CN109641945A - 包含维尔姆斯瘤蛋白抗原的基于李斯特菌的免疫原性组合物及其使用方法 - Google Patents

包含维尔姆斯瘤蛋白抗原的基于李斯特菌的免疫原性组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

提供了包含维尔姆斯瘤蛋白(WT1)抗原的基于李斯特菌的免疫原性组合物以及针对癌症对受试者进行治疗和接种并且诱导针对癌症的免疫应答的方法。本文还提供了包含维尔姆斯瘤蛋白抗原的重组融合多肽或嵌合多肽、编码此类嵌合多肽或融合多肽的核酸、包含此类嵌合多肽或融合多肽或此类核酸的重组细菌或李斯特菌属菌株，以及包含此类重组细菌或李斯特菌属菌株的细胞库。本文还提供了产生此类嵌合多肽或融合多肽、此类核酸和此类重组细菌或李斯特菌属菌株的方法。还提供了包含此类嵌合多肽或融合多肽、此类核酸或者此类重组细菌或李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物和疫苗。还提供了使用此类重组嵌合多肽或融合多肽、核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗诱导受试者的抗WT1免疫应答的方法、诱导受试者的抗WT1表达肿瘤或抗WT1表达癌症免疫应答的方法、治疗受试者的WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法、预防受试者的WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法以及保护受试者免于WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法。

Description

包含维尔姆斯瘤蛋白抗原的基于李斯特菌的免疫原性组合物 及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月5日提交的美国申请号62/358,539的权益，所述美国申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
对以文本文件的形式经由EFS网站递交的序列表的引用
写入文件499335SEQLIST.txt中的序列表是171千字节，在2017年6月30日创建，并且通过引用并入在此。
背景技术
维尔姆斯瘤蛋白(WT1)在许多癌症中被过度表达并且可能在血液恶性肿瘤和多种实体瘤(包括白血病、乳腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、软组织肉瘤和其他癌症)中起致肿瘤作用。WT1可能有望成为免疫疗法和驾驭免疫系统以治疗患有与WT1表达相关的癌症的患者的靶标。
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes；Lm)是一种革兰氏阳性兼性细胞内细菌，其能直接进入抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)的细胞质，此在很大程度上由于李斯特菌溶血素-O(LLO)的成孔活性所致。LLO是由Lm在被细胞吞噬后分泌，并且穿透吞噬溶酶体膜，从而允许细菌避开液泡并且进入细胞质。LLO经由I类MHC分子而非常有效地呈递至免疫系统。此外，Lm来源的肽也能经由吞噬溶酶体进入II类MHC呈递。
发明内容
提供用于治疗或预防维尔姆斯瘤蛋白(WT1)表达肿瘤或WT1相关肿瘤的癌症免疫疗法的方法和组合物。在一方面，本文提供了微基因构建体，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。所述抗原性WT1肽可以是天然WT1肽和/或异变(heteroclitic)突变WT1肽。还提供了由此类微基因构建体编码的嵌合多肽和包含此类微基因构建体的重组李斯特菌属菌株。
在另一方面，提供了包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。还提供了此类融合多肽和编码此类融合多肽的核酸。
在另一方面，本文提供了包含含有微基因构建体的重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列；或包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。还提供了包含所述嵌合多肽或融合多肽或者编码所述嵌合多肽或融合多肽的核酸的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。
在另一方面，本文提供了诱导受试者对WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含微基因构建体的重组李斯特菌属菌株，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列；或包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ IDNO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。还提供了诱导受试者对WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含此类重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。还提供了诱导受试者对WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用所述嵌合多肽或融合多肽或者编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸、包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的免疫原性组合物、包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的药物组合物，或者包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的疫苗。
在另一方面，本文提供了预防或治疗受试者的WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含微基因构建体的重组李斯特菌属菌株，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列；或包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。还提供了预防或治疗受试者的WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含此种重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。还提供了预防或治疗受试者的WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用所述嵌合多肽或融合多肽、编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸、包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的免疫原性组合物、包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的药物组合物，或者包含所述嵌合多肽或融合多肽或编码所述嵌合多肽(例如，所述微基因构建体)或融合多肽的核酸的疫苗。
在另一方面，本文提供了包含一种或多种包含微基因构建体的重组李斯特菌属菌株的细胞库，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列；或包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ IDNO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。
在另一方面，提供了一种包含重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物，所述重组李斯特菌属菌株包括包含编码重组多肽的核酸的重组减毒李斯特菌属菌株，其中所述重组多肽包含与维尔姆斯瘤蛋白或其免疫原性片段融合的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用此类免疫原性组合物。
在另一方面，提供了一种在受试者中引发增强的抗癌T细胞应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用此类免疫原性组合物。
在另一方面，提供了一种在受试者中引发增强的抗癌免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用此类免疫原性组合物。
附图说明
本说明书的结论部分中特别指出并且明确要求保护被视为本发明的标的物。然而，当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述可以最好地理解本发明的组织与操作方法以及其目的、特征和优点。
图1A至图1C示出了用LmddA323(WT1)和LmddA324(Ova)免疫的C57BL/6小鼠对WT1和Ova肽的IFN-γ应答。图1A示出了用WT1(1号和2号小鼠)或Ova(3号和4号小鼠)微基因构建体免疫的小鼠对WT1和Ova肽刺激的初级应答。图1B至图1C示出了用表达Lm的WT1微基因(图1B)或Ova微基因(图1C)免疫的小鼠对WT1和Ova肽刺激的二级应答。
图2A至图2C示出了鼠树枝状DC2.4细胞中的阳性对照(图2A)、阴性对照(图2B)和WT1(图2C)的表达和分泌水平。
图3A和图3B示出了WT1微基因构建体的示意图。图3A示出了设计为表达单个WT1嵌合多肽抗原的WT1微基因构建体。图3B示出了设计为表达三个单独WT1嵌合多肽抗原的WT1微基因构建体。
图4示出了在用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:101)和FMFPNAPYL(SEQ ID NO:114)离体刺激的脾细胞中的ELISPOT测定。所述脾细胞来自用WT1-F微基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。使用PBS和LmddA274作为阴性对照。
图5示出了在用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:101)和YMFPNAPYL(SEQ ID NO:115)离体刺激的脾细胞中的ELISPOT测定。脾细胞来自用WT1-AH1-Tyr微基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。使用PBS和LmddA274作为阴性对照。
图6A和图6B示出了每百万个用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:101；图6A)和FMFPNAPYL(SEQ ID NO:114；图6B)离体刺激的脾细胞中的IFN-γ斑点形成细胞(SFC)。所述脾细胞来自用WT1-F微基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。使用PBS和LmddA274作为阴性对照。
图7A和图7B示出了每百万个用WT1肽RMFPNAPYL(SEQ ID NO:101；图7A)和YMFPNAPYL(SEQ ID NO:115；图7B)离体刺激的脾细胞中的IFN-γ斑点形成细胞(SFC)。所述脾细胞来自用WT1-AH1-Tyr微基因构建体免疫的HLA2转基因小鼠。使用PBS和LmddA274作为阴性对照。
图8A和图8B示出了Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸微基因构建体(图8A)和Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-异变酪氨酸微基因构建体(图8B)的蛋白质印迹。在图8A中，泳道1是序列梯，泳道2是Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-异变酪氨酸微基因构建体(68kDa)，并且泳道3是阴性对照。在图8B中，泳道1是序列梯，泳道2是阴性对照，而泳道3是WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸微基因构建体(1号构建体)。
图9示出了表达异变突变WT1肽的若干种Lm-微基因构建体的菌落PCR结果。突变的残基用粗体并且加下划线。
定义
本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”是指任何长度的聚合形式的氨基酸，包括编码氨基酸和非编码氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸。所述术语包括已经过修饰的聚合物，例如具有修饰的肽骨架的多肽。
蛋白质被称为具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”涉及以具有游离胺基团(-NH2)的氨基酸封端的蛋白质或多肽起始端。术语“C末端”涉及以游离羧基(-COOH)封端的氨基酸链(蛋白质或多肽)末端。
术语“融合蛋白”是指包含通过肽键或其他化学键连接在一起的两个或更多个肽的蛋白质。所述肽可以通过肽或其他化学键直接连接在一起。举例来说，嵌合分子可以重组表达为单链融合蛋白。可选地，所述肽可以通过“接头”，例如一个或多个氨基酸或者在两个或更多个肽之间的另一合适的接头而连接在一起。
本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或修饰形式。它们包括单链、双链和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。
核酸因为以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸在一个方向上经由磷酸二酯键附接至其相邻者的3'氧的方式使单核苷酸反应以制造寡核苷酸而被称为具有“5’末端”和“3’末端”。如果寡核苷酸的5'磷酸没有连接至单核苷酸戊糖环的3'氧，则将其末端称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧没有连接至另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸，则称其为“3'末端”。核酸序列即使在较大寡核苷酸的内部也可以说成具有5'末端和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为在“下游”或3'元件的“上游”或5'。
“密码子优化”是指通过在保持天然氨基酸序列的同时用宿主细胞基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以增强在特定宿主细胞中的表达的过程。举例来说，可以修饰编码融合多肽的多核苷酸以取代为在指定李斯特菌细胞或任何其他宿主细胞中与天然存在的核酸序列相比具有更高使用频率的密码子。密码子使用表易于获得，例如，在“密码子使用数据库”。单增李斯特菌对每一种氨基酸使用的最佳密码子展示于US 2007/0207170中，该专利出于所有目的通过引用整体并入本文。这些表格可以通过多种方式进行调整。参见Nakamura等人(2000)Nucleic AcidsResearch 28:292，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。还可利用对供在特定宿主中表达的特定序列进行密码子优化的计算机算法(参见例如Gene Forge)。
术语“质粒”或“载体”包括任何已知的递送载体，包括细菌递送载体、病毒载体递送载体、肽免疫疗法递送载体、DNA免疫疗法递送载体、附加型质粒、整合质粒或噬菌体载体。术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送和任选地表达一个或多个融合多肽的构建体。
术语“附加型质粒”或“染色体外质粒”是指与染色体DNA物理上分开的核酸载体(即，附加型或染色体外，并且没有整合至宿主细胞基因组中)并且以不依赖染色体DNA的方式进行复制。质粒可以是线性的或环状的，而且它可以是单链或双链的。附加型质粒可以任选地以多拷贝的形式存留在宿主细胞的细胞质(例如李斯特菌)中，从而导致附加型质粒内的任何目标基因的扩增。
术语“基因组整合”是指核酸已经被引入细胞中，使得核苷酸序列整合至所述细胞的基因组中并且能够被其后代继承。任何方案都可以用于将核酸稳定并入细胞基因组中。
术语“稳定维持”是指在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下维持核酸分子或质粒至少10代而没有可检测的损失。举例来说，周期可以是至少15代、20代、至少25代、至少30代、至少40代、至少50代、至少60代、至少80代、至少100代、至少150代、至少200代、至少300代或至少500代。稳定维持可以指在体外细胞中(例如，在培养基中)稳定维持、在体内稳定维持或两者的核酸分子或质粒。
“开放阅读框”或“ORF”是DNA中含有可能编码蛋白质的碱基序列的部分。举例来说，ORF可以位于基因的起始编码序列(起始密码子)与终止密码子序列(终止密码子)之间。
“启动子”是DNA中通常包含能够指导RNA聚合酶II在对于特定多核苷酸序列适当的转录起始位点起始RNA合成的TATA盒的调节区。启动子可以另外包含影响转录起始速率的其他区域。本文公开的启动子序列调节可操作地连接的多核苷酸的转录。启动子可能在本文公开的一种或多种细胞类型(例如，真核生物细胞、非人哺乳动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化细胞或其组合)中具有活性。启动子可以是例如组成型活性启动子、条件启动子、诱导型启动子、时间限制启动子(例如，发育调控启动子)或空间限制启动子(例如，细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的实例可以在例如WO2013/176772中找到，该文献通过引用整体并入本文。
“可操作的连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个组件(例如，启动子和另一个序列元件)毗邻，使得两个组件都正常发挥功能并且使得有可能至少一个组件可以介导对至少一个其他组件发挥功能。举例来说，如果启动子响应于一个或多个转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则启动子可以可操作地连接至编码序列。可操作的连接可以包括此类序列彼此邻接或以反式起作用(例如，调控序列可以在一定距离起作用以控制编码序列的转录)。
在两个多核苷酸或多肽序列的情况下，“序列同一性”或“同一性”是指当在指定比较窗口上对齐以获得最大一致性时两个序列中的残基是相同的。当参考蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不同一的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以修正取代的保守性质。通过此类保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段对本领域技术人员是众所周知的。通常，这涉及将保守替代评分为部分而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，举例来说，在同一性氨基酸得分1并且非保守取代得分0的情况下，保守取代得分在0与1之间。计算保守取代的得分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所实施。
“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列(最大数目的完全匹配残基)而确定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列部分相较于参考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)以实现该两个序列的最佳对齐。通过以下方式计算该百分比：确定两个序列中存在同一核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。除非另有说明(例如，较短序列包括连接的异源序列)，否则比较窗口是所比较的两个序列中较短序列的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10，使用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3和nwsgapdna.cmp评分矩阵获得的核苷酸序列同一性％和相似性％；使用GAP权重8和长度权重2和BLOSUM62评分矩阵获得的氨基酸序列同一性％和相似性％；或其任何等效程序。“等效程序”包括对于所讨论的任两个序列，当与GAP第10版产生的相应比对进行比较时产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对的任何序列比较程序。
术语“保守氨基酸取代”是指用具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代序列中正常情况下存在的氨基酸。保守取代的实例包括非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代为另一个非极性残基。同样，保守取代的实例包括一个极性(亲水性)残基取代为另一个极性(亲水性)残基，例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间或甘氨酸与丝氨酸之间。另外，碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代为另一个碱性残基，或一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸取代为另一个酸性残基是保守取代的额外实例。非保守取代的实例包括非极性(疏水性)氨基酸残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸取代为极性(亲水性)残基例如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，和/或极性残基取代为非极性残基。典型的氨基酸分类总结如下。
“同源”序列(例如，核酸序列)是指与已知参考序列同一或基本相似，使得其与所述已知参考序列具有例如至少至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
术语“野生型”是指具有在正常(与突变、患病、改变等等相反)状态或情况下发现的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
术语“分离的”就蛋白质和核酸而言是指相对于正常情况下可存在于原位的其他细菌、病毒或细胞组分相对纯化的蛋白质和核酸，直至并且包括基本上纯的蛋白质和多核苷酸制剂。术语“分离的”还包括没有天然存在的对应物、已经化学合成并且因此基本上没有被其他蛋白质或核酸污染，或者已经与在天然情况下伴随它们的大部分其他细胞组分(例如，其他细胞蛋白质、多核苷酸或细胞组分)分离或自其中纯化的蛋白质和核酸。
“外源”或“异源”分子或序列是正常情况下不在细胞中表达或正常情况下不以该形式存在于细胞中的分子或序列。正常存在包括就细胞的特定发育阶段和环境条件而言的存在。举例来说，外源或异源分子或序列可以包括细胞内的相应内源序列的突变形式，或者可以包括对应于细胞内的内源序列但是呈不同的形式(即，不在染色体内)的序列。特定细胞中的外源或异源分子或序列还可以是来源于与细胞参考物种不同的物种或来自相同物种内的不同生物体的分子或序列。举例来说，在表达异源多肽的李斯特菌属菌株的情况下，异源多肽可以是对李斯特菌属菌株不是天然的或内源的、正常情况下不是由李斯特菌属菌株表达的、来自除李斯特菌属菌株以外的来源的、来源于同一物种内的不同生物体的多肽。
相反，“内源”分子或序列或者“天然”分子或序列是在特定环境条件下在特定发育阶段通常以该形式存在于特定细胞中的分子或序列。
术语“变体”是指与群体中的大多数不同但仍然与被视为其中之一的常见模式充分相似的氨基酸或核酸序列(或者生物体或组织)(例如，剪接变体)。
术语“同种型”是指与另一个同种型或型式(例如，属于相同蛋白质)相比仅具有轻微差异的分子(例如蛋白质)形式。举例来说，蛋白质同种型可以由不同但相关的基因产生，它们可以通过交替剪接而由同一基因产生，或者它们可以由单核苷酸多态性而产生。
当提及蛋白质时，术语“片段”意指比全长蛋白质更短或具有更少氨基酸的蛋白质。当提及核酸时，术语“片段”意指比全长核酸更短或具有更少核苷酸的核酸。片段可以是例如N末端片段(即，去除蛋白质的C末端的一部分)、C末端片段(即，去除蛋白质的N末端的一部分)或内部片段。片段还可以是例如功能片段或免疫原性片段。
当提及蛋白质时，术语“类似物”是指通过保守氨基酸差异、通过不影响氨基酸序列的修饰或两者而不同于天然存在的蛋白质的蛋白质。
术语“功能性”是指蛋白质或核酸(或其片段、同种型或变体)表现出生物活性或功能的先天能力。此类生物活性或功能可以包括例如当施用于受试者时引发免疫应答的能力。此类生物活性或功能还可以包括例如与相互作用伴侣的结合。在功能性片段、同种型或变体的情况下，实际上可以改变(例如，就其特异性或选择性而言)这些生物学功能，但保留基本生物学功能。
术语“免疫原性”或“免疫原性的”是指分子(例如，蛋白质、核酸、抗原或生物体)在施用于受试者时在受试者中引发免疫应答的先天能力。免疫原性可以例如通过针对分子的抗体的更大数目、针对分子的抗体的更大多样性、分子特异性T细胞的更大数目、针对分子的更大细胞毒性或辅助T细胞应答等等来衡量。
本文使用的术语“抗原”是指当与受试者或生物体接触时(例如，当存在于受试者或生物体中时或当被受试者或生物体检测到时)引起所述受试者或生物体的可检测的免疫应答的物质。抗原可以是例如脂质、蛋白质、碳水化合物、核酸或其组合和变化形式。举例来说，“抗原性肽”是指当存在于受试者或生物体中或者被受试者或生物体检测到时在受试者或生物体中引起免疫应答的产生的肽。举例来说，此类“抗原性肽”可以涵盖被加载至并呈递于宿主细胞表面上的I类和/或II类MHC分子上并且可以被宿主的免疫细胞识别或检测，从而引起对所述蛋白质产生免疫应答的蛋白质。此类免疫应答还可以延伸到宿主内的其他细胞，例如表达该蛋白质的患病细胞(例如，肿瘤细胞或癌细胞)。
术语“表位”是指抗原上被免疫系统识别的位点(例如，抗体结合的位点)。表位可以由连续氨基酸或者通过一个或多个蛋白质的三级折叠而毗邻的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包括独特空间构象中的至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols,Methods in MolecularBiology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
术语“突变”是指基因或蛋白质结构的任何变化。举例来说，突变可以由染色体或蛋白质的缺失、插入、取代或重排引起。“插入”通过添加一个或多个额外核苷酸或氨基酸来改变基因中核苷酸的数目或蛋白质中氨基酸的数目。“缺失”通过减少一个或多个额外核苷酸或氨基酸来改变基因中核苷酸的数目或蛋白质中氨基酸的数目。
当核苷酸的添加或缺失改变基因的阅读框时，DNA中发生“框移”突变。阅读框由多组3个碱基组成，每一碱基编码一个氨基酸。框移突变转换了这些碱基的分组并且改变了氨基酸的代码。所得蛋白质通常不具功能性。插入和缺失各自可以是框移突变。
“错义”突变或取代是指蛋白质的一个氨基酸中的变化或单个核苷酸中导致编码氨基酸的变化的点突变。单个核苷酸中导致一个氨基酸中的变化的点突变是DNA序列中的“非同义”取代。非同义取代还可以导致“无义”突变，其中密码子变为过早终止密码子，从而导致所得蛋白质的截短。相反，DNA中的“同义”突变是不改变蛋白质的氨基酸序列(由于密码子简并性)的突变。
术语“体细胞突变”包括由生殖细胞(例如，精子或卵子)以外的细胞获得的基因变异。此类突变可以在细胞分裂过程中传递给突变细胞的后代，但是不可遗传。相反，生殖细胞突变发生在生殖细胞系中并且可以传递给下一代后代。
术语“体外”是指人造环境以及在人造环境(例如，试管)内发生的过程或反应。
术语“体内”是指天然环境(例如，细胞或生物体或身体)以及在天然环境内发生的过程或反应。
“包含/包括(comprising/including)”一个或多个所列举要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其他要素。举例来说，“包含/包括(comprises/includes)”蛋白质的组合物可以含有单独的或与其他成分组合的该蛋白质。
指定值的范围包括该范围内或界定该范围的所有整数，以及由该范围内的整数界定的所有子范围。
除非另外从上下文显而易见，否则术语“约”涵盖在所述值的标准测量误差范围(例如，SEM)内或者相对于规定值偏差±0.5％、1％、5％或10％的值。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式的冠词“一个/种(a/an)”和“所述/该”包括复数形式。举例来说，术语“一种抗原”或“至少一种抗原”可以包括多种抗原，包括其混合物。
统计学上显著意指p≤0.05。
具体实施方式
I.概述
提供了包含维尔姆斯瘤蛋白(WT1)抗原的免疫原性组合物以及在受试者中针对WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症进行治疗和接种并且诱导针对癌症的免疫反应的方法。作为一个实例，本文提供了微基因构建体，所述微基因构建体包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；和(c)一个或多个抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述一个或多个抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。本文还提供了所编码的嵌合多肽和包含此类微基因构建体或嵌合多肽的重组细菌或李斯特菌属菌株。根据另一实例，本文提供了重组融合多肽，所述重组融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性WT1肽融合的含PEST肽。本文还提供了编码此类融合多肽的核酸和包含此类融合多肽或此类核酸的重组细菌或李斯特菌属菌株。
还提供了包含此类重组细菌或李斯特菌属菌株的细胞库；包含此类嵌合多肽或融合多肽、此类核酸或此类重组细菌或李斯特菌属菌株的免疫原性组合物、药物组合物和疫苗；以及产生此类嵌合多肽或融合多肽、此类核酸和此类重组细菌或李斯特菌属菌株的方法。还提供了在受试者中诱导抗WT1免疫应答的方法、在受试者中诱导抗WT1表达肿瘤或抗WT1表达癌症免疫应答的方法、在受试者中治疗WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法、在受试者中预防WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法，以及使用此类重组嵌合多肽或融合多肽、核酸、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗保护受试者免于WT1表达或WT1相关肿瘤或癌症的方法。
在一个具体实例中，本文公开了包含减毒活重组李斯特菌属菌株的组合物，所述减毒活重组李斯特菌属菌株包含与维尔姆斯瘤蛋白或其免疫原性片段融合的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的融合蛋白。还公开了在癌症受试者中引发增强的抗WT1表达肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的此类组合物。本文还公开了使用此类组合物在受试者中引发增强的抗癌免疫应答的方法，所述方法包括对患有癌症的受试者施用此类组合物。本文还公开了使用此类组合物治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用此类组合物。本文还公开了使用此类组合物在受试者中引发增强的抗癌T细胞应答的方法，所述方法包括对患有癌症的受试者施用此类组合物。
本文公开的方法中的癌症类型的实例包括已知与维尔姆斯瘤蛋白表达相关的任何类型的癌症。示例性癌症包括乳腺癌例如三阴性乳腺癌(TNBC)和胃肠癌例如食道癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、结肠直肠癌、肛门癌和胃肠道类癌瘤。三阴性乳腺癌(TNBC)是指不表达雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或Her2/neu基因的任何乳腺癌。这使它更难以治疗，因为大部分化学治疗剂靶向这三个受体之一。
维尔姆斯瘤蛋白(WT1、AEWS-GUD、NPHS4、WAGR、WIT-2、WT33、维尔姆斯瘤蛋白1)是在人类中由染色体11p上的WT1基因编码的蛋白质。该基因编码在C末端含有四个锌指基序且在N末端含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域的转录因子。WT1抗原是一般不在正常成体细胞中表达但出现在大量癌症中以及某些癌症干细胞中的转录因子。举例来说，全长维尔姆斯瘤蛋白可用于本文公开的方法和组合物中，并且维尔姆斯瘤蛋白的免疫原性片段(例如SEQ ID NO:95(RMFPNAPY)中所示的片段)可用于本文公开的方法和组合物中。
优选地，所述重组李斯特菌属菌株是单增李斯特菌菌株。此类减毒菌株的一个实例是Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。此类减毒菌株的另一个实例是Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。参见例如US 2011/0142791，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。LmddA基于李斯特菌属疫苗载体，其由于内源毒力基因actA的缺失而减毒。此类菌株可以通过dal基因的互补作用而保留用于体内和体外抗原表达的质粒。可选地，LmddA可以是具有内源dal、dat和actA基因突变的dal/dat/actA李斯特菌属。此类突变可以是例如突变基因的缺失、截短或灭活。
优选地，维尔姆斯瘤蛋白或其免疫原性片段与李斯特菌溶血素O(LLO)或其片段融合。优选地，LLO是截短LLO(tLLO)。优选地，tLLO包含PEST样序列。早已鉴定了真核生物蛋白质中的PEST序列。举例来说，一般但不总是侧接含有若干个带正电氨基酸的聚簇的含有富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(PEST)的氨基酸序列的蛋白质具有快速细胞内半衰期(Rogers等(1986)Science234:364-369，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。此外，据报道，这些序列使蛋白质靶向泛素-蛋白酶体途径以便降解(Rechsteiner和Rogers(1996)Trends Biochem.Sci.21:267-271，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。该途径还被真核生物细胞用于产生结合I类MHC的免疫原性肽，并且已经假设PEST序列在产生免疫原性肽的真核生物蛋白中是丰富的(Realini等(1994)FEBS Lett.348:109-113，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。原核生物蛋白通常不含PEST序列，因为它们没有这种酶途径。然而，已经报道了在LLO氨基末端的富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的PEST样序列，而且据报道它对单增李斯特菌致病性是必需的(Decatur和Portnoy(2000)Science 290:992-995，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。LLO中存在这种PEST样序列靶向该蛋白质而使其被宿主细胞的蛋白水解机制破坏，使得一旦LLO发挥其功能并且促进单增李斯特菌从吞噬溶酶体液泡中逃逸，它就会在它能破坏细胞之前被破坏。
优选地，tLLO是指非溶血性的LLO片段。举例来说，可以通过激活结构域的缺失或突变使LLO片段成为非溶血性的。可选地，可以通过包含半胱氨酸484的区域的缺失或突变使LLO片段成为非溶血性的。可选地，可以通过胆固醇结合结构域(CBD)的缺失或突变使LLO片段成为非溶血性的，如美国专利号8,771,702中所详述，该美国专利出于所有目的通过引用整体并入本文。
用于本发明组合物和方法中的LLO蛋白的示例性N末端片段具有(SEQ ID NO:57)中所示的序列。用于本发明组合物和方法中的LLO蛋白的另一个示例性N末端片段具有SEQID NO:59中所示的序列。
Lm技术的作用机制合并了有效先天免疫刺激、将靶肽直接递送至树突细胞和抗原呈递细胞的胞质溶胶中、产生靶向性T细胞应答以及通过肿瘤微环境中的调控T细胞和髓源性抑制细胞来降低免疫抑制。可以在没有中和抗体的情况下给予和/或组合多种治疗。Lm技术可以使用例如减毒活生物工程化Lm细菌来刺激免疫系统以将肿瘤细胞视为潜在细菌感染细胞并且靶向它们以便消除。该技术过程能够以减毒活李斯特菌属菌株开始，并且可以添加例如编码融合蛋白序列的质粒的多个拷贝，所述融合蛋白序列包括例如与目标抗原连接的LLO(李斯特菌溶血素O)分子的片段。该融合蛋白由抗原呈递细胞内的李斯特菌分泌。这导致了对免疫系统的先天性臂与适应性臂的刺激，从而减弱肿瘤防御机制并且使免疫系统更容易攻击和破坏癌细胞。
单独的WT1肽在接种疫苗后不具有足够的免疫原性并且快速降解。举例来说，必须在称为Montanide的角鲨烯油佐剂中对它们进行配制以增强免疫原性。此外，将要进行注射的区域必须通过注射药物非格司亭进行预处理，以诱导局部发炎并且将抗原呈递细胞吸引到该区域。这种组合治疗导致延长硬结区域，并且需要多次注射以达到最佳T细胞应答水平，有时超过12次注射。由于持续存在注射部位反应和延迟型超敏反应，所以必须每次注射替代身体区域。注射过的患者会出现延迟型超敏反应，这会使治疗复杂化并且可能导致早期终止。此外，佐剂(Montanide)倾向于产生比CD8+T细胞应答更多的CD4+T细胞应答，因为含有肽的油被提取并与1类HMC系统相比更多地被呈递至2类MHC系统。本文公开的基于Lm的载体相对于与非格司亭注射剂组合的Montanide肽乳液提供了显著的免疫学、临床、实践和制造改进。
在免疫学上，基于Lm的载体是用于产生CD8+显性T细胞应答的更优越平台。首先，不需要添加非格司亭注射剂的佐剂。这是因为减毒活细菌载体固有地触发许多先天免疫激活触发物，包括若干种TLR、PAMP和DAMP受体，并且具有在抗原呈递细胞的胞质溶胶内激动STING受体的有效能力。这是更广泛的免疫微环境变化，促使患者的免疫系统进行适应性免疫应答。第二，经静脉内输注Lm载体。这使它到达比有限的皮下组织区域中可能留存的抗原呈递细胞显著更多的抗原呈递细胞。它还消除了皮下注射的需要、非格司亭的使用以及延迟型超敏反应的风险。它还有可能更快地产生高T细胞滴度，因为最佳CD8+T细胞数目通常在3次、不超过10次治疗后达到峰值。第三，Lm促进主要CD8+T细胞应答与CD4+交叉反应性以获得T细胞帮助。CD8+T细胞在杀死癌细胞方面最有效，并且由于Lm载体在APC细胞质中呈递其抗原，因此这些肽被快速分流到蛋白酶体以进行加工，与1类MHC复合并转运到APC表面以便主要呈递至CD8+T细胞。这将会带来产生比抗原性肽的皮下Montanide呈递更多的CD8+T细胞的优势。第四，Lm载体增加肿瘤和周围淋巴结上趋化因子和趋化因子受体的表达。这有利于将激活的T细胞吸引到实体瘤附近。第五，Lm载体降低可以保护肿瘤免于T细胞攻击的免疫抑制细胞的相对数目和抑制功能，从而更好地使T细胞能够杀死癌细胞。调控T细胞和骨髓源性抑制细胞的免疫抑制能力的这种降低将更好地使针对这些肽产生的T细胞在实体瘤中具有更好的活性。第六，Lm载体不产生中和抗体。因此，这些载体可以长时间重复施用而不会丧失中和抗体的功效和产生延迟型超敏反应或急性超敏反应(可能包括过敏反应)。
Lm载体具有一些临床优势。与治疗相关的任何副作用出现在输注后的数小时内(此时患者仍在诊所)，几乎全是轻度-中度的并且容易响应于治疗，而且在给药当天解决，没有延迟发作、累积毒性或持续性后遗症的迹象。实际优点包括不需要施用多个药剂并且切换至备用给药部位以进行后续施用的事实。
从制造观点来看，存在若干优点。首先，不需要制造高浓度和高纯度的个别肽。Lm细菌在细菌内的多个DNA质粒拷贝上同时转录DNA，并将这些肽直接分泌到APC的细胞质中，在那里它们几乎立即被转运到蛋白酶体进行加工。实质上，所述肽是由细菌刚好在用于抗原加工时制造。其次，Lm载体具有高度可扩展性。一旦基因工程化完成，细菌就会在肉汤培养基中复制。可以扩大培养规模，从而大大降低商品成本。第三，不需要在复杂载体如Montanide中配制或制造乳液。第四，细菌非常稳定，一些超过5年，而不用担心肽降解或分解产物污染可能导致肽制剂丧失效力。
本文公开的一些Lm微基因构建体将WT1-122A1长肽、WT1-427长肽和/或WT1-331长肽表达为融合蛋白。这些肽在患有血液恶性肿瘤或实体瘤的患者中具有免疫原性，因为发现大多数患者对这些肽中的一种或多种产生T细胞应答。临床益处与针对这些肽的T细胞应答的产生之间存在显著相关性。这些肽的组合在北美HLA*A02、HLA*A03、HLA*B07中存在的主要1类MHC HLA单倍型中提供显著交叉反应性。
本文公开的一些Lm微基因构建体将A-24-天然肽、A-24-het-1肽和/或A-24-het-2肽表达为融合蛋白。这些增加了1类HLA*A24单倍型的额外覆盖。这种单倍型占北美人口的约10％，但在亚洲人群中占比更高。举例来说，一些报道引用HLA*A24频率高达日本人口的90％。在中国、韩国和其他亚洲国家也很常见。HLA*A24肽的添加提供了将在这些亚洲人群以及未被WT1-122A1长肽、WT1-427长肽和WT1-331长肽覆盖的10％北美患者中产生针对WT1的T细胞的免疫原性WT1肽。
使用本文公开的微基因构建方法用于表达特异性I类MHC结合抗原决定子允许将短肽序列高效递送至专职抗原呈递细胞(pAPC)的抗原呈递途径。微基因技术的一个特殊优点是它绕过了需要蛋白酶体介导较大蛋白质的降解以便释放可以结合并呈递在I类MHC分子上的短肽序列。这导致pAPC表面上的肽-I类MHC抗原呈递效率高得多，并因此导致引发抗原特异性T细胞应答的抗原表达水平高得多。
II.含PEST重组融合多肽
本文公开了重组融合多肽，其包含与天然(即，天然存在的或未修饰的)维尔姆斯瘤蛋白(WT1)(即，全长天然WT1蛋白)或其免疫原性(即，抗原性)片段融合的含PEST肽。本文还公开了重组融合多肽，其包含与免疫原性(即，抗原性)WT1肽(其中所述肽包含SEQ IDNO:114或136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成)融合的含PEST肽。本文还公开了重组融合多肽，其包含与一个或多个天然WT1蛋白、天然WT1蛋白的免疫原性片段和包含SEQID NO:114或136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成的WT1肽融合的含PEST肽。含PEST肽可以直接与天然WT1、其片段或者包含SEQ ID NO:114或136、基本上由其组成或由其组成的WT1肽融合，或者它们可以经由肽接头或经由一个或多个其他抗原性WT1肽连接。
本文其他部分详细讨论了融合多肽内免疫原性(即，抗原性)肽的选择、变化和排列，并且本文其他部分更详细地讨论了天然WT1肽及其免疫原性片段。
所述重组融合多肽可以包含一个或多个标签。举例来说，所述重组融合多肽可以包含在所述天然WT1蛋白、所述天然WT1蛋白的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成的WT1肽的N末端和/或C末端的一个或多个肽标签。标签可以直接与抗原性肽融合或经由接头(其实例在本文其他部分公开)与抗原性肽连接。标签的实例包括以下：FLAG标签；2xFLAG标签；3xFLAG标签；His标签、6xHis标签；和SIINFEKL标签。示例性SIINFEKL标签示于SEQ ID NO:16中(由SEQ ID NO:1-15中所示的核酸中的任一个编码)。示例性3xFLAG标签示于SEQ ID NO:32中(由SEQ ID NO:17-31中所示的核酸中的任一个编码)。示例性变异3xFLAG标签示于SEQ ID NO:99中。可以一起使用两个或更多个标签，例如2xFLAG标签与SIINFEKL标签、3xFLAG标签与SIINFEKL标签、或6xHis标签与SIINFEKL标签。如果使用两个或更多个标签，则它们可以位于重组融合多肽内的任一处并且呈任何顺序。举例来说，两个标签可以在重组融合多肽C末端，两个标签可以在重组融合多肽N末端，两个标签可以位于重组融合多肽内部，一个标签可以在重组融合多肽C末端且一个标签在重组融合多肽N末端，一个标签可以在重组融合多肽C末端且一个标签在重组融合多肽内部，或者一个标签可以在重组融合多肽N末端且一个标签在重组融合多肽内部。其他标签包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。特定重组融合多肽包含C末端SIINFEKL标签。此类标签可以使得容易地检测重组融合蛋白，确认重组融合蛋白的分泌，或通过跟踪对这些“标签”序列肽的免疫应答来跟踪所分泌的融合多肽的免疫原性。可以使用许多试剂监测此类免疫应答，包括例如对这些标签具特异性的单克隆抗体和DNA或RNA探针。
本文公开的重组融合多肽可以由重组李斯特菌属菌株表达，或者可以从用于蛋白质表达和分离的其他载体和细胞系统表达和分离。包含表达此类抗原性肽的重组李斯特菌属菌株可以用于例如包含此类重组李斯特菌属的免疫原性组合物和包含所述重组李斯特菌属菌株和佐剂的疫苗中。在李斯特菌属菌株和李斯特菌属以外的宿主细胞系统中，一种或多种抗原性肽在宿主细胞系统中表达为具有非溶血性截短形式的LLO、ActA或PEST样序列的融合多肽可以导致抗原性肽的免疫原性增强。
还公开了编码此类重组融合多肽的核酸。所述核酸可以呈任何形式。所述核酸可以包含DNA或RNA或者由DNA或RNA组成，并且可以是单链或双链的。所述核酸可以呈质粒形式，例如附加型质粒、多拷贝附加型质粒或整合质粒。可选地，所述核酸可以呈病毒载体、噬菌体载体或细菌人工染色体的形式。此类核酸可以具有一个开放阅读框或可具有两个或更多个开放阅读框(例如，编码重组融合多肽的开放阅读框和编码代谢酶的第二开放阅读框)。在一个实例中，此类核酸可以包含两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。举例来说，所述核酸可以包含二至四个开放阅读框，所述二至四个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。每一个开放阅读框可以编码不同的多肽。在一些核酸中，编码融合多肽羧基末端的密码子后接两个终止密码子以确保终止蛋白质合成。
A.天然WT1蛋白及其免疫原性片段
维尔姆斯瘤蛋白(WT1、AEWS-GUD、NPHS4、WAGR、WIT-2、WT33、维尔姆斯瘤蛋白1)是在人类中由染色体11p上的WT1基因编码的蛋白质。该基因编码在C末端含有四个锌指基序并且在N末端含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域的转录因子。WT1抗原是一般不在正常成体细胞中表达但出现在大量癌症中以及某些癌症干细胞中的转录因子。
示例性人WT基因被指定GenBank登记号AY245105.1。示例性人WT1蛋白被指定UniProt登记号P19544(SEQ ID NO:138)、NCBI登记号NP_001185481.1(SEQ ID NO:140)、NCBI登记号NP_001185480.1(SEQ ID NO:141)、NCBI登记号NP_077744.3(SEQ ID NO:142)、NCBI登记号NP_077742.2(SEQ ID NO:143)和NCBI登记号NP_000369.3(SEQ ID NO:144)。包含去除了残基54-68的UniProt登记号P19544中所示的WT1蛋白的示例性WT1片段示于SEQID NO:139中。其他示例性人WT1蛋白或其片段示于SEQ ID NO:145-148中。来自其他物种的示例性WT1蛋白同源物包括UniProt登记号P22561(小鼠)、P49952(大鼠)、O62651(猪)和B7ZSG3(非洲爪蟾)。
天然WT1蛋白是天然存在的WT1蛋白(例如，没有产生异变突变)。可以使用编码全长天然WT1蛋白或天然WT1蛋白的免疫原性/抗原性片段的核酸。天然WT1蛋白的片段包括发生下列一者或多者的天然WT1蛋白序列：已去除C末端区段、已去除N末端区段或已去除一个或多个内部片段。举例来说，片段可以是WT1的N末端片段、WT1的C末端片段、WT1的内部片段、去除了一个或多个内部片段的WT1蛋白等等。去除了内部片段的WT1蛋白片段的实例示于SEQ ID NO:139中。天然WT1蛋白的内部片段(即，去除了C末端和N末端序列的天然WT1蛋白的片段)的实例示于SEQ ID NO:95中。在一个实例中，融合多肽中包括的天然WT1蛋白的片段包含SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:139中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。合适的天然WT1肽的其他实例公开在本文其他部分中。
融合多肽可以包括与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和由SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列组成、基本上由其组成或包含所述序列的WT1肽的一个抗原性或免疫原性WT1肽融合的含PEST肽。可选地，所述融合多肽可以包括与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和由SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列组成、基本上由其组成或包含所述序列的WT1肽的两个或更多个抗原性或免疫原性WT1肽融合的含PEST肽。举例来说，融合多肽可以包含2-20个、2-15个、2-10个、2-5个、2-4个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、18个或20个抗原性WT1肽。抗原性WT1肽中的两个或更多个或全部可以是相同的，或者抗原性WT1肽中的两个或更多个或全部可以是不同的(例如，每一个抗原性WT1肽可以是不同的)。如果第一抗原性肽包括不在第二抗原性肽中的单个氨基酸，则第一抗原性肽与第二抗原性肽不同。每一个抗原性WT1肽可以具有足以诱导免疫应答的任何长度，并且每一个抗原性WT1肽可以具有相同的长度或所述抗原性肽可以具有不同的长度。举例来说，本文公开的抗原性WT1肽的长度可以在约8-600个、8-500个、8-450个、8-400个、8-350个、8-300个、8-250个、8-200个、8-150个、8-100个、8-90个、8-80个、8-70个、8-60个、8-50个、8-40个、8-30个、8-20个、8-15个、8-12个或8-10个氨基酸之间。可选地，抗原性WT1肽的长度可以是例如不超过约8个、9个、10个、12个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个氨基酸，或抗原性WT1肽的长度可以是例如至少约8个、9个、10个、12个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个或600个氨基酸。
每一个抗原性肽还可以是亲水性的，或者可以达到或低于某个亲水性阈值，这可以预测单增李斯特菌或另一种目标细菌的分泌性。举例来说，可以通过Kyte-Doolittle亲水性指数以21个氨基酸窗口对抗原性肽进行评分，并且可以排除高于截止值(约1.6)的所有得分，因为它们不可能由单增李斯特菌分泌。同样地，抗原性肽组合或融合多肽可以是亲水性的，或者可以达到或低于某个亲水性阈值，这可以预测单增李斯特菌或另一种目标细菌的分泌性。
如果融合多肽包含两个或更多个抗原性肽，则抗原性肽可以按任何方式连接在一起。举例来说，抗原性肽可以在没有插入序列的情况下彼此直接融合。可选地，抗原性肽可以经由一个或多个接头，例如肽接头而彼此间接连接。在一些情况下，一些相邻抗原性肽对可以彼此直接融合，而其他抗原性肽对可以经由一个或多个接头而彼此间接连接。可以在每一对相邻抗原性肽之间使用相同的接头，或者可以在不同的相邻抗原性肽对之间使用任何数目的不同的接头。另外，可以在一对相邻抗原性肽之间使用一个接头，或者可以在一对相邻抗原性肽之间使用多个接头。
任何合适的序列都可以用于肽接头。举例来说，接头序列的长度可以是例如1至约50个氨基酸。一些接头可能是亲水性的。接头可以用于不同的目的。举例来说，接头可用于增加细菌分泌、促进抗原加工、增加融合多肽的柔性、增加融合多肽的刚性，或任何其他目的。在一些情况下，不同的氨基酸接头序列分布在抗原性肽之间，或者编码相同氨基酸接头序列的不同核酸分布在抗原性肽之间(例如，SEQ ID NO:84-94)，以便将重复减至最少。这还可以用于减少二级结构，从而允许在Lm重组载体菌株群内有效转录、翻译、分泌、维持或稳定编码融合多肽的核酸(例如质粒)。可以选择其他合适的肽接头序列，例如，基于以下因素中的一个或多个：(1)它们能够采用柔性延伸构象；(2)它们不能够采用可以与抗原性肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与功能性表位反应的疏水或带电残基。举例来说，肽接头序列可以含有Gly、Asn和Ser残基。其他近中性氨基酸，如Thr和Ala也可以用在接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括以下公开的那些：Maratea等(1985)Gene 40:39-46；Murphy等(1986)Proc Natl Acad Sci USA 83:8258-8262；US 4,935,233；和US 4,751,180，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。接头的具体实例包括下表中的那些(每一个接头可以单独用作接头，用于包含序列重复的接头中，或用于还包含该表中的一个或多个其他序列的接头中)，但是还可以设想其他接头(参见例如Reddy Chichili等(2013)Protein Science 22:153-167，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。除非规定，否则“n”表示所列出的接头中的重复数目不确定。
B.含PEST肽
本文公开的重组融合蛋白包含含PEST肽。含PEST肽可以在融合多肽的氨基末端(N末端)(即，抗原性肽的N末端)，可以在融合多肽的羧基末端(C末端)(即，抗原性肽的C末端)，或者可以包埋在抗原性肽内。在一些重组李斯特菌属菌株和方法中，含PEST肽不是融合多肽的一部分，而是与融合多肽分开。抗原性肽与PEST样序列(例如LLO肽)融合可以增强抗原性肽的免疫原性并且可以增加细胞介导的抗肿瘤免疫应答(即，增加细胞介导的抗肿瘤免疫力)。参见例如Singh等(2005)J Immunol 175(6):3663-3673，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
含PEST肽是包含PEST序列或PEST样序列的肽。早已鉴定真核生物蛋白中的PEST序列。举例来说，一般但不总是侧接含有若干个带正电氨基酸的聚簇的含有富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(PEST)的氨基酸序列的蛋白质具有快速细胞内半衰期(Rogers等(1986)Science 234:364-369，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。此外，据报道，这些序列使蛋白质靶向泛素-蛋白酶体途径以便降解(Rechsteiner和Rogers(1996)Trends Biochem.Sci.21:267-271，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。该途径还被真核生物细胞用于产生结合I类MHC的免疫原性肽，并且已经假设PEST序列在产生免疫原性肽的真核生物蛋白中是丰富的(Realini等(1994)FEBS Lett.348:109-113，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。原核生物蛋白在正常情况下不含PEST序列，因为它们没有这种酶途径。然而，已经报道了在LLO氨基末端的富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的PEST样序列，而且据报道它对单增李斯特菌致病性是必需的(Decatur和Portnoy(2000)Science 290:992-995，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。LLO中存在这种PEST样序列靶向该蛋白质而使其被宿主细胞的蛋白水解机制破坏，使得一旦LLO发挥其功能并且促进单增李斯特菌从吞噬体或吞噬溶酶体液泡中逃逸，它就会在它能破坏细胞之前被破坏。
PEST和PEST样序列的鉴定在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Rogers等(1986)Science 234(4774):364-378中以及Rechsteiner和Rogers(1996)TrendsBiochem.Sci.21:267-271中，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。可以使用PEST-find程序鉴定PEST或PEST样序列。举例来说，PEST样序列可以是富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的区域。任选地，PEST样序列可以侧接一个或多个含有若干个带正电氨基酸的聚簇。举例来说，PEST样序列可以定义为具有局部高脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和/或苏氨酸(T)残基浓度的至少12个氨基酸长度的亲水性片段。在一些情况下，PEST样序列不含有带正电氨基酸，即，精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。一些PEST样序列可以含有一个或多个内部磷酸化位点，并且这些位点在蛋白质降解之前磷酸化。
在一个实例中，PEST样序列符合Rogers等公开的算法。在另一个实例中，PEST样序列符合Rechsteiner和Rogers公开的算法。还可以通过初步扫描指定蛋白质序列内的带正电氨基酸R、H和K来鉴定PEST样序列。计算带正电侧翼之间的所有氨基酸，并且仅进一步考虑含有许多等于或高于窗口大小参数的氨基酸的那些基序。任选地，PEST样序列必须含有至少一个P、至少一个D或E，以及至少一个S或T。
可以通过基于关键氨基酸的局部富集以及基序疏水性的评分参数来改进PEST基序的质量。D、E、P、S和T的富集以质量百分比(w/w)表示，并且针对一个当量的D或E、一个当量的P和一个当量的S或T进行校正。还可以按照Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105的方法中的原理来计算疏水性，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。为了简化计算，使用以下线性转换将Kyte-Doolittle亲水性指数(最初在精氨酸-4.5至异亮氨酸+4.5的范围内)转换为正整数：亲水性指数＝10*Kyte-Doolittle亲水性指数+45，由此产生从精氨酸0至异亮氨酸90的值。
还可以将潜在PEST基序的疏水性计算为每一个氨基酸种类的摩尔百分比与疏水性指数的乘积之和。获得如以下等式所示的呈局部富集项与疏水性项的组合形式的所期望的PEST得分：PEST得分＝0.55*DEPST-0.5*疏水性指数。
因此，含PEST肽可以指在使用上述算法时得分为至少+5的肽。可选地，它可以指得分为至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少32、至少35、至少38、至少40或至少45的肽。
本领域已知的任何其他可用方法或算法也可以用于鉴定PEST样序列。参见例如CaSPredictor(Garay-Malpartida等(2005)Bioinformatics 21增刊1:i169-76，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。可以使用的另一种方法如下：通过给氨基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln分配值1来计算每一个适当长度(例如30-35个氨基酸的延伸段)的PEST指数。每一个PEST残基的系数值(CV)是1，并且每一个其他AA(非PEST)的CV是零。
PEST样氨基酸序列的实例是SEQ ID NO:43-51中所示的那些。PEST样序列的一个实例是KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:43)。PEST样序列的另一个实例是KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID NO:44)。然而，可以使用任何PEST或PEST样氨基酸序列。PEST序列肽是已知的并且描述于例如US 7,635,479、US 7,665,238和US 2014/0186387中，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
PEST样序列可以来自李斯特菌属物种，如来自单增李斯特菌。举例来说，单增李斯特菌ActA蛋白含有至少四个此类序列(SEQ ID NO:45-48)，其中任一个都适用于本文公开的组合物和方法。其他类似的PEST样序列包括SEQ ID NO:52-54。来自链球菌属某种(Streptococcus sp.)的链球菌溶血素O蛋白也含有PEST序列。举例来说，化脓性链球菌链球菌(Streptococcus pyogene)溶血素O包含在氨基酸35-51处的PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:49)，而似马链球菌链球菌(Streptococcus equisimilis)溶血素O包含在氨基酸38-54处的PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:50)。PEST样序列的另一个实例来自由lso基因编码的西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)细胞溶素：RSEVTISPAETPESPPATP(例如，SEQ ID NO:51)。
可选地，PEST样序列可以来源于其他原核生物。其中预期PEST样氨基酸序列的其他原核生物包括例如其他李斯特菌属物种。
(1)李斯特菌溶血素O(LLO)
可以用于本文公开的组合物和方法中的含PEST肽的一个实例是李斯特菌溶血素O(LLO)肽。LLO蛋白的实例是指定GenBank登记号P13128的蛋白质(SEQ ID NO:55；核酸序列示于GenBank登记号X15127中)。SEQ ID NO:55是包括信号序列的原蛋白。所述原蛋白的前25个氨基酸是信号序列，并且在它被细菌分泌时从LLO中裂解，从而产生没有信号序列的504个氨基酸的全长活性LLO蛋白。本文公开的LLO肽可以包含信号序列，或者可以包含不包括信号序列的肽。可以使用的示例性LLO蛋白质包含SEQ ID NO:55中所示的序列或者SEQID NO:55的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段、基本上由其组成或由其组成。可以使用编码LLO蛋白片段或LLO蛋白同源物、变体、同种型、类似物、同源物片段、变体片段或类似物片段的任何序列。同源LLO蛋白可以与参考LLO蛋白具有例如高于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
LLO蛋白的另一个实例示于SEQ ID NO:56中。可以使用的LLO蛋白可以包含SEQ IDNO:56中所示的序列或者SEQ ID NO:56的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段、基本上由其组成或由其组成。
LLO蛋白的另一个实例是如GenBank登记号：ZP_01942330或EBA21833中所示，或由GenBank登记号NZ_AARZ01000015或AARZ01000015.1中所示的核酸序列编码的来自单增李斯特菌10403S菌株的LLO蛋白。LLO蛋白的另一个实例是来自单增李斯特菌4b F2365菌株(参见例如GenBank登记号：YP_012823)、EGD-e菌株(参见例如GenBank登记号：NP_463733)或任何其他单增李斯特菌菌株的LLO蛋白。LLO蛋白的另一个实例是来自黄杆菌目(Flavobacteriales)细菌HTCC2170的LLO蛋白(参见例如GenBank登记号：ZP_01106747或EAR01433，或由GenBank登记号：NZ_AAOC01000003编码)。可以使用的LLO蛋白质可以包含任何上述LLO蛋白或上述LLO蛋白的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段中的任一个、基本上由其组成或由其组成。
还可以使用与LLO或其同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段同源的蛋白质。一个此类实例是蜂房杆菌溶素，其可以例如在蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)中发现(参见例如GenBank登记号：P23564或AAA22224，或由GenBank登记号：M62709编码)。其他此类同源蛋白质是已知的。
LLO肽可以是全长LLO蛋白或截短LLO蛋白或LLO片段。同样地，LLO肽可以是保留天然LLO蛋白的一种或多种功能或者缺乏天然LLO蛋白的一种或多种功能的肽。举例来说，保留的LLO功能可以允许细菌(例如李斯特菌属)从吞噬体或吞噬溶酶体中逃逸，或者增强与其融合的肽的免疫原性。保留的功能还可以是溶血功能或抗原功能。可选地，LLO肽可以是非溶血性LLO。LLO的其他功能是已知的，用于评估LLO功能的方法和测定也是已知的。
LLO片段可以是PEST样序列或可以包含PEST样序列。LLO片段可以包含内部缺失、自C末端截短和自N末端截短中的一种或多种。在一些情况下，LLO片段可以包含多于一个内部缺失。其他LLO肽可以是具有一个或多个突变的全长LLO蛋白。
一些LLO蛋白或片段相对于野生型LLO具有降低的溶血活性，或者是非溶血性片段。举例来说，可以通过羧基末端激活结构域的缺失或突变、通过半胱氨酸484的缺失或突变或者通过另一个位置上的缺失或突变使LLO蛋白质成为非溶血性的。
如US 8,771,702中所详述通过胆固醇结合结构域(CBD)的缺失或突变使其他LLO蛋白质成为非溶血性的，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。突变可以包括例如取代或缺失。可以使整个CBD突变，可以使CBD的部分突变，或者可以使CBD内的特定残基突变。举例来说，LLO蛋白可以包含SEQ ID NO:55的残基C484、W491和W492中的一个或多个(例如，C484、W491、W492、C484和W491、C484和W492、W491和W492，或所有三个残基)或在与SEQID NO:55最佳对齐时的相应残基(例如，相应的半胱氨酸或色氨酸残基)的突变。举例来说，可以产生突变LLO蛋白，其中LLO的残基C484、W491和W492被丙氨酸残基取代，这相对于野生型LLO将显著降低溶血活性。具有C484A、W491A和W492A突变的突变LLO蛋白被称为“mutLLO”。
作为另一个实例，可以产生具有内部缺失的包含胆固醇结合结构域的突变LLO蛋白。SEQ ID NO:55的胆固醇结合结构域的序列示于SEQ ID NO:74中。举例来说，内部缺失可以是1-11个氨基酸缺失、11-50个氨基酸缺失或更长。同样，突变区可以是1-11个氨基酸、11-50个氨基酸或更长(例如，1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100或30-150个氨基酸)。举例来说，由SEQ ID NO:55的残基470-500、470-510或480-500组成的突变区将产生包含CBD(SEQ ID NO:55的残基483-493)的缺失序列。然而，突变区还可以是CBD的片段，或者可以与CBD的一部分重叠。举例来说，突变区可以由SEQ ID NO:55的残基470-490、480-488、485-490、486-488、490-500或486-510组成。举例来说，CBD的片段(残基484-492)可以置换为异源序列，相对于野生型LLO，这将显著降低溶血活性。举例来说，CBD(ECTGLAWEWWR；SEQ ID NO:74)可以置换为来自抗原NY-ESO-1(ESLLMWITQCR；SEQ ID NO:75)的CTL表位，其含有来自NY-ESO-1的HLA-A2限制性表位157-165。所得LLO被称为“ctLLO”。
在一些突变LLO蛋白中，突变区可以置换为异源序列。举例来说，突变区可以置换为相同数目的异源氨基酸、较少数目的异源氨基酸或较大数目的氨基酸(例如，1-50、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10、12-50、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-50、11-60、11-70、11-80、11-90、11-100、11-150、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-50、15-60、15-70、15-80、15-90、15-100、15-150、20-25、20-30、20-35、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-150、30-35、30-40、30-60、30-70、30-80、30-90、30-100或30-150个氨基酸)。其他突变LLO蛋白具有一个或多个点突变(例如，1个残基、2个残基、3个残基或更多个残基的点突变)。突变残基可以是连续的或不连续的。
在一个示例性实施方案中，LLO肽可以在信号序列中具有缺失并且在CBD中具有突变或取代。
一些LLO肽是N末端LLO片段(即，具有C末端缺失的LLO蛋白)。一些LLO肽的长度是至少494、489、492、493、500、505、510、515、520或525个氨基酸或者长度是492-528个氨基酸。举例来说，LLO片段可以由LLO蛋白的约前440或441个氨基酸(例如，SEQ ID NO:55或56的前441个氨基酸，或另一LLO蛋白当与SEQ ID NO:55或56最佳对齐时的相应片段)组成。其他N末端LLO片段可以由LLO蛋白的前420个氨基酸(例如，SEQ ID NO:55或56的前420个氨基酸，或另一LLO蛋白当与SEQ ID NO:55或56最佳对齐时的相应片段)组成。其他N末端片段可以由LLO蛋白的约氨基酸20-442(例如，SEQ ID NO:55或56的氨基酸20-442，或另一LLO蛋白当与SEQ ID NO:55或56最佳对齐时的相应片段)组成。其他N末端LLO片段包含任何ΔLLO而没有包含半胱氨酸484的激活域，且具体来说没有半胱氨酸484。举例来说，N末端LLO片段可以对应于LLO蛋白的前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25个氨基酸(例如，SEQ ID NO:55或56的前425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、50或25个氨基酸，或另一LLO蛋白当与SEQ ID NO:55或56最佳对齐时的相应片段)。优选地，所述片段包含一个或多个PEST样序列。LLO片段和截短LLO蛋白可以含有对应于上述特定氨基酸范围中的任一个的同源LLO蛋白残基。残基编号不需要完全对应于以上列举的残基编号(例如，如果同源LLO蛋白相对于本文公开的特定LLO蛋白具有插入或缺失)。N末端LLO片段的实例包括SEQ ID NO:57、58和59。可以使用的LLO蛋白质包含SEQ ID NO:57、58或59中所示的序列或者SEQ ID NO:57、58或59的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段、基本上由其组成或由其组成。在一些组合物和方法中，使用SEQ ID NO:59中所示的N末端LLO片段。编码SEQ IDNO:59中所示的N末端LLO片段的核酸的实例是SEQ ID NO:60。
(2)ActA
可用于本文公开的组合物和方法中的含PEST肽的另一个实例是ActA肽。ActA是表面相关蛋白，并且在受感染宿主细胞中充当支架，以促进宿主肌动蛋白聚合物的聚合、组装和激活，从而推动单增李斯特菌通过细胞质。在进入哺乳动物细胞质溶胶中后不久，单增李斯特菌诱导宿主肌动蛋白丝聚合，并且使用肌动蛋白聚合产生的力移动，首先在细胞内，然后在细胞间。ActA负责介导肌动蛋白成核和基于肌动蛋白的运动。ActA蛋白为宿主细胞骨架成分提供多个结合位点，从而充当组装细胞肌动蛋白聚合机构的支架。ActA的N末端与单体肌动蛋白结合，并且通过刺激内在肌动蛋白成核活性而起到组成活性成核促进因子的作用。actA和hly基因都是受转录激活因子PrfA调控的10-kb基因簇的成员，并且actA在哺乳动物胞质溶胶中上调约226倍。可以使用编码ActA蛋白或ActA蛋白的同源物、变体、同种型、类似物、同源物片段、变体片段或类似物片段的任何序列。同源ActA蛋白可以与参考ActA蛋白具有例如高于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
ActA蛋白的一个实例包含SEQ ID NO:61中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。ActA蛋白的另一个实例包含SEQ ID NO:62中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。对应于这些序列中任一个的原蛋白的前29个氨基酸是信号序列，并且在它被细菌分泌时从ActA蛋白裂解。ActA肽可以包含信号序列(例如，SEQ ID NO:61或62的氨基酸1-29)，或者可以包含不包括信号序列的肽。ActA蛋白的其他实例包含SEQ ID NO:61或62的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、同种型片段或类似物片段，基本上由其组成或由其组成。
ActA蛋白的另一个实例是来自单增李斯特菌10403S菌株(GenBank登记号：DQ054585)、NICPBP 54002菌株(GenBank登记号：EU394959)、S3菌株(GenBank登记号：EU394960)、NCTC 5348菌株(GenBank登记号：EU394961)、NICPBP 54006菌株(GenBank登记号：EU394962)、M7菌株(GenBank登记号：EU394963)、S19菌株(GenBank登记号：EU394964)或任何其他单增李斯特菌菌株的ActA蛋白。可以使用的LLO蛋白质可以包含上述LLO蛋白或上述LLO蛋白的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段和同种型片段中的任一个，基本上由其组成或由其组成。
ActA肽可以是全长ActA蛋白或截短ActA蛋白或ActA片段(例如，去除了C末端部分的N末端ActA片段)。优选地，截短ActA蛋白包含至少一个PEST序列(例如，多于一个PEST序列)。另外，截短ActA蛋白可以任选地包含ActA信号肽。截短ActA蛋白中含有的PEST样序列的实例包括SEQ ID NO:45-48。一些此类截短ActA蛋白包含SEQ ID NO:45-48中所示的PEST样序列或其同源物中的至少两个、SEQ ID NO:45-48中所示的PEST样序列或其同源物中的至少三个或SEQ ID NO:45-48中所示的PEST样序列或其同源物中的全部四个。截短ActA蛋白的实例包括包含全长ActA蛋白序列(例如，SEQ ID NO:62)的约残基30-122、约残基30-229、约残基30-332、约残基30-200或约残基30-399，基本上由其组成或由其组成的那些。截短ActA蛋白的其他实例包括包含全长ActA蛋白序列(例如，SEQ ID NO:62)的前50、100、150、200、233、250、300、390、400或418个残基，基本上由其组成或由其组成的那些。截短ActA蛋白的其他实例包括包含全长ActA蛋白序列(例如SEQ ID NO:62)的残基200-300或残基300-400，基本上由其组成或由其组成的那些。举例来说，截短ActA由如US 7,655,238中所述的野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。作为另一个实例，截短ActA可以是ActA-N100或其修饰形式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序已缺失并且含有如US 2014/0186387中所述的非保守QDNKR(SEQ ID NO:73)取代，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。可选地，截短ActA蛋白可以含有同源ActA蛋白中对应于本文公开的ActA肽中的任一种的上述氨基酸范围之一或氨基酸范围的残基。残基编号不需要完全对应于本文列举的残基编号(例如，如果同源ActA蛋白相对于本文使用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可以相应地调整残基编号)。
截短ActA蛋白的实例包括例如包含SEQ ID NO:63、64、65或66中所示的序列或SEQID NO:63、64、65或66的同源物、变体、同种型、类似物、变体片段、同种型片段或类似物片段，基本上由其组成或由其组成的蛋白质。SEQ ID NO:63称为ActA/PEST1，并且由SEQ IDNO:62中所示的全长ActA序列的氨基酸30-122组成。SEQ ID NO:64称为ActA/PEST2或LA229，并且由SEQ ID NO:62中所示的全长ActA序列中所示的全长ActA序列的氨基酸30-229组成。SEQ ID NO:65称为ActA/PEST3，并且由SEQ ID NO:62中所示的全长ActA序列的氨基酸30-332组成。SEQ ID NO:66称为ActA/PEST4，并且由SEQ ID NO:62中所示的全长ActA序列的氨基酸30-399组成。作为具体实例，可以使用由SEQ ID NO:64中所示的序列组成的截短ActA蛋白。
截短ActA蛋白的实例包括例如包含SEQ ID NO:67、69、70或72中所示的序列或SEQID NO:67、69、70或72的同源物、变体、同种型、类似物、变体片段、同种型片段或类似物片段，基本上由其组成或由其组成的蛋白质。作为具体实例，可以使用由SEQ ID NO:67中所示的序列组成(由SEQ ID NO:68中所示的核酸编码)的截短ActA蛋白。作为另一具体实例，可以使用由SEQ ID NO:70中所示的序列组成(由SEQ ID NO:71中所示的核酸编码)的截短ActA蛋白。SEQ ID NO:71是编码单增李斯特菌10403S菌株中的ActA的前1170个核苷酸。在一些情况下，ActA片段可以与异源信号肽融合。举例来说，SEQ ID NO:72示出了与Hly信号肽融合的ActA片段。
C.产生编码重组融合多肽的免疫疗法构建体
本文还提供了用于产生编码本文公开的重组融合多肽的免疫疗法构建体的方法或包含本文公开的重组融合多肽的组合物。举例来说，此类方法可以包括选择和设计抗原性或免疫原性肽以包括在免疫疗法构建体中(并且例如测试每一个抗原性肽的亲水性，并且如果其得分高于选定亲水性指数阈值，则对抗原性肽进行修饰或取消选择)；设计一个或多个包含每一个选定抗原性肽的融合多肽；以及产生编码融合多肽的核酸构建体。
可以针对疏水性或亲水性对抗原性肽进行筛选。举例来说，如果抗原性肽是亲水性的或者如果它们的得分达到或低于某个亲水性阈值，则可以选择它们，这可以预测特定目标细菌(例如，单增李斯特菌)的分泌性。举例来说，可以通过Kyte-Doolittle亲水性指数以21个氨基酸窗口对抗原性肽进行评分，得分高于截止值(约1.6)的都被排除，因为它们不可能由单增李斯特菌分泌。参见例如Kyte-Doolittle(1982)J Mol Biol 157(1):105-132；该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。可选地，可以改变关于选定截止值的抗原性肽评分(例如，改变抗原性肽的长度)。可以使用的其他滑动窗大小包括例如9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或更多个氨基酸。举例来说，滑动窗大小可以是9-11个氨基酸、11-13个氨基酸、13-15个氨基酸、15-17个氨基酸、17-19个氨基酸、19-21个氨基酸、21-23个氨基酸、23-25个氨基酸或25-27个氨基酸。可以使用的其他截止值包括例如以下范围1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2.0、2.0-2.2、2.2-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0或4.0-4.5，或者截止值可以是1.4、1.5、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。截止值可以(例如)取决于用于递送融合多肽的细菌的属或种而变化。
其他合适的亲水性图或其他适当量表包括例如以下文献中报道的那些：Rose等(1993)Annu Rev Biomol Struct 22:381-415；Biswas等(2003)Journal ofChromatography A 1000:637-655；Eisenberg(1984)Ann Rev Biochem 53:595-623；Abraham和Leo(1987)Proteins:Structure,Function and Genetics 2:130-152；Sweet和Eisenberg(1983)Mol Biol 171:479-488；Bull和Breese(1974)Arch Biochem Biophys161:665-670；Guy(1985)Biophys J 47:61-70；Miyazawa等(1985)Macromolecules 18:534-552；Roseman(1988)J Mol Biol 200:513-522；Wolfenden等(1981)Biochemistry 20:849-855；Wilson(1981)Biochem J 199:31-41；Cowan和Whittaker(1990)PeptideResearch 3:75-80；Aboderin(1971)Int J Biochem 2:537-544；Eisenberg等(1984)J MolBiol 179:125-142；Hopp和Woods(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78:3824-3828；Manavalan和Ponnuswamy(1978)Nature 275:673-674；Black和Mould(1991)Anal Biochem193:72-82；Fauchere和Pliska(1983)Eur J Med Chem 18:369-375；Janin(1979)Nature277:491-492；Rao和Argos(1986)Biochim Biophys Acta 869:197-214；Tanford(1962)AmChem Soc 84:4240-4274；Welling等(1985)FEBS Lett 188:215-218；Parker等(1986)Biochemistry 25:5425-5431；以及Cowan和Whittaker(1990)Peptide Research 3:75-80，各文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
任选地，可以对抗原性肽结合受试人白细胞抗原(HLA)类型的能力进行评分(例如通过使用可在www.iedb.org获得的免疫表位数据库(IED)，其包括netMHCpan、ANN、SMMPMBEC.SMM、CombLib_Sidney2008、PickPocket和netMHCcons)并且通过每一个抗原性肽的最佳MHC结合评分进行排名。其他来源包括TEpredict(tepredict.sourceforge.net/help.html)或其他可用的MHC结合测量表。对于不同的表达载体例如沙门氏菌(Salmonella)，截止值可能不同。
任选地，可以筛选抗原性肽的免疫抑制表位(例如，T-reg表位、IL-10诱导辅助T细胞表位等)以取消选择抗原性肽或避免免疫抑制性影响。
任选地，可以使用表位免疫原性的预测算法来筛选抗原性肽。然而，这些算法在预测哪个肽将产生T细胞应答时最多20％准确。可选地，不使用筛选/预测算法。可选地，可以针对免疫原性筛选抗原性肽。举例来说，这可以包括使一个或多个T细胞与抗原性肽接触，并且分析免疫原性T细胞应答，其中免疫原性T细胞应答将该肽鉴定为免疫原性肽。这还可以包括在使一个或多个T细胞与肽接触后使用免疫原性测定法测量CD25、CD44或CD69中的至少一者的分泌或测量选自包含IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-2的组的细胞因子的分泌，其中分泌增加将该肽鉴定为包含一个或多个T细胞表位。
可以将选定抗原性肽排列成潜在融合多肽的一个或多个候选顺序。如果存在比可装入单个质粒中更多的可用抗原性肽，则可以根据需要/期望将不同的抗原性肽指定优先级别和/或将其分至不同的融合多肽中(例如，包括在不同的重组李斯特菌属菌株中)。优先级可以通过例如相对大小、转录优先权和/或翻译多肽的总体疏水性等因素来确定。可以对抗原性肽进行排列以使得它们在没有接头或在任何数目的抗原性肽对之间的接头的任何组合的情况下直接连接在一起，如本文其他部分更详细公开。欲包括的线性抗原性肽的数目可以基于以下考量来确定：所需构建体数目对比突变负荷、单个质粒的多个表位的翻译和分泌效率以及每一个包含质粒的细菌或Lm所需的MOI。
还对抗原性肽组合或整个融合多肽(即，包含抗原性肽和含PEST肽和任何标签)进行疏水性评分。举例来说，可以通过Kyte-Doolittle亲水性指数以21个氨基酸滑动窗对全部融合的抗原性肽或整个融合多肽进行亲水性评分。如果任何区域得分高于截止值(例如，约1.6)，则抗原性肽可以在融合多肽内重新排序或改组，直到发现可接受的抗原性肽顺序(即，其中没有区域得分高于截止值的抗原性肽顺序)。可选地，可以去除或重新设计任何有问题的抗原性肽以具有不同的大小。可选地或另外，可以添加或修饰如本文其他部分所公开的抗原性肽之间的一个或多个接头以改变疏水性。对于个别抗原性肽的亲水性测试，可以使用其他窗口大小，或者可以使用其他截止值(例如，取决于用于递送融合多肽的细菌的属或种)。此外，可以使用其他合适的亲水性图或其他适当量表。
任选地，可以进一步筛选抗原性肽组合或整个融合多肽的免疫抑制性表位(例如，T-reg表位、IL-10诱导辅助T细胞表位等等)以取消选择抗原性肽或避免免疫抑制性影响。
然后可以设计和优化编码抗原性肽或融合多肽的候选组合的核酸。举例来说，可以优化序列以提高翻译水平、表达持续时间、分泌水平、转录水平及其任何组合。举例来说，可以相对于对照未优化序列增加2倍至1000倍、2倍至500倍、2倍至100倍、2倍至50倍、2倍至20倍、2倍至10倍，或3倍至5倍。
举例来说，可以优化融合多肽或编码融合多肽的核酸以降低寡核苷酸序列中可能形成的二级结构的水平，或者可选地优化以防止任何可能修饰序列的酶的附着。可以阻碍细菌细胞中的表达，例如，通过转录沉默、低mRNA半衰期、二级结构形成、寡核苷酸结合分子例如阻遏剂和抑制剂的附着位点，以及稀有tRNA库的可用性。在原始序列中找到了细菌表达中的许多问题的来源。RNA优化可以包括顺式作用元件的修饰、其GC含量的改动、就细菌细胞的非限制性tRNA库调节密码子偏好性，以及避免内部同源区。因此，优化序列可能需要例如调整非常高(>80％)或非常低(<30％)GC含量的区域。优化序列还可以需要例如避免以下顺式作用序列基序中的一个或多个：内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC的序列延伸段；重复序列和RNA二级结构；(隐蔽性)剪接供体和受体位点；分支点；或其组合。优化表达可能还需要将序列元件添加至基因两侧区域和/或质粒中的其他部分。
优化序列可能还需要例如使密码子使用适应宿主基因(例如，单增李斯特菌基因)的密码子偏好性。举例来说，下面的密码子可以用于单增李斯特菌。
A＝GCA G＝GGT L＝TTA Q＝CAA V＝GTT
C＝TGT H＝CAT M＝ATG R＝CGT W＝TGG
D＝GAT I＝ATT N＝AAC S＝TCT Y＝TAT
E＝GAA K＝AAA P＝CCA T＝ACA Stop＝TAA
F＝TTC
可以产生编码融合多肽的核酸并将其引入递送载体(例如细菌菌株或李斯特菌属菌株)中。其他递送载体可适用于DNA免疫疗法或肽免疫疗法，例如牛痘病毒或病毒样颗粒。一旦产生了编码融合多肽的质粒并将其引入细菌菌株或李斯特菌属菌株中，就可以培养和表征所述细菌或李斯特菌属菌株以确认包含抗原性肽的融合多肽的表达和分泌。
III.由微基因构建体编码的重组嵌合多肽
本文公开了重组嵌合多肽，其从N末端到C末端包含细菌分泌信号序列、泛素(Ub)蛋白和抗原性WT1肽(或者一个或多个抗原性WT1肽)。如果包括两个或更多个抗原性肽，则抗原性肽可以串联(例如，Ub-肽1-肽2)。可选地，可以使用单独的嵌合多肽的组合，其中每一个抗原性WT1肽与其自有分泌序列和Ub蛋白融合(例如，Ub1-肽1；Ub2-肽2)。合适的抗原性WT1肽的实例在本文其他部分公开。
还公开了编码此类重组嵌合多肽的核酸(称为微基因构建体)。此类微基因核酸构建体可以进一步包含两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。举例来说，微基因核酸构建体可以进一步包含两个至四个开放阅读框，所述两个至四个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。每一个开放阅读框可以编码不同的嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端到C末端包含细菌分泌序列、泛素(Ub)蛋白和一个或多个抗原性WT1肽。编码嵌合多肽羧基末端的密码子可后接两个终止密码子以确保终止蛋白质合成。
在由微基因构建体编码的一些嵌合多肽中，细菌分泌序列与泛素蛋白之间存在一个或多个额外抗原性WT1肽。举例来说，细菌分泌序列与泛素蛋白之间可以存在1-20个、1-15个、1-10个、1-5个、1-4个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、18个或20个额外抗原性WT1肽。如果存在两个或更多个额外抗原性WT1肽，则它们可以彼此直接融合，经由肽接头连接。示例性接头在本文其他部分公开。额外抗原性WT1肽可以包含一个或多个天然WT1肽和/或一个或多个异变突变WT1肽。天然WT1肽的实例包括包含SEQ ID NO:95、101-113、152、154、155、158和161中任一个的序列的肽。合适的天然WT1肽的其他实例在本文其他部分公开。异变WT1突变肽的实例包括包含SEQ ID NO:114-137、159、160、162和163中任一个的序列的肽。合适的异变突变WT1肽的其他实例在本文其他部分公开。在一个实例中，所述一个或多个额外抗原性肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：第一额外抗原性WT1肽，所述第一额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:154中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；第二额外抗原性WT1肽，所述第二额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:155中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；和第三额外抗原性WT1肽，所述第三额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。在另一个实例中，所述一个或多个额外抗原性肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：第一额外抗原性WT1肽，所述第一额外抗原性WT1肽包含SEQ IDNO:154中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；第二额外抗原性WT1肽，所述第二额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:155中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；和第三额外抗原性WT1肽，所述第三额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:137中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。在这些实例的任一个中，泛素后面的WT1抗原性肽可以例如包含SEQ ID NO:114或115中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所得嵌合多肽可以包含例如SEQ IDNO:153中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
本文其他部分更详细地公开了细菌分泌信号序列的实例。泛素可以是例如全长蛋白质。由微基因构建体编码的示例性泛素肽包含SEQ ID NO:100中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。由本文提供的核酸构建体表达的泛素可以在进入宿主细胞胞质溶胶后通过水解酶的作用而在泛素羧基末端与由核酸构建体表达的重组融合多肽的其余部分发生裂解。由此释放融合多肽的其余部分，从而在宿主细胞胞质溶胶中产生肽。
本文其他部分详细讨论了融合多肽内WT1抗原性肽的选择、变化和排列，并且本文其他部分更详细地讨论了产生异变突变WT1抗原性肽的方法。
重组嵌合多肽可以包含一个或多个标签。举例来说，重组嵌合多肽可以包含在一个或多个抗原性WT1肽的N末端和/或C末端的一个或多个肽标签。标签可以直接与抗原性肽融合或通过接头与抗原性肽连接(其实例在本文其他部分公开)。标签的实例包括以下：FLAG标签；2xFLAG标签；3xFLAG标签；His标签、6xHis标签；和SIINFEKL标签。示例性SIINFEKL标签示于SEQ ID NO:16中(由SEQ ID NO:1-15中所示的任一个核酸编码)。示例性3xFLAG标签示于SEQ ID NO:32中(由SEQ ID NO:17-31中所示的任一个核酸编码)。示例性变体3xFLAG标签示于SEQ ID NO:99中。可以一起使用两个或更多个标签，例如2xFLAG标签与SIINFEKL标签、3xFLAG标签与SIINFEKL标签或6xHis标签与SIINFEKL标签。如果使用两个或更多个标签，则它们可以位于重组融合多肽内的任一处并且呈任何顺序。举例来说，两个标签可以在重组融合多肽的C末端，两个标签可以在重组融合多肽的N末端，两个标签可位于重组融合多肽内部，一个标签可以在重组融合多肽的C末端且一个标签在N末端，一个标签可以在重组融合多肽的C末端且一个在内部，或者一个标签可以在重组融合多肽的N末端且一个在内部。其他标签包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。特定重组融合多肽包含C末端SIINFEKL标签。此类标签可以使得容易地检测重组融合蛋白，确认重组融合蛋白分泌，或通过跟踪对这些“标签”序列肽的免疫应答来跟踪所分泌的融合多肽的免疫原性。可以使用许多试剂监测此类免疫应答，包括例如对这些标签具特异性的单克隆抗体和DNA或RNA探针。
本文公开的重组嵌合多肽可以由重组李斯特菌属菌株表达，或者可以从用于蛋白质表达和分离的其他载体和细胞系统表达和分离。包含表达此类抗原性肽的重组李斯特菌属菌株可用于例如包含此类重组李斯特菌的免疫原性组合物以及包含重组李斯特菌属菌株和佐剂的疫苗中。
还公开了编码此类重组嵌合多肽的核酸(微基因构建体)。核酸可以呈任何形式。核酸可以包含DNA或RNA或由其组成，并且可以是单链或双链的。核酸可以呈质粒形式，例如附加型质粒、多拷贝附加型质粒或整合质粒。可选地，核酸可以呈病毒载体、噬菌体载体或细菌人工染色体的形式。此类核酸可以具有一个开放阅读框或者可具有两个或更多个开放阅读框(例如，编码重组嵌合多肽的开放阅读框和编码代谢酶的第二开放阅读框)。在一个实例中，此类核酸可以包含两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。举例来说，核酸可以包含两个至四个开放阅读框，所述两个至四个开放阅读框通过各开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列连接。每一个开放阅读框可以编码不同的多肽。编码嵌合多肽羧基末端的密码子可后接两个终止密码子以确保终止蛋白质合成。
一些示例性重组嵌合多肽包括具有包含SEQ ID NO:153、156、157和164-166中任一个所示的序列、基本上由其组成或由其组成的序列的那些。
A.由微基因构建体编码的抗原性WT1肽
由本文公开的微基因构建体编码的WT1肽可以是天然的(即，未改变的、天然存在的)WT1肽或异变WT1肽(例如，I类和II类HLA异变肽)。天然WT1肽的实例包括包含SEQ IDNO:95、101-113、152、154、155、158和161中任一个的序列的肽。异变WT1肽的实例包括包含SEQ ID NO:114-137、159、160、162和163中任一个的序列的肽。术语“异变”是指产生识别异变肽所来源的天然肽(例如，不含锚残基突变的肽)的免疫应答的肽。举例来说，通过使残基1突变为苯丙氨酸，由RMFPNAPYL(SEQ ID NO:101)产生FMFPNAPYL(SEQ ID NO:114)。异变肽可以产生识别异变肽所来源的天然肽的免疫应答。举例来说，通过接种异变肽而产生的针对天然肽的免疫应答的量级可以等于或大于通过接种天然肽而产生的免疫应答。免疫应答可以增加例如2倍、3倍、5倍、7倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、100倍、150倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更多。
本文公开的天然或异变WT1肽可以结合一个或多个HLA分子。HLA分子也称为主要组织相容性复合体(MHC)分子，其结合肽并将它们呈递至免疫细胞。肽的免疫原性可部分地由其对HLA分子的亲和力决定。I类HLA分子与普遍存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的CD8分子相互作用。II类HLA分子与普遍存在于辅助性T淋巴细胞上的CD4分子相互作用。举例来说，本文公开的WT1肽能以足够的亲和力结合HLA分子以激活T细胞前体或以足够的亲和力结合HLA分子以介导T细胞识别。
本文公开的天然或异变WT1肽可以结合一个或多个II类HLA分子。举例来说，WT1肽可以结合HLA-DRB分子、HLA-DRA分子、HLA-DQA1分子、HLA-DQB1分子、HLA-DPA1分子、HLA-DPB1分子、HLA-DMA分子、HLA-DMB分子、HLA-DOA分子或HLA-DOB分子。
本文公开的天然或异变WT1肽可以结合一个或多个I类HLA分子。举例来说，WT1肽可以结合HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子、HLA-A0201分子、HLA A1、HLA A2、HLA A2.1、HLA A3、HLA A3.2、HLA A11、HLA A24、HLA B7、HLA B27或HLA B8。类似地，WT-1肽可以结合I类HLA分子超家族，例如A2超家族、A3超家族、A24超家族、B7超家族、B27超家族、B44超家族、C1超家族或C4超家族。
异变WT1肽可以包含使肽与II类HLA分子的结合相对于相应的天然WT1肽有所增强的突变。可选地或另外地，异变WT1肽可以包含使肽与I类HLA分子的结合相对于相应的天然WT1肽有所增强的突变。举例来说，突变残基可以是II类HLA基序锚残基。在另一个实施方案中，“锚基序”或“锚残基”是指HLA结合序列(例如，II类HLA结合序列或I类HLA结合序列)中特定位置上的一个或一组优选残基。
用于产生有可能引发对野生型表位的交叉反应性免疫原性应答的预测异变表位的各种方法是众所周知的。举例来说，为了设计有可能引发对野生型表位的交叉反应性免疫原性应答的异变表位，可以使用NetMHCpan 3.0 Server(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)来确定野生型表位的基线预测肽-MHC结合亲和力。肽-MHC结合亲和力百分比等级小于或等于1.0被视为可能引发免疫应答的强结合体。通过在但不限于被预测为强结合体的野生型表位的1位、2位、3位或C末端位置随机取代1个或多个氨基酸来产生潜在异变表位。然后使用NetMHCpan 3.0 Server估算潜在异变表位的肽-MHC结合亲和力。具有与野生型表位类似的结合亲和力百分比等级和小于或等于1.0百分比等级的异变表位可以被视为潜在抗原以供将来验证。
用于鉴定I类和II类HLA残基以及通过使残基突变来改善HLA结合的其他方法是众所周知的。参见例如US 8,765,687、US 7,488,718、US 9,233,149和US 7,598,221，各专利都出于所有目的通过引用整体并入本文。举例来说，用于预测II类MHC表位的方法是众所周知的。作为一个实例，可以使用TEPITOPE(Meister等(1995)Vaccine 13:581-591，其出于所有目的通过引用整体并入本文)预测II类MHC表位。作为另一个实例，可以使用EpiMatrix(De Groot等(1997)AIDS Res.Hum.Retroviruses 13:529-531，其出于所有目的通过引用整体并入本文)来预测II类MHC表位。作为又一个实例，可以使用预测方法(PredictMethod)(Yu K等(2002)Mol.Med.8:137-148，其出于所有目的通过引用整体并入本文)来预测II类MHC表位。作为又一个实例，可以使用SYFPEITHI表位预测算法来预测II类MHC表位。SYFPEITHI是包含超过4500个已知结合I类和II类MHC分子的肽序列的数据库。SYFPEITHI基于沿MHC结合槽的某些位置上的某些氨基酸的存在来提供得分。理想氨基酸锚值10点，异常锚值6-8分，辅助锚值4-6分，优选残留值1-4分；对结合得分的负氨基酸作用在-1与-3之间。HLA-A*0201的最大得分是36。作为又一个实例，可以使用Rankpep来预测II类MHC表位。Rankpep使用位置特异性评分矩阵(PSSM)或已知结合给定MHC分子的多组对齐肽的轮廓作为MHC-肽结合的预测因子。Rankpep包括关于在选定轮廓下的肽的得分以及预测肽的最佳或百分位数得分相对于产生最大得分的共有序列的最佳或百分位数得分的％的信息。Rankpep包括102和80PSSM的选择，分别用于预测肽与MHC I和MHC II分子的结合。用于预测不同大小的肽结合物的若干种PSSM通常可用于每一个MHC I分子。作为另一个实例，可以使用SVMHC(Donnes和Elofsson(2002)BMC Bioinformatics 11；3:25，其出于所有目的通过引用整体并入本文)来鉴定II类MHC表位。
用于鉴定I类MHC表位的方法也是众所周知的。作为一个实例，可以使用BIMAS软件预测I类MHC表位。BIMAS评分基于MHC-I/β2-微球蛋白/肽复合物的理论半衰期的计算，其为肽结合亲和力的量度。该程序使用了关于长度为8-10个氨基酸的HLA-I肽的信息。肽与MHC的结合亲和力越高，该肽代表表位的可能性越大。BIMAS算法假设肽中的每一个氨基酸独立地促成与I类分子的结合。对结合至关重要的显性锚残基在表中具有远远高于1的系数。不利的氨基酸具有小于1的正系数。如果不知道氨基酸对结合作出有利还是不利贡献，则给它赋值1。将赋予氨基酸的所有值相乘，并且将所得运行得分乘以常数以产生解离半衰期的估计值。作为另一个实例，可以使用SYFPEITHI来鉴定I类MHC表位。作为又一个实例，可以使用SVMHC鉴定I类MHC表位。作为又一个实例，可以使用NetMHC-2.0(Buus等(2003)TissueAntigens 62:378-384，其出于所有目的通过引用整体并入本文)来鉴定I类MHC表位。
可以使HLA结合基序中的不同的残基突变以增强MHC结合。在一个实例中，增强MHC结合的突变在I类HLA结合基序的1位残基处(例如，突变成酪氨酸、甘氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸)。作为另一个实例，突变可以在I类HLA结合基序的2位(例如，突变成亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸)。作为另一个实例，突变可以在I类HLA结合基序的6位(例如，突变成缬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或组氨酸)。作为另一个实例，突变可以在I类HLA结合基序的9位或在C末端位置(例如，突变成缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸或半胱氨酸)。突变可以在主锚残基中或在次锚残基中。举例来说，I类HLA主锚残基可以在2位和9位，而次锚残基可以在1位和8位或1位、3位、6位、7位和8位。在另一个实例中，点突变可以在选自4位、5位和8位的位置。
类似地，可以使II类HLA结合位点中的不同的残基突变。举例来说，可以修饰II类HLA基序锚残基。举例来说，可以使P1位置、P2位置、P6位置或P9位置突变。可选地，可以使P4位置、P5位置、P10位置、P11位置、P12位置或P13位置突变。
由微基因构建体编码的嵌合多肽可以包括单个抗原性WT1肽，或者可以包括两个或更多个抗原性肽。每一个抗原性肽可以具有足以诱导免疫应答的任何长度，并且每一个抗原性肽可以是相同的长度，或者抗原性肽可以具有不同的长度。举例来说，由微基因构建体编码的抗原性肽的长度可以是8-100、8-50、8-30、8-25、8-22、8-20、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11或8-10个氨基酸。在一个实例中，抗原性WT1肽的长度可以是9个氨基酸。
每一个抗原性肽还可以是亲水性的或者可以达到或低于某个亲水性阈值，这可以预测单增李斯特菌或另一种目标细菌的分泌性。举例来说，可以通过Kyte-Doolittle亲水性指数以21个氨基酸窗口对抗原性肽进行评分，并且可以排除高于截止值(约1.6)的所有得分，因为它们不可能由单增李斯特菌分泌。同样地，抗原性肽组合或嵌合多肽可以是亲水性的或者可以达到或低于某个亲水性阈值，这可以预测单增李斯特菌或另一种目标细菌的分泌性。
如果嵌合多肽包含多于一个抗原性肽，则抗原性肽可以按任何方式连接在一起。举例来说，抗原性肽可以在没有插入序列的情况下彼此直接融合。可选地，抗原性肽可以经由一个或多个接头，例如肽接头而彼此间接连接。在一些情况下，一些相邻抗原性肽对可以彼此直接融合，而其他抗原性肽对可以经由一个或多个接头而彼此间接连接。可以在每一对相邻抗原性肽之间使用相同的接头，或者可以在不同的相邻抗原性肽对之间使用任何数目的不同的接头。另外，可以在一对相邻抗原性肽之间使用一个接头，或者可以在一对相邻抗原性肽之间使用多个接头。
任何合适的序列都可用于肽接头。合适的接头的实例在本文其他部分公开。
由微基因构建体编码的示例性天然和相应异变突变WT1肽在下表中提供。异变肽中的突变残基用粗体并且加下划线。其他示例性天然WT1肽包括SEQ ID NO:95和152。
由微基因构建体编码的其他示例性天然WT1肽和相应异变突变WT1肽示于下表中。异变肽中的突变残基用粗体并且加下划线。
B.细菌分泌信号序列
细菌分泌信号序列可以是李斯特菌信号序列，例如Hly或ActA信号序列，或任何其他已知的信号序列。在其他情况下，信号序列可以是LLO信号序列。示例性LLO信号序列示于SEQ ID NO:150中。举例来说，由本文的微基因构建体编码的细菌分泌信号序列可以是LLO的N末端片段，例如SEQ ID NO:59中所示的。信号序列可以是细菌的，可以是宿主细菌原生的(例如，单增李斯特菌，例如secA1信号肽)，或者可以对宿主细菌是外来的。信号肽的具体实例包括来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽、来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原信号肽、secA2信号肽例如来自单增李斯特菌的p60信号肽，和Tat信号肽例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Tat信号肽(例如，PhoD)。在具体实例中，分泌信号序列来自李斯特菌属蛋白，例如ActA300分泌信号或ActA100分泌信号(包含ActA分泌信号序列的前100个氨基酸)。示例性ActA信号序列示于SEQ ID NO:151中。
C.产生编码由微基因构建体编码的重组嵌合多肽的免疫疗法构建体
本文还提供了用于产生编码本文公开的重组嵌合多肽的免疫疗法构建体的方法或包含本文公开的重组嵌合多肽的组合物。举例来说，此类方法可以包括选择和设计抗原性或免疫原性肽以包括在免疫疗法构建体中(并且例如测试每一个抗原性肽的亲水性，并且如果其得分高于选定亲水性指数阈值，则对抗原性肽进行修饰或取消选择)；设计一个或多个包含每一个选定抗原性肽的融合多肽，以及产生编码融合多肽的核酸构建体。此类方法在本文其他部分更详细地公开。此外，本文其他部分更详细地描述了产生有可能引发对野生型表位的交叉反应性免疫原性应答的预测异变表位的方法。
IV.重组细菌或李斯特菌属菌株
本文还提供了重组细菌菌株，例如李斯特菌属菌株，其包含本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽或者编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)，如本文其他部分所公开。优选地，细菌菌株是李斯特菌属菌株，例如单增李斯特菌(Lm)菌株。Lm作为疫苗载体具有许多固有的优点。该细菌在体外非常有效地生长而没有特殊要求，而且它缺乏LPS，其为革兰氏阴性细菌，例如沙门氏菌中的主要毒性因子。基因减毒Lm载体还提供了额外的安全性，因为在严重副作用的情况下，它们可以用抗生素很容易地消除，并且不同于一些病毒载体，不会发生遗传物质整合到宿主基因组中。
重组李斯特菌属菌株可以是任何李斯特菌属菌株。合适的李斯特菌属菌株的实例包括西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、默氏李斯特菌(Listeria murrayi)、威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)、单增李斯特菌(Lm)或本领域已知的任何其他李斯特菌属。优选地，重组李斯特菌属菌株是单增李斯特菌属的菌株。单增李斯特菌菌株的实例包括以下：单增李斯特菌10403S野生型(参见例如Bishop和Hinrichs(1987)J Immunol 139:2005-2009；Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186)；单增李斯特菌DP-L4056，它经过噬菌体熟化(参见例如Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186)；单增李斯特菌DP-L4027，它经过噬菌体熟化并且具有hly基因缺失(参见例如Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186；Jones和Portnoy(1994)Infect Immunity 65:5608-5613)；单增李斯特菌DP-L4029，它经过噬菌体熟化并且具有actA基因缺失(参见例如Lauer等(2002)J Bact 184:4177-4186；Skoble等(2000)JCell Biol 150:527-538)；单增李斯特菌DP-L4042(ΔPEST)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci.USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4097(LLO-S44A)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4364(ΔlplA；脂肪酸蛋白连接酶)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4405(ΔinlA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4406(ΔinlB)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl AcadSci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌CS-LOOOl(ΔactA；ΔinlB)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌CS-L0002(ΔactA；ΔlplA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad SciUSA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌CS-L0003(LLO L461T；ΔlplA)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4038(ΔactA；LLO L461T)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad SciUSA 101:13832-13837和支持信息)；单增李斯特菌DP-L4384(LLO S44A；LLO L461T)(参见例如Brockstedt等(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837和支持信息)；具有lplA1缺失的单增李斯特菌菌株(编码脂肪酸蛋白连接酶LplA1)(参见例如O’Riordan等(2003)Science 302:462-464)；单增李斯特菌DP-L4017(具有LLO L461T的10403S)(参见例如US 7,691,393)；单增李斯特菌EGD(参见例如GenBank登记号AL591824)。在另一个实施方案中，李斯特菌属菌株是单增李斯特菌EGD-e(参见GenBank登记号NC_003210；ATCC登记号BAA-679)；单增李斯特菌DP-L4029(actA缺失，任选与uvrAB缺失组合(DP-L4029uvrAB)(参见例如US 7,691,393)；单增李斯特菌actA-/inlB-双突变体(参见例如ATCC登记号PTA-5562)；单增李斯特菌lplA突变体或hly突变体(参见例如US 2004/0013690)；单增李斯特菌dal/dat双突变体(参见例如US 2005/0048081)。其他单增李斯特菌菌株包括经过修饰(例如，通过质粒和/或通过基因组整合)而含有编码以下基因之一或任何组合的核酸的那些：hly(LLO；李斯特菌溶素)；iap(p60)；inlA；inlB；inlC；dal(丙氨酸消旋酶)；dat(D-氨基酸氨基转移酶)；plcA；plcB；actA；或介导单壁囊泡的生长、扩散、分解、双壁囊泡的分解、与宿主细胞的结合或被宿主细胞摄取的任何核酸。上述参考文献中的每一个都出于所有目的通过引用整体并入本文。
重组细菌或李斯特菌属可以具有野生型毒力，可以具有减毒的毒力，或者可以是无毒的。举例来说，重组李斯特菌属可以具有足以逃避吞噬体或吞噬溶酶体并进入胞质溶胶的毒力。此类李斯特菌属菌株还可以是减毒活李斯特菌属菌株，其包含至少一种如本文其他部分所公开的减毒突变、缺失或灭活。优选地，重组李斯特菌属是减毒营养缺陷型菌株。营养缺陷型菌株是不能合成其生长所需的特定有机化合物的菌株。此类菌株的实例描述于US 8,114,414中，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
优选地，重组李斯特菌属菌株缺乏抗生素抗性基因。举例来说，此类重组李斯特菌属菌株可以包含不编码抗生素抗性基因的质粒。然而，本文提供的一些重组李斯特菌属菌株包含含有编码抗生素抗性基因的核酸的质粒。抗生素抗性基因可用于分子生物学和疫苗制备中常用的常规选择和克隆过程。示例性抗生素抗性基因包括赋予对氨苄青霉素、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素和庆大霉素的抗性的基因产物。
A.包含重组融合多肽或嵌合多肽或者编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸的细菌或李斯特菌属菌株
本文公开的重组细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)包含本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽或编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)，如本文其他部分所公开。
在包含编码重组融合蛋白的核酸的细菌或李斯特菌属菌株中，可以对核酸进行密码子优化。单增李斯特菌用于每一个氨基酸的最佳密码子的实例示于US 2007/0207170中，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。如果核酸中的至少一个密码子被置换为单增李斯特菌更常用于该氨基酸的密码子而不是原始序列中的密码子，则核酸被密码子优化。
核酸可以存在于细菌或李斯特菌属菌株内的附加型质粒中和/或核酸可以基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中。一些重组细菌或李斯特菌属菌株包含编码两个如本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽的两个单独的核酸：一个核酸呈附加型质粒形式，并且一个核酸被基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中。
附加型质粒可以是在体外(在细胞培养物中)，体内(在宿主中)或体外与体内都稳定维持的质粒。如果呈附加型质粒形式，则编码重组融合多肽或嵌合多肽的开放阅读框可以与质粒中的启动子/调控序列可操作地连接。如果被基因组整合在细菌或李斯特菌属菌株中，则编码重组融合多肽或嵌合多肽的开放阅读框可以与外源启动子/调控序列或内源启动子/调控序列可操作地连接。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列的实例是众所周知的，包括例如李斯特菌属hly、hlyA、actA、prfA和p60启动子、链球菌属bac启动子、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。在某些情况下，插入的目标基因不会中断或受到调控限制，所述调控限制通常由于整合到基因组DNA中而发生，并且在一些情况下，存在插入的异源基因不会导致细胞自身重要区域的重排或中断。
此类重组细菌或李斯特菌属菌株可以通过用包含编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸的质粒或载体转化本文其他部分描述的细菌或李斯特菌属菌株或者减毒的细菌或李斯特菌属菌株来制备。质粒可以是没有整合到宿主染色体中的附加型质粒。可选地，质粒可以是整合到细菌或李斯特菌属菌株的染色体中的整合质粒。本文使用的质粒还可以是多拷贝质粒。转化细菌的方法是众所周知的，且包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法，噬菌体介导的转导、化学转化技术和物理转化技术。参见例如de Boer等(1989)Cell56:641-649；Miller等(1995)FASEB J.9:190-199；Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等(1997)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt等编,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society forMicrobiology,Washington,D.C.；及Miller,1992,A Short Course in BacterialGenetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，其中各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
具有基因组整合异源核酸的细菌或李斯特菌属菌株可以例如通过使用位点特异性整合载体来制备，由此使用同源重组来产生包含整合基因的细菌或李斯特菌。所述整合载体可以是能够感染细菌或李斯特菌属菌株的任何位点特异性整合载体。此类整合载体可以包含例如PSA attPP'位点、编码PSA整合酶的基因、U153attPP'位点、编码U153整合酶的基因、A118attPP'位点、编码A118整合酶的基因或任何其他已知的attPP'位点或任何其他噬菌体整合酶。
包含整合基因的此类细菌或李斯特菌属菌株还可以使用任何用于将异源核酸整合到细菌或李斯特菌染色体中的其他已知方法产生。用于同源重组的技术是众所周知的，并且描述于例如以下文献中：Baloglu等(2005)Vet Microbiol 109(1-2):11-17；Jiang等(2005)Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)37(1):19-24；和US 6,855,320，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
整合到细菌或李斯特菌染色体中还可以使用转座子插入来实现。用于转座子插入的技术是众所周知的，并且举例来说，Sun等(1990)Infection and Immunity 58:3770-3778描述了DP-L967的构建，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。转座子诱变可以实现稳定的基因组插入，但是在已经插入异源核酸的基因组中的位置是未知的。
整合至细菌或李斯特菌染色体中还可以使用噬菌体整合位点来实现(参见例如Lauer等(2002)J Bacteriol 184(15):4177-4186，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。举例来说，噬菌体(例如，U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和附着位点可用于将异源基因插入相应的附着位点，所述附着位点可以是基因组中的任何适当位点(例如，comK或arg tRNA基因的3’末端)。在整合异源核酸之前，可以使来自所使用的附着位点的内源前噬菌体熟化。举例来说，此类方法可以产生单拷贝整合体。为了避免“噬菌体熟化步骤”，可以使用基于PSA噬菌体的噬菌体整合系统(参见例如Lauer等(2002)J Bacteriol 184:4177-4186，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。维持整合基因可能需要例如通过抗生素进行连续选择。可选地，可以建立不需要用抗生素进行选择的基于噬菌体的染色体整合系统。相反，可以补充营养缺陷型宿主菌株。举例来说，可以使用供临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中使用对于必需酶(包括例如D-丙氨酸消旋酶)而言为营养缺陷的宿主菌株(例如，Lm dal(-)dat(-))。
还可以使用缀合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。缀合方法是众所周知的，并且描述于例如Nikodinovic等(2006)Plasmid 56(3):223-227和Auchtung等(2005)Proc NatlAcad Sci USA 102(35):12554-12559中，各文献都出于所有目的通过引用并入本文。
在一个具体实例中，重组细菌或李斯特菌属菌株可以包含作为具有内源actA序列(编码ActA蛋白)或内源hly序列(编码LLO蛋白)的开放阅读框被基因组整合到细菌或李斯特菌属基因组中的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸。举例来说，融合多肽或嵌合多肽的表达和分泌可以受内源actA启动子和ActA信号序列控制，或者可以受内源hly启动子和LLO信号序列控制。作为另一个实例，编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸可以置换编码ActA蛋白的actA序列或编码LLO蛋白的hly序列。
可以通过任何手段实现重组细菌或李斯特菌属菌株的选择。举例来说，可以使用抗生素选择。抗生素抗性基因可用于分子生物学和疫苗制备中常用的常规选择和克隆过程中。示例性抗生素抗性基因包括赋予对氨苄青霉素、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素和庆大霉素的抗性的基因产物。可选地，可以使用营养缺陷型菌株，并且可以使用外源代谢基因代替或外加抗生素抗性基因用于选择。举例来说，为了选择本文提供的包含编码代谢酶的质粒或互补基因的营养缺陷型细菌，可以使转化过的营养缺陷型细菌在将选择用于表达编码代谢酶的基因(例如氨基酸代谢基因)或互补基因的培养基中生长。可选地，温度敏感性质粒可用于选择重组体或任何其他已知的重组体选择手段。
B.细菌或李斯特菌属菌株的减毒
可以对本文公开的重组细菌菌株(例如，重组李斯特菌属菌株)进行减毒。术语“减毒”包括细菌在宿主动物中引起疾病的能力减弱。举例来说，减毒李斯特菌属菌株的致病特征与野生型李斯特菌相比可以减弱，但减毒李斯特菌能够在培养基中生长和维持。使用以减毒李斯特菌对BALB/c小鼠进行静脉内接种作为实例，50％接种动物存活的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50增加至少约10倍，更优选至少约100倍，更优选至少约1,000倍，甚至更优选至少约10,000倍，且最优选至少约100,000倍。因此，减毒李斯特菌属菌株是不会杀死施用它的动物的菌株，或者是仅当施用的细菌数目远远大于杀死动物所需的野生型非减毒细菌数目时才会杀死该动物的菌株。减毒细菌还应当被视为意指在一般环境中不能够复制的细菌，因为其中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌仅限在提供所需营养物的受控环境中复制。减毒菌株对环境无害，因为它们不能够进行不受控制的复制。
(1)使细菌和李斯特菌属菌株减毒的方法
可以通过任何已知的手段来实现减毒。举例来说，此类减毒菌株可能缺乏一个或多个内源毒力基因或者一个或多个内源代谢基因。本文公开了此类基因的实例，并且可通过灭活本文公开的基因中的任一个或任何组合来实现减毒。灭活可以通过例如缺失或通过突变(例如，灭活突变)来实现。术语“突变”包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并且可以包括缺失、截短、插入、取代、破坏或易位。举例来说，突变可以包括框移突变、导致蛋白质过早终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。可以使用重组DNA技术或使用传统诱变技术使用诱变化学品或辐射并且随后选择突变体来实现诱变。缺失突变体可能是优选的，因为伴随着较低逆转概率。术语“代谢基因”是指编码合成宿主细菌利用或需要的营养物所涉及或需要的酶的基因。举例来说，酶可以为合成宿主细菌持续生长所需的营养素所涉及或需要。术语“毒力”基因包括在生物体基因组中的存在或活动促成对生物体的致病性(例如，使生物体能够实现宿主中生态位的定植(包括附着至细胞)、免疫逃避(逃避宿主的免疫应答)、免疫抑制(抑制宿主的免疫应答)、进入和退出细胞或从宿主获得营养)的基因。
此类减毒菌株的具体实例是单增李斯特菌(Lm)dal(-)dat(-)(Lmdd)。此类减毒菌株的另一个实例是Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。参见例如US 2011/0142791，其出于所有目的通过引用整体并入本文。LmddA基于因内源毒力基因actA缺失而减毒的李斯特菌属菌株。此类菌株可以通过dal基因的互补作用而保留用于体内和体外抗原表达的质粒。可选地，LmddA可以是在内源dal、dat和actA基因中具有突变的dal/dat/actA李斯特菌。此类突变可以是例如缺失或其他灭活突变。
减毒菌株的另一个具体实例是Lm prfA(-)或prfA基因中具有部分缺失或灭活突变的菌株。PrfA蛋白控制包含Lm定植其脊椎动物宿主所需的必需毒力基因的调控子的表达；因此，prfA突变强烈损害PrfA激活PrfA依赖性毒力基因表达的能力。
减毒菌株的又一个具体实例是LminlB(-)actA(-)，其中对细菌的天然毒力至关重要的两个基因，即内化素B和actA缺失。
减毒细菌或李斯特菌属菌株的其他实例包括缺乏一个或多个内源毒力基因的细菌或李斯特菌属菌株。此类基因的实例包括李斯特菌属中的actA、prfA、plcB、plcA、inlA、inlB、inlC、inlJ和bsh。减毒李斯特菌属菌株还可以是上述菌株中任一个的双突变体或三重突变体。减毒李斯特菌属菌株可以包含所述基因中每一个的突变或缺失，或包含本文提供的基因中任一个(例如，包括actA、prfA和dal/dat基因)，例如至多十个的突变或缺失。举例来说，减毒李斯特菌属菌株可以包含内源内化素C(inlC)基因的突变或缺失和/或内源actA基因的突变或缺失。可选地，减毒李斯特菌属菌株可以包含内源内化素B(inlB)基因的突变或缺失和/或内源actA基因的突变或缺失。可选地，减毒李斯特菌属菌株可以包含内源inlB、inlC和actA基因的突变或缺失。李斯特菌向邻近细胞易位受该过程所涉及的内源actA基因和/或内源inlC基因或内源inlB基因缺失的抑制，从而导致高水平的减毒作用，伴随免疫原性和作为菌株骨架的效用的增加。减毒李斯特菌属菌株还可以是包含plcA与plcB突变或缺失的双突变体。在一些情况下，菌株可以由EGD李斯特菌属骨架构建。
细菌或李斯特菌属菌株还可以是在代谢基因中具有突变的营养缺陷型菌株。作为一个实例，菌株可以缺乏一个或多个内源氨基酸代谢基因。举例来说，缺乏D-丙氨酸的李斯特菌属营养缺陷型菌株的产生可以例如通过众多众所周知的手段来实现，包括缺失突变、插入突变、框移突变、导致蛋白质过早终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。缺失突变体可能是优选的，因为伴随低营养缺陷型表型逆转概率。举例来说，可以在简单的实验室培养测定中测试根据本文提供的方案产生的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下生长的能力。可以选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体。
内源氨基酸代谢基因的实例包括维生素合成基因、编码泛酸合酶的基因、D-谷氨酸合酶基因、D-丙氨酸氨基转移酶(dat)基因、D-丙氨酸消旋酶(dal)基因、dga、参与二氨基庚二酸(DAP)合成的基因、参与半胱氨酸合酶A(cysK)合成的基因、非维生素B12依赖性甲硫氨酸合酶、trpA、trpB、trpE、asnB、gltD、gltB、leuA、argG和thrC。李斯特菌属菌株可以缺乏两个或更多个此类基因(例如，dat和dal)。D-谷氨酸合成部分受参与D-glu+pyr转化为α-酮戊二酸+D-ala以及逆反应的dal基因控制。
作为另一个实例，减毒李斯特菌属菌株可以缺乏内源合酶基因，例如氨基酸合成基因。此类基因的实例包括folP、编码二氢尿苷合酶家族蛋白的基因、ispD、ispF、编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的基因、hisF、hisH、fliI、编码核糖体大亚基假尿苷合酶的基因、ispD、编码双功能GMP合酶/谷氨酰胺转酰胺酶蛋白的基因、cobS、cobB、cbiD、编码尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶的基因、cobQ、uppS、truB、dxs、mvaS、dapA、ispG、folC、编码柠檬酸合酶的基因、argJ、编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶的基因、编码吲哚-3-甘油-磷酸合酶的基因、编码邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺转酰胺酶组分的基因、menB、编码甲基萘醌特异性异分支酸合酶的基因、编码磷酸核糖基甲酰甘氨脒合酶I或II的基因、编码磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀甲酰胺合酶的基因、carB、carA、thyA、mgsA、aroB、hepB、rluB、ilvB、ilvN、alsS、fabF、fabH、编码假尿苷合酶的基因、pyrG、truA、pabB和atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等等)。
减毒李斯特菌属菌株可能缺乏内源phoP、aroA、aroC、aroD或plcB。作为又一个实例，减毒李斯特菌属菌株可以缺乏内源肽转运蛋白。实例包括编码ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白、寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白、寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白、锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白、糖ABC转运蛋白、磷酸盐转运蛋白、ZIP锌转运蛋白、EmrB/QacA家族耐药性转运蛋白、硫酸盐转运蛋白、质子依赖性寡肽转运蛋白、镁转运蛋白、甲酸盐/亚硝酸盐转运蛋白、亚精胺/腐胺ABC转运蛋白、Na/Pi共转运蛋白、糖磷酸盐转运蛋白、谷氨酰胺ABC转运蛋白、主要易化子家族转运蛋白、甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白、钼ABC转运蛋白、磷壁酸ABC转运蛋白、钴ABC转运蛋白、铵转运蛋白、氨基酸ABC转运蛋白、细胞分裂ABC转运蛋白、锰ABC转运蛋白、铁化合物ABC转运蛋白、麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白、Bcr/CflA家族耐药性转运蛋白以及上述蛋白质之一的亚基的基因。
其他减毒细菌和李斯特菌属菌株可以缺乏代谢用于细菌生长过程、复制过程、细胞壁合成、蛋白质合成、脂肪酸代谢或用于任何其他生长或复制过程的氨基酸的内源代谢酶。同样地，减毒菌株可能缺乏能催化细胞壁合成中所使用的氨基酸的形成、能催化细胞壁合成中所使用的氨基酸的合成或者能参与细胞壁合成中所使用的氨基酸的合成的内源代谢酶。可选地，氨基酸可用于细胞壁生物发生。可选地，代谢酶是细胞壁组分D-谷氨酸的合成酶。
其他减毒李斯特菌属菌株可能缺乏由D-谷氨酸合成基因、dga、alr(丙氨酸消旋酶)基因或参与丙氨酸合成的任何其他酶编码的代谢酶。李斯特菌属菌株可以缺乏的代谢酶的其他实例包括由serC(磷酸丝氨酸氨基转移酶)、asd(天冬氨酸β半醛脱氢酶；参与细胞壁成分二氨基庚二酸的合成)、编码gsaB-谷氨酸-1-半醛氨基转移酶的基因(催化由(S)-4-氨基-5-氧代戊酸酯形成5-氨基乙酰丙酸酯)、hemL(催化由(S)-4-氨基-5-氧代戊酸酯形成5-氨基乙酰丙酸)、aspB(催化由L-天冬氨酸和2-氧戊二酸形成草酰乙酸和L-谷氨酸的天冬氨酸氨基转移酶)、argF-1(参与精氨酸生物合成)、aroE(参与氨基酸生物合成)、aroB(参与3-脱氢奎尼酸生物合成)、aroD(参与氨基酸生物合成)、aroC(参与氨基酸生物合成)、hisB(参与组氨酸生物合成)、hisD(参与组氨酸生物合成)、hisG(参与组氨酸生物合成)、metX(参与蛋氨酸生物合成)、proB(参与脯氨酸生物合成)、argR(参与精氨酸生物合成)、argJ(参与精氨酸生物合成)、thil(参与硫胺素生物合成)、LMOf2365_1652(参与色氨酸生物合成)、aroA(参与色氨酸生物合成)、ilvD(参与缬氨酸和异亮氨酸生物合成)、ilvC(参与缬氨酸和异亮氨酸生物合成)、leuA(参与亮氨酸生物合成)、dapF(参与赖氨酸生物合成)和thrB(参与苏氨酸生物合成)编码的酶(全部GenBank登记号NC_002973)。
减毒李斯特菌属菌株可以通过使其他代谢酶(例如tRNA合成酶)突变产生。举例来说，代谢酶可以由编码色氨酰tRNA合成酶的trpS基因编码。举例来说，宿主菌株细菌可以是Δ(trpS aroA)，并且两种标记物都可以包含在整合载体中。
可以突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括由murE(参与二氨基庚二酸的合成；GenBank登记号：NC_003485)、LMOf2365_2494(参与磷壁酸生物合成)、WecE(脂多糖生物合成蛋白rffA；GenBank登记号：AE014075.1)或amiA(N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)编码的酶。代谢酶的其他实例包括天冬氨酸氨基转移酶、组氨醇-磷酸氨基转移酶(GenBank登记号NP_466347)或细胞壁磷壁酸糖基化蛋白GtcA。
可以突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括肽聚糖组分或前体的合成酶。该组分可以是例如UDP-N-乙酰基胞壁酰五肽、UDP-N-乙酰葡糖胺、MurNAc-(五肽)-焦磷酰-十一碳烯醇、GlcNAc-p-(1,4)-MurNAc-(五肽)-焦磷酰十一碳烯醇或者任何其他肽聚糖组分或前体。
可以突变以产生减毒李斯特菌属菌株的代谢酶的其他实例包括由murG、murD、murA-1或murA-2编码的代谢酶(全部示于GenBank登记号NC_002973中)。可选地，代谢酶可以是肽聚糖组分或前体的任何其他合成酶。代谢酶还可以是转糖基化酶、转肽酶、羧肽酶、任何其他类别的代谢酶或任何其他代谢酶。举例来说，代谢酶可以是任何其他李斯特菌代谢酶或任何其他单增李斯特菌代谢酶。
可以如上文针对李斯特菌所述，通过使其他细菌菌株中的相应直系同源基因突变来对其他细菌菌株进行减毒。
(2)补充减毒细菌和李斯特菌属菌株的方法
本文公开的减毒细菌或李斯特菌属菌株可以进一步包含含有互补基因或编码互补减毒突变(例如，补充营养缺陷型李斯特菌属菌株的营养缺陷)的代谢酶的核酸。举例来说，具有编码本文公开的融合多肽或嵌合多肽的第一开放阅读框的核酸可以进一步包含含有互补基因或编码互补代谢酶的第二开放阅读框。可选地，第一核酸可以编码融合多肽或嵌合多肽，并且单独的第二核酸可以包含互补基因或编码互补代谢酶。
互补基因可以在染色体外或者可以整合到细菌或李斯特菌基因组中。举例来说，营养缺陷型李斯特菌属菌株可以包含含有编码代谢酶的核酸的附加型质粒。此类质粒将以附加型或染色体外方式包含在李斯特菌中。可选地，营养缺陷型李斯特菌属菌株可以包含含有编码代谢酶的核酸的整合质粒(即整合载体)。此类整合质粒可以用于整合到李斯特菌染色体中。优选地，附加型质粒或整合质粒缺乏抗生素抗性标记物。
可以使用代谢基因代替或外加抗生素抗性基因用于选择。举例来说，为了选择包含编码本文提供的代谢酶的质粒或互补基因的营养缺陷型细菌，可以使转化过的营养缺陷型细菌在将选择用于表达编码代谢酶的基因(例如氨基酸代谢基因)或互补基因的培养基中生长。举例来说，可以用包含D-谷氨酸合成基因的质粒转化用于D-谷氨酸合成的营养缺陷型细菌，并且将在不存在D-谷氨酸的情况下使营养缺陷型细菌生长，而没有用质粒转化或不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白质的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。类似地，当转化并表达包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的核酸的质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下使用于D-丙氨酸合成的营养缺陷型细菌生长。此类用于制备包含或缺乏必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等等的适当培养基的方法是众所周知的并且可获自市面。
一旦已经在适当培养基中选择了包含编码本文提供的代谢酶的质粒或互补基因的营养缺陷型细菌，就可以在选择压力的存在下使细菌繁殖。此类繁殖可以包括使细菌在没有营养缺陷因子的培养基中生长。营养缺陷型细菌中存在表达代谢酶的质粒或互补基因确保质粒将与细菌一起复制，从而不断选择带有质粒的细菌。通过调节包含质粒的营养缺陷型细菌正在其中生长的培养基的体积，可以容易地扩大细菌或李斯特菌属菌株的产生。
在一个具体实例中，减毒菌株是具有dal和dat的缺失或灭活突变的菌株(例如，单增李斯特菌(Lm)dal(-)dat(-)(Lmdd)或Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA))，并且互补基因编码丙氨酸消旋酶(例如，由dal基因编码)或D-氨基酸氨基转移酶(例如，由dat基因编码)。示例性丙氨酸消旋酶蛋白可具有SEQ ID NO:76中所示的序列(由SEQ ID NO:78编码；GenBank登记号：AF038438)，或者可以是SEQ ID NO:76的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段或同种型片段。丙氨酸消旋酶蛋白质还可以是任何其他李斯特菌丙氨酸消旋酶蛋白。可选地，丙氨酸消旋酶蛋白可以是任何其他革兰氏阳性丙氨酸消旋酶蛋白或任何其他丙氨酸消旋酶蛋白。示例性D-氨基酸氨基转移酶蛋白可以具有SEQ ID NO:77中所示的序列(由SEQ ID NO:79编码；GenBank登记号：AF038439)，或者可以是SEQ ID NO:77的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段或同种型片段。D-氨基酸氨基转移酶蛋白质还可以是任何其他李斯特菌D-氨基酸氨基转移酶蛋白。可选地，D-氨基酸氨基转移酶蛋白可以是任何其他革兰氏阳性D-氨基酸氨基转移酶蛋白或任何其他D-氨基酸氨基转移酶蛋白。
在另一个具体实例中，减毒菌株是具有prfA的缺失或灭活突变的菌株(例如，LmprfA(-))，并且互补基因编码PrfA蛋白。举例来说，互补基因可以编码恢复了部分PrfA功能的突变PrfA(D133V)蛋白。野生型PrfA蛋白的实例示于SEQ ID NO:80(由SEQ ID NO:81中所示的核酸编码)中，并且D133V突变PrfA蛋白的实例示于SEQ ID NO:82(由SEQ ID NO:83中所示的核酸编码)中。互补PrfA蛋白可以是SEQ ID NO:80或82的同源物、变体、同种型、类似物、片段、同源物片段、变体片段、类似物片段或同种型片段。PrfA蛋白还可以是任何其他李斯特菌PrfA蛋白。可选地，PrfA蛋白可以是任何其他革兰氏阳性PrfA蛋白或任何其他PrfA蛋白。
在另一个实例中，细菌菌株或李斯特菌属菌株可以包含actA基因的缺失或灭活突变，并且互补基因可以包含actA基因以补充突变并恢复李斯特菌属菌株的功能。
还可以采取其他营养缺陷型菌株和互补系统与本文提供的方法和组合物一起使用。
C.细菌或李斯特菌属菌株的制备和存储
任选地，已经通过动物宿主对重组细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)进行传代。此类传代可以使李斯特菌属菌株作为疫苗载体的功效最大化，可以稳定李斯特菌属菌株的免疫原性，可以稳定李斯特菌属菌株的毒力，可以增加李斯特菌属菌株的免疫原性，可以增加李斯特菌属菌株的毒力，可以去除李斯特菌属菌株的不稳定亚株，或者可以降低李斯特菌属菌株不稳定亚株的流行程度。用于使重组李斯特菌属菌株通过动物宿主传代的方法在本领域中是众所周知的，并且描述于例如US 2006/0233835中，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
重组细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)可以存储在冷冻细胞库中或存储在冻干细胞库中。此类细胞库可以是例如主细胞库、工作细胞库或良好生产规范(GMP)细胞库。“良好生产规范”的实例包括由美国联邦法规第21篇CFR 210-211定义的那些。然而，“良好生产规范”还可以通过针对生产临床级材料或针对人类消费的其他标准来定义，如除美国以外的国家的标准。此类细胞库可能意在用于生产临床级材料或可能符合供人类使用的管理规范。
重组细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)还可以来自疫苗剂量批料、来自冷冻储备物或来自冻干储备物。
举例来说，此类细胞库、冷冻储备物或疫苗剂量批料在解冻后可以表现出大于90％的活力。举例来说，解冻可以在低温保藏存储或冷冻存储24小时后进行。可选地，存储可以持续例如2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、5个月、6个月、9个月或1年。
细胞库、冷冻储备物或疫苗剂量批料可以低温保藏，例如，通过包括以下的方法：使细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)培养物在营养培养基中生长，将培养物在包含甘油的溶液中冷冻，以及将李斯特菌属菌株存储在-20℃以下。温度可以是例如约-70℃或在约-70至约-80℃之间。可选地，细胞库、冷冻储备物或疫苗剂量批料可以通过包括以下的方法进行低温保藏：使李斯特菌属菌株培养物在确定成分培养基中生长，将培养物在含有甘油的溶液中冷冻，以及将李斯特菌属菌株存储在-20℃以下。温度可以是例如约-70℃或在约-70至约-80℃之间。该方法中可以使用任何确定微生物培养基。
可以例如从细胞库、冷冻储备物、起始培养物或菌落接种培养物(例如，用于产生李斯特菌疫苗剂量批料的李斯特菌疫苗菌株的培养物)。可以例如在对数生长中期、大致在对数生长中期或在另一个生长期接种培养物。
用于冷冻的溶液任选地含有代替甘油或连同甘油一起的另一种依数性添加剂或具有抗冻性能的添加剂。此类添加剂的实例包括例如甘露醇、DMSO、蔗糖或任何其他依数性添加剂或具有抗冻性能的添加剂。
供细菌菌株(例如李斯特菌属菌株)培养物生长的营养培养基可以是任何合适的营养培养基。合适的营养剂的实例包括例如LB；TB；改良无动物产物Terrific肉汤；或确定成分培养基。
生长步骤可以通过任何已知的细菌生长手段来进行。举例来说，生长步骤可以用摇瓶(如带挡板摇瓶)、分批发酵罐、搅拌罐或烧瓶、气升式发酵罐、分批馈料、连续型细胞反应器、固定化细胞反应器或任何其他细菌生长手段来进行。
任选地，在培养物生长期间(例如在分批发酵罐中)维持恒定的pH值。举例来说，pH值可以维持在约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0。同样地，pH值可以是例如约6.5至约7.5、约6.0至约8.0、约6.0至约7.0、约6.0至约7.0或约6.5至约7.5。
任选地，可以在培养物生长期间维持恒定的温度。举例来说，温度可以维持在约37℃或在37℃。可选地，温度可以维持在25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃或39℃。
任选地，在培养物生长期间可以维持恒定的溶解氧浓度。举例来说，溶解氧浓度可以维持在20％饱和、15％饱和、16％饱和、18％饱和、22％饱和、25％饱和、30％饱和、35％饱和、40％饱和、45％饱和、50％饱和、55％饱和、60％饱和、65％饱和、70％饱和、75％饱和、80％饱和、85％饱和、90％饱和、95％饱和、100％饱和或接近100％饱和。
用于冻干和低温保藏重组细菌菌株(例如，李斯特菌属菌株)的方法是已知的。举例来说，李斯特菌培养物可以在液氮中快速冷冻，然后存储在最终冷冻温度下。可选地，培养物可以用较逐渐的方式(例如，通过将培养物小瓶放在最终存储温度下)进行冷冻。培养物还可以通过任何其他已知的冷冻细菌培养物的方法进行冷冻。
培养物的存储温度可以例如在-20℃至-80℃之间。举例来说，温度可以显著低于-20℃或不高于-70℃。可选地，温度可以是约-70℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-80℃、-30℃至-70℃、-40至-70℃、-50℃至-70℃、-60℃至-70℃、-30℃至-80℃、-40℃至-80℃、-50℃至-80℃、-60℃至-80℃或-70℃至-80℃。可选地，温度可以低于70℃或低于-80℃。
V.免疫原性组合物、药物组合物和疫苗
还提供了免疫原性组合物，药物组合物或疫苗，其包含如本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、如本文所公开的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)或者如本文所公开的重组细菌或李斯特菌属菌株。包含李斯特菌属菌株的免疫原性组合物由于其包含李斯特菌属菌株而具有固有免疫原性，和/或所述组合物还可以进一步包含佐剂。其他免疫原性组合物包括DNA免疫疗法或肽免疫疗法组合物。
术语“免疫原性组合物”是指含有抗原的任何组合物，其在受试者中在暴露于该组合物后引发针对该抗原的免疫应答。由免疫原性组合物引发的免疫应答可以针对特定抗原或抗原上的特定表位。
免疫原性组合物可以包含单一如本文所公开的重组融合多肽或嵌合多肽、如本文所公开的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)或如本文所公开的重组细菌或李斯特菌属菌株，或者其可以包含多种不同的如本文所公开的重组融合多肽或嵌合多肽、如本文所公开的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)或如本文所公开的重组细菌或李斯特菌属菌株。第一重组融合多肽或嵌合多肽不同于第二重组融合多肽或嵌合多肽，例如，如果它包括一个抗原性肽，则第二重组融合多肽或嵌合多肽则不然。两个重组融合多肽或嵌合多肽可以包括一些相同的抗原性肽而仍然被视为不同的。此类不同的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸或者重组细菌或李斯特菌属菌株可以同时施用至受试者或依次施用至受试者。当包含本文公开的重组李斯特菌属菌株(或重组融合多肽或嵌合多肽或核酸)的原料药呈不同剂型(例如，一种剂是片剂或胶囊，而另一种剂是无菌液体)和/或按不同的给药方案施用(例如，混合物中的一种组合物至少每天施用，而另一种组合物以较低频率施用，例如每周一次、每两周一次或每三周一次)时，依次施用尤其适用。多种重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸或者重组细菌或李斯特菌属菌株可以各自包含不同组的抗原性肽。可选地，两种或更多种重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸或者重组细菌或李斯特菌属菌株可以包含同一组抗原性肽(例如，按不同的顺序的同一组抗原性肽)。
免疫原性组合物可以另外包含佐剂(例如，两种或更多种佐剂)、细胞因子、趋化因子或其组合。任选地，免疫原性组合物可以另外包含抗原呈递细胞(APC)，所述抗原呈递细胞可以是自体的或者可以对受试者是同种异体的。
术语佐剂包括增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。举例来说，佐剂可以是免疫应答的非特异性刺激剂或允许在受试者中生成储库的物质，当与本文公开的免疫原性组合物组合时，其提供甚至更加增强和/或延长的免疫应答。佐剂可以有利于例如主要由Th1介导的免疫应答、Th1型免疫应答或Th1介导的免疫应答。同样地，佐剂可以有利于细胞介导的免疫应答而不是抗体介导的应答。可选地，佐剂可以有利于抗体介导的应答。一些佐剂可通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂可通过以下机制中的任一种来介导其作用：增加细胞浸润、发炎和向注射部位运输，特别是对于抗原呈递细胞(APC)；通过上调共刺激信号或主要组织相容性复合体(MHC)表达来促进APC的激活状态；增强抗原呈递；或诱导细胞因子释放以实现间接作用。
佐剂的实例包括皂苷QS21、CpG寡核苷酸、含未甲基化CpG的寡核苷酸、MPL、TLR激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂、咪喹莫特、细胞因子或编码其的核酸、趋化因子或编码其的核酸、IL-12或编码其的核酸、IL-6或编码其的核酸和脂多糖。合适佐剂的另一个实例是Montanide ISA 51。Montanide ISA 51含有天然可代谢油和精制乳化剂。合适佐剂的其他实例包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或编码其的核酸和钥孔血蓝蛋白(KLH)蛋白或编码其的核酸。GM-CSF可以是例如在酵母(酿酒酵母)载体中生长的人蛋白。GM-CSF促进造血祖细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞和T细胞的克隆扩增和分化。合适佐剂的又一个实例是去毒李斯特菌溶血素O(dtLLO)蛋白。适合用作佐剂的dtLLO的一个实例由SEQ ID NO:149编码。由与SEQ ID NO:149具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列编码的dtLLO也适合用作佐剂。佐剂的其他实例包括生长因子或编码其的核酸、细胞群、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG(卡介苗)、明矾、白细胞介素或编码其的核酸、羽管糖苷(quill glycoside)、单磷酰脂质A、脂质体、细菌促分裂原、细菌毒素或任何其他类型的已知佐剂(参见例如Fundamental Immunology,第5版(2003年8月):William E.Paul(编)；Lippincott Williams&Wilkins Publishers；第43章:Vaccines,GJVNossal，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。
免疫原性组合物还可以包含一个或多个免疫调节分子。实例包括干扰素γ、细胞因子、趋化因子和T细胞刺激剂。
免疫原性组合物可以呈疫苗或药物组合物形式。术语“疫苗”和“药物组合物”可互换，并且是指在药学上可接受的载体中以供体内施用至受试者的免疫原性组合物。疫苗可以是例如肽疫苗(例如，包含如本文所公开的重组融合多肽或嵌合多肽)、DNA疫苗(例如，包含如本文所公开的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸)或包含在细胞内且由细胞递送的疫苗(例如，如本文所公开的重组李斯特菌)。疫苗可以防止受试者接触或罹患疾病或病状，和/或疫苗可以对患有疾病或病状的受试者具有治疗作用。制备肽疫苗的方法是众所周知的，并且描述于例如以下文献中：EP 1408048、US 2007/0154953和Ogasawara等(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 89:8995-8999，其各自都出于所有目的通过引用整体并入本文。任选地，可以使用肽进化技术来产生具有更高免疫原性的抗原。用于肽进化的技术是众所周知的，并且描述于例如US 6,773,900中，该文献出于所有目的通过引用并入本文。
“药学上可接受的载体”是指含有免疫原性组合物的载体，所述免疫原性组合物可以在没有显著不利作用的情况下引入受试者中并且对免疫原性组合物没有不利作用。也就是说，“药学上可接受的”是指任何安全的制剂，并且为所期望的施用途径提供有效量的供用于本文公开的方法中的至少一种免疫原性组合物的适当递送。药学上可接受的载体或媒剂或赋形剂是众所周知的。合适的药学上可接受的载体的描述及其选择所涉及的因素可在多种容易获得的来源中找到，举例来说，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,1990，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。此类载体可适用于任何施用途径(例如肠胃外、经肠(例如口服)或局部应用)。此类药物组合物可以经过缓冲，例如，其中根据免疫原性组合物的稳定性和施用途径将pH维持在pH 4.0至pH 9.0范围内的特定所期望值。
合适的药学上可接受的载体包括例如无菌水、盐溶液例如生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液例如磷酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、白石蜡、甘油、海藻酸盐、透明质酸、胶原蛋白、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。药物组合物或疫苗还可以包括助剂，包括例如稀释剂、稳定剂(例如糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、增粘添加剂、润滑剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、维生素、着色剂、调味剂、芳香物质等，它们不会与免疫原性组合物发生不利反应。
对于液体制剂，举例来说，药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂包括例如丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括例如水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。油的实例包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油和鱼肝油。固体载体/稀释剂包括例如树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖或右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。
任选地，可以配制持续或定向释放的药物组合物或疫苗。这可以例如通过使用脂质体或组合物来实现，其中活性化合物用差异性可降解包衣(例如，通过微胶囊化、多层包衣等)加以保护。可配制此类组合物用于立即或缓慢释放。还有可能冻干组合物并使用所获得的冻干物(例如，用于制备注射用产品)。
本文公开的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗还可以包含一种或多种在预防或治疗癌症方面有效的额外化合物。举例来说，额外化合物可以包括化疗用化合物，例如安吖啶(amsacrine)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、卡莫司汀植入膜剂(gliadelimplant)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、甲酰四氢叶酸、脂质体多柔比星、脂质体道诺霉素、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、美司钠(mesna)、氨甲蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、沙铂(satraplatin)、链脲佐菌素、替加氟(tegafur)-尿嘧啶、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、噻替派(thiotepa)、硫鸟嘌呤、托泊替康(topotecan)、苏消安(treosulfan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)或其组合。额外化合物还可以包括其他生物制剂，包括针对HER2抗原的(曲妥珠单抗)、针对VEGF的(贝伐单抗)或针对EGF受体的抗体，例如(西妥昔单抗)和(帕尼单抗)。额外化合物还可以包括例如额外免疫治疗剂。
额外化合物还可以包括免疫检查点抑制剂拮抗剂，例如PD-1信号传导途径抑制剂、CD-80/86和CTLA-4信号传导途径抑制剂、T细胞膜蛋白3(TIM3)信号传导途径抑制剂、腺苷A2a受体(A2aR)信号传导途径抑制剂、淋巴细胞激活基因3(LAG3)信号传导途径抑制剂、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)信号传导途径抑制剂、CD40信号传导途径抑制剂或任何其他抗原呈递细胞/T细胞信号途径抑制剂。免疫检查点抑制剂拮抗剂的实例包括抗PD-L1/PD-L2抗体或其片段、抗PD-1抗体或其片段、抗CTLA-4抗体或其片段，或者抗B7-H4抗体或其片段。额外化合物还可以包括T细胞刺激剂，例如与T细胞受体共刺激分子结合的抗体或其功能片段、结合共刺激分子的抗原呈递细胞受体，或TNF受体超家族成员。T细胞受体共刺激分子可以包括例如CD28或ICOS。结合共刺激分子的抗原呈递细胞受体可以包括例如CD80受体、CD86受体或CD46受体。TNF受体超家族成员可以包括例如糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。参见例如WO2016100929、WO2016011362和WO2016011357，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
VI.治疗方法
本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗可以用于各种方法中。举例来说，它们可以用于诱导或增强受试者的抗WT1免疫应答的方法中、诱导或增强受试者的抗WT1表达肿瘤或抗WT1表达癌症免疫应答的方法中、治疗受试者的肿瘤或癌症的方法中、预防受试者的肿瘤或癌症的方法中或保护受试者免于肿瘤或癌症的方法中。它们还可以用于增加受试者脾和肿瘤中的T效应细胞与调控T细胞(Treg)的比率的方法中，其中T效应细胞靶向WT1抗原。它们还可以用于增加受试者的WT1T细胞、增加患有肿瘤或癌症的受试者的存活时间、延迟受试者的癌症发作或减小受试者的肿瘤或转移大小的方法中。
诱导受试者的抗维尔姆斯瘤蛋白免疫应答的方法可以包括例如向受试者施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗(例如，包含本文其他部分公开的重组融合多肽或嵌合多肽或者编码所述重组融合多肽或嵌合多肽的核酸者)。由此可以在受试者中诱导抗维尔姆斯瘤蛋白免疫应答。举例来说，在重组李斯特菌属菌株的情况下，李斯特菌属菌株可以表达融合多肽或嵌合多肽，从而引发受试者的免疫应答。免疫应答可以包括例如T细胞应答，例如CD4+FoxP3T细胞应答、CD8+T细胞应答或CD4+FoxP3和CD8+T细胞应答。此类方法还可以增加受试者的脾和肿瘤微环境中T效应细胞与调控T细胞(Treg)的比率，从而允许受试者的更深层次的抗肿瘤应答。
诱导受试者的抗WT1表达肿瘤或抗WT1表达癌症免疫应答的方法可以包括例如向受试者施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。由此可以诱导受试者的抗肿瘤或抗癌免疫应答。举例来说，在重组李斯特菌属菌株的情况下，李斯特菌属菌株可以表达融合多肽或嵌合多肽，从而引发受试者的抗肿瘤或抗癌应答。
治疗受试者的肿瘤或癌症的方法(例如，其中肿瘤或癌症表达维尔姆斯瘤蛋白)可以包括例如向受试者施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。受试者随后可以对表达维尔姆斯瘤蛋白的肿瘤或癌症产生免疫应答，从而治疗受试者的肿瘤或癌症。
预防受试者的肿瘤或癌症或者保护受试者免于罹患肿瘤或癌症(例如，其中肿瘤或癌症与维尔姆斯瘤蛋白的表达相关)的方法可以包括例如向受试者施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。受试者随后可以产生针对维尔姆斯瘤蛋白的免疫应答，从而预防肿瘤或癌症或者保护受试者免于罹患肿瘤或癌症。
在一些上述方法中，施用两种或更多种重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。多种重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗可以以任何顺序或组合依次施用，或者可以以任何组合同时施用。举例来说，如果施用四种不同的李斯特菌属菌株，则它们可以依次施用，它们可以同时施用，或者它们可以以任何组合施用(例如，同时施用第一和第二菌株，并且随后同时施用第三和第四菌株)。任选地，在依次施用的情况下，组合物可以在同一免疫应答期间施用，优选彼此在0-10或3-7天内。多种重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗可以各自包含不同组的抗原性肽。可选地，两种或更多种可以包含同一组抗原性肽(例如，按不同的顺序的同一组抗原性肽)。
癌症是哺乳动物的生理性病状，其典型地以不受调控的细胞生长和增殖为特征。表达WT1或与WT1表达相关的任何癌症或恶变前病状都可以是本文公开的治疗或预防方法的标的物(即，任何血液瘤或实体瘤恶性肿瘤以及任何恶变前发育不良组织或病状)。癌症可以是造血系统恶性肿瘤或实体瘤(即，由过度细胞生长或增殖引起的细胞肿块，包括癌前病变)。转移性癌症是指从其首先开始处扩散至体内另一处的癌症。由转移性癌细胞形成的肿瘤称为转移性肿瘤或转移，该术语也用于指癌细胞扩散至身体其他部位的过程。一般来说，转移性癌症与原始癌症或原发性癌症具有相同的名称和相同类型的癌细胞。实体瘤的实例包括黑素瘤、癌瘤、胚细胞瘤和肉瘤。血液系统恶性肿瘤包括例如白血病或淋巴恶性肿瘤，如淋巴瘤。癌症的示例性类别包括脑、乳腺、胃肠道、泌尿生殖系统、妇科、头颈部、血红素、皮肤和胸腺。脑恶性肿瘤包括例如成胶质细胞瘤、高级脑桥胶质瘤、低级胶质瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤和毛细胞星形细胞瘤。胃肠癌包括例如结肠直肠癌、胆囊癌、肝细胞癌、胰腺癌、PNET癌、胃癌和食道癌。泌尿生殖系统癌包括例如肾上腺皮质癌、膀胱癌、肾嫌色细胞癌、肾(透明细胞)癌、肾(乳头状)癌、横纹肌样癌和前列腺癌。妇科癌包括例如子宫癌肉瘤、子宫内膜癌、浆液性卵巢癌和宫颈癌。头颈癌包括例如甲状腺癌、鼻咽癌、头颈癌和腺样囊性癌。血红素癌包括例如多发性骨髓瘤、脊髓发育不良、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓性白血病(AML)。皮肤癌包括例如皮肤黑素瘤和鳞状细胞癌。胸腺癌包括例如鳞状肺癌、小细胞肺癌和肺腺癌。
此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌或癌瘤(例如，口腔鳞状细胞癌)、骨髓瘤、口腔癌、青少年鼻咽血管纤维瘤、神经内分泌肿瘤、肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃部或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质瘤、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝细胞癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌或癌瘤、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌(如肾细胞癌)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、肛门癌、阴茎癌、纤维肉瘤、胆囊癌、骨肉瘤、间皮瘤以及头颈部癌。癌症还可以是脑癌或其他类型的CNS或颅内肿瘤。举例来说，受试者可以患有星形细胞肿瘤(例如，星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤)、少突神经胶质瘤(例如少突神经胶质瘤、间变性少突神经胶质瘤)、室管膜细胞瘤(例如室管膜瘤)、间变性室管膜瘤、粘液性室管膜瘤、室管膜下瘤、混合性胶质瘤(例如混合性少突细胞瘤、间变性少突细胞瘤)、不明原因性神经上皮肿瘤(例如极性成胶质细胞瘤、星形胶质瘤、脑胶质瘤病)、脉络丛肿瘤(例如，脉络丛乳头状瘤、脉络丛癌瘤)、神经元或混合性神经胶质瘤(例如神经节细胞瘤、小脑发育不良性节细胞瘤、神经胶质瘤、间变性神经胶质瘤、结缔组织增生性婴儿神经节胶质细胞瘤、中枢神经细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、嗅神经胚细胞瘤)、松果体实质肿瘤(例如松果体细胞瘤、松果体胚细胞瘤、混合松果体细胞瘤/松果体胚细胞瘤)，或者具有混合成神经细胞要素或成胶质细胞要素的肿瘤(例如，髓质上皮瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、视网膜胚细胞瘤、室管膜细胞瘤)。
已知与维尔姆斯瘤蛋白表达相关的癌症类型的一些具体实例包括维尔姆斯瘤(小儿肾胚细胞瘤)、乳腺癌如三阴性乳腺癌(TNBC)和胃肠癌如食道癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、结肠直肠癌、肛门癌和胃肠道类癌瘤。三阴性乳腺癌(TNBC)是指不表达雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或Her2/neu基因的任何乳腺癌。可表达WT1的癌症的其他实例包括急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良综合征(MDS)、与MDS相关的癌症、非小细胞肺癌(NSCLC)、白血病、血液癌、淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、间皮瘤、恶性间皮瘤、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、肝细胞癌、肝癌、肾癌、卡波西肉瘤或任何其他癌瘤或肉瘤。表达WT1的癌症可以是实体瘤，如与MDS相关的实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、胃肠癌、皮肤癌或黑素瘤。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其中目标在于预防或减轻所靶向的肿瘤或癌症。治疗可以包括直接影响或治愈、阻抑、抑制、预防、降低严重程度、延迟发作、减缓进展、稳定进展、诱导缓解、预防或延迟转移、减轻/改善与肿瘤或癌症相关的症状中的一种或多种或其组合。举例来说，治疗可以包括增加预期存活时间或减小肿瘤或转移大小。效果(例如，阻抑、抑制、预防、减轻严重程度、延迟发作、减缓进展、稳定进展、诱导缓解、预防或延迟转移、减轻/改善症状等等)可以相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者。术语“治疗”还可以指增加存活几率百分比或增加患有肿瘤或癌症的受试者的预期存活时间(例如，相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者)。在一个实例中，“治疗”是指延迟进展、加速缓解、诱导缓解、加强缓解、加速恢复、增加替代治疗剂的功效、降低对替代治疗剂的抗性或其组合(例如，相对于未接受治疗或接受安慰剂治疗的对照受试者)。术语“预防”或“阻碍”可以指例如延迟症状的发作、预防肿瘤或癌症复发、减少复发事件次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期、预防肿瘤或癌症转移或其组合。术语“阻抑”或“抑制”可以指例如降低症状的严重程度、降低急性发作的严重程度、减少症状的数目、减少疾病相关症状的发病率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活时间，或其组合。
术语“受试者”是指需要治疗肿瘤或癌症或易于罹患肿瘤或癌症的哺乳动物(例如人)。术语受试者还指接受预防性或治疗性治疗的哺乳动物(例如人)。受试者可以包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠、小鼠、非人哺乳动物和人。术语“受试者”未必排除在所有方面都健康而且没有或没显示癌症或肿瘤迹象的个体。
如果受试者具有至少一种已知风险因素(例如，遗传、生物化学、家族史和情境暴露)，则个体处在增加的罹患肿瘤或癌症的风险下，从而将有该风险因素的个体置于与没有该风险因素的个体相比统计学上显著更大的患肿瘤或患癌风险下。
“症状”或“征象”是指医师观察到的疾病的客观证据或疾病的主观证据，例如受试者感知到的步态变化。症状或征象可以是疾病的任何表现。症状可以是原发性的或继发性的。术语“原发性的”指是特定疾病或病症(例如，肿瘤或癌症)的直接结果的症状，而术语“继发性”指来源于原发性病因或由其引起的症状。本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗可以治疗原发性或继发性症状或继发性并发症。
重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗以有效方案施用，意指延迟发作、降低严重性、抑制进一步恶化和/或改善肿瘤或癌症的至少一种征象或症状的剂量、施用途径和施用频率。可选地，重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗以有效方案施用，意指诱导对重组融合多肽或嵌合多肽(或由核酸编码)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗中的异源抗原的免疫应答，或者在重组细菌或李斯特菌属菌株的情况下诱导对细菌或李斯特菌属菌株本身的免疫应答的剂量、施用途径和施用频率。如果受试者已经罹患肿瘤或癌症，则该方案可以称为治疗有效方案。如果受试者相对于普通人群处在升高的患肿瘤或患癌风险下但尚未经历症状，则该方案可以称为预防有效方案。在一些情况下，相对于历史对照或同一患者的过往经历，可以在个别患者中观察到治疗或预防功效。在其他情况下，相对于对照未治疗患者群体，可以在已治疗患者群体的临床前或临床试验中证明治疗或预防功效。举例来说，如果个别已治疗患者实现来比未用本文描述的方法治疗的对照可比患者群体中的平均结果更有利的结果，或者如果已治疗患者对比受控临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中的对照患者显示了在p<0.05或0.01或甚至0.001水平下的更有利的结果，则可以认为该方案在治疗上或预防上是有效的。
重组李斯特菌属菌株的示例性剂量是例如1×106至1×107CFU、1×107至1×108CFU、1×108至3.31×1010CFU、1×109至3.31×1010CFU、5-500×108CFU、7-500×108CFU、10-500×108CFU、20-500×108CFU、30-500×108CFU、50-500×108CFU、70-500×108CFU、100-500×108CFU、150-500×108CFU、5-300×108CFU、5-200×108CFU、5-15×108CFU、5-100×108CFU、5-70×108CFU、5-50×108CFU、5-30×108CFU、5-20×108CFU、1-30×109CFU、1-20×109CFU、2-30×109CFU、1-10×109CFU、2-10×109CFU、3-10×109CFU、2-7×109CFU、2-5×109CFU和3-5×109CFU。重组李斯特菌属菌株的其他示例性剂量是例如1×107个微生物、1.5×107个微生物、2×108个微生物、3×107个微生物、4×107个微生物、5×107个微生物、6×107个微生物、7×107个微生物、8×107个微生物、10×107个微生物、1.5×108个微生物、2×108个微生物、2.5×108个微生物、3×108个微生物、3.3×108个微生物、4×108个微生物、5×108个微生物、1×109个微生物、1.5×109个微生物、2×109个微生物、3×109个微生物、4×109个微生物、5×109个微生物、6×109个微生物、7×109个微生物、8×109个微生物、10×109个微生物、1.5×1010个微生物、2×1010个微生物、2.5×1010个微生物、3×1010个微生物、3.3×1010个微生物、4×1010个微生物和5×1010个微生物。剂量可取决于患者的状况和对先前治疗的应答(如果有的话，无论该治疗是预防性的还是治疗性的)以及其他因素。
可以通过任何合适的手段施用。举例来说，施用可以经肠胃外、经静脉内、口服、经皮下、经动脉内、经颅内、经鞘内、经脑室内、经腹膜内、经局部、经鼻内、经肌肉内、经眼内、经直肠内、经结膜、透皮、经皮内、经阴道、经直肠、经肿瘤内、经肠胃外、跨粘膜、经血管内、经心室内、吸入(气溶胶)、鼻吸(喷雾)、经舌下、气溶胶、栓剂或其组合。对于经鼻内施用或通过吸入施用来说，在存在适当载体的情况下混合并气雾化或雾化的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗的溶液或悬浮液是合适的。此类气溶胶可以包含本文所述的任何重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。施用还可以呈栓剂(例如，直肠栓剂或尿道栓剂)的形式、呈供皮下植入的丸剂的形式(例如，在一段时间内提供控制释放)或呈胶囊的形式。施用还可以经由注射至肿瘤部位或肿瘤中。可以基于诸多因素，如所治疗的肿瘤或癌症的确切性质和类型、肿瘤或癌症的严重程度、受试者的年龄和一般身体状况、受试者的体重、个别受试者的应答等而容易地确定施用方案。
施用频率可能取决于重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗在受试者中的半衰期、受试者的状况和施用途径以及其他因素。频率可以是例如每日、每周、每月、每季度或响应于受试者的状况变化或所治疗的肿瘤或癌症的进展而以不规则间隔。疗程可以取决于受试者的状况和其他因素。举例来说，疗程可以是数周、数月或数年(例如，长达2年)。举例来说，重复施用(剂量)可以在第一疗程后立即进行，或者在数天、数周或数月间隔后进行，以实现肿瘤消退或阻抑肿瘤生长。可以通过任何已知的技术，包括诊断方法如成像技术、分析血清肿瘤标志物、活组织检查或肿瘤相关症状的存在、不存在或改善来判断评价。作为一个具体实例，可以每3周施用重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗，长达2年。在一个实例中，本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗以增加剂量施用，以便增加T效应细胞与调控T细胞的比率并且产生更有效的抗肿瘤免疫应答。通过给受试者提供细胞因子，包括例如IFN-γ、TNF-α和已知增强细胞免疫应答的其他细胞因子，可以进一步强化抗肿瘤免疫应答。参见例如US6,991,785，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
一些方法还可以包括用额外的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗“加强”受试者，或者多次施用重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗。“加强”是指向受试者再施用一个剂量。举例来说，在一些方法中，施用2次加强(或总共3次接种)，施用3次加强，施用4次加强，施用5次加强，或施用6次或更多次加强。施用的剂量数可以取决于例如肿瘤或癌症对治疗的应答。
任选地，用于加强接种的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗与用于初始“初免”接种的重组融合多肽或嵌合多肽、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗相同。可选地，加强重组融合多肽或嵌合多肽、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗与初免重组融合多肽或嵌合多肽、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗不同。任选地，在初免和加强接种时使用相同的剂量。可选地，在加强时使用较大剂量，或在加强时使用较小剂量。初免与加强接种之间的时间段可以通过实验确定。举例来说，初免与加强接种之间的时间段可以是1周、2周、3周、4周、5周、6-8周或8-10周。
异源初免加强策略对于增强免疫应答和防止多种病原体是有效的。参见例如Schneider等(1999)Immunol.Rev.170:29-38；Robinson(2002)Nat.Rev.Immunol.2:239-250；Gonzalo等(2002)Vaccine20:1226-1231；和Tanghe(2001)Infect.Immun.69:3041-3047，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。在初免和加强注射时提供不同形式的抗原可以使对抗原的免疫应答最大化。DNA疫苗初免后用含蛋白质的佐剂或通过病毒载体递送编码抗原的DNA进行加强是改善抗原特异性抗体和CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的一种有效方式。参见例如Shiver等(2002)Nature 415:331-335；Gilbert等(2002)Vaccine 20:1039-1045；Billaut-Mulot等(2000)Vaccine 19:95-102；和Sin等(1999)DNACell Biol.18:771-779，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。作为一个实例，当受试者用DNA初免进行接种，然后用表达抗原的腺病毒载体加强时，将CRL1005泊洛沙姆(12kDa，5％POE)加入至编码抗原的DNA中可以增强T细胞应答。参见例如Shiver等(2002)Nature 415:331-335，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。作为另一个实例，可以施用编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的免疫原性部分的蛋白质。参见例如US 2002/0165172，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。类似地，核酸接种的免疫应答可以通过同时施用(例如，在同一免疫应答期间，优选彼此在0-10天或3-7天内)目标多核苷酸和多肽来增强。参见例如US 6,500,432，该文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
本文公开的治疗方法还可以包括施用一种或多种在预防或治疗癌症方面有效的额外化合物。举例来说，额外化合物可以包括化疗用化合物，例如安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、卡莫司汀植入膜剂、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸、脂质体多柔比星、脂质体道诺霉素、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链脲佐菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替派、硫鸟嘌呤、托泊替康、苏消安、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或其组合。可选地，额外化合物还可以包括其他生物制剂，包括针对HER2抗原的(曲妥珠单抗)、针对VEGF的(贝伐单抗)或针对EGF受体的抗体，如(西妥昔单抗)和(帕尼单抗)。可选地，额外化合物可以包括其他免疫治疗剂。可选地，额外化合物可以是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂，例如1-甲基色氨酸(1MT)、1-甲基色氨酸(1MT)、Necrostatin-1、吡哆醛异烟酰腙、依布硒啉、5-甲基吲哚-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗体或小分子IDO抑制剂。IDO抑制可以增强化学治疗剂的功效。本文公开的治疗方法还可以与放射、干细胞治疗、手术或任何其他治疗组合。
此类额外化合物或治疗可以在施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之前；在施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗之后；或与施用本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗同时进行。
靶向性免疫调节疗法主要集中于共刺激受体的激活，例如通过使用靶向肿瘤坏死因子受体超家族成员(包括4-1BB、OX40和GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体相关))的激动性抗体。GITR的调节已经在抗肿瘤和疫苗情形下显示了潜力。激动性抗体的另一个靶标是用于T细胞激活的共刺激信号分子。靶向共刺激信号分子可以增强T细胞的激活和促进更有效的免疫应答。共刺激还可以帮助防止检查点抑制的抑制性影响并且增加抗原特异性T细胞增殖。
基于李斯特菌的免疫疗法通过诱导能浸润并破坏肿瘤的肿瘤抗原特异性T细胞的从头生成以及通过降低肿瘤微环境中的免疫抑制性调控T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSC)的数目和活性来起作用。针对T细胞共抑制或共刺激受体的抗体(或其功能片段)(例如，检查点抑制剂CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG3和共刺激剂CD137、OX40、GITR和CD40)可以与基于李斯特菌的免疫疗法具有协同作用。
因此，一些方法可以包括进一步施用包含免疫检查点抑制剂拮抗剂，如PD-1信号传导途径抑制剂、CD-80/86和CTLA-4信号传导途径抑制剂、T细胞膜蛋白3(TIM3)信号传导途径抑制剂、腺苷A2a受体(A2aR)信号传导途径抑制剂、淋巴细胞激活基因3(LAG3)信号传导途径抑制剂、杀伤免疫球蛋白受体(KIR)信号传导途径抑制剂、CD40信号传导途径抑制剂或其他抗原呈递细胞/T细胞信号传导途径抑制剂的组合物。免疫检查点抑制剂拮抗剂的实例包括抗PD-L1/PD-L2抗体或其片段、抗PD-1抗体或其片段、抗CTLA-4抗体或其片段，或抗B7-H4抗体或其片段。举例来说，抗PD-1抗体可以按每2周5-10mg/kg、每3周5-10mg/kg、每3周1-2mg/kg、每周1-10mg/kg、每2周1-10mg/kg、每3周1-10mg/kg或每4周1-10mg/kg施用至受试者。
同样地，一些方法还可以包括施用T细胞刺激剂，如与T细胞受体共刺激分子结合的抗体或其功能片段、结合共刺激分子的抗原呈递细胞受体或TNF受体超家族成员。T细胞受体共刺激分子可以包括例如CD28或ICOS。结合共刺激分子的抗原呈递细胞受体可以包括例如CD80受体、CD86受体或CD46受体。TNF受体超家族成员可以包括例如糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25。
举例来说，一些方法还可以包括施用有效量的组合物，所述组合物包含与T细胞受体共刺激分子结合的抗体或其功能片段或者与结合共刺激分子的抗原呈递细胞受体结合的抗体或其功能片段。抗体可以是例如抗TNF受体抗体或其抗原结合片段(例如，TNF受体超家族成员糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40(CD134受体)、4-1BB(CD137受体)或TNFR25)、抗OX40抗体或其抗原结合片段，或抗GITR抗体或其抗原结合片段。可选地，可施用其他激动剂分子(例如，GITRL、GITRL的活性片段、含GITRL的融合蛋白、含GITRL的活性片段的融合蛋白、抗原呈递细胞(APC)/T细胞激动剂、CD134或其配体或片段、CD137或其配体或片段，或诱导型T细胞共刺激(ICOS)或其配体或片段，或激动性小分子)。
在一个具体实例中，一些方法还可以包括施用抗CTLA-4抗体或其功能片段和/或抗CD137抗体或其功能片段。举例来说，抗CTLA-4抗体或其功能片段或抗CD137抗体或其功能片段可在第一剂重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗后约72小时，或者在第一剂重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因构建体)、重组细菌或李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗后约48小时施用。抗CTLA-4抗体或其功能片段或抗CD137抗体或其功能片段可以以例如约0.05mg/kg和约5mg/kg的剂量施用。重组李斯特菌属菌株或包含重组李斯特菌属菌株的免疫原性组合物可以以例如约1×109CFU的剂量施用。一些此类方法还可以包括施用有效量的抗PD-1抗体或其功能片段。
用于评价癌症免疫疗法功效的方法是众所周知的，并且描述于例如以下文献中：Dzojic等(2006)Prostate 66(8):831-838；Naruishi等(2006)Cancer Gene Ther.13(7):658-663；Sehgal等(2006)Cancer Cell Int.6:21)；和Heinrich等(2007)Cancer ImmunolImmunother 56(5):725-730，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。作为一个实例，对于前列腺癌来说，前列腺癌模型可以测试本文公开的方法和组合物，如TRAMP-C2小鼠模型、178-2BMA细胞模型、PAIII腺癌细胞模型、PC-3M模型，或任何其他前列腺癌模型。
可选地或另外地，可以在人受试者中测试免疫疗法，并且可以使用已知的方法监测功效。此类方法可以包括例如直接测量CD4+和CD8+T细胞应答，或测量疾病进展(例如，通过测定肿瘤转移的数目或大小，或监测疾病症状，如咳嗽、胸痛、体重减轻等)。用于评价癌症免疫疗法在人受试者中的功效的方法是众所周知的，并且描述于例如以下文献中：Uenaka等(2007)Cancer Immun.7:9；和Thomas-Kaskel等(2006)Int J Cancer 119(10):2428-2434，各文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
VII.药盒
还提供了包含用于执行本文公开的方法的试剂的药盒，或包含本文公开的组合物、工具或仪器的药盒。
举例来说，此类药盒可以包含本文公开的重组融合多肽或嵌合多肽、本文公开的编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，本文公开的微基因核酸构建体)、本文公开的重组细菌或李斯特菌属菌株、本文公开的免疫原性组合物、本文公开的药物组合物或本文公开的疫苗。此类药盒可以另外包含描述使用重组融合多肽或嵌合多肽、编码重组融合多肽或嵌合多肽的核酸(例如，微基因核酸构建体)、重组李斯特菌属菌株、免疫原性组合物、药物组合物或疫苗来执行本文公开的方法的指导材料。此类药盒可任选地还包括施药器。尽管下面描述了模型药盒，但根据本公开内容将显而易知其他可用药盒的内容。
上文或下文引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登记号等等都出于所有目的通过引用整体并入，达到如同具体且单独地指示每一个单独项目都这样通过引用并入的程度。如果不同版本的序列与不同时间的登记号相关联，则意指与本申请的有效提交日期时的登记号关联的版本。有效提交日期是指实际提交日期或提及登记号的优先权申请的提交日期中较早的那个(如果适用)。同样，除非另有说明，否则如果在不同时间发布了出版物、网站等的不同版本，则意指在本申请的有效提交日期最近发布的版本。除非另有明确说明，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施方案或方面都可以与任何其他特征、步骤、要素、实施方案或方面组合使用。尽管出于清楚性和理解的目的通过说明和实施例详细描述了本发明，但应当显而易见，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改。
实施方案清单
本文公开的标的物包括但不限于以下实施方案。
1.一种免疫原性组合物，其包含重组李斯特菌属菌株，所述重组李斯特菌属菌株包括含有编码重组多肽的核酸的重组减毒李斯特菌属菌株，其中所述重组多肽包含与维尔姆斯瘤蛋白或其免疫原性片段融合的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
2.实施方案1的组合物，其中所述重组多肽包含与全长维尔姆斯瘤蛋白融合的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
3.实施方案1的组合物，其中所述重组多肽包含与SEQ ID NO:95中所示的维尔姆斯瘤蛋白免疫原性片段融合的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
4.前述实施方案中任一个的组合物，其中所述维尔姆斯瘤蛋白或其免疫原性片段与截短李斯特菌溶血素O(tLLO)蛋白融合。
5.实施方案4的组合物，其中所述tLLO包含SEQ ID NO:57中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
6.前述实施方案中任一个的组合物，其中所述李斯特菌属菌株是单增李斯特菌菌株。
7.实施方案6的组合物，其中所述单增李斯特菌菌株是单增李斯特菌dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)菌株。
8.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括对所述受试者施用实施方案1-7中任一个的组合物。
9.一种在受试者中引发增强的抗癌T细胞应答的方法，其包括对所述受试者施用实施方案1-7中任一个的组合物。
10.一种在受试者中引发针对癌症的增强免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用实施方案1-7中任一个的组合物。
11.实施方案8-10中任一个的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
12.实施方案11的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
13.实施方案8-10中任一个的方法，其中所述癌症是胃肠癌。
本文公开的标的物还包括但不限于以下实施方案。
1.一种微基因构建体，其包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；(c)抗原性维尔姆斯瘤蛋白(WT1)肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。
2.实施方案1的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含异变突变WT1肽。
3.实施方案2的微基因构建体，其中所述异变突变WT1肽包含SEQ ID NO:114-137、159、160、162和163中任一个所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
4.实施方案3的微基因构建体，其中所述异变突变WT1肽包含SEQ ID NO:114、115、162或163中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
5.实施方案4的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:156、157、165或166中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
6.如任一实施方案1的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含天然WT1肽。
7.实施方案6的微基因构建体，其中所述天然WT1肽包含SEQ ID NO:95或158中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
8.实施方案7的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:164中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
9.实施方案1-4、6和7中任一个的微基因构建体，其中所述嵌合多肽还包含在所述细菌信号序列与所述泛素蛋白之间的一个或多个额外抗原性WT1肽。
10.实施方案9的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性WT1肽包括两个或更多个额外抗原性WT1肽。
11.实施方案10的微基因构建体，其中所述两个或更多个额外抗原性WT1肽在没有插入序列的情况下彼此直接融合。
12.实施方案10的微基因构建体，其中所述两个或更多个额外抗原性WT1肽经由肽接头彼此连接。
13.实施方案9-12中任一个的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：第一额外抗原性WT1肽，所述第一额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:154中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；第二额外抗原性WT1肽，所述第二额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:155中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；和第三额外抗原性WT1肽，所述第三额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
14.实施方案9-12中任一个的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：第一额外抗原性WT1肽，所述第一额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:154中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；第二额外抗原性WT1肽，所述第二额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:155中所示的序列、基本上由其组成或由其组成；和第三额外抗原性WT1肽，所述第三额外抗原性WT1肽包含SEQ ID NO:137中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
15.实施方案14的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:153中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
16.前述实施方案中任一个的微基因构建体，其中所述细菌分泌信号序列是李斯特菌溶血素O(LLO)分泌信号序列。
17.实施方案16的微基因构建体，其中所述LLO分泌信号序列包含SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:150中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
18.前述实施方案中任一个的微基因构建体，其中所述泛素蛋白包含SEQ ID NO:100中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
19.前述实施方案中任一个的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含SEQ IDNO:95、114-137、158、162和163中任一个所示的序列、基本上由其组成或由其组成，所述细菌分泌信号序列包含SEQ ID NO:59中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述泛素蛋白包含SEQ ID NO:100中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。
20.前述实施方案中任一个的微基因构建体，其中所述微基因构建体包含两个或更多个开放阅读框，每一个开放阅读框编码嵌合多肽，所述嵌合多肽包含以下各物、基本上由其组成或由其组成：(a)细菌分泌信号序列；(b)泛素蛋白；(c)抗原性WT1肽，其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述抗原性WT1肽从每一个嵌合多肽的氨基末端到羧基末端串联排列，并且其中在每一个嵌合多肽中的所述抗原性WT1肽是不同的，并且其中所述微基因构建体包含在每一对开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列。
21.一种嵌合多肽，其由前述实施方案中任一个的微基因构建体编码。
22.一种重组李斯特菌属菌株，其包含实施方案1-20中任一个的微基因构建体。
23.一种重组李斯特菌属菌株，其包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列、基本上其组成或由其组成的WT1肽的抗原性肽融合的含PEST的肽。
24.实施方案23的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述天然WT1。
25.实施方案23的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述天然WT1的免疫原性片段。
26.实施方案25的重组李斯特菌属菌株，其中所述天然WT1的免疫原性片段包含SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:139中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
27.实施方案23的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述包含SEQ IDNO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成的WT1肽。
28.实施方案23-27中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含与两个或更多个抗原性WT1肽融合的含PEST肽，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽中的至少一个选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成的WT1肽，并且其中所述两个或更多个抗原性WT1肽是相同的或不同的。
29.实施方案23-28中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽在没有插入序列的情况下彼此直接融合。
30.实施方案23-28中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽经由肽接头彼此连接。
31.实施方案23-30中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽还包含在所述天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQID NO:136中所示的序列、基本上由其组成或由其组成的WT1肽中的一个或多个的N末端和/或C末端的一个或多个肽标签。
32.实施方案31的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个肽标签包含下列中的一个或多个：3xFLAG标签；6xHis标签；SIINFEKL标签；和SEQ ID NO:99中所示的FLAG标签。
33.实施方案23-32中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST肽在所述融合多肽的N末端上。
34.实施方案23-33中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST肽是LLO的N末端片段。
35.实施方案34的重组李斯特菌属菌株，其中所述LLO的N末端片段包含SEQ IDNO:59中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
36.实施方案22-35中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸被可操作地整合至李斯特菌基因组中。
37.实施方案22-35中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式。
38.实施方案22-37中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸不赋予所述重组李斯特菌属菌株抗生素抗性。
39.实施方案22-38中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是营养缺陷型减毒李斯特菌属菌株。
40.实施方案39的重组李斯特菌属菌株，其中所述减毒李斯特菌属菌株在一个或多个内源基因中包含将所述一个或多个内源基因灭活的突变。
41.实施方案40的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含prfA。
42.实施方案40的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA。
43.实施方案40的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA和inlB。
44.实施方案40的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA、dal和dat。
45.实施方案22-44中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸包含编码代谢酶的第二开放阅读框。
46.实施方案45的重组李斯特菌属菌株，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶。
47.实施方案22-46中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽由hly启动子表达。
48.实施方案22-47中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是重组单增李斯特菌菌株。
49.实施方案22-33中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是包含prfA的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式并且包含编码D133V PrfA突变蛋白的第二开放阅读框。
50.实施方案22-33中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是包含actA、dal和dat的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式并且包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且其中含PEST肽是LLO的N末端片段。
51.实施方案22-33中任一个的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是包含actA和inlB的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸经过基因组整合，并且其中所述含PEST肽是ActA蛋白质或其片段。
52.一种免疫原性组合物，其包含实施方案22-51中任一个的重组李斯特菌属菌株和佐剂。
53.实施方案52的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶血素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含未甲基化CpG的寡核苷酸。
54.一种诱导受试者对WT1表达肿瘤或癌症的免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用实施方案22-51中任一个的重组李斯特菌属菌株或实施方案52-53中任一个的免疫原性组合物。
55.一种预防或治疗受试者的WT1表达肿瘤或癌症的方法，其包括对所述受试者施用实施方案22-51中任一个的重组李斯特菌属菌株或实施方案52-53中任一个的免疫原性组合物。
序列简要说明
使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出了所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵循从序列的5'末端开始并向前(即，在每一行中从左到右)前进至3'末端的标准惯例。仅示出了每一个核苷酸序列的一条链，但应理解，对所展示的链的任何引用都包括互补链。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并向前(即，在每一行中从左到右)前进至羧基末端的标准惯例。
实施例
实施例1.LmddA323(WT1)和LmddA324(Ova)的制备。
用新引物从给定构建体(ppl2-actA-ubiqitin-sinc pept质粒)扩增WT1和OVA的序列，纯化并连接在pCR2.1载体中。将连接混合物转化至Top10大肠杆菌细胞中。菌落PCR确认了质粒的存在。通过DNA测序验证质粒序列。将它们命名为pAdv318、pAdv319、pAdv320、pAdv321和pAdv322。
将WT1和OVA的序列连接至pAdv134中并转化至MB2159中。制备微量制备物并送去测序以确认正确者。将它们命名为pAdv323、pAdv324。将质粒pAdv323、pAdv324转化至LmddA中。进行两次传代并且通过菌落PCR确认LmddA 323、LmddA 324。序列分析确认了LmddA323和LmddA324的正确序列。从微基因构建体表达的WT1肽的氨基酸序列是：RMFPNAPY(SEQ IDNO:95)。
用LmddA323(WT1)和LmddA324(Ova)免疫的C57BL/6小鼠中对WT1和Ova肽的IFN-γ应答示于图1A至图1C中。图1A和图1C中最后一只小鼠对对照肽的高应答是由于体外刺激期间的肽交叉污染所致。在初次(图1A)和二次(图1B和图1C)免疫后，通过ICS评估对WT1和Ova肽的IFN-γ应答。初次免疫后没有检测到对WT1肽的应答；然而，3只小鼠中有2只在加强免疫后显示出可测量的对WT1肽的应答。初次免疫和加强免疫后在所有测试小鼠中都检测到了Ova特异性应答。
实施例2.用基于李斯特菌的特定免疫疗法/微基因构建体免疫后产生对WT1-H-2Db表位具特异性的T细胞系/克隆。
使用ADXS11-001(DP，批料-2013)、ADXS31-142(批料)、LmddA323(微基因-WT1)、ADXS31-164，根据下表1对来自Jackson Labs的6-8周龄雄性和雌性C57BL/6小鼠进行免疫。
表1.小鼠/脾脏收集物的免疫日期。
根据上表1收集每一只小鼠的脾脏。将来自每一只小鼠的脾脏收集在含有5mL c-RPMI培养基的单个管中。c-RPMI培养基(完全培养基)是450mL RPMI 1640、50mL FCS、5mLHEPES、5mL NEAA、5mLGlutamax、5mL丙酮酸钠、5mL青霉素/链霉素和129μL 2-ME(14.6M)。制备分离的脾细胞的详细步骤如下。
使用无菌镊子和剪刀从实验体和对照中收集脾脏，并且在含有10mL PBS的15mL管中运输至实验室。然后将脾脏倒入无菌培养皿中。使用两个玻璃载玻片或3mL注射器的柱塞后部在洗涤培养基(仅RPMI)中将脾脏捣碎。将培养基中的细胞转移至15mL管(对于1或2个脾脏)或50mL管(对于多于两个脾脏)中。在室温下以1,000RPM使细胞沉淀5分钟。丢弃上清液，将细胞轻轻地重悬于其余洗涤缓冲液中，并将每个脾脏2mL RBC溶解缓冲液加入细胞沉淀物中。通过敲击管子将细胞与溶解缓冲液轻缓地混合。等待1分钟后，立即将10mL c-RPMI培养基加入细胞悬浮液中以使裂解缓冲液失活。在室温下以1,000将细胞旋转5分钟。使细胞通过细胞过滤器并用10mL c-RPMI再洗涤一次。使用血细胞计数器对细胞进行计数，并且通过台盼蓝染色来检查活力。每一个脾脏产生约1-2×108个细胞。
在用以肽脉冲的丝裂霉素C处理的EL4细胞刺激后，体外扩增对不同抗原例如E7、PSA和WT1具特异性的T细胞，持续3-4周。通过五聚体染色和/或IFN-γICS确认了扩增的T细胞具抗原特异性，并且通过有限稀释法来选择克隆。对每一个抗原具特异性的T细胞克隆将进一步用作开发体外效力测定的工具。
实施例3.WT1抗原构建体的产生以及在抗原呈递细胞中的表达和分泌。
产生包含具有C末端SIINFEKL-S-6xHIS标签(ARSIINFEKLSHHHHHH；SEQ ID NO:96)的WT1抗原的构建体。具体来说，产生包含具有C末端标签的WT1蛋白的构建体。WT1单一构建体示于SEQ ID NO:97中。
用Lmdda-WT1标签表达载体感染鼠树突DC2.4细胞。然后将样品用25D-APC缀合的抗体染色，并且在流式细胞仪上运行以检测25D-APC。用25D-APC缀合的抗体检测C末端SIINFEKL标签(SEQ ID NO:98)示于图2A至图2C中。如图2C中所示，WT1样品显示与图2A中的阳性对照相当的高阳性染色水平，并且显著高于图2B中的阴性对照，确认了抗原在感染后在抗原呈递细胞中表达和分泌。
实施例4.李斯特菌表达异变WT1微基因融合蛋白的能力的评估。
使用肽微基因表达系统来评价靶向维尔姆斯瘤蛋白的九种独特异变微基因。设计该表达系统以便于克隆在羧基末端含有不同的肽部分的重组蛋白质组。这通过利用编码信号序列(SS)-泛素(Ub)-抗原性肽构建体之一的序列作为模板的简单PCR反应来实现。通过使用延伸至Ub序列的羧基末端区中的引物并且在引物的3’末端引入所期望肽序列的密码子，可以在单个PCR反应中产生新的SS-Ub-肽序列。编码细菌启动子的5'引物和信号序列(例如，LLO或ActA1-100分泌信号序列)的前几个核苷酸对于所有构建体都可以是相同的。使用该策略产生的构建体示意性地表示在图3A和图3B中。
微基因系统的一个优点是将有可能使用单个李斯特菌载体构建体装载具有多个肽的细胞。可以使用上述单肽表达系统的修饰将多个肽引入重组减毒李斯特菌(例如Lmdda)中。编码连续SS-Ub-肽序列的多个不同的肽的嵌合蛋白可以在一个插入序列中编码。参见例如图3B。SD核糖体结合位点可以引入在每一个SS-Ub-肽编码序列之前，以使每一个肽构建体都能够分开翻译。图3B示出了设计为表达来自一个重组李斯特菌属菌株的三个单独肽抗原的构建体的示意性图示。
为了通过ADXS Lmdda李斯特菌构建体评价tLLO-WT1-异变融合蛋白的表达，在pAdv134质粒中产生10个靶向维尔姆斯瘤1蛋白的独特异变微基因，并且转化至Lmdda中。pAdv134 tLLO质粒编码SEQ ID NO:59中所示的N末端LLO片段。tLLO-WT1异变融合蛋白从N末端至C末端包含：SEQ ID NO:59中所示的N末端LLO片段，之后是SEQ ID NO:99中所示的FLAG标签，之后是SEQ ID NO:100所示的泛素序列，之后是下表2中列出的异变WT1 9聚体。
表2.异变WT1肽。
组合WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸构建体(1号构建体)示于SEQ ID NO:156中。产生了一种靶向3个WT1肽(P1-P2-P3；S EQ ID NO:154(RSDELVRHHNMHQRNMTKL)、155(PGCNKRY FKLSHLQMHSRKHTG)和137(SGQAYMFPNAPYLPSCLES))的额外构建体(Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸微基因构建体)。每一个‘P’肽都由19-22个氨基酸组成，其长度足以提供额外CD4辅助T细胞表位。三个肽通过接头分开。P3肽含有将SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:152)转化成SGQAYMFPNAPY LPSCLES(SEQ ID NO:137)的异变突变。除了异变P3肽以外，Lm dda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸微基因构建体还在C末端含有泛素-YMFPNAPYL(SEQ ID NO:115)部分。组合WT1-tL LO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸微基因构建体示于SEQ ID NO:153中。通过对独特异变WT1微基因产物的tLLO-融合蛋白表达的蛋白质印迹来测定每一个单独Lmdda构建体。
通过对独特异变WT1微基因产物的tLLO-融合蛋白表达的蛋白质印迹来测定1号构建体(Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-异变苯丙氨酸微基因构建体)和Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-异变酪氨酸微基因构建体。在37℃干燥振荡孵育箱中，使用来自含有Lm WT1微基因构建体的板的单个菌落将过夜培养物接种在6mL脑心浸液(BHI)肉汤中。第二天，将原始过夜培养物的1:10稀释液重悬于9mL新鲜BHI中，并且在37℃干燥振荡孵育箱中生长，直至达到OD600＝0.6。通过以13000RPM离心2分钟使细胞沉淀。收集样品上清液并且在SDS-PAGE上跑胶。通过用25μL 4X LDS样品缓冲液(目录号161-0747)稀释75μL样品，在98℃煮沸10分钟，置于冰上，然后在4℃下以最大速度离心10分钟来制备样品。将13μL样品在4-15％预制蛋白质凝胶(BioRad目录号4561086)上跑胶。使用Trans-Blot Turbo转移装置(目录号170-4155)和PVDF Midi转移包(Bio-Rad编号170-4157)转移蛋白质凝胶。将印迹与作为一抗的抗FLAG单克隆抗体(Sigma F1804)或抗LLO(Abcam ab200538)和作为二抗的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合(sc2005)一起孵育。然后将印迹在iBind Flex(Invitrogen目录号1772866)上孵育，洗涤，然后通过Super Signal West Dura持久性化学发光底物(Signal West DuraExtended Duration Substrate)(ThermoFisher编号34076)显影；图像在Amersham Imager600(GE)上显影。
确认了独特tLLO-WT1-异变微基因融合蛋白的表达和分泌。来自1号构建体和Lmdda-WT1-P1-P2-P3-YMFPNAPYL异变酪氨酸+微基因构建体的培养物上清液的抗Flag标签抗体蛋白质印迹分别示于图8A和图8B中。我们能够检测到对应于每一个单独tLLO-WT1-异变微基因融合蛋白的正确大小和身份的蛋白质条带。这些数据证明了异变肽靶向使用pAdv134质粒和Lmdda李斯特菌属菌株产生的WT1蛋白内的多个肽片段的能力。
对于表2中的2-9号构建体，通过菌落PCR测定每一个单独Lmdda构建体，以检测来自含有异变WT1微基因的每一个独特tLLO融合蛋白的质粒DNA。
材料
程序
所使用的一般菌落PCR程序如下。获得具有大量菌落的板(一般来说，在37℃下生长24小时的板非常适用于该程序)。如下产生主混合物以供进行PCR。
将20μL主混合物等分至每一个PCR管中。使用移液管尖端(10-20μL体积效果最佳)从一个菌落中吸取大量体积。将移液管尖端轻敲至PCR管中数次并旋转以去除细菌。使用以下PCR程序在热循环仪中进行PCR反应。
从热循环仪中取出PCR管，加入4μL 6X装载染料。在1％琼脂糖凝胶上以10μL进行各PCR反应以及10μL 1kb+DNA序列梯。引物向产物添加额外163个碱基对。正向引物结合tLLO的3’末端上游的70个碱基对(包括XhoI位点)。反向引物结合终止位点下游的93个碱基对(包括XmaI位点)。
显示含有表2的2-9号pAdv134WT1异变质粒的Lmdda菌株的代表性菌落PCR结果示于图9中。我们能够检测到对应于每一个单独tLLO-WT1-异变微基因质粒的正确大小和身份的DNA条带。这些数据证明了异变肽靶向使用pAdv134质粒和Lmdda李斯特菌属菌株产生的WT1蛋白内多个肽片段的能力，这表明此类构建体可用作靶向WT1的治疗组合物以产生或增强针对WT1以及WT1表达癌症和肿瘤的免疫应答。
实施例5.WT1构建体的免疫原性的评估。
为了使用两个不同的WT1构建体评价AAD小鼠中WT1特异性T细胞应答的产生，进行ELISpots以确定所期望的疫苗诱导的Ag特异性应答。AAD小鼠(B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J；The Jackson Laboratory-储存编号：004191)是在人HLA-A2.1启动子指导下表达种间杂种I类MHC基因AAD的转基因小鼠，AAD含有人HLA-A2.1基因的α-1和α-2结构域以及小鼠H-2Dd基因的α-3跨膜结构域和细胞质结构域。该转基因菌株能够模拟人T细胞对HLA-A2呈递抗原的免疫应答，并且可用于测试传染病疫苗或癌症疗法。表3中提供了免疫计划表。所使用的小鼠是8-10周龄雌性C57BL/6小鼠。
表3.免疫计划表。
疫苗制备。简而言之，以每一种甘油储备液在所需的营养板上划线并且生长过夜。使用单个菌落在抗生素选择下在脑心浸液(BHI)肉汤的过夜培养物中生长。以1:10(体积/体积)稀释度使用过夜培养物以接种新鲜BHI肉汤。在轨道式振荡器中在37℃下将细菌孵育1-3小时达到对数中期，OD为～0.6-0.7。以1×109CFU Lm通过于PBS中进行腹膜内接种来感染小鼠。
ELISPOT。在第18天，根据IACUC方案通过CO2窒息处死小鼠，收集脾脏，并将脾细胞单细胞悬浮液接种在96孔板上并且用野生型或异变肽进行刺激(表4)。用其他成对野生型和异变肽进行类似的实验(表5)。使用ELISPOT测定计量响应于野生型或异变肽的抗原特异性CD8T细胞。完整ELISPOT方案按照CTL免疫斑点法(www.immunospot.com/resources/protocols/ELISPOT-protocol.htm)。
表4.野生型和异变WT1肽。
表5.野生型和异变WT1肽。
以下提供通用ELISPOT方案。
第0天(无菌条件)。根据您的具体方案，通过稀释捕获抗体来制备捕获溶液。许多细胞因子受益于用70％乙醇预润湿PVDF膜30秒并用150μL PBS洗涤三次，然后向每一个孔中加入80μL捕获溶液。在4℃下在加湿室中将板孵育过夜。
第1天(无菌条件)。通过添加1％新鲜L-谷氨酰胺来制备CTL-TestTM培养基。在CTL-TestTM培养基中制备2倍终浓度的抗原/促分裂原溶液。从第0天开始倾析涂有抗体的板并用150μL PBS洗涤一次。以100μL/孔铺涂抗原/促分裂原溶液。在将PBMC解冻或以密度梯度分离白细胞后，在CTL-TestTM培养基中将PBMC调整至所期望的浓度，例如，3,000,000个/mL，相当于300,000个细胞/孔(然而，细胞数目可以根据预期斑点计数加以调整，因为100,000-800,000个细胞/孔将提供线性结果)。在处理PBMC并且直到接种的同时，将细胞保持在37℃湿润孵育箱中(5-9％CO2)。使用大孔口尖端以100μL/孔铺涂PBMC。完成后，轻轻敲击板两侧，并且立即放入37℃湿润孵育箱中(5-9％CO2)。孵育24-72小时，此取决于您的细胞因子。不要堆摞板。小心开合孵育箱门以避免摇晃板。孵育期间请勿触摸板。
第2天。准备当天的洗涤液：PBS、蒸馏水和Tween-PBS。根据您的具体方案，通过稀释检测抗体来制备检测溶液。将板用PBS洗涤两次，然后用0.05％Tween-PBS洗涤两次，每次200μL/孔。添加80μL/孔检测溶液。在室温下孵育2小时。根据您的具体方案，通过稀释第三抗体来制备第三溶液。以200μL/孔用0.05％Tween-PBS洗涤板三次。添加80μL/孔的Strep-AP溶液。在室温下孵育30分钟。根据您的具体方案来制备显色剂溶液。将板用0.05％Tween-PBS洗涤两次，然后用蒸馏水洗涤两次，每一次200μL/孔。以80μL/孔添加显色剂溶液。在室温下孵育10-20分钟。用自来水轻轻冲洗膜来停止反应，倾析，并且重复三次。取下板的保护性暗渠，并且用自来水冲洗板背面。在通风橱中或纸巾上将板面向下风干2小时，在台面上保持24小时。对板进行扫描和计数。
如所描述对HLA-A2转基因B6小鼠进行接种，并用特定WT1肽(RMFPNAPYL(SEQ IDNO:101)、FMFPNAPYL(SEQ ID NO 114))离体刺激脾细胞，并且通过IFNg ELISpot测定进行分析。异变接种(WT1-F微基因：FMFPNAPYL；SEQ ID NO:114)在免疫过的HLA2转基因小鼠中诱导Ag特异性T细胞应答。另外，异变接种引发与天然WT1肿瘤抗原(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:101)交叉反应的T细胞应答。数据证明用WT1-F异变微基因疫苗接种可以引发与WT1天然肿瘤抗原(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:101)交叉反应的T细胞。总体上，数据表明异变微基因疫苗可以引发与天然肿瘤抗原交叉反应的T细胞。
如所描述对HLA-A2转基因B6小鼠进行接种并收集脾细胞。通过IFNg ELISpot测定来测定T细胞响应于疫苗特异性YMFPNAPYL肽(SEQ ID NO:115)或天然WT1肽(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:101)而产生IFNg的能力。异变接种(WT1-AH1-Tyr微基因：YMFPNAPYL；SEQ IDNO:115)在免疫过的HLA2转基因小鼠中诱导Ag特异性T细胞应答。另外，异变接种引发与天然WT1肿瘤抗原(RMFPAPYL；SEQ ID NO:101)交叉反应的T细胞应答。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
<120> 包含维尔姆斯瘤蛋白抗原的基于李斯特菌的免疫原性组合物及其使用方法
<130> 062384/499335
<150> US 62/358,539
<151> 2016-07-05
<160> 168
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gctcgctcta tcatcaattt cgaaaaactt taataa 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gcacgtagta ttattaactt cgaaaagtta taataa 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
gcacgttcca tcattaactt tgaaaaacta taataa 36
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<212> DNA
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gctcgctcaa tcatcaactt tgaaaagcta taataa 36
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<212> DNA
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gctcgctcta ttatcaattt tgaaaaatta taataa 36
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gctcgttcga ttatcaactt cgaaaaactg taataa 36
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gcgcgttcta ttattaattt tgaaaaatta taataa 36
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Ala Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
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gacaaa 66
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<212> DNA
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gactataaag accacgatgg cgattataaa gaccatgata ttgactacaa agatgatgat 60
gataag 66
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<212> DNA
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gattataaag atcatgatgg cgactataaa gatcatgata tcgattacaa agatgacgat 60
gacaaa 66
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gactacaaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgaca ttgattataa agacgatgat 60
gacaaa 66
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gattacaaag atcacgatgg tgattataag gatcacgata ttgattacaa agacgacgac 60
gataaa 66
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gattacaaag atcacgatgg cgattacaaa gatcatgaca ttgactacaa agacgatgat 60
gataaa 66
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gattacaagg atcatgatgg tgattacaaa gatcacgata tcgactacaa agatgatgac 60
gataaa 66
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<212> DNA
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<220>
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gactacaaag atcatgatgg tgattacaaa gatcatgaca ttgattataa agatgatgat 60
gacaaa 66
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<212> DNA
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gattataaag accatgatgg tgattataag gatcatgata tcgattataa ggatgacgac 60
gataaa 66
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gattataaag atcacgatgg cgattataaa gaccacgata ttgattataa agacgacgat 60
gacaaa 66
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gataaa 66
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gactacaaag atcacgacgg cgattataaa gatcacgata ttgactataa agatgacgat 60
gataaa 66
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gattataaag accatgatgg agattacaaa gatcatgata ttgactataa agacgacgac 60
gataaa 66
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gataaa 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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gactacaaag atcacgatgg tgattataaa gaccatgata ttgattacaa agatgatgat 60
gacaaa 66
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Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
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Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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Gly Ala Ser Gly Ala Ser
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Gly Ser Ala Gly Ser Ala
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Gly Gly Gly Gly
1
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Gly Gly Gly Gly Ser
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Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly
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Pro Ala Pro Ala Pro
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Leu Arg Ala Leu Arg Ala
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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Ser Pro Lys
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 46
Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
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Glu Glu Leu Arg
20
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
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1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Arg Ser Glu Val Thr Ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Ala Thr Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 54
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
<210> 55
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 56
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 57
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
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Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
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Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
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Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
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Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 58
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
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Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
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Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
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Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
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<220>
<223> 合成的
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Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
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<212> DNA
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atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gat 1323
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<220>
<223> 合成的
<400> 61
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
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Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
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Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
100 105 110
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115 120 125
Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val
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225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
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Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
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340 345 350
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355 360 365
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<220>
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Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser
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485 490 495
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Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
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530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
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565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
610 615 620
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
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Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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275 280 285
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115 120 125
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130 135 140
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Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
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Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
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atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 69
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100
<210> 70
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe
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Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser
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Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 71
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
atgcgtgcga tgatggtagt tttcattact gccaactgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattcc agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattga ggaactagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagcaaaa gcagagaaag gtccgaataa caataataac 300
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actctgcaag tggagcgtcg tcatccaggt ctgtcatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 480
aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 600
aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 840
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gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 1020
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Ser Arg Ala Thr Asp Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln
35 40 45
Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val
50 55 60
Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn
65 70 75 80
Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys
85 90 95
Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala
100 105 110
Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu
115 120 125
Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys
130 135 140
Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu
165 170 175
Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser
180 185 190
Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe
195 200 205
Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg
210 215 220
Asp Lys
225
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Asp Asn Lys Arg
1 5
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg
1 5 10
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Glu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 368
<212> PRT
<213> 单核细胞增生李斯特菌
<400> 76
Met Val Thr Gly Trp His Arg Pro Thr Trp Ile Glu Ile Asp Arg Ala
1 5 10 15
Ala Ile Arg Glu Asn Ile Lys Asn Glu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Ser
20 25 30
Val Asp Leu Trp Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ile
35 40 45
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50 55 60
Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Ala Gly Phe Gln
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ile Leu Val Leu Gly Ala Thr Arg Lys Glu Asp Ala Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Lys Asn His Ile Ser Leu Thr Val Phe Arg Glu Asp Trp
100 105 110
Leu Glu Asn Leu Thr Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ile His Leu Lys Val
115 120 125
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130 135 140
Arg Ile Glu Ala Thr Ser Thr Asn Asp His Gln Leu Gln Leu Glu Gly
145 150 155 160
Ile Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Gln Leu Glu Thr Ser Tyr Phe
165 170 175
Glu Gln Gln Leu Ala Lys Phe Gln Thr Ile Leu Thr Ser Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Pro Thr Tyr Val His Thr Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu Leu Gln
195 200 205
Pro Gln Ile Gly Phe Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ile Ser Met Tyr Gly
210 215 220
Leu Thr Pro Ser Thr Glu Ile Lys Thr Ser Leu Pro Phe Glu Leu Lys
225 230 235 240
Pro Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Met Val His Val Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Pro Gly Asp Ser Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Arg
260 265 270
Glu Trp Val Ala Thr Leu Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Leu Ile Arg
275 280 285
His Tyr Ser Gly Phe His Val Leu Val Asp Gly Glu Pro Ala Pro Ile
290 295 300
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305 310 315 320
Phe Gln Thr Gly Ser Lys Val Thr Ile Ile Gly Lys Asp His Gly Asn
325 330 335
Thr Val Thr Ala Asp Asp Ala Ala Gln Tyr Leu Asp Thr Ile Asn Tyr
340 345 350
Glu Val Thr Cys Leu Leu Asn Glu Arg Ile Pro Arg Lys Tyr Ile His
355 360 365
<210> 77
<211> 289
<212> PRT
<213> 单核细胞增生李斯特菌
<400> 77
Met Lys Val Leu Val Asn Asn His Leu Val Glu Arg Glu Asp Ala Thr
1 5 10 15
Val Asp Ile Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr Glu
20 25 30
Val Val Arg Leu Tyr Asn Gly Lys Phe Phe Thr Tyr Asn Glu His Ile
35 40 45
Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Ile Asp Leu Val Ile Pro Tyr
50 55 60
Ser Lys Glu Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Val Ala Glu Asn
65 70 75 80
Asn Ile Asn Thr Gly Asn Val Tyr Leu Gln Val Thr Arg Gly Val Gln
85 90 95
Asn Pro Arg Asn His Val Ile Pro Asp Asp Phe Pro Leu Glu Gly Val
100 105 110
Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Val Pro Arg Asn Glu Arg Gln Phe Val
115 120 125
Glu Gly Gly Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys
130 135 140
Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Asn Ile Leu Ala Lys Asn Lys
145 150 155 160
Ala His Gln Gln Asn Ala Leu Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Gln
165 170 175
Val Thr Glu Cys Ser Ala Ser Asn Val Ser Ile Ile Lys Asp Gly Val
180 185 190
Leu Trp Thr His Ala Ala Asp Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg
195 200 205
Gln Val Ile Ile Asp Val Ala Lys Lys Asn Gly Ile Pro Val Lys Glu
210 215 220
Ala Asp Phe Thr Leu Thr Asp Leu Arg Glu Ala Asp Glu Val Phe Ile
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Ile Glu Ile Thr Pro Ile Thr His Ile Asp Gly Val
245 250 255
Gln Val Ala Asp Gly Lys Arg Gly Pro Ile Thr Ala Gln Leu His Gln
260 265 270
Tyr Phe Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Cys Gly Glu Leu Glu Phe Ala
275 280 285
Lys
<210> 78
<211> 1107
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特菌
<400> 78
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aatataaaaa atgaacaaaa taaactcccg gaaagtgtcg acttatgggc agtagtcaaa 120
gctaatgcat atggtcacgg aattatcgaa gttgctagga cggcgaaaga agctggagca 180
aaaggtttct gcgtagccat tttagatgag gcactggctc ttagagaagc tggatttcaa 240
gatgacttta ttcttgtgct tggtgcaacc agaaaagaag atgctaatct ggcagccaaa 300
aaccacattt cacttactgt ttttagagaa gattggctag agaatctaac gctagaagca 360
acacttcgaa ttcatttaaa agtagatagc ggtatggggc gtctcggtat tcgtacgact 420
gaagaagcac ggcgaattga agcaaccagt actaatgatc accaattaca actggaaggt 480
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gctaagttcc aaacgatttt aacgagttta aaaaaacgac caacttatgt tcatacagcc 600
aattcagctg cttcattgtt acagccacaa atcgggtttg atgcgattcg ctttggtatt 660
tcgatgtatg gattaactcc ctccacagaa atcaaaacta gcttgccgtt tgagcttaaa 720
cctgcacttg cactctatac cgagatggtt catgtgaaag aacttgcacc aggcgatagc 780
gttagctacg gagcaactta tacagcaaca gagcgagaat gggttgcgac attaccaatt 840
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tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac ggtaacagca 1020
gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt gttaaatgag 1080
cgcataccta gaaaatacat ccattag 1107
<210> 79
<211> 870
<212> DNA
<213> 单核细胞增生李斯特菌
<400> 79
atgaaagtat tagtaaataa ccatttagtt gaaagagaag atgccacagt tgacattgaa 60
gaccgcggat atcagtttgg tgatggtgta tatgaagtag ttcgtctata taatggaaaa 120
ttctttactt ataatgaaca cattgatcgc ttatatgcta gtgcagcaaa aattgactta 180
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aatatcaata cagggaatgt ctatttacaa gtgactcgtg gtgttcaaaa cccacgtaat 300
catgtaatcc ctgatgattt ccctctagaa ggcgttttaa cagcagcagc tcgtgaagta 360
cctagaaacg agcgtcaatt cgttgaaggt ggaacggcga ttacagaaga agatgtgcgc 420
tggttacgct gtgatattaa gagcttaaac cttttaggaa atattctagc aaaaaataaa 480
gcacatcaac aaaatgcttt ggaagctatt ttacatcgcg gggaacaagt aacagaatgt 540
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ttaatcttaa atggtatcac tcgtcaagtt atcattgatg ttgcgaaaaa gaatggcatt 660
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gcatgtggcg aattagagtt tgcaaaataa 870
<210> 80
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp
20 25 30
Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys
50 55 60
Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val
85 90 95
Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His
100 105 110
Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu
115 120 125
Ala Lys Phe Asn Asp Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys
130 135 140
Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys
180 185 190
Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val
195 200 205
Gln Asn Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp
210 215 220
Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn
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<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60
caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120
ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180
caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240
ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300
gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360
caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa cgggaagctt 420
ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480
ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540
gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600
tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat cttgattatc tcaaaagata tgcccctaaa 660
ttagatgaat ggttttattt agcatgtcct gctacttggg gaaaattaaa ttaa 714
<210> 82
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly
1 5 10 15
Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp
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Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His
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Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu
115 120 125
Ala Lys Phe Asn Val Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys
130 135 140
Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys
180 185 190
Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val
195 200 205
Gln Asn Arg Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp
210 215 220
Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn
225 230 235
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<211> 713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60
caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120
ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180
caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240
ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300
gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360
caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgttt tttcgattaa cgggaagctt 420
ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480
ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540
gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600
tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat ctgattatct caaaagatat gcccctaaat 660
tagatgaatg gttttattta gcatgtcctg ctacttgggg aaaattaaat taa 713
<210> 84
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
ggtggtggag ga 12
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
ggtggaggtg ga 12
<210> 86
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
ggtggaggag gt 12
<210> 87
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
ggaggtggtg ga 12
<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
ggaggaggtg gt 12
<210> 89
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 90
ggaggaggag gt 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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ggaggaggtg ga 12
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<212> DNA
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<223> 合成的
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ggaggtggag ga 12
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ggaggaggag ga 12
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Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
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Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His
65 70 75 80
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro
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Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
100 105 110
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala
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130 135 140
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145 150 155 160
Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln
165 170 175
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp
180 185 190
Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser
195 200 205
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225 230 235 240
Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr
245 250 255
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
260 265 270
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
275 280 285
Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu
290 295 300
Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
305 310 315 320
Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
325 330 335
Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
355 360 365
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370 375 380
Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser
385 390 395 400
Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys
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Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln
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Gly Leu Arg Arg Gly Ile Gln Asp Val
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Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Val
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Tyr Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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Asn Met His Gln Arg Val Met Thr Lys
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Asn Met Tyr Gln Arg Val Met Thr Lys
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<220>
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1 5 10 15
Leu Glu Ser
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
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Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
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Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
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Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
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Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
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Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
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Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
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Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
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Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
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Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
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Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
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Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
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Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His
65 70 75 80
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro
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Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
100 105 110
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala
115 120 125
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser
130 135 140
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser
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Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln
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Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp
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Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser
195 200 205
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Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser
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Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr
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Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
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Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
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Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
305 310 315 320
Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
325 330 335
Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
355 360 365
Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys
370 375 380
Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser
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Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
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Ala Leu
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Glu Lys Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
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Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
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Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
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Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
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Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
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Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly
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Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg
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Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
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Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
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Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln
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Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys
210 215 220
Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His
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Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
245 250 255
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275 280 285
<210> 141
<211> 302
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Met Glu Lys Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
20 25 30
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
35 40 45
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
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Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
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Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
100 105 110
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
115 120 125
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
130 135 140
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
145 150 155 160
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
165 170 175
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
180 185 190
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
195 200 205
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
210 215 220
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
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Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
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Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
275 280 285
Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
290 295 300
<210> 142
<211> 517
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Met Gln Asp Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro Ala Ser Gln His
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly
20 25 30
Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ala Ser Gly Ser
50 55 60
Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
65 70 75 80
Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
85 90 95
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
130 135 140
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
165 170 175
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly
210 215 220
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
225 230 235 240
Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
245 250 255
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
260 265 270
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
290 295 300
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala
305 310 315 320
Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
325 330 335
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
340 345 350
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
355 360 365
Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu
370 375 380
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys
385 390 395 400
Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
405 410 415
Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val
435 440 445
Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp
450 455 460
His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys
465 470 475 480
Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
485 490 495
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
500 505 510
Leu Gln Leu Ala Leu
515
<210> 143
<211> 514
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Met Gln Asp Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro Ala Ser Gln His
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly
20 25 30
Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ala Ser Gly Ser
50 55 60
Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
65 70 75 80
Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
85 90 95
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
130 135 140
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
165 170 175
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly
210 215 220
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
225 230 235 240
Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
245 250 255
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
260 265 270
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
290 295 300
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala
305 310 315 320
Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
325 330 335
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
340 345 350
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
355 360 365
Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu
370 375 380
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys
385 390 395 400
Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
405 410 415
Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val
435 440 445
Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp
450 455 460
His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser
465 470 475 480
Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
485 490 495
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu
500 505 510
Ala Leu
<210> 144
<211> 497
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Met Gln Asp Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro Ala Ser Gln His
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly
20 25 30
Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ala Ser Gly Ser
50 55 60
Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
65 70 75 80
Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
85 90 95
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
130 135 140
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
165 170 175
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180 185 190
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
195 200 205
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210 215 220
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
225 230 235 240
Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
245 250 255
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
260 265 270
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
290 295 300
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
305 310 315 320
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
325 330 335
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
420 425 430
Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
435 440 445
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450 455 460
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
465 470 475 480
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485 490 495
Leu
<210> 145
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Glu Asp Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 146
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Ala Ala Glu Ala Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ala Ser Gly Ser Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
20 25 30
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
35 40 45
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
50 55 60
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
65 70 75 80
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
85 90 95
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
100 105 110
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
115 120 125
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
130 135 140
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
145 150 155 160
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
165 170 175
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
180 185 190
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
195 200 205
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210 215 220
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
225 230 235 240
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
245 250 255
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
260 265 270
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
275 280 285
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
290 295 300
Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
305 310 315 320
Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly
325 330 335
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
340 345 350
Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu
355 360 365
Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His
370 375 380
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385 390 395 400
Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys
405 410 415
Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
420 425 430
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
435 440 445
Leu Gln Leu Ala Leu
450
<210> 147
<211> 514
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Met Gln Asp Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro Ala Ser Gln His
1 5 10 15
Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly
20 25 30
Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala
35 40 45
Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ala Ser Gly Ser
50 55 60
Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
65 70 75 80
Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
85 90 95
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
130 135 140
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
145 150 155 160
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
165 170 175
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
180 185 190
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
195 200 205
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly
210 215 220
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
225 230 235 240
Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
245 250 255
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
260 265 270
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
275 280 285
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
290 295 300
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala
305 310 315 320
Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
325 330 335
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
340 345 350
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
355 360 365
Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu
370 375 380
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys
385 390 395 400
Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
405 410 415
Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val
435 440 445
Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp
450 455 460
His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser
465 470 475 480
Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
485 490 495
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu
500 505 510
Ala Leu
<210> 148
<211> 168
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His
1 5 10 15
Ile Glu Gly Arg His Met Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
20 25 30
Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
35 40 45
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
50 55 60
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Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
145 150 155 160
Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
165
<210> 149
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ala Lys Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 150
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys
20 25
<210> 151
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala
20 25
<210> 152
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 153
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(441)
<223> tLLO
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (442)..(460)
<223> WT1-427长
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (466)..(487)
<223> WT1-331长
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (493)..(511)
<223> WT1-122A1长
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (512)..(532)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> WT1-A1
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<213> 智人
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<223> FLAG标签
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<223> 泛素
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (538)..(546)
<223> WT1-A1
<400> 157
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
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<212> PRT
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<223> 合成的
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(441)
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> 野生型A24
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Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
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<213> 人工序列
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(441)
<223> tLLO
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<221> MISC_FEATURE
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<223> FLAG标签
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (463)..(537)
<223> 泛素
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (538)..(546)
<223> 变态A24 v1
<400> 165
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Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
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Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
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Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly
435 440 445
Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile
450 455 460
Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro
465 470 475 480
Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly
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Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu
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His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala
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Thr Leu
545
<210> 166
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(441)
<223> tLLO
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (442)..(462)
<223> FLAG标签
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (463)..(537)
<223> 泛素
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (538)..(546)
<223> 变态A24 v2
<400> 166
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
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Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
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Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
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Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly
435 440 445
Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile
450 455 460
Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro
465 470 475 480
Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly
485 490 495
Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu
500 505 510
Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu
515 520 525
His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala
530 535 540
Thr Leu
545
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
catcgatcac tctgga 16
<210> 168
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
ctaactccaa tgttacttg 19

Claims (55)

1.一种微基因构建体，其包含含有编码嵌合多肽的开放阅读框的核酸，其中所述嵌合多肽包含：
(a)细菌分泌信号序列；
(b)泛素蛋白；和
(c)抗原性维尔姆斯瘤蛋白(WT1)肽，
其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述抗原性WT1肽从所述嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列。
2.如权利要求1所述的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含异变突变WT1肽。
3.如权利要求2所述的微基因构建体，其中所述异变突变WT1肽包含SEQ ID NO:114-137、159、160、162和163中的任一个中所示的序列。
4.如权利要求3所述的微基因构建体，其中所述异变突变WT1肽包含SEQ ID NO:114、115、162或163中所示的序列。
5.如权利要求4所述的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:156、157、165或166中所示的序列。
6.如任一权利要求1所述的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含天然WT1肽。
7.如权利要求6所述的微基因构建体，其中所述天然WT1肽包含SEQ ID NO:95或158中所示的序列。
8.如权利要求7所述的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:164中所示的序列。
9.如权利要求1至4、6和7中任一项所述的微基因构建体，其中所述嵌合多肽还包含在所述细菌信号序列与所述泛素蛋白之间的一个或多个额外抗原性WT1肽。
10.如权利要求9所述的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性WT1肽包括两个或更多个额外抗原性WT1肽。
11.如权利要求10所述的微基因构建体，其中所述两个或更多个额外抗原性WT1肽在没有插入序列的情况下彼此直接融合。
12.如权利要求10所述的微基因构建体，其中所述两个或更多个额外抗原性WT1肽经由肽接头彼此连接。
13.如权利要求9至12中任一项所述的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性肽包含含有SEQ ID NO:154中所示的序列的第一额外抗原性WT1肽、含有SEQ ID NO:155中所示的序列的第二额外抗原性WT1肽和含有SEQ ID NO:136中所示的序列的第三额外抗原性WT1肽。
14.如权利要求9至12中任一项所述的微基因构建体，其中所述一个或多个额外抗原性肽包含含有SEQ ID NO:154中所示的序列的第一额外抗原性WT1肽、含有SEQ ID NO:155中所示的序列的第二额外抗原性WT1肽和含有SEQ ID NO:137中所示的序列的第三额外抗原性WT1肽。
15.如权利要求14所述的微基因构建体，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:153中所示的序列。
16.如上述权利要求中任一项所述的微基因构建体，其中所述细菌分泌信号序列是李斯特菌溶血素O(LLO)分泌信号序列。
17.如权利要求16所述的微基因构建体，其中所述LLO分泌信号序列包含SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:150中所示的序列。
18.如上述权利要求中任一项所述的微基因构建体，其中所述泛素蛋白包含SEQ IDNO:100中所示的序列。
19.如上述权利要求中任一项所述的微基因构建体，其中所述抗原性WT1肽包含SEQ IDNO:95、114-137、158、162和163中的任一个中所示的序列，所述细菌分泌信号序列包含SEQID NO:59中所示的序列，并且所述泛素蛋白包含SEQ ID NO:100中所示的序列。
20.如上述权利要求中任一项所述的微基因构建体，其中所述微基因构建体包含两个或更多个开放阅读框，每一开放阅读框编码包含以下的嵌合多肽：
(a)细菌分泌信号序列；
(b)泛素蛋白；和
(c)抗原性WT1肽，
其中所述细菌分泌信号序列、所述泛素和所述抗原性WT1肽从每一嵌合多肽的氨基末端至羧基末端串联排列，并且
其中每一嵌合多肽中的所述抗原性WT1肽不同，并且
其中所述微基因构建体包含在每一对开放阅读框之间的SD核糖体结合位点核酸序列。
21.一种由如上述权利要求中任一项所述的微基因构建体编码的嵌合多肽。
22.一种重组李斯特菌属菌株，其包含如权利要求1至20中任一项所述的微基因构建体。
23.一种重组李斯特菌属菌株，其包含含有编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸，其中所述融合多肽包含与选自天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的免疫原性片段和包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽的抗原性肽融合的含PEST肽。
24.如权利要求23所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述天然WT1。
25.如权利要求23所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述天然WT1的所述免疫原性片段。
26.如权利要求25所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述天然WT1的所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:139中所示的序列。
27.如权利要求23所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含所述包含SEQID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽。
28.如权利要求23至27中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽包含与两个或更多个抗原性WT1肽融合的所述含PEST肽，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽中的至少一个选自所述天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的所述免疫原性片段和所述包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽，并且其中所述两个或更多个抗原性WT1肽是相同的或不同的。
29.如权利要求23至28中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽在没有插入序列的情况下彼此直接融合。
30.如权利要求23至28中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述两个或更多个抗原性WT1肽经由肽接头彼此连接。
31.如权利要求23至30中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽还包含在所述天然维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、所述天然WT1的所述免疫原性片段和所述包含SEQ IDNO:114或SEQ ID NO:136中所示的序列的WT1肽中的一个或多个的N末端和/或C末端的一个或多个肽标签。
32.如权利要求31所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个肽标签包含下列中的一个或多个：3xFLAG标签；6xHis标签；SIINFEKL标签；和SEQ ID NO:99中所示的FLAG标签。
33.如权利要求23至32中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST肽在所述融合多肽的N末端。
34.如权利要求23至33中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述含PEST肽是LLO的N末端片段。
35.如权利要求34所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述LLO的N末端片段包含SEQ IDNO:59中所示的序列。
36.如权利要求22至35中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸被可操作地整合至李斯特菌基因组中。
37.如权利要求22至35中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式。
38.如权利要求22至37中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸不赋予所述重组李斯特菌属菌株抗生素抗性。
39.如权利要求22至38中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是营养缺陷型减毒李斯特菌属菌株。
40.如权利要求39所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述减毒李斯特菌属菌株在一个或多个内源基因中包含将所述一个或多个内源基因灭活的突变。
41.如权利要求40所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含prfA。
42.如权利要求40所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA。
43.如权利要求40所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA和inlB。
44.如权利要求40所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述一个或多个内源基因包含actA、dal和dat。
45.如权利要求22至44中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述核酸包含编码代谢酶的第二开放阅读框。
46.如权利要求45所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶。
47.如权利要求22至46中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述融合多肽由hly启动子表达。
48.如权利要求22至47中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是重组单增李斯特菌菌株。
49.如权利要求22至33中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是包含prfA的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式并且包含编码D133V PrfA突变蛋白的第二开放阅读框。
50.如权利要求22至33中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中所述重组李斯特菌属菌株是包含actA、dal和dat的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸呈附加型质粒形式并且包含编码丙氨酸消旋酶或D-氨基酸氨基转移酶的第二开放阅读框，并且其中所述含PEST肽是LLO的N末端片段。
51.如权利要求22至33中任一项所述的重组李斯特菌属菌株，其中重组李斯特菌属菌株是包含actA和inlB的缺失或灭活突变的减毒单增李斯特菌菌株，其中所述核酸被基因组整合，并且其中所述含PEST肽是ActA蛋白或其片段。
52.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求22至51中任一项所述的重组李斯特菌属菌株和佐剂。
53.如权利要求52所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括去毒李斯特菌溶血素O(dtLLO)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含未甲基化CpG的寡核苷酸。
54.一种诱导受试者对WT1表达肿瘤或癌症的免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用如权利要求22至51中任一项所述的重组李斯特菌属菌株或如权利要求52至53中任一项所述的免疫原性组合物。
55.一种预防或治疗受试者的WT1表达肿瘤或癌症的方法，其包括对所述受试者施用如权利要求22至51中任一项所述的重组李斯特菌属菌株或如权利要求52至53中任一项所述的免疫原性组合物。
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