30

Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met

35 40 45

Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys

50 55 60

Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro

85 90 95

Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys

100 105 110

Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln Val Val Asn

115 120 125

Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser

130 135 140

Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys

165 170 175

Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn Ala Val Asn

180 185 190

Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn

195 200 205

Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser

210 215 220

Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser

225 230 235 240

Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu

245 250 255

Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro

260 265 270

Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu

275 280 285

Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser

290 295 300

Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr Asn Ser His

305 310 315 320

Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser

325 330 335

Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe

340 345 350

Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile

355 360 365

Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr

370 375 380

Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe

385 390 395 400

Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile

405 410 415

Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile Asn Ile Asp His

420 425 430

Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn

435 440 445

Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys Asn Trp Ser Glu

450 455 460

Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro

465 470 475 480

Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu

485 490 495

Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu

500 505 510

Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys

515 520 525

Tyr Ser Asn Lys Leu Gln Val Asp Asn Pro Ile Glu

530 535 540

<210> 4

<211> 1620

<212> DNA

<213> 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 4

atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60

caaactgaag caaaggatgc atcggatcct actgaagcaa aggatgcatc tgcattcaat 120

aaagaaaatt caatttcatc catggcacca ccagcatctc cgcctgcaag tcctaagacg 180

ccaatcgaaa agaaacacgc ggatgaaatc gataagtata tacaaggatt ggattacaat 240

aaaaacaatg tattagtata ccacggagat gcagtgacaa atgtgccgcc aagaaaaggt 300

tacaaagatg gaaatgaata tattgttgtg gagaaaaaga agaaatccat caatcaaaat 360

aatgcagaca ttcaagttgt gaatgcaatt tcgagcctaa cctatccagg tgctctcgta 420

aaagcgaatt cggaattagt agaaaatcaa ccagatgttc tccctgtaaa acgtgattca 480

ttaacactca gcattgattt gccaggtatg actaatcaag acaataaaat cgttgtaaaa 540

aatgccacta aatcaaacgt taacaacgca gtaaatacat tagtggaaag atggaatgaa 600

aaatatgctc aagcttatcc aaatgtaagt gcaaaaattg attatgatga cgaaatggct 660

tacagtgaat cacaattaat tgcgaaattt ggtacagcat ttaaagctgt aaataatagc 720

ttgaatgtaa acttcggcgc aatcagtgaa gggaaaatgc aagaagaagt cattagtttt 780

aaacaaattt actataacgt gaatgttaat gaacctacaa gaccttccag atttttcggc 840

aaagctgtta ctaaagagca gttgcaagcg cttggagtga atgcagaaaa tcctcctgca 900

tatatctcaa gtgtggcgta tggccgtcaa gtttatttga aattatcaac taattcccat 960

agtactaaag taaaagctgc ttttgatgct gccgtaagcg gaaaatctgt ctcaggtgat 1020

gtagaactaa caaatatcat caaaaattct tccttcaaag ccgtaattta cggaggttcc 1080

gcaaaagatg aagttcaaat catcgacggc aacctcggag acttacgcga tattttgaaa 1140

aaaggcgcta cttttaatcg agaaacacca ggagttccca ttgcttatac aacaaacttc 1200

ctaaaagaca atgaattagc tgttattaaa aacaactcag aatatattga aacaacttca 1260

aaagcttata cagatggaaa aattaacatc gatcactctg gaggatacgt tgctcaattc 1320

aacatttctt gggatgaagt aaattatgat cctgaaggta acgaaattgt tcaacataaa 1380

aactggagcg aaaacaataa aagcaagcta gctcatttca catcgtccat ctatttgcca 1440

ggtaacgcga gaaatattaa tgtttacgct aaagaatgca ctggtttagc ttgggaatgg 1500

tggagaacgg taattgatga ccggaactta ccacttgtga aaaatagaaa tatctccatc 1560

tggggcacca cgctttatcc gaaatatagt aataaactgc aggtagataa tccaatcgaa 1620

<210> 5

<211> 84

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 5

gatgaagtct caggccttga gcagcttgag agtataatca actttgaaaa actgactgaa 60

tggaccagtt ctaatgttat ggaa 84

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 6

gatgaagtga gcggcctgga gcagctggag agcattatca acttcgaaaa actgaccgag 60

tggaccagca gcaatgtgat ggaa 84

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus)

<400> 7

Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu

1 5 10 15

Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu

20 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgaaatata gtaataaact gcag 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgcaggtag ataatccaat cgaa 24

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Glu Val Ser Gly Leu

1 5 10 15

Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr

20 25 30

Ser Ser Asn Val Met Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Claims

1.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞是将免疫细胞与修饰细胞接触后获得的特异性免疫细胞；其中，所述修饰细胞由具有目标效应活性的细胞和重组李斯特菌进行接触后获得，所述重组李斯特菌含有：(i)重组核酸分子；或(ii)重组质粒；或(iii)重组表达载体；或所述重组李斯特菌表达：(iv)重组蛋白；其中，

所述(i)重组核酸分子包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或如SEQID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽；

2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其特征在于，所述具有目标效应活性的细胞选自巨噬细胞、单核细胞和/或树突状细胞；优选地，所述抗原呈递细胞选自骨髓诱导巨噬细胞，和/或骨髓诱导树突状细胞；

3.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其特征在于，所述(i)重组核酸分子中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。

5.根据权利要求4所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其特征在于，所述(i)重组核酸分子中，还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；可选的，所述(i)重组核酸分子中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:10所示的序列的核苷酸序列；优选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。

7.根据权利要求6所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，和编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

8.根据权利要求1-7任一项所述的工程化细胞，其中，所述(i)重组核酸分子中，所述第一启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。

9.一种药物组合物，其含有治疗有效量的，根据权利要求1-8中任一项所述的工程化细胞；可选的，所述药物组合物进一步包含第二治疗试剂和/或药学上可接受的载体；优选的，所述第二治疗试剂选自第二抗癌试剂；更优选的，所述第二抗癌试剂选自第二修饰细胞、第二重组李斯特菌、放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂。

10.权利要求1-8中任一项所述的工程化细胞，或权利要求9所述药物组合物在制备用于杀死细胞的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述细胞被包含在患者体内；可选的，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。

12.权利要求1-8中任一项所述的工程化细胞，或权利要求9所述药物组合物在如下(a)-(c)至少一种中的应用：

(a)制备用于治疗或预防肿瘤患者的药物；

(b)制备用于缓慢持续杀伤细胞的药物；

(c)制备在受试者中诱导免疫应答的药物。

13.一种制备工程化细胞的方法，其特征在于，包括将免疫细胞与权利要求1-8任一项所述的修饰细胞共培养，获得所述特异性免疫细胞；可选的，所述方法还包括使用含有细胞因子的培养基重悬所述共培养的细胞。