CN108884468A - 基于个性化递送载体的免疫疗法及其用途 - Google Patents

基于个性化递送载体的免疫疗法及其用途 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于患有疾病或病症的受试者的个性化免疫治疗组合物，包含治疗性疫苗递送载体及其制备方法，所述治疗性疫苗递送载体包含表达与由包含至少一个移码突变的核酸序列编码的一个或多个新表位相关的移码突变衍生肽的基因表达构建体，其中所述移码突变特定于受试者的癌症或不健康的组织。本申请公开的递送载体包括细菌载体；或病毒载体、或肽疫苗载体；或DNA疫苗载体，包含含有一个或多个融合蛋白的李斯特菌属细菌载体，所述融合蛋白包含一个或多个移码突变衍生肽，所述移码突变衍生肽包含存在于从所述受试者获得的患有疾病的生物样品中的一个或多个新表位。本申请还公开了使用这些组合物来诱导针对疾病或病症(包括肿瘤或癌症)或所述受试者感染的免疫应答的方法。

Description

基于个性化递送载体的免疫疗法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月27日提交的美国申请号62/287,871的优先权，该申请全部内容通过引用并入本申请以用于任何目的。
引用以文本文件的形式经由EFS WEB提交的序列表
文件490970SEQLIST.txt中的序列表为180kb，于2017年1月27日创建，并且通过引用并入本申请。
背景技术
在个性化医疗之前，大多数患有特定类型癌症和处于特定癌症阶段的患者接受相同的治疗。然而，医生和患者已然清楚，某些治疗方法对某些患者有效，而对其他患者则不然。因此，需要开发对特定肿瘤有疗效的有效个性化癌症疫苗。与标准治疗的预期疗效和副作用相比，个性化治疗方案可能更有效且副作用更少。
人的DNA突变导致肿瘤发展，其可导致包含宿主产生的相应正常蛋白中不存在的新表位的突变或异常蛋白的产生。这些新表位中的许多刺激T细胞反应并导致免疫系统破坏早期癌细胞。然而，在癌症已发生的情况下，免疫应答是不充分的。在其他情况下，已经证明了难以开发靶向癌症中的肿瘤抗原但不特异性靶向其新表位的有效长期疫苗，其主要原因是特异性针对肿瘤自身抗原的T细胞通过耐受机制被消除或失活。
新表位是存在于与疾病(例如癌症)相关的蛋白中的表位，其中特异性“新表位”不存在于没有患病或患病组织的受试者相关的相应正常蛋白中。新表位可能难以识别，但识别它们并开发靶向它们的治疗将有利于在个性化治疗方案中使用，因为它们是罕见的并可能因人而异。一些新表位是突变(如移码突变)的结果，这可能导致无义肽的表达。无义肽潜在地具有经表达的免疫原性新表位，因此对于设计用于个性化治疗的疫苗可能是有用的。
单核细胞增多性李斯特菌(Lm)是引起李斯特菌病的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。在其细胞间生命周期中，Lm通过吞噬作用或通过对非吞噬细胞的主动侵入进入宿主细胞。内化后，Lm可通过分泌几种细菌毒力因子(主要是成孔蛋白李斯特菌溶血素O(LLO))来介导其逃离膜结合的吞噬体/液泡，使得细菌进入宿主细胞的细胞质。在细胞质中，Lm复制并基于细菌肌动蛋白聚合蛋白(ActA)促进的移动力来扩散到相邻细胞。在细胞质中，Lm分泌的蛋白被蛋白酶体降解并在内质网中被加工成与MHC I类分子结合的肽。这种独特的特征使其成为非常有吸引力的癌症疫苗载体，因为肿瘤抗原可与MHC I类分子一起呈递以激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。当存在于胞质溶胶中时，该细菌可被各种细胞间受体识别，例如，通过核寡聚化结构域样受体识别肽聚糖和通过DNA传感器AIM2识别LmDNA，并激活炎性和免疫调节级联反应。
此外，一经内化后，可以在吞噬溶酶体区室中处理Lm，并在MHC II类分子上呈递肽以激活Lm特异性CD4-T细胞应答。该炎症应答与有效地向MHC I和MHC II分子途径递送抗原的组合使得Lm成为治疗肿瘤、防止肿瘤和诱导针对肿瘤的免疫应答的有效疫苗载体。
以受试者癌症的特异性新表位为靶标将其作为基于李斯特菌的疫苗的一个组分，其额外地刺激T细胞反应或与其他疗法联合使用，可以提供既个性化针对受试者的癌症又有效治疗癌症的疫苗。增加抗原免疫原性或疫苗的刺激已逃脱耐受机制的T细胞的能力的抗原融合方案可作为特别有潜力的免疫疗法。
发明简述
本申请公开了提供个性化免疫疗法组合物及其用于靶向受试者的异常或不健康组织内潜在的新表位的用途，其中所述免疫疗法包括使用重组李斯特菌疫苗或另一种免疫疗法递送载体以用于递送和免疫治疗载体来用于表达肽和/或融合多肽，所述肽和/或融合多肽包括这些新表位以增强靶向这些新表位的免疫应答。产生的所述个性化免疫疗法可有效地治疗、预防或降低疾病(例如受试者中的癌症)的发生率。此外，本申请公开的免疫疗法递送载体和重组李斯特菌可有效地用于与其他抗疾病或抗癌症疗法组合使用。
在一个方面，本申请公开了一种包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个移码突变衍生肽，所述一个或多个移码突变衍生肽包含一个或多个免疫原性新表位的移码突变衍生肽。这种免疫疗法递送载体可以是，例如，重组李斯特菌菌株。所述移码突变衍生肽可以是，例如，疾病特异性或病症特异性的。
在另一个方面，本申请公开了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括至少一个本申请公开的免疫疗法递送载体。这种免疫原性组合物还可包括例如佐剂。
在另一个方面，本申请公开了一种治疗、压制、预防或抑制受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用本申请公开的免疫疗法递送载体或本申请公开的免疫原性组合物，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品的源核酸序列编码。这种方法可以例如在所述受试者中引发个性化的抗疾病或抗病症免疫应答，其中所述个性化的免疫应答靶向一个或多个移码突变衍生肽。
在另一个方面，本申请公开了一种用于形成针对患有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法，其包括：(a)将从所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了编码一种或多种肽的一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含在来自所述患有疾病或病症的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个包含一个或多个移码突变，并编码包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个移码突变衍生肽；以及(b)产生包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含所述一种或多种肽，所述肽包含步骤(a)中识别到的所述一个或多个免疫原性新表位。任选地，所述方法还可包括储存所述免疫疗法递送载体或所述DNA免疫疗法或所述肽免疫疗法，以用于在预定的时间段内向所述受试者施用。任选地，所述方法还可包括向所述受试者施用包含所述免疫治疗载体的组合物，其中所述施用过程导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
在一个方面，本申请公开涉及一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个相关方面，所述重组李斯特菌还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一种或多种肽包括一个或多个免疫原性新表位。在另一个方面，所述一种或多种肽是有义肽。
在另一个方面，本申请公开涉及一种免疫疗法递送载体，所述免疫疗法递送载体包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个相关方面，所述重组李斯特菌还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一种或多种肽包括一个或多个免疫原性新表位。在另一个方面，所述一种或多种肽是有义肽。
在一个相关方面，所述移码突变是与健康生物样品的源核酸序列进行比较的。
在另一个相关方面，所述至少一个移码突变包括多个移码突变，并且所述多个移码突变存在于相同基因中。在另一个相关方面，所述至少一个移码突变包括多个移码突变，并且所述多个移码突变不存在于相同基因中。
在另一个相关方面，至少一个移码突变位于基因的外显子编码区内。在另一个相关方面，所述外显子是所述基因的最后一个外显子。在一个相关方面，所述一个或多个无义肽中的每个可从非常短(例如约10个氨基酸序列)到非常长(例如超过100个氨基酸序列)。在一个相关方面，所述一个或多个无义肽中的每个的长度为约60-100个氨基酸。在一个相关方面，所述一个或多个无义肽中的每个的长度均为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500或更多个氨基酸。在另一个相关方面，所述一个或多个无义肽在所述患有疾病或病症的生物样品中表达。
在另一个相关方面，所述一个或多个无义肽不编码翻译后切割位点。在另一个相关方面，所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。在另一个相关方面，所述一个或多个新表位包含T细胞表位。
在一个相关方面，所述一个或多个新表位包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性的新表位。在另一个相关方面，包含一个或多个新表位的所述一个或多个无义肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。在另一个相关方面，所述重组李斯特菌表达并分泌所述一个或多个重组多肽。在另一个相关方面，所述重组多肽中的每个包含约1-20个所述新表位。
在一个相关方面，所述一个或多个无义肽或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。在另一个相关方面，所述一个或多个无义肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作连接的无义肽或其片段，其中所述免疫原性多肽与所述多个无义肽或其片段中的一个融合。在另一个相关方面，所述免疫原性多肽与所述N末端无义肽可操作地连接。在另一个相关方面，所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在一个相关方面，所述一个或多个重组多肽与所述C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。在另一个相关方面，所述接头序列编码4X甘氨酸接头。在另一个相关方面，所述标签选自下组：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。在另一个相关方面，编码所述重组多肽的所述核酸序列包含编码所述标签的序列后的2个终止密码子。
在一个相关方面，编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：pHly-tLLO-[无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述无义肽或其片段的长度为21个氨基酸，并且其中n＝1-20。在另一个相关方面，所述无义肽或其片段可以相同或不同。
在一个相关方面，至少一个编码所述重组多肽的核酸序列被整合到李斯特菌基因组中。在另一个相关方面，至少一个编码所述重组多肽的核酸序列位于质粒中。在另一个相关方面，在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述李斯特菌菌株中。
在一个相关方面，所述李斯特菌菌株是减毒李斯特菌菌株。在另一个相关方面，所述减毒李斯特菌包含一个或多个内源性基因的突变。在一个相关方面，所述内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dal基因双突变，或dal/dat/actA基因三突变或其组合。在另一个相关方面，所述突变包括基因的失活、截短、缺失、置换或破坏。在另一个相关方面，至少一个编码所述重组多肽的核酸序列还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，或者其中所述李斯特菌菌株包含第二核酸序列，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。在另一个相关方面，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
在一个相关方面，所述李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
在一个相关方面，通过比较从所述患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF，获得所述无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列中的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的所述核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自所述患有疾病的生物样品的所述一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
在一个相关方面，所述比较包括使用筛选检测或筛选工具及相关数字软件，将从所述患有疾病的生物样品中提取的所述核酸序列中的一个或多个ORF与从所述健康生物样品中提取的所述核酸序列中的一个或多个ORF进行比较。
在一个相关方面，所述比较包括比较预定义的基因集的开放阅读框外显子，所述基因集选自下组：编码已知的和预测的癌症或肿瘤抗原的核酸序列、编码肿瘤或癌症相关抗原的核酸序列、编码已知的或预测的肿瘤或癌蛋白标记物的核酸序列、编码已知的和预测的感染性疾病或病症相关基因的核酸序列、编码在所述患有疾病的生物样品中表达的基因的核酸序列、包含微卫星不稳定区的核酸序列以及其任何组合。
在一个相关方面，所述患有疾病的生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。在另一个相关方面，所述健康生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。在另一个相关方面，所述生物样品包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
在一个相关方面，通过以下方式表征所述无义肽的新表位：(i)从所述无义肽产生一种或多种不同的肽序列；和任选地，(ii)筛选每个(i)中产生的所述肽，并通过与MHC I类或MHC II类分子的结合对其进行选择，所述MHC I类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
在一个方面，本申请公开涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括任何一种本申请公开的李斯特菌菌株中的至少一个。在另一个相关方面，所述免疫原性组合物还包含其他佐剂。在另一个相关方面，所述其他佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A，或未甲基化的含CpG寡核苷酸。
在一个方面，本申请公开涉及一种在患有疾病或病症的受试者中引发个性化靶向免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物，其中所述个性化的免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在一个方面，本申请公开涉及一种治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个方面，本申请公开涉及一种提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物，其中所述效应T细胞被靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在一个方面，本申请公开涉及一种增加受试者中新表位特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个方面，本申请公开涉及一种增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个方面，本申请公开涉及一种减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个相关方面，本申请公开的方法还包括施用强化治疗。
在一个相关方面，施用本申请公开的重组李斯特菌或其组合物，在所述受试者中引发个性化增强的抗感染性疾病免疫应答。在另一个相关方面，所述方法引发个性化的抗癌症或抗肿瘤免疫应答。
根据以下详述、实施例和附图，本申请公开的其他特征和优势将变得显而易见。然而应当理解，详述和具体实施例仅以说明的方式指示了本申请公开优选的实施方案，因为根据该详述，本领域技术人员应当熟知本申请公开的意图和范围内的各种改变和修改。
附图简述
视为本申请公开的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本申请公开(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点。
图1A示出了在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图。
图1B示出了klk3基因被整合到Lmdd和LmddA染色体中。使用klk3特异性引物对来自每个构建体的染色体DNA制备物进行的的PCR扩增了对应于klk3基因的714bp的条带，缺乏野生型蛋白的分泌信号序列。
图2A示出了pADV134质粒的图谱。
图2B示出了沉淀来自LmddA-134培养上清液的蛋白，在SDS-PAGE中进行分离，并且通过Wetsern印迹使用抗E7单克隆抗体来检测LLO-E7蛋白。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人PSA基因(klk3)组成。
图2C示出了pADV142质粒的图谱。
图2D示出了Western印迹显示使用抗PSA和抗LLO抗体的LLO-PSA融合蛋白的表达。
图3A示出了在具有和不具有选择压力(D-丙氨酸)的情况下培养时LmddA-LLO-PSA的体外质粒稳定性。首先列出菌株和培养条件，然后列出用于CFU测定的板。
图3B示出了LmddA-LLO-PSA体内清除和此期间的潜在的质粒损失的评价。静脉内注射细菌并且在指定时间点将其从脾脏分离。在BHI和BHI+D-丙氨酸板上测定CFU。
图4A示出了在C57BL/6小鼠中施用108个CFU之后菌株LmddA-LLO-PSA的体内清除率。通过在BHI/str板上铺板来测定CFU的数量。该方法的检测限为100个CFU。
图4B示出了用10403S、LmddA-LLO-PSA和XFL7菌株进行的J774细胞的细胞感染测定。
图5A示出了在强化剂量之后第6天时，未经处理的小鼠和经LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞中的PSA四聚体特异性细胞。
图5B示出了用PSA肽刺激5小时的未经处理的小鼠和经LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞中IFN-γ的胞内细胞因子染色。
图5C和图5D示出了使用基于半胱天冬酶的测定法(图5C中所示)和基于铕的测定法(如图5D所示)在不同效应子/靶比率下，来自经LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠和未经处理的小鼠的体外刺激效应T细胞对用PSA肽脉冲处理的EL4细胞的特异性裂解。
图5E示出了在PSA肽存在或无肽存在的情况下刺激24小时后所获得的未经处理的和经免疫的脾细胞中的IFNγ斑点的数量。
图6A-6C示出了用LmddA-142免疫引起Tramp-C1-PSA(TPSA)肿瘤消退。小鼠不做处理(n＝8)(图6A)或在第7天、第14天和第21天用LmddA-142(1×108个CFU/只小鼠)(n＝8)(图6B)或Lm-LLO-PSA(n＝8)，(图6C)腹膜内免疫。测量每个肿瘤的肿瘤大小，并且数值表示为以毫米为单位的平均直径。每条线表示单个小鼠。
图7A示出了未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫的小鼠的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的PSA-四聚体+CD8+T细胞的分析。
图7B示出了未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的CD4+调节性T细胞(定义为CD25+FoxP3+)的分析。
图8A示出了在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图。
图8B示出了klk3基因被整合到Lmdd和LmddA染色体中。使用klk3特异性引物对来自每个构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的760bp的条带。
图9A示出了Lmdd-143和LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白。使来自细菌培养上清液的蛋白沉淀，在SDS-PAGE中分离，并且通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来检测LLO和LLO-PSA蛋白。
图9B示出了Lmdd-143和LmddA-143产生的LLO保留溶血活性。将绵羊红细胞与细菌培养上清液的连续稀释液一起培育，并且通过590nm下的吸光度测量溶血活性。
图9C示出了Lmdd-143和LmddA-143在巨噬细胞样J774细胞内部生长。将J774细胞与细菌一起培育1小时，随后用庆大霉素处理以杀死胞外细菌。通过对在指定时间点获得的J774裂解物的连续稀释液进行铺板来测量胞内生长。在这些实验中Lm 10403S用作对照。
图10示出了用Lmdd-143和LmddA-143免疫小鼠诱导PSA特异性免疫应答。将C57BL/6小鼠用1×108个CFU的Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以一周间隔免疫两次，并且在7天后收获脾脏。在莫能菌素存在下用1μM PSA65-74肽刺激脾细胞5小时。针对CD8、CD3、CD62L和胞内IFN-γ对细胞进行染色，并且在FACS Calibur细胞计数器中分析。
图11A和图11B涉及ADXS31-164的构建。图11示出了pAdv164的质粒图谱，其具有在组成型李斯特菌p60启动子控制下的枯草芽孢杆菌dal基因，用于弥补LmddA菌株的染色体dal-dat缺失。其还含有截短的LLO(1-441)与嵌合的人Her2/neu基因的融合体，该融合体通过3个片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而构建。图11B示出了通过对用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀细胞培养物上清液进行的Western印迹分析检测了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表达和分泌。～104KD的差异条带对应于tLLO-ChHer2。检测到内源性LLO为58KD条带。李斯特菌对照缺乏ChHer2表达。
图12A-12C示出了ADXS31-164的免疫原性特征。图12A示出了使用NT-2细胞作为刺激物、3T3/neu细胞作为靶标对基于Her2/neu李斯特菌的疫苗在经免疫的小鼠的脾细胞中引发的细胞毒性T细胞应答进行测试。Lm对照基于在各个方面相同但表达不相关抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。图12B示出了在使用丝裂霉素C处理的NT-2细胞体外刺激24小时后，通过ELISA测定的由来自经免疫的FVB/N小鼠的脾细胞分泌到细胞培养基中的IFN-γ。图12C示出了经嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞响应于与来自蛋白不同区域的肽的体外温育而分泌IFN-γ。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，并且不相关肽或无肽组构成阴性对照，如图例中所列出。使用72小时共温育后收获的细胞培养上清液进行ELISA分析，以测定IFN-γ分泌。每个数据点是一式三份数据的平均值+/-标准误差。*P值<0.001。
图13示出了李斯特菌-ChHer2/neu疫苗的肿瘤预防研究，用每种重组李斯特菌-ChHer2或对照李斯特菌疫苗注射Her2/neu转基因小鼠六次。在6周龄开始免疫，每3周一次延续直到第21周。每周监测肿瘤的外观并以无肿瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每组。
图14示出了ADXS31-164免疫对脾脏中Treg的百分比的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且用每种疫苗以一周为间隔免疫3次。在第二次免疫后7天收获脾脏。在分离免疫细胞后，将其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。来自代表性实验的Treg的点图显示了CD25+/FoxP3+T细胞的频率，其表示为不同处理组中总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分率。
图15A和图15B示出了ADXS31-164免疫对NT-2肿瘤中肿瘤浸润Treg的百分比的作用。向FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且用每种疫苗以一周为间隔免疫3次。在第二次免疫后7天收获肿瘤。在分离免疫细胞后，将其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。图15A示出了来自代表性实验的Treg的点图。图15B示出了CD25+/FoxP3+T细胞的频率，其表示为不同治疗组中总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分率(左板块)和肿瘤内CD8/Treg比率(右板块)。数据以2个独立实验获得的平均值±SEM表示。
图16A-16C示出了ADXS31-164疫苗接种可以延缓脑中乳腺癌细胞系的生长。Balb/c小鼠用ADXS31-164或对照李斯特菌疫苗免疫3次。在经麻醉的小鼠中颅内注射EMT6-Luc细胞(5000个)。图16A示出了使用Xenogen X-100CCD相机在指定的天数对小鼠离体成像。图16B示出了像素强度以光子数/秒/cm2表面积绘图；以平均辐亮度表示。图16C示出了通过使用抗Her2/neu抗体的Western印迹检测EMT6-Luc细胞、4T1-Luc和NT-2细胞系的Her2/neu的表达。小鼠巨噬细胞样细胞系J774.A2细胞用作阴性对照。
图17A-C示出了重组李斯特菌蛋白微基因构建体的示意性图谱。图17A示出了产生卵清蛋白源SIINFEKL肽的构建体(SEQ ID NO:1)。图17B示出了可比较的重组蛋白，其中已通过PCR克隆引入GBM源肽，以代替SIINFEKL。图17C示出了被设计为经由李斯特菌菌株表达4种单独的肽抗原的构建体。
图18示出了在质粒主链pAdv142(参见图1C)中克隆不同ActA PEST区域以形成所示的质粒pAdv211、pAdv223和pAdv224的示意图。该示意图示出了将不同ActA编码区克隆入使用XbaI和XhoI限制酶切割获得的质粒pAdv142主链中的李斯特菌溶血素O信号序列的同一框架中。
图19A示出了使用TPSA23作为可移植肿瘤模型进行的肿瘤消退研究。在第0天用1×106个肿瘤细胞植入3个组(每组8只小鼠)，并在第6天、第13天和第20天用108个CFU的不同疗法进行治疗：LmddA142、LmddA211、LmddA223和LmddA224。未经处理的小鼠未接受任何治疗。每周监测肿瘤，并且如果平均肿瘤直径为14-18mm则处死小鼠。图表中的每个符号代表单个小鼠的肿瘤大小。重复了两次实验并且获得类似的结果。
图19B示出了未经处理的小鼠和免疫小鼠在不同实验天数的存活百分比。
图20A-B示出了特异性免疫应答通过四聚体染色(图20A)和用于IFN-γ的细胞内细胞因子染色(图20B)进行检查。将小鼠以周为间隔用108个CFU的不同疗法免疫3次：LmddA142(ADXS31-142)、LmddA211、LmddA223和LmddA224。对于免疫测定，在第二次强化之后第6天收获脾脏。将来自2只小鼠/组的脾脏合并以用于该实验。在图20A中，使用PSA-表位特异性四聚体染色来检测未经处理的小鼠、LmddA142、LmddA211、LmddA223和LmddA224免疫的小鼠的脾脏中的PSA特异性T细胞。将细胞用小鼠抗CD8(FITC)、抗CD3(Percp-Cy5.5)、抗CD62L(APC)和PSA四聚体-PE染色，并且通过FACS Calibur进行分析。在图20B中，用于在未经处理的小鼠和用1μPSA特异性H-2Db肽(HCIRNKSVIL；SEQ ID NO:59)刺激5小时后的免疫小鼠中检测分泌IFN-γ的CD8+CD62L低细胞的百分比的细胞内细胞因子染色。
图21A-C示出了使用TPSA23肿瘤模型，以通过使用ActA/PEST2(LA229)融合PSA和tLLO融合PSA研究在C57BL6小鼠中的免疫应答生成。在第0天，用1×106个肿瘤细胞植入四个组(每组5只小鼠)，并且在第6天和第14天用108个CFU的不同疗法进行治疗：LmddA274、LmddA142(ADXS31-142)和LmddA211。未经处理的小鼠未接受任何治疗。在最后免疫后的第6天，收集每只小鼠的脾脏和肿瘤。图21A示出了显示免疫后第13天的肿瘤体积的表格。通过脾脏(图21B)和肿瘤(图21C)中的五聚体染色检查PSA特异性免疫应答。为了进行免疫检测，将来自2只小鼠/组或3只小鼠/组的脾脏合并，并且将来自5只小鼠/组的肿瘤合并。将细胞用小鼠抗CD8(FITC)、抗CD3(Percp-Cy5.5)、抗CD62L(APC)和PSA五聚体-PE染色，并且通过FACS Calibur进行分析。
图22示出了通过使用包含所有新抗原和患者HLA类型的输出数据来生成个性化质粒载体的DNA序列的方法的流程图(手动或自动)，所述质粒载体包含用于递送载体(例如单核细胞增多性李斯特菌)中的一个或多个新表位。
图23A示出了B16F10肿瘤实验(包括用Lm Neo构建体进行处理)的时间线。
图23B示出了PBS作为阴性对照的情况下，LmddA274、Lm-Neo-12和Lm-Neo-20导致的肿瘤消退。
图23C比较了在PBS作为阴性对照的情况下，用LmddA274、Lm-Neo-12或Lm-Neo-20治疗具有B16F10肿瘤的小鼠后，小鼠的存活。
图24A-C示出了PSA-生存素-SIINFEKL(图24A)、不具有SIINFEKL的PSA-生存素(图24B)和Neo 20-SIINFEKL(图24C)的表达和分泌水平。
图25示出了针对Neo 20抗原(具有C末端SIINFEKL标签)或阴性对照的CD8T细胞应答。该图指示了针对每种条件的SIINFEKL特异性CD8T细胞应答的百分比。
图26A示出了在PBS作为阴性对照的情况下，LmddA274、Lm-Neo-12、Lm-Neo-20和Lm-Neo 30导致的肿瘤消退。
图26B比较在用PBS作为阴性对照的情况下，用LmddA274、Lm-Neo-12、Lm-Neo-20和Lm-Neo 30治疗之具有B16F10肿瘤的小鼠后，小鼠的存活。
图27示出了对来自前列腺腺癌(PRAD)、胰腺腺癌(PAAD)、乳腺浸润癌(BRCA)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)和甲状腺癌(THCA)中的移码突变的肽的分析。
图28示出了与仅用空载体阴性对照(LmddA-274)处理的携带肿瘤的动物相比，使用分泌来源于B16F10肿瘤细胞的移码突变(移码突变1或移码突变2)的Lm构建体免疫的携带B16F10肿瘤的小鼠，肿瘤生长减少。Neo 12构建体用作阳性对照。
应当理解，为了说明的简单和清楚，显示在图中的要素未必是按比例绘制的。例如，为清楚起见，一些要素的大小可以是相对其他要素而放大的。此外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
发明详述
在以下详述中，阐述了许多具体细节以提供对本申请公开的透彻理解。然而，本领域一般技术人员应当理解，没有这些具体细节也可以实践本申请公开。在其他情况下，未详细说明已知的方法、程序和组分，以不使本申请公开变得模糊。
新抗原衍生自肿瘤细胞DNA(或其他疾病或病症)中导致非同义突变的突变。这些突变中的大多数导致单个氨基酸取代，这种取代可与MHC I类分子结合并由其呈递，用于被细胞毒性CD8+T细胞识别。然而，在某些情况下，一个或两个核苷酸的插入或缺失(indel)可导致移码突变的产生，所述移码突变编码具有完全独特的氨基酸序列的多肽，所述多肽将被宿主免疫系统识别为外来物，并且代表了潜在的新抗原序列的丰富来源。然而，将这些移码衍生的多肽序列用于T细胞靶向免疫疗法是具有局限性的。这些限制之一在于与源自移码突变的mRNA序列相关联的有限的翻译水平。这是被称为无义介导的衰变的现象所导致的结果，其中具有通常存在于移码突变中的提前终止密码子的mRNA序列在仅一轮或两轮翻译后被降解。因此，衍生自含有移码错误的核苷酸序列的蛋白以极其有限的量产生，这严重限制了其在针对可能存在于移码衍生的蛋白中的抗原肽的T细胞应答的交叉激活中的可用性。出于这一原因，对于研究移码衍生的蛋白作为T细胞介导的免疫疗法的靶标仅付出了有限的努力。
针对衍生自非专业抗原呈递细胞(如大多数肿瘤细胞)中所表达的蛋白的抗原的T细胞激活需要将足够量的蛋白转移到专职抗原呈递细胞，如树突细胞。该过程称为交叉呈递，并且由交叉呈递导致的T细胞激活称为交叉激活。由于无义介导的衰变将移码相关序列的翻译限制为仅一轮或两轮，所以可用于交叉呈递和交叉激活的蛋白的量可能不足。因此，任何依赖于内源性T细胞激活的免疫疗法(例如检查点调节剂、过继性T细胞疗法等)对于移码衍生的抗原不太可能有效。然而，一旦CD8+T细胞应答被激活，为了在细胞表面上呈递足够的抗原肽以使其被靶向破坏所需的蛋白表达水平显著低于交叉激活所需的蛋白表达水平。因此，如果可以通过使用重组表达系统(如本申请公开的李斯特菌平台)引入移码相关的抗原序列来完成T细胞激活事件，则可能靶向由肿瘤细胞表达的移码衍生抗原(参见例如本申请公开的实施例22)。
在一个方面，本申请公开了一种包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个包含一个或多个免疫原性新表位的移码突变衍生肽。所述免疫疗法递送载体可以是例如重组李斯特菌菌株。所述移码突变衍生肽可以是例如疾病特异性或病症特异性的。
在另一个方面，本申请公开了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括至少一个本申请公开的免疫疗法递送载体。这种免疫原性组合物还可包括例如佐剂。
在另一个方面，本申请公开了一种治疗、压制、预防或抑制受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用本申请公开的免疫疗法递送载体或本申请公开的免疫原性组合物，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品的源核酸序列编码。这种方法可例如在所述受试者中引发个性化的抗疾病或抗病症免疫应答，其中所述个性化的免疫应答靶向一个或多个移码突变衍生肽。
在另一个方面，本申请公开了一种用于生成针对患有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法，其包括：(a)将从所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了编码一种或多种肽的一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含一个或多个免疫原性新表位，所述一个或多个免疫原性新表位在来自所述患有疾病或病症的生物样品的一个或多个ORF中编码，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个包含一个或多个移码突变，并编码包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个移码突变衍生肽；以及(b)产生包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含一种或多种含有步骤(a)中识别的一个或多个免疫原性新表位的肽。任选地，所述方法还可包括储存所述免疫疗法递送载体或所述DNA免疫疗法或所述钛免疫疗法，以用于在预定的时间段内向所述受试者施用。任选地，所述方法还可包括向所述受试者施用包含所述免疫治疗载体的组合物，其中所述施用过程导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
在一个实施方式中，本申请公开了一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源(source)获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。在另一个实施方式中，将所述移码突变与获取自健康生物样品的源核酸序列进行比较。
在另一个实施方式中，所述重组李斯特菌还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一种或多种肽包括一个或多个免疫原性新表位。在另一个实施方式中，所述一种或多种肽是有义肽。
在另一个实施方式中，本申请公开涉及一种免疫疗法递送载体，所述免疫疗法递送载体包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，所述免疫疗法递送载体还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一个或多个肽包括一个或多个免疫原性新表位。在另一个实施方式中，所述一种或多种肽是有义肽。
在另一个实施方式中，本申请公开的至少一个移码突变包括多个移码突变，并且所述多个移码突变存在于相同基因中。在另一个实施方式中，本申请公开的至少一个移码突变包括多个移码突变，并且所述多个移码突变不存在于相同基因中。
在另一个实施方式中，本申请公开的至少一个移码突变位于基因的外显子编码区内。在另一个实施方式中，所述外显子是所述基因的最后一个外显子。在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个无义肽在所述患有疾病或病症的生物样品中表达。在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个无义肽不编码翻译后切割位点。在另一个实施方式中，所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位包含T细胞表位。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位包含癌症或肿瘤相关新表位。在一个实施方式中，具有肿瘤相关新表位的癌症包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。在另一个实施方式中，包含一个或多个新表位的本申请公开的一个或多个无义肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
在另一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌表达并分泌一个或多个重组多肽。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个无义肽或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个无义肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作连接的无义肽或其片段，其中所述免疫原性多肽与所述多个无义肽或其片段中的一个融合。
在另一个实施方式中，本申请公开的一种或多种肽或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。在另一个实施方式中，本申请公开的一种或多种肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作连接的肽或其片段，其中所述免疫原性多肽与所述一种或多种肽或其片段中的一个融合。
在一个实施方式中，本申请公开的肽是有义肽。在另一个实施方式中，肽是无义肽。
在另一个实施方式中，所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。所述免疫原性多肽可包含例如含PEST的肽。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个重组多肽与所述C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。在另一个实施方式中，所述标签选自下组：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。
在另一个实施方式中，编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：phly-tLLO-[无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述无义肽或其片段的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
在另一个实施方式中，编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：phly-tLLO-[肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述肽或其片段的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
在另一个实施方式中，本申请公开的至少一个编码本申请公开的重组多肽的核酸序列被整合到李斯特菌基因组中。在另一个实施方式中，至少一个编码所述重组多肽的核酸序列位于质粒中。
在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株是减毒李斯特菌菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
在另一个实施方式中，本申请公开的减毒李斯特菌包含一个或多个内源性基因的突变。在另一个实施方式中，所述内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dal基因双突变，或dal/dat/actA基因三突变或其组合。
在另一个实施方式中，至少一个编码所述重组多肽的核酸序列还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，或者其中所述李斯特菌菌株包含第二核酸序列，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。在另一个实施方式中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
在另一个实施方式中，通过比较从所述患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF，获得本申请公开的无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列中的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的所述核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自所述患有疾病的生物样品的所述一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
在另一个实施方式中，本申请公开的患有疾病的生物样品获取自所述患有疾病或病症的受试者。在另一个实施方式中，健康生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。
在另一个实施方式中，所述无义肽通过以下方式表征新表位：(i)从所述无义肽产生一种或多种不同的肽序列；和任选地，(ii)筛选每个(i)中产生的肽，并通过与MHC I类复合物或MHC II类复合物的结合对其进行选择，所述MHC I类复合物或MHC II类复合物与T细胞受体结合。
在一个实施方式中，本申请公开了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括任何一种本申请所述的李斯特菌菌株中的至少一个。
在另一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物还包含其他佐剂。
在一个实施方式中，本申请公开了一种在患有疾病或病症的受试者中引发个性化靶向免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本申请所述的免疫原性组合物，其中所述免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在一个实施方式中，本申请公开了一种治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用如本申请所述的免疫原性组合物。
在一个实施方式中，本申请公开了一种提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用如本申请所述的免疫原性组合物，其中所述效应T细胞靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在一个实施方式中，本申请公开了一种增加受试者中新表位特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个实施方式中，本申请公开了一种增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在一个实施方式中，本申请公开了一种减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法还包括施用强化治疗。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法在所述受试者中引发个性化增强的抗感染性疾病免疫应答。在另一个实施方式中，所述方法引发个性化的抗癌症或抗肿瘤免疫应答。
I.个性化免疫疗法
本申请公开了个性化免疫疗法，如重组李斯特菌菌株。例如，该免疫疗法递送载体可包含核酸，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个包含一个或多个免疫原性新表位(例如T细胞表位)的移码突变衍生肽。所述移码突变中的一个或多个或全部可以是疾病特异性或病症特异性的(即存在于来自具有疾病或病症的生物样品的源核酸序列中，但不存在于来自健康生物样品的源核酸序列中)。来自所述疾病或病症的源核酸序列可包含例如一个或多个微卫星不稳定性区域。
所述免疫疗法递送载体可以是任何合适的免疫疗法递送载体，如DNA免疫疗法、肽免疫疗法或重组李斯特菌菌株或其他细菌菌株。
移码突变可位于基因(例如编码蛋白的基因)中的任何地方。例如，移码突变可位于基因的倒数第二个外显子或最后一个外显子中。由移码突变编码的移码突变衍生肽可以为任意长度。例如，该移码突变衍生肽的长度可为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500个氨基酸。一些这样的移码突变衍生肽不编码翻译后切割位点。
所述疾病或病症可以是任何包含新表位的疾病或病症。例如，所述疾病或病症可以是癌症或肿瘤，并且所述一个或多个移码突变衍生肽包含癌症相关或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。例如，所述一个或多个免疫原性新表位可包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。在本申请的其他地方公开了具体的肿瘤或癌症的示例。例如，肿瘤或癌症可以是黑色素瘤、肺癌(例如肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌)、膀胱癌、胃癌(胃癌)、食道癌(例如食道腺癌)、结直肠癌、子宫癌(子宫内膜癌或子宫癌)、头颈癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌(肾细胞癌，如乳头状肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌和嫌色细胞肾细胞癌)、多发性骨髓瘤、胰腺癌、乳腺癌、低级别胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌、神经母细胞瘤、类癌瘤、成神经管细胞瘤、急性髓性白血病、甲状腺癌、急性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤或横纹肌样瘤。类似地，肿瘤或癌症可以是胰腺癌(例如胰腺腺癌)、前列腺癌(例如前列腺腺癌)、乳腺癌(例如乳腺浸润癌)、卵巢癌(例如卵巢浆液性囊腺癌)或甲状腺癌(例如甲状腺癌)。其他类型的肿瘤或癌症也是可能的。在一些实施例中，所述肿瘤是具有少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样品中的)非同义错义突变的肿瘤，或所述肿瘤是下述类型的癌症，在该类型的癌症中，不同患者中肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样本中的)非同义错义突变的平均数或中位数少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个，或者所述癌症是这样的一种癌症，患有该类型癌症的患者中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％具有包含少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样本中的)非同义错义突变的肿瘤。作为另一个示例，所述疾病或病症可以是感染性疾病。例如，所述一个或多个移码突变衍生肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
所述重组多肽可包含任意数量的新表位。例如，所述重组多肽可包括约1-20个新表位。本申请的其他地方公开了其他可能性。
所述一个或多个异源肽可包含多种异源肽。例如，其可包含可操作地串联连接的多个异源肽，其中所述含PEST的肽与所述多个异源肽中的一个融合。同样，所述重组多肽可包含多个移码突变衍生肽，其中每个移码突变衍生肽是相同或不同的。如果两个肽相差至少一个氨基酸，则它们是不同的。在一些情况下，所述多个异源肽彼此可操作地连接而没有间隔序列(例如彼此通过肽键直接融合在一起)。或者，所述多个异源肽可通过一个或多个接头彼此可操作地连接，如一个或多个肽接头或一个或多个4x甘氨酸接头。本申请的其他地方公开了这些接头。
在一些包含多个异源肽的该重组多肽中，所述含PEST的肽与所述N-末端异源肽可操作地连接。其可直接连接而无间隔序列(例如彼此通过肽键直接融合)，或其可通过一个或多个接头连接，如一个或多个肽接头或一个或多个4x甘氨酸接头。本申请的其他地方公开了这些接头。含PEST的肽的示例包括突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。本申请的其他地方公开了其他示例。
所述重组多肽还可包含一个或多个标签。所述标签可位于如本申请的其他地方公开的重组多肽的N末端、C末端或其中的任何位置处。例如，所述重组多肽的C末端可与标签可操作地连接。其可直接连接而无间隔序列(例如彼此通过肽键直接融合)，或者其可通过一个或多个接头来连接，如一个或多个肽接头或一个或多个4x甘氨酸接头。本申请的其他地方公开了这些接头。标签的示例包括：6X组氨酸标签、2x FLAG标签、3x FLAG标签、SIINFEKL肽、与SIINFEKL肽可操作地连接的6X组氨酸标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的3X FLAG标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的2X FLAG标签以及其任何组合。
任选地，编码所述重组多肽的开放阅读框在3’端(例如在编码所述标签的序列后)处包含两个终止密码子。这种开放阅读框的一个示例与hly启动子可操作地连接，并且从N末端到C末端编码以下组分：tLLO-[异源肽]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中，n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽，该开放阅读框的另一个实施例与hly启动子可操作地连接，并编码包含从N末端到C末端的组分：tLLO-[(异源肽)-(甘氨酸接头(4x))]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中，n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽。
所述一个或多个异源肽还可包含不是移码突变编码的移码突变衍生肽的肽。例如，所述一个或多个异源肽还可包含一个或多个非同义错义突变衍生肽。作为示例，所述一个或多个异源肽还可包含一个或多个由源核酸序列编码的肽，所述源核酸序列包含至少一个疾病特异性或病症特异性的非同义错义突变。非同义错义突变衍生肽可为足以引发阳性免疫应答(例如足以使用Lm技术来引发阳性免疫应答)的任何长度。例如，其长度可为约5-50个氨基酸、约8-27个氨基酸或约21个氨基酸。
一些这样的免疫疗法递送载体包含重组李斯特菌菌株。本申请的其他地方公开了重组李斯特菌菌株的变体的示例。
在一个实施方式中，本申请公开了一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，无义肽包括至少一个免疫原性新表位。在另一个实施方式中，免疫原性新表位包含之前未被免疫系统识别的表位。新表位可与肿瘤抗原相关并可以存在于致癌细胞中。当蛋白经历生物化学途径中的进一步修饰(如糖基化、磷酸化或蛋白水解)时，可形成新表位。即，通过改变蛋白或其部分的结构，可产生新的或“neo”表位或新表位。
技术人员将理解，表达体细胞突变或突变或序列差异的肽可包含“新表位”。
技术人员将进一步理解，术语“新表位”在一个实施方式中可包含参照样品(如正常的非癌细胞或种系细胞或组织)中不存在的表位，其中所述新表位存在于患病组织中，例如在癌细胞中。例如，正常的非癌细胞或种系细胞可包含表位；然而，由于癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生免疫原性新表位。在另一个实施方式中，新表位包含突变的表位。在另一个实施方式中，新表位在该表位的任一侧上均具有未突变的序列。
在另一个实施方式中，新表位是免疫原性的。在另一个实施方式中，所述一个或多个新表位中的至少一个是免疫原性的。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位在MHC I分子上呈递。在另一个实施方式中，一个或多个新表位在MHC II分子上呈递。在又一个实施方式中，一个或多个新表位在MHC I分子和MHC II分子上均呈递。
在一个实施方式中，新表位是线性表位。在另一个实施方式中，新表位被认为是溶剂暴露的，因此可被T细胞抗原受体接近。在另一个实施方式中，新表位是构象表位。
在另一个实施方式中，新表位包含T细胞表位。在另一个实施方式中，新表位包含适应性免疫应答表位。在另一个实施方式中，新表位能够导致针对新表位或针对包含新表位的抗原的T细胞免疫应答的诱导。在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位不包含免疫抑制性T-调节新表位。在其他实施方式中，编码无义肽或其片段的源核酸序列包含一个或多个新表位，而不编码免疫抑制性表位。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个免疫原性新表位在KyteDoolittle亲水性图上显示达1.6的得分。
在另一个实施方式中，新表位与所述受试者的疾病或病症相关。在另一个实施方式中，新表位是引起所述受试者的疾病或病症的原因。在另一个实施方式中，新表位存在于患有疾病的生物样品中。在另一个实施方式中，新表位存在于患病生物组织中，但其不是引起所述疾病或病症的原因或与所述疾病或病症无关。在另一个实施方式中，疾病或病症包含癌症或肿瘤生长。在又一个实施方式中，疾病或病症包含感染性疾病或自身免疫疾病。
在另一个实施方式中，包含一个或多个免疫原性新表位的所述一个或多个无义肽包含癌症或肿瘤相关新表位或癌症或肿瘤特异性新表位。
在另一个实施方式中，免疫原性新表位或其片段包含至少一个抗原部分，例如，人乳头瘤病毒(HPV)-16-E6抗原、HPV-16-E7抗原、HPV-18-E6抗原、HPV-18-E7抗原、Her/2-neu抗原、嵌合Her2抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、二价PSA抗原、ERG抗原、雄激素受体(AR)抗原、PAK6抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、NY-ESO-1抗原、角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)抗原、Wilms肿瘤抗原1(WT-1)、HIV-1Gag抗原、人端粒酶逆转录酶(hTERT)抗原、蛋白酶3抗原、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)抗原、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、滑膜肉瘤抗原、X(SSX)-2抗原、癌胚抗原(CEA)、黑色素瘤相关抗原E(MAGE-A、MAGE 1，MAGE2、MAGE3、MAGE4)、白细胞介素-13受体α(IL13-Rα)抗原、碳酸酐酶IX(CAIX)抗原、存活素抗原，GP100抗原、血管生成抗原、ras蛋白抗原、p53蛋白抗原、p97黑素瘤抗原、KLH抗原、MART1抗原、TRP-2抗原、HSP-70抗原、β-HCG抗原或Testisin抗原。
在另一个实施方式中，所述HPV抗原是HPV-31。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-35。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-39。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-45。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-51。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-52。在另一个实施方式中，所述HPV是HPV-58。在另一个实施方式中，所述HPV是高风险HPV类型。在另一个实施方式中，所述HPV是粘膜HPV类型。
在另一个实施方式中，在本申请公开的组合物或方法中，使用HPV E6抗原代替E7抗原，或者除在E7抗原之外使用HPV E6抗原，以用于治疗或改善HPV介导的疾病、病症或症状。在另一个实施方式中，使用HPV-16E6和E7代替HPV-18E6和E7或将HPV-16E6和E7与HPV-18E6和E7组合使用。在这样的实施方式中，所述重组李斯特菌可表达来自染色体的HPV-16E6和E7以及来自质粒的HPV-18E6和E7，反之亦然。在另一个实施方式中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原表达自本申请公开的重组李斯特菌中存在的质粒。在另一个实施方式中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原表达自本申请公开的重组李斯特菌的染色体。在另一个实施方式中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原在上述实施方式中的任何组合中表达，包括其中来自各HPV菌株的每个E6和E7均表达自所述质粒或所述染色体。
在另一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位包含与疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。技术人员将理解，可通过本申请公开的组合物和方法治疗的癌症或肿瘤不必限于本申请公开的癌症或肿瘤，而是包括本领域已知的任何癌症或液体或实体肿瘤。
在另一个实施方式中，包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个无义肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。在另一个实施方式中，本申请公开的感染性疾病包含病毒或细菌感染。在另一个实施方式中，所述感染性疾病是由以下病原体之一引起的：利什曼虫、溶组织内阿米巴(其导致阿米巴病)、鞭虫、BCG/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感、A型流感(H1N1)流行病、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗(单价、二价和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒梭状芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、重型天花(天花)和其他相关的痘病毒、土拉热弗朗西斯菌(土拉菌病)、病毒性出血热、沙粒病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒属、裂谷热)、黄病毒属(登革热)、线状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、假鼻疽伯克霍尔德菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁杆菌属种(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德菌(鼻疽)、鹦鹉衣原体(鹦鹉热)、蓖麻蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒热(普氏立克次体)、其他立克次体、食品和水传播的病原体、细菌(致腹泻性的大肠杆菌、致病性的弧菌属、志贺氏菌属种、沙门氏菌属BCG/、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、LaCrosse、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒属、蜱传出血热病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV))、原生动物(小隐孢子虫、卡晏环孢子虫、兰伯贾第虫、溶组织内阿米巴、弓形虫属)、真菌(微孢子目)、黄热病、结核病(包括耐药结核病)、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、posadasii球孢子菌、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、变形链球菌或阴道毛滴虫。
在一个实施方式中，本申请公开的一个或多个新表位包含至少本申请公开的异源抗原的部分。技术人员应当理解，术语“异源”可包含抗原或其部分，其在自然或正常情况下不由细菌表达。在一个实施方式中，异源抗原包含在自然或正常情况下不由李斯特菌属菌株表达的抗原。
技术人员将进一步理解，本申请公开的术语“异源”包含衍生自与参照物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表达异源多肽的李斯特菌菌株在一个实施方式中将表达对于李斯特菌菌株不是天然的或内源性的多肽，或在另一个实施方式中，表达通常不由李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施方式中，表达来自李斯特菌菌株以外来源的多肽。在另一个实施方式中，异源可用于描述衍生自同一物种中的不同生物的物质。在另一个实施方式中，所述异源抗原由李斯特菌的重组菌株表达，并且在重组菌株感染哺乳动物细胞时被加工并呈递给细胞毒性T细胞。在另一个实施方式中，由李斯特菌菌种表达的异源抗原不需要与肿瘤细胞或传染剂中对应的未修饰的抗原或蛋白精确匹配，只要其导致识别在哺乳动物中天然表达的未修饰抗原或蛋白的T细胞应答即可。
技术人员应当理解，术语“异源抗原”在本文中可称为“抗原多肽”、“异源蛋白”、“异源蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原片段”、“抗原部分”、“多肽”、“免疫原性多肽”、“无意义肽”、“免疫原性新表位”、“抗原”和“新表位”或其语法等价物等，并可涵盖本申请所述的在存在于受试者细胞中的MHC I类和/或II类分子上加工和呈递从而在向所述受试者施用时(或在另一个实施方式中，被宿主检测到时)导致产生免疫应答的多肽、肽、无义肽或重组肽，。在一个实施方式中，所述抗原对宿主来说可能是外来的。在另一个实施方式中，抗原可能存在于宿主中，但由于免疫耐受，宿主不会引发针对它的免疫应答。在另一个实施方式中，抗原是包含一个或多个新表位的新抗原。
在一个实施方式中，本申请公开的疾病是感染性疾病。在一个实施方式中，感染性疾病是由但不限于以下病原体中的任何一种引起的：利什曼虫、溶组织内阿米巴(其导致阿米巴病)、鞭虫、BCG/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感、A型流感(H1N1)流行病、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗(单价、二价和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒梭状芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、重型天花(天花)和其他相关的痘病毒、土拉热弗朗西斯菌(土拉菌病)、病毒性出血热、沙粒病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒属、裂谷热)、黄病毒属(登革热)、线状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、假鼻疽伯克霍尔德菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁杆菌属种(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德菌(鼻疽)、鹦鹉衣原体(鹦鹉热)、蓖麻蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒热(普氏立克次体)、其他立克次体、食品和水传播的病原体、细菌(致腹泻性的大肠杆菌、致病性的弧菌属、志贺氏菌属种、沙门氏菌属BCG/、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、LaCrosse、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒属、蜱传出血热病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV))、原生动物(小隐孢子虫、卡晏环孢子虫、兰伯贾第虫、溶组织内阿米巴、弓形虫属)、真菌(微孢子目)、黄热病、结核病(包括耐药结核病)、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、posadasii球孢子菌、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、阴道毛滴虫或本领域已知的在本文中没有列出的任何其他感染性疾病。
在一个实施方式中，病原性原生动物和寄生虫感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺囊虫(pneumocystis carinii)；巴贝斯虫病；贾第虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫或吸虫；和cestode(绦虫)感染。
在一个实施方式中，本申请公开的HPV抗原(如E6和E7抗原)选自：HPV 6菌株、HPV11菌株、HPV 16菌株、HPV-18菌株、HPV-31菌株、HPV-35菌株、HPV-39菌株、HPV-45菌株、HPV-51菌株、HPV-52菌株、HPV-58菌株或HPV-59菌株。在另一个实施方式中，所述HPV抗原选自高风险HPV菌株。在另一个实施方式中，所述HPV菌株是粘膜HPV类型。在另一个实施方式中，HPV抗原可选自所有HPV菌株，包括引起疣和发育异常的非致癌性HPV，如6型、11型等。
在另一个实施方式中，所述抗原是Her-2/neu。在另一个实施方式中，所述抗原是NY-ESO-1。在另一个实施方式中，所述抗原是LMP-1。在另一个实施方式中，所述抗原是碳酸酐酶IX(CAIX)。在另一个实施方式中，所述抗原是PSMA。在另一个实施方式中，所述抗原是HMW-MAA。在另一个实施方式中，所述抗原是HIV-1Gag。在另一个实施方式中，所述抗原是PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施方式中，所述抗原是二价PSA。在另一个实施方式中，所述抗原是ERG。在另一个实施方式中，所述抗原是III型ERG构建体。在另一个实施方式中，所述抗原是VI型ERG构建体。在另一个实施方式中，所述抗原是雄激素受体(AR)。在另一个实施方式中，所述抗原是PAK6。在另一个实施方式中，所述抗原包含PAK6的富含表位的区域。在另一个实施方式中，所述抗原选自NY-ESO-1、SCCE、HMW-MAA、EGFR-III、含有凋亡重复序列的杆状病毒抑制剂5(BIRC5)、HIV-1Gag、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或其组合。在另一个实施方式中，抗原包含所述抗原的野生形式。在另一个实施方式中，抗原包含所述抗原的突变形式。
在另一个实施方式中，Her-2蛋白是称为“HER-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。
在一个实施方式中，所述Her2-neu嵌合蛋白具有Her2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，显示出致癌基因上的MHC-I类表位簇，其中，在另一个实施方式中，所述嵌合蛋白具有3个H2Dq和至少17个Her2/neu抗原(片段EC1、EC2和IC1)的定位的人MHC-I类表位。在另一个实施方式中，所述嵌合蛋白具有至少13个定位的人MHC-I类表位(片段EC2和IC1)。在另一个实施方式中，所述嵌合蛋白具有至少14个定位的人MHC-I类表位(片段EC1和IC1)。在另一个实施方式中，所述嵌合蛋白具有至少9个定位的人MHC-I类表位(片段EC1和IC2)。
在一个实施方式中，衍生本申请公开的无义肽的抗原来自真菌病原体、寄生虫或病毒。在其他实施方式中，衍生本申请公开的无义肽的抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感嗜血杆菌外膜蛋白、幽门螺杆菌脲酶、脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白、淋病奈瑟菌菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原酪氨酸酶(MART-1)、来自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45型人乳头瘤病毒的人乳头瘤病毒抗原E1和E2、间皮素或EGFRVIII。
在其他实施方式中，所述无义肽衍生自与以下疾病之一相关的抗原：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症，包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥(如肾脏、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物)、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫性疾病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节炎、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿病、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、荨麻疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、疟疾环子孢子(circumsporozite)蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原和李斯特菌病。在另一个实施方式中，本申请公开的病症是发育异常。在另一个实施方式中，所述疾病是肿瘤形成。在另一个实施方式中，所述疾病是肛门上皮内瘤变(AIN)。在另一个实施方式中，所述疾病是阴道上皮内瘤变(VIN)。在另一个实施方式中，所述疾病是宫颈上皮内瘤变(CIN)。
在另一个实施方式中，本申请公开的病症恶变前病症或在不及时治疗的情况下会发展成为慢性或急性疾病的病症。
在另一个实施方式中，衍生本申请公开的肽的抗原是肿瘤相关抗原，在一个实施方式中，所述肿瘤相关抗原是以下肿瘤抗原中的一个：与晚期癌症相关的ras肽或p53肽。本申请公开还考虑了本领域其他已知的肿瘤相关抗原。
在一个实施方式中，所述无义肽衍生自美国专利号9,084,747所述的嵌合Her2抗原，其通过引用整体并入本申请。
技术人员应当理解，“免疫原性新表位”是如本申请所公开，在单独或在组合物中或作为疫苗的一部分向受试者施用时引发免疫应答的新表位。这种新表位包含必需的表位以引发体液免疫应答和/或适应性免疫应答。在一个实施方式中，在向受试者施用时，包含在一个或多个无义肽中的一个或多个免疫原性新表位引发体液免疫应答。在另一个实施方式中，在向受试者施用时，包含在一个或多个无义肽中的所述一个或多个免疫原性新表位引发适应性免疫应答。在又一个实施方式中，在向受试者施用时，包含在一个或多个无义肽中的所述一个或多个免疫原性新表位引发体液免疫应答和适应性免疫应答。
在另一个实施方式中，本申请公开的新表位序列是肿瘤特异性的、转移特异性的、细菌感染特异性的、病毒感染特异性的或其任何组合。此外或或者，所述新表位序列是炎症特异性的、免疫调节分子表位特异性的、T细胞特异性的、自身免疫疾病特异性的、移植物抗宿主病(GvHD)特异性的，或其任何组合。在进一步的实施方式中，所述新表位序列与肿瘤、癌症、转移、细菌感染、病毒感染、炎症、免疫调节分子、T细胞、自身免疫疾病或其任何组合相关。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，包含患有疾病或病症的生物样品中的新表位的候选基因可包括：小行星同系物1(ASTE1)、HNF1同源框A(HNF1A)、序列相似家族111成员B(FAM111B)、INO80E、含TCP1伴侣蛋白、亚基8(θ)样蛋白1(CCT8L1)、球蛋白转录因子1(GAFA1)、黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)、联会复合蛋白1(SYCP1)、半胱氨酸/组氨酸丰富蛋白1(CYHR1)、鸟苷酸结合蛋白3(GBP3)、LOC100127950、LOC100131089、三基序蛋白59(TRIM59)、O连接的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转移酶(OGT)、D070、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、HPDMPK、Sec63、MAC30X TTK蛋白激酶TTK、卷曲螺旋结构域蛋白43(CCDC43)、钾离子通道四聚体结构域蛋白16(KCTD16)、中介体复合物亚基8(MED8)、依莫帕米结合蛋白样蛋白(EBPL)、信号淋巴细胞活化分子家族成员1(SLAMF1)、SFRS112IP1、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3LG)、(不存在、小或同源异位)样蛋白1(ASH1L)、G蛋白信号转导调节因子22(RGS22)、GINS1、F-框亮氨酸丰富重复蛋白3(FBXL3)、KIAA2018、锚蛋白重复结构域蛋白49(ANKRD49)、BEN结构域蛋白5(BEND5)、与RBPJ 1(CIR1)相互作用的辅助抑制因子、同源框基因A11(HOXA11)、LOC643677、LOC100128175、松弛素/胰岛素样肽受体家族2(RXFP2)、切除修复交叉互补基因1(ERCCS)、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶1(DMT1)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)、Alstrom综合征蛋白1(ALMS1)、6号染色体开放阅读框89抗体(C6ORF89)、Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白3B(FNDC3B)、β受体II(TGFβR2)、转化生长因子、β受体I(TGFβR1)、豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物蛋白-1(MARCKS-1)、豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物蛋白-2(MARCKS-2)、尾型同源框转录因子2(CDX2)、TATA盒结合蛋白相关因子1B(TAF1B)、山核桃素样蛋白2(PCNXL2/FLJ11383)、Baxα+1、2型激活素受体(ACVR2)、C14orf106/FLJ11186、半胱天冬酶5、转录因子7类似物2(TCF7L2/TCF-4)、p21/ras、胰岛素样生长因子II型受体(IGFIIR)、人错配结合因子MutSHomolog 3(hMSH3)或MutS Homolog 6(hMSH6)。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述新表位或其部分可由一个基因的至少一部分来编码。在另一个实施方式中，所述新表位或其部分可由与本申请提及的肿瘤或癌症中的突变相关的一种或多种候选基因来编码。因此，所述新表位可完全由所述基因编码或可部分由所述基因编码。
在另一个实施方式中，一个或多个新表位或其部分可由一个DNA错配修复基因的至少一部分编码。在另一个实施方式中，一个或多个新表位可由一个细胞周期调控相关基因的至少一部分编码。在另一个实施方式中，一个或多个新表位可由一个细胞凋亡调控相关基因的至少一部分编码。在另一个实施方式中，一个或多个新表位可由一个血管生成相关基因的至少一部分来编码。在另一个实施方式中，一个或多个新表位可由一个生长因子或生长因子受体相关基因的至少一部分编码。在另一个实施方式中，一个或多个新表位可由包含编码单核苷酸重复序列(cMNR)的基因编码。
技术人员将理解，术语“基因组”可包括生物体染色体中遗传信息的总量。技术人员还将理解，术语“外显子组”可包括基因组的编码区，术语“转录组”可包括所有RNA分子的集合。
在另一个实施方式中，用对患病组织或细胞的外显子组测序或转录组测序来确定新表位。在另一个实施方式中，将完整的外显子组与野生型外显子组或存在于非患病组织或细胞中的外显子组进行比较，以识别新表位。在另一个实施方式中，比较选定的基因集以识别新表位。在另一个实施方式中，所述基因集是肿瘤/癌症类型特异性的、器官特异性的、感染性疾病特异性的、免疫条件特异性的或细胞功能特异性的。在另一个实施方式中，基因集包含选自以下的一种或多种基因：凋亡相关基因、生长因子相关基因、DNA错配修复相关基因、细胞周期调控相关基因和cMNR接触基因。在某些实施方式中，与呈现为野生型的基因或来自健康组织或细胞的基因进行比较。
在另一个实施方式中，在患有疾病的样品与健康样品之间比较以用于识别新表位的基因集包含本申请提到的任何一种或多种基因。在又一个实施方式中，在患有疾病的样品与健康样品之间比较以用于识别包含一个或多个新表位的无义肽的基因集包含本申请提到的任何一种或多种基因。
在一个实施方式中，无义肽中包含的一个或多个新表位由核酸序列来编码，与健康样品中存在的核酸序列相比，该核酸序列包含一个或多个核酸序列突变。在另一个实施方式中，一个或多个新表位由包含开放阅读框(基因外显子)的核酸序列来编码。在另一个实施方式中，所述突变在基因外显子中编码。在另一个实施方式中，所述新表位不包含翻译后切割位点。
在另一个实施方式中，本申请公开的突变包含一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失、重复扩增突变、一个或多个核苷酸的重复、一个或多个核苷酸的取代、移码突变以及其任何组合。在另一个实施方式中，本申请公开的新表位由包含至少一个移码突变的序列来编码。
技术人员将理解，本申请公开的核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更优选地包含RNA，最优选地包含体外转录的RNA(ΓνRNA)或合成RNA。本申请公开的核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。在另一个实施方式中，核酸可作为单链或双链和线性或共价环状闭合的分子存在。
在另一个实施方式中，核酸是分离的。技术人员将理解，术语“分离的核酸”可包括(i)例如通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增的核酸、(ii)通过克隆重组产生的核酸、(iii)例如通过裂解和通过凝胶电泳分离而纯化的核酸，或(iv)例如通过化学合成而合成的核酸。核酸可用于引入到细胞中，即细胞转染，特别是以可通过体外转录由DNA模板制备的RNA的形式。可在施用前通过稳定序列、加帽和多聚腺苷酸化来修饰RNA。
技术人员应当理解，术语“突变”可包括核酸序列中与参照序列相比的改变或差异(核苷酸取代、添加或缺失、提前终止或中止)。例如，获取自患有疾病或病症的受试者的生物样品中存在的变化或差异，其不存在于健康的非患病生物样品中。
“体细胞突变”可以发生于身体除生殖细胞(精子和卵子)之外的任何细胞，因此不会传递给子代。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病或病症。在一个实施方式中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”包括导致氨基酸变化(如翻译产物中的氨基酸取代)的突变(优选地，核苷酸取代)。
在异常或疾病样品是肿瘤或癌症组织的情况下，在一个实施方式中，突变可包含“癌症突变特征”。术语“癌症突变特征”是指当与非癌性参照细胞相比时存在于癌细胞中的突变集。包括癌前或发育异常的组织及其体细胞突变。
在一个实施方式中，当正常的密码子序列被一个或多个核苷酸的插入或缺失破坏时，如果添加或去除的核苷酸的数目不是3的倍数，则产生移码突变。例如，如果仅从序列中删除一个核苷酸，则包括突变以及突变之后的所有密码子将具有破坏的阅读框。这可能导致蛋白中许多不正确的氨基酸掺入。相比之下，如果插入或删除3个核苷酸，密码子阅读框将不会发生移位；然而，最终蛋白中会有一个额外的或一个缺失的氨基酸。因此，移码突变导致异常蛋白产物，其具有可长于或短于正常蛋白的不正确的氨基酸序列。因而，技术人员将理解，本申请公开的移码突变可包括由核酸序列(例如DNA/RNA)中的缺失或插入引起的基因突变，该突变改变了读取序列的方式或序列读取框，并且这种突变改变了自突变位点起的氨基酸序列。在一个实施方式中，包含移码突变的核酸编码自突变位点起的无义氨基酸序列。
在一个实施方式中，以健康样品为参照，在患有疾病或病症的样品中发现的核酸序列突变的数量可在约1-20、1-50、1-80、1-102、1-103、1-104或1-105的范围内。此类突变可以是移码突变、错义突变、非同义错义突变或其他类型的突变。例如，以健康样品为参照，在患有疾病或病症的样品中发现的移码突变的数量、错义突变的数量、非同义错义突变的数量或总突变的数量可在约1-20、1-50、1-80、1-102、1-103、1-104或1-105的范围内。在另一个实施方式中，以健康样品为参照，在患有疾病或病症的样品中发现的核酸突变的数量可在约1-10、10-20、20-40、40-60、60-80、80-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500、600、600-700、700-800、800-1000、1000-1500、1500、5000、5000-10000或10000-100000的范围内。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，以健康样品为参照，在患有疾病或病症的样品中发现的核酸突变的数量约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500、1000、5000、10000、50000或100000。此类突变可以是移码突变、错义突变、非同义错义突变或其他类型的突变。例如，以健康样品为参照，在患有疾病或病症的样品中发现的移码突变的数量、错义突变的数量、非同义错义突变的数量或总突变的数量可约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500、1000、5000、10000、50000或100000。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，发现的核酸突变的数量与肿瘤类型相关。在另一个实施方式中，与健康样品相比，在患有疾病或病症的样品中发现的突变数量用作检查点值，以评估发现的核酸序列突变量为真实的概率。
技术人员将理解，插入或插入突变可包括向序列添加/插入至少一个核酸所引起的核酸序列中DNA碱基数量的变化。在另一个实施方式中，插入或插入突变包括移码突变。在另一个实施方式中，由所述核酸序列编码的氨基酸序列不能正常发挥作用。在另一个实施方式中，所述氨基酸序列包含在肽或多肽中。在另一个实施方式中，所述肽或多肽包括无义肽。
技术人员将理解，插入或插入突变可包括去除序列中的至少一个核酸所引起的DNA碱基/核酸数量的变化。在另一个实施方式中，缺失去除了基因中的一个或几个碱基对。在另一个实施方式中，缺失去除了整个基因或几个相邻基因。在另一个实施方式中，缺失或缺失突变包括移码突变。在另一个实施方式中，包含缺失的核酸序列改变编码的氨基酸序列的功能。在另一个实施方式中，所述氨基酸序列包含在肽或多肽中。在另一个实施方式中，所述肽或多肽包括无义肽。
技术人员将理解，复制或复制突变可包括在核酸序列中异常复制一次或多次的至少一个核酸的复制。在另一个实施方式中，复制或复制突变包括移码突变。在另一个实施方式中，复制突变改变编码的氨基酸序列的功能。在另一个实施方式中，所述氨基酸序列包含在肽或多肽中。在另一个实施方式中，所述肽或多肽包含无义肽。
技术人员将理解，重复扩增可包括增加短序列重复次数的突变。在另一个实施方式中，重复扩增包括移码突变。在一个实施方式中，这种类型的突变导致编码的氨基酸序列不能正常发挥作用。在另一个实施方式中，所述氨基酸序列包含在肽或多肽中。在另一个实施方式中，所述肽或多肽包括无义肽。
技术人员将理解，移码突变包括当DNA碱基(核酸)的添加或缺失改变编码核酸序列阅读框(例如开放阅读框(ORF))时发生的突变。阅读框由3个碱基(密码子)组成，其中每个密码子编码一个氨基酸。在一个实施方式中，移码突变改变了这些碱基的分组并改变了编码氨基酸序列的密码子。在另一个实施方式中，得到的氨基酸序列是无功能的。在一个替代实施方式中，得到的氨基酸序列具有部分功能。在又一个实施方式中，得到的氨基酸序列具有完全功能。在另一个实施方式中，所述氨基酸序列包含肽或多肽。在另一个实施方式中，无功能或具有部分功能的肽或多肽包含无义肽。
在另一个实施方式中，移码突变包含核酸序列，所述核酸序列是剪切点的突变或中断、取消终止序列以提供核酸序列的读取或提供基因融合、向序列中插入至少一个核酸、重复或缺失或至少一种核酸，或者导致另外的翻译起始点的突变的结果。每种可能性代表本申请公开的另一个实施方式。
在一个实施方式中，移码突变在至少一个外显子的核酸序列中编码，在另一个实施方式中，移码突变在基因的最后一个外显子的核酸序列中编码，
在另一个实施方式中，移码突变编码无义蛋白。在另一个实施方式中，移码突变编码提前蛋白终止位点。在另一个实施方式中，移码突变自移码突变位点起向3’方向(编码的氨基酸序列中的C-末端方向)改变编码的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，至少一个移码突变包含多个移码突变。在另一个实施方式中，所述多个移码突变存在于相同基因中。在另一个实施方式中，所述多个移码突变不存在于相同基因中。
在另一个实施方式中，所述移码突变可以是微卫星不稳定的结果。在另一个实施方式中，所述移码突变位于微卫星不稳定编码区中。
技术人员将理解，微卫星不稳定性(MSI)可能包括某些细胞(如肿瘤细胞)的核酸序列中发生的变化，其中微卫星(短的、重复的核酸序列)的重复数不同于遗传时核酸序列中的重复数。在一个实施方式中，微卫星不稳定性包括修复DNA在细胞中复制时所犯错误的能力的缺陷。在另一个实施方式中，微卫星不稳定性包括与正常结肠DNA相比，影响肿瘤DNA中5个共有单核苷酸重复(BAT25、BAT26、NR21、NR22和NR24)中的至少两个的不稳定性。在另一个实施方式中，本申请公开的核酸序列包括存在于具有微卫星不稳定性的任何肿瘤或癌症中的核酸序列。
在另一个实施方式中，所述移码突变位于基因的最后一个外显子中。在另一个实施方式中，所述移码突变在基因的倒数第二个外显子中编码。技术人员将理解，一些具有由移码突变引起的提前终止密码子的异常mRNA不会受到无义介导的mRNA衰变(NMD)系统的降解。其他具有由移码突变引起的提前终止密码子的异常mRNA会受到无义介导的mRNA衰变(NMD)系统的降解。在一个实施方式中，选择新表位还包括选择位于最后一个外显子或倒数第二个外显子中的新表位和/或无义肽。在一个实施方式中，所述方法还包括消除衍生自移码突变的新表位和/或无义肽，所述移码突变在第一外显子内或者特定基因外显子的任何预定义上限中编码。
在另一个实施方式中，将所述移码突变与健康生物样品的源核酸序列进行比较。
在另一个实施方式中，至少一个移码突变位于基因的外显子编码区内。在另一个实施方式中，所述外显子是所述基因的最后一个外显子。
在另一个实施方式中，样品中存在的移码突变的数量在约1-5、5-10、1-10、10-20、20-30、20-40、1-20、1-40、1-60、40-60、60-80、80-100、100-150、150-200、200-400或400-1000的范围内。在另一个实施方式中，样品中存在的移码突变的数量在约103-104的范围内。在另一个实施方式中，样品中存在的移码突变的数量达约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、103、104或105。在另一个实施方式中，样品中的移码突变的数量小于约为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000，或大于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。每种可能性代表本申请公开的另一个实施方式。
在另一个实施方式中，所述新表位由在核酸序列中移码后而表达的无义肽序列产生。
技术人员将理解，术语“无义肽”包括翻译自具有移码突变的序列的肽。这种肽的至少一部分或全部由移码突变后的序列编码。等同术语包括“移码突变衍生肽”或“移码肽”。在另一个实施方式中，与健康样品肽相比，所述无义肽包含新的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述无义肽至少部分具有功能。在另一个实施方式中，所述无义肽包含具有至少一个改变的特性的蛋白。在另一个实施方式中，所述无义肽是功能肽。“有义肽”是非无义肽(即不是移码突变衍生的肽，并且不由移码突变后的任何序列编码)。
在另一个实施方式中，包含核酸序列的载体编码全长无义肽。在另一个实施方式中，所述核酸序列编码所述无义肽的至少一个片段。
在另一个实施方式中，所述无义肽包含约1-10个氨基酸、5-10个氨基酸、10-20个氨基酸、20-40个氨基酸、40-60个氨基酸、20-50个氨基酸、60-80个氨基酸、80-100个氨基酸、80-110个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、1-200个氨基酸、200-500个氨基酸、500-1000个氨基酸、1000-5000个氨基酸、5000-10000个氨基酸、1-104个氨基酸或1-105个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的另一个实施方式。
在另一个实施方式中，一个或多个无义肽中的每个的长度为约60-100个氨基酸。在另一个实施方式中，所述一个或多个无义肽中的每个的长度范围可以为非常短(例如约10个氨基酸序列)至非常长(例如超过100个氨基酸序列)。在另一个实施方式中，所述一个或多个无义肽中的每个的长度为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500或更多个氨基酸。例如，每个无义肽的长度可为约10-450、10-425、10-400、10-375、10-350、10-325、10-300、10-275、10-250、10-225、10-200、10-175、10-150、10-125、10-100、10-75、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、15-450、15-425、15-400、15-375、15-350、15-325、15-300、15-275、15-250、15-225、15-200、15-175、15-150、15-125、15-100、15-75、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30、15-25或15-20个氨基酸。在一些实施方式中，每个无义肽的长度至少为约10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
在另一个实施方式中，所述无义肽包含达约5个氨基酸、6个氨基酸、8个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸、40个氨基酸、50个氨基酸、60个氨基酸、70个氨基酸、80个氨基酸、100个氨基酸、150个氨基酸、103个、104个或105个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，每个新表位氨基酸序列的长度为约21个氨基酸或是“21聚体”新表位序列。在另一个实施方式中，一个或多个或每个新表位氨基酸序列的长度为约1-100、5-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-20、5-15或5-10个氨基酸。在又一个实施方式中，一个或多个或每个新表位氨基酸序列的长度为1-100、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-15或1-10个氨基酸。在又一个实施方式中，一个或多个或每个新表位氨基酸序列的长度为约8-11或11-16个氨基酸。
在一个实施方式中，新表位由包含一个突变的核苷酸序列编码。在另一个实施方式中，新表位由包含至少一个突变的核苷酸序列编码。在另一个实施方式中，新表位由包含多个突变的核苷酸序列编码。在另一个实施方式中，所述突变包括插入突变。在另一个实施方式中，所述突变包括缺失突变。在一个其他实施方式中，所述突变包括复制突变。在另一个实施方式中，所述突变包括重复扩增突变。在又一个实施方式中，所述突变包括移码突变。
在一个实施方式中，一个或多个新表位各包含约8至27个氨基酸、5至50个氨基酸、8至10个氨基酸或8至12个氨基酸。在另一个实施方式中，一个或多个新表位中的每个包含约21个氨基酸、8个氨基酸或27个氨基酸。在另一个实施方式中，一个或多个新表位各包含约5个氨基酸、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110或120个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，新表位包含在无义氨基酸序列的N末端、C末端或两者侧接的约5-30个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含在无义氨基酸序列的每一侧侧接约11个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含在无义氨基酸序列的每一侧侧接约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，新表位包含突变，其中约1-50个氨基酸侧接无义氨基酸序列的每一侧。
在一个实施方式中，新表位包含移码突变衍生肽的约5-30或1-50个氨基酸或由移码突变后基因序列编码的约5-30或1-50个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含移码突变衍生肽的约11个氨基酸或由移码突变后基因序列编码的约11个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含移码突变衍生肽的或由移码突变后基因序列编码的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一些实施方式中，移码突变衍生肽仅包括由移码突变下游的基因序列编码的序列。在其他实施方式中，移码突变衍生肽还包括一些由移码突变上游的基因序列编码的氨基酸(例如由移码突变上游的基因序列编码的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1-50、1-40、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸)。
对于非同义错义突变衍生肽，新表位包含例如在由错义突变编码的突变氨基酸的N末端、C末端或二者侧接的约5-30个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含在由错义突变编码的突变氨基酸的每一侧侧接的约11个氨基酸。在另一个实施方式中，新表位包含在由错义突变编码的突变氨基酸的每一侧侧接的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，新表位包含非同义错义突变衍生肽，其中约1-50个氨基酸侧接由错义突变编码的突变氨基酸的每一侧。
在另一个实施方式中，所述侧翼序列在氨基酸长度上是对称的。例如，非同义错义突变衍生肽可包含由具有错义突变的基因编码的肽，其中所述肽包含由基因编码的突变氨基酸和侧翼序列，其中所述每一侧的侧翼序列长度相等。在另一个实施方式中，每一侧的所翼序列在氨基酸长度上是不对称的。另外地或另选地，不同大小的新表位插入物长度范围为约8-27个氨基酸序列。另外地或另选地，以约5-50个氨基酸序列的长度范围插入不同大小的新表位插入物。另外地或另选地，以10-30、10-40、15-30、15-40或15-25个氨基酸的长度范围插入不同大小的新表位插入物(即编码新表位的肽)。在另一个实施方式中，每个新表位插入物的长度为1-10、10-20、20-30或30-40个氨基酸。在另一个实施方式中，所述新表位插入物的长度为1-100、5-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-20、5-15或5-10个氨基酸。在又一个实施方式中，所述新表位氨基酸序列的长度为1-100、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-15或1-10。在另一个实施方式中，每个新表位插入物的长度为约21个氨基酸或是“21聚体”新表位序列。在又一个实施方式中，所述新表位氨基酸插入物的长度约为8-11或11-16个氨基酸。
在另一个实施方式中，新表位包含与健康生物样品或野生型氨基酸序列相比全新的序列。在另一个实施方式中，所述新表位包含与健康样品中的平行序列至少部分不同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述新表位包含与健康样品中的平行序列完全不同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述新表位与来自健康样品的平行氨基酸序列之间的同一性在约0-99.999％的范围内。在另一个实施方式中，所述新表位与来自健康样品的平行氨基酸序列之间的同一性达约99％、98％、97％、96％、95％、达90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，编码新表位的核酸序列编码不受翻译后蛋白水解裂解影响的氨基酸序列。在另一个实施方式中，编码新表位的核酸序列编码受翻译后泛素化影响的氨基酸序列并会被定向至蛋白组用于降解。在另一个实施方式中，在患有疾病或病症的组织的细胞上可显示降解的蛋白部分。
技术人员将了解，术语“约”包括与指定的数字或数字范围0.0001-5％之间的偏差。在一个实施方式中，术语“约”包括与指定的数字或数字范围1-10％之间的偏差。在一个实施方式中，术语“约”包括与指定的数字或数字范围达25％的偏差。
在一个实施方式中，选择无义肽并表征其免疫原性以识别免疫原性新表位。在另一个实施方式中，选定的无义肽包含超过5、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，表征包括自无义肽产生所有可能的新表位氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述无义肽包括至少一个免疫原性新表位。在另一个实施方式中，所述无义肽包含新表位，其范围为约1个新表位、2、3、4、5、1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-500、500-103或103-104个新表位。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述无义肽包含达5个新表位、20个新表位、50个新表位、100个新表位、150个新表位、200个新表位或500个新表位。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述无义肽或其片段由基因的至少片段编码，所述基因包括本申请公开的肿瘤或癌症中突变的一种或多种候选基因。
在另一个实施方式中，所述无义肽或其片段由DNA错配修复基因的至少片段编码。在另一个实施方式中，所述无义肽由细胞周期调控相关基因的至少片段编码。在另一个实施方式中，所述无义肽由凋亡调控相关基因的至少片段编码。在另一个实施方式中，所述无义肽由血管生成相关基因的至少片段编码。在另一个实施方式中，所述无义肽由生长因子或生长因子受体相关基因的至少片段编码。在另一个实施方式中，所述无义肽由包含编码单核苷酸重复序列(cMNR)编码的基因编码。在另一个实施方式中，本申请公开比较整个外显子组以识别无义肽。在另一个实施方式中，本申请公开比较选定的基因集以识别无义肽。在另一个实施方式中，所述基因集是肿瘤/癌症类型特异性的、器官特异性的、感染性疾病特异性的，以及免疫条件特异性的或细胞功能特异性的。在另一个实施方式中，所述基因集包含选自以下的一种或多种基因：凋亡相关基因、生长因子相关基因、DNA错配修复相关基因、细胞周期调控相关基因和cMNR接触基因。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，编码一个或多个新表位的核酸序列在患有疾病或病症的生物样品中表达。在另一个实施方式中，编码一个或多个无义肽的核酸序列在患有疾病或病症的生物样品中表达。技术人员将理解，术语“表达”包括核酸序列的转录和翻译。
在一个实施方式中，所述无义肽和/或新表位在患有疾病或病症的样品细胞中高度表达。技术人员将理解，术语“高度表达”包括高于整个外显子组的中位表达水平的表达水平。在另一个实施方式中，“高度表达”包括高于在生物样品细胞中表达的基因的表达水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的表达水平。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，高表达水平包含高于一种或多种选定的基因标记的表达水平的表达水平。
在一个实施方式中，通过移码产生的无义肽或其片段被转录和翻译。
在另一个实施方式中，通过比较从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF，识别所述无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列中的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自所述患有疾病的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
在另一个实施方式中，所述比较包括比较预定义基因集的开放阅读框外显子组，其选自下组：编码已知的和预测的癌症或肿瘤抗原的核酸序列、编码肿瘤或癌症相关抗原的核酸序列、编码已知的或预测的肿瘤或癌蛋白标记物的核酸序列、编码已知的和预测的感染性疾病或病症相关基因的核酸序列、编码在所述患有疾病的生物样品中表达的基因的核酸序列、包含微卫星不稳定区的核酸序列以及其任何组合。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株包含至少一个核酸序列，其中所述核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段。免疫原性多肽可以是例如含PEST的肽。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株表达和分泌至少一个或重组多肽，所述至少一个或重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在感染所述受试者期间表达和分泌一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，每个李斯特菌菌株包含多个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段。在另一个实施方式中，每个李斯特菌菌株包含核酸序列，所述核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，使用对患病组织或细胞的外显子组测序或转录组测序来确定所述无义肽。在另一个实施方式中，所述无义肽包含编码新表位的核酸序列，所述新表位包含部分或整体获取自所述无义肽的选定的氨基酸序列。在另一个实施方式中，一个或多个无义肽包含免疫原性表位，并具有在Kyte Doolittle亲水性图上达1.6的得分。
在一个实施方式中，一个或多个新表位由源核酸序列编码，其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，本申请公开的多肽或重组多肽包含一个或多个本申请公开的免疫原性新表位。
在一个实施方式中，重组多肽包含由编码一个或多个开放阅读框的核酸构建体所编码的多肽，所述一个或多个开放阅读框编码包含至少一个新表位的一个或多个多肽。在另一个实施方式中，重组多肽包含融合多肽，所述融合多肽包含至少一个新表位和至少一个免疫原性多肽。所述免疫原性多肽可以是例如含PEST的肽。在另一个实施方式中，重组多肽包含由编码一个或多个开放阅读框的核酸构建体所编码的多肽，所述一个或多个开放阅读框编码包含至少一个新表位的一个或多个无义肽或其片段。在另一个实施方式中，重组多肽包含融合多肽，所述融合多肽包含与至少一个免疫原性多肽融合的一个或多个无义肽或其片段。
在一个实施方式中，所述源获取自患有疾病或病症的生物样品。在另一个实施方式中，本申请公开的编码所述重组多肽的核酸序列是质粒插入物。在一个实施方式中，所述核酸序列至少部分整合到基因组中。在另一个实施方式中，所述插入物包含编码所述重组多肽的第一开放阅读框。在另一个实施方式中，所述开放阅读框包含与一个或多个重组多肽融合的免疫原性多肽或其片段，所述一个或多个重组多肽包含本申请公开的一个或多个新表位。
在另一个实施方式中，所述核酸序列位于重组李斯特菌菌株中的质粒内。在另一个实施方式中，所述质粒是整合型质粒。在另一个实施方式中，所述质粒是染色体外多拷贝质粒。在另一个实施方式中，在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述李斯特菌菌株中。在另一个实施方式中，所述质粒不赋予所述重组李斯特菌抗生素抗性。
另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在重组李斯特菌基因组中的单个位置中包含核酸分子，所述核酸分子包含一个或多个新表位。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在所述李斯特菌基因组中的多个位置中包含核酸分子，所述核酸分子包含一个或多个新表位。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在一个质粒中包含至少一个核酸分子，所述至少一个核酸分子包含一个或多个新表位。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在至少两个不同质粒中包含新表位，其中在所述重组李斯特菌菌株中平行包含所述两个不同质粒。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在多个不同质粒中包含新表位，其中在所述重组李斯特菌菌株中平行包含所述多个不同质粒。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株在所述李斯特菌基因组中的一个或多个位置中和在一个或多个不同质粒中包含新表位。其中在各处的新表位可以是相同的或是不同的。
在另一个实施方式中，每个李斯特菌表达一个或多个重组多肽，每个所述重组多肽包含约1-20个新表位。
在另一个实施方式中，确定每个核酸序列中的构建体相对于突变负荷的数目，以确定新表位的表达和分泌效率。在另一个实施方式中，确定每个重组多肽的新表位的量，以确定分子的最佳三维折叠，以便提供新表位向T细胞受体的呈递。在另一个实施方式中，从每个重组多肽或核酸序列的约2、5、10、20、50、100个表位开始，测试了线性新表位的范围。在另一个实施方式中，从每个重组多肽或核酸序列的约1-5、5-10、10-20、20-50、50-70、70-90、90-110、110-150、150-200、200-250、300-350或400-500个表位开始，测试了线性新表位的范围。每种可能性代表一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，通过考虑来自单个分子的多个表位的翻译和/或分泌的效率，和/或参考新表位的数量来确定每个重组多肽的新表位数量或编码重组多肽的核酸序列的待用数量。
在另一个实施方式中，所述重组多肽包含一个新表位。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含至少一个新表位、两个新表位、3个新表位、4个新表位、5个新表位、6个新表位、7个新表位、8个新表位、9个新表位、10个或更多个新表位。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含约11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90或100个新表位。在另一个实施方式中，本申请公开的重组多肽包含约40个新表位、50个新表位、1-10个新表位、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80或1-100个新表位。
在一个实施方式中，所述重组多肽包含至少一个无义肽或其片段。在一个实施方式中，所述核酸序列编码至少一个无义肽或其片段。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含至少两个不同的新表位氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含新表位重复序列的一个或多个相同氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述重组多肽包含多个无义肽或其片段。在一个实施方式中，所述核酸序列编码多个无义肽或其片段。
在一个实施方式中，所述重组多肽包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个无义肽或其片段。在一个实施方式中，所述重组多肽包含的一个或多个无义肽或其片段的范围在约1-5、1-10、1-20、1-50、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200或200-500个。在一个实施方式中，所述重组多肽包含达约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个无义肽或其片段。每种可能性代表一个独立实施方式。
在一个实施方式中，所述核酸序列编码约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，所述核酸序列编码的一个或多个无义肽或其片段的范围在约1-5、1-10、1-20、1-50、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200或200-500个。在另一个实施方式中，所述核酸序列编码达约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个无义肽或其片段。在另一个实施方式中，所述核酸序列编码超过约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个无义肽或其片段。每种可能性代表一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述重组多肽包含免疫原性多肽。所述免疫原性多肽可以是例如含PEST的肽。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含至少一个免疫原性多肽。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含多个免疫原性多肽。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个免疫原性多肽。
在另一个实施方式中，包含一个或多个无义肽的重组多肽融合多肽中的每个与免疫原性多肽融合。例如，所述一个或多个肽中的每个可与不同的免疫原性多肽或其片段融合，或所述一个或多个肽的组合可与免疫原性多肽或其片段融合(例如免疫原性多肽与第一新表位连接，所述第一新表位与第二新表位连接，所述第二新表位与第三新表位连接，以此类推)。在另一个实施方式中，多个无义肽与至少一个免疫原性多肽融合。例如，所述一个或多个无义肽可彼此串联连接或融合，其中N末端或C末端无义肽与所述免疫原性多肽连接或融合。在另一个实施方式中，一个无义肽与免疫原性多肽融合。在另一个实施方式中，至少一个或多个无义肽与至少一个免疫原性多肽融合。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含一种或多种肽，所述一种或多种肽包含一个或多个免疫原性无义肽，所述一个或多个免疫原性无义肽与免疫原性多肽或其片段可操作地融合。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽从N末端到C末端可操作地连接，其中所述免疫原性多肽与所述一个或多个无义肽中的一个融合。在另一个实施方式中，所述免疫原性多肽与N末端的无义肽可操作地连接。在另一个实施方式中，所述接头是肽键。在另一个实施方式中，所述重组多肽包含一个或多个新表位或其片段，所述一个或多个新表位或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。
在另一个实施方式中，包含一个或多个无义肽或其片段的重组多肽从N末端到C末端包含多个可操作连接的无义肽或其片段，其中所述免疫原性多肽与所述多个无义肽或其片段中的一个融合。在另一个实施方式中，所述免疫原性多肽与所述N末端无义肽可操作地连接。在另一个实施方式中，所述接头是肽键。
在另一个实施方式中，所述重组多肽包含一个或多个无义肽，每个无义肽与在相同载体上编码的下一个无义肽经接头序列连接。在另一个实施方式中，所述接头是4X甘氨酸DNA序列。在另一个实施方式中，所述接头是聚甘氨酸。技术人员将理解，本领域已知的其他接头序列可用于本申请公开的方法和组合物中(参见例如Reddy Chichili,V.P.、Kumar,V.和Sivaraman,J.(2013)，Linkers in the structural biology of protein–proteininteractions.Protein Science,22:153–167，其通过引用整体并入本申请)。在又一个实施方式中，所述接头选自下组：SEQ ID NO:46-56或其任何组合。
在另一个实施方式中，不同的接头序列分布在所述无义肽之间，以使得重复序列最小化。在另一个实施方式中，在无义肽之间分布不同的接头序列减少了二级结构，从而实现了质粒的有效转录、翻译、分泌、维持或稳定化，所述质粒包含Lm重组载体菌株群中的插入物。
在另一个实施方式中，编码包含一个或多个无义肽的一个或多个重组多肽的核酸序列包含一个或多个接头序列，所述接头序列在至少一个第一无义肽或其片段与至少一个第二无义肽或其片段之间掺入。在另一个实施方式中，所述核酸序列包含至少两个不同的接头序列，所述至少两个不同的接头序列在至少一个第一无义肽或其片段与至少一个第二无义肽或其片段到至少一个第三无义肽或其片段之间掺入。
在另一个实施方式中，一个或多个接头选自下组：如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白、ActA-PEST2融合蛋白或PEST氨基酸序列。所述免疫原性多肽可包含例如含PEST的肽。
在另一个实施方式中，所述ActA-PEST2融合蛋白如SEQ ID NO:17所示。在另一个实施方式中，所述tLLO蛋白如SEQ ID NO:4所示。在另一个实施方式中，所述ActA如SEQ IDNO:12-18和20-21中的任何一个所示。在另一个实施方式中，所述PEST氨基酸序列选自如SEQ ID NO:6-11所示的序列。
在另一个实施方式中，所述突变的LLO包含胆固醇结合结构域(CBD)中的突变。在另一个实施方式中，所述突变包含SEQ ID NO:3中的残基C484、W491或W492或其任何组合的取代。
在另一个实施方式中，由核酸序列编码的最终新表位或最终非无义肽与后接终止密码子的标签序列融合。技术人员将理解，标签可在例如从Lm载体分泌期间或当测试构建体对特定T细胞的亲和力或抗原呈递细胞的呈递时，使融合多肽或嵌合蛋白易于检测。
在另一个实施方式中，一个或多个重组多肽与C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。在另一个实施方式中，所述接头序列编码4X甘氨酸接头。在另一个实施方式中，所述接头如本申请所述。
在另一个实施方式中，所述标签序列是使得新表位或无义肽易于检测的氨基酸或核酸序列。在另一个实施方式中，所述标签序列是用于确认本申请公开的新表位或无义肽的分泌的氨基酸或核酸序列。技术人员将理解，所述标签的序列可掺入质粒或噬菌体载体上的融合肽序列中。可表达这些标签并呈现抗原表位，以使临床医师能够通过跟踪对这些“标签”序列肽的免疫应答来跟踪分泌的重组多肽或无义肽的免疫原性。可使用许多试剂来监测这种免疫应答，所述试剂包括但不限于特异性针对这些标签的单克隆抗体和DNA或RNA探针。
在另一个实施方式中，所述标签选自下组：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签、聚组氨酸标签以及其任何组合。在另一个实施方式中，所述标签可以是C末端SIINFEKL-S-6xHIS标签。在另一个实施方式中，本申请公开的重组多肽包含任何本领域已知的其他标签，包括但不限于几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。在一个实施方式中，所述标签选自下组：6X组氨酸标签、2x FLAG标签、3x FLAG标签、SIINFEKL肽、与SIINFEKL肽可操作地连接的6X组氨酸标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的3X FLAG标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的2X FLAG标签以及其任何组合。两个或更多个标签可一起使用，如2xFLAG标签和SIINFEKL标签、3xFLAG标签和SIINFEKL标签，或6x组氨酸标签和SIINFEKL标签。如果使用两个或更多个标签，其可以以任何顺序位于重组多肽中的任何位置。例如，两个标签可位于所述重组多肽的C末端、两个标签可位于所述重组多肽的N末端、两个标签可位于所述重组多肽的内部、一个标签可位于所述重组多肽的C末端而另一个标签位于所述重组多肽的N末端、一个标签可位于所述重组多肽的C末端而另一个位于所述重组多肽的内部，或者一个标签可位于所述重组多肽的N末端而另一个位于所述重组多肽的内部。
在另一个实施方式中，本申请公开的核酸序列编码本领域已知的任何其他标签，包括但不限于几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、多组氨酸标签、SIINFEKL-S-6xHIS标签、6X组氨酸标签、SIINFEKL肽和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。
在另一个实施方式中，所述核酸序列包含至少一个序列，所述至少一个序列编码与被编码的无义肽融合的标签。在另一个实施方式中，所述标签包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，编码一个或多个重组多肽的所述核酸序列包含编码所述标签的序列后的2个终止密码子。
在另一个实施方式中，编码一个或多个重组多肽的核酸序列编码以下组分：phly-tLLO-[无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述无义肽或其片段的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。在另一个相关方面，所述无义肽或其片段可以是任何n表示的相同或不同的序列。
在另一个实施方式中，编码一个或多个重组多肽的核酸序列编码以下组分：phly-tLLO-[新表位-甘氨酸接头(4x)-新表位-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述新表位的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。在另一个实施方式中，所述新表位可以是任何n表示的相同或不同的序列。
在另一个实施方式中，编码所述重组多肽的核酸序列编码以下组分：phly-tLLO-[新表位/无义肽-甘氨酸接头(4x)-新表位/无义肽-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述新表位/无义肽的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。在另一个实施方式中，所述新表位/无义肽可以是任何n表示的相同或不同的序列。
在另一个实施方式中，n表示任何整数。在另一个实施方式中，n表示约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在另一个实施方式中，1≤n≤5、1≤n≤10、1≤n≤20、1≤n≤30、1≤n≤40、1≤n≤50、1≤n≤60、1≤n≤70、1≤n≤80、1≤n≤90、1≤n≤100、1≤n≤200、1≤n≤300、1≤n≤400、1≤n≤500、n<5、n<10、n<20、n<30、n<40、n<50、n<60、n<70、n<80、n<90、n<100、n<200、n<300、n<400、n<500、n>5、n>10、n>20、n>30、n>40、n>50、n>60、n>70、n>80、n>90、n>100、n>200、n>300、n>400或n>500。每种可能性代表一个独立实施方式。
在一个实施方式中，本申请公开了一种编码重组多肽的核酸构建体，所述重组多肽包含以下元素：与第一新表位氨基酸序列融合的含PEST的肽(例如移码突变衍生肽)，其中所述第一新表位序列与第二新表位氨基酸序列可操作地连接(例如直接融合或通过接头序列连接)，其中所述第二新表位序列与至少一个其他新表位氨基酸序列可操作地连接(例如直接融合或通过接头序列连接)。任选地，含PEST的肽是N-末端截短的LLO(tLLO)。任选地，最后的新表位在C末端处与标签(例如3xFLAG标签、2xFLAG标签、与SIINFEKL肽组合的3xFLAG标签或与SIINFEKL肽组合的2xFLAG标签)可操作地连接(例如直接融合或通过接头序列)。任选地，所述核酸构建体包含编码C末端的序列后(例如在编码标签的序列后)的至少1个终止密码子(例如2个终止密码子)。在另一个实施方式中，编码重组多肽的至少一个核酸序列构建体包含以下元素：与第一无义肽氨基酸序列融合的N末端截短的LLO(tLLO)，其中所述第一无义肽氨基酸序列通过接头序列与第二无义肽氨基酸序列可操作地连接，其中所述第二无义肽氨基酸序列通过接头序列与至少一个另外的无义肽氨基酸序列可操作地连接，并且其中最后的无义肽在C末端处通过接头序列与组氨酸标签可操作地连接。在另一个实施方式中，所述元素从N末端到C末端排列或可操作地连接。在另一个实施方式中，每个核酸构建体包含编码所述6X组氨酸(HIS)标签的序列后的至少1个终止密码子。在另一个实施方式中，每个核酸构建体包含编码所述6X组氨酸(HIS)标签的序列后的2个终止密码子。在另一个实施方式中，所述6X组氨酸标签在N末端与SIINFEKL肽可操作地连接。在另一个实施方式中，所述接头是4X甘氨酸接头。技术人员应当理解，本申请公开的构建体可包含无义肽或其片段，所述无义肽或其片段包含新表位。在另一个实施方式中，本申请公开的构建体包含由新表位组成的无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，至少一个核酸序列构建体编码重组多肽，所述重组多肽包含与无义肽的21个氨基酸序列融合的N末端截短的LLO，其侧接接头序列，之后是至少一个第二新表位，其侧接另一个接头序列，并且由SIINFEKL-6X组氨酸标签-和封闭开放阅读框的2个终止密码子终止：pHly-tLLO-21聚体#1-4x甘氨酸接头G1-21聚体#2-4x甘氨酸接头G2-...-SIINFEKL-6x组氨酸标记-2x终止密码子。在另一个实施方式中，上述构建体的表达由hly启动子驱动。
技术人员应当理解，术语“异常的”、“患病的”或“不健康生物样品”包括并且可与“患有疾病的生物样品”、“患有疾病的样品”或“患有疾病或病症的生物样品”互换使用。在一个实施方式中，生物样品是组织、细胞、血液、血清、任何获取自包含淋巴细胞的受试者的样品、任何获取自包含患病细胞的受试者的样品，或任何获取自健康受试者但与获取自相同受试者或类似个体的患有疾病的样品相当的样品。在另一个实施方式中，所述生物样品包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
在一个实施方式中，异常或不健康生物样品包含肿瘤组织或癌组织或其一部分。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症可以是实体肿瘤。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症不是实体肿瘤或癌症，例如血癌或其中不形成肿瘤的乳腺癌。在另一个实施方式中，所述肿瘤或癌症是液体肿瘤或癌症。
在另一个实施方式中，肿瘤样品涉及任何样品，如衍生自含有或预期含有肿瘤或癌细胞的患者的身体样品。身体样品可以是任何组织样品，如血液、获取自原发肿瘤或肿瘤转移的组织样品或含有肿瘤或癌细胞的任何其他样品。在又一个实施方式中，身体样品是血液、来自唾液的细胞或来自脑脊液的细胞。在另一个实施方式中，肿瘤样品涉及一个或多个分离的肿瘤或癌细胞，如循环肿瘤细胞(CTC)或含有一个或多个分离的肿瘤或癌细胞(如循环肿瘤细胞(CTC))的样品。
在另一个实施方式中，通过施用本申请公开的组合物、疫苗、免疫疗法或方法治疗的肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括宫颈癌或肿瘤。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括含Her2的肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括黑色素瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括胰腺肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括卵巢肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括胃肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括胰腺的癌性病变。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括肺腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括多形性胶质母细胞瘤肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括结肠直肠腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括肺鳞状腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括胃腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括口腔鳞状细胞癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括非小细胞肺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括子宫内膜癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括膀胱肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括头颈肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括前列腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括胃腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括口咽肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括肺肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括肛门肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括结肠直肠肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括食道肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，肿瘤或癌症包括间皮瘤肿瘤或癌症。其他合适类型的肿瘤或癌症包括黑色素瘤、肺癌(例如肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌)、膀胱癌、胃癌(胃癌)、食道癌(例如食道腺癌)、结肠直肠癌、子宫癌(子宫内膜癌或子宫癌)、头颈癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、肾细胞癌(肾细胞癌，如乳头状肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌和嫌色细胞肾细胞癌)、多发性骨髓瘤、胰腺癌、乳腺癌、低级别胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌、神经母细胞瘤、类癌瘤、成神经管细胞瘤、急性髓性白血病、甲状腺癌、急性淋巴细胞白血病、尤文肉瘤或横纹肌样瘤。类似地，肿瘤或癌症可以是胰腺癌(例如胰腺腺癌)、前列腺癌(例如前列腺腺癌)、乳腺癌(例如乳腺浸润癌)、卵巢癌(例如卵巢浆液性囊腺癌)或甲状腺癌(例如甲状腺癌)。其他类型的肿瘤或癌症也是可能的。在一些示例中，所述肿瘤是具有少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样品中)的非同义错义突变的肿瘤，或所述癌症是下述类型的癌症，在该类型的癌症中，不同患者中肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样本中的)非同义错义突变的平均数或中位数少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个，或者所述癌症使患有该类型癌症的患者中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％具有含少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个肿瘤相关或肿瘤特异性(即不存在于健康生物样本中的)非同义错义突变的肿瘤。
在另一个实施方式中，所述患有疾病的生物样品获取自一个显示疾病或病症的位置。在另一个实施方式中，所述患有疾病的生物样品获取自显示疾病或病症的两个不同位置。在另一个实施方式中，所述患有疾病的生物样品获取自显示疾病或病症的范围为约2-5个的不同位置，或显示患有疾病或病症的组织的约2-10个的不同位置。在另一个实施方式中，个患有疾病的生物样品获取自至少一个原发性肿瘤，并且至少第二样品获取自转移。在另一个实施方式中，患有疾病的生物样品获取自原发性肿瘤。在另一个实施方式中，患有疾病的生物样品获取自转移。在另一个实施方式中，一个患有疾病的生物样品获取自至少一个转移，并且至少一个第二样品获取自不同的转移。在另一个实施方式中，至少一个患有疾病的生物样品获取自至少一个患有疾病或病症的组织，并且至少一个第二样品获取自血液或血清。
在另一个实施方式中，异常或不健康生物样品包含非肿瘤或非癌性组织。在另一个实施方式中，异常或不健康生物样品包含从血液样品中分离的细胞、来自唾液的细胞或来自脑脊髓液的细胞。在另一个实施方式中，异常或不健康生物样品包含被认为是异常或不健康的任何组织或其部分的样品。
在一个实施方式中，包含感染性疾病的其他非肿瘤或非患癌疾病包含在本申请公开中，根据本申请公开的方法，可从该感染性疾病获取患有疾病的生物样品用于分析。在另一个实施方式中，感染性疾病包括病毒感染。在另一个实施方式中，感染性疾病包括慢性病毒感染。在另一个实施方式中，感染性疾病包括慢性病毒疾病，如HIV。在另一个实施方式中，感染性疾病包括细菌感染。在另一个实施方式中，所述感染性疾病是寄生虫感染。
在一个实施方式中，病原性原生动物和寄生虫感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)；巴贝虫病；贾第虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫或吸虫；和绦虫感染。
在另一个实施方式中，所述感染性疾病是牲畜感染性疾病。在另一个实施方式中，牲畜疾病可传播给人，并被称作“人畜共患病”。在另一个实施方式中，这些疾病包括但不限于口蹄疫、西尼罗病毒、狂犬病、犬细小病毒、猫白血病病毒、马流感病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)、伪狂犬病、古典猪瘟(CSF)、由牛1型牛疱疹病毒(BHV-1)感染牛造成的IBR以及猪伪狂犬病(奥尔斯基病)、弓形虫病、炭疽、水疱性口炎病毒、马红球菌、土拉菌病、鼠疫(鼠疫耶尔森氏菌)、毛滴虫等。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，其他非肿瘤或非癌性疾病包括自身免疫疾病，从该自身免疫疾病可获得患有疾病的生物样品用于分析。技术人员应当理解，术语“自身免疫疾病”包括由针对个体自身组织、器官的免疫反应产生的疾病或病症或该免疫反应的表现形式或者由该表现形式引起的病症。技术人员应当理解，术语“自身免疫疾病”包括癌症和其他疾病状态，其中针对自身组织的抗体不一定参与疾病病症但在诊断中仍然是重要的。另外，在一个实施方式中，自身免疫疾病包含由抗体的B细胞产生与正常身体组织和抗原反应的自身抗体引起或由此加重的病症。在其他实施方式中，自身免疫疾病包括涉及分泌对来自自身抗原(例如核抗原)的表位具有特异性的自身抗体的一种疾病。
生物样品可使用本领域熟知的常规活检程序获得。活检可包括由专业医学人员(例如病理学家)从受试者中取出细胞或组织。存在许多不同类型的活检程序。最常见的类型包括：(1)切取活检，其中仅取出组织样品；(2)切除活检，其中取出整个肿块或疑似区域；以及(3)针刺活检，其中用针取出组织或流体样品。当使用宽针时，程序称为组织芯活检。当使用薄针时，程序称为细针抽吸活检。
在一个实施方式中，本申请公开的生物样品通过切取活检获得。在另一个实施方式中，生物样品通过切除活检获得。在另一个实施方式中，生物样品使用针刺活检获得。在另一个实施方式中，针活检是组织芯活检。在另一个实施方式中，活检是细针抽吸活检。在另一个实施方式中，生物样品作为血液样品的一部分获得。在另一个实施方式中，生物样品作为脸颊拭子的一部分获得。在另一个实施方式中，生物样品作为唾液取样的一部分获得。在另一个实施方式中，生物样品包括所有或部分组织活检。在另一个实施方式中，获得组织活检物并且收集来自该组织样品的细胞，其中这些细胞构成本申请公开的生物样品。在另一个实施方式中，本申请公开的生物样品作为细胞活检物的一部分获得。在另一个实施方式中，多种活检物可取自相同受试者。在另一个实施方式中，来自相同受试者的活检物可从相同组织或细胞中收集。在另一个实施方式中，来自相同受试者的活检物可从受试者内的细胞来源的不同组织中收集。
在一个实施方式中，活检物包括骨髓组织。在另一个实施方式中，活检物包括血液样品。在另一个实施方式中，活检物包括胃肠组织的活检物，例如食道、胃、十二指肠、直肠、结肠和末端回肠。在另一个实施方式中，活检物包括肺组织。在另一个实施方式中，活检物包括前列腺组织。在另一个实施方式中，活检物包括肝组织。在另一个实施方式中，活检物包括神经系统组织，例如脑活检物、神经活检物或脑膜活检物。在另一个实施方式中，活检物包括泌尿生殖器组织，例如肾活检物、子宫内膜活检物或子宫颈锥切术。在另一个实施方式中，活检物包括乳腺活检物。在另一个实施方式中，活检物包括淋巴结活检物。在另一个实施方式中，活检物包括肌肉活检物。在又一个实施方式中，活检物包括皮肤活检物。在另一个实施方式中，活检物包括骨骼活检物。在另一个实施方式中，检查每种样品的患有疾病样品病理学以确认对患病组织的诊断。在另一个实施方式中，检查健康样品以确认对健康组织的诊断。
在一个实施方式中，正常或健康的生物样品获取自受试者。在另一个实施方式中，正常或健康的生物样品是与来源于受试者的任何样品(如身体样品)相关的非致瘤样品，。该样品可以是获取自本申请公开的生物样品的任何组织样品，如健康细胞。在另一个实施方式中，正常或健康的生物样品获取自另一个体，在另一个实施方式中，该个体是相关个体。在另一个实施方式中，另一个体是与受试者相同的物种。在另一个实施方式中，另一个体是不含有或不预期含有患有疾病的生物样品的健康个体。在另一个实施方式中，另一个体是不含有或不预期含有肿瘤或癌症细胞的健康个体。技术人员将理解，健康个体可使用本领域已知的方法对疾病的存在进行筛选，以确定他或她是健康的。患有疾病的生物样品和健康生物样品均可获取自相同组织(例如含有肿瘤组织和周围正常组织的组织切片)。优选地，健康生物样品基本上或完全由正常的健康细胞组成，并且可用于与患有疾病的生物样品(例如被认为包含癌细胞或特定类型的癌细胞的样品)进行比较。优选地，这些样品属于相同类型(例如二者均是血液或二者均是血清)。例如，如果患有疾病的生物样品包含细胞，则优选地，健康生物样品中的细胞与患有疾病的生物样品中的患病细胞具有相同的组织来源(例如肺或脑)并且由相同细胞类型(例如神经元、上皮、间充质、造血)产生。
在另一个实施方式中，正常或健康的生物样品与患有疾病的生物样品同时获得。技术人员将理解，术语“正常或健康的生物样品”包含术语“参照样品”或“参照组织”，并且可在全文中互换使用，其全部具有所有相同的含义和性质。在另一个实施方式中，参照样品用于关联并比较从肿瘤样本中获得的结果。在另一个实施方式中，参照样品凭经验通过测试足够大数量的来自相同物种的正常样本来确定。在另一个实施方式中，正常或健康的生物样品在不同时间获得，其中所述时间可使得正常或健康的样品在获得异常或不健康样品之前或之后获得。获得方法包括本领域常规用于活检物或血液采集的方法。在另一个实施方式中，样品是冷冻样品。在另一个实施方式中，样品作为组织石蜡包埋(FFPE)组织块被包括。
在另一个实施方式中，所述患有疾病的生物样品获取自患有疾病或病症的受试者。在另一个实施方式中，所述健康生物样品获取自患有疾病或病症的受试者。
在一个实施方式中，在获得正常或健康的生物样品后，处理所述样品以用于使用本领域熟知的技术和方法提取核酸。在另一个实施方式中，所提取的核酸包括DNA。在另一个实施方式中，所提取的核酸包括RNA。在另一个实施方式中，RNA是mRNA。在另一个实施方式中，制备下一代测序(NGS)文库。可构建下一代测序文库并且可经历外显子组或靶向基因捕获。在另一个实施方式中，使用本领域已知的技术制备cDNA表达文库，参见例如US20140141992，其全文并入本申请。
II.重组李斯特菌菌株
本申请提供了重组李斯特菌菌株(例如单核细胞增多性李斯特菌)，用作个性化免疫疗法递送载体。例如，该重组李斯特菌菌株可包含核酸，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个移码突变衍生肽，所述移码突变衍生肽包含一个或多个免疫原性新表位。这种重组李斯特菌菌株可表达和分泌所述重组多肽。这些元素中的每一个的不同可能性如本申请的其他地方关于免疫疗法递送载体所述。
在一些这样的重组李斯特菌菌株中，所述编码重组多肽的开放阅读框被整合到李斯特菌基因组中。另选地，编码所述重组多肽的开放阅读框位于质粒中。例如，在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述重组李斯特菌菌株中。还可能存在包含两个这样的开放阅读框的重组李斯特菌菌株：一个的基因组被整合到李斯特菌基因组中，而另一个位于质粒中。所述两个开放阅读框可以是相同的(即编码相同的重组多肽)或是不同的(即编码两个不同的重组多肽)。
所述重组李斯特菌菌株可以是减毒李斯特菌菌株。例如，其可包含一个或多个内源性基因的突变。所述突变可选自例如actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dat基因双突变、dal/dat/actA基因三突变或其组合。所述突变可包含例如基因的失活、截短、缺失、置换或破坏。
在一些这样的重组李斯特菌菌株中，包含编码所述重组多肽的开放阅读框的核酸还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。同样，所述重组李斯特菌菌株还可包含第二核酸，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。例如，所述代谢酶可以是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
具体地，例如，所述重组李斯特菌菌株可以是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株，其包含actA、dal和dat中的缺失或失活突变，其中包含编码所述重组多肽的开放阅读框的核酸在游离型质粒中，并包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且其中所述含PEST的肽是LLO的N-末端片段。
在一个实施方式中，本申请公开了一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株包含至少一个核酸序列，所述核酸序列包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含截短的李斯特菌溶血素O(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或与包含一个或多个新表位的一个或多个无义肽融合的PEST氨基酸序列。技术人员将理解，本申请公开的包含一个或多个新表位的一个或多个无义肽可以是以免疫原性开始，并且其免疫原性可通过与免疫原性多肽(如tLLO、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列)融合或混合来增强。这种免疫原性多肽可以是例如含PEST的肽。
在一个实施方式中，截短的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白包含推定的PEST序列。在一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含含PEST的氨基酸序列。在一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含推定的含PEST氨基酸的序列。
在一个实施方式中，PEST氨基酸(AA)序列包含截短的LLO序列。在另一个实施方式中，所述PEST氨基酸序列包含KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:2)。在另一个实施方式中，将抗原与来自李斯特菌的其他LM PEST AA序列融合也将增强无义肽的免疫原性。在另一个实施方式中，将新表位与来自李斯特菌的其他LM PEST AA序列融合也将增强新表位的免疫原性。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的N末端LLO蛋白片段包含SEQID NO:4。在另一个实施方式中，所述片段包含LLO信号肽。在另一个实施方式中，所述片段包含SEQ ID NO:4。在另一个实施方式中，所述片段近似由SEQ ID NO:4组成。在另一个实施方式中，所述片段基本由SEQ ID NO:4组成。在另一个实施方式中，所述片段对应于SEQ IDNO:4。在另一个实施方式中，所述片段与SEQ ID NO:4同源。在另一个实施方式中，所述片段与SEQ ID NO:4的片段同源。在一个实施方式中，所用的截短的LLO去除了信号序列。在另一个实施方式中，所述截短的LLO包含信号序列。本领域技术人员清楚的是，任何不具有活化结构域，特别是不具有半胱氨酸484的截短的LLO适于本申请公开的方法和组合物。在另一个实施方式中，异源抗原与任何包含PEST AA序列(SEQ ID NO:2)的截短的LLO的融合增强了所述抗原的细胞介导的免疫力和抗肿瘤免疫力。在另一个实施方式中，无义肽与任何包含PEST AA序列(SEQ ID NO:2)的截短的LLO的融合增强了所述无义肽的细胞介导的免疫力和抗肿瘤免疫力。
在另一个实施方式中，用于构建本申请公开的重组多肽的LLO蛋白具有如SEQ IDNO:3所示的序列(GenBank登录号P13128；核酸序列如GenBank登录号X15127所示)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA是信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切割下来。因此，在该实施方式中，全长活性LLO蛋白长度为504个残基。在另一个实施方式中，上述LLO片段用作并入本申请公开的重组多肽或疫苗中的LLO片段的来源。
在另一个实施方式中，本申请公开的组合物和方法中使用的LLO蛋白的N-末端片段具有如SEQ ID NO:4所示的序列。
在另一个实施方式中，所述LLO片段对应于本申请中使用的LLO蛋白的大约AA 20-442。
在另一个实施方式中，所述LLO片段具有如SEQ ID NO:5所示的序列。
技术人员将理解，术语“N-末端截短的LLO蛋白”、“N-末端LLO片段”、“截短的LLO蛋白”、“ΔLLO”或其语法等同物在本申请中可互换使用，并且包含非溶血性LLO的片段。在另一个实施方式中，这些术语包含LLO片段，其包含推定的PEST序列。
在另一个实施方式中，通过活化结构域的缺失或突变使所述LLO片段变为非溶血性的。在另一个实施方式中，通过包含半胱氨酸484的区域的缺失或突变使所述LLO片段变为非溶血性的。在另一个实施方式中，通过胆固醇结合结构域(CBD)的缺失或突变使LLO变为非溶血性，如美国专利号8,771,702中所详述，该专利通过引用并入本申请。
在一个实施方式中，本申请公开的重组蛋白或多肽包含李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白，其中所述LLO蛋白包含所述LLO蛋白的胆固醇结合结构域(CBD)的残基C484、W491、W492或其组合的突变。在一个实施方式中，所述C484、W491和W492残基是如SEQ ID NO:3所示的残基C484、W491和W492，而在另一个实施方式中，如本领域技术人员已知的，其为可使用序列比对推导的对应残基。在一个实施方式中，残基C484、W491和W492发生突变。在一个实施方式中，突变为取代，在另一个实施方式中，突变为缺失。在一个实施方式中，整个CBD发生突变，而在另一个实施方式中，CBD的部分发生突变，而在另一个实施方式中，只有CBD中的特定残基发生突变。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的LLO片段的长度包含至少484个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过484个AA。在另一个实施方式中，所述长度为至少489个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过489。在另一个实施方式中，所述长度为至少493个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过493。在另一个实施方式中，所述长度为至少500个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过500。在另一个实施方式中，所述长度为至少505个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过505。在另一个实施方式中，所述长度为至少510个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过510。在另一个实施方式中，所述长度为至少515个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过515。在另一个实施方式中，所述长度为至少520个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过520。在另一个实施方式中，所述长度为至少525个AA。在另一个实施方式中，所述长度超过520。指代本申请LLO片段长度时包含了信号序列。因此，CBD中第一个半胱氨酸的编号为484，AA残基的总数为529。
本领域技术人员将了解，术语“融合肽”、“融合多肽”、“重组多肽”、“嵌合蛋白”或“重组蛋白”包含肽或多肽，所述肽或多肽包含通过肽键或其他化学键连接在一起的两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个蛋白。在另一个实施方式中，所述蛋白通过肽键或其他化学键直接连接在一起。在另一个实施方式中，所述蛋白与两个或更多个蛋白之间的一个或多个AA(例如“间隔区”)连接在一起。
在另一个实施方式中，截短的LLO片段包含LLO蛋白的前441个AA。在另一个实施方式中，所述LLO片段包含LLO的前420个AA。在另一个实施方式中，所述LLO片段为野生型LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-25组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-50组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-75组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-100组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-125组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-150组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1175组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-200组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-225组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-250组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-275组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-300组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-325组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-350组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-375组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-400组成。在另一个实施方式中，所述LLO片段由大约残基1-425组成。
在另一个实施方式中，所述LLO片段含有对应于上述AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。在另一个实施方式中，残基编号不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果所述同源LLO蛋白相对于本申请使用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可相应地调整残基编号。在另一个实施方式中，所述LLO片段是本领域已知的任何其他LLO片段。
识别同源蛋白的对应残基的方法是本领域熟知的，并且包括例如序列比对。在一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于70％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于72％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于75％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于78％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于80％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于82％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于83％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于85％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于87％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于88％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于90％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于92％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于93％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于95％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于96％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于97％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于98％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的大于99％的LLO序列。在另一个实施方式中，同源LLO包含本申请公开的100％的LLO序列。
技术人员应当理解，术语“PEST氨基酸序列”、“PEST序列”、“PEST序列肽”、“PEST肽”或“含PEST序列的蛋白或肽”可互换使用，并可包含截短的LLO蛋白，所述截短的LLO蛋白在一个实施方式中是N末端LLO，或在另一个实施方式中是截短的ActA蛋白。PEST序列肽是本领域已知的，并描述于美国专利号7,635,479和美国专利公开号2014/0186387中，两者均整体并入本申请。
在另一个实施方式中，原核生物的PEST序列可根据如Rechsteiner和Roberts(TBS21：267-271,1996)针对单核细胞增多性李斯特菌所述的方法，以常规方式识别。另选地，来自其他原核生物的PEST氨基酸序列也可通过这一方法识别。可预期其中包含PEST氨基酸序列的其他原核生物体包括但不限于其他李斯特菌菌种。例如，单核细胞增多性李斯特菌蛋白ActA含有四个这样的序列。这些序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:6)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:7)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:8)和RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:9)。来自链球菌菌种的链球菌溶血素O也包含PEST序列。例如，酿脓链球菌链球菌溶血素O包含在氨基酸35-51处的PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)，并且类马链球菌链球菌溶血素O包含在氨基酸38-54处的PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:11)。另外，据信PEST序列可嵌入抗原蛋白内。技术人员将理解，如本申请所公开，当涉及PEST序列融合时，术语“融合”包括抗原蛋白，其既包含抗原(例如无义肽)也包含连在抗原一端或嵌入抗原内的PEST氨基酸序列。在其他实施方式中，PEST序列或含有PEST的多肽不是融合蛋白的一部分，所述多肽也不包含异源抗原。
技术人员将理解，术语“核酸序列”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“核酸构建体”在本申请中可互换使用，并且可以包含DNA或RNA分子，其可包括但不限于原核序列、真核生物mRNA、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。该术语还包括包含任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。这些术语还可包括至少两个碱基-糖-磷酸盐组合的串。该术语还可包括核酸聚合物的单体单元。在一个实施方式中，RNA可以是以下形式：tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶。siRNA和miRNA的用途已在描述(Caudy AA等，Genes&Devel 16：2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。另外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链。这些术语还可包括可含有其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施方式中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA含有肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施方式中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施方式中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施方式中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施方式中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域技术人员已知的，并且在例如NeilsenPE，Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NK等，Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域技术人员已知的，并且在例如MolecularCloning,(2001),Sambrook和Russell编，以及Methods in Enzymology:Methods formolecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。
在另一个实施方式中，本申请公开的核酸分子由游离型载体或质粒载体表达。在另一个实施方式中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地保持在所述重组李斯特菌菌株中。在另一个实施方式中，所述质粒不赋予所述重组李斯特菌抗生素抗性。
在一个实施方式中，本申请公开的免疫原性多肽或其片段是ActA蛋白或其片段。在一个实施方式中，ActA蛋白包含如SEQ ID NO:12所示的序列。
对应于这一序列的前蛋白的前29个AA是信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割下来。在一个实施方式中，ActA多肽或肽包含如上述SEQ ID NO:12所示的信号序列AA1-29。在另一个实施方式中，ActA多肽或肽不包含如上述SEQ ID NO:12所示的信号序列AA1-29。
在一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含ActA蛋白的N-末端片段。在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白是ActA蛋白的N-末端片段。在一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:13所示的序列。
在另一个实施方式中，所述ActA片段包含如SEQ ID NO:13所示的序列。
在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:14所示的序列。
在另一个实施方式中，所述ActA片段是本领域已知的任何其他ActA片段。在另一个实施方式中，所述ActA片段是免疫原性片段。
在另一个实施方式中，ActA蛋白包含如SEQ ID NO:15所示的序列。对应于这一序列的前蛋白的前29个AA是信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。在一个实施方式中，ActA多肽或肽包含如SEQ ID NO:15所示的信号序列AA 1-29。在另一个实施方式中，ActA多肽或肽不包含如SEQ ID NO:15所示的信号序列AA 1-29。
在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:16所示的序列。在另一个实施方式中，如SEQ ID NO:16所示的截短的ActA被称为ActA/PEST1。在另一个实施方式中，截短的ActA包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸122。在另一个实施方式中，SEQID NO:16包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸122。在另一个实施方式中，截短的ActA包含SEQ ID NO:15的前30个氨基酸到氨基酸122。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:16包含SEQ ID NO:15的前30个氨基酸到氨基酸122。
在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:17所示的序列。在另一个实施方式中，如SEQ ID NO:17所示的截短的ActA被称为ActA/PEST2。在另一个实施方式中，如SEQ ID NO:17所示的截短的ActA被称为LA 229。在另一个实施方式中，截短的ActA包含全长ActA序列的氨基酸30到氨基酸229。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:17包含全长ActA序列的约氨基酸30到约氨基酸229。在另一个实施方式中，截短的ActA包含SEQ ID NO:15的约氨基酸30到约氨基酸229。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:17包含SEQ ID NO:15的氨基酸30到氨基酸229。
在另一个实施方式中，本申请公开的截短的ActA序列进一步在N-末端处与hly信号肽融合。在另一个实施方式中，与hly信号肽融合的截短的ActA包含SEQ ID NO:18。
在另一个实施方式中，与hly信号肽融合的截短的ActA由包含SEQ ID NO:19的序列编码。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:19包含编码接头区(SEQ ID NO:19的核苷酸73-78)的序列，该接头区域用于形成XbaI的独特限制酶位点，以使得可在信号序列后克隆不同的多肽、异源抗原等。因此，技术人员将理解，信号肽酶作用于接头区之前的序列以切割信号肽。
在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:20所示的序列。在另一个实施方式中，如SEQ ID NO:20所示的截短的ActA被称为ActA/PEST3。在另一个实施方式中，该截短的ActA包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸332。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:20包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸332。在另一个实施方式中，截短的ActA包含SEQ ID NO:15的约前30个氨基酸到氨基酸332。在另一个实施方式中，SEQ IDNO:20包含SEQ ID NO:15的前30个氨基酸到氨基酸332。
在另一个实施方式中，截短的ActA蛋白包含如SEQ ID NO:21所示的序列。在另一个实施方式中，如SEQ ID NO:21所示的截短的ActA被称为ActA/PEST4。在另一个实施方式中，该截短的ActA包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸399。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:21包含全长ActA序列的前30个氨基酸到氨基酸399。在另一个实施方式中，截短的ActA包含SEQ ID NO:15的前30个氨基酸到氨基酸399。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:18包含SEQ ID NO:15的前30个氨基酸到氨基酸399。
在另一个实施方式中，“截短的ActA”或“ΔActA”包含ActA的片段，其包含PEST结构域。在另一个实施方式中，这些术语包含ActA片段，其包含PEST序列。在另一个实施方式中，编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸包含如SEQ ID NO:22所示的序列。
在另一个实施方式中，所述重组核苷酸具有如SEQ ID NO:22所示的序列。在另一个实施方式中，所述重组核苷酸包含任何其他编码ActA蛋白的片段的序列。
在另一个实施方式中，所述ActA片段由ActA蛋白的约前100个AA组成。
在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-25组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-50组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-75组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-100组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-125组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-150组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-175组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-200组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-225组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-250组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-275组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-300组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-325组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-338组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-350组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-375组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-400组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-450组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-500组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-550组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-600组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-639组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-100组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-125组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-150组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-175组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-200组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-225组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-250组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-275组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-300组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-325组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-338组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-350组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-375组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-400组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-450组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-500组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-550组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基1-600组成。在另一个实施方式中，所述ActA片段由大约残基30-604组成。
在另一个实施方式中，所述ActA片段含有对应于上述AA范围之一的同源ActA蛋白的残基。在另一个实施方式中，残基编号不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果所述同源ActA蛋白相对于本申请使用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可相应地调整残基编号。在另一个实施方式中，所述ActA片段是本领域已知的任何其他ActA片段。
技术人员应当理解，当提及本申请公开的任何核酸序列时，术语“同源性”可包括候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
在一个实施方式中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定序列比对的同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可包括使用任何数量的可用软件包，例如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施方式中，“同源性”是指与选自本申请公开的序列的序列同一性大于68％。在另一个实施方式中，“同源性”是指与选自本申请公开的序列的序列同一性大于70％。在另一个实施方式中，“同源性”是指与选自本申请公开的序列的序列同一性大于72％。在另一个实施方式中，所述同一性大于75％。在另一个实施方式中，所述同一性大于78％。在另一个实施方式中，所述同一性大于80％。在另一个实施方式中，所述同一性大于82％。在另一个实施方式中，所述同一性大于83％。在另一个实施方式中，所述同一性大于85％。在另一个实施方式中，所述同一性大于87％。在另一个实施方式中，所述同一性大于88％。在另一个实施方式中，所述同一性大于90％。在另一个实施方式中，所述同一性大于92％。在另一个实施方式中，所述同一性大于93％。在另一个实施方式中，所述同一性大于95％。在另一个实施方式中，所述同一性大于96％。在另一个实施方式中，所述同一性大于97％。在另一个实施方式中，所述同一性大于98％。在另一个实施方式中，所述同一性大于99％。在另一个实施方式中，所述同一性是100％。
在另一个实施方式中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见例如“Nucleic Acid Hybridization”，Hames,B.D和Higgins S.J.编(1985)；Sambrook等，2001，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press,N.Y.；以及Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精子DNA。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株能够逃离吞噬溶酶体。在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株能够逃离逃脱吞噬体。
在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株包含的内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dal基因双突变，或dal/dat/actA基因三突变或其组合。
在一个实施方式中，李斯特菌基因组包含内源性actA基因的缺失，在一个实施方式中，该基因毒力因子。在一个实施方式中，异源性抗原或抗原多肽被整合到李斯特菌染色体中与LLO同框的位置。在另一个实施方式中，整合的核酸分子被整合到actA基因座中与ActA同框处。在另一个实施方式中，编码ActA的染色体核酸被编码抗原的核酸分子替代。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌包含核酸分子，所述核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框，所述重组多肽包含一个或多个无义肽，其中所述一个或多个无义肽包含一个或多个新表位。在另一个实施方式中，所述重组多肽还包含如本申请所公开截短的LLO蛋白、截短的ActA蛋白或与无义肽或其片段融合的PEST序列。
在另一个实施方式中，本申请公开的细菌信号序列是李斯特菌信号序列，在另一个实施方式中，该序列是hly或actA信号序列。在另一个实施方式中，所述细菌信号序列是本领域已知的任何其他信号序列。
在一个实施方式中，编码本申请公开的重组多肽的核酸还包含信号肽或信号序列。在一个实施方式中，由本申请公开的核酸构建体或核酸分子编码的细菌分泌信号序列是李斯特菌分泌信号序列。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的融合蛋白包含来自李斯特菌溶血素O(LLO)的LLO信号序列。技术人员应当理解，包含本申请公开的一个或多个新表位的抗原或肽可通过使用信号序列，如李斯特菌属信号序列，例如溶血素(hly)信号序列或actA信号序列来表达。另选地，例如，外源基因可在单核细胞增多性李斯特菌启动子下游表达，而不形成融合蛋白。在另一个实施方式中，信号肽是细菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一个实施方式中，信号肽是细菌天然的。在另一个实施方式中，信号肽是细菌外源的。在另一个实施方式中，信号肽是来自单核细胞增多性李斯特菌的信号肽，如secA1信号肽。在另一个实施方式中，信号肽是来自乳酸乳球菌的Usp45信号肽，或来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽。在另一个实施方式中，信号肽是secA2信号肽，如来自单核细胞增多性李斯特菌的p60信号肽。另外，重组核酸分子任选地包含编码p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一个实施方式中，信号肽是Tat信号肽，如枯草芽孢杆菌Tat信号肽(例如PhoD)。在一个实施方式中，信号肽位于编码重组多肽的相同翻译阅读框中。
在另一个实施方式中，分泌信号序列来自李斯特菌蛋白。在另一个实施方式中，分泌信号是ActA300分泌信号。在另一个实施方式中，分泌信号是ActA100分泌信号。
在一个实施方式中，本申请公开的核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。在另一个实施方式中，所述代谢酶补充重组李斯特菌菌株染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施方式中，所述代谢酶补充重组李斯特菌菌株染色体中突变的内源性基因。在另一个实施方式中，由所述第二开放阅读框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶(dal)。在另一个实施方式中，由所述第二开放阅读框编码的代谢酶是D-氨基酸转移酶(dat)。在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株在内源性dal/dat基因中包含突变。在另一个实施方式中，所述李斯特菌缺乏dal/dat基因。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的第一开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施方式中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。
技术人员应当理解，术语“代谢酶”可包括参与宿主细菌所需的营养物合成的酶。在一个实施方式中，该术语包括宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施方式中，该术语包括参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施方式中，该术语包括参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施方式中，酶是营养素的合成所需的。
在另一个实施方式中，所述重组李斯特菌是减毒的营养缺陷型菌株。
在一个实施方式中，减毒的菌株是Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施方式中，减毒的菌株是Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌疫苗载体，该载体由于缺失毒力基因actA而减毒并保留了质粒，以通过补充dal基因用于期望的异源抗原或截短的LLO在体内和体外表达。
在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmddA。在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmΔactA。在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmΔPrfA。在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmΔPrfA*。在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmΔPlcB。在另一个实施方式中，所述减毒菌株是LmΔPlcA。在另一个实施方式中，所述菌株是任何上述菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施方式中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施方式中，该菌株由EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施方式中，本申请公开的菌株是表达非溶血性LLO的李斯特菌菌株。
在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。
在一个实施方式中，可以例如通过本领域技术人员熟知的多种方式来生成本申请公开的D-丙氨酸缺陷的李斯特菌，这些方式包括缺失诱变、插入诱变和导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变，或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施方式中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体选择。在另一个实施方式中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施方式中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本申请提供的方案生生的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施方式中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的突变体用于进一步研究。
在另一个实施方式中，除了上述D-丙氨酸相关基因之外，如本申请公开的涉及代谢酶合成酶的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。
在另一个实施方式中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在一个实施方式中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施方式中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施方式中，代谢酶是氨基酸代谢酶。在另一个实施方式中，代谢酶在重组李斯特菌菌株中用于催化细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施方式中，代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一个实施方式中，代谢酶是D-氨基酸转移酶。
在一个实施方式中，营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，所述游离型表达载体包含补充营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施方式中，所述构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施方式中，外源抗原由重组李斯特菌菌株携带的质粒载体表达。在另一个实施方式中，游离型表达质粒载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的抗原与包含PEST序列的多肽融合。
在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是氨基酸(AA)代谢酶缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是dat基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是二氨基庚二酸的合成中涉及到的基因，CysK缺陷的。在另一个实施方式中，所述基因是维生素B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是trpA。在另一个实施方式中，所述基因是trpB。在另一个实施方式中，所述基因是trpE。在另一个实施方式中，所述基因是asnB。在另一个实施方式中，所述基因是gltD。在另一个实施方式中，所述基因是gltB。在另一个实施方式中，所述基因是leuA。在另一个实施方式中，所述基因是argG。在另一个实施方式中，所述基因是thrC。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是一个或多个本申请所述的基因缺陷的。
在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施方式中，所述基因是AA合成基因。在另一个实施方式中，所述基因是folP。在另一个实施方式中，所述基因是二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是ispD。在另一个实施方式中，所述基因是ispF。在另一个实施方式中，所述基因是磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是hisF。在另一个实施方式中，所述基因是hisH。在另一个实施方式中，所述基因是fliI。在另一个实施方式中，所述基因是核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施方式中，所述基因是ispD。在另一个实施方式中，所述基因是双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是cobS。在另一个实施方式中，所述基因是cobB。在另一个实施方式中，所述基因是cbiD。在另一个实施方式中，所述基因是尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施方式中，所述基因是cobQ。在另一个实施方式中，所述基因是uppS。在另一个实施方式中，所述基因是truB。在另一个实施方式中，所述基因是dxs。在另一个实施方式中，所述基因是mvaS。在另一个实施方式中，所述基因是dapA。在另一个实施方式中，所述基因是ispG。在另一个实施方式中，所述基因是folC。在另一个实施方式中，所述基因是柠檬酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是argJ。在另一个实施方式中，所述基因是3-脱氧-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施方式中，所述基因是menB。在另一个实施方式中，所述基因是甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施方式中，所述基因是磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施方式中，所述基因是磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施方式中，所述基因是carB。在另一个实施方式中，所述基因是carA。在另一个实施方式中，所述基因是thyA。在另一个实施方式中，所述基因是mgsA。在另一个实施方式中，所述基因是aroB。在另一个实施方式中，所述基因是hepB。在另一个实施方式中，所述基因是rluB。在另一个实施方式中，所述基因是ilvB。在另一个实施方式中，所述基因是ilvN。在另一个实施方式中，所述基因是alsS。在另一个实施方式中，所述基因是fabF。在另一个实施方式中，所述基因是fabH。在另一个实施方式中，所述基因是假尿苷合酶。在另一个实施方式中，所述基因是pyrG。在另一个实施方式中，所述基因是truA。在另一个实施方式中，所述基因是pabB。在另一个实施方式中，所述基因是atp合酶基因(例如atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一个实施方式中，所述基因是phoP。在另一个实施方式中，所述基因是aroA。在另一个实施方式中，所述基因是aroC。在另一个实施方式中，所述基因是aroD。在另一个实施方式中，所述基因是plcB。
在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施方式中，所述基因是ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是糖ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是磷酸转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是ZIP锌转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是硫酸转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是镁转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是Na/Pi协同转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是磷酸糖转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是主要协助家族转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是钼ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是钴ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是铵转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是锰ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施方式中，所述基因是本申请公开的蛋白之一的亚基。
在一个实施方式中，本申请公开了核酸分子，所述核酸分子用于转化李斯特菌以获得重组李斯特菌。在另一个实施方式中，本申请公开的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施方式中，所述核酸分子整合到李斯特菌基因组中并携带非功能性毒力基因。在另一个实施方式中，所述毒力基因在所述重组李斯特菌是突变的。在又一个实施方式中，所述核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施方式中，所述毒力基因是actA基因、inlA基因、和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。技术人员应当理解，所述毒力基因可以是本领域已知的任何与重组李斯特菌中的毒力相关的基因。
在又一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、dal/dat突变体、prfA突变体、plcB缺失突变体、或缺乏plcA和plcB或actA和inlB的双突变体。在另一个实施方式中，所述李斯特菌包含这些基因的缺失或突变，无论是单独的还是组合的。在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌缺乏所述基因的每一个。在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌缺乏至少1个且最多10个本申请所述的任何基因，包括所述actA、prfA和dal/dat基因。在另一个实施方式中，所述prfA李斯特菌突变体可通过质粒编码来实现，所述质粒编码包含编码PrfA突变蛋白的核酸序列，所述PrfA突变蛋白包含D133V突变。
在一个实施方式中，所述代谢基因、毒力基因等在李斯特菌菌株的染色体中缺乏、缺失或突变。在另一个实施方式中，代谢基因、毒力基因等在李斯特菌菌株的染色体和任何游离型遗传元件中缺乏、缺失或突变。在另一个实施方式中，代谢基因、毒力基因等在毒力菌株的基因组中缺乏、缺失或突变。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株是减毒的。在另一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌包含本申请公开的内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。
技术人员将了解，术语“突变”及其语法等同物包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并且包括缺失突变、截短、失活、断裂、插入、复制、移码或易位。这些类型的突变是本领域众所周知的。
在一个实施方式中，为了选择包含编码代谢酶或本申请公开的补充基因的质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施方式中，用包含用D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成营养缺陷型细菌，并且所述营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施方式中，如果质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，则D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化并表达本申请公开的质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包括或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，并且可商购获得(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。每种方法代表本申请公开的独立实施方式。
在另一个实施方式中，一旦在适当的培养基上选择了包含本申请公开的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括细菌在没有营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细胞中的存在将确保，所述质粒将与细菌一起复制，从而连续选择携带所述质粒的细菌。技术人员在获知本申请公开内容和本申请的方法后，将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌疫苗载体的产量。
技术人员将理解，在另一个实施方式中，其他营养缺陷型菌株和互补系统也用于本申请公开的用途。
在一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段和无义肽直接互相融合。在另一个实施方式中，编码N末端LLO蛋白片段和无义肽的基因直接互相融合。在另一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段和无义肽通过接头肽可操作地连接。在另一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段和无义肽通过异源肽连接。在另一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段是无义肽的N末端。在另一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施方式中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施方式中，截短的LLO在C末端被截短以得到N末端LLO。在另一个实施方式中，截短的LLO是非溶血性LLO。
在一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段和无义肽直接互相融合。在另一个实施方式中，编码N末端ActA蛋白片段和无义肽的基因直接互相融合。在另一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段和无义肽通过接头肽可操作地连接。在另一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段和无义肽通过异源肽连接。在另一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段是无义肽的N末端。在另一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施方式中，N末端ActA蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施方式中，截短的ActA在C末端被截短以得到N末端ActA。
在一个实施方式中，本申请公开的重组李斯特菌菌株表达所述重组多肽。在另一个实施方式中，所述重组李斯特菌菌株包含编码所述重组多肽的质粒。在另一个实施方式中，本申请公开的重组核酸位于本申请公开的重组李斯特菌菌株中的质粒中。在另一个实施方式中，所述质粒是不整合到重组李斯特菌菌株的染色体中的游离质粒。在另一个实施方式中，所述质粒是整合到李斯特菌菌株的染色体中的整合型质粒。在另一个实施方式中，所述质粒是多拷贝质粒。
在另一个实施方式中，在未经处理的动物或用不相关的李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图12A)。而在另一个实施方式中，本申请公开的减毒营养缺陷型菌株能够通过来自野生型FVB/N小鼠的脾细胞刺激IFN-γ的分泌(图12B和图12C)。
在另一个实施方式中，使用转座子插入将构建体或核酸分子整合到李斯特菌染色体中。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等(Infection and Immunity1990，58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。
III.递送载体
在一个实施方式中，本申请公开的载体是本领域已知的载体，包括质粒或噬菌体载体。在另一个实施方式中，使用包含噬菌体整合位点的噬菌体载体将构建体或核酸分子整合到李斯特菌染色体中(Lauer P、Chow MY等，Construction,characterization,anduse of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.JBacteriol 2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施方式中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的接连位点，所述接连位点可以是基因组中任何适当的位点(例如comK或arg tRNA基因的3’端)。在另一个实施方式中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的接连位点解离。在另一个实施方式中，这种方法产生单拷贝的整合体。在另一个实施方式中，本申请公开还包含用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施方式中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施方式中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施方式中，本申请公开使得能够建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。相反，可补充营养缺陷型宿主菌株。
在一个实施方式中，用于递送核酸的载体，所述核酸编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽或其片段或一个或多个无义肽或其片段，不限于重组李斯特菌菌株，而包含任何本领域已知的用于在哺乳动物受试者中递送核酸或肽的递送载体。在另一个实施方式中，本申请公开的载体是本领域已知的递送载体，包括细菌递送载体、DNA疫苗递送载体、RNA疫苗递送载体、病毒传递载体、病毒样颗粒、脂质体递送载体或核酸负载纳米颗粒。本领域技术人员应当理解，术语“递送载体”是指能够递送一个或多个新表位或包含一个或多个新表位的肽并且在某些实施方式中能够在宿主细胞中表达这些新表位或肽的构建体。此类载体的代表性示例包括病毒载体、核酸表达载体、裸DNA和某些真核细胞(例如生产细胞)。在一个实施方式中，递送载体不同于质粒或噬菌体载体。在另一个实施方式中，本申请公开的递送载体和质粒或噬菌体载体是相同的。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物中所用的细菌递送载体是单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施方式中，递送载体是细菌载体、病毒载体、肽免疫疗法或疫苗载体或DNA免疫疗法或疫苗载体。
在一个实施方式中，病毒递送载体可选自以下：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、人泡沫病毒(HFV)、慢病毒或任何其他本领域已知的病毒递送载体。
在一个实施方式中，所述免疫疗法递送载体是纳米颗粒。在另一个实施方式中，所述纳米颗粒用有阳离子聚合物或阳离子脂质包袱。在另一个实施方式中，所述包被的纳米颗粒还包含靶向配体，所述靶向配体将包含本申请公开的重组核酸序列的纳米颗粒靶向所需组织或肿瘤细胞。
在一个实施方式中，本申请公开的脂质体递送载体是阳离子脂质体。
在另一个实施方式中，本申请公开的免疫疗法递送载体在全身施用后，在循环时避开网状内皮系统(RES)，并且穿过几个屏障，然后到达靶细胞(如患病组织或肿瘤细胞)的细胞质或细胞核。
在本申请公开的方法和组合物的一个实施方式中，术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导侧接重组位点的核酸片段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.，(Current Opinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
“噬菌体表达载体”、“噬菌体载体”或“噬粒”是指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型地或诱导型表达本申请公开的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线性或环状表达系统，并包括保持游离或整合到宿主细胞基因组中的两种基于噬菌体的表达载体。
在一个实施方式中，用于本申请的术语“可操作地连接”是指将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来说，这意味着将启动子和转录引发或起始序列位于编码区的5’。
在一个实施方式中，“开放阅读框”或“ORF”是生物体基因组的一部分，其含有可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施方式中，ORF的开始和结束端不等于mRNA的末端，但它们通常包含在mRNA内。在一个实施方式中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，在一个实施方式中，可操作地整合到基因组中与内源多肽一起作为开放阅读框的核酸分子是已整合到基因组中与内源多肽处于相同开放阅读框中的核酸分子。
在另一个实施方式中，递送载体还包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码一个或多个免疫调节分子的一个或多个开放阅读框。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株还包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码一个或多个免疫调节分子的一个或多个开放阅读框。此类分子的示例包括干扰素γ、细胞因子、趋化因子、T细胞刺激剂以及其任何组合。
在另一个实施方式中，所述免疫调节分子由所述李斯特菌菌株表达和分泌，其中所述分子选自下组：干扰素γ、细胞因子、趋化因子、T细胞刺激剂以及其任何组合。
在一个实施方式中，本申请公开提供了一种包含接头序列的融合多肽。在一个实施方式中，“接头序列”是指连接两个异源多肽或其片段或结构域的氨基酸序列。一般来说，用于本申请的接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示质粒载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放阅读框编码的氨基酸序列的展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员所理解，接头可包含另外的氨基酸，如甘氨酸和其他小的中性氨基酸。
技术人员应当理解，术语“内源性的”可包括已在参照生物体内发育或起源的或由于参照生物体内的成因而产生的某物。在另一个实施方式中，内源性的是指天然的。
在一个实施方式中，“稳定维持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下维持10代而没有可检测的损失。在另一个实施方式中，周期是15代。在另一个实施方式中，周期是20代。在另一个实施方式中，周期是25代。在另一个实施方式中，周期是30代。在另一个实施方式中，周期是40代。在另一个实施方式中，周期是50代。在另一个实施方式中，周期是60代。在另一个实施方式中，周期是80代。在另一个实施方式中，周期是100代。在另一个实施方式中，周期是150代。在另一个实施方式中，周期是200代。在另一个实施方式中，周期是300代。在另一个实施方式中，周期是500代。在另一个实施方式中，周期是更多代。在另一个实施方式中，所述核酸分子或质粒在体外(例如在培养物中)稳定维持。在另一个实施方式中，所述核酸分子或质粒在体内稳定维持。在另一个实施方式中，所述核酸分子或质粒在体外和体内均稳定维持。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种重组李斯特菌菌株，其包含作为具有内源性ActA序列的开放阅读框可操作地整合到李斯特菌基因组中的核酸分子。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达质粒载体，其包含编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含与ActA或截短的ActA融合的抗原。在一个实施方式中，抗原的表达和分泌受actA启动子和actA信号序列的控制，并其作为与ActA的1-233个氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施方式中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利号7,655,238中所述，该专利通过引用整体并入本申请。在另一个实施方式中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰形式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序已缺失，并且含有非保守性QDNKR(SEQ ID NO:60)取代，如美国专利公开号2014/0186387中所述。
在一个实施方式中，本申请公开的片段是功能性片段。在另一个实施方式中，“功能性片段”是当向受试者单独施用或在本申请公开的疫苗组合物中施用时能够引发免疫应答的免疫原性片段。在另一个实施方式中，如技术人员将理解的并且如本申请进一步公开的，功能性片段具有生物活性。
在一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株是减毒菌株。在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株是重组菌株。在另一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌菌株是活的减毒重组李斯特菌菌株。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是重组威尔逊李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一个实施方式中，所述李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌属菌种的重组菌株。
在另一个实施方式中，本申请的重组李斯特菌菌株已在动物宿主传代。在另一个实施方式中，所述传代使菌株作为疫苗载体的功效最大化。在另一个实施方式中，所述传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施方式中，所述传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施方式中，所述传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施方式中，所述传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施方式中，所述传代去除了李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施方式中，传代降低李斯特菌菌株不稳定亚株的普遍性。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施方式中，所述传代如本申请所述进行。在另一个实施方式中，所述传代通过本领域已知任何其他方法进行。在另一个实施方式中，李斯特菌未进行传代。
在另一个实施方式中，本申请的重组核酸与驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子/调控序列可操作地连接。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的PhlyA、PActA和p60启动子、链球菌bac启动子、灰色链霉菌sgiA启动子和苏云金芽孢杆菌phaZ启动子。
在另一个实施方式中，通过将编码本申请公开的肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的控制下，以实现编码所述肽的核酸的诱导型和组织特异性表达。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的示例包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施方式中，使用响应于诱导剂(如金属、糖皮质素等)而诱导的启动子。因此，应理解，本申请公开包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子/调控序列。技术人员应当理解，术语“游离型表达载体”包括这样的核酸质粒载体，其可以是线性的或环状的，并且通常为双链的形式且是染色体外，因为其存在于宿主细菌或细胞的细胞质中，而不是整合到细菌或细胞的基因组中。在一个实施方式中，游离型表达载体包含所关注基因。在另一个实施方式中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注基因的扩增，并且在另一个实施方式中，在必要时提供病毒反式作用因子。在另一个实施方式中，游离型表达载体在本申请中可被称为质粒。在另一个实施方式中，“整合型质粒”包括将其插入或携带的所关注基因的插入靶向宿主基因组内的序列。在另一个实施方式中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合到细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施方式中，插入的异源基因的存在不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施方式中，在稳定的转染过程中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等(1991)Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of a mutant human cellline(HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression plasmidvector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等(1997)Extremely efficientgene transfection into lympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体或体外细胞。质粒载体也可单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
在一个实施方式中，术语“融合”是指通过共价键合可操作地连接。在一个实施方式中，该术语包括(核酸序列或其开放阅读框的)重组融合。在另一个实施方式中，该术语包括化学偶联。在一个实施方式中，术语“融合”是指连接以使得形成单个阅读框的核酸序列。在一个实施方式中，术语“融合”是指连接以使得形成多个阅读框的核酸序列。在一个实施方式中，术语“融合”是指连接以使得启动子序列功能性地连接到开放阅读框的核酸序列。在一个实施方式中，术语“融合”是指与第二核酸序列的N末端连接的核酸序列。在另一个实施方式中，术语“融合”是指与第二核酸序列的C末端连接的核酸序列。
在一个实施方式中，“转化”是指将细菌细胞工程化以摄取质粒或其他异源DNA分子。在另一个实施方式中，“转化”是指将细菌细胞工程化以表达质粒基因或其他异源DNA分子。每种可能性代表本申请公开的方法和组合物的一个独立实施方式。在一个实施方式中，使用质粒或噬菌体载体实现转化。
在另一个实施方式中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入到细菌中。缀合的方法是本领域熟知的，并且在例如Nikodinovic J.等(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3):223-7)和Auchtung JM等(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。每种方法代表本申请公开的方法和组合物的独立实施方式。
在一个实施方式中，术语“减毒”是指细菌在动物中的致病能力降低。换句话说，与野生型李斯特菌相比，减毒李斯特菌菌株的病原学特征已降低，尽管减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1000倍，甚至更优选地至少约10000倍，且最优选地至少约100000倍。因此，李斯特菌的减毒菌株是不杀死施用其的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在一般环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。因此，本申请公开的减毒菌株是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为每株李斯特菌约1-100个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为每株李斯特菌约100-200个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约10个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约20个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约50个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约200个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约300个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约400个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约500个新表位。另选地，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为约1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、5-15、5-20、5-25、15-20、15-25、15-30、15-35、20-25、20-35、20-45、30-45、30-55、40-55、40-65、50-65、50-75、60-75、60-85、70-85、70-95、80-95、80-105或95-105个。另选地，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为约1-100、5-100、5-75、5-50、5-40、5-30、5-20、5-15或5-10个。另选地，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为约1-100、1-75、1-50、1-40、1-30、1-20、1-15或1-10个。另选地，李斯特菌菌株包含新表位，其范围为每株李斯特菌约50-100个。另选地，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌最多约300个新表位。另选地，李斯特菌菌株包含最多约10个、最多约20个、最多约30个、最多约40个或约最多约50个新表位。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌多于约100个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌多于约500个新表位。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株包含一个新表位。另选地，李斯特菌菌株包含每株李斯特菌约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个新表位。
在另一个实施方式中，李斯特菌包含或表达在具有截短的LLO、截短的ActA或PEST序列的融合蛋白的背景下的一种或多种无义肽，其中所述一种或多种无义肽包含上述实施方式中公开的任何数目的新表位。
IV.个性化免疫疗法的方法
本申请还公开用于个性化免疫疗法的方法。在一个实施方式中，本申请公开的一种方法形成一种个性化的免疫疗法。在另一个实施方式中，形成针对患有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法包括识别和选择对于患者的疾病有特异性的突变和变异抗原(新抗原)内的新表位。在另一个实施方式中，本申请公开的方法包括识别具有至少一个导致无义肽或无义多肽的一部分的翻译的移码突变的核酸分子。在另一个实施方式中，用于形成针对受试者的个性化免疫疗法的方法是为了提供用于所述受试者的治疗。在另一个实施方式中，个体化免疫疗法可用于治疗疾病，如癌症、自身免疫疾病、器官移植排斥、细菌感染、病毒感染和慢性病毒疾病，如HIV。
在另一个实施方式中，本申请用于形成个性化免疫疗法的方法可包括使用从异常或不健康样品中提取的核酸和从正常或健康参照样品中提取的核酸，以识别与正常或健康样品相比，存在于异常或不健康样品中的体细胞突变或序列差异，其中这些具有体细胞突变或差异的序列编码表达的氨基酸序列。在另一个实施方式中，表达所述体细胞突变或序列差异的肽可在某些实施方式中自始至终被称为“新表位”。在某些实施方式中，由包含至少一个移码突变的核苷酸序列表达的肽可被为“无义肽”，其中这些无义肽包含一个或多个新表位。
例如，用于形成针对患有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法包括：(a)将从所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了编码一种或多种肽的一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含在来自所述患有疾病或病症的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位(例如T细胞表位)，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个包含一个或多个移码突变，并编码包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个移码突变衍生肽；以及(b)产生包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含所述一种或多种肽，所述肽包含步骤(a)中识别到的所述一个或多个免疫原性新表位。所述免疫疗法递送载体可以是任何类型的免疫疗法递送载体。例如，该方法可用于形成DNA免疫疗法、肽免疫疗法或重组李斯特菌菌株或其他用于免疫疗法的细菌菌株。
在一个实施方式中，一个或多个新表位包含多个新表位。任选地，步骤(b)还可包括随机化包含多个新表位的一种或多种肽在步骤(b)的核酸序列内的顺序的一次或多次迭代。这种随机化可以包括例如将包含多个新表位的一种或多种肽的全部集的顺序随机化，或者可以包括将包括多个新表位的子集的一种或多种肽的顺序随机化。例如，如果核酸序列包含含有20个新表位的20种肽(按顺序的1-20)，则随机化可包含将所有20种肽的顺序随机化，或者可包括仅将这些肽的一个子集(例如肽1-5或6-10)的顺序随机化。这种顺序的随机化可以有利于新表位和每个单独区域的分泌和呈递。
所述方法还可包括储存所述免疫疗法递送载体，以用于在预定的时间段内向所述受试者施用。同样，所述方法还可包括向所述受试者施用包含所述免疫治疗载体、所述DNA免疫疗法或所述肽免疫疗法的组合物，其中所述施用过程导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
患有疾病或病症的生物样品可以获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。同样，健康生物样品可以获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。健康生物样品还可获取自除所述受试者之外的其他人。适宜的生物样品的示例包括组织、细胞、血液样品或血清样品。
步骤(a)中的比较可以是任何合适的方式。例如，其可包括使用筛选测或筛选工具及相关数字软件，以用于将从患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，所述相关数字软件可包括访问序列数据库，所述序列数据库允许筛选从患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的ORF中的突变，以用于鉴定新表位的免疫原性潜力。
从患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列和从健康生物样品中提取的核酸序列可以通过任何方式来确定。例如，从患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列和从健康生物样品中提取的核酸序列可以使用外显子组测序或转录组测序确定。
所述方法还可包括通过从一个或多个移码突变衍生肽产生一种或多种不同的肽序列来对所述一个或多个移码突变衍生肽进行新表位的表征。所述一种或多种不同的肽序列可具有足以引发阳性免疫应答(例如足以使用Lm技术来引发阳性免疫应答)的任何长度，并且可以来自所述移码突变衍生肽的任何部分。可以进一步表征所述一种或多种不同的肽序列。例如，如在本申请的其他地方所公开的，所述一种或多种不同的肽序列，并且在肽序列评分不低于预测单核细胞增多性李斯特菌中分泌性的亲水性阈值的情况下排除所述肽序列。在一个示例中，所述评分过程通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸窗来进行，且排除任何高于约1.6截止值的肽序列或将其修改为低于所述截止值。所述一种或多种不同的肽序列还可以筛选和选择与MHC I类或MHC II类分子的结合，所述MHC I类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
移码突变可位于编码蛋白的基因中的任何地方。例如，移码突变可位于基因的倒数第二个外显子或最后一个外显子中。由移码突变编码的无义肽可具有足以引发阳性免疫应答(例如，足以使用Lm技术引发阳性免疫应答)的任何长度。例如，一个或多个或每个所述无义肽的长度可为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500个氨基酸。一些这样的无义肽不编码翻译后切割位点。
所述疾病或病症可以是任何其中存在新表位的疾病或病症。例如，所述疾病或病症可以是癌症或肿瘤。例如，所述一个或多个免疫原性新表位可包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关的新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性的新表位。本申请的其他地方提供了肿瘤或癌症的示例。例如，所述疾病或病症可以是具有少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个不存在于健康生物样品中在的非同义错义突变的肿瘤。所述疾病或病症还可以是感染性疾病。例如，所述一个或多个无义肽可包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性的新表位。
本申请的其他地方进一步详细说明了可通过该方法产生的免疫疗法递送载体(例如重组李斯特菌菌株)。可重复所述方法以产生多个免疫疗法递送载体，其各包含不同的一个或多个免疫原性新表位的集。例如，所述多个免疫疗法递送载体可包含约2-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40或40-50个免疫疗法递送载体。再例如，所述多个免疫疗法递送载体的组合可包含约5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或100-200个免疫原性新表位。
在一个实施方式中，本申请公开一种用于形成针对患有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了包含至少一个移码突变并且编码一种或多种肽一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含一个或多个在来自所述患有疾病的样品中的一个或多个ORF中编码的一个或多个新表位；(b)用包含核酸序列的载体转换减毒李斯特菌菌株，所述核酸序列编码包含a中识别到所述一个或多个新表位的一种或多种肽；以及另选地，储存所述减毒重组李斯特菌，以用于以预定的时间段向所述受试者施用，或者向所述受试者施用包含所述减毒李斯特菌菌株的组合物，并且其中所述施用导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答；任选地，(c)从所述受试者获取包含T细胞克隆的第二生物样品或从所述T细胞免疫应答获取T-浸润细胞，并表征包含一个或多个与所述T细胞上的T细胞受体结合的新表位的特异性肽，其中所述一个或多个新表位是免疫原性的；(d)筛选和选择编码一种或多种肽的核酸构建体，所述一种或多种肽包含(c)中识别到的一个或多个免疫原性新表位；以及(e)用载体转化第二减毒重组李斯特菌菌株，所述载体包含编码一种或多种肽的核酸序列，所述一种或多种肽包含所述一个或多个免疫原性新表位；以及另选地，储存所述第二减毒重组李斯特菌菌株，以用于以预定的时间段向所述受试者施用，或者向所述受试者施用包含所述第二减毒重组李斯特菌菌株的第二组合物，其中所述方法针对所述受试者形成了个性化免疫疗法。在另一个实施方式中，步骤(a)包括将从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了包含至少一个移码突变的一个或多个核酸序列，其中可以对由包含所述移码突变的核酸序列编码的氨基酸序列筛选包含一个或多个新表位的一个或多个无义肽，所述一个或多个新表位在来自所述患有疾病的样品的所述一个或多个ORF中编码。
在一个实施方式中，通过考虑以下预定义组来确定待使用的载体(例如李斯特菌载体)的数目：循环肿瘤细胞中可见的已知的肿瘤相关突变；已知的癌症“驱动器”突变；和/或已知的耐化学疗法突变，并且在21个氨基酸序列肽选择中给出这些以优先权(参见实施例19)。在另一个实施方式中，这可通过筛选针对COSMIC(体细胞突变目录，cancer.Sanger.ac.uk)识别的突变基因或癌症基因组分析或其他类似的癌症相关基因数据库来实现。另外并且在另一个实施方式中，筛选免疫抑制表位(T-reg表位、IL-10诱导的T辅助表位等)用于取消选择或避免对载体的免疫抑制影响。
在另一个实施方式中，将从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较的步骤还包括使用筛选测定或筛选工具和相关数字软件，以用于将从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述相关数字软件包括访问序列数据库，所述序列数据库允许筛选从患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的ORF中的突变，以用于鉴定新表位的免疫原性潜力。
在一个实施方式中，比较来自患有疾病的样品和健康样品的核酸序列，以识别移码突变。在一个实施方式中，移码序列变体可产生新的或至少部分新的无义肽序列，其包括如本申请所述的新表位。
在另一个实施方式中，可选择无义肽或移码突变衍生肽序列。随后，可将选定的肽排列成潜在重组多肽的一个或多个候选顺序。如果存在比装入单个质粒中更有用的肽，则不同的肽可根据需要/要求通过优先级分配到和/或分离成不同的重组多肽(例如包含在不同的重组李斯特菌菌株中)。优先级可通过如相对大小、转录优先级和/或翻译的多肽的总疏水性等因素来确定。如本申请的其他地方更详细地公开，可以排列所述肽，使其直接连接在一起而没有接头，或具有任何数目的肽对之间接头的任何组合。可以基于考虑所需构建体的数目与突变负荷、来自单个质粒的多个表位的翻译和分泌的效率或每种细菌或包含质粒的Lm所需要的MOI之间的关系，来确定待包含的线性肽的数目。例如，线性抗原肽的范围可以以每个质粒约50、40、30、20或10个抗原肽开始。
在另一个实施方式中，在本申请公开的任何方法还包括以下步骤：针对疏水性和亲水性筛选一个或多个新表位、包含一个或多个新表位的无意义肽或包含一个或多个新表位的重组多肽。
在另一个实施方式中，本申请所述的方法还包括以下步骤：选择包含一个或多个具有亲水性的新表位的一个或多个新表位、无意义肽或重组多肽。
在另一个实施方式中，本申请所述的方法包括以下步骤：选择在Kyte Doolittle亲水性图中得分最多1.6的一个或多个新表位、包含一个或多个新表位的肽、包含一个或多个新表位的无义肽或重组多肽。
在一个实施方式中，疏水性使用Kyte-Doolittle(Kyte J,Doolittle RF(1982年5月).“A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.”J.Mol.Biol.157(1):105–32)或其他适合的亲水性图或其他适当标度来设定等级，所述适当标度包括但不限于以下文献所公开的：Rose等(Rose,G.D.和Wolfenden，R.(1993)Annu.Rev.Biomol.Struct.,22,381–415.)；Kallol M.Biswas,Daniel R.DeVido,JohnG.Dorsey(2003)Journal of Chromatography A,1000,637–655,Eisenberg D(1984年7月).Ann.Rev.Biochem.53:595–623.)；Abraham D.J.,Leo A.J.Proteins:Structure,Function and Genetics2:130-152(1987)；Sweet R.M.,Eisenberg D.J.Mol.Biol.171:479-488(1983)；Bull H.B.,Breese K.Arch.Biochem.Biophys.161:665-670(1974)；GuyH.R.Biophys J.47:61-70(1985)；Miyazawa S.等，Macromolecules 18:534-552(1985)；Roseman M.A.J.Mol.Biol.200:513-522(1988)；Wolfenden R.V.等Biochemistry 20:849-855(1981)；Wilson K.J；Biochem.J.199:31-41(1981)；Cowan R.,Whittaker R.G.PeptideResearch 3:75-80(1990)；Aboderin A.A.Int.J.Biochem.2:537-544(1971)；EisenbergD.等，J.Mol.Biol.179:125-142(1984)；Hopp T.P.,WoodsK.R.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828(1981)；Manavalan P.,PonnuswamyP.K.Nature 275:673-674(1978).；Black S.D.,Mould D.R.Anal.Biochem.193:72-82(1991)；Fauchere J.-L.,Pliska V.E.Eur.J.Med.Chem.18:369-375(1983)；JaninJ.Nature 277:491-492(1979)；Rao M.J.K.,Argos P.Biochim.Biophys.Acta 869:197-214(1986)；Tanford C.J.Am.Chem.Soc.84:4240-4274(1962)；Welling G.W.等，FEBSLett.188:215-218(1985)；Parker J.M.R.等，Biochemistry 25:5425-5431(1986)；CowanR.,Whittaker R.G.Peptide Research 3:75-80(1990)，所有这些文献均通过引用整体并入本申请。在另一个实施方式中，将在标度适当测量上对于有效分泌具有不能令人满意的高水平疏水性的所有表位评分从列表中移除或取消选择。在另一个实施方式中，将Kyte-Doolittle图上的对于有效分泌具有不能令人满意的高水平疏水性(如1.6或以上)的所有表位评分从列表中移除或取消选择。在另一个实施方式中，使用免疫表位数据库(IEDB)分析资源来评定每个新表位结合受试者HLA的能力，该分析资源包括：netMHCpan、ANN、SMMPMBEC.SMM，CombLib_Sidney2008，PickPocket，netMHCcons。其他资源包括TEpredict(tepredict.sourceforge.net/help.html)或本领域中可用的替代性MHC结合测量标度。
在一个实施方式中，一旦识别到新表位或无义肽，则通过Kyte和Doolittle亲水性指数21氨基酸窗对所述新表位或无义肽评分，其中在另一个实施方式中，排除超过特定截止点(约1.6)的新表位评分，因为它们不太可能由单核细胞增多性李斯特菌分泌。在一个实施方式中，通过Kyte和Doolittle亲水性指数21氨基酸窗对重组多肽中包含一种或多种异源肽的部分、重组多肽中包含一个或多个无义肽或移码突变衍生肽的部分，或者所述重组多肽评分。如果任何区域的评分超过截止点(例如大约1.6)，可使用选择的参数或使用随机化，将所述肽在重组多肽中重新排列或改变顺序，直到找到可接受的抗原肽顺序(即其中没有评分超过截止点的区域的顺序)。另选地，可去除任何有问题的肽或将其重新设计以具有不同的大小，或者以改变所述肽中包含的蛋白的序列。另选地或另外地，可在如本申请的其他地方公开的肽之间添加一个或多个接头以改变疏水性。在另一个实施方式中，所述截止点选自以下范围：1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2.0-2.2、2.2-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0或4.0-4.5。在一个实施方式中，用于确定从列表中移除或取消选择的表位的截止分数是1.6。在另一个实施方式中，截止点为1.4、1.5、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，截止点根据所使用的递送载体的属类来改变。在另一个实施方式中，截止点根据所使用的递送载体的物种来改变。
在一个实施方式中，通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸滑动窗口来对所述新表位或无义肽或移码突变衍生肽进行评分。在一个实施方式中，通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸滑动窗口来对所述新表位、所述无义肽、所述移码突变衍生肽、重组多肽中包含一种或多种异源肽的部分、重组多肽中包含一个或多个无义肽或移码突变衍生肽的部分或所述重组多肽进行评分。在另一个实施方式中，滑动窗大小选自包括以下的组：9、11、13、15、17、19和21个氨基酸。在另一个实施方式中，滑动窗大小是9-11个氨基酸、11-13个氨基酸、13-15个氨基酸、15-17个氨基酸、17-19个氨基酸或19-21个氨基酸。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，使用免疫表位数据库(IED)或本领域已知的任何其他替代数据库和相关数字软件对每个新表位或无义肽结合至受试者HLA的能力进行评定。在另一个实施方式中，所用的其他相关的预测服务器和相关数据库包括NetMHCpan服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)、IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)、Bimas-HLA肽结合预测(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、Rankpep：预测肽与I类和II类MHC分子的结合(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、针对MHC配体和肽基序的SYFPEITHI数据库(http://www.syfpeithi.de/)以及人工神经网络(ANN)(http://ann.thwien.de/index.php？title＝Main_Page)。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，在所有可能的9聚体和10聚体肽中预测主要组织相容性复合物(MHC)I和/或II的结合亲和力。在另一个实施方式中，在可以从包含突变或编码由移码形成的无义肽的序列中产生的所有可能的新表位中预测亲和力。在另一个实施方式中，针对大小为约21个氨基酸的序列(21聚体)进行所述预测。在另一个实施方式中，针对包括至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的序列进行所述预测。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，针对长度至少为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的序列进行所述预测。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，针对范围为约8-12个氨基酸、5-10、5-12、5-15、5-25、5-35、8-15或约5-50个氨基酸的序列进行所述预测。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，针对可变或相似氨基酸长度的序列进行预测。
在另一个实施方式中，在多个肿瘤(以及大量的HLA等位基因)中估计的新表位的丰度每个点突变约1.5个HLA结合肽，IC50<500nM，以及每个移码突变约4个结合肽。
在另一个实施方式中，技术人员应当理解，可通过竞争实验直接评估不同无义肽与特定MHC分子的相对结合能力。在一个实施方式中，IC50值是指导致标准肽50％抑制的肽浓度，并且相对结合能量可被描述为标准肽的IC50与测试肽的IC50之间的比率。在另一个实施方式中，这些值可与预测的HLA肽结合相关。
在另一个实施方式中，技术人员将理解，HLA肽结合预测领域中的结合预测标准可以定义为：IC50<150nM的肽为强结合剂，IC50为150至500nM的肽为中等至弱结合剂0，以及IC50>500nM的肽为非结合剂。在另一个实施方式中，HLA结合肽的截止点约为IC50<50nM、IC50<100nM、IC50<150nM、IC50<200nM、IC50<250nM、IC50<300nM、IC50<350nM、IC50<400nM、IC50<450nM、IC50<500nM、IC50<550nM、IC50<600nM、IC50<650nM、IC50<700nM或IC50<750nM。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，HLA结合肽的截止点的范围约为：0<IC50<150nM、0<IC50<200nM、0<IC50<250nM、0<IC50<350nM、0<IC50<400nM、0<IC50<450nM、0<IC50<550nM、0<IC50<600nM、0<IC50<650nM、0<IC50<700nM、0<IC50<750nM、0<IC50<800nM。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，从患有疾病的样品中识别的新表位或无义肽可在主要组织相容性复合物I类分子(MHCI)上呈现。在一个实施方式中，含有新表位突变的肽具有免疫原性，并被适应性免疫系统识别为“非自身”新抗原。在另一个实施方式中，使用在肽、重组多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，所述靶向免疫疗法可以在某些实施方式中治疗性地激活针对疾病或病症的T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用在无义肽、多肽或融合多肽中的包含一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，所述靶向免疫疗法在某些实施方式中可以治疗性地激活针对疾病或病症的适应性免疫应答。
在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：针对免疫抑制表位筛选一个或多个新表位或无义肽，并从识别的新表位中将其排除。在一个实施方式中，这些免疫抑制表位如序列中所呈现的，或者由于将表位序列和接头剪接在一起而人工形成。
在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：针对T-调节激活表位筛选一个或多个新表位或无义肽，并从识别的新表位中将其排除。
在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：针对由患有疾病或病症的生物样品表达的表位筛选一个或多个新表位或无义肽，并从识别的新表位中排除未表达的表位。
在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：针对不包含翻译后切割位点的表位筛选一个或多个新表位或无义肽。
在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：筛选包含移码突变的一个或多个核酸序列。在另一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：识别在基因的最后一个外显子中编码的移码突变。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法还包括以下步骤：筛选一个或多个表达的无义肽。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法还包括以下步骤：针对表达的表位筛选一个或多个新表位或无义肽，并从识别的新表位中排去未表达的表位。
在另一个实施方式中，选择无义肽和/或新表位还包括以下步骤：筛选高度表达的无义肽和/或新表位。
在一个实施方式中，所述无义肽或其片段和/或新表位可在患有疾病或病症的样品中累积。在另一个实施方式中，本申请公开还包括消除患有疾病或病症的生物样品中未累积达到某一阈值的无义肽或其片段。在一个实施方式中，含肽的新表位可在患有疾病或病症的样品中累积。在另一个实施方式中，本申请公开还包括消除患有疾病或病症的生物样品中未累积达到某一阈值的含肽的新表位。在一个实施方式中，所述累积可以通过本领域已知的蛋白检测手段来检测，如ELISA、蛋白芯片、蛋白印迹、荧光标记等。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法包括以下步骤：通过将从所述患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，获得所述无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列内的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自患有疾病的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
分析所有样品在ORF中的新基因测序。将从所述患有疾病的生物样品和所述健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)进行比较的方法包括使用筛选测定或筛选工具和相关数字软件。用于进行生物信息学分析的方法是本领域已知的，参见例如US 2013/0210645、US 2014/0045881和WO 2014/052707，其全文并入本申请。
根据本申请公开的另一个实施方式，将序列进行比较包括将整个外显子开放阅读框进行比较。另外地或另选地，将序列进行比较包括将整个蛋白组进行比较。
人肿瘤通常具有显著数量的体细胞突变。然而，在肿瘤中很少发现任何特定基因中的相同突变(甚至发生相同的最常见的驱动突变的频率也很低)。因此，在一个实施方式中，本申请公开的全面识别患者特异性的肿瘤移码突变的方法为个性化免疫疗法提供了靶标。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法包括以下步骤：比较预定义基因集的开放阅读框外显子组，其选自下组：编码已知的和预测的癌症或肿瘤抗原的核酸序列、编码肿瘤或癌症相关抗原的核酸序列、编码已知的或预测的肿瘤或癌蛋白标记物的核酸序列、编码已知的和预测的感染性疾病或病症相关基因的核酸序列、编码在所述患有疾病的生物样品中表达的基因的核酸序列、包含微卫星不稳定区的核酸序列以及其任何组合。
在另一个实施方式中，形成个性化免疫疗法的方法中的一个步骤是从患有疾病或病症的受试者中获取异常或不健康生物样品。在另一个实施方式中，疾病是感染性疾病或肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，本申请通篇公开了所述疾病、肿瘤、癌症、病症。在另一个实施方式中，所述疾病是局部疾病。在另一个实施方式中，所述疾病是肿瘤或癌症、自身免疫疾病、感染性疾病、病毒感染性疾病或细菌感染性疾病。
在另一个实施方式中，公开了一种本申请公开的方法，其包括以下步骤：(a)识别、分离和扩增针对疾病响应的T细胞克隆或T-浸润细胞；以及(b)筛选和识别一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含装载在在与T细胞上的T细胞受体结合的特异性MHC I类或MHC II类分子上的一个或多个免疫原性新表位。
在另一个实施方式中，所述筛选和识别步骤包括T细胞受体测序、基于多路复用的流式细胞术或高效液相色谱法。在另一个实施方式中，所述测序包括使用相关数字软件和数据库。
在一个实施方式中，通过DNA外显子组对一式三份对根据本申请公开获得的每种样品进行测序。由移码突变产生的无义肽将展示所编码的突变肽的整个序列，直至终止密码子。另外地或另选地，移码突变编码包含至少一部分新表位的无义肽。在另一个实施方式中，所述移码突变编码包含至少一个新表位的无义肽。在另一个实施方式中，所述无义肽包含多个不同的氨基酸序列作为潜在的新表位。在一个实施方式中，通过本申请公开的方式或方法对潜在的新表位进行筛选、表征、评定、选择或任何其组合。
在另一个实施方式中，新表位包括独特的肿瘤或癌症新表位、癌症特异性或肿瘤特异性表位。在另一个实施方式中，新表位是免疫原性的。在另一个实施方式中，新表位由T细胞识别。在另一个实施方式中，包含一个或多个新表位的肽激活针对肿瘤或癌症的T细胞应答，其中所述应答对于所述受试者是个性化的。在另一个实施方式中，新表位包括与感染性疾病相关的独特表位。在一个实施方式中，感染性疾病表位直接与所述疾病相关。在一个另选的实施方式中，感染性疾病表位与所述感染性疾病相关。
在另一个实施方式中，在新表位序列之间包括接头序列的步骤。所述接头是任何本领域已知的接头序列。在另一个实施方式中，所述接头包含4X甘氨酸。在另一个实施方式中，所述接头包含聚甘氨酸。在又一个实施方式中，所述接头选自下组：SEQ ID NO:46-56及其任何组合。
在另一个实施方式中，将如本申请所述的标签连接到新表位或无义肽的步骤。在另一个实施方式中，所述标签是本领域已知的任何标签。在另一个实施方式中，所述标签选自SIINFEKL-S-6xHIS标签、6xHIS标签、SIINFEKL标签、任何聚组氨酸标签。在一个实施方式中，将所述标签连接到重组多肽或核酸序列的C-末端或N-末端。在一个实施方式中，将所述标签连接到所述核酸序列包括产生开放阅读框，所述开放阅读框编码所述标签，并且包含新表位或无义肽，以及任选地包含接头和任选地包含免疫原性多肽。在一个实施方式中，所述标签选自下组：6X组氨酸标签、2x FLAG标签、3x FLAG标签、SIINFEKL肽、与SIINFEKL肽可操作地连接的6X组氨酸标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的3X FLAG标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的2X FLAG标签以及其任何组合。两个或更多个标签可以一起使用，如2xFLAG标签和SIINFEKL标签、3xFLAG标签和SIINFEKL标签或6x组氨酸标签和SIINFEKL标签。如果使用两个或更多个标签，它们可以以任何顺序位于重组多肽内的任何位置。例如，两个标签可位于所述重组多肽的C末端、两个标签可位于所述重组多肽的N末端、两个标签可位于所述重组多肽内部、一个标签可位于所述重组多肽的C末端而另一个标签可位于所述重组多肽的N末端、一个标签可位于所述重组多肽的C末端而另一个可位于所述重组多肽内部，或者一个标签可位于所述重组多肽的N末端而另一个可位于所述重组多肽内部。
在另一个实施方式中，将与标签连接的接头序列连接到新表位或无义肽的步骤。
在另一个实施方式中，在检测新表位分泌的步骤中，使用与多组氨酸(His)标签或SIINFEKL-S-6xHIS标签特异性结合的蛋白、分子或抗体(或其片段)来检测肽或重组多肽(融合/嵌合)。在另一个实施方式中，在检测新表位分泌的步骤中，使用与2xFLAG标签或3xFLAG标签或任何本申请公开的其他标签特异性结合的蛋白、分子或抗体(或其片段)来检测肽或重组多肽(融合/嵌合)。
在另一个实施方式中，肽疫苗包含一个或多个包含一个或多个免疫原性新表位的无义肽，其中每个无义肽与免疫原性多肽或其片段融合或混合。在另一个实施方式中，所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施方式中，本申请公开通篇描述了所述免疫原性多肽。例如，所述免疫原性多肽可包含含PEST的肽。
在一个实施方式中，所述系统或方法还包括培养和表征李斯特菌菌株以确认T细胞新表位的表达和分泌。在一个实施方式中，所述系统或方法还包括培养和表征李斯特菌菌株以确认适应性免疫应答新表位的表达和分泌。在一个实施方式中，所述系统或方法还包括培养和表征李斯特菌菌株以确认一个或多个无义肽的表达和分泌。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法使得能够在患有疾病的受试者中产生个性化增强的抗疾病或抗感染或抗感染性疾病或抗肿瘤的免疫应答。在另一个实施方式中，所述方法使得能够个体化治疗或预防受试者中的疾病或感染或感染性疾病或肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，所述方法增加了患有疾病或感染或感染性疾病或肿瘤或癌症的受试者的存活时间。
在一个实施方式中，本申请公开包括以下步骤：产生包含本申请公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物、本申请公开的重组多肽或本申请公开的核酸序列，以及药学上可接受的运载体。在一个实施方式中，本申请公开包括以下步骤：产生本申请公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物、本申请公开的重组多肽和本申请公开的核酸序列中的任何一个或多个与药学上可接受的运载体的组合。
V.组合物及其使用方法
在一个实施方式中，本申请公开的组合物是免疫原性组合物。该免疫原性组合物可包括至少一个本申请公开的免疫疗法递送载体或至少一个本申请公开的重组李斯特菌菌株。所述免疫原性组合物还包含佐剂。
一些所述免疫原性组合物包括多个本申请公开的免疫疗法递送载体或多个重组李斯特菌菌株。每个免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株可包含或编码如本申请公开的不同的重组多肽，或可包含一个或多个免疫原性新表位的不同集合。例如，所述多个免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株可包含例如2-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40或40-50个免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株。同样，所述多个免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株可包含例如约5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或100-200个免疫原性新表位。
所述免疫原性组合物、免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株可用于治疗、压制、预防或抑制受试者的疾病或病症的方法中，所述方法包括向所述受试者施用所述免疫原性组合物、免疫疗法递送载体或重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品的源核酸序列编码。该方法可引发所述受试者中的个性化的抗疾病或抗病症免疫应答，其中所述个性化的免疫应答针对所述一个或多个移码突变衍生肽。例如，所述疾病或病症可以是病症或肿瘤。如本申请的其他地方所公开，该方法还可包括施用强化治疗。
在一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，所述干扰素-γ在一个实施方式中具有抗血管生成特性(Dominiecki等，Cancer ImmunolImmunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日电子版，其通过引用整体并入本申请；Beatty和Paterson,J.Immunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，其通过引用整体并入本申请)。在一个实施方式中，李斯特菌的抗血管生成特性由CD4+T细胞介导(Beatty和Paterson，2001)。在另一个实施方式中，李斯特菌的抗血管生成特性由CD8+T细胞介导。在另一个实施方式中，由李斯特菌接种导致的IFN-γ分泌由NK细胞、NKT细胞、Th1CD4+T细胞、TC1CD8+T细胞或其组合介导。
在另一个实施方式中，本申请公开的组合物的施用诱导一种或多种抗血管生成蛋白或因子的生成。在一个实施方式中，所述抗血管生成蛋白是IFN-γ。在另一个实施方式中，所述抗血管生成蛋白是色素上皮衍生因子(PEDF)；血管生成抑制素；内皮抑素；fms样酪氨酸激酶(sFlt)-1或可溶内皮糖蛋白(sEng)。在一个实施方式中，本申请公开的李斯特菌参与抗血管生成因子的释放，并且因此在一个实施方式中，其除了作为用于将抗原引入到受试者的质粒载体中之外还具有治疗作用。每个李斯特菌菌株及其类型代表本申请公开的独立实施方式。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物所诱导的免疫应答是T细胞应答。在另一个实施方式中，免疫应答包括T细胞应答。在另一个实施方式中，应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施方式中，所述应答包括CD8+T细胞应答。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，所述施用导致产生针对疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
在另一个实施方式中，施用本申请公开的组合物增加抗原特异性T细胞的数量。在另一个实施方式中，施用组合物激活T细胞上的共刺激受体。在另一个实施方式中，施用组合物诱导记忆和/或效应T细胞的增殖。在另一个实施方式中，施用组合物增加T细胞的增殖。在另一个实施方式中，施用组合物引发受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答。在另一个实施方式中，施用组合物抑制在受试者中的肿瘤介导的免疫抑制。在另一个实施方式中，施用组合物增加受试者脾和肿瘤中的调节性T细胞(Treg)或效应T细胞的比例。
在另一个实施方式中，向所述受试者施用组合物产生所述受试者中的个性化增强的抗疾病或抗病症免疫应答。在另一个实施方式中，所述免疫应答包含抗癌症或抗肿瘤应答。在另一个实施方式中，所述免疫应答包含抗感染性疾病应答。
用于本申请的术语“组合物”和“免疫原性组合物”是可互换的，具有完全相同的含义和特性。
在另一个实施方式中，本申请公开的用于同时或依次施用各组分的包含重组李斯特菌菌株并且还包含抗体或其功能性片段的免疫原性组合物也称作“组合疗法”。技术人员将理解，组合疗法也可以包括另外的组分、抗体、疗法等。
技术人员将理解，术语“药物组合物”可包含适于药物用途，例如向有需要的受试者施用的组合物。
在一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含本申请公开的重组李斯特菌菌株。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，当提及李斯特菌时，“李斯特菌疫苗”或“疫苗”可与本申请的“李斯特菌免疫疗法”或“免疫疗法”互换使用。在另一个实施方式中，本申请公开的免疫疗法包含至少一个本申请公开的重组李斯特菌菌株和药学上可接受的运载体。
在另一个实施方式中，公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述重组一个或多个多肽包含一个或一个或多个与免疫原性多肽融合的免疫原性新表位，其中所述免疫原性新表位的一个或多个由包含至少一个突变的源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。例如，所述至少一个突变可以是非同义错义突变或体细胞非同义错义突变。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或一个或多个免疫原性新表位，其中所述免疫原性新表位的一个或多个由源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含本申请公开的核酸序列分子。在另一个实施方式中，本申请公开提供了一种DNA疫苗和药学上可接受的运载体，所述DNA疫苗包含本申请公开的核酸序列分子。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含本申请公开的牛痘病毒株或病毒样颗粒。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含本申请公开的包含一个或多个新表位的重组多肽。在另一个实施方式中，本申请公开了一种肽疫苗和药学上可接受的运载体，所述肽疫苗包含一个或多个本申请公开的包含一个或多个新表位的重组多肽。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种药物组合物和药学上可接受的运载体，所述药物组合物包含本申请公开的包含一个或多个新表位的无义肽或其片段。在另一个实施方式中，本申请公开的肽疫苗、DNA疫苗、牛痘病毒或病毒样颗粒或重组李斯特菌包含或表达(适用时)一个或多个无义肽或其片段和药学上可接受的运载体，所述一个或多个无义肽或其片段包含包含本申请公开的一个或多个新表位。
技术人员将理解，术语“药物组合物”包括治疗有效量的活性成分和药学上可接受的运载体或稀释剂，所述治疗有效量的活性成分包括以下至少一种：本申请公开的一个或多个重组李斯特菌菌株、一个或多个重组多肽，其包含一个或多个包含至少一个新表位的无义肽、至少一个编码一个或多个新表位的核酸序列、一个或多个无义肽或其片段，以及其任何组合。应了解，术语“治疗有效量”是指针对给定病症和施用方案提供治疗效果的量。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种重组疫苗载体，所述重组疫苗载体包含如本申请公开的核酸序列分子。在另一个实施方式中，载体是表达载体。在另一个实施方式中，表达载体是质粒。在另一个实施方式中，本申请公开提供了一种用于将本申请公开的核苷酸分子引入到细胞中的方法。用于构建和利用重组载体的方法是本领域熟知的，并且在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)和Brent等(2003,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)中有所描述。在另一个实施方式中，所述载体是细菌载体。在其他实施方式中，载体选自沙门氏菌、志贺氏菌、BCG、单核细胞增多性李斯特菌和戈氏链球菌。在另一个实施方式中，通过经修饰以逃避吞噬溶酶体融合并生存在细胞的细胞质中的重组细菌载体来递送一种或多种肽。在另一个实施方式中，载体是病毒载体。在其他实施方式中，载体选自牛痘病毒、禽痘病毒、腺病毒、AAV、牛痘病毒NYVAC、经修饰的安卡拉株牛痘病毒(MA)、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、疱疹病毒和逆转录病毒。在另一个实施方式中，载体是裸DNA载体。在另一个实施方式中，载体是本领域已知的任何其他载体。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，包含本申请公开的包含李斯特菌菌株的组合物还包含佐剂。在另一个实施方式中，组合物还包含佐剂，所述组合物至少包括以下之一：本申请公开的一个或多个重组李斯特菌菌株、一个或多个包含一个或多个新表位的重组多肽、至少一个编码一个或多个新表位的核酸序列、一个或多个无义肽或其片段。在一个实施方式中，本申请公开的组合物还包含佐剂。
在另一个实施方式中，免疫原性组合物包含载体和佐剂，所述载体包含核酸序列，所述核酸序列包含重组多肽，所述重组多肽包含与免疫原性多肽或其片段融合的一个或多个无义肽或其片段。在另一个实施方式中，免疫原性组合物包含重组多肽和佐剂，所述重组多肽包含与免疫原性多肽或其片段融合的一个或多个无义肽或其片段。
在一个实施方式中，所述组合物包含本领域已知或本申请公开的佐剂。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物中使用的佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、GM-CSF蛋白、编码GM-CSF的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A、SBAS2、未经甲基化的含CpG寡核苷酸、免疫刺激细胞因子、编码免疫刺激细胞因子的核苷酸分子、刺糖苷(quill glycoside)、细菌有丝分裂原或细菌毒素。合适的佐剂的另一个示例是解毒的李斯特菌溶血素O(dtLLO)蛋白。适于用作佐剂的dtLLO的一个示例由SEQ ID NO:67编码。由与SEQ ID NO:67具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列编码的dtLLO也适于用作佐剂。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。在另一个实施方式中，所述佐剂是或包含本领域已知的任何其他佐剂。
在一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物包含本申请公开的重组李斯特菌菌株。
在一个实施方式中，组合物包含重组单核细胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。在一个实施方式中，免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。在另一个实施方式中，无义肽或其片段与截短的LLO、截短的ActA或PEST序列融合。
在一个实施方式中，免疫原性组合物包含至少一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个免疫原性新表位，其中所述一个或多个免疫原性新表位由包含至少一个突变的源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，免疫原性组合物包含至少一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的免疫原性新表位，其中所述一个或多个免疫原性新表位由包含至少一个突变的源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，免疫原性组合物包含载体，所述载体包含核酸序列，所述核酸序列包含重组多肽，所述重组多肽包含与免疫原性多肽或其片段融合的一个或多个无义肽或其片段。在另一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物包含至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物包含一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，其中所述新表位的一个或多个由源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，免疫原性组合物包含至少一个核酸序列，所述至少一个核酸序列编码一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物包含本申请公开的重组李斯特菌菌株、递送载体或表达载体。在一个实施方式中，所述源核酸获取自患有疾病或病症的生物样品。在又一个实施方式中，本申请公开的疾病或病症是感染性疾病、自身免疫疾病、器官移植排斥、肿瘤或癌症。在另一个实施方式中，所述感染性疾病包含病毒或细菌感染。
在另一个实施方式中，本申请公开的免疫原性组合物的每个组分在本申请公开的免疫原性组合物的另一个组分之前、同时或之后施用。
在另一个实施方式中，本申请公开的组合物通过本领域技术人员已知的任何方法向受试者施用，如胃肠外、癌旁、透粘膜、透皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内施用。
在另一个实施方式中，所述组合物经口施用，并因此被配制为适合经口施用的形式，即作为固体或液体制剂。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本申请公开的另一个实施方式中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施方式，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本申请公开的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施方式中，通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂来施用组合物。适合的液体制剂包括溶液、悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施方式中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施方式中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施方式中，将药物组合物肌内施用，因此将其配制为适合肌内施用的形式。
在一个实施方式中，每1-2周、每2-3周、每3-4周、每4-5周、每6-7周、每7-8周或每9-10周向受试者施用一剂本申请公开的任何组合物，以实现预期的引起针对受试者疾病或病症的免疫应答。在一个实施方式中，每1-2个月、每2-3个月、每3-4个月、每4-5个月、每6-7个月、每7-8个月或每9-10个月向受试者施用一剂本申请的任何组合物，以实现预期的引起针对受试者疾病或病症的免疫应答的。
在一个实施方式中，本申请公开的组合物或疫苗的重复施用(强化剂量)可在第一疗程后立即进行，或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施方式中，重复剂量可在第一疗程后立即进行，或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法，如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、或肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施方式中，每1-2周、每2-3周、每3-4周、每4-5周、每6-7周、每7-8周或每9-10周向受试者施用增强剂，以实现预期的抗肿瘤应答。在一个实施方式中，每1-2个月、每2-3个月、每3-4个月、每4-5个月、每6-7个月、每7-8个月或每9-10个月向受试者施用增强剂，以实现针对受试者疾病或病症的免疫应答的预期诱导。
还应了解，如本申请进一步公开的，这些组合物的施用增强免疫应答或提高效应T细胞与调节性T细胞的比率或者引发抗肿瘤免疫应答。在一个实施方式中，本申请公开了一种使用方法，其包括施用包含所述李斯特菌菌株并且还包含抗体或其功能片段的组合物。在另一个实施方式中，使用方法包括施用多于一种本申请公开的抗体，所述抗体可存在于相同或不同的组合物中，并可存在于与李斯特菌相同的组合物中或单独的组合物中。每种可能性代表本申请公开的方法的不同实施方式。
技术人员将理解，术语“施用”包括使受试者与本申请公开的组合物接触。在一个实施方式中，施用可在体外即在试管中实现，或在体内即在活生物体(例如人)的细胞或组织中实现。在一个实施方式中，本申请公开的方法包括向受试者施用李斯特菌菌株及其组合物。
在一个实施方式中，疫苗包含本申请公开的组合物。在另一个实施方式中，所述疫苗还包含佐剂和/或药物运载体。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法包括至少单次施用如本申请所公开的组合物、疫苗和/或李斯特菌菌株，其中在另一个实施方式中，方法包括多次施用组合物、疫苗和/或李斯特菌菌株。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，本申请公开的方法包括单次施用重组李斯特菌。在另一个实施方式中，施用李斯特菌两次。在另一个实施方式中，施用李斯特菌3次。在另一个实施方式中，施用李斯特菌四次。在另一个实施方式中，施用李斯特菌超过四次。在另一个实施方式中，施用李斯特菌多次。在另一个实施方式中，以规律的间隔施用李斯特菌，在一个实施方式中，该间隔可以是每天、每周、每两周、每3周或每个月。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，方法包括单次施用本申请公开的组合物。在另一个实施方式中，施用组合物两次。在另一个实施方式中，施用组合物3次。在另一个实施方式中，施用组合物四次。在另一个实施方式中，施用组合物超过四次。在另一个实施方式中，施用组合物多次。在另一个实施方式中，以规律的间隔施用组合物，在一个实施方式中，该间隔可以是每天、每周、每两周、每3周或每个月。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
在一个实施方式中，方法包括单次施用疫苗。在另一个实施方式中，施用疫苗两次。在另一个实施方式中，施用疫苗3次。在另一个实施方式中，施用疫苗四次。在另一个实施方式中，施用疫苗超过四次。在另一个实施方式中，施用疫苗多次。在另一个实施方式中，以规律的间隔施用疫苗，在一个实施方式中，该间隔可以是每天、每周、每两周、每3周或每个月。每种可能性代表本申请公开的一个独立实施方式。
技术人员应当理解，术语“受试者”可包括哺乳动物，包括需要治疗病症或其后遗症，或者易患病症或其后遗症的成年人类或人类儿童、少年或青少年，并且还可包括非人类哺乳动物，如狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。还应理解，该术语可包括家畜。术语“受试者”不排除在所有方面都正常的个体。
在一个实施方式中，递送载体是指本申请公开的重组李斯特菌、本申请公开的编码一个或多个无义肽或新表位的核酸序列、本申请公开的包含一个或多个无义肽或新表位的重组多肽、本申请公开的编码一个或多个无义肽的核酸序列或本申请公开的包含一个或多个无义肽的重组多肽。
在另一个实施方式中，本申请公开的组合物包含至少一个递送载体，以及不同或相同的递送载体的任何组合。
在一个实施方式中，DNA分子或核酸序列分子是指一个或多个，但不限于，质粒或人工染色体，包含编码重组多肽的核酸序列，所述重组多肽包含一个或多个新表位。
在一个实施方式中，DNA分子或核酸序列分子是指一个或多个，但不限于，质粒或人工染色体，包含编码重组多肽的核酸序列，所述重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的新表位。
在一个实施方式中，DNA分子或核酸序列分子是指一个或多个，但不限于，质粒或人工染色体，包含编码重组多肽的核酸序列，所述重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述无义肽包含一个或多个新表位。
在一个实施方式中，本申请公开的个性化免疫疗法组合物包含一个或多个本申请公开的递送载体。在一个实施方式中，本申请公开的个性化免疫疗法组合物包含一个或多个以上公开的任何李斯特菌菌株。在另一个实施方式中，个性化免疫疗法组合物包含1-2、1-5、1-10、1-20或1-40个重组递送载体的混合物，每个载体表达一个或多个新表位。在另一个实施方式中，所述混合物包含多个递送载体(例如重组李斯特菌菌株)，每个递送载体包含一个或多个新表位的不同集合。如果第一集合新表位包含第二集合不包含的一个新表位，则所述第一集合新表位可以是不同于所述第二集合的。同样地，如果第一集合新表位不包含第二集合包含的一个新表位，则所述第一集合新表位可以是不同于所述第二集合的。例如，第一集合新表位和第二集合新表位可包含一个或多个相同的新表位并且仍然可以是不同的集，或者第一集合可由于不包含任何相同的新表位而不同于第二集合新表位。在另一个实施方式中，个性化免疫疗法组合物包含1-2、1-5、1-10、1-20或1-40个重组递送载体的混合物，每个载体表达一个或多个无义肽或其片段。每种可能性代表一个独立实施方式。
在另一个实施方式中，个性化免疫疗法组合物包含1-2、1-5、1-10、1-20或1-40个重组递送载体的混合物，每种载体表达在具有截短的LLO蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列的融合蛋白的背景下的一个或多个新表位。在一个实施方式中，存在于递送载体的混合物中的单独递送载体作为疗法的一部分同时施用于受试者。在另一个实施方式中，存在于递送载体的混合物中的单独递送载体作为疗法的一部分依次施用于受试者。每种可能性代表一个独立实施方式。
在一个实施方式中，本申请公开的包含一个或多个重组递送载体的免疫原性组合物通过本申请公开的方法产生。在一个实施方式中，本申请公开的包含一个或多个重组递送载体的组合物的免疫原性混合物通过本申请公开的方法产生。在另一个实施方式中，所述混合物中的每个所述递送载体包含核酸序列，所述核酸序列编码重组多肽或嵌合蛋白，所述重组多肽或嵌合蛋白包含一个或多个新表位。
本领域技术人员将理解，术语“重组递送载体”包括如本申请所述的重组李斯特菌菌株递送载体、多肽递送载体或DNA分子递送载体。
在另一个实施方式中，每个组合物的混合物包含1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-100个递送载体。每种可能性代表一个独立实施方式。
在一个实施方式中，本申请公开的包含一种或多种重组李斯特菌菌株的组合物的免疫原性混合物通过本申请公开的方法产生。在另一个实施方式中，混合物中所述李斯特菌中的每个包括至少一个核酸序列，所述至少一个核酸序列编码重组多肽或嵌合蛋白，所述重组多肽或嵌合蛋白包含一个或多个新表位。在另一个实施方式中，每个混合物包含1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40或40-50或50-100个重组李斯特菌菌株。每种可能性代表独立实施方式。
在另一个实施方式中，所述组合物包含多种李斯特菌菌株或李斯特菌菌株的组合，其中每个菌株包含核酸构建体，所述核酸构建体包含一个或多个开放阅读框，所述一个或多个开放阅读框编码一个或多个包含至少一个新表位的肽。在另一个实施方式中，所述组合物包含多种李斯特菌菌株或李斯特菌菌株的组合，其中每个菌株包含核酸构建体，所述核酸构建体包含一个或多个开放阅读框，所述一个或多个开放阅读框编码一个或多个包含一个或多个新表位的无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，组合物可包含多个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含至少两个不同的新表位氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述组合物表达至少两个不同的新表位氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述组合物包含新表位，范围为约1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-1000个新表位。每种可能性代表独立实施方式。在另一个实施方式中，所述组合物包含新表位，范围为约50-100个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含新表位，范围为约1-100个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含超过约100个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约10个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约20个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约50个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约100个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约500个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含最多约1000个新表位。在另一个实施方式中，所述组合物包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个新表位。每种可能性代表独立实施方式。在另一个实施方式中，所述组合物包含约51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个新表位。每种可能性代表独立实施方式。
在一个实施方式中，任何包含本申请所述的李斯特菌菌株的组合物可用本申请公开的方法中。
在另一个实施方式中，所述组合物还包含至少一个免疫调节分子，其中所述分子选自下组：干扰素γ、细胞因子、趋化因子、T细胞刺激剂以及其任何组合。
在一个实施方式中，向患有所述疾病或病症的受试者施用李斯特菌菌株产生针对受试者的疾病或病症的免疫应答。在另一个实施方式中，李斯特菌菌株是针对所述受试者的个性化免疫疗法载体，其针对所述受试者的疾病或病症。在另一个实施方式中，所述个性化免疫疗法增加患有疾病或病症的受试者的存活时间。在另一个实施方式中，所述个性化免疫疗法减小患有疾病或病症的受试者的肿瘤大小或转移大小。在另一个实施方式中，所述个性化免疫疗法预防患有疾病或病症的受试者中的转移。
在一个实施方式中，用于增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法包括向所述受试者施用本申请通篇公开的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施方式中，用于增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法包括向所述受试者施用本申请公开的个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种增加患有癌症或患有肿瘤的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用本申请所述的包括重组李斯特菌疫苗菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌疫苗菌株包括核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含与一个或多个新表位或无义肽或其片段融合的截短的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述无义肽或其片段包含一个或多个新表位。
在另一个实施方式中，增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法包括向所述受试者施用本申请公开的包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种用于增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包括至少一种重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述至少一种重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，引发患有疾病或病症的受试者中的个性化靶向免疫应答的方法包括向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物的步骤，其中所述免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种引发患有疾病或病症的受试者中的个性化靶向免疫应答的方法，其中所述免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的组织中的新表位，所述方法包括向所述受试者施用包括至少一种重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述至少一个菌株包含至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在一个实施方式中，引发针对存在于患有疾病或病症的受试者中的患有所述疾病或病症的组织或细胞中的至少一个新表位的免疫应答的方法包括向所述受试者施用本申请公开的个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤。
在一个实施方式中，引发患有疾病或病症的受试者中的靶向免疫应答的方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物或疫苗，其中施用所述李斯特菌菌株产生针对所述受试者的疾病或病症的个性化免疫疗法。
在一个实施方式中，治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法包括向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施方式中，治疗、压制或抑制受试者中的疾病或病症的方法包括施用本申请所述的个性化免疫疗法或疫苗用于靶向所述疾病或病症的步骤。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用包括至少一种重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述至少一种重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，方法包括治疗受试者中的肿瘤或癌症或感染或感染性疾病，其包括向所述受试者施用本申请公开的包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施方式中，提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法包括向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物的步骤，其中所述效应T细胞靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种提高受试者脾脏和肿瘤微环境中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，其包括施用本申请公开的免疫原性组合物。在另一个实施方式中，提高受试者脾脏和肿瘤微环境中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率使得所述受试者中可以实现更明显的抗肿瘤应答。
在另一个实施方式中，提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法包括向所述受试者施用本申请公开的个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤。其中所述效应T细胞被向存在于受试者的患有疾病或病症的组织中的新表位。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，其中所述效应T细胞靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的组织中的新表位，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括至少一种重组李斯特菌菌株，所述至少一种重组李斯特菌菌株包含至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，效应T细胞包含CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施方式中，效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施方式中，效应T细胞包含CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施方式中，效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施方式中，调节性T细胞是CD4+FoxP3+T细胞。
在另一个实施方式中，免疫应答是T细胞应答。在另一个实施方式中，T细胞应答是CD4+FoxP3-T细胞应答。在另一个实施方式中，T细胞应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施方式中，T细胞应答是CD4+FoxP3-T和CD8+T细胞应答。
在施用本申请公开的免疫原性组合物后，本申请公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤位点处存在的效应T细胞增加。在另一个实施方式中，本申请公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。技术人员将理解，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施方式中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施方式中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施方式中，效应T细胞比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。
在一个实施方式中，增加受试者中新表位特异性T细胞的方法包括向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种增加受试者中新表位特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含至少一种重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述至少一种重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含所述一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种增加患有癌症或患有肿瘤的受试者中抗原特异性T细胞的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物，其中所述融合多肽包含与一个或多个新表位或包含一个或多个新表位的无义肽或其片段融合的截短的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在另一个实施方式中，用于增加受试者中抗原特异性T细胞的方法包括向所述受试者施用个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤，其中所述重组多肽包含一个或多个新表位或无义肽或其片段。
在另一个实施方式中，用于增加受试者中抗原特异性T细胞的方法包括向所述受试者施用本申请公开的包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施方式中，减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法包括向所述受试者施用本申请所述的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施方式中，本申请公开了一种减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用包含至少一种重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述至少一种重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含所述一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，保护受试者使其免于感染性疾病的方法包括向所述受试者施用本申请公开的个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤。
在另一个实施方式中，保护受试者使其免于肿瘤或癌症的方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施方式中，抑制或延迟受试者中癌症发作的方法包括向所述受试者施用本申请公开的个性化免疫疗法组合物或疫苗的步骤。
在一个实施方式中，所述方法引发个性化的抗癌症或抗肿瘤免疫应答。
在一个实施方式中，本申请公开了一种引发受试者中增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用有效量的包含重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含所述一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包含至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包含一个或多个免疫原性新表位，其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品，并且其中所述方法还包括施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含免疫检查点抑制剂拮抗剂。
在一个实施方式中，本申请公开了一种引发受试者中增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用有效量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括重组李斯特菌疫苗菌株，所述重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含与一个或多个新表位或包含一个或多个新表位的无义肽或其片段融合的截短的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含免疫检查点抑制剂拮抗剂。
在一个实施方式中，所述组合物包含一个或多个检查点抑制剂。在另一个实施方式中，检查点抑制剂可包含一个或多个抗体。在另一个实施方式中，一个或多个抗体可包含抗PD-L1/PD-L2抗体或其片段；抗PD-1抗体或其片段；抗CTLA-4抗体或其片段；抗B7-H4抗体或其片段；以及其任何组合。其他免疫检查点抑制剂拮抗剂包括PD-1信号转导通路抑制剂、CD-80/86和CTLA-4信号转导通路抑制剂、T细胞膜蛋白3(TIM3)信号转导通路抑制剂、腺苷A2a受体(A2aR)信号转导通路抑制剂、淋巴细胞活化基因3(LAG3)信号转导通路抑制剂、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)信号转导通路抑制剂、CD40信号转导通路抑制剂，或任何其他抗原呈递细胞/T细胞信号转导通路抑制剂。
在一个实施方式中，所述组合物包含一个或多个T细胞刺激剂，如与T细胞受体共刺激分子结合的抗体或其功能片段、结合抗原呈递细胞受体的共刺激分子，或TNF受体超家族的成员。T细胞受体共刺激分子可包括例如CD28或ICOS。结合抗原呈递细胞受体的共刺激分子可包括例如CD80受体、CD86受体或CD46受体。TNF受体超家族成员可包括例如糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。参见例如WO2016100929、WO2016011362和WO2016011357，其各自出于所有目的通过引用整体并入本申请。
在一个实施方式中，本申请公开的组合物的重复施用(剂量)可在第一疗程后立即进行，或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施方式中，重复剂量可在第一疗程后立即进行，或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法，如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、或肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施方式中，本申请公开了用于预防、治疗表达异源抗原的肿瘤并针对该肿瘤进行疫苗接种，并且诱导对异源抗原的次优势表位的免疫应答，同时防止肿瘤的逃逸突变的方法和组合物。
在一个实施方式中，用于预防、治疗表达异源性抗原的肿瘤和针对所述肿瘤进行疫苗接种的方法和组合物包括使用截短的李斯特菌溶血素(tLLO)蛋白。在另一个实施方式中，本申请公开的方法和组合物包含过度表达tLLO的重组李斯特菌。在另一个实施方式中，tLLO从李斯特菌中的质粒表达。
在一个实施方式中，术语“治疗”是指治愈疾病。在另一个实施方式中，“治疗”是指防止疾病。在另一个实施方式中，“治疗”是指减少疾病的发生。在另一个实施方式中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施方式中，“治疗”是指提高患者的无进展存活期或总体存活期。在另一个实施方式中，“治疗”是是指稳定疾病的进展。在另一个实施方式中，“治疗”是指诱导缓解。在另一个实施方式中，“治疗”是指减缓疾病的进展。在另一个实施方式中，“治疗”尤其是指延缓进展、加速缓解、诱导缓解、加强缓解、加速恢复、增加替代疗法的效力或降低对替代疗法的抗性，或其组合。在另一个实施方式中，术语“减少”、“压制”和“抑制”是指减轻或降低。在另一个实施方式中，所述术语“压制”和“抑制”是指预防性的(prophylactic)或预防性的(preventative)措施，其中目的是预防或减轻如上所述的目标病理状况或疾病。在另一个实施方式中，治疗可包括直接影响或治愈疾病、紊乱或病症和/或相关症状，同时压制或抑制可包括预防疾病、紊乱或病症、减轻其严重性、延迟其发作、减轻与其相关的症状，或其组合。在一个实施方式中，“预防(prophylaxis)”，“预防性(prophylactic)”、“预防(preventing)”或“抑制”尤其是指延迟症状的发作、预防疾病复发、减少复发事件的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期，或其组合。在一个实施方式中，“压制”尤其是指减轻症状的严重程度、减轻急性发作的严重程度、减少症状的数量、减少疾病相关症状的发生、减少症状的潜伏期、改善症状、减轻继发症状、减少继发感染、延长患者存活期或其组合。每种可能性可代表独立实施方式。
在一个实施方式中，以治疗有效量施用疫苗、组合物或重组李斯特菌菌株。技术人员将理解，当提及肿瘤的治疗时，术语“治疗有效量”包括能够引起以下一种或多种作用的量：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全生长停滞；(2)减少肿瘤细胞数量；(3)减小肿瘤细胞大小；(4)抑制(即减少、减缓或完全停止)肿瘤细胞浸润到外周器官中；(5)抑制(即减少、减缓或完全停止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，其可以但不一定导致肿瘤的消退或排斥；和/或(7)在某种程度上减轻与病症相关的一种或多种症状。本申请公开的用于治疗肿瘤的疫苗的“治疗有效量”可凭经验和以常规方式确定。
在另一个实施方式中，诱导受试者中肿瘤消退的方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施方式中，降低肿瘤或癌症发生或复发的方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施方式中，压制受试者中肿瘤形成的方法包括包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施方式中，诱导受试者中癌症消退的方法包括向所述受试者施用本申请公开的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施方式中，所述方法包括将重组李斯特菌与另外的疗法共同施用的步骤。在另一个实施方式中，所述另外的疗法是手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法、基于抗体的免疫疗法或其组合。在另一个实施方式中，所述另外的疗法在施用重组李斯特菌之前进行。在另一个实施方式中，所述另外的疗法在施用重组李斯特菌之后进行。在另一个实施方式中，所述另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施方式中，所述重组李斯特菌以增大剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将理解，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子而进一步增强，所述细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α和本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，其中的一些可见于美国专利序列号6,991,785，其通过引用并入本申请。
在一个实施方式中，本申请公开的方法还包将本申请公开的免疫原性组合物与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通路抑制剂共同施用的步骤。用于本申请公开的IDO通路抑制剂包括任何本领域已知的IDO通路抑制剂，其包括但不限于1-甲基色氨酸(1MT)、1-甲基色氨酸(1MT)、Necrostatin-1、吡哆醛异烟腙、依布硒啉、5-甲基吲哚-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗体或小分子IDO抑制剂。在另一个实施方式中，本申请公开的组合物和方法还可与化疗或放疗方案联合使用或在此之前或之后使用。在另一个实施方式中，IDO抑制增强化疗剂的功效。
在一个实施方式中，本申请公开了一种引发受试者中的个性化抗肿瘤应答的方法，所述方法包括向所述受试者同时或依次施用本申请公开的免疫原性混合物组合物的步骤。在另一个实施方式中，本申请公开了一种预防或治疗受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者同时或依次施用本申请公开的免疫原性混合物组合物的步骤。在一个实施方式中，包含选自所述组合物混合物的至少一种重组李斯特菌菌株的组合物可与选自所述组合物混合物的至少另一种重组李斯物菌菌株同时(即在相同的药剂中)、并行(即以任何顺序一个接一个地施用的单独的药物中)或以任何顺序依次施用。当包含本申请公开的重组李斯特菌菌株的药物物质呈不同剂型(一种药剂是片剂或胶囊剂并且另一种药剂是无菌液体)和/或以不同的给药方案施用，例如来自所述包含一种李斯特菌菌株的组合物混合物的一种组合物至少每天施用一次，并且另一种组合物以较低频率施用，如一周一次、两周一次或3周一次时，依序施用是特别有用的。
在另一个实施方式中，所述个性化免疫疗法组合物引发针对一个或多个新表位的免疫应答。在另一个实施方式中，所述个性化免疫疗法组合物引发针对一个或多个无义肽或其片段的免疫应答。
为了治疗患有自身免疫疾病的受试者，本申请公开了免疫原性组合物和识别自身反应性新表位的方法，其中所述方法包括使患有自身免疫疾病的受试者具有针对这些自身反应性新表位免疫以诱导抗体或免疫抑制细胞(例如Treg或MDSC)介导的耐受性的方法。
在一个实施方式中，自身免疫疾病包括全身性自身免疫疾病。术语“全身性自身免疫疾病”是指由影响超过一种器官的自身免疫反应导致的疾病、病症或症状的组合。在另一个实施方式中，全身性自身免疫疾病包括但不限于抗GBM肾炎(Goodpasture氏疾病)、肉芽肿病伴随多血管炎(GPA)、显微镜下多血管炎(MPA)、全身性红斑狼疮(SLE)、多肌炎(PM)或乳糜泻。
在一个实施方式中，自身免疫疾病包含结缔组织疾病。技术人员将理解，术语“结缔组织疾病”包括由影响身体结缔组织的自身免疫反应导致的疾病、病症或症状的组合。在另一个实施方式中，结缔组织疾病包括但不限于全身性红斑狼疮(SLE)、多肌炎(PM)、全身性硬化或混合型结缔组织疾病(MCTD)。
在一个实施方式中，本申请公开了其他非肿瘤或非癌性疾病，包括可从其获得患有疾病的生物样品以用于根据本文所提供的方法进行分析的器官移植排斥。在另一个实施方式中，所排斥的器官是实体器官，包括但不限于心脏、肺、肾、肝、胰腺、肠、胃、睾丸、角膜、皮肤、心脏瓣膜、血管或骨。在另一个实施方式中，所排斥的器官包括但不限于血液组织、骨髓或朗格汉斯胰岛细胞。
为了治疗患有移植器官排斥或经历移植物抗宿主病(GVhD)的受试者，在一个实施方式中，本申请公开了识别自身反应性新表位的方法，其中所述方法包括使患有自身免疫疾病的受试者针对这些自身反应性新表位免疫以诱导抗体或免疫抑制细胞(例如Treg或MDSC)介导的耐受性的方法。
在一个实施方式中，本申请所述的方法还包括施用强化治疗。在另一个实施方式中，施用引发受试者中的个性化增强的抗感染性疾病免疫应答。在另一个实施方式中，施用引发受试者中的增强的抗感染性疾病或抗病症的个体化免疫应答。在另一个实施方式中，所述方法引发抗癌症或抗肿瘤的个性化免疫应答。在另一个实施方式中，方法还包括用包含本申请公开的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施方式中，方法还包括施用强化剂量的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本申请公开的重组李斯特菌菌株。在另一个实施方式中，所述强化包括本申请所述的一个或多个DNA分子/核酸序列/核酸构建体/核酸载体。在另一个实施方式中，所述强化包含本申请所述的一个或多个重组多肽/嵌合蛋白/肽/融合蛋白。
在另一个实施方式中，所述强化包含至少一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，所述强化包含至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，所述强化包含一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，所述强化包含一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包含一个或多个免疫原性新表位，其中所述新表位中的一个或多个由包含至少一个突变的源核酸序列编码，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法还包括用本申请公开的重组李斯特菌菌株或抗体或其功能性片段强化受试者的步骤。在另一个实施方式中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施方式中，强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施方式中，用于强化接种的抗体与用于初始的“初免”接种的抗体结合相同的抗原。在另一个实施方式中，强化抗体不同于初免抗体。
在另一个实施方式中，初免和强化接种使用相同的剂量。在另一个实施方式中，强化使用较大剂量。在另一个实施方式中，强化使用较小剂量。
在另一个实施方式中，本申请公开的方法还包括向受试者施用强化疫苗接种的步骤。在一个实施方式中，强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施方式中，单将强化疫苗接种在初免疫苗接种之后施用。在另一个实施方式中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种之后施用。在另一个实施方式中，3次强化疫苗在初免疫苗接种之后施用。
在另一个实施方式中，所述强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用强化免疫原性组合物的步骤。在一个实施方式中，所述强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施方式中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施方式中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施方式中，3次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施方式中，包含本申请公开的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员通过实验方法确定。在另一个实施方式中，剂量由技术人员通过实验方法确定。在另一个实施方式中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施方式中为2周，在另一个实施方式中为3周，在另一个实施方式中为4周，在另一个实施方式中为5周，在另一个实施方式中为6-8周，在又一个实施方式中，强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。
异源“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider等，Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.，Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的最有效方式。ShiverJ.W.等，Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等，Strain 20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等，Strain 19:95-102(2000)；Sin,J.I.等，DNA Cell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据表明，当以HIV gag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIV gag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL 1005泊洛沙姆(12kDa，5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-ga强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等，Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请公开号US2002/0165172 A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利号6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10或3-7天内施用多核苷酸和多肽。所有上述参考文献均通过引用整体并入本申请。
在一个实施方式中，本申请公开包括的处理方案是治疗性的。在另一实施例中，所述方案是预防性的。在另一个实施方式中，如技术人员将理解的，将本申请公开的组合物用于保护因为家族性遗传或其他情况使其易于罹患如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的人们免于这些类型的疾病的风险。在另一个实施方式中，本申请公开的免疫疗法或疫苗在通过外科手术、常规化学疗法或放射疗法摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在这些治疗之后，施用免疫疗法或疫苗，以使得对免疫疗法的肿瘤抗原的CTL应答破坏剩余的转移瘤并延长癌症的缓解。在另一个实施方式中，将免疫疗法或疫苗用于影响先前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。
在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列用于提供治疗性抗肿瘤或抗癌T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地活化抗肿瘤或抗癌适应性免疫应答。在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列用于提供治疗性抗自身免疫疾病T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地活化抗自身免疫疾病适应性免疫应答。在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列用于提供治疗性抗感染性疾病T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地活化抗感染性疾病适应性免疫应答。在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列用于提供治疗性抗器官移植排斥T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一个或多个新表位序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地活化抗器官移植排斥适应性免疫应答。
在另一个实施方式中，其中免疫原性应答的存在与一个或多个免疫原性新表位的存在相关。在另一个实施方式中，重组李斯特菌包含编码新表位的核酸，所述新表位包含T细胞表位或适应性免疫应答表位或其任何组合。
在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一种或多种无义肽序列用于提供治疗性抗肿瘤或抗癌T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，使用包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一种或多种无义肽序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地活化抗肿瘤或抗癌适应性免疫应答。在另一个实施方式中，一种或多种无义肽序列用于提供治疗性抗自身免疫疾病T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，一种或多种无义肽序列用于活化抗自身免疫疾病适应性免疫应答。在另一个实施方式中，一种或多种无义肽序列用于提供治疗性抗感染性疾病T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，一种或多种无义肽序列用于活化抗感染性疾病适应性免疫应答。在另一个实施方式中，一种或多种无义肽序列用于提供治疗性抗器官移植排斥T细胞免疫应答。在另一个实施方式中，包含在肽、重组多肽或融合多肽中的一种或多种无义肽序列提供了一种靶向免疫疗法，在某些实施方式中，所述靶向免疫疗法治疗性地用于活化抗器官移植排斥适应性免疫应答。
在另一个实施方式中，免疫原性应答的存在与一个或多个免疫原性无义肽的存在相关。在另一个实施方式中，重组李斯特菌包含编码一个或多个无义肽或其片段的核酸，所述一个或多个无义肽或其片段包含T细胞表位或适应性免疫应答表位或其任何组合。
除非上下文另外明确指出，否则用于本申请的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
本申请的各个实施方式在本申请通篇可以以范围的形式表示。应理解，以范围形式描述仅是出于方便和简洁，而不应认为是对本申请公开范围的呆板限制。因此，对范围的描述应认为是已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应理解为已具体公开了如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。这种适用性与范围的广度无关。
每当在本申请中指出数值范围时，其旨在包括所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”和“从”第一指定数“至”第二指定数的“范围”在本申请中可互换使用，旨在包括第一和第二指定数以及它们之间的所有分数和整数。
技术人员将理解，术语“方法”包括用于实现给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的，或者易于从已知的方式、手段、技术和工序开发的方式、手段、技术和工序。
技术人员将理解，术语“多个”可包括大于1的整数。在一个实施方式中，该术语是指1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90或90-100的范围。每种可能性代表独立实施方式。
上文或下文引用的所有专利文件、网站、其他出版物、登录号等均出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的项目被特别地和单独地指示为通过引用并入。如果不同版本的序列与不同时间的登录号相关，则意味着与本申请的有效提交日期的登录号相关的版本。有效提交日期意指实际提交日期或在适用时关于登录号的优先权申请的提交日期之前。同样，如果不同版本的出版物、网站或类似文献在不同时间出版，则除非另外说明，否则意味着最近在本申请的有效提交日期公开的版本。除非另外特别指出，否则本申请的任何特征、步骤、要素、实施方式或方面可与任何其他特征、步骤、要素、实施方式或方面组合使用。尽管已经出于明确和易于理解的目的通过说明和示例的方式较详细地描述了本申请，但是显而易见的是，可在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。
实施方式列表
本申请公开的主题包括但不限于以下实施方式。
1.一种重组李斯特菌菌株，所述重组李斯特菌菌株包括至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
2.根据实施方式1所述的重组李斯特菌菌株，其中将所述移码突变与健康生物样品的源核酸序列进行比较。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述至少一个移码突变包含多个移码突变，并且所述多个移码突变存在于所述重组李斯特菌菌株中的相同基因中。
4.根据实施方式1-2中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述至少一个移码突变包含多个移码突变，并且所述多个移码突变不存在于所述重组李斯特菌菌株中的相同基因中。
5.根据实施方式1-6中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述至少一个移码突变位于基因的外显子编码区内。
6.根据实施方式7所述的重组李斯特菌菌株，其中所述外显子是所述基因的最后一个外显子。
7.根据实施方式1-8中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个无义肽中的每个的长度为约60-100个氨基酸。
8.根据实施方式1-9中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个无义肽在所述患有疾病或病症的生物样品中表达。
9.根据实施方式1-10中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个无义肽不编码翻译后切割位点。
10.根据实施方式1-11所述的重组李斯特菌菌株，其中所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。
11.根据实施方式1-12中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个新表位包含T细胞表位。
12.根据实施方式1-13中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个新表位包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关的新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性的新表位。
13.根据实施方式14所述的重组李斯特菌菌株，其中所述肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤、宫颈癌或肿瘤、表达Her2的癌症或肿瘤、黑素瘤、胰腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、胃癌或肿瘤、胰腺癌病变、肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤、结肠直肠腺癌、肺鳞状腺癌、胃腺癌、卵巢表面上皮肿瘤、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌或肿瘤、头颈癌或肿瘤、前列腺癌、肾癌或肿瘤、骨癌或肿瘤、血癌或脑癌或肿瘤，或所述癌症或所述肿瘤中任何一种的转移。
14.根据实施方式1-15中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个包含一个或多个新表位的无义肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
15.根据实施方式1-16中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述重组李斯特菌表达并分泌所述一个或多个重组多肽。
16.根据实施方式1-17中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中每个所述重组多肽包含约1-20个所述新表位。
17.根据实施方式1-18中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。
18.根据实施方式1-17中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个无义肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作地连接的无义肽或其片段，并且其中所述免疫原性多肽与所述多个无义肽或其片段中的一个融合。
19.根据实施方式18所述的重组李斯特菌菌株，其中所述免疫原性多肽与所述N末端无义肽可操作地连接。
20.根据实施方式22所述的重组李斯特菌菌株，其中所述接头是肽键。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个重组多肽与C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。
23.根据实施方式22所述的重组李斯特菌菌株，其中所述接头序列编码4X甘氨酸接头。
24.根据实施方式22-23中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述标签选自下组：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。
25.根据实施方式22-24中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列在编码所述标签的序列后包含2个终止密码子。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：pHly-tLLO-[无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述无义肽或其片段的长度为21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
27.根据实施方式26所述的重组李斯特菌菌株，其中所述无义肽或其片段可以相同或不同。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述至少一个核酸序列被整合到所述李斯特菌基因组中。
29.根据实施方式1-27中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述至少一个核酸序列位于质粒中。
30.根据实施方式29所述的重组李斯特菌菌株，其中在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述李斯特菌菌株中。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株是减毒李斯特菌菌株。
32.根据实施方式31所述的重组李斯特菌菌株，其中所述减毒李斯特菌包含一个或多个内源性基因的突变。
33.根据实施方式32所述的重组李斯特菌菌株，其中所述内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dal基因双突变，或dal/dat/actA基因三突变或其组合。
34.根据实施方式32-33中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述突变包含基因的失活、截短、缺失、置换或破坏。
35.根据实施方式1-34中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述至少一个核酸序列还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，或者其中所述李斯特菌菌株包含第二核酸序列，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。
36.根据实施方式35所述的重组李斯特菌菌株，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
37.根据实施方式1-36中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株是单核细胞增多性李斯特菌。
38.根据实施方式1-37中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中通过比较从所述患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF，获得所述无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列内的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的所述核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自所述患有疾病的生物样品的所述一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
39.根据实施方式1-38中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述患有疾病的生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。
40.根据实施方式2和38中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述健康生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。
41.根据实施方式1-40中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述生物样品包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
42.根据实施方式1-41中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述无义肽通过以下方式表征新表位：
(ii)从所述无义肽产生一种或多种不同的肽序列；和任选地，
(ii)筛选和选择每个(i)中产生的肽与MHC I类或MHC II类分子的结合，所述MHCI类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
43.根据实施方式1-42中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述重组李斯特菌还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一种或多种与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一种或多种肽包括一个或多个免疫原性新表位。
44.根据实施方式43所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一种或多种肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作地连接的肽或其片段，并且所述免疫原性多肽与所述一种或多种肽或其片段中的一个融合。
45.根据实施方式43-44中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
46.根据实施方式43-45中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述一个或多个重组多肽与所述C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。
47.根据实施方式46所述的重组李斯特菌菌株，其中所述接头序列编码4X甘氨酸接头。
48.根据实施方式46-47中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中所述标签选自下组：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。
49.根据实施方式46-48中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列在编码所述标签的序列后包含2个终止密码子。
50.根据实施方式43-49中任一项所述的重组李斯特菌菌株，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：pHly-tLLO-[肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述肽或其片段的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
51.根据实施方式50所述的重组李斯特菌菌株，其中所述肽或片段包含不同的氨基酸序列。
52.一种免疫原性组合物，其包含根据实施方式1-51中任一项所述的李斯特菌菌株中任一个的至少一个。
53.根据实施方式52所述的免疫原性组合物，其还包含其他佐剂。
54.根据实施方式53所述的免疫原性组合物，其中所述其他佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或未甲基化的含CpG寡核苷酸。
55.一种引发患有疾病或病症的受试者中的个性化靶向免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述个性化免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
56.一种治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物。
57.一种提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述效应T细胞靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
58.一种增加受试者中新表位特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物。
59.一种增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物。
60.一种减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式52-54中任一项所述的免疫原性组合物。
61.根据实施方式52-54中任一项所述的方法，其还包括施用强化治疗。
62.根据实施方式52-54中任一项所述的方法，其中所述施用在所述受试者中引发个性化增强的抗感染性疾病免疫应答。
63.根据实施方式52-54中任一项所述的方法，其中所述方法引发个性化的抗癌症或抗肿瘤免疫应答。
64.一种免疫疗法递送载体，所述免疫疗法递送载体包含至少一个核酸序列，每个核酸序列编码一个或多个重组多肽，所述一个或多个重组多肽包括一个或多个与免疫原性多肽融合的无义肽或其片段，其中所述一个或多个无义肽由源核酸序列编码，所述源核酸序列包括至少一个移码突变，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个包括一个或多个免疫原性新表位，并且其中所述源获取自受试者的患有疾病或病症的生物样品。
65.根据实施方式64所述的免疫疗法递送载体，其中将所述移码突变与健康生物样品的源核酸序列进行比较。
66.根据实施方式64-65中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述至少一个移码突变包含多个移码突变，并且所述多个移码突变存在于所述重组李斯特菌中的相同基因中。
67.根据实施方式64-65中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述至少一个移码突变包含多个移码突变，并且所述多个移码突变不存在于所述重组李斯特菌中的相同基因中。
68.根据实施方式64-67中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述至少一个移码突变位于基因的外显子编码区内。
69.根据实施方式68所述的免疫疗法递送载体，其中所述外显子是所述基因的最后一个外显子。
70.根据实施方式64-69中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个无义肽中的每个的长度为约60-100个氨基酸。
71.根据实施方式64-70中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个无义肽在所述患有疾病或病症的生物样品中表达。
72.根据实施方式64-71中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个无义肽不编码翻译后切割位点。
73.根据实施方式64-72所述的免疫疗法递送载体，其中所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。
74.根据实施方式64-73中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个新表位包含T细胞表位。
75.根据实施方式64-74中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个新表位包含与所述疾病或病症相关的自身抗原，其中所述自身抗原包含癌症或肿瘤相关的新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性的新表位。
76.根据实施方式75所述的免疫疗法递送载体，其中所述肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤、宫颈癌或肿瘤、表达Her2的癌症或肿瘤、黑素瘤、胰腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、胃癌或肿瘤、胰腺癌病变、肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤、结肠直肠腺癌、肺鳞状腺癌、胃腺癌、卵巢表面上皮肿瘤、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌或肿瘤、头颈癌或肿瘤、前列腺癌、肾癌或肿瘤、骨癌或肿瘤、血癌或脑癌或肿瘤，或所述癌症或肿瘤中任何一种的转移。
77.根据实施方式64-76中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中包含一个或多个新表位的所述一个或多个无义肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
78.根据实施方式64-77中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组李斯特菌表达并分泌所述一个或多个重组多肽。
79.根据实施方式64-78中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个无义肽或其片段中的每个与免疫原性多肽融合。
80.根据实施方式64-79中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个无义肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作地连接的无义肽或其片段，并且所述免疫原性多肽与所述多个无义肽或其片段中的一个融合。
81.根据实施方式80所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫原性多肽与所述N末端无义肽可操作地连接。
82.根据实施方式81所述的免疫疗法递送载体，其中所述接头是肽键。
83.根据实施方式64-82中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
84.根据实施方式64-83中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个重组多肽与所述C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。
85.根据实施方式84所述的免疫疗法递送载体，其中所述接头序列编码4X甘氨酸接头。
86.根据实施方式84-85中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述标签选自：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。
87.根据实施方式84-86中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列在编码所述标签的序列后包含2个终止密码子。
88.根据实施方式64-87中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：pHly-tLLO-[无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-无义肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述无义肽或其片段的长度为21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
89.根据实施方式64-88中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中通过比较从所述患有疾病的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF，得到所述无义肽，其中所述比较识别了所述核酸序列内的一个或多个移码突变，其中包含所述突变的所述核酸序列编码一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含在来自所述患有疾病的生物样品的所述一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位。
90.根据实施方式64-89中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述患有疾病的生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。
91.根据实施方式65和89中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述健康生物样品获取自患有所述疾病或病症的所述受试者。
92.根据实施方式64-91中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述生物样品包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
93.根据实施方式64-92中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述无义肽通过以下方式表征新表位：
(i)从所述无义肽产生一种或多种不同的肽序列；和任选地，
(ii)筛选和选择每个(i)中产生的肽中与MHC I类或MHC II类分子的结合，所述MHC I类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
94.根据实施方式64-93中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫疗法递送载体还包括至少一个编码一个或多个重组多肽的核酸序列，所述一个或多个重组多肽包括一种或多种与免疫原性多肽融合的肽，其中所述一种或多种肽包括一个或多个免疫原性新表位。
95.根据实施方式94所述的免疫疗法递送载体，其中所述一种或多种肽或其片段从N末端到C末端包含多个可操作地连接的肽或其片段，并且所述免疫原性多肽与所述一种或多种肽或其片段中的一个融合。
96.根据实施方式94-95中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫原性多肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
97.根据实施方式94-96中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个重组多肽与所述C末端处的标签可操作地连接，任选地通过接头序列连接。
98.根据实施方式97所述的免疫疗法递送载体，其中所述接头序列编码4X甘氨酸接头。
99.根据实施方式97-98中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述标签选自：6X组氨酸标签、SIINFEKL肽、与6X组氨酸可操作地连接的6X组氨酸标签以及其任何组合。
100.根据实施方式97-99中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列在编码所述标签的序列后包含2个终止密码子。
101.根据实施方式94-100中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中编码所述重组多肽的所述核酸序列编码以下组分：pHly-tLLO-[肽或其片段-甘氨酸接头(4x)-肽或其片段-甘氨酸接头(4x)]n-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子，其中所述肽或其片段的长度为约21个氨基酸，并且其中n＝1-20。
102.根据实施方式101所述的免疫疗法递送载体，其中所述肽或片段包含不同的氨基酸序列。
103.一种免疫原性组合物，其包含根据实施方式64-102中任一项所述的李斯特菌菌株中任一个的至少一个。
104.根据实施方式103所述的免疫原性组合物，其还包含其他佐剂。
105.根据实施方式104所述的免疫原性组合物，其中所述其他佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或未甲基化的含CpG寡核苷酸。
106.一种引发患有疾病或病症的受试者中的个性化靶向免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述个性化的免疫应答靶向一个或多个无义肽或其片段，所述一个或多个无义肽或其片段包含一个或多个存在于所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
107.一种治疗、压制、预防或抑制受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物。
108.一种提高受试者脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述效应T细胞靶向一个或多个无义肽，所述一个或多个无义肽包含一个或多个存在于受试者的患有疾病或病症的生物样品中的新表位。
109.一种增加受试者中新表位特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物。
110.一种增加患有肿瘤或患有癌症或患有感染性疾病的受试者的存活时间的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物。
111.一种减少受试者中肿瘤或转移灶大小的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用根据实施方式103-105中任一项所述的免疫原性组合物。
112.根据实施方式106-111中任一项所述的方法，其还包括施用强化治疗。
113.根据实施方式106-111中任一项所述的方法，其中所述施用引发所述受试者中的个性化增强的抗感染性疾病免疫应答。
114.根据实施方式106-111中任一项所述的方法，其中所述方法引发个性化的抗癌症或抗肿瘤免疫应答。
本申请公开的主题还包括但不限于以下实施方式。
1.一种包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个包含一个或多个免疫原性新表位的移码突变衍生肽。
2.根据实施方式1所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由包含至少一个疾病特异性或病症特异性移码突变的源核酸序列编码。
3.根据实施方式2所述的免疫疗法递送载体，其中所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。
4.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述至少一个移码突变位于基因的倒数第二个外显子或最后一个外显子内。
5.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽中每个的长度均为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500个氨基酸。
6.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽不编码翻译后切割位点。
7.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个免疫原性新表位包含T细胞表位。
8.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽包含癌症相关或肿瘤相关的新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。
9.根据实施方式8所述的免疫疗法递送载体，其中所述肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤、宫颈癌或肿瘤、表达Her2的癌症或肿瘤、黑素瘤、胰腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、胃癌或肿瘤、胰腺癌病变、肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤、结肠直肠腺癌、肺鳞状腺癌、胃腺癌、卵巢表面上皮肿瘤、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌或肿瘤、头颈癌或肿瘤、前列腺癌、肾癌或肿瘤、骨癌或肿瘤、血癌或脑癌或肿瘤，或所述癌症或肿瘤中任何一种的转移。
10.根据实施方式1-7中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
11.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽包含约1-20个新表位。
12.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个异源肽包含可操作地串联连接的多个异源肽，其中所述含PEST的肽与所述多个异源肽中的一个融合。
13.根据实施方式12所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽包含多个移码突变衍生肽，其中每个移码突变衍生肽是不同的。
14.根据实施方式12或13所述的免疫疗法递送载体，其中所述多个异源肽直接互相融合而没有间隔序列。
15.根据实施方式12或13所述的免疫疗法递送载体，其中所述多个异源肽通过一个或多个肽接头或一个或多个4x甘氨酸接头彼此可操作地连接。
16.根据实施方式12-15中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述含PEST的肽与所述N-末端异源肽可操作地连接。
17.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述含PEST的肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
18.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽的C末端与标签可操作地连接。
19.根据实施方式18所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽的C末端通过肽接头或4X甘氨酸接头与标签可操作地连接。
20.根据实施方式18或19所述的免疫疗法递送载体，其中所述标签选自：6X组氨酸标签、2x FLAG标签、3x FLAG标签、SIINFEKL肽、与SIINFEKL肽可操作地连接的6X组氨酸标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的3X FLAG标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的2X FLAG标签以及其任何组合。
21.根据实施方式18-20中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框在编码所述标签的序列后包含两个终止密码子。
22.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框与hly启动子可操作地连接，并且从N末端到C末端编码以下组分：tLLO-[异源肽]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中，n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽，
或其中所述编码重组多肽的开放阅读框与hly启动子可操作地连接，并且从N末端到C末端编码以下组分：tLLO-[(异源肽)-(甘氨酸接头(4x))]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽。
23.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个异源肽还包含一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽。
24.根据实施方式23所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽由包含至少一个疾病特异性或病症特异性非同义错义突变的源核酸序列编码。
25.根据实施方式23或24所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽中每个的长度均为约5-50个氨基酸或约为8-27个氨基酸。
26.根据任何前述实施方式所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫疗法递送载体是重组李斯特菌菌株。
27.根据实施方式26所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组李斯特菌菌株表达并分泌所述重组多肽。
28.根据实施方式26或27所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框被整合到李斯特菌基因组中。
29.根据实施方式26或27所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框位于质粒中。
30.根据实施方式29所述的免疫疗法递送载体，其中在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述重组李斯特菌菌株中。
31.根据实施方式26-30中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述李斯特菌菌株是减毒李斯特菌菌株。
32.根据实施方式31所述的免疫疗法递送载体，其中所述减毒李斯特菌包含一个或多个内源性基因的突变。
33.根据实施方式32所述的免疫疗法递送载体，其中所述内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dat基因双突变、dal/dat/actA基因三突变或其组合，并且所述突变包括基因的失活、截短、缺失、置换或破坏。
34.根据实施方式26-33中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中包含所述编码重组多肽的开放阅读框的所述核酸还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，或其中所述重组李斯特菌菌株还包含第二核酸，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。
35.根据实施方式34所述的免疫疗法递送载体，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
36.根据实施方式26-35中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
37.根据实施方式36所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组李斯特菌菌株包含actA、dal和dat中的缺失或失活突变，其中包含所述编码重组多肽的开放阅读框的所述核酸在游离型质粒中，并包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且所述含PEST的肽是LLO的N-末端片段。
38.一种免疫原性组合物，其包含至少一个根据实施方式1-37中任一项所述的免疫治疗递送载体。
39.根据实施方式38所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
40.根据实施方式49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A、未甲基化的含CpG寡核苷酸，或脱毒的非溶血形式的LLO(dtLLO)。
41.一种治疗、压制、预防或抑制受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方式38-40中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品的源核酸序列编码。
42.根据实施方式42所述的方法，其中所述方法引发所述受试者中的个性化的抗疾病或抗病症免疫应答，其中所述个性化的免疫应答针对一个或多个移码突变衍生肽。
43.根据实施方式41或42所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或肿瘤。
44.根据实施方式41-43中任一项所述的方法，其还包括施用强化治疗。
45.一个用于形成针对患有疾病或病症的受试者个性化的根据实施方式1-37中任一项所述的免疫疗法递送载体的方法，其包括：
(a)将从来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了编码一种或多种肽的一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含在来自所述患有疾病或病症的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个包含一个或多个移码突变，并编码包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个移码突变衍生肽；以及
(b)产生包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含所述一种或多种肽，所述肽包含步骤(a)中识别到的所述一个或多个免疫原性新表位。
46.根据实施方式45所述的方法，其还包括储存所述免疫疗法递送载体，以用于在预定的时间段内向所述受试者施用。
47.根据实施方式45或46所述的方法，其还包括向所述受试者施用包含所述免疫治疗载体的组合物，其中所述施用过程导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
48.根据实施方式45-47中任一项所述的方法，其中所述患有疾病或病症的生物样品来自患有所述疾病或病症的受试者。
49.根据实施方式45-48中任一项所述的方法，其中所述健康生物样品来自患有所述疾病或病症的受试者。
50.根据实施方式45-49中任一项所述的方法，其中所述患有疾病或病症的生物样品和所述健康生物样品各自包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
51.根据实施方式45-50中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述比较包括使用筛选测定或筛选工具及相关数字软件，用于将从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列中的所述一个或多个ORF与从所述健康生物样品中提取的所述核酸序列中的所述一个或多个ORF进行比较，
其中所述相关数字软件包括访问序列数据库，所述序列数据库允许筛选从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列中的所述ORF中的突变，用于识别所述新表位的免疫原性潜力。
52.根据实施方式45-51中任一项所述的方法，其中使用外显子组测序或转录组测序来确定从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列和从所述健康生物样品中提取的所述核酸序列。
53.根据实施方式45-52中任一项所述的方法，其中通过从所述一个或多个移码突变衍生肽产生一种或多种不同的肽序列来对所述一个或多个移码突变衍生肽进行新表位的表征。
54.根据实施方式53所述的方法，其还包括对所述一种或多种不同的肽序列中的每个进行评分，并且在肽序列评分不低于预测单核细胞增多性李斯特菌中分泌性的亲水性阈值的情况下排除所述肽序列。
55.根据实施方式54所述的方法，其中所述评分过程通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸窗来进行，且排除任何高于约1.6截止值的肽序列，或将其修改为低于所述截止值。
56.根据实施方式53-55中任一项所述的方法，其还包括筛选和选择每个所述一种或多种不同的肽序列中与MHC I类或MHC II类分子的结合，所述MHC I类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
57.根据实施方式45-56中任一项所述的方法，其中重复所述方法以产生多个免疫疗法递送载体，每个免疫疗法递送载体包含一组不同的一个或多个免疫原性新表位。
58.根据实施方式57所述的方法，其中所述多个免疫疗法递送载体包含2-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40或40-50个免疫疗法递送载体。
59.根据实施方式57或58所述的方法，其中所述多个免疫疗法递送载体的组合包含约5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或100-200个免疫原性新表位。
60.根据实施方式45-59中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是具有少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个在所述健康生物样品中不存在的非同义错义突变的肿瘤。
虽然本申请已说明和描述了某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到多种修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖所有这些修改和变化。
在以下实施例中，阐述了多个具体细节，以提供对本申请公开的透彻理解。在其他情况下，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
实施例
实施例1：构建减毒李斯特菌菌株-LmddΔactA并将人klk3基因同框插入Lmdd和Lmdda菌株中的hly基因。
材料和方法
开发了分泌融合到tLLO的PSA的重组Lm(Lm-LLO-PSA)，该重组Lm引起与前列腺癌小鼠模型中肿瘤消退相关的强PSA特异性免疫应答，其中tLLO-PSA的表达来源于基于pGG55的质粒(表1)，其赋予载体抗生素抗性。我们最近开发出基于pADV142质粒的PSA疫苗的新菌株，其不具有抗生素抗性标记并且称为LmddA-142(表1)。这种新菌株与Lm-LLO-PSA相比减毒10倍。另外，与Lm-LLO-PSA相比，LmddA-142具有稍高的免疫原性并且显著更有效地抑制表达PSA的肿瘤。
表1质粒和菌株。
质粒pAdv142(6523bp)的序列如SEQ ID NO:23所示。2008年2月20日在Genewiz实验室从大肠杆菌菌株对此质粒进行测序。
通过毒力因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。在Lmdaldat(Lmdd)背景下构建actA的框内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极性效应。Lm daldatΔactA含有ActA在N末端的前19个氨基酸和C末端的28个氨基酸残基，并缺失了591个氨基酸。
通过扩增对应于actA的上游(657bp-寡核苷酸的Adv 271/272)部分和下游(625bp-寡核苷酸的Adv 273/274)部分的染色体区域并且通过PCR接合而产生actA缺失突变体。用于该扩增的引物序列在表2中给出。actA的上游和下游DNA区域在EcoRI/PstI限制性位点克隆到pNEB193中，并且从该质粒中将EcoRI/PstI进一步克隆到温敏质粒pKSV7中，从而产生ΔactA/pKSV7(pAdv120)。
表2用于扩增actA的上游和下游DNA序列的引物序列。
引物 序列 SEQ ID NO:
Adv271-actAF1 cg GAATTCGGATCCgcgccaaatcattggttgattg 24
Adv272-actAR1 gcgaGTCGACgtcggggttaatcgtaatgcaattggc 25
Adv273-actAF2 gcgaGTCGACccatacgacgttaattcttgcaatg 26
Adv274-actAR2 gataCTGCAGGGATCCttcccttctcggtaatcagtcac 27
使用从外部结合至actA缺失区域的引物来验证从其染色体位置的基因缺失，所述引物在图1A和图1B中显示为引物3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc，SEQ ID NO:28)和引物4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO:29)。对分离自Lmdd和LmddΔactA的染色体DNA进行PCR分析。预期在Lmdd染色体DNA中两组不同的引物对1/2和3/4扩增以后的DNA片段的大小为3.0kb和3.4kb。另一方面，对于LmddΔactA，使用引物对1/2和3/4的PCR的预期大小为1.2kb和1.6kb。因此，图1A和图1B中的PCR分析确认actA的1.8kb区域在LmddΔactA菌株中缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区域在菌株LmddΔactA中的缺失。
实施例2：构建用Lm载体的与无需抗生素的用于抗原递送的游离型表达系统。
用Lm载体(pAdv142)的无需抗生素的用于抗原递送的游离型表达系统是下一代无抗生素质粒pTV3(Verch等，Infect Immun,2004.72(11):6418-25，其通过引用并入本申请)。由于李斯特菌菌株Lmdd在染色体中含有prfA基因的拷贝，因此将毒力基因转录激活因子的基因prfA从pTV3缺失。另外，在NheI/PacI限制性位点将p60-李斯特菌dal的盒置换为p60-枯草芽孢杆菌dal，从而产生质粒pAdv134(图2A)。李斯特菌和芽孢杆菌dal基因的相似性约为30％，从而实际上消除了质粒与Lmdd染色体中的dal基因的剩余片段之间重组的机会。质粒pAdv134含有抗原表达盒tLLO-E7。将LmddA菌株用pADV134质粒转化，并且通过Western印迹确认来自所选克隆的LLO-E7蛋白的表达(图2B)。来源于10403S野生型菌株的Lmdd系统缺乏抗生素抗性标记，但具有Lmdd链霉素抗性。
此外，将pAdv134用XhoI/XmaI限制以克隆人PSA，klk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv142(图2C，表1)含有在李斯特菌p60启动子控制下的芽孢杆菌dal(B-Dal)。穿梭质粒pAdv142在不存在外源性D-丙氨酸的情况下补偿大肠杆菌ala drx MB2159以及单核细胞增多性李斯特菌菌株Lmdd的生长。质粒pAdv142中的抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白组成(图2C)。
质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株，从而产生Lm-ddA-LLO-PSA。通过用抗LLO和抗PSA抗体的Western印迹确认了LLO-PSA融合蛋白经菌株Lm-ddA-LLO-PSA的表达和分泌(图2D)。在两次体内传代后，菌株Lm-ddA-LLO-PSA稳定表达并分泌LLO-PSA融合蛋白。
实施例3：菌株LmddA-LLO-PSA的体外和体内稳定性
通过在存在或不存在选择压力的情况下培养LmddA-LLO-PSA李斯特菌菌株8天来检验质粒的体外稳定性。菌株LmddA-LLO-PSA的选择压力是D-丙氨酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在脑-心输液(BHI)和BHI+100μg/ml D-丙氨酸中传代。在铺板于选择性(BHI)和非选择性(BHI+D-丙氨酸)培养基上之后每天测定CFU。预期在铺板于非选择性培养基(BHI+D-丙氨酸)上之后质粒损失将导致CFU较高。如图3A所示，选择性和非选择性培养基中的CFU数量之间不存在差异。这表明当实验终止时，质粒pAdv142稳定至少50代。
通过在C57BL/6小鼠中静脉内注射5×107个CFU LmddA-LLO-PSA来测定质粒体内维持。在24小时和48小时从在PBS中均质化的脾脏分离的活细菌。在BHI板和BHI+100mg/mlD-丙氨酸上测定各时间点的各样品的CFU。将脾细胞铺板于选择性和非选择性培养基之后，在24小时后回收菌落。由于这种菌株高度减毒，因此在体内24小时细菌负荷就会被清除。选择性和非选择性板上未检测到显著CFU差异，这表明重组质粒在所有分离的细菌中稳定存在(图3B)。
实施例4：菌株LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的体内传代、毒力和清除率
LmddA-142是一种重组李斯特菌菌株，其分泌游离型表达的tLLO-PSA融合蛋白。为了测定安全剂量，将小鼠用多种剂量的LmddA-LLO-PSA免疫并且测定毒性效应。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性效应(数据未示出)。结果表明小鼠良好耐受108个CFULmddA-LLO-PSA剂量。毒力研究表明菌株LmddA-LLO-PSA高度减毒。
测定在C57BL/6小鼠中腹膜内施用安全剂量108个CFU后LmddA-LLO-PSA的体内清除率。第2天后，在用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的肝脏和脾脏中不存在可检测的菌落。由于该菌株高度减毒，所以其在体内48小时会被完全清除(图4A)。
为了确定LmddA-LLO-PSA的减毒是否会减弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬细胞和胞内生长的能力，进行了细胞感染测定。将小鼠巨噬细胞样细胞系(如J774A.1)用李斯特菌构建体体外感染，并且对胞内生长进行定量。阳性对照菌株(野生型李斯特菌菌株10403S)在胞内生长，而prfA突变体阴性对照XFL7不能逃避吞噬溶酶体，因此不会在J774细胞中生长。LmddA-LLO-PSA的胞质内生长比10403S缓慢，这是由于该菌株失去从细胞扩散至细胞的能力(图4B)。结果表明LmddA-LLO-PSA具有感染巨噬细胞和胞质内生长的能力。
实施例5：菌株-LmddA-LLO-PSA在C57BL/6小鼠中的免疫原性
使用PSA四聚体染色来测定在C57BL/6小鼠中由构建体LmddA-LLO-PSA引发的PSA特异性免疫应答。小鼠以一周为间隔用LmddA-LLO-PSA免疫两次，并且在强化后第6天将脾细胞针对PSA四聚体染色。用PSA特异性四聚物对脾细胞的染色显示LmddA-LLO-PSA引发了23％的PSA四聚体+CD8+CD62L低细胞(图5A)。使用胞内细胞因子染色检查PSA特异性T细胞在用PSA肽刺激5小时后分泌IFN-γ的功能性能力。与未暴露的小鼠相比，LmrdA-LLO-PSA组中用PSA肽刺激的CD8+CD62L低IFN-γ分泌细胞的百分比增加200倍(图5B)，表明LmddA-LLO-PSA菌株具有很强的免疫原性，并且在脾脏中针对PSA引发高水平的功能活性PSA CD8+T细胞应答。
为了测定用LmddA-LLO-PSA免疫小鼠后而针对PSA产生的细胞毒性T细胞的功能活性，我们在体外测定中测试了PSA特异性CTL对用H-2Db肽脉冲处理的EL4细胞进行裂解的能力。使用基于FACS的半胱天冬酶测定(图5C)和铕释放(图5D)来测量细胞裂解。用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞含有对呈现PSA肽(作为靶抗原)的细胞具有高细胞溶解活性的CTL。
进行Elispot来测定效应T细胞在用抗原刺激24小时后分泌IFN-γ的功能性能力。使用ELISpot，观察到与未暴露的小鼠的脾细胞相比，来自用特异性肽刺激的LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞的IFN-γ斑点数增加20倍(图5E)。
实施例6：用LmddA-142菌株的免疫诱导表达PSA的肿瘤的消退和PSA特异性CTL对肿瘤的浸润
使用工程化以表达PSA的前列腺腺癌细胞系(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等，2008)来测定构建体LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的治疗功效。向小鼠皮下植入2×106个TPSA细胞。当肿瘤在肿瘤接种后第6天达到4-6mm的可触大小时，小鼠以一周为间隔用108个CFU LmddA-142、107个CFU Lm-LLO-PSA(阳性对照)免疫3次或不做处理。未暴露的小鼠逐渐形成肿瘤(图6A)。全部用LmddA-142免疫的小鼠直至第35天均无肿瘤，并且8只小鼠中有3只逐渐产生肿瘤，其相较于未暴露的小鼠以慢得多的速度生长(图6B)。在第70天，8只小鼠中有5只仍无肿瘤。正如预期，Lm-LLO-PSA疫苗接种的小鼠的肿瘤比未暴露的对照小，且肿瘤发展也比对照中的缓慢(图6C)。因此，构建体LmddA-LLO-PSA可消退TPSA细胞系建立的60％肿瘤并且减缓其他小鼠中的肿瘤生长。仍无肿瘤的治愈小鼠在第68天用TPSA肿瘤再攻毒。
用LmddA-142免疫小鼠可在超过60％的实验动物中控制7天建立的Tramp-C1肿瘤(其经工程化以表达PSA)的生长并诱导其消退(图6B)，而未暴露的组中均无此效果(图6A)。使用高度减毒载体(LmddA)和质粒pADV142来构建LmddA-142(表1)。
此外，研究了由LmddA-LLO-PSA构建体产生的PSA特异性CD8淋巴细胞浸润肿瘤的能力。将肿瘤和基质胶的混合物皮下植入小鼠，随后以七天间隔用未暴露的或对照(Lm-LLO-E7)李斯特菌或用LmddA-LLO-PSA免疫两次。在第21天切除肿瘤并且分析浸润在肿瘤中的CD8+CD62L低PSA四聚体+和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞群体。
在未暴露的和Lm-LLO-E7对照免疫小鼠中观察到存在极低数量的对PSA具有特异性的CD8+CD62L低PSA四聚体+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠中PSA特异性CD8+CD62L低PSA四聚体+TIL的百分比增加了10-30倍(图7A)。有趣的是，脾脏中的CD8+CD62L低PSA四聚体+细胞群体比肿瘤中少7.5倍(图7A)。
另外，测定未处理小鼠和李斯特菌免疫小鼠的肿瘤中CD4+/CD25+/Foxp3+调节性T细胞(Treg)的存在。有趣的是，用李斯特菌免疫导致肿瘤而非脾脏中的CD4+CD25+FoxP3+T-reg数量显著降低(图7B)。然而，与未暴露的和Lm-LLO-E7免疫组相比，构建体LmddA-LLO-PSA对降低肿瘤中的CD4+CD25+FoxP3+T-reg的频率的影响更强(图7B)。
因此，LmddA-142疫苗可诱导能够浸润肿瘤位点的PSA特异性CD8+T细胞(图7A)。有趣的是，用LmddA-142免疫与肿瘤中调节性T细胞数量减少相关(图7B)，从而可能形成对高效抗肿瘤CTL活性更有利的环境。
实施例7：Lmdd-143和LmddA-143尽管在PSA融合的情况下也分泌功能性LLO。
Lmdd-143和LmddA-143含有全长人klk3基因，其编码PSA蛋白，该蛋白经同源重组插入下游并且与染色体中的hly基因同框。这些构建体使用pKSV7质粒通过同源重组制备(Smith和Youngman，Biochimie.1992；74(7-8)p705-711)，所述质粒携带hly-klk3-mpl重组盒的温敏复制子。由于第二重组事件之后切除质粒，所以失去用于整合选择的抗生素抗性标记。另外，actA基因在LmddA-143菌株中缺失(图8A)。通过PCR(图8B)和测序(数据未示出)来验证在两个构建体中klk3与hly向染色体的同框插入。
这些染色体构建体的一个重要方面是LLO-PSA的产生不会完全消除LLO的功能，李斯特菌从吞噬体逃逸、单核细胞增多性李斯特菌产生的胞质溶胶侵袭和高效免疫性需要所述LLO功能。对来自Lmdd-143和LmddA-143培养上清液的分泌蛋白的Western印迹分析显示出对应于LLO-PSA融合蛋白的～81kDa条带和～60kDa条带(其为LLO的预期大小)(图9A)，表明LLO从LLO-PSA融合体裂解或仍作为单个蛋白质由单核细胞增多性李斯特菌产生，而与染色体中的融合基因无关。与野生型单核细胞增多性李斯特菌10403S相比，Lmdd-143和LmddA-143分泌的LLO保留了50％的溶血活性(图9B)。与这些结果一致，Lmdd-143和LmddA-143均能够在巨噬细胞样J774细胞系中胞内复制(图9C)。
实施例8：Lmdd-143和LmddA-143均引发针对PSA抗原的细胞介导的免疫应答。
在显示Lmdd-143和LmddA-143均能够分泌融合到LLO的PSA之后，研究了这些菌株是否能够在体内引发PSA特异性免疫应答的问题。C57Bl/6小鼠不做处理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫两次。通过用PSA65-74肽刺激脾细胞和针对IFN-γ进行胞内染色来测量PSA特异性CD8+T细胞应答。如图10所示，染色体和基于质粒的载体诱导的免疫应答类似。
材料和方法(实施例9-15)
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成，并且DNA测序则由Genewiz Inc.，South Plainfield，NJ进行。流式细胞术试剂购自Becton Dickinson Biosciences(BD，SanDiego，CA)。除非另外指明，否则细胞培养基、补充剂和所有其他试剂均购自Sigma(St.Louise，MO)。由EZbiolabs(Westfield，IN)合成Her2/neu HLA-A2肽。完全RPMI 1640(C-RPMI)培养基含有2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素/链霉素和Hepes(25mM)。之前描述的多克隆抗LLO抗体，抗Her2/neu抗体购自Sigma。
小鼠和细胞系
所有的动物实验均根据宾夕法尼亚大学或罗格斯大学的IACUC批准的方案进行。FVB/N小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor，ME)。在宾夕法尼亚大学的动物中心机构安置和饲养FVB/N Her2/neu转基因小鼠，其过表达大鼠Her2/neu肿瘤蛋白。NT-2肿瘤细胞系表达高水平的大鼠Her2/neu蛋白，其来源于这些小鼠中的自发性乳腺肿瘤，并按之前描述的生长。DHFR-G8(3T3/neu)细胞获取自ATCC，并且根据ATCC推荐方案生长。EMT6-Luc细胞系由John Ohlfest博士(明尼苏达州明尼苏达大学)慷慨赠送，并在完全C-RPMI培养基中生长。生物荧光工作在宾夕法尼亚大学(宾夕法尼亚州费城)的小动物成像机构(SAIF)的指导下进行。
李斯特菌构建体和抗原表达
Her2/neu-pGEM7Z由宾夕法尼亚大学的Mark Greene博士友情提供，并含有克隆到pGEM7Z质粒(Promega，Madison WI)中的全长人Her2/neu(hHer2)基因。将该质粒用作模板，使用表3所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通过PCR扩增hHer-2/neu的3个区段，即EC1，EC2和IC1。
表3：用于克隆人Her-2嵌合体的引物。
通过SOEing PCR方法，并将每个单独的hHer-2/neu区段作为模板，通过直接融合产生Her-2/neu嵌合体构建体。引物如表4所示。
表4：用于扩增不同片段人Her2区域的引物序列。
使用XhoI和SpeI限制性酶从pAdv138切离ChHer2基因，并将其与LLO的截短的非溶血性片段同框克隆到Lmdd穿梭载体pAdv134中。通过DNA测序分析确认插入(即，LLO和hly启动子)的序列。将该质粒电穿孔转化至电感受态actA、dal、dat突变单核细胞增多性李斯特菌菌株中，在含有链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆体。在一些实验中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特菌菌株用于对比目的。在所有研究中，均包含不相关李斯特菌构建体(Lm对照)以表明李斯特菌对免疫系统的抗原非依赖性效应。Lm对照基于与ADXS31-164(LmddA-ChHer2)相同的李斯特菌平台，但表达不同的抗原，如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试李斯特菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体体内传代两次。
细胞毒性测定
以3-5只FVB/N小鼠为一组，使用1×108个菌落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm对照(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫3次或保持未暴露。使NT-2细胞体外生长，通过胰蛋白酶脱壁，并用丝裂霉素C(250μg/ml，溶于无血清C-RPMI培养基)在37℃处理45分钟。洗涤5次后，将其与从免疫或未暴露的动物收集的脾细胞以1:5(刺激因子：应答细胞)的比率在37℃和5％CO2下一起温育5天。根据前述方法，使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶标进行标准细胞毒性测定。在温育4小时后使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测定从杀死的靶细胞释放的铕。特异性裂解百分比定义为(实验组中的裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)。
来自免疫小鼠的脾细胞分泌的干扰素γ
以3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠为一组，使用1×108个CFU的阴性李斯特菌对照ADXS31-164(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫3次或保持未暴露。在最后一次免疫后一周分离来自FVB/N小鼠的脾细胞，并以5×106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基中在存在丝裂霉素C处理的NT-2细胞的情况下共培养。在存在1μM HLA-A2特异性肽或1μg/ml的重组His标记的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且通过基于镍的亲和色谱系统纯化)的情况下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。在24或72小时后从上清液获取样品，并且根据制造商的推荐方案使用小鼠IFNγ-酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒来测试干扰素-γ(IFN-γ)的存在。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
用5×108个CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm对照来免疫6周龄FVB/N大鼠Her2/neu转基因小鼠(9-14个/组)6次。每周两次观察自发性乳腺肿瘤的出现，使用电子卡尺测量肿瘤，直到52周。当平均直径大小达到1cm2时切下逃逸的肿瘤并在-20℃下保存于RNAlater中。为了确定Her2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的影响，使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA并且测序。
ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞的作用
向小鼠皮下(s.c.)植入1×106个NT-2细胞。在第7、14和21天，使用1×108个CFU的ADXS31-164、LmddA对照对它们进行免疫或保持未暴露。在第28天提取肿瘤和脾脏并通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+Treg的存在。简而言之，通过在C-RPMI培养基中匀化两个载玻片之间的脾脏而分离脾细胞。使用无菌刀片切碎肿瘤，并用含有DNase(12U/ml)和溶于PBS的胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在室温下搅拌温育60分钟后，通过猛烈吹打而分离细胞。用RBC裂解缓冲液裂解红细胞，然后用含有10％FBS的完全RPMI-1640培养基洗涤数次。通过尼龙网过滤后，将肿瘤细胞和脾细胞重悬于FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，并用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，然后进行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)进行流式细胞术分析，并且使用cell quest软件(BD)分析数据。
统计学分析
将数秩卡方检验用于存活期数据，并将student’s t检验用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地进行。在这些分析中，小于0.05的p值(以*标记)被视为具有统计学上的显著性。所有统计学分析均使用Prism软件V.4.0a(2006)或SPSS软件V.15.0(2006)进行。除非另有说明，否则对于所有的FVB/N大鼠Her2/neu转基因研究，我们均使用8-14只小鼠/组，对于所有野生型FVB/N研究，我们均使用至少8只小鼠/组。除了在Her2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究外，所有研究重复至少一次。
实施例9：分泌与Her-2片段融合的LLO片段的单核细胞增多性李斯特菌菌株的制备：ADXS31-164的构建
嵌合Her2/neu基因(ChHer2)的构建如下所述。简而言之，通过SOEing PCR方法，通过直接融合Her2/neu蛋白的两个胞外片段(aa 40-170和aa 359-433)和一个胞内片段(aa678-808)，制备ChHer2基因。嵌合蛋白含有蛋白的大部分已知的人MHC I类表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切离ChHer2基因并克隆到LmddA穿梭质粒中，从而产生质粒pAdv164(图11A)。这两个质粒骨架之间存在两个主要差异。1)pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)进行重组细菌的体外选择，而pAdv164含有来自枯草芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，其使用代谢互补通路进行体外选择以及在缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的体内质粒保持。该疫苗平台被设计和开发成解决FDA对工程化李斯特菌疫苗株抗生素抗性的关注。2)与pAdv138不同，pAdv164在质粒中没有prfA基因拷贝(参见下面的序列和图11A)，因为这对于Lmdd菌株的体内互补而言不是必需的。LmddA疫苗株还缺乏actA基因(负责李斯特菌的胞内移动和细胞间扩散)，因此来源于该骨架的重组疫苗株的毒性比来源于其亲代株Lmdd的重组疫苗株小100倍。基于LmddA的疫苗从免疫小鼠脾脏的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小时内)。体外生长8小时后经TCA沉淀的细胞培养物上清液中，来自该菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图11B)，如使用Western印迹分析通过抗LLO抗体检测到～104KD的条带。仅表达tLLO的李斯特菌骨架菌株用作阴性对照。
pAdv164序列(7075个碱基对)(参见图11A和图11B)如SEQ ID NO:58所示。
实施例10：ADXS31-164的免疫原性与Lm-LLO-ChHER2一样
在标准CTL测定中，将ADXS31-164在产生抗Her2/neu特异性细胞毒性T细胞方面的免疫原性特性与Lm-LLO-ChHer2疫苗的免疫原性特性进行比较。两种疫苗均引发针对由3T3/neu靶细胞表达的Her2/neu抗原的强烈但相当的细胞毒性T细胞应答。相应的，使用仅表达与LLO融合的Her2的胞内片段的李斯特菌免疫的小鼠显示出比含有多个MHC I类表位的嵌合体更低的裂解活性。在未暴露的动物或注射不相关李斯特菌疫苗的小鼠中未检测到CTL活性(图12A)。ADXS31-164也能够刺激来自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图12B)。在与经丝裂霉素C处理的表达高水平的Her2/neu抗原的NT-2细胞共培养的这些细胞的培养物上清液中，这也被检测到了(图12C)。
在HLA-A2小鼠中测试了ADXS31-164免疫后人MHC I类表位的适当处理和呈递。将来自经免疫的HLA-A2转基因动物的脾细胞与对应于标绘的HLA-A2限制性表位的肽一起温育72小时，所述HLA-A2限制性表位位于Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:42或KIFGSLAFL SEQ ID NO:43)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:44)结构域(图12C)。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽则作为阴性对照。来自该实验的数据表明，ADXS31-164能够引发针对位于靶抗原的不同域处的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
实施例11：ADXS31-164在预防自发性乳腺肿瘤的发作中比Lm-LLO-ChHER2更有效
对比了ADXS31-164与Lm-LLO-ChHer2在Her2/neu转基因动物中的抗肿瘤效果，该转基因动物在20-25周龄时发展出缓慢生长的自发性乳腺肿瘤。所有使用不相关李斯特菌对照疫苗免疫的动物在21-25周内产生乳腺肿瘤并且在第33周前处死。相比之下，李斯特菌Her2/neu重组疫苗导致乳腺肿瘤形成的显著延迟。在第45周，超过50％的ADXS31-164疫苗接种的小鼠(9只中的5只)仍无肿瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％仍无肿瘤。在第52周，8只经ADXS31-164免疫的小鼠中的2只仍保持无肿瘤，而来自其他实验组的所有小鼠均已死于其疾病(图13)。这些结果表明，尽管ADXS31-164更加减毒，但其在预防Her2/neu转基因动物中自发性乳腺肿瘤的发作方面比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实施例12：经ADXS31-164免疫后HER2/Neu基因的突变
Her2/neu的MHC I类表位中的突变已被认为是造成对小片段疫苗免疫后或对曲妥珠单抗(赫赛汀，一种靶向Her2/neu的胞外域中表位的单克隆抗体)的肿瘤逃逸的原因。为了评估该作用，从转基因动物中的逃逸肿瘤提取基因组物质，并对嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中的neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中均未观察到突变，这提示替代性逃避机制(数据未示出)。
实施例13：ADXS31-164引起肿瘤内调节性T细胞的显著减少
为了阐明ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞频率的影响，向小鼠植入NT-2肿瘤细胞。在3次免疫后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并对定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞的Treg进行染色，但是当单独分析时，FoxP3或CD25标记获得了类似的结果。结果表明，与不相关李斯特菌疫苗或未暴露的动物相比，ADXS31-164免疫对脾脏中Treg的频率没有影响(图14)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫对肿瘤中Treg的存在产生很大的影响(图15A)。然而在未处理肿瘤中，所有CD3+T细胞中平均19.0％是Treg，该频率对于不相关疫苗而言下降至4.2％，并且对于ADXS31-164而言下降至3.4％，肿瘤内Treg的频率下降了5倍(图15B)。任一LmddA疫苗处理的小鼠中肿瘤内Treg的频率降低不能归因于肿瘤大小的差异。在代表性实验中，ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]显著小于未治疗的小鼠(8.69±0.98，n＝5，p<0.01)或不相关疫苗治疗的小鼠(8.41±1.47，n＝5，p＝0.04)的肿瘤，而最后两组的比较未显示出肿瘤大小的统计学上的显著差异(p＝0.73)。LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，这表明在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。然而，只有表达靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减缓肿瘤生长，表明Treg的减少仅在肿瘤中存在抗原特异性应答时有效。
实施例14：ADXS31-164的外周免疫可延缓脑中转移性乳腺癌细胞系的生长
使用ADXS31-164或不相关Lm对照疫苗腹腔免疫小鼠，然后颅内植入5000个表达荧光素酶和低水平Her2/neu的EMT6-Luc肿瘤细胞(图16A)。在接种后的不同时间通过麻醉小鼠的离体成像监测肿瘤。在肿瘤接种后第8天，在所有对照动物中检测到肿瘤，但ADXS31-164组的小鼠均未显示出任何可检测的肿瘤(图16A和图16B)。ADXS31-164可明显延缓这些肿瘤的发病，因为在肿瘤接种后第11天，阴性对照组的所有小鼠已死于肿瘤，但ADXS31-164组中的所有小鼠仍然存活，并且仅显示出少量肿瘤生长的迹象。这些结果有力地表明，ADXS31-164的外周施用获得的免疫应答可能到达中枢神经系统，并且基于LmddA的疫苗可具有治疗CNS肿瘤的潜在用途。
实施例15：肽“微基因”表达系统
材料和方法
该表达系统被设计成有利于在羧基端含有不同肽部分的成组的重组蛋白的克隆。这通过将编码SS-Ub-肽构建体之一的序列用作模板而进行的简单PCR反应来实现。通过使用延伸到Ub序列的羧基末端区域中的引物并在该引物的3’端引入所需肽序列的密码子，可在单个PCR反应中生成新的SS-Ub-肽序列。编码细菌启动子的5’引物和ActA信号序列的前几个核苷酸对于所有构建体而言是相同的。使用该方案生成的构建体在图17A-17C中示意性地示出。在此实施例中，描述两个构建体。一个构建体含有在小鼠MHC I类分子上呈递的模型肽抗原，第二个构建体指示治疗性相关肽(如来源于人胶质母细胞瘤(GBM)TAA的肽)将被取代的位置。为清楚起见，我们设计了在图17A-C中示为含有ActA1-100分泌信号的构建体。然而，可以用基于LLO的分泌信号代替而获得等同效果。
所提出的系统的优点之一在于将可能使用单个李斯特菌载体构建体来加载具有多个肽的细胞。使用对上述单肽表达系统的修饰，可以将多个肽引入重组减毒李斯特菌(例如prfA突变体李斯特菌或dal/dat/actA突变体李斯特菌)。编码多个不同肽的嵌合蛋白来自在一个插入片段中编码的顺序SS-Ub-肽序列。在每个SS-Ub-肽编码序列之前引入Shine-Dalgarno核糖体结合位点，以使能够单独翻译每个肽构建体。图17C说明了被设计为由重组李斯特菌的一个菌株表达4种单独的肽抗原的构建体的示意图。由于这仅仅是通用表达方案的示例，所以我们包括了4种不同的来源于已知的小鼠或人肿瘤相关抗原或感染性疾病抗原的MHC I类结合肽。
材料和方法(实施例16-18)
质粒pAdv142和菌株LmddA142已在以上实施例1中描述。以下提供了另外的细节。
质粒pAdv142和菌株LmddA142的构建
该质粒是下一代无抗生素质粒pTV3，其先前由Verch等构建。由于Lm-ddA在染色体中含有prfA基因的拷贝，因此毒力基因转录激活因子的非必需拷贝prfA从质粒pTV3缺失。因此，prfA基因在含有dal的质粒中的存在不是必需的。另外，p60-李斯特菌dal的盒在NheI/PacI限制性位点处被置换为p60-枯草芽孢杆菌dal(dalBs)，从而产生质粒pAdv134。此外，用XhoI/XmaI限制pAdv134以克隆人PSA，klk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv142(图2C)含有dalBs并且其表达受Lm p60启动子控制。穿梭质粒pAdv142在存在无外源添加的D-丙氨酸的情况下可补充大肠杆菌ala drxMB2159以及Lmdd的生长。质粒pAdv 142中的抗原表达盒由hly启动子和tLLO-PSA融合蛋白组成(图18)。
将质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddA，从而产生LmddA142或ADXS31-142。通过Western分析使用抗LLO和抗PSA抗体来确认LLO-PSA融合蛋白经菌株ADXS31-142的表达和分泌，并且在图2D中示出。在C57BL/6小鼠中两次体内传代后，菌株ADXS31-142稳定表达和分泌LLO-PSA融合蛋白。
LmddA211、LmddA223和LmddA224菌株的构建
将不同ActA/PEST区域克隆到质粒pAdv142中以形成含有ActA蛋白的不同截短片段的3个不同质粒pAdv211、pAdv223和pAdv224。
LLO信号序列(LLOss)-ActAPEST2(pAdv211)/LmddA211。通过使用SOEing PCR方法扩增前两个片段PsiI-LLOss-XbaI(大小为817bp)和LLOss-XbaI-ActA-PEST2(大小为602bp)，并随后将其融合在一起，其中有25个碱基的重叠。该PCR产物此时含有大小为762bp的PsiI-LLOss-XbaI-ActAPEST2-XhoI片段。用PsiI/XhoI限制性酶消化新的PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2-XhoI PCR产物和pAdv142(LmddA-PSA)质粒并纯化。建立连接并将其转化到MB2159电感受态细胞中并接种到LB琼脂板上。选择出了PsiI-LLOss-XbaI-ActAPEST2/pAdv142(PSA)克隆，并且通过插入片段特异性PCR反应筛选出了PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2/pAdv142(PSA)克隆9号、10号为阳性，并且通过小量制备物来纯化质粒。在通过PCR筛选对克隆进行筛选之后，对来自阳性克隆的插入片段进行测序。将称为pAdv211.10的质粒PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2/pAdv142(PSA)转化到李斯特菌LmddA突变体电感受态细胞中并将其接种到BHI/strep琼脂板上。通过菌落PCR筛选所得LmddA211菌株。选择几个李斯特菌菌落并且针对内源LLO和ActAPEST2-PSA(LA229-PSA)蛋白的表达和分泌进行筛选。在小鼠体内传代两次后，ActAPEST2-PSA融合蛋白稳定表达。
LLOss-ActAPEST3和PEST4。通过PCR方法形成ActAPEST3和ActAPEST4片段。将含有LLOss-XbaI-ActAPEST3-XhoI(大小为839bp)和LLOss-XbaI-ActAPEST4-XhoI a片段(大小为1146bp)的PCR产物克隆到pAdv142中。选择所得质粒pAdv223(PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST3-XhoI/pAdv 142)和pAdv224(PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST4/pAdv 142)克隆，并且通过插入片段特异性PCR反应对其进行筛选。将质粒pAdv223和pAdv224转化到LmddA骨架中，从而分别产生LmddA223和LmddA224。选择几个李斯特菌菌落并且针对内源LLO、ActAPEST3-PSA(LmddA223)或ActAPEST4-PSA(LmddA224)蛋白的表达和分泌进行筛选。在小鼠体内传代两次之后，融合蛋白ActAPEST3-PSA(LmddA223)或ActAPEST4-PSA(LmddA224)稳定表达和分泌。
实验计划1
使用TPSA23(PSA表达肿瘤模型)评价和比较ActA-PEST-PSA(PEST3、PEST2和PEST4序列)和tLLO-PSA的治疗功效。将未处理的小鼠用作对照组。也使用干扰素-γ的细胞内细胞因子染色和PSA四聚体染色平行评价免疫应答。
关于肿瘤消退研究。在第0天向10组(每组8只)C57BL/6小鼠(7周龄雄性)皮下植入1×106个TPSA23细胞。在第6天，这些小鼠接受免疫，之后以一周为间隔给予2个强化剂量。每周监测肿瘤生长，直至其达到平均直径1.2cm的大小。
免疫原性研究。将两组C57BL/6小鼠(7周龄雄性)以一周间隔用下表所列出的疫苗免疫3次。在最后一次强化注射后6天，处死小鼠，收获脾脏，并且通过四聚体染色和细胞内细胞因子染色测得的IFN-γ分泌来检测免疫应答。
实验计划2
该实验是实验计划1的重复实验，然而，其中仅包括未暴露的、tLLO、ActA/PEST2-PSA和tLLO-PSA组。与实验计划1类似，使用TPSA23(PSA表达肿瘤模型)评价治疗功效。在第0天，向每组5只C57BL/6小鼠皮下植入1×106个TPSA23细胞。在第6天，这些小鼠接受免疫(1×108个CFU/mL)，之后在一周后接受强化免疫。在最后一次治疗后第6天收集脾和肿瘤。使用脾和肿瘤中的PSA五聚体染色监测免疫应答。
材料和方法。在完全培养基中培养TPSA23细胞。在将肿瘤细胞植入小鼠前两天，TPSA23细胞在完全培养基中进行传代培养。在实验当天(第0天)，用胰蛋白酶处理细胞并用PBS洗涤两次。对细胞计数并以1×106个细胞/200μl/只小鼠的浓度重悬于PBS中以用于注射。在每只小鼠的侧腹皮下注射肿瘤细胞。
用于TPSA23细胞的完全培养基。通过将430ml DMEM与葡萄糖、45ml胎牛血清(FCS)、25ml Nu-血清IV、5ml 100X L-谷氨酰胺、5ml 100mM丙酮酸钠、5ml 10000U/mL青霉素/链霉素混合来制备用于TPSA23细胞的完全培养基。在细胞分裂时将0.005mg/ml牛胰岛素和10nM脱氢表雄甾酮加入烧瓶中。
用于脾细胞的完全培养基(c-RPMI)。通过将450ml RPMI 1640、50ml胎牛血清(FCS)、5ml 1M HEPES、5ml 100X非必需氨基酸(NEAA)、5ml 100X L-谷氨酰胺、5ml 100mM丙酮酸钠、5ml 10000U/mL青霉素/链霉素和129ul 14.6M 2-巯基乙醇混合来制备完全培养基。
制备分离的脾细胞
在生物危害通风厨中进行工作。使用无菌镊子和剪刀从实验和对照小鼠组中收获脾脏。将其在含有10ml PBS的15ml管中转移到实验室。单独处理来自每只小鼠的脾脏。将脾脏置于无菌培养皿中，并且使用来自3mL注射器的柱塞背面捣碎。将脾细胞转移到含有10mlRPMI 1640的15ml管中。通过在4℃以1000RPM离心5分钟来使细胞沉淀。将上清液丢弃在10％漂白剂中。通过轻敲来轻轻破碎细胞沉淀物。通过向细胞沉淀物中加入2ml的RBC裂解缓冲液/脾脏来裂解RBC。使RBC裂解2分钟。立即向细胞悬浮液中加入10ml c-RPMI培养基以使RBC裂解缓冲液失活。通过在4℃以1000RPM离心5分钟来使细胞沉淀。弃去上清液并且将细胞沉淀物重悬于10ml c-RPMI中并且使其通过细胞过滤网。使用血细胞计数器对细胞计数，并且通过将10μl细胞悬浮液与90μl台盼蓝染色混合来检查活力。将约2×106个细胞用于五聚体染色。(注意：每个脾脏应产生1-2×108个细胞)。
使用Miltenyi小鼠肿瘤解离试剂盒由肿瘤制备单细胞悬浮液
通过将2.35mL RPMI1640、100μL酶D、50μL酶R和12.5μL酶A加入温和MACS C管中来制备酶混合物。将肿瘤(0.04-1g)切成2-4mm的小块并且将其转移到含有酶混合物的温和MACS C管中。将管倒置地连接到温和MACS分离器的套筒上并且运行程序m_impTumor_02。在终止程序之后，将C管与温和MACS分离器脱离。在使用MACSmix管旋转机连续旋转的情况下将样品在37℃下温育40分钟。在完成温育之后，再将C管倒置地连接到温和MACS分离器的套筒上并且运行程序m_impTumor_03两次。使细胞悬浮液通过放置于15mL管上的70μm过滤器，也用10mL RPMI 1640洗涤过滤器。将细胞以300×g离心7分钟。弃去上清液并且将细胞重悬于10ml RPMI 1640中。此时可将细胞分开以用于五聚体染色。
脾细胞的五聚体染色
使用来自ProImmune的可商购获得的PSA-H-2Db五聚体，并且使用制造商推荐的方案检测PSA特异性T细胞。针对CD8、CD62L、CD3和五聚体对脾细胞进行染色。同时针对CD8、CD62L、CD45和五聚体对肿瘤细胞进行染色。门控CD3+CD8+CD62Llow细胞以确定CD3+CD8+CD62LlowPSA五聚体+细胞的频率。获得染色的细胞并使用Cell quest软件在FACS Calibur上进行分析。
五聚体染色所需的材料。脾细胞(上文所述的制备物)，与PE偶联的重组MHCPSA五聚体(注意：确保储备五聚体一直储存在4℃下的黑暗中，其中盖子紧密关闭)，与PerCP Cy5.5偶联的抗CD3抗体、与FITC偶联的抗CD8抗体和与APC偶联的抗CD62L抗体、洗涤缓冲液(溶于PBS中的0.1％BSA)以及固定溶液(PBS中的1％加热灭活胎牛血清(HI-FCBS)和2.5％甲醛)。
标准染色方案。将PSA五聚体在冷却微型离心机中以14000×g离心5-10分钟，以去除存在于溶液中的任何蛋白聚集物。这些聚集物如果包含在测试体积中会导致非特异性染色。每个染色条件分配2×106个脾细胞，并且每个管中加入1ml洗涤缓冲液。将细胞在冷却离心机中在4℃下以500×g离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于残余体积(约50μl)中。除非另外指出，否则将所有管在冰上冷却以用于所有后续步骤。向细胞中加入10μl标记的五聚体，并且通过吹打进行混合。在避光的情况下，将细胞在室温(22℃)下孵育10分钟。将细胞用每管2ml洗涤缓冲液来洗涤并且重悬于残余液体(约50μl)中。加入最佳量的抗CD3、抗CD8和抗CD62L抗体(1:100稀释)并且通过吹打进行混合。也在此时制备单染色对照样品。在避光的情况下，将样品在冰上温育20分钟。将细胞用每管2ml洗涤缓冲液洗涤两次。将细胞沉淀物重悬于残余体积(约50μl)中。向每个管中加入200μl固定溶液并进行涡旋。将管储存在黑暗的冷藏库中，直到准备进行数据采集。(注意：细胞的形态在固定之后会发生变化，因此建议将样品静置3小时后再进行数据采集。样品可储存最多2天)。
细胞内细胞因子染色(IFN-γ)方案。将2×107个细胞/ml脾细胞置于FACS管中，并且向管中加入100μl布雷菲德菌素A(BD Golgi Plug)。为了进行刺激，将2μM肽加入管中并且将细胞在室温下温育10-15分钟。对于阳性对照样品，将PMA(10ng/ml)(2x)和离子霉素(1μg/ml)(2x)加入对应的管中。将来自每次处理的100μl培养基加入U形底96孔板中的对应孔中。将100μl细胞加入对应孔中(200μl最终体积-培养基+细胞)。将板以600rpm离心2分钟，并且在37℃，5％CO2下温育5小时。将来自板的内容物转移到FACS管中。向每个管中加入1mlFACS缓冲液，并且以1200rpm进行离心5分钟。弃去上清液。向细胞中加入200μl 2.4G2上清液和10μl兔血清，并且在室温下温育10分钟。用1mL FACS缓冲液洗涤细胞。通过1200rpm离心5分钟来收集细胞。将细胞悬浮于含有荧光团偶联单克隆抗体(CD8FITC、CD3PerCP-Cy5.5、CD62L APC)的50μl FACS缓冲液中，并且在黑暗中在4℃下温育30分钟。用1mL FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且将其重悬于200μl 4％福尔马林溶液中，并且在4℃下温育20分钟。用1mL FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且将其重悬于BD Perm/Wash(0.25ml/管)中15分钟。通过离心收集细胞并且将其重悬于50μl含有针对所关注的细胞因子(IFNg-PE)的荧光团偶联单克隆抗体的BD Perm/Wash溶液中。将细胞在黑暗中在4℃下温育30分钟。用BDPerm/Wash(1ml/管)洗涤细胞两次，并且在分析之前将其重悬于200μl FACS缓冲液中。
结果
实施例16：用重组李斯特菌构建体接种导致肿瘤消退
数据显示，至第1周，所有组均产生平均大小为2-3mm的肿瘤。在第3周(第20天)用ActA/PEST2(也称为“LA229”)-PSA、ActA/PEST3-PSA和ActA/PEST3-PSA以及表达tLLO融合PSA的LmddA-142(ADXS31-142)免疫的小鼠显示肿瘤消退和肿瘤生长减慢。至第6周，未暴露组中的所有小鼠和ActAPEST4-PSA治疗组中的大部分小鼠具有大肿瘤并且必须安乐死(图19A)。然而，LmddA-142、ActA-PEST2和ActA-PEST3小鼠组显示出更好的肿瘤消退和存活率(图19A和图19B)。
实施例17：用重组李斯特菌接种生成高水平的抗原特异性T细胞
与LmddA-ActAPEST(3或4)-PSA或LmddA-142相比，LmddA-ActAPEST2-PSA疫苗生成高水平的PSA特异性T细胞应答(图20A)。在PSA特异性疫苗中PSA四聚体特异性T细胞的数量比未经处理的小鼠高30倍。类似地，对于LmddA-ActAPEST2-PSA疫苗，观察到响应于PSA特异性抗原刺激的更高水平的IFN-γ分泌(图20B)。
实施例18：用ActA/PEST2疫苗接种(LA229)在脾脏中生成高数目的抗原特异性CD8+T细胞
与表达Lm的tLLO融合PSA或tLLO治疗组相比，Lm表达的ActA/PEST2融合PSA能够在脾中生成更高数目的PSA特异性CD8+T细胞。对于Lm-tLLO-PSA和Lm-ActA/PEST2-PSA免疫的小鼠而言，PSA特异性CD8+T细胞浸润肿瘤的数目是类似的(图21B和图21C)。此外，表达Lm的ActA/PEST2-PSA的肿瘤消退能力类似于在表达tLLO-PSA的LmddA-142中所见的能力(图21A)。
实施例19：新表位表达载体的构建
使用下文详述的步骤构建包含一个或多个新表位的Lm载体。
全基因组测序
首先，进行比较性全基因组测序，包括定位存在于大约>20％的肿瘤细胞中的非同义突变并以FASTA形式提供结果。通过外部供应商对来自全外显子组的匹配的正常/肿瘤样品进行测序，并且以优选的FASTA形式给出输出数据，将所有新抗原列出为21个氨基酸的序列肽，例如在突变体氨基酸任一侧上具有10个非突变氨基酸的肽。还包括患者HLA类型。
提取来自从人组织(或任何非人动物)获得的生物样品的DNA和RNA，一式三份。新抗原的另一个来源可以是来自测序的转移瘤或循环肿瘤细胞。这些新抗原可含有初始活检物中不存在但可包含在载体中的额外突变，以特异性靶向细胞毒性T细胞(CTC)或转移瘤(具有不同于所测序的初始活检物的突变)。通过DNA外显子组测序对每个样品进行测序，一式三份。简而言之，使用超声波装置将3μg纯化的基因组DNA(gDNA)片段化至约150-200bp。将片段末端修复、5’磷酸化、3’腺苷酸化，然后根据制造商说明书将Illumina配对的末端衔接子连接至gDNA片段。使用Illumina PE PCR引物添加富集的预捕获和流动细胞特异性序列。将约500ng的衔接子连接的、PCR富集的gDNA片段杂交至生物素化外显子组(人外显子组或任何其他非人动物外显子组，例如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、绵羊)。将RNA文库在65℃下引诱24小时。然后使用链霉亲和素包被的磁珠去除杂交的gDNA/RNA诱饵(bait)复合物，将其洗涤并且将RNA诱饵裂解。对这些洗脱的gDNA片段进行PCR扩增，然后在Illumina测序设备上进行测序。
RNA基因表达谱分析(RNA-Seq)
由总计约5μg的总RNA一式三份地制备条形编码的mRNA-seq cDNA文库，然后，简言之，分离mRNA并且将其片段化。之后，将mRNA片段转化为cDNA并且将其连接至特定的Illumina衔接子，使其成簇并且根据标准illumine方案进行测序。将输出序列读数与参照序列(RefSeq)比对。进行基因组比对和转录物组比对。也将读数与外显子-外显子连接区比对。通过将读数坐标与RefSeq转录物的坐标交叉，计数重叠的外显子和外显子连接区读数以及归一化至标准归一化单元(如RPKM表达单元(每百万作图的读数中每千碱基转录物所作图的读数))，来确定表达值。
检测突变
通过可从供应商获得的软件(例如Samtools、GATK和Somatic Sniper)将从患有疾病或病症的组织样品分离的gDNA的片段与健康组织的参考匹配的gDNA比对。
在检测到的突变的每一侧上并入约10个侧接氨基酸以适应1类MHC-1的呈递，以便提供至少一些不同的HLA TCR阅读框。
表5显示50个新表位肽的样品列表，其中每个突变用加粗的氨基酸字母表示，并且在每一侧侧接10个氨基酸，从而提供21个氨基酸肽的新表位。
表5
1加粗字母表示突变的氨基酸
使用输出FASTA文件，以手动或通过根据下面详述的一种或多种标准的程序化脚本设计患者特异性构建体。程序化脚本自动使用一系列方案针对每位受试者形成含有一个或多个新表位的个性化血浆构建体(图22)。输入输出的FASTA文件并且在运行这些方案之后，输出包含一个或多个新表位的LM载体的DNA序列。软件程序可用于针对每位受试者形成个性化免疫疗法。
用于并入构建体中的新表位的优先化
通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸窗对新表位进行评分，排除超过截止点(约1.6)的所有评分，因为它们不太可能由单核细胞增多性李斯特菌分泌。然后对其余长为21个氨基酸的肽结合患者HLA的能力进行评分(例如通过使用IEDB、免疫表位数据库和分析来源，http：//www.iedb.org/)，并且通过来自每种21个氨基酸序列肽的最佳MHC结合评分进行分等级。对于不同的表达载体(如沙门氏菌)，截止点可能是不同的。
确定相对于突变负荷的构建体的数目，以确定新表位的表达和分泌效率。以每个载体约50个表位开始测试线性新表位的范围。在某些情况下，构建体将包含每个载体至少一个新表位。考虑例如来自单个载体的多个表位的翻译和分泌效率，以及含有特异性新表位的每个Lm载体所需的MOI，或者参考新表位的数目，以确定待使用的载体的数目。另一种考虑因素可以是通过预定义已知肿瘤相关突变/循环肿瘤细胞中可见的突变/已知癌症“驱动”突变/已知化疗抗性突变组，并且在21个氨基酸序列肽选择中给予它们优先级。这可通过筛选针对COSMIC(癌症中的体细胞突变目录，cancer.Sanger.ac.uk)识别的突变基因或癌症基因组分析或其他类似的癌症相关基因数据库来实现。此外，筛选免疫抑制表位(T-reg表位、IL-10诱导的T辅助表位等)用于取消选择(de-selected)或避免对载体的免疫抑制影响。对所选密码子进行密码子优化以根据特定李斯特菌菌株进行高效翻译和分泌。针对本领域已知的单核细胞增多性李斯特菌进行密码子优化的示例呈现在表6中。
表6初步单核细胞增多性李斯特菌优选(最常见)密码子表。
A＝GCA G＝GGT L＝TTA Q＝CAA V＝GTT
C＝TGT H＝CAT M＝ATG R＝CGT W＝TGG
D＝GAT I＝ATT N＝AAC S＝TCT Y＝TAT
E＝GAA K＝AAA P＝CCA T＝ACA Stop＝TAA
F＝TTC
将其余21个氨基酸肽新表位组装到pAdv134-MCS(SEQ ID NO:45)质粒中，或者任选地组装到pAdv134中，从而交换如以上实施例8所示的LLO-E7盒，以形成tLLO-新表位-标签融合多肽。通过Kyte和Doolittle测试重新检查作为氨基酸序列的相容性插入片段和完整片段，以确认在整个完整构建体中没有亲水性问题。如果需要，则重新布置插入片段顺序或者从构建体中去除有问题的21个氨基酸序列肽。
将构建体氨基酸序列可逆地翻译成对应DNA序列，用于将DNA合成/克隆到pAdv134-MCS(SEQ ID NO:45)中。核苷酸2400-2453是指用于外部供体的多克隆位点。对单个21个氨基酸肽序列和SIINFEKL-6xHis标签DNA序列(例如SEQ ID NO:57)进行优化以在单核细胞增多性李斯特菌中表达和分泌，而4x甘氨酸接头序列是11个预先设定的DNA序列(G1-G11，SEQ ID NO:46-56)之一。改变接头序列密码子以避免过量重复，从而更好地实现DNA合成。4X甘氨酸接头的不同序列密码子(G1-G11，SEQ ID NO:46-56)的示例呈现在表7中。
表7. 4x甘氨酸接头DNA序列和末端标签序列。
每个新表位通过接头序列连接至在相同载体上编码的随后新表位。插入片段中的最后一个新表位与TAG序列融合，接着是终止密码子。融合的TAG如SEQ ID NO:57、C末端SIINFEKL和6xHis氨基酸序列所示。TAG使得在例如从Lm载体分泌期间或在测试构建体与特异性T细胞的亲和力或通过抗原呈递细胞的呈递时容易检测tLLO新表位。接头是4X甘氨酸DNA序列，其相应地选自包括G1-G11(SEQ ID NO:46-56)或其任何组合的组。
如果存在比装入单个质粒(已经测试过的最大有效载荷)中更有用的21个氨基酸肽，则不同的21个氨基酸肽按需要/按要求通过优先等级分配到第1个、第2个等构建体中。分配到组成所需新表位的整个集合的多个载体之一的优先级基于各种因素来确定，如翻译多肽的相对大小、转录优先级和总疏水性。
在一个实施方式中，本申请公开的构建体包含编码与一个或多个21聚体新表位氨基酸序列融合的N末端截短的LLO的核酸序列，该新表位由接头序列侧接并接着是由另一个接头侧接的至少一个第二新表位，并由SIINFEKL-6X组氨酸标签和封闭开放阅读框的2个终止密码子终止：pHly-tLLO-21聚体#1-4x甘氨酸接头G1-21聚体#2-4x甘氨酸接头G2-...-SIINFEKL-6x组氨酸标签-2x终止密码子。在另一个实施方式中，上述构建体的表达由hly基因启动子序列或本领域已知并且本申请中进一步公开的其他适合的启动子序列驱动。技术人员将理解，每个21聚体新表位序列也可与免疫原性多肽融合，如本申请公开的tLLO、截短的ActA或PEST氨基酸序列。
不同的接头序列分布在新表位之间以使重复序列最小化。这减少了可能的二级结构，从而允许在Lm重组载体菌株群体中高效转录、翻译、分泌、维持或稳定包含插入片段的质粒。
通过对来自供应商的构成构建体的核苷酸序列进行排序来实现DNA合成，所述构建体包含含有与至少一个新表位融合的tLLO或tActA或ActA或PEST氨基酸序列的开放阅读框。另外地或另选地，通过一个或多个接头4x甘氨酸序列分开多个新表位。另外地或另选地，构建插入片段以通过分子生物学工艺包含所需序列，例如：通过将PCR与特异性搭接引物和特异性引物相结合，或者任选地在限制性酶解离之后通过适当的酶(例如连接酶)连接不同的核苷酸序列，以及其任何其组合。
在一个实施方式中，不同的接头序列分布在新表位之间以使重复序列最小化。这减少了可能的二级结构，从而允许在Lm重组载体菌株群体中高效转录、翻译、分泌、维持或稳定包含插入片段的质粒。
所选DNA插入片段通过本领域标准技术(例如PCR、DNA复制-生物复制、寡核苷酸化学合成)合成并且克隆到质粒中，例如如实施例8所呈现的。然后将质粒转染或偶联到Lm载体中。另外地或另选地，将插入片段整合到噬菌体载体中并且通过噬菌体感染插入到Lm载体中。使用本领域已知的技术进行该构建体的确认，例如使用插入片段特异性引物进行细菌菌落PCR，或者通过纯化质粒或对包含该插入片段的至少一部分进行测序。
实施例20：Lm新抗原构建体在B16F10小鼠黑色素瘤模型中的治疗作用
在癌细胞中识别对应健康细胞中不存在的非同义突变之后，通常投入大量努力来确定突变功能影响(例如癌症驱动基因对比乘客基因状态)，以形成用于选择治疗性靶标的基础。然而，少量注意力已投入到定义这些突变的免疫原性或者表征它们所引发的免疫应答。从免疫学的角度看来，突变可以是特别强效的疫苗接种靶标，因为它们可形成不经历中枢免疫耐受的新抗原。当投入注意力来定义这些突变的免疫原性或者表征它们所引发的免疫应答时，通常致力于将非同义突变缩小为肽中所包含的单个突变，以进行免疫。例如，在Castle等中，在B16F10ih小鼠黑色素瘤细胞中识别到962个非同义点突变，这些突变中的563个位于表达的基因中。基于选择标准选择这些突变中的50个，这些选择标准包括低错误发现率(FDR)信值、表达的基因中的位置和预测的免疫原性。在这50个突变中，发现仅16个在免疫小鼠中引发免疫应答，并且16个中只有11个诱导优选识别突变表位的免疫应答。然后发现这些突变中的两个诱导肿瘤生长抑制。参见例如Castle等，(2012)Cancer Res.72(5):1081-1091，其出于所有目的通过引用整体并入本申请。然而，在以下实验中所述的构建体中，我们的数据表明Neo 20和Neo 30更好地控制肿瘤生长。在我们的构建体中，Neo-12含有12个最具免疫原性的表位。Neo 12含有两个肿瘤控制表位(Mut30和Mut44，如上文实施例19中的表5中所公开)。Neo 20含有Mut30-Mut2-Mut3-Mut3-Mut4......Mut19)。Neo 30含有Mut30-Mut2-Mut3......Mut-29)。Neo 20和Neo 30仅含有一个由Castle识别的肿瘤控制表位(Mut30)，然后它们含有免疫原性和非免疫原性表位。尽管不具有多个肿瘤控制表位并且含有许多非肿瘤控制表位以及甚至非免疫原性表位，但我们的数据仍表明，Neo 20和Neo30在控制肿瘤生长方面更好。
实验1
为了确定通过Lm新抗原构建体生成的治疗性应答，设计肿瘤消退研究以在B16F10C57Bl/6小鼠黑素瘤模型中检查此类构建体对肿瘤生长的治疗性作用。确切地说，如实施例19中的表5中所示，将Lm新抗原载体用由Castle等识别的12个新抗原(Lm-Castle12，其含有Mut30、Mut5、Mut17、Mut20、Mut22、Mut24、Mut25、Mut44、Mut46、Mut48和Mut50)或20个新抗原(Lm-Castle 20，其含有Mut30、Mut2、Mut3、Mut4、Mut5、Mut6、Mut7、Mut8、Mut9、Mut10、Mut11、Mut12、Mut13、Mut14、Mut15、Mut16、Mut17、Mut18、Mut19和Mut20)设计。参见例如Castle等，(2012)Cancer Res.72(5):1081-1091，其出于所有目的通过引用整体并入本申请。
肿瘤细胞系扩增。在含有10％FBS(50mL)和1X Glutamax(5mL)的c-RPMI中培养B16F10黑素瘤细胞系。c-RPMI培养基包括以下组分：
肿瘤接种。在第0天，用胰蛋白酶处理B16F10细胞并且将其用培养基洗涤两次。对细胞计数并且以1×105个细胞/200μl PBS的浓度重悬以用于注射。随后在每只小鼠的右侧腹皮下植入B16F10细胞。在研究的第3天，对小鼠进行疫苗接种。每周两次测量和记录肿瘤，直至直径达到12mm的大小。一旦肿瘤符合处死标准，对小鼠实施安乐死并且切下并测量肿瘤。
免疫疗法治疗。在第3天，开始免疫疗法和治疗。用Lm(腹腔注射)处理多个组，并且强化两次。详情列于表8中。
表8治疗计划。
免疫疗法治疗制备物。
1.仅PBS–腹腔注射200μL/只小鼠。
2.LmddA-274(滴度：1.5×109个CFU/mL)
a.在37℃水浴中将1个小瓶从-80℃解冻。
b.以14000rpm旋转2分钟并弃去上清液。
c.用1mL PBS洗涤2次并弃去PBS。
d.在PBS中重悬以达到最终浓度5×108个CFU/mL。
3.Lm-Castle 12(滴度：1.59×109个CFU/mL)和Lm-Castle 20(滴度：1.6×109个CFU/mL)
a.在37℃水浴中将1个小瓶从-80℃解冻。
b.以14000rpm旋转2分钟并弃去上清液。
c.用1mL PBS洗涤2次并弃去PBS。
d.在PBS中重悬以达到最终浓度5×108个CFU/mL。
如图23B所示，与对照组(PBS和Lmdd274)相比，Lm-Neo 12和Lm-Neo 20抑制了肿瘤生长。LmddA274是李斯特菌对照并且是空载体。其包括截短的LLO(tLLO)，然而没有连接新表位。另外，含有20个新抗原的Lm-Neo 20抑制肿瘤生长的程度大于含有12个新抗原的Lm-Neo 12。同样地，与对照组相比，Lm-Neo 20和Lm-Neo 12各自引起存活时间增加，其中Lm-Neo 20提供最大的保护作用(图23C)。这些数据显示使用，携带新表位的Lm进行免疫能够赋予抗肿瘤作用，并且增加新表位的数目增加了抗肿瘤作用。
实验2
为了进一步比较通过不同Lm新抗原构建体生成的治疗性应答，设计肿瘤消退研究以在B16F10 C57Bl/6小鼠黑素瘤模型中检查此类构建体对肿瘤生长的治疗性作用。确切地说，使用由Castle等识别的12个新抗原(Lm-Castle 12)、20个新抗原(Lm-Castle 20)或39个新抗原(Lm-Castle 39；无接头，无20-29(Lm-Castle 30))设计Lm新抗原载体。参见例如Castle等，(2012)Cancer Res.72(5):1081-1091，其出于所有目的通过引用整体并入本申请。
肿瘤细胞系扩增。在含有10％FBS(50mL)和1X Glutamax(5mL)的c-RPMI中培养B16F10黑素瘤细胞系。
肿瘤接种。在第0天，用胰蛋白酶处理B16F10细胞并且将其用培养基洗涤两次。对细胞计数并且以1×105个细胞/200μl PBS的浓度重悬以用于注射。随后在每只小鼠的右侧腹皮下植入B16F10细胞。在研究的第4天，对小鼠进行疫苗接种。每周两次测量和记录肿瘤，直至体积达到1500mm3的大小。一旦肿瘤符合处死标准，对小鼠实施安乐死并且切下并测量肿瘤。
免疫疗法治疗。在第4天，开始免疫疗法和治疗。每7天对动物进行一次治疗直至研究结束。用PBS、Lmdd274、Lm-Castle 12、Lm-Castle 20、Lm-Castle 39无接头无20-29来处理各组，详见表9。
表9治疗方案。
免疫疗法治疗制备物。
1.仅PBS–腹腔注射200μL/只小鼠。
2.LmddA-274(滴度：1.7×109个CFU/mL)
a.在37℃水浴中将1个小瓶从-80℃解冻。
b.以14000rpm旋转2分钟并弃去上清液。
c.用1mL PBS洗涤2次并弃去PBS。
d.在PBS中重悬以达到最终浓度5×108个CFU/mL。
3.Lm-Castle 12(滴度：1.59×109个CFU/mL)和Lm-Castle 20(滴度:1.6×109个CFU/mL)和Lm-Castle 39(滴度：1×109个CFU/mL)
a.在37℃水浴中将1个小瓶从-80℃解冻。
b.以14000rpm旋转2分钟并弃去上清液。
c.用1mL PBS洗涤2次并弃去PBS。
d.在PBS中重悬以达到最终浓度5×108个CFU/mL。
收获详情。在含有5mL c-RPMI培养基的单个管中收集来自每只小鼠的脾。详细步骤如下所述。在研究终止时切下并测量所有肿瘤。
1.使用无菌镊子和剪刀收获脾脏。
2.使用两个载玻片或来自3mL注射器的柱塞背面在洗涤培养基(仅RPMI)中捣碎的每个脾。
3.将培养基中的细胞转移至15mL管中。
4.在室温下使细胞以1000RPM沉淀5分钟。
5.弃去上清液，将细胞轻轻重悬于其余洗涤缓冲液中，将每个脾2mL RBC裂解缓冲液加入细胞沉淀物中。通过轻敲管来将细胞与裂解缓冲液轻轻混合并等待1分钟。
6.立即向细胞悬浮液中加入10mL c-RPMI培养基以灭活细胞裂解缓冲液。
7.在室温下使细胞以1000旋转5分钟。
8.使细胞通过细胞过滤器，并且将其用10mL c-RPMI再洗涤一次。
9.使用血细胞计数器/moxi flow对细胞计数，并且通过台盼蓝染色检查活力。每个脾应产生约1-2×108个细胞。
10.将细胞分开用于染色。
11.遵循immudex dextramer染色方案：除了是将细胞表面抗体(CD8、CD62L)添加在2.4G2中，而非染色缓冲液中(www.immudex.com/media/12135/tf1003.03_general_staining_procedure_mhc_dextramer.pdf)。
CD8+T细胞应答。如上所述进行25D测定，以测量Lm-Neo 20构建体在抗原呈递细胞中的表达和分泌。图24A是阳性对照(PSA-生存素-SIINFEKL)，图24B是阴性对照(PSA-生存素而无SIINFEKL)，并且图24C是Lm-Neo 20(在C端具有SIINFEKL标签)。如图24所示，Lm-Neo20表达并被分泌，但与阳性对照相比仅以低水平进行。然而，在这些低分泌水平下仍然观察到了对SIINFEKL的特异性CD8+T细胞应答。图25示出了对“低分泌”Lm-Neo 20构建体的SIINFEKL特异性CD8+T细胞应答。如图25所示，大约20％的CD8+T细胞对于Lm Neo 20构建体中的抗原是特异性的。
抗肿瘤作用。如图26A所示，与对照组(PBS和Lmdd274)相比，Lm-Neo 12和Lm-Neo20和Lm-Neo 30抑制了肿瘤的生长。另外，含有30个新抗原的Lm-Neo 30抑制肿瘤生长的程度大于含有20个新抗原的Lm-Neo 20，Lm-Neo 20抑制肿瘤生长的程度大于含有12个新抗原的Lm-Neo 12。同样地，与对照组相比，Lm-Neo 30、Lm-Neo 20和Lm-Neo 12各自引起存活时间增加，其中Lm-Neo 30提供最大的保护作用且Lm-Neo 20提供第二大的保护作用(图23C)。这些数据显示，使用携带新表位的Lm进行免疫接种能够赋予抗肿瘤作用，并且增加新表位的数目增加了抗肿瘤作用。
实施例21：识别由移码突变产生的潜在新抗原
基于非同义体细胞错义突变的新表位水平在适应症之间和之内显著不同。表10中示出了适应症之间和之内的变化的示例。
表10基于非同义体细胞突变的新表位在适应症中和内部显著不同。
新表位的大概率存在可能是应答的重要因素，且具有较少新表位的肿瘤不太可能产生应答。为了增加具有低数量的肿瘤特异性、非同义、体细胞、错义突变的肿瘤的潜在新表位的数量，可使用由具有肿瘤特异性移码突变的基因编码的无义肽。突变数据获取自前列腺腺癌(PRAD)、胰腺腺癌(PAAD)、乳腺浸润癌(BRCA)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)和甲状腺癌的癌症基因组图谱(TCGA)。这些疾病群组中的患者的特征在于单核苷酸变异(SNV)的突变率低(低错义突变率)。识别由移码突变产生的新抗原可扩增Lm技术的靶标。为此，我们识别了TCGA疾病群组中每位患者的每个移码突变，并且对所得的新抗原肽进行计算(表11，图27)。来自移码突变的新抗原肽的平均数的范围为甲状腺癌中的1.56至胰腺腺癌中的20.02。肽序列的平均长度范围为胰腺腺癌中的26.90至甲状腺癌中的31.10。所有群组中最大的肽长度为403个氨基酸长。MHC I类分子可结合长度为8-11个氨基酸的肽。由移码突变产生的非自身肽序列具有呈现多个肽片段的潜力，所述肽片段将利用Lm技术引发阳性免疫应答。
表11 PAAD、PRAD、BRCA、OV和THCA群组中的移码突变。
实施例22：来源于肿瘤特异性移码突变的新抗原能够控制肿瘤生长
为了确定含有来源于移码突变的新抗原的Lm构建体是否能够控制肿瘤生长，进行了肿瘤消退研究以检验Lm新抗原载体(Lm Neo 12、Lm移码突变1和Lm移码突变2)相比于空载体阴性对照菌株LmddA-274的治疗功效。Lm B16F10移码突变1嵌合蛋白如SEQ ID NO:61所示(由SEQ ID NO:62编码)。Lm B16F10移码突变2嵌合蛋白如SEQ ID NO:63所示(由SEQID NO:64编码)。第3个Lm B16F10移码突变嵌合蛋白如SEQ ID NO:65所示(由SEQ ID NO:66编码)。
肿瘤细胞系扩增：将B16F10黑素瘤细胞在含有10％FBS(50mL)和1X Glutamax(5mL)的c-RPMI中进行培养。
肿瘤接种：在第0天，用胰蛋白酶处理(26SEP16)B16F10细胞并将其用培养基洗涤两次。对细胞计数并以1×105个细胞/200μl PBS的浓度重悬以用于注射。在每只小鼠的右侧腹皮下植入B16F10细胞。将全部动物置于随机组中。在研究的第3天对小鼠进行接种(29SEP16)。
疫苗/Lm处理：在第3天开始疫苗和处理。用Lm处理各组(200μL/只小鼠，腹腔注射)并进行无限强化治疗(详情列于表12中)。
疫苗/治疗制备。
a.在37℃水浴中将1个小瓶从-80℃解冻。
b.以14000rpm旋转2分钟并弃去上清液。
c.用1mL PBS洗涤2次并弃去PBS。
d.在PBS中重悬以达到最终浓度5×108个CFU/mL。
表12：治疗方案。
结果：如图28所示，与仅用空载体阴性对照(LmddA-274)处理的肿瘤携带动物相比，用分泌来源于B16F10肿瘤细胞的移码突变(移码突变1或移码突变2)的Lm构建体免疫的B16F10肿瘤携带小鼠的肿瘤生长减少。Neo 12用作阳性对照。
虽然本申请已说明和描述了本申请公开的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本申请真实精神范围内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
<120> 基于个性化递送载体的免疫疗法及其用途
<130> 062384/490970
<150> US 62/287,871
<151> 2016-01-27
<160> 120
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 鸡
<400> 1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 2
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
20 25 30
<210> 3
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 3
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
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Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
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Glu
<210> 4
<211> 441
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 4
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Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
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Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
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Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
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Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
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Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
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Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
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<211> 416
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<213> 单核细胞增多性李斯特菌
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Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
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Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
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260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 6
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 7
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 8
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 9
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
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Arg
<210> 10
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<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 10
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Streptococcus equisimilis
<400> 11
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 12
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<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 12
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
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65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
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Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
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165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
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225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
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275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
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Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
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340 345 350
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405 410 415
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Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro
435 440 445
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450 455 460
Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn
465 470 475 480
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Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
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<211> 390
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 13
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
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Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
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Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
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Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
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Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
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Gly Arg Gly Gly Arg Pro
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<211> 100
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 14
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100
<210> 15
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<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 15
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
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Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys
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Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile
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Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys
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340 345 350
Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser
355 360 365
Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro
370 375 380
Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu
385 390 395 400
Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu
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Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly
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Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe
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Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn
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Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr
485 490 495
Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
515 520 525
Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met
530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
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Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser
565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
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Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630 635
<210> 16
<211> 93
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 16
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
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Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly
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<210> 17
<211> 200
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 17
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165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys
195 200
<210> 18
<211> 226
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 18
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Ser Arg Ala Thr Asp Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln
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Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn
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Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys
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Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu
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Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys
130 135 140
Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr
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Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu
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Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser
180 185 190
Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe
195 200 205
Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg
210 215 220
Asp Lys
225
<210> 19
<211> 678
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 19
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag catctagagc gacagatagc gaagattcca gtctaaacac agatgaatgg 120
gaagaagaaa aaacagaaga gcagccaagc gaggtaaata cgggaccaag atacgaaact 180
gcacgtgaag taagttcacg tgatattgag gaactagaaa aatcgaataa agtgaaaaat 240
acgaacaaag cagacctaat agcaatgttg aaagcaaaag cagagaaagg tccgaataac 300
aataataaca acggtgagca aacaggaaat gtggctataa atgaagaggc ttcaggagtc 360
gaccgaccaa ctctgcaagt ggagcgtcgt catccaggtc tgtcatcgga tagcgcagcg 420
gaaattaaaa aaagaagaaa agccatagcg tcgtcggata gtgagcttga aagccttact 480
tatccagata aaccaacaaa agcaaataag agaaaagtgg cgaaagagtc agttgtggat 540
gcttctgaaa gtgacttaga ttctagcatg cagtcagcag acgagtctac accacaacct 600
ttaaaagcaa atcaaaaacc atttttccct aaagtattta aaaaaataaa agatgcgggg 660
aaatgggtac gtgataaa 678
<210> 20
<211> 303
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 20
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
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Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
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Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
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Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
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Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
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Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser
290 295 300
<210> 21
<211> 370
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 21
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
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Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe
290 295 300
Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu
305 310 315 320
Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser
325 330 335
Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro
340 345 350
Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr
355 360 365
Ser Glu
370
<210> 22
<211> 1170
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 22
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 23
<211> 6523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 23
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagattgt gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtgg 2460
cctctcgtgg cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacag 2520
ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatc 2580
ctgaagacac aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgata 2640
tgagcctcct gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgc 2700
tgctccgcct gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgccca 2760
cccaggagcc agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag 2820
aggagttctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 2880
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 2940
cagggggcaa aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt tatggtgtgc 3000
ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgt 3060
acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctaac 3120
ccgggccact aactcaacgc tagtagtgga tttaatccca aatgagccaa cagaaccaga 3180
accagaaaca gaacaagtaa cattggagtt agaaatggaa gaagaaaaaa gcaatgattt 3240
cgtgtgaata atgcacgaaa tcattgctta tttttttaaa aagcgatata ctagatataa 3300
cgaaacaacg aactgaataa agaatacaaa aaaagagcca cgaccagtta aagcctgaga 3360
aactttaact gcgagcctta attgattacc accaatcaat taaagaagtc gagacccaaa 3420
atttggtaaa gtatttaatt actttattaa tcagatactt aaatatctgt aaacccatta 3480
tatcgggttt ttgaggggat ttcaagtctt taagaagata ccaggcaatc aattaagaaa 3540
aacttagttg attgcctttt ttgttgtgat tcaactttga tcgtagcttc taactaatta 3600
attttcgtaa gaaaggagaa cagctgaatg aatatccctt ttgttgtaga aactgtgctt 3660
catgacggct tgttaaagta caaatttaaa aatagtaaaa ttcgctcaat cactaccaag 3720
ccaggtaaaa gtaaaggggc tatttttgcg tatcgctcaa aaaaaagcat gattggcgga 3780
cgtggcgttg ttctgacttc cgaagaagcg attcacgaaa atcaagatac atttacgcat 3840
tggacaccaa acgtttatcg ttatggtacg tatgcagacg aaaaccgttc atacactaaa 3900
ggacattctg aaaacaattt aagacaaatc aataccttct ttattgattt tgatattcac 3960
acggaaaaag aaactatttc agcaagcgat attttaacaa cagctattga tttaggtttt 4020
atgcctacgt taattatcaa atctgataaa ggttatcaag catattttgt tttagaaacg 4080
ccagtctatg tgacttcaaa atcagaattt aaatctgtca aagcagccaa aataatctcg 4140
caaaatatcc gagaatattt tggaaagtct ttgccagttg atctaacgtg caatcatttt 4200
gggattgctc gtataccaag aacggacaat gtagaatttt ttgatcccaa ttaccgttat 4260
tctttcaaag aatggcaaga ttggtctttc aaacaaacag ataataaggg ctttactcgt 4320
tcaagtctaa cggttttaag cggtacagaa ggcaaaaaac aagtagatga accctggttt 4380
aatctcttat tgcacgaaac gaaattttca ggagaaaagg gtttagtagg gcgcaatagc 4440
gttatgttta ccctctcttt agcctacttt agttcaggct attcaatcga aacgtgcgaa 4500
tataatatgt ttgagtttaa taatcgatta gatcaaccct tagaagaaaa agaagtaatc 4560
aaaattgtta gaagtgccta ttcagaaaac tatcaagggg ctaataggga atacattacc 4620
attctttgca aagcttgggt atcaagtgat ttaaccagta aagatttatt tgtccgtcaa 4680
gggtggttta aattcaagaa aaaaagaagc gaacgtcaac gtgttcattt gtcagaatgg 4740
aaagaagatt taatggctta tattagcgaa aaaagcgatg tatacaagcc ttatttagcg 4800
acgaccaaaa aagagattag agaagtgcta ggcattcctg aacggacatt agataaattg 4860
ctgaaggtac tgaaggcgaa tcaggaaatt ttctttaaga ttaaaccagg aagaaatggt 4920
ggcattcaac ttgctagtgt taaatcattg ttgctatcga tcattaaatt aaaaaaagaa 4980
gaacgagaaa gctatataaa ggcgctgaca gcttcgttta atttagaacg tacatttatt 5040
caagaaactc taaacaaatt ggcagaacgc cccaaaacgg acccacaact cgatttgttt 5100
agctacgata caggctgaaa ataaaacccg cactatgcca ttacatttat atctatgata 5160
cgtgtttgtt tttctttgct ggctagctta attgcttata tttacctgca ataaaggatt 5220
tcttacttcc attatactcc cattttccaa aaacatacgg ggaacacggg aacttattgt 5280
acaggccacc tcatagttaa tggtttcgag ccttcctgca atctcatcca tggaaatata 5340
ttcatccccc tgccggccta ttaatgtgac ttttgtgccc ggcggatatt cctgatccag 5400
ctccaccata aattggtcca tgcaaattcg gccggcaatt ttcaggcgtt ttcccttcac 5460
aaggatgtcg gtccctttca attttcggag ccagccgtcc gcatagccta caggcaccgt 5520
cccgatccat gtgtcttttt ccgctgtgta ctcggctccg tagctgacgc tctcgccttt 5580
tctgatcagt ttgacatgtg acagtgtcga atgcagggta aatgccggac gcagctgaaa 5640
cggtatctcg tccgacatgt cagcagacgg gcgaaggcca tacatgccga tgccgaatct 5700
gactgcatta aaaaagcctt ttttcagccg gagtccagcg gcgctgttcg cgcagtggac 5760
cattagattc tttaacggca gcggagcaat cagctcttta aagcgctcaa actgcattaa 5820
gaaatagcct ctttcttttt catccgctgt cgcaaaatgg gtaaataccc ctttgcactt 5880
taaacgaggg ttgcggtcaa gaattgccat cacgttctga acttcttcct ctgtttttac 5940
accaagtctg ttcatccccg tatcgacctt cagatgaaaa tgaagagaac cttttttcgt 6000
gtggcgggct gcctcctgaa gccattcaac agaataacct gttaaggtca cgtcatactc 6060
agcagcgatt gccacatact ccgggggaac cgcgccaagc accaatatag gcgccttcaa 6120
tccctttttg cgcagtgaaa tcgcttcatc caaaatggcc acggccaagc atgaagcacc 6180
tgcgtcaaga gcagcctttg ctgtttctgc atcaccatgc ccgtaggcgt ttgctttcac 6240
aactgccatc aagtggacat gttcaccgat atgttttttc atattgctga cattttcctt 6300
tatcgcggac aagtcaattt ccgcccacgt atctctgtaa aaaggttttg tgctcatgga 6360
aaactcctct cttttttcag aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt 6420
atattgatta atactaagtt tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag 6480
ctccaaaggc taaagaggac tataccaact atttgttaat taa 6523
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
cggaattcgg atccgcgcca aatcattggt tgattg 36
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gcgagtcgac gtcggggtta atcgtaatgc aattggc 37
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gcgagtcgac ccatacgacg ttaattcttg caatg 35
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gatactgcag ggatccttcc cttctcggta atcagtcac 39
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tgggatggcc aagaaattc 19
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
ctaccatgtc ttccgttgct tg 22
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tgatctcgag acccacctgg acatgctc 28
<210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgc 49
<210> 32
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gcagccagca aactcctgga tattcttcca caaaatcgtg tcctggtag 49
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcagca gaagatccgg aagtacacga 50
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tcgtgtactt ccggatcttc tgctgccctc gggcgcacag ctggtggcag 50
<210> 35
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
gtggcccggg tctagattag tctaagaggc agccatagg 39
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ccgcctcgag gccgcgagca cccaagtg 28
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
cgcgactagt ttaatcctct gctgtcacct c 31
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
ccgcctcgag tacctttcta cggacgtg 28
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
cgcgactagt ttactctggc cggttggcag 30
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
ccgcctcgag cagcagaaga tccggaagta c 31
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
cgcgactagt ttaagcccct tcggagggtg 30
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val
1 5
<210> 45
<211> 5851
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 45
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgaggagct cctgcagtct agagtcgaca ctagtggatc cagatctccc gggccactaa 2460
ctcaacgcta gtagtggatt taatcccaaa tgagccaaca gaaccagaac cagaaacaga 2520
acaagtaaca ttggagttag aaatggaaga agaaaaaagc aatgatttcg tgtgaataat 2580
gcacgaaatc attgcttatt tttttaaaaa gcgatatact agatataacg aaacaacgaa 2640
ctgaataaag aatacaaaaa aagagccacg accagttaaa gcctgagaaa ctttaactgc 2700
gagccttaat tgattaccac caatcaatta aagaagtcga gacccaaaat ttggtaaagt 2760
atttaattac tttattaatc agatacttaa atatctgtaa acccattata tcgggttttt 2820
gaggggattt caagtcttta agaagatacc aggcaatcaa ttaagaaaaa cttagttgat 2880
tgcctttttt gttgtgattc aactttgatc gtagcttcta actaattaat tttcgtaaga 2940
aaggagaaca gctgaatgaa tatccctttt gttgtagaaa ctgtgcttca tgacggcttg 3000
ttaaagtaca aatttaaaaa tagtaaaatt cgctcaatca ctaccaagcc aggtaaaagt 3060
aaaggggcta tttttgcgta tcgctcaaaa aaaagcatga ttggcggacg tggcgttgtt 3120
ctgacttccg aagaagcgat tcacgaaaat caagatacat ttacgcattg gacaccaaac 3180
gtttatcgtt atggtacgta tgcagacgaa aaccgttcat acactaaagg acattctgaa 3240
aacaatttaa gacaaatcaa taccttcttt attgattttg atattcacac ggaaaaagaa 3300
actatttcag caagcgatat tttaacaaca gctattgatt taggttttat gcctacgtta 3360
attatcaaat ctgataaagg ttatcaagca tattttgttt tagaaacgcc agtctatgtg 3420
acttcaaaat cagaatttaa atctgtcaaa gcagccaaaa taatctcgca aaatatccga 3480
gaatattttg gaaagtcttt gccagttgat ctaacgtgca atcattttgg gattgctcgt 3540
ataccaagaa cggacaatgt agaatttttt gatcccaatt accgttattc tttcaaagaa 3600
tggcaagatt ggtctttcaa acaaacagat aataagggct ttactcgttc aagtctaacg 3660
gttttaagcg gtacagaagg caaaaaacaa gtagatgaac cctggtttaa tctcttattg 3720
cacgaaacga aattttcagg agaaaagggt ttagtagggc gcaatagcgt tatgtttacc 3780
ctctctttag cctactttag ttcaggctat tcaatcgaaa cgtgcgaata taatatgttt 3840
gagtttaata atcgattaga tcaaccctta gaagaaaaag aagtaatcaa aattgttaga 3900
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gcttgggtat caagtgattt aaccagtaaa gatttatttg tccgtcaagg gtggtttaaa 4020
ttcaagaaaa aaagaagcga acgtcaacgt gttcatttgt cagaatggaa agaagattta 4080
atggcttata ttagcgaaaa aagcgatgta tacaagcctt atttagcgac gaccaaaaaa 4140
gagattagag aagtgctagg cattcctgaa cggacattag ataaattgct gaaggtactg 4200
aaggcgaatc aggaaatttt ctttaagatt aaaccaggaa gaaatggtgg cattcaactt 4260
gctagtgtta aatcattgtt gctatcgatc attaaattaa aaaaagaaga acgagaaagc 4320
tatataaagg cgctgacagc ttcgtttaat ttagaacgta catttattca agaaactcta 4380
aacaaattgg cagaacgccc caaaacggac ccacaactcg atttgtttag ctacgataca 4440
ggctgaaaat aaaacccgca ctatgccatt acatttatat ctatgatacg tgtttgtttt 4500
tctttgctgg ctagcttaat tgcttatatt tacctgcaat aaaggatttc ttacttccat 4560
tatactccca ttttccaaaa acatacgggg aacacgggaa cttattgtac aggccacctc 4620
atagttaatg gtttcgagcc ttcctgcaat ctcatccatg gaaatatatt catccccctg 4680
ccggcctatt aatgtgactt ttgtgcccgg cggatattcc tgatccagct ccaccataaa 4740
ttggtccatg caaattcggc cggcaatttt caggcgtttt cccttcacaa ggatgtcggt 4800
ccctttcaat tttcggagcc agccgtccgc atagcctaca ggcaccgtcc cgatccatgt 4860
gtctttttcc gctgtgtact cggctccgta gctgacgctc tcgccttttc tgatcagttt 4920
gacatgtgac agtgtcgaat gcagggtaaa tgccggacgc agctgaaacg gtatctcgtc 4980
cgacatgtca gcagacgggc gaaggccata catgccgatg ccgaatctga ctgcattaaa 5040
aaagcctttt ttcagccgga gtccagcggc gctgttcgcg cagtggacca ttagattctt 5100
taacggcagc ggagcaatca gctctttaaa gcgctcaaac tgcattaaga aatagcctct 5160
ttctttttca tccgctgtcg caaaatgggt aaatacccct ttgcacttta aacgagggtt 5220
gcggtcaaga attgccatca cgttctgaac ttcttcctct gtttttacac caagtctgtt 5280
catccccgta tcgaccttca gatgaaaatg aagagaacct tttttcgtgt ggcgggctgc 5340
ctcctgaagc cattcaacag aataacctgt taaggtcacg tcatactcag cagcgattgc 5400
cacatactcc gggggaaccg cgccaagcac caatataggc gccttcaatc cctttttgcg 5460
cagtgaaatc gcttcatcca aaatggccac ggccaagcat gaagcacctg cgtcaagagc 5520
agcctttgct gtttctgcat caccatgccc gtaggcgttt gctttcacaa ctgccatcaa 5580
gtggacatgt tcaccgatat gttttttcat attgctgaca ttttccttta tcacggacaa 5640
gtcaatttcc gcccacgtat ctctgtaaaa aggttttgtg ctcatggaaa actcctctct 5700
tttttcagaa aatcccagta cgtaattaag tatttgagaa ttaattttat attgattaat 5760
actaagttta cccagttttc acctaaaaaa caaatgatga gataatagct ccaaaggcta 5820
aagaggacta taccaactat ttgttaatta a 5851
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 46
ggtggtggag ga 12
<210> 47
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 47
ggtggaggtg ga 12
<210> 48
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 48
ggtggaggag gt 12
<210> 49
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
ggaggtggtg ga 12
<210> 50
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 50
ggaggaggtg gt 12
<210> 51
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 51
ggaggtggag gt 12
<210> 52
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
ggaggaggag gt 12
<210> 53
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 53
ggaggaggtg ga 12
<210> 54
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 54
ggaggtggag ga 12
<210> 55
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 55
ggtggaggag ga 12
<210> 56
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
ggaggaggag ga 12
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签肽
<400> 57
Ala Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ser His His His His His
1 5 10 15
His
<210> 58
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 58
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 2460
acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 2520
aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 2580
tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 2640
atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 2700
agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 2760
cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgca 2820
agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac ccagcctcca 2880
acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa gagatcacag 2940
gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc 3000
tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc 3060
tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca 3120
tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga 3180
acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg 3240
gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcagcagaa gatccggaag tacacgatgc 3300
ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac acctagcgga gcgatgccca 3360
accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag gaaggtgaag gtgcttggat 3420
ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc tgatggggag aatgtgaaaa 3480
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc caaagccaac aaagaaatct 3540
tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 3600
tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660
actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu
1 5 10
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST基序替换
<400> 60
Gln Asp Asn Lys Arg
1 5
<210> 61
<211> 649
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合蛋白
<400> 61
Gly Ala Glu Gly Gly Glu Gly Val Ser Val Pro Pro Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ser Ala Arg Pro Leu Cys Ser Arg
20 25 30
His Arg Val Trp His Arg Ser Trp Leu Gly His Gly Pro Pro Ser Ser
35 40 45
Phe Gly His Leu Gln Trp Arg Asp His Pro Val Pro Arg Pro Pro Trp
50 55 60
Ala Val Pro Thr Trp Pro Arg Trp Arg Leu Tyr Ser Thr Leu Pro Glu
65 70 75 80
Ala Pro Thr Gly Pro Pro Gly Arg Gly Lys Gly Asp Pro Asp Arg Arg
85 90 95
Arg His Cys Pro Cys Phe Leu Glu Thr Pro Arg Trp Pro Arg Asp Ser
100 105 110
Gly Asp Thr Leu His His Leu Val Cys Phe Gln Glu Gly Leu Asp Cys
115 120 125
Gly Arg Val Ala Gly Ser Ser Pro Arg Arg Gly Asn His His Gly Phe
130 135 140
Ala Gly Lys Pro Gly Gly Arg Glu Arg Val His Cys Gln Asp Ile Cys
145 150 155 160
Val Gln Arg Gly Gly Arg Arg Ala Leu Phe Lys Leu Arg Gly Ala Gly
165 170 175
Arg Pro Pro Gln Gly Cys Phe Arg Val Glu Pro Glu Ala Gln Ala Phe
180 185 190
Gly Phe Phe Gln Cys Gln Ser Leu Phe Arg Leu Leu Pro Ser Gly Pro
195 200 205
Lys Val Asn Asp Gly His Arg Ser Arg Arg Trp His Ser Leu Asp Leu
210 215 220
Tyr Pro His Leu Cys Ser His Leu Asp Leu Pro Lys Gln Ser Gln Glu
225 230 235 240
Val Ile Arg Leu Cys Glu Ser Ile Ser Glu Leu Leu Tyr Arg Met Gly
245 250 255
Ser Pro Ala Leu Val Ile Leu Lys Ile Ser Ala Gln Leu Arg Ile Thr
260 265 270
Ala Glu Val Cys Arg Leu Pro Thr Ala Ala Gln Gly Ala Pro Tyr Val
275 280 285
Ile Thr Arg Leu Val Glu Ser Ser Pro Gln His Pro Leu Ala Leu Thr
290 295 300
Gly Glu Cys Cys Pro Ser Ala Trp Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Thr
305 310 315 320
Pro Ser Cys Ile Pro Cys Cys Asp Thr Asn Thr Ala Gly Ala Ala Arg
325 330 335
Ser Ser Ser His Asp Leu Ser Gly Arg Arg Arg Ser Arg Gly Gly Ala
340 345 350
Arg Cys Ser Ala Ser Gly Leu Cys Arg Gln Arg Thr Gln Asp Gly His
355 360 365
Ser Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Pro Cys Cys
370 375 380
Ile Leu Lys Leu Leu Ala Ser Asp Trp Leu Gly Cys Thr Ser Gly Leu
385 390 395 400
Val Ser Leu His Ser Arg Arg Gly Arg Arg Leu Glu Cys Leu Gln Ser
405 410 415
Gln Pro Pro Glu Pro Met Thr Ser Thr Asn Pro Pro Ser Phe Pro Leu
420 425 430
Arg Lys Arg Glu Ser Gly Arg Ile Pro Val Arg Lys Ser Ser Ser Gln
435 440 445
Met Pro Ser Val Gly Leu Pro Gly Asp Phe Leu His Pro Pro Gln Ala
450 455 460
Gln His Thr Glu Arg His Thr Asp Asn Phe Gly Lys Tyr Asn Pro Ser
465 470 475 480
Asp Tyr Leu Gln Gly Thr Ala Gly Pro Gly Leu Ala Leu Ala Gln Cys
485 490 495
Ser Ala Thr Thr Val Cys Leu His Ser Lys Asp Gly His Pro Lys Leu
500 505 510
Ser Leu Leu Val Leu Pro Thr Ser Gln Trp Trp Tyr Tyr Phe Leu Gly
515 520 525
Pro Ala Ser Ser Ser Thr Cys Gly Gln Ser Ala Asn Ile Gln Gly Val
530 535 540
Gln Arg Ser Leu Glu Gly Trp Gln Thr Cys Trp Gly Arg Ser Arg Lys
545 550 555 560
His Trp Gly Ser Thr Trp Asn Gly Ser Ala Arg Leu Ser Pro Gly Ser
565 570 575
Thr Leu Trp Val Met Arg Ile Cys Leu Arg Ser Leu Gly Ile Ala Arg
580 585 590
Thr Trp Leu Ser Cys Arg Ser Thr Ser Arg Lys Cys Ser Pro Ala Phe
595 600 605
Pro Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Arg Val Gly Pro Thr Gly Glu Lys
610 615 620
Arg Arg His Gly Gly Gln Arg Thr Glu Arg His Cys Gly Pro Pro Trp
625 630 635 640
Lys Asn Trp Ser His Trp Arg Lys Arg
645
<210> 62
<211> 2004
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码嵌合蛋白的核酸序列
<400> 62
ggtgcggaag gtggtgaggg cgtaagtgtt cctccacttt tatctcttcg tttgttagaa 60
cttttgcgtg aatctgcacg tccgctttgt tctcgtcacc gtgtatggca tcgttcatgg 120
ttaggacatg gtccaccaag ttcttttggt cacctacaat ggcgtgacca ccctgtacca 180
agaccaccat gggctgttcc aacatggcct cgctggcgct tatacagtac gcttcctgaa 240
gcgccgactg gcccaccagg tcgtggaaaa ggagacccag accgtcgtcg tcactgtcca 300
tgtttccttg agactccacg ctggccacgc gattcaggag atactttaca ccatttagta 360
tgttttcaag aaggtctaga ttgtggacgt gttgctggta gcagccctcg tcgtggtaat 420
catcatggat ttgcaggaaa accaggtggt cgtgaacgcg tgcactgtca agacatctgc 480
gttcagcgcg gtggacgccg tgcacttttc aaactacgcg gcgctggccg tccacctcaa 540
ggatgtttcc gtgtagaacc tgaagcacaa gcattcggtt ttttccaatg tcaatcactt 600
ttccgtcttc ttcctagtgg tccaaaagtt aatgacggtc atcgttcacg tcgctggcac 660
agccttgatt tatatccaca tttatgtagt cacttggatc ttcctaaaca atctcaagaa 720
gtaatccgtc tttgtgaatc tattagtgaa ttactttatc gtatgggttc tccagctctg 780
gtaattttga aaatctcagc tcaacttcgt atcactgcag aagtatgccg tttacctact 840
gcagctcaag gcgcaccata cgttattact cgtttagttg aaagctctcc tcaacaccca 900
ttagcattaa ctggtgaatg ttgtccgtct gcatggccaa cagctcgtcc actattaaca 960
ccttcttgca ttccatgctg tgacacaaat acagctggag cagctagatc atcctcacat 1020
gatttatctg gacgtcgtcg ttcacgtggt ggcgctcgtt gttcagcatc tggtttgtgt 1080
cgccaacgta cacaagacgg ccattcttta ggagcaccag atagtggctc tggaggttcc 1140
cctccatgtt gcattttaaa acttcttgca agtgattggt taggatgtac gtcaggttta 1200
gtatctctac attctcgtcg aggtcgtcgt cttgaatgtt tacaatctca accaccagaa 1260
ccaatgactt ccacaaatcc tccaagtttt cctttacgta agcgtgaatc gggtcgtatt 1320
ccagttcgca aatcttctag ccaaatgcca tcagtaggcc taccgggtga ttttttacac 1380
cctcctcaag ctcaacacac agaacgtcac actgacaact tcggcaaata caacccaagc 1440
gattatttgc agggtactgc tggtccaggc ttagcactag cacaatgttc tgctacgaca 1500
gtttgtcttc atagtaaaga tggacaccca aaattatctt tattagtcct tccaacaagc 1560
caatggtggt attacttttt aggtccagct tcatcttcta cttgtggtca atctgcaaat 1620
attcaaggcg ttcaacgcag tttagaaggc tggcaaacat gttggggccg ttcccgtaag 1680
cactggggta gcacttggaa tggctccgca agattgtccc caggatctac cctttgggtt 1740
atgcgtattt gtttacgtag tttgggcatt gcacgtacat ggttaagctg tcgttcaacg 1800
tctcgtaaat gttctcccgc attcccagcg tcatctggtc gtccaggccg tgttggtcca 1860
accggcgaaa aacgtcgcca cggaggtcaa cgcaccgaac gtcactgcgg tccaccatgg 1920
aaaaactgga gccattggcg taaacgcgct cgttctatca ttaacttcga aaaattatct 1980
catcaccatc atcaccatta ataa 2004
<210> 63
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合蛋白
<400> 63
Asn Ile Gln Gly Val Gln Arg Ser Leu Glu Gly Trp Gln Thr Cys Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Arg Lys His Trp Gly Ser Thr Trp Asn Gly Ser Ala Arg
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Ser Thr Leu Trp Val Met Arg Ile Cys Leu Arg Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Ala Arg Thr Trp Leu Ser Cys Arg Ser Thr Ser Arg Lys
50 55 60
Cys Ser Pro Ala Phe Pro Ala Ser Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ala Pro
65 70 75 80
Thr Gly Pro Pro Gly Arg Gly Lys Gly Asp Pro Asp Arg Arg Arg His
85 90 95
Cys Pro Cys Phe Leu Glu Thr Pro Arg Trp Pro Arg Asp Ser Gly Asp
100 105 110
Thr Leu His His Leu Val Cys Phe Gln Glu Gly Leu Asp Cys Gly Arg
115 120 125
Val Ala Gly Ser Ser Pro Arg Arg Gly Asn His His Gly Phe Ala Gly
130 135 140
Lys Pro Gly Gly Arg Glu Arg Val His Cys Gln Asp Ile Cys Val Gln
145 150 155 160
Arg Gly Gly Arg Arg Ala Leu Phe Lys Leu Arg Gly Ala Gly Arg Pro
165 170 175
Pro Gln Gly Cys Phe Arg Val Glu Pro Glu Ala Gln Ala Phe Gly Phe
180 185 190
Phe Gln Cys Gln Ser Leu Phe Arg Leu Leu Pro Ser Gly Pro Lys Val
195 200 205
Asn Asp Gly His Arg Ser Arg Arg Trp His Ser Leu Asp Leu Tyr Pro
210 215 220
His Leu Cys Ser His Leu Asp Leu Pro Lys Gln Ser Gln Glu Val Ile
225 230 235 240
Arg Leu
<210> 64
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码嵌合蛋白的核酸序列
<400> 64
aacattcaag gtgtacaacg ttctctagaa ggttggcaaa catgttgggg tcgttctcgt 60
aagcactggg gaagcacatg gaacggctct gctcgtttat ctccaggttc tacgttatgg 120
gtaatgcgta tctgtctacg ttccctaggt atcgcgcgta cttggttaag ctgccgctcc 180
acttctcgca aatgttctcc agcatttccg gcatcgtcat ctactctacc agaagctcca 240
actggaccac caggtcgtgg taaaggcgat ccagaccgtc gtcgtcactg tccatgtttc 300
ttagaaactc cacgttggcc aagagatagc ggagacacat tgcatcatct agtatgtttc 360
caagaaggtt tagactgtgg tcgtgttgca ggttccagcc cacgtagagg taaccaccac 420
ggcttcgccg gtaaaccagg tggtcgtgaa cgtgttcatt gccaagatat ctgtgtacaa 480
cgtggaggtc gtcgtgcttt atttaaatta cgaggagcgg gtcgtcctcc acaaggttgt 540
tttcgcgttg aaccagaagc acaagcattt ggattctttc agtgtcaatc tcttttccgt 600
cttttgccta gtggaccaaa agtaaatgac ggacatcgct ctcggcgttg gcactcatta 660
gatttgtatc ctcatctttg tagtcatcta gatctaccaa aacaatctca agaagtaatt 720
cgtcttgctc gttctatcat taacttcgaa aaattatctc atcaccatca tcaccattaa 780
taa 783
<210> 65
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合蛋白
<400> 65
Asp Ala Leu Val Lys Asp Ser Glu Glu Asn Cys Lys Asn Trp Ser Asn
1 5 10 15
Ser Lys Arg Arg Leu Gln Lys Lys Lys Ala Pro Ser Arg Ser Gly Met
20 25 30
Ser Glu Arg Asn Asp Leu Phe Ser Phe Thr Phe Pro Arg Pro Asp Leu
35 40 45
Ala Cys Gly Ala Thr Trp Ile Arg Arg Asp Asp Thr Trp Gly Gly Gly
50 55 60
Asn Arg Asp Leu Asn Pro Val Gly Lys Gln Phe Lys Glu Trp His Cys
65 70 75 80
Ser Leu Cys Ser Val Cys Ala Arg Asn Ala Ile Asn Met Glu Tyr Thr
85 90 95
Ile Asp Ile Phe Phe Cys Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Glu Thr Ile
100 105 110
Gln Asn Met Ser Ile Lys Arg Leu Tyr Ser Ile Pro Ser Thr Glu Lys
115 120 125
Lys Glu Asn Leu Trp Thr Lys Phe Ile Leu Ala Arg Gly Gly Glu Glu
130 135 140
Gly Gly Ile Arg Thr Glu Asp Phe Phe Ala Ala Leu Asp Leu Lys Ala
145 150 155 160
Cys Pro Pro Ser Pro Ser Ala Gly Ser Trp Thr Glu Asp Ile Lys Leu
165 170 175
Glu Glu Lys Lys Lys Asn Pro Ser Arg Asn Gly Ser His Leu Ile Ala
180 185 190
Val Thr Val Phe Leu Trp Asp Phe Val Leu Tyr Val Pro Gln Ala Ser
195 200 205
Ile Ile Glu Asp Asp Glu Ser Gly Thr Glu Asn Arg Glu Gly Gln Phe
210 215 220
Thr Ala Leu Ser Asp Gly Val Asp Lys Gln Met Thr Gly Asn Phe Pro
225 230 235 240
Gln Glu Ile Arg Ser Phe Lys Cys Trp Thr Leu Asp Thr Leu His Pro
245 250 255
Asp Val Lys Lys Tyr Ile Ser Asp His Met Lys Val His Ser Pro Ser
260 265 270
Pro Cys Leu Ser Tyr Lys Gln Gln Ser His Ser Asn Leu Lys Lys Ile
275 280 285
Ser Phe Ser Ser Phe Ser Thr Tyr Leu Cys Pro Tyr Leu Thr Met Asp
290 295 300
Gln Ser Ala Lys Ser Ile Lys Glu Lys Lys Asn Met Lys Tyr Trp Ser
305 310 315 320
Cys Cys Arg Arg Lys Asn Phe Arg Phe Arg Gly Gly Leu Arg Arg Arg
325 330 335
Gly Ser Met Ala Pro Leu Arg Phe Ser Gly Val Ala Gln Gln Pro Leu
340 345 350
Ser Asn Gly Ala Ile Arg Glu Leu Ser Ala Lys Ala Cys Thr Thr Glu
355 360 365
Thr Val Ser Phe Leu Arg Lys Lys Lys Val Lys Leu Arg Ile Ile Tyr
370 375 380
Gly Glu Glu Asn Trp Arg Asn Arg Arg Lys Arg Ser Gln Leu Asp Val
385 390 395 400
Met Glu Gln Leu Glu Pro Lys Cys Pro Pro Lys Cys Pro Pro Lys Cys
405 410 415
Pro Pro Cys Val Phe Leu Leu Asn Gln Pro Val Gly Asn His Pro Ile
420 425 430
Pro Gly Gly Asn Arg Pro Ser Gln Gln Thr Val Glu Ile Lys Gly Lys
435 440 445
Ala Gln Lys Cys Phe Ser Phe Ser Met Ile Phe Ser Phe Leu Pro Tyr
450 455 460
Ser Met Ser Tyr Ser Gly His Phe
465 470
<210> 66
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码嵌合蛋白的核酸序列
<400> 66
gacgctcttg taaaagattc agaagaaaac tgtaagaact ggtcaaatag taaacgtcgc 60
cttcaaaaga aaaaagcacc atcccgttct ggtatgtccg aacgcaatga tttatttagt 120
ttcacattcc cacgccctga ccttgcgtgc ggcgcaacct ggatccgtcg tgatgatact 180
tggggcgggg gtaatcgcga tttaaatcca gttgggaaac aattcaaaga atggcattgc 240
tctctttgta gtgtttgtgc acgtaacgct attaacatgg aatatacgat cgacattttt 300
ttttgtccta acttagtagc tgctttagaa actattcaaa acatgagcat taaacgttta 360
tattctatcc catccactga aaaaaaagaa aacttatgga caaaattcat tttagcgcgt 420
ggtggtgaag aagggggaat tcgtacagaa gatttctttg ctgcacttga tttaaaagct 480
tgtccaccaa gcccatcagc aggcagttgg acggaagaca tcaaacttga agaaaaaaaa 540
aaaaacccta gccgtaacgg ctctcatcta attgcagtaa cagtattctt gtgggatttt 600
gtgttatatg tacctcaagc atcgattatt gaggacgatg aaagtggtac agaaaacaga 660
gaaggtcaat tcactgctct ttcagacggt gtagataaac aaatgacagg aaattttcct 720
caagaaatcc gttccttcaa atgttggact ttagatacac tacatccaga tgttaaaaaa 780
tatatctcag accatatgaa agttcattct ccttcaccat gtcttagcta caaacaacaa 840
tctcattcta acttaaaaaa aatctcattc tcaagcttct ctacatacct atgtccatat 900
ttaacgatgg accaatctgc aaaatctata aaagaaaaaa agaatatgaa atactggtct 960
tgttgtcgcc gcaaaaactt tcgttttcgt ggtggtctgc gtcgtcgtgg atctatggcg 1020
cctctacgtt tcagtggagt tgctcaacag ccactttcta atggtgctat ccgcgaactt 1080
agtgctaaag catgcacaac agaaacagtg agtttccttc gtaagaaaaa agttaaattg 1140
cgtattattt atggtgaaga aaattggcgc aaccgtcgta aacgctctca acttgacgta 1200
atggaacaac ttgaaccaaa atgtccacct aaatgtcctc caaaatgtcc accttgtgtt 1260
ttcttattaa accaacctgt tggcaaccac ccaatccctg gaggtaaccg tccatcccaa 1320
caaacagtag aaatcaaagg gaaagcacaa aaatgtttct ctttttctat gattttctcc 1380
tttttacctt atagtatgtc ttactccggc cacttcgctc gttctatcat taacttcgaa 1440
aaattatctc atcaccatca tcaccattaa taa 1473
<210> 67
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 解毒的李斯特菌溶血素O
<400> 67
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 68
Phe Met Val Ala Val Ala His Val Ala Ala Phe Leu Leu Glu Asp Arg
1 5 10 15
Ala Val Cys Val
20
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 69
Ala Glu Asn Val Glu Gln Val Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly Ala Val
1 5 10 15
Asp Tyr Pro Asp Pro
20
<210> 70
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 70
Ser Phe Lys Lys Lys Phe Glu Glu Cys Gln His Asn Ile Ile Lys Leu
1 5 10 15
Gln Asn Gly His Thr
20
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 71
Ser Ala Leu Ile Glu Ser Leu Asn Gln Lys Thr Gln Ser Thr Gly Asp
1 5 10 15
His Pro Gln Pro Thr
20
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 72
Lys Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe Ala Phe Thr Ala Asp Leu
1 5 10 15
Arg Ser Asn Thr Gly
20
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 73
His Thr Leu Leu Glu Ile Thr Glu Glu Ser Gly Ala Val Leu Val Asp
1 5 10 15
Lys Ser Asp Ser Asp
20
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 74
Ser Val Met Cys Thr Tyr Ser Pro Pro Leu Asp Lys Leu Phe Cys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Lys Thr Cys
20
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 75
Glu Ser Gly Lys His Lys Tyr Arg Gln Thr Ala Met Phe Thr Ala Thr
1 5 10 15
Met Pro Pro Ala Val
20
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 76
Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ser Ser Pro Ala Asp Val Gln Ser Leu Lys
1 5 10 15
Lys Ala Met Ser Ser
20
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 77
Ser Gln Leu Phe Ser Leu Asn Pro Arg Gly Arg Ser Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Gly Arg Ile Asp Arg
20
<210> 78
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 78
Ser Leu Ala Arg Gly Pro Leu Ser Glu Ala Gly Leu Ala Leu Phe Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Ser Lys Glu
20
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 79
Gln Lys Lys Leu Cys His Leu Ser Ser Thr Gly Leu Pro Arg Glu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Leu Pro
20
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 80
Leu Thr Ala Ser Asn Met Glu Gly Lys Ser Trp Pro Ser Glu Val Leu
1 5 10 15
Val Cys Thr Thr Ser
20
<210> 81
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 81
Tyr Ala Ala Gln Gln His Glu Thr Phe Leu Thr Asn Gly Asp Arg Ala
1 5 10 15
Gly Phe Leu Ile Gly
20
<210> 82
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 82
Gln Ala Lys Val Pro Phe Ser Glu Glu Thr Gln Asn Leu Ile Leu Pro
1 5 10 15
Tyr Ile Ser Asp Met
20
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 83
Cys Asn Arg Ala Gly Glu Lys His Cys Phe Ser Ser Asn Glu Ala Ala
1 5 10 15
Arg Asp Phe Gly Gly
20
<210> 84
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 84
Arg Asn Pro Gln Phe Leu Asp Pro Val Leu Ala Tyr Leu Met Lys Gly
1 5 10 15
Leu Cys Glu Lys Pro
20
<210> 85
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 85
Leu Glu Cys Glu Arg Gly Lys Gln Glu Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg
1 5 10 15
Ser Arg Phe Glu Asp
20
<210> 86
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 86
Ala Pro Leu Glu Trp Leu Arg Tyr Phe Asp Lys Lys Glu Leu Glu Leu
1 5 10 15
Met Leu Cys Gly Met
20
<210> 87
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 87
Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Met Asp Glu Met Glu
1 5 10 15
Phe Thr Glu Ala Glu
20
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 88
Asp Glu Val Ala Leu Val Glu Gly Val Gln Ser Leu Gly Phe Thr Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Leu Lys Asp
20
<210> 89
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 89
Asp Phe Ser Gln Leu Gln Arg Asn Ile Leu Pro Ser Asn Pro Arg Val
1 5 10 15
Thr Arg Phe His Ile
20
<210> 90
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 90
Ile Ser Thr Asn Gly Ser Phe Ile Arg Leu Leu Asp Ala Phe Lys Gly
1 5 10 15
Val Val Met His Thr
20
<210> 91
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 91
Ile Thr Pro Pro Thr Thr Thr Thr Lys Lys Ala Arg Val Ser Thr Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ala Thr Pro
20
<210> 92
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 92
Asn Tyr Asn Thr Ser His Leu Asn Asn Asp Val Trp Gln Ile Phe Glu
1 5 10 15
Asn Pro Val Asp Trp
20
<210> 93
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 93
Gln Lys Thr Leu His Asn Leu Leu Arg Lys Val Val Pro Ser Phe Ser
1 5 10 15
Ala Glu Ile Glu Arg
20
<210> 94
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 94
Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg His Gly Thr
1 5 10 15
Thr His Ser Leu Val
20
<210> 95
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 95
Gly Ile Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Lys Pro Phe Leu Val Asn Asn
1 5 10 15
Lys Ile Asn Lys Ile
20
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 96
Gly Thr Thr Ile Leu Asn Cys Phe His Asp Val Leu Ser Gly Lys Leu
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser
20
<210> 97
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 97
Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu
1 5 10 15
Asn Ser Thr Asp Gln
20
<210> 98
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 98
Pro Ala Leu Val Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Gly Asn Phe Val Ala Asn
1 5 10 15
Asp Leu Asp Trp Leu
20
<210> 99
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 99
Glu Leu Lys Ala Cys Lys Pro Asn Gly Lys Arg Asn Pro Tyr Cys Glu
1 5 10 15
Val Ser Met Gly Ser
20
<210> 100
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 100
Ser Pro Phe Pro Ala Ala Val Ile Leu Arg Asp Ala Leu His Met Ala
1 5 10 15
Arg Gly Leu Lys Tyr
20
<210> 101
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 101
Gln Gln Leu Asp Thr Tyr Ile Leu Lys Asn Val Val Ala Phe Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Lys Tyr Arg
20
<210> 102
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 102
Ser Phe Val Gly Gln Thr Arg Val Leu Met Ile Asn Gly Glu Glu Val
1 5 10 15
Glu Glu Thr Glu Leu
20
<210> 103
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 103
Ala Phe Phe Ile Asn Phe Ile Ala Ile Tyr His His Ala Ser Arg Ala
1 5 10 15
Ile Pro Phe Gly Thr
20
<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 104
Gly Leu Ala Leu Pro Asn Asn Tyr Cys Asp Val Cys Leu Gly Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ile Asn Lys Lys
20
<210> 105
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 105
Glu Gly Gln Ile Ser Ile Ala Lys Tyr Glu Asn Cys Pro Lys Asp Asn
1 5 10 15
Pro Met Tyr Tyr Cys
20
<210> 106
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 106
Asn Phe Lys Arg Lys Arg Val Ala Ala Phe Gln Lys Asn Leu Ile Glu
1 5 10 15
Met Ser Glu Leu Glu
20
<210> 107
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 107
Lys Met Lys Gly Glu Leu Gly Met Met Leu Ile Leu Gln Asn Val Ile
1 5 10 15
Gln Lys Thr Thr Thr
20
<210> 108
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 108
Ser Ile Glu Cys Lys Gly Ile Asp Lys Glu Ile Asn Glu Ser Lys Asn
1 5 10 15
Thr His Leu Asp Ile
20
<210> 109
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 109
Glu Leu Glu Ala Ala Ile Glu Thr Val Val Cys Thr Phe Phe Thr Phe
1 5 10 15
Ala Gly Arg Glu Gly
20
<210> 110
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 110
Ser Leu Ser His Arg Glu Arg Glu Gln Met Lys Ala Thr Leu Asn Tyr
1 5 10 15
Glu Asp His Cys Phe
20
<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 111
His Ile Lys Ala Phe Asp Arg Thr Phe Ala Asn Asn Pro Gly Pro Met
1 5 10 15
Val Val Phe Ala Thr
20
<210> 112
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 112
Ile Thr Ser Asn Phe Val Ile Pro Ser Glu Tyr Trp Val Glu Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Lys Gln Lys
20
<210> 113
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 113
Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Val Met Ser Arg Glu Thr
1 5 10 15
Thr Asp Thr Asp Thr
20
<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 114
His Leu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Ile Val Gly Lys Gln Val Leu Leu
1 5 10 15
Gly Arg Lys Val Val
20
<210> 115
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 115
His Trp Asn Asp Leu Ala Val Ile Pro Ala Gly Val Val His Asn Trp
1 5 10 15
Asp Phe Glu Pro Arg
20
<210> 116
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 116
Ser Met Asp His Lys Thr Gly Thr Ile Ala Met Gln Asn Thr Thr Gln
1 5 10 15
Leu Arg Ser Arg Tyr
20
<210> 117
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变肽
<400> 117
Gln Pro Leu Arg Arg Leu Val Leu His Val Val Ser Ala Ala Gln Ala
1 5 10 15
Glu Arg Leu Ala Arg
20
<210> 118
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 118
ccatctttcc aagaattcgt tgattgggaa aacgtttctc cagaattaaa ctctacagat 60
caaggtggtg gaggaaaagc atatttacca gttaacgaat ctttcgcatt cacagcagat 120
ttacgttcta acacaggtgg tggaggtgga cgtaacccac aattcttaga tccagtttta 180
gcatatttaa tgaaaggttt atgtgaaaaa ccaggtggag gaggtaaagc attcttacat 240
tggtatacag gtgaagcaat ggatgaaatg gaattcacag aagcagaagg aggtggtgga 300
gatttctctc aattacaacg taacatttta ccatctaacc cacgtgttac acgtttccat 360
attggaggag gtggtattac accaccaaca acaacaacaa aaaaagcacg tgtttctaca 420
ccaaaaccag caacaccagg aggtggaggt aactataaca catctcattt aaacaacgat 480
gtttggcaaa ttttcgaaaa cccagttgat tggggaggag gaggtcatat taaagcattc 540
gatcgtacat tcgcaaacaa cccaggtcca atggttgttt tcgcaacagg aggaggtgga 600
attacatcta acttcgttat tccatctgaa tattgggttg aagaaaaaga agaaaaacaa 660
aaaggaggtg gaggaggttt agttacattc caagcattca ttgatgttat gtctcgtgaa 720
acaacagata cagatacagg tggaggagga cattggaacg atttagcagt tattccagca 780
ggtgttgttc ataactggga tttcgaacca cgtggaggag gaggacaacc attacgtcgt 840
ttagttttac atgttgtttc tgcagcacaa gcagaacgtt tagcacgtgc acgttctatt 900
attaacttcg aaaaattatc tcatcatcat catcatcatt aataa 945
<210> 119
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 119
ccatctttcc aagaattcgt tgattgggaa aacgtttctc cagaattaaa ctctacagat 60
caaggtggtg gaggattcat ggttgcagtt gcacatgttg cagcattctt attagaagat 120
cgtgcagttt gtgttggagg aggaggagca gaaaacgttg aacaagtttt agttacatct 180
attcaaggtg cagttgatta tccagatcca ggtggaggtg gatctttcaa aaaaaaattc 240
gaagaatgtc aacataacat tattaaatta caaaacggtc atacaggtgg aggaggttct 300
gcattaattg aatctttaaa ccaaaaaaca caatctacag gtgatcatcc acaaccaaca 360
ggaggtggtg gaaaagcata tttaccagtt aacgaatctt tcgcattcac agcagattta 420
cgttctaaca caggtggagg aggtggtcat acattattag aaattacaga agaatctggt 480
gcagttttag ttgataaatc tgattctgat ggaggtggag gttctgttat gtgtacatat 540
tctccaccat tagataaatt attctgtcaa ttagcaaaaa catgtggagg aggaggtgaa 600
tctggtaaac ataaatatcg tcaaacagca atgttcacag caacaatgcc accagcagtt 660
ggaggaggtg gagcagcacc atctgcagca tcttctccag cagatgttca atctttaaaa 720
aaagcaatgt cttctggagg tggaggatct caattattct ctttaaaccc acgtggtcgt 780
tctttagtta cagcaggtcg tattgatcgt ggtggaggag gatctttagc acgtggtcca 840
ttatctgaag caggtttagc attattcgat ccatattcta aagaaggagg aggaggacaa 900
aaaaaattat gtcatttatc ttctacaggt ttaccacgtg aaacaattgc atctttacca 960
ggtggtggag gattaacagc atctaacatg gaaggtaaat cttggccatc tgaagtttta 1020
gtttgtacaa catctggtgg aggtggatat gcagcacaac aacatgaaac attcttaaca 1080
aacggtgatc gtgcaggttt cttaattggt ggtggaggag gtcaagcaaa agttccattc 1140
tctgaagaaa cacaaaactt aattttacca tatatttctg atatgggagg tggtggatgt 1200
aaccgtgcag gtgaaaaaca ttgtttctct tctaacgaag cagcacgtga tttcggtggt 1260
ggaggaggtg gtcgtaaccc acaattctta gatccagttt tagcatattt aatgaaaggt 1320
ttatgtgaaa aaccaggagg tggaggttta gaatgtgaac gtggtaaaca agaagcaaaa 1380
ttattagcag aacgttctcg tttcgaagat ggaggaggag gtgcaccatt agaatggtta 1440
cgttatttcg ataaaaaaga attagaatta atgttatgtg gtatg 1485
<210> 120
<211> 1884
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒DNA
<400> 120
ccatctttcc aagaattcgt tgattgggaa aacgtttctc cagaattaaa ctctacagat 60
caagcagaaa acgttgaaca agttttagtt acatctattc aaggtgcagt tgattatcca 120
gatccatctt tcaaaaaaaa attcgaagaa tgtcaacata acattattaa attacaaaac 180
ggtcatacat ctgcattaat tgaatcttta aaccaaaaaa cacaatctac aggtgatcat 240
ccacaaccaa caaaagcata tttaccagtt aacgaatctt tcgcattcac agcagattta 300
cgttctaaca caggtcatac attattagaa attacagaag aatctggtgc agttttagtt 360
gataaatctg attctgattc tgttatgtgt acatattctc caccattaga taaattattc 420
tgtcaattag caaaaacatg tgaatctggt aaacataaat atcgtcaaac agcaatgttc 480
acagcaacaa tgccaccagc agttgcagca ccatctgcag catcttctcc agcagatgtt 540
caatctttaa aaaaagcaat gtcttcttct caattattct ctttaaaccc acgtggtcgt 600
tctttagtta cagcaggtcg tattgatcgt tctttagcac gtggtccatt atctgaagca 660
ggtttagcat tattcgatcc atattctaaa gaacaaaaaa aattatgtca tttatcttct 720
acaggtttac cacgtgaaac aattgcatct ttaccattaa cagcatctaa catggaaggt 780
aaatcttggc catctgaagt tttagtttgt acaacatctt atgcagcaca acaacatgaa 840
acattcttaa caaacggtga tcgtgcaggt ttcttaattg gtcaagcaaa agttccattc 900
tctgaagaaa cacaaaactt aattttacca tatatttctg atatgtgtaa ccgtgcaggt 960
gaaaaacatt gtttctcttc taacgaagca gcacgtgatt tcggtggtcg taacccacaa 1020
ttcttagatc cagttttagc atatttaatg aaaggtttat gtgaaaaacc attagaatgt 1080
gaacgtggta aacaagaagc aaaattatta gcagaacgtt ctcgtttcga agatgcacca 1140
ttagaatggt tacgttattt cgataaaaaa gaattagaat taatgttatg tggtatgcca 1200
gcattagttg aagaatattt agaacgtggt aacttcgttg caaacgattt agattggtta 1260
gaattaaaag catgtaaacc aaacggtaaa cgtaacccat attgtgaagt ttctatgggt 1320
tcttctccat tcccagcagc agttatttta cgtgatgcat tacatatggc acgtggttta 1380
aaatatcaac aattagatac atatatttta aaaaacgttg ttgcattctc tcgtacagat 1440
aaatatcgtt ctttcgttgg tcaaacacgt gttttaatga ttaacggtga agaagttgaa 1500
gaaacagaat tagcattctt cattaacttc attgcaattt atcatcatgc atctcgtgca 1560
attccattcg gtacaggttt agcattacca aacaactatt gtgatgtttg tttaggtgat 1620
tctaaaatta acaaaaaaga aggtcaaatt tctattgcaa aatatgaaaa ctgtccaaaa 1680
gataacccaa tgtattattg taacttcaaa cgtaaacgtg ttgcagcatt ccaaaaaaac 1740
ttaattgaaa tgtctgaatt agaaaaaatg aaaggtgaat taggtatgat gttaatttta 1800
caaaacgtta ttcaaaaaac aacaacagca cgttctatta ttaacttcga aaaattatct 1860
catcatcatc atcatcatta ataa 1884

Claims (60)

1.一种包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含与一个或多个异源肽融合的含PEST的肽，其中所述一个或多个异源肽包含一个或多个包含一个或多个免疫原性新表位的移码突变衍生肽。
2.根据权利要求1所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由包含至少一个疾病特异性或病症特异性移码突变的源核酸序列编码。
3.根据权利要求2所述的免疫疗法递送载体，其中所述源核酸序列包含一个或多个微卫星不稳定区。
4.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述至少一个移码突变位于基因的倒数第二个外显子或最后一个外显子内。
5.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽中每个的长度均为约8-10、11-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500或8-500个氨基酸。
6.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽不编码翻译后切割位点。
7.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个免疫原性新表位包含T细胞表位。
8.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽包含癌症相关或肿瘤相关新表位，或者癌症特异性或肿瘤特异性新表位。
9.根据权利要求8所述的免疫疗法递送载体，其中所述肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤、宫颈癌或肿瘤、表达Her2的癌症或肿瘤、黑素瘤、胰腺癌或肿瘤、卵巢癌或肿瘤、胃癌或肿瘤、胰腺癌病变、肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤、结肠直肠腺癌、肺鳞状腺癌、胃腺癌、卵巢表面上皮肿瘤、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌或肿瘤、头颈癌或肿瘤、前列腺癌、肾癌或肿瘤、骨癌或肿瘤、血癌或脑癌或肿瘤，或所述癌症或肿瘤中任何一种的转移。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个移码突变衍生肽包含感染性疾病相关或感染性疾病特异性新表位。
11.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽包含约1-20个新表位。
12.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个异源肽包含可操作地串联连接的多个异源肽，其中所述含PEST的肽与所述多个异源肽中的一个融合。
13.根据权利要求12所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽包含多个移码突变衍生肽，其中每个移码突变衍生肽是不同的。
14.根据权利要求12或13所述的免疫疗法递送载体，其中所述多个异源肽直接互相融合而没有间隔序列。
15.根据权利要求12或13所述的免疫疗法递送载体，其中所述多个异源肽通过一个或多个肽接头或一个或多个4x甘氨酸接头彼此可操作地连接。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述含PEST的肽与所述N-末端异源肽可操作地连接。
17.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述含PEST的肽是突变的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短的LLO(tLLO)蛋白、截短的ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
18.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽的C末端与标签可操作地连接。
19.根据权利要求18所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组多肽的C末端通过肽接头或4X甘氨酸接头与标签可操作地连接。
20.根据权利要求18或19所述的免疫疗法递送载体，其中所述标签选自：6X组氨酸标签、2x FLAG标签、3x FLAG标签、SIINFEKL肽、与SIINFEKL肽可操作地连接的6X组氨酸标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的3X FLAG标签、与SIINFEKL肽可操作地连接的2X FLAG标签以及其任何组合。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框在编码所述标签的序列后包含两个终止密码子。
22.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框与hly启动子可操作地连接，并且从N末端到C末端编码以下组分：tLLO-[异源肽]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中，n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽，
或其中所述编码重组多肽的开放阅读框与hly启动子可操作地连接，并且从N末端到C末端编码以下组分：tLLO-[(异源肽)-(甘氨酸接头(4x))]n-(肽标签)-(2x终止密码子)，其中n＝2-20，并且至少一个异源肽是移码突变衍生肽。
23.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个异源肽还包含一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽。
24.根据权利要求23所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽由包含至少一个疾病特异性或病症特异性非同义错义突变的源核酸序列编码。
25.根据权利要求23或24所述的免疫疗法递送载体，其中所述一个或多个非同义-错义-突变-衍生肽中每个的长度均为约5-50个氨基酸或约为8-27个氨基酸。
26.根据任何前述权利要求所述的免疫疗法递送载体，其中所述免疫疗法递送载体是重组李斯特菌菌株。
27.根据权利要求26所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组李斯特菌菌株表达并分泌所述重组多肽。
28.根据权利要求26或27所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框被整合到李斯特菌基因组中。
29.根据权利要求26或27所述的免疫疗法递送载体，其中所述编码重组多肽的开放阅读框位于质粒中。
30.根据权利要求29所述的免疫疗法递送载体，其中在不存在抗生素选择的情况下，所述质粒稳定地保持在所述重组李斯特菌菌株中。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述李斯特菌菌株是减毒李斯特菌菌株。
32.根据权利要求31所述的免疫疗法递送载体，其中所述减毒李斯特菌包含一个或多个内源性基因的突变。
33.根据权利要求32所述的免疫疗法递送载体，其中所述内源性基因突变选自actA基因突变、prfA突变、actA和inlB双突变、dal/dat基因双突变、dal/dat/actA基因三突变或其组合，并且所述突变包括基因的失活、截短、缺失、置换或破坏。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中包含所述编码重组多肽的开放阅读框的所述核酸还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，或其中所述重组李斯特菌菌株还包含第二核酸，所述第二核酸包含编码代谢酶的开放阅读框。
35.根据权利要求34所述的免疫疗法递送载体，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
36.根据权利要求26-35中任一项所述的免疫疗法递送载体，其中所述李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。
37.根据权利要求36所述的免疫疗法递送载体，其中所述重组李斯特菌菌株包含actA、dal和dat中的缺失或失活突变，其中包含所述编码重组多肽的开放阅读框的所述核酸在游离型质粒中，并包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且所述含PEST的肽是LLO的N-末端片段。
38.一种免疫原性组合物，其包含至少一个根据权利要求1-37中任一项所述的免疫治疗递送载体。
39.根据权利要求38所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
40.根据权利要求49所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A、未甲基化的含CpG寡核苷酸，或脱毒的非溶血形式的LLO(dtLLO)。
41.一种治疗、压制、预防或抑制受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求38-40中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述一个或多个移码突变衍生肽由来自所述受试者的患有疾病或病症的生物样品的源核酸序列编码。
42.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法引发所述受试者中的个性化的抗疾病或抗病症免疫应答，其中所述个性化的免疫应答针对一个或多个移码突变衍生肽。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或肿瘤。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其还包括施用强化治疗。
45.一个用于形成针对患有疾病或病症的受试者个性化的根据权利要求1-37中任一项所述的免疫疗法递送载体的方法，其包括：
(a)将从所述受试者的患有疾病或病症的生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF进行比较，其中所述比较识别了编码一种或多种肽的一个或多个核酸序列，所述一种或多种肽包含在来自所述患有疾病或病症的生物样品的一个或多个ORF中编码的一个或多个免疫原性新表位，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个包含一个或多个移码突变，并编码包含一个或多个免疫原性新表位的一个或多个移码突变衍生肽；以及
(b)产生包含核酸的免疫疗法递送载体，所述核酸包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含所述一种或多种肽，所述肽包含步骤(a)中识别到的所述一个或多个免疫原性新表位。
46.根据权利要求45所述的方法，其还包括储存所述免疫疗法递送载体，以用于在预定的时间段内向所述受试者施用。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其还包括向所述受试者施用包含所述免疫治疗载体的组合物，其中所述施用过程导致产生针对所述疾病或病症的个性化T细胞免疫应答。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述患有疾病或病症的生物样品来自患有所述疾病或病症的受试者。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述健康生物样品来自患有所述疾病或病症的受试者。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述患有疾病或病症的生物样品和所述健康生物样品各自包含组织、细胞、血液样品或血清样品。
51.根据权利要求45-50中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述比较包括使用筛选测定或筛选工具及相关数字软件，用于将从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列中的所述一个或多个ORF与从所述健康生物样品中提取的所述核酸序列中的所述一个或多个ORF进行比较，
其中所述相关数字软件包括访问序列数据库，所述序列数据库允许筛选从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列中的所述ORF中的突变，用于鉴定所述新表位的免疫原性潜力。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的方法，其中使用外显子组测序或转录组测序来确定从患有所述疾病或病症的生物样品中提取的所述核酸序列和从所述健康生物样品中提取的所述核酸序列。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的方法，其中通过从所述一个或多个移码突变衍生肽产生一种或多种不同的肽序列来对所述一个或多个移码突变衍生肽进行新表位的表征。
54.根据权利要求53所述的方法，其还包括对所述一种或多种不同的肽序列中的每个进行评分，并且在肽序列评分不低于预测单核细胞增多性李斯特菌中分泌性的亲水性阈值的情况下排除所述肽序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述评分通过Kyte和Doolittle亲水指数21氨基酸窗来进行，且排除任何高于约1.6截止值的肽序列或将其修饰为低于所述截止值。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其还包括筛选和选择每个所述一种或多种不同的肽序列中与MHC I类或MHC II类分子的结合，所述MHC I类或MHC II类分子与T细胞受体结合。
57.根据权利要求45-56中任一项所述的方法，其中重复所述方法以产生多个免疫疗法递送载体，每个免疫疗法递送载体包含一组不同的一个或多个免疫原性新表位。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多个免疫疗法递送载体包含2-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40或40-50个免疫疗法递送载体。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述多个免疫疗法递送载体的组合包含约5-10、10-15、15-20、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或100-200个免疫原性新表位。
60.根据权利要求45-59中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是具有少于120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个在所述健康生物样品中不存在的非同义错义突变的肿瘤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111334521A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 上海若泰医药科技有限公司 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9012141B2 (en) 2000-03-27 2015-04-21 Advaxis, Inc. Compositions and methods comprising KLK3 of FOLH1 antigen
CN103687611A (zh) 2011-03-11 2014-03-26 阿德瓦希斯公司 基于李斯特菌属的佐剂
BR112014022662A2 (pt) 2012-03-12 2017-10-03 Advaxis Inc Inibição da função de célula supressora seguindo tratamento de vacina de listeria
EP3107566A4 (en) 2014-02-18 2017-10-11 Advaxis, Inc. Biomarker directed multi-target immunotherapy
MA39849A (fr) 2014-04-24 2017-03-01 Advaxis Inc Souches de listeria utilisées comme vaccin recombinant et procédé de production
MA41644A (fr) * 2015-03-03 2018-01-09 Advaxis Inc Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation
WO2018102584A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof
CN111356760A (zh) 2017-09-19 2020-06-30 阿德瓦希斯公司 细菌或李斯特菌菌株的冻干组合物和方法
CN110408634B (zh) * 2018-04-27 2021-08-03 苏州若泰医药科技有限公司 一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法
CA3161242A1 (en) * 2019-12-18 2021-06-24 Birgitte Rono Nucleic acid vaccination using neo-epitope encoding constructs
CN115867311A (zh) * 2020-05-14 2023-03-28 纳特科瑞克股份有限公司 包含抗原载荷的多核苷酸

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076843A (zh) * 2008-05-19 2011-05-25 艾杜罗生物科技公司 包含prfa*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法
US20120014984A1 (en) * 2009-11-11 2012-01-19 Vafa Shahabi Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of her2/neu over-expressing tumors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3107566A4 (en) * 2014-02-18 2017-10-11 Advaxis, Inc. Biomarker directed multi-target immunotherapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076843A (zh) * 2008-05-19 2011-05-25 艾杜罗生物科技公司 包含prfa*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法
US20120014984A1 (en) * 2009-11-11 2012-01-19 Vafa Shahabi Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of her2/neu over-expressing tumors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INGVIL 等: ""Frameshift-mutation-derived peptides as tumor-specific antigens in inherited and spontaneous colorectal cancer"", 《PNAS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111334521A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 上海若泰医药科技有限公司 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法
CN111334521B (zh) * 2018-12-18 2022-02-18 上海若泰医药科技有限公司 一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

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