定義
除非另外陳述，否則本說明書及申請專利範圍中所用之下列術語具有下文所陳述之下列含義。 本文所提及之「阿維魯單抗」包含IgG1類型之抗PD-L1抗體，如在WO2013079174中根據其胺基酸序列所定義及如本專利申請案中根據其胺基酸序列及根據其轉譯後修飾所定義。本文所提及之「阿維魯單抗」可包含生物相似藥，例如可與WO2013079174中所揭示之胺基酸序列共有至少75%、適宜地至少80%、適宜地至少85%、適宜地至少90%、適宜地至少95%、適宜地至少96%、適宜地至少97%、適宜地至少98%或最適宜地至少99%之胺基酸序列一致性。或者或另外，本文所提及之「阿維魯單抗」可包含區別在於轉譯後修飾、尤其本文所揭示之醣基化模式之生物相似藥。 術語「生物相似藥」(亦稱為第二代生物製劑(follow-on biologics))在業內已眾所周知，且熟習此項技術者將易於瞭解何時將藥物物質視為阿維魯單抗之生物相似藥。術語「生物相似藥」通常用於闡述先前已經官方授予市場准入之「創新生物醫藥產品」(藥物物質係由活生物體製得或衍生自活生物體或經由重組DNA或受控基因表現方法製得之「生物製劑」)之後續形式(通常來自不同來源)。因生物製劑具有高度分子複雜性，且通常對製造製程之變化(例如若在其產生中使用不同細胞系)敏感，且因後續製造商通常不能獲知原始分子純系、細胞庫、關於發酵及純化製程之技術訣竅且並不瞭解活性藥物物質本身(僅創新者之商業化藥品)，故任何「生物相似藥」不可能與創新藥品嚴格相同。 在本文中，術語「緩衝液」或「緩衝溶液」係指通常包括酸(通常係弱酸，例如乙酸、檸檬酸、組胺酸之咪唑鎓形式)及其共軛鹼(例如乙酸鹽或檸檬酸鹽，例如乙酸鈉、檸檬酸鈉或組胺酸)之混合物或替代地鹼(通常係弱鹼，例如組胺酸)及其共軛酸(例如質子化組胺酸鹽)之混合物之水溶液。在添加少量強酸或強鹼時「緩衝溶液」之pH變化極輕微，此乃因「緩衝劑」賦予「緩衝效應」。 在本文中，「緩衝液系統」包括一或多種緩衝劑及/或其酸/鹼共軛物，且更適宜地包括一或多種緩衝劑及其酸/鹼共軛物，且最適宜地包括僅一種緩衝劑及其酸/鹼共軛物。除非另外陳述，否則本文關於「緩衝液系統」所規定之任何濃度(亦即緩衝液濃度)適宜地係指緩衝劑及/或其酸/鹼共軛物之組合濃度。換言之，本文關於「緩衝液系統」所規定之濃度適宜地係指所有相關緩衝物質(亦即彼此呈動態平衡之物質，例如檸檬酸鹽/檸檬酸)之組合濃度。因此，組胺酸緩衝液系統之給定濃度通常係指組胺酸及組胺酸之咪唑鎓形式之組合濃度。然而，在組胺酸之情形下，藉由參照組胺酸或其鹽之輸入量，該等濃度通常直接用於計算。包括相關緩衝液系統之組合物之整體pH通常反映每一相關緩衝物質之平衡濃度(亦即緩衝劑與其酸/鹼共軛物之平衡)。 在本文中，術語「緩衝劑」係指緩衝液或緩衝溶液之酸或鹼組分(通常係弱酸或弱鹼)。緩衝劑幫助將給定溶液之pH維持於預定值或其附近，且通常選擇緩衝劑以補充預定值。緩衝劑適宜地係產生期望緩衝效應之單一化合物，尤其在將該緩衝劑與適當量(端視預定期望pH)之其相應「酸/鹼共軛物」混合(及適宜地能夠與其進行質子交換)時，或在原位形成所需量之其相應「酸/鹼共軛物」時-此可藉由添加強酸或強鹼直至達到所需pH來達成。舉例而言，在乙酸鈉緩衝液系統中，可能開始時為乙酸鈉溶液(鹼性)，然後使用(例如)鹽酸酸化；或開始時為乙酸溶液(酸性)，添加氫氧化鈉或乙酸鈉直至達到期望 pH為止。 通常，「穩定劑」係指尤其在冷凍及/或凍乾及/或儲存期間(尤其在暴露於應力時)有助於維持生物醫藥藥物之結構完整性之組分。此穩定效應可源於各種原因，但通常該等穩定劑可用作減輕蛋白質變性之滲透物。如本文中所使用，穩定劑可為糖醇(例如肌醇、山梨醇)、二醣(例如蔗糖、麥芽糖)、單醣(例如右旋糖(D-葡萄糖))或不同形式之胺基酸離胺酸(例如離胺酸之單鹽酸鹽、乙酸鹽或單水合物)或鹽(例如氯化鈉)。 用作本發明之緩衝劑、抗氧化劑或表面活性劑之試劑不包含於本文所用之術語「穩定劑」之含義中，即使其可尤其展現穩定活性。 在本文中，術語「表面活性劑」係指表面活性試劑，較佳係非離子型表面活性劑。本文所用之表面活性劑之實例包含聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯(80)山梨醇酐單油酸酯，亦以商品名Tween 80習知)；聚乙二醇蓖麻油，例如聚乙二醇35蓖麻油，其係藉由使蓖麻油與環氧乙烷以1 : 35之莫耳比率進行反應來製得且亦以商品名Kolliphor ELP習知；或Kollidon 12PF或17PF，其係低分子量聚維酮(povidone) (聚乙烯基吡咯啶酮)，以CAS編號9003-39-8習知且具有略微不同之分子量(12PF: 2000-3000 g/mol, 17PF: 7000-11000 g/mol)。 用作本發明之緩衝劑、抗氧化劑或穩定劑之試劑不包含於本文所用之術語「表面活性劑」之含義中，即使其可尤其展現表面活性劑活性。 在本文中，術語「穩定」通常係指組分、通常活性物質或其組合物在貯藏/儲存期間之物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物穩定性。 在本文中，術語「抗氧化劑」係指能夠防止或減少擬在調配物中穩定之生物醫藥藥物之氧化之試劑。抗氧化劑包含自由基清除劑(例如抗壞血酸、BHT、亞硫酸鈉、對胺基苯甲酸、麩胱甘肽或沒食子酸丙酯)、螯合劑(例如EDTA或檸檬酸)或鏈終止劑(例如甲硫胺酸或N-乙醯基半胱胺酸)。 用作本發明之緩衝劑、穩定劑或表面活性劑之試劑不包含於本文所用之術語「抗氧化劑」之含義中，即使其可尤其展現抗氧化活性。 「稀釋劑」係構成任何液體醫藥組合物中各成分之平衡以使得(例如)重量百分比總計為100%之試劑。在本文中，液體醫藥組合物係水性醫藥組合物，從而本文所用之「稀釋劑」係水、較佳地注射用水(WFI)。 在本文中，術語「粒度」或「孔徑」分別係指給定顆粒或孔之最長尺寸之長度。可使用雷射粒度分析儀及/或電子顯微鏡(例如穿透式電子顯微鏡TEM或掃描電子顯微鏡SEM)來量測兩個大小。可使用實例中所概述之方案及設備來獲得顆粒計數(關於任何給定大小)，該顆粒計數係關於在顯微鏡下才可見的顆粒之顆粒計數。 在本文中，術語「約」係指熟習此技術領域者易知之各別值之常用誤差範圍。本文所提及之「約」某一值或參數包含(且闡述)涉及該值或參數本身之實施例。若有疑問或業內關於某一值或參數之誤差範圍並無公認常用理解，則「約」意指此值或參數之± 5%。 在本文中，針對關於聚醣種類所使用之術語「份額百分比」直接係指不同種類之數量。舉例而言，術語「以所有聚醣種類計，該FA2G1具有25% - 41%之份額」意指，在所分析50種具有100條重鏈之抗體分子中，25-41條重鏈將展現FA2G1醣基化模式。 應瞭解，所提及之「治療(treating或treatment)」包含預防以及緩解病狀之確立症狀。「治療(treating或treatment)」某一狀態、病症或病狀由此包含：(1)預防或延遲在可患有或易患該狀態、病症或病狀但尚未經歷或顯示該狀態、病症或病狀之臨床或亞臨床症狀之人類中出現所發生狀態、病症或病狀之臨床症狀，(2)抑制該狀態、病症或病狀，亦即阻止、減少或延遲疾病之發生或其復發(在維持治療情形下)或其至少一種臨床或亞臨床症狀，或(3)減輕或減弱該疾病，亦即使該狀態、病症或病狀或至少一種其臨床或亞臨床症狀消退。
水性抗 PD-L1 抗體調配物
在第一態樣中，本發明提供一種新穎水性醫藥抗體調配物，其包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至30 mg/mL且作為抗體； (ii)甘胺酸、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽-磷酸鹽或組胺酸，其濃度為5 mM至35 mM且作為緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽、單水合離胺酸、乙酸離胺酸、右旋糖、蔗糖、山梨醇或肌醇，其濃度為100 mM至320 mM且作為穩定劑； (iv)聚維酮、聚乙二醇蓖麻油或聚山梨醇酯，其濃度為0.25 mg/mL至0.75 mg/mL且作為表面活性劑； 其中該調配物不包括甲硫胺酸，且 另外其中該調配物具有3.8至5.2之pH。 在一較佳實施例中，調配物不包括任何抗氧化劑。 在一實施例中，該調配物中之阿維魯單抗之濃度為約10 mg/mL至約20 mg/mL。 在又一實施例中，該調配物中之甘胺酸、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽-磷酸鹽或組胺酸之濃度為約10 mM至約20 mM。 在其他實施例中，在該調配物中，離胺酸單鹽酸鹽之濃度為約140 mM至約280 mM，或該單水合離胺酸之濃度為約280 mM，或該乙酸離胺酸之濃度為約140 mM。 在又一實施例中，該調配物中之右旋糖、蔗糖、山梨醇或肌醇之濃度為約280 mM。 在又一實施例中，該調配物中之聚維酮、聚乙二醇蓖麻油或聚山梨醇酯肌醇之濃度為約0.5 mg/mL。 在一較佳實施例中，該調配物中之該聚維酮係具有CAS編號9003-39-8之低分子量聚乙烯基吡咯啶酮Kollidon 12PF或17PF。 在另一較佳實施例中，該聚乙二醇蓖麻油係聚乙二醇35蓖麻油。在又一較佳實施例中，該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。 在一更佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)甘胺酸，其濃度為5 mM至15 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽、右旋糖、蔗糖或山梨醇，其濃度為100 mM至320 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv) Kollidon 12PF、聚乙二醇35蓖麻油或聚山梨醇酯80，其濃度為0.25 mg/mL至0.75 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有3.8至4.6之pH，且不包括抗氧化劑。 在一等佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)琥珀酸鹽，其濃度為5 mM至15 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽、右旋糖、蔗糖或山梨醇，其濃度為100 mM至320 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv) Kollidon 12PF或聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為0.25 mg/mL至0.75 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有4.9至5.2之pH，且不包括抗氧化劑。 在一等佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)檸檬酸鹽-磷酸鹽，其濃度為10 mM至20 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽、右旋糖、蔗糖或山梨醇，其濃度為100 mM至320 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv) Kollidon 12PF或聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為0.25 mg/mL至0.75 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有3.8至4.7之pH，且不包括抗氧化劑。 在一等佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)甘胺酸，其濃度為約10 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽，其濃度為約140 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為約0.5 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有4.2至4.6之pH，且不包括抗氧化劑。 在一更佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)甘胺酸，其濃度為約10 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)乙酸離胺酸，其濃度為約140 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為約0.5 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有4.2至4.6之pH，且不包括抗氧化劑。 在一等佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)組胺酸，其濃度為約10 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)蔗糖，其濃度為約280 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv) Kollidon 12PF，其濃度為約0.5 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有4.8至5.2之pH，且不包括抗氧化劑。 在一等佳實施例中，新穎水性醫藥抗體調配物包括： (i)阿維魯單抗，其濃度為1 mg/mL至約20 mg/mL且作為抗體； (ii)琥珀酸鹽，其濃度為約10 mM且作為緩衝劑，且不包括任何其他緩衝劑； (iii)離胺酸單鹽酸鹽，其濃度為約140 mM且作為穩定劑，且不包括任何其他穩定劑； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為約0.5 mg/mL且作為表面活性劑，且不包括任何其他表面活性劑； 其中該調配物具有4.8至5.2之pH，且不包括抗氧化劑。 在上述實施例之一更佳實施例中，阿維魯單抗之濃度為約20 mg/ml。 在一甚至更佳實施例中，該調配物由以下組成： (i)阿維魯單抗，其濃度為20 mg/mL； (ii)甘胺酸，其濃度為10 mM； (iii)離胺酸單鹽酸鹽，其濃度為140 mM； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為0.5 mg/mL； (v) HCl或NaOH ，其用以調節pH； (vi)水(注射用)，其用作溶劑； 且具有4.4 (± 0.1)之pH； 或 (i)阿維魯單抗，其濃度為20 mg/mL； (ii)甘胺酸，其濃度為10 mM； (iii)乙酸離胺酸，其濃度為140 mM； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為0.5 mg/mL； (v) HCl或NaOH，其用以調節pH； (vi)水(注射用)，其用作溶劑； 且具有4.4 (± 0.1)之pH； 或 (i)阿維魯單抗，其濃度為20 mg/mL； (ii)組胺酸，其濃度為10 mM； (iii)蔗糖，其濃度為280 mM； (iv) Kollidon 12PF，其濃度為0.5 mg/mL； (v) HCl或NaOH，其用以調節pH； (vi)水(注射用)，其用作溶劑； 且具有5.0 (± 0.1)之pH； 或 (i)阿維魯單抗，其濃度為20 mg/mL； (ii)琥珀酸鹽，其濃度為10 mM； (iii)離胺酸單鹽酸鹽，其濃度為140 mM； (iv)聚乙二醇35蓖麻油，其濃度為0.5 mg/mL； (v) HCl或NaOH，其用以調節pH； (vi)水(注射用)，其用作溶劑； 且具有5.0 (± 0.1)之pH。 在另一較佳實施例中，調配物具有介於270 mOsm/kg與330 mOsm/kg之間之滲透壓。 在一實施例中，如上文所闡述調配物中之該阿維魯單抗具有圖1a (SEQ ID NO:1)或圖1b (SEQ ID NO:2)之重鏈序列、圖2之輕鏈序列(SEQ ID NO:3)，且在Asn300上帶有包括如主要聚醣種類FA2及FA2G1之醣基化，該等聚醣種類佔所有聚醣種類＞ 70%之總份額。 在一較佳實施例中，在阿維魯單抗醣基化中，以所有聚醣種類計，該FA2具有44% - 54%之份額，且該FA2G1具有25% - 41%之份額。 在一較佳實施例中，在阿維魯單抗醣基化中，以所有聚醣種類計，該FA2具有47% - 52%之份額，且該FA2G1具有29% - 37%之份額。 在一較佳實施例中，在阿維魯單抗醣基化中，以所有聚醣種類計，該FA2具有約49%之份額，且該FA2G1具有約30% -約35%之份額。 在一較佳實施例中，以所有聚醣種類計，阿維魯單抗醣基化進一步包括以下次要聚醣種類：A2，佔份額＜ 5%；A2G1，佔份額＜ 5%；A2G2，佔份額＜ 5%；及FA2G2，佔份額＜ 7%。 在一較佳實施例中，在阿維魯單抗醣基化中，以所有聚醣種類計，該A2具有3%-5%之份額，該A2G1具有＜ 4%之份額，該A2G2具有＜ 3%之份額，且該FA2G2具有5%-6%之份額。 在一較佳實施例中，在阿維魯單抗醣基化中，以所有聚醣種類計，該A2具有約3.5% -約4.5%之份額，該A2G1具有約0.5% -約3.5%之份額，該A2G2具有＜ 2.5%之份額，且該FA2G2具有約5.5%之份額。 在一實施例中，如上文所闡述調配物中之該阿維魯單抗具有圖1b之重鏈序列(SEQ ID NO:2)。 在一實施例中，如上文所闡述之阿維魯單抗調配物係用於靜脈內(IV)投與。
藥物遞送裝置
在第二態樣中，本發明提供包括如本文所定義液體醫藥組合物之藥物遞送裝置。適宜地，藥物遞送裝置包括醫藥組合物滯留於其內之室。適宜地，藥物遞送裝置係無菌的。 藥物遞送裝置可為小瓶、安瓿、注射器、注射筆(例如基本上納入注射器)或i.v. (靜脈內)袋。 非經腸、較佳地經由皮下注射、肌內注射、靜脈內注射或靜脈內輸注來投與水性醫藥調配物。最佳投與方式係靜脈內輸注。 在一較佳實施例中，藥物遞送裝置係含有如上文所闡述之調配物之小瓶。 在一更佳實施例中，該小瓶含有於10 mL溶液中之濃度為20 mg/mL之200 mg阿維魯單抗。 在一甚至更佳實施例中，小瓶係玻璃小瓶。
醫學治療
在第三態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其包括向患者投與如上文所闡述之調配物。 在一實施例中，擬治療癌症係選自非小細胞肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌、間皮瘤、默克爾細胞癌、胃癌或胃食道接合部癌、卵巢癌、乳癌、胸腺瘤、胃腺癌、腎上腺皮質癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎細胞癌、黑色素瘤及/或典型何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)。
製造方法
本發明亦提供製造如本文所定義之水性醫藥調配物之方法。該方法適宜地包括以任何視為適當之特定順序將形成水性醫藥調配物所需之任何相關組分混合至一起。熟習此項技術者可參照業內熟知之實例或技術來形成水性醫藥調配物(尤其用於經由注射器注射或靜脈內輸注者)。 該方法涉及首先製備不含阿維魯單抗之一些或所有組分(視情況與一些或所有稀釋劑一起)之預混合物(或預溶液)，且然後將阿維魯單抗本身(視情況與一些稀釋劑一起或預溶於其中)與該預混合物(或預溶液)混合以提供水性醫藥調配物或組合物，然後添加最終組分以得到最終水性醫藥調配物。較佳地，該方法涉及形成緩衝液系統、適宜地包括如本文所定義之緩衝劑之緩衝液系統。適宜地，在添加阿維魯單抗之前，在預混合物中形成緩衝液系統。可經由簡單混合緩衝劑(以製成品形式供應)與其酸/鹼共軛物(適宜地使用適當相對量以提供期望pH -此可由熟習此項技術者根據理論或實驗來測定)來形成緩衝液系統。在乙酸鹽緩衝液系統之情形下，此意指(例如)混合乙酸鈉與HCl或混合乙酸與NaOH或乙酸鹽。可藉由添加所需量之鹼或酸或一定量之緩衝劑或酸/鹼共軛物來謹慎調節最終水性醫藥調配物之預混合物之pH。 在某些實施例中，使緩衝劑及/或緩衝液系統預形成為單獨混合物，且經由緩衝液交換(例如使用滲濾直至達到相關濃度或滲透壓為止)將緩衝液系統轉移至水性醫藥調配物之前體(包括除緩衝劑及/或緩衝液系統外之一些或所有組分，適宜地包括阿維魯單抗且可能僅包括阿維魯單抗)中。然後可視需要添加其他賦形劑以產生最終液體醫藥組合物。可在存在所有組分之後或之前來調節pH。 在與其他組分混合之前，可將任何、一些或所有組分預溶於稀釋劑中或與其預混合。 可過濾最終水性醫藥調配物以適宜地去除微粒物質。適宜地，經由經定大小處於或低於1 μm、適宜地0.22 μm之過濾器來進行過濾。適宜地，經由PES過濾器或PVDF過濾器、適宜地使用0.22 μm PES過濾器來進行過濾。 熟習此項技術者熟知可如何使用水性醫藥調配物來製備靜脈內溶液，從而可經靜脈內投與抗體藥物物質。 靜脈內溶液之製備通常係由以下步驟組成：使用塑膠注射器(PP)及針自鹽水袋(例如0.9%或0.45%鹽水)抽出某一量之溶液，及使用水性醫藥調配物代替該溶液。所代替之溶液量取決於患者體重。
縮寫
ANOVA 方差分析 CD 圓偏光二色性 CE - SDS 毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉 cIEF 毛細管等電聚焦 DoE 實驗設計 DP 藥品 DS 藥物物質 FT 冷凍-解凍 HMW 較高分子量 LMW 低分子量 SE-HPLC 粒徑篩析高效液相層析 OD 光學密度 PES 聚醚碸 PVDF 聚二氟亞乙烯 RH 相對濕度 SE - HPLC 粒徑篩析高效層析 UV 紫外光 WFI 注射用水
實例 實例 1 - 阿維魯單抗之結構
1.1 一級結構 阿維魯單抗係具有兩個重鏈及兩個輕鏈分子之IgG。兩種鏈之胺基酸序列分別展示於圖1a (SEQ ID NO:1) / 1b (SEQ ID NO:2)及2 (SEQ ID NO:3)中。 1.2二級結構 使用LC-MS及MS/MS方法證實分子之完整鏈及蛋白質中之轉譯後修飾之存在。阿維魯單抗分子亞單元之二級結構展示於圖3中。 如藉由胰蛋白酶消化所獲得肽之UPLC-Q-TOF質譜所證實，二硫鍵Cys21-Cys96、Cys21-Cys90、Cys147-Cys203、Cys138-Cys197、Cys215-Cys223、Cys229-Cys229、Cys232-Cys232、Cys264-Cys324及Cys370-Cys428形成9種典型IgG鍵結模式。 1.3醣基化 該分子在重鏈之Asn300上含有一個N-醣基化位點。如藉由肽定位所測定，藉由MALDI-TOF鑑別之主要結構係具有零(G0F)、一(G1F)或兩個半乳糖(G2F)殘基之複合二分枝型核心岩藻糖基化寡醣。主要種類係G0F及G1F。 藉由HILIC-UPLC-ESI-Q-TOF分析經2-胺基苯甲醯胺螢光標記之阿維魯單抗聚醣。圖4展示所發現聚醣種類之UPLC特徵。 表1：2AB HILIC-UPLC層析圖之峰鑑別
代表聚醣結構單元之幾何形狀對應於下列分子實體：
Man：甘露糖，Fuc：岩藻糖，Gal：半乳糖，GalNAc：N-乙醯基半乳糖胺，NANA：唾液酸 所用聚醣命名遵循牛津記法(Oxford Notation)，如由Harvey等人(Proteomics 2009, 9, 3796-3801)所提出。在含有岩藻糖(FA2、FA2G1、FA2G2)之種類中，Fuc-GlcNAc連結性為α1-6。在具有末端GlcNAc之種類中，GlcNAc-Man連結性為β1-2。在含有半乳糖之種類中，Gal-GlcNAc連結性為β1-4。 已對所報告層析特徵進行積分且產生如表2a中所展示之阿維魯單抗之聚醣種類分佈。 表2a
** 可能係甘露糖5與二分枝單-半乳糖基化種類之共洗脫物 聚醣定位分析證實了藉由肽定位(其容許鑑別兩種主要聚醣種類)實施之鑑別，另外，亦藉由此方法來表徵對於聚醣分析具有特異性之二級及次要種類。 在另一量測中，觀察到下列聚醣種類分佈。 表2b：
實例 2 - DoE 篩選
20 mg/mL阿維魯單抗下之實驗設計篩選評價若干因素(例如不同緩衝液類型/pH、穩定劑、表面活性劑類型及相關濃度)之影響。該研究測試80種不同調配物且選擇可最大化蛋白質穩定性之適宜條件。 在此DoE中檢驗以下4種涵蓋不同緩衝液類型及有效pH緩衝範圍之不同緩衝液： 胺基酸緩衝液，例如甘胺酸(有效pH為4.0至7.5)及組胺酸(有效pH為5.0至6.6)。 螯合離子緩衝液，例如檸檬酸鹽(有效pH為4.0至7.5)。 琥珀酸鹽(有效pH為5.0至6.0)。 在DoE中基於化學結構選擇7種穩定劑。在DoE中包含糖、多元醇、鹽及胺基酸。細分如下： 糖：選擇二醣蔗糖及麥芽糖以及單醣右旋糖(D-葡萄糖)。 糖醇：選擇兩種糖醇/多元醇用於DoE -山梨醇及肌醇。 鹽：在此DoE中探究作為單獨穩定劑之氯化鈉。 胺基酸：探究離胺酸，其係帶正電胺基酸。 表3列示試樣及其各別組成。
表 3 ： DoE 篩選調配物
表4列示在此DoE篩選框架中所實施及呈現於本文中之分析測試(短期穩定性、機械應力、曝光、F/T)。 表4 針對DoE篩選調配物實施之分析組
(1) 2100生物分析儀(Agilent) 2.1用於測定穩定性之方法
熱穩定性
在40±2℃ (75% R.H.)下儲存4週之後針對下列方面檢驗調配物之熱穩定性： ‧ 聚集指數：藉由光學密度計算以追蹤HMW雜質之聚集及形成 ‧ 目測檢查可視顆粒之存在 ‧ 藉由SE - HPLC測定HMW含量(以追蹤聚集) ‧ 藉由生物分析儀測定LMW含量(以追蹤片段化)
光應力
將調配物曝光於滿足ICHQ1B導則要求且強度為765 W/m
2
之光7小時。藉由下列技術分析調配物： ‧ 聚集指數：藉由OD計算，其量測源自光應力之聚集物形成程度 ‧ 目測檢查：測定源自聚集之可見顆粒之存在 ‧ CE-SDS：測定LMW雜質之產生，其亦指示HMW雜質 ‧ SE-HPLC：量化源自聚集之HMW雜質 ‧ cIEF：提供對電荷變體之相對量之理解，可監測氧化(光應力之副產物)
機械應力
機械(振盪)應力通常與聚集物產生有關，而聚集物產生係源於蛋白質在溶液中之疏水性區域中之蛋白質自我締合及相互作用。在200 rpm及室溫下攪拌24小時之後檢驗此研究中之DoE調配物之振盪應力抗性。如下所述來分析振盪應力調配物： ‧ 聚集指數：藉由光學密度計算以追蹤HMW雜質之聚集及形成 ‧ 目測檢查可視顆粒之存在 ‧ 藉由SE-HPLC測定HMW含量(以追蹤HMW雜質生成且由此監測聚集) ‧ 藉由生物分析儀測定LMW含量(以追蹤片段化)
冷凍 / 解凍應力
在蛋白質調配物發生冷凍時，隨著溶液內之微區域開始固化，形成界面。在該等微環境中，隨著調配物緩衝液之不同組分進出正固化之液體基質，存在極性變化。最終，隨著親水性/疏水性相互作用施加於該等改變微環境中之分子上，蛋白質發生沈澱。為確定各種穩定劑及表面活性劑在DoE中之有效性，將試樣暴露於三個冷凍-解凍循環。然後藉由下列分析檢驗試樣以測定其對於源於冷凍-解凍之沈澱/聚集/降解之抗性： ‧ 聚集指數：藉由光學密度計算以追蹤HMW雜質之聚集及形成 ‧ 目測檢查可視顆粒之存在 ‧ 藉由SE-HPLC測定HMW含量(以追蹤HMW雜質生成且由此監測聚集) 2.2製造組合物之藥物物質材料：藉由切向流過濾(使用Pellicon XL Cassette Biomax，PES中之截止分子量為10 KDa)在三種緩衝液中平衡20.6 mg/mL阿維魯單抗、51 mg/mL D-甘露醇、0.6 mg/mL冰乙酸(pH 5.2) (不含表面活性劑)： - 10 mM檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH 5.2， - 10 mM甘胺酸，pH 5.2， - 10 mM組胺酸，pH 5.2， - 10 mM琥珀酸鹽，pH 5.2。 使用上文所提及DS於4種相關緩衝液中之一者中之5倍稀釋液實施緩衝液交換且平衡/濃縮直至獲得初始體積為止。將此操作重複三次。在製造調配物之前，藉由OD測試4種平衡藥物物質材料之蛋白質含量。
調配物 1-21 ( 於檸檬酸鹽 - 磷酸鹽緩衝液中 )
將所交換DS材料(26.4 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(30.30克)中。若需要，則藉由添加二水合磷酸氫二鈉及單水合檸檬酸來調節緩衝液之濃度(交換DS之起始莫耳濃度：10 mM；DoE調配物中之莫耳濃度範圍：10 - 50 mM)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下穩定劑：山梨醇(2.04克)或右旋糖(2.02 g)或肌醇(2.02 g)或單水合麥芽糖(4.04 g)或離胺酸單鹽酸鹽(2.02 g)或氯化鈉(0.327 g)或蔗糖(3.83 g)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.4 mL 50 mg/mL Tween 40儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Tween 80儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液或20 mg Kollidon 12PF (無需儲備溶液)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀正磷酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(40 g)。
調配物 22-31 ( 於甘胺酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(24.5 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(30.65 g)中。若需要，則藉由添加甘胺酸來調節緩衝液之濃度(交換DS之起始莫耳濃度：10 mM；DoE調配物中之莫耳濃度範圍：10 - 50 mM)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下穩定劑：山梨醇(2.04 g)或右旋糖(2.02 g)或肌醇(2.02 g)或單水合麥芽糖(4.04 g)或離胺酸單鹽酸鹽(2.02 g)或氯化鈉(0.327 g)或蔗糖(3.83 g)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.4 mL 50 mg/mL Tween 40儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Tween 80儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液或20 mg Kollidon 12PF (無需儲備溶液)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(40 g)。
調配物 32-43 ( 於甘胺酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(23.2 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(34.48 g)中。若需要，則藉由添加甘胺酸來調節緩衝液之濃度(交換DS之起始莫耳濃度：10 mM；DoE調配物中之莫耳濃度範圍：10 - 50 mM)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下穩定劑：山梨醇(2.04 g)或右旋糖(2.02 g)或肌醇(2.02 g)或單水合麥芽糖(4.04 g)或離胺酸單鹽酸鹽(2.02 g)或氯化鈉(0.327 g)或蔗糖(3.83 g)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.4 mL 50 mg/mL Tween 40儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Tween 80儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液或20 mg Kollidon 12PF (無需儲備溶液)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(40 g)。
調配物 64-80 ( 於琥珀酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(22.5 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(35.55克)中。若需要，則藉由添加琥珀酸來調節緩衝液之濃度(交換DS之起始莫耳濃度：10 mM；DoE調配物中之莫耳濃度範圍：10 - 50 mM)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下穩定劑：山梨醇(2.04 g)或右旋糖(2.02 g)或肌醇(2.02 g)或單水合麥芽糖(4.04 g)或離胺酸單鹽酸鹽(2.02 g)或氯化鈉(0.327 g)或蔗糖(3.83 g)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.4 mL 50 mg/mL Tween 40儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Tween 80儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液或20 mg Kollidon 12PF (無需儲備溶液)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(40克)。
調配物 44-63 ( 於組胺酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(24.4 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(32.80 g)中。若需要，則藉由添加組胺酸來調節緩衝液之濃度(交換DS之起始莫耳濃度：10 mM；DoE調配物中之莫耳濃度範圍：10 - 50 mM)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下穩定劑：山梨醇(2.04 g)或右旋糖(2.02 g)或肌醇(2.02 g)或單水合麥芽糖(4.04 g)或離胺酸單鹽酸鹽(2.02 g)或氯化鈉(0.327 g)或蔗糖(3.83 g)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.4 mL 50 mg/mL Tween 40儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Tween 80儲備液或0.4 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液或20 mg Kollidon 12PF (無需儲備溶液)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(40克)。
過濾及填充
經由組裝於50 mL注射器上之0.22微米過濾器(Millex GP 0.22 μm Express PES膜或Millex GV 0.22 μm Durapore PVDF膜)來過濾每一調配物。然後將經過濾溶液填充於相關容器中(2 mL/容器)。 2.3結果
在製造時藉由 OD 檢查蛋白質含量
在時間0 (在製造時)藉由OD測定蛋白質含量。發現與預期目標(20 mg/mL)一致之值。 2.3.1熱應力
藉由 OD 測得之聚集指數
藉由OD測定聚集指數。關於使用聚集指數作為工具來檢測不能由SE-HPLC檢測到之在顯微鏡下才可見的顆粒/較大聚集物之其他資訊提供於附件(Annex)部分中。 已發現，組胺酸緩衝液通常使得在經受應力後聚集指數具有較高增加(亦即顆粒之增加較大)，且在將pH自5.0增加至6.6時最為顯著(pH依賴性效應)。 在其他緩衝液中，聚集指數之變化通常較低，由此指示在顯微鏡下才可見的顆粒之增加較低。 在調配於檸檬酸鹽-磷酸鹽及甘胺酸緩衝液中之一些(少數)試樣中觀察到之聚集指數增加並不直接歸因於特定因素(例如穩定劑或表面活性劑類型)。 在統計學上藉由ANOVA針對反應表面線性模型(Response Surface Linear Model)來評估數據，其提供下列結果： 緩衝液類型、濃度及pH之統計學顯著影響(其p值皆＜ 0.001)：為最小化聚集指數，應靶向低緩衝液濃度(10 mM)，且使用低pH範圍檸檬酸鹽-磷酸鹽(4.0 - 5.0)及甘胺酸(4.0 - 5.8)及琥珀酸鹽(5.0 - 5.5)，而組胺酸通常對在顯微鏡下才可見的顆粒/較大聚集物形成會產生負面影響。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
藉由SE - HPLC在時間0且在熱應力下測定總聚集物(HMW)。檸檬酸鹽-磷酸鹽所產生之聚集通常高於參考調配物(參考臨限值在圖表中突出顯示為紅色水平條)，最特定而言在pH增加時如此。在甘胺酸緩衝液中，低pH範圍較佳(低於5.0)，較高pH值涉及較高聚集(類似於在使用檸檬酸鹽-緩衝液時)。琥珀酸鹽通常在所有條件下皆產生高於參考之聚集值，而組胺酸緩衝液在低pH (5.0 - 5.5)下似乎提供相當於參考之聚集值。 亦在統計學上藉由ANOVA針對反應表面線性模型來評估數據且已證實緩衝液類型係顯著因子(p值= 0.02)。 總而言之，為減少熱應力下之聚集物，檸檬酸鹽-磷酸鹽(pH範圍為4.0 - 5.0)、甘胺酸(pH範圍為4.0 - 6.8)及組胺酸(pH範圍為5.0 - 5.8)應優於琥珀酸鹽緩衝液。 如存在於2號調配物(於pH 4.0檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之Tween 40 +右旋糖)、22號調配物(於pH 4.0甘胺酸緩衝液中之Kollidon 12PF +氯化鈉)及28號調配物(於pH 4.5甘胺酸緩衝液中之Tween 40 +氯化鈉)中之組合似乎不利於蛋白質穩定化(儘管施加最佳pH/緩衝液條件，但聚集顯著增加)，此可能係由於具有低pH (約4.0 - 4.5)/相互作用之Kollidon 12PF及Tween 40與特定穩定劑(如氯化鈉)不相容。
藉由生物分析儀測得之片段
藉由生物分析儀來評價片段化程度。儘管藉由ANOVA評估不能突出顯示統計學顯著之結果，但可突出顯示最有效地最小化提供與參考組合物一致之LMW百分比之片段化之條件： - 檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液，pH範圍為4.5 - 7.0 - 甘胺酸緩衝液，pH範圍為4.0 - 5.8。 考慮到方法之可變性(在應用生物分析儀時，通常最高為± 2 - 3%之LMW)，據觀察，其他條件(如組胺酸及琥珀酸鹽緩衝液中之剩餘組合物)維持LMW %相對較低且由此值得進一步探究。
藉由目測檢查 測得之 可見顆粒
在熱應力之前及之後藉由目測檢查來評價可見顆粒之存在。檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之不同條件可在熱應力後使得存在可見顆粒(最通常微粒 -如懸浮液)。 在甘胺酸緩衝液中，顆粒形成最通常與Tween種類之存在有關(23、24、26、28號試樣含有Tween 40且30號調配物含有Tween 80)。甘胺酸緩衝液中之其他調配物(32號至39號試樣)展示在時間0時存在顆粒且往往在應力後減少(可能係可逆簇)。 在組胺酸中，Tween種類通常在應力後涉及形成可見顆粒(所有在應力之後展示可見顆粒之調配物皆含有兩種Tween替代物中之一者)。 在琥珀酸鹽緩衝液中，已發現，在時間0時於大部分調配物中觀察到之顆粒在熱應力後皆有所減少(可能由於可逆締合隨時間而破壞)。
匯總 ： 熱應力
根據熱應力下之SE - HPLC、OD及生物分析儀結果，可提供有益性能之條件包含： - 緩衝液：檸檬酸鹽-磷酸鹽或甘胺酸(較佳地在更具酸性之pH下及最相關地在4.0 - 5.0 (對於檸檬酸鹽-磷酸鹽)及4.0 - 5.8 (對於甘胺酸)之範圍內)， - 緩衝液濃度：較佳地較低(根據聚集指數結果)， - 穩定劑：未獲得特定指示， - 表面活性劑：據觀察，Kolliphor ELP可有效減少在顯微鏡下才可見的顆粒。 2.3.2光應力
藉由 O.D. 測得之聚集指數
已發現，大部分DoE組合物在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之聚集指數高於參考調配物(在較高pH範圍中最為顯著)。亦在甘胺酸緩衝液中證實pH效應，然而已發現，聚集指數遠低於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(在pH範圍4.0 - 4.5內，突出顯示與參考組合物相當或較低之值)。組胺酸以及琥珀酸鹽緩衝液通常可導致聚集指數大大增加(組胺酸明顯差於琥珀酸鹽)。 藉由ANOVA實施之統計學分析證實了來自緩衝液類型、pH及濃度之顯著影響(p值＜ 0.0001)，從而指示最小化顆粒形成之最佳條件包含利用檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(在4.0 - 5.0範圍內及低緩衝液濃度下)、甘胺酸(在4.0 - 5.8範圍內)。 亦觀察到表面活性劑對穩定性具有一定影響，其中Kolliphor ELP係在旨在減少顆粒時所考慮之最佳選擇。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
藉由SE - HPLC在時間0且在光應力後測定總聚集物(HMW)。檸檬酸鹽-磷酸鹽通常產生高於參考調配物之聚集，最尤其在pH增加時。在甘胺酸緩衝液中，低pH範圍較佳(低於4.8)，較高pH值涉及較高聚集(類似於在使用檸檬酸鹽-緩衝液時)。琥珀酸鹽通常在所有條件下皆產生高於參考之聚集值，而組胺酸緩衝液(除少數例外之外之所有範圍)似乎提供與參考相當之聚集值。 亦在統計學上藉由ANOVA針對反應表面線性模型來評估數據且已證實緩衝液類型及pH係顯著因子(p值＜ 0.0001)。 總而言之，為減少熱應力下之聚集物，甘胺酸(pH範圍為4.0 - 5.0)及組胺酸(pH範圍為5.0 - 6.0)應優於琥珀酸鹽及檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。 重要的是，穩定劑(如離胺酸、右旋糖、山梨醇及蔗糖)針對光應力所提供之穩定化優於氯化鈉、麥芽糖及肌醇(p值＜ 0.01)。
藉由 CE - SDS 測得之純度
如藉由CE - SDS測得之純度傳達HMW及LMW種類之資訊，此乃因其係以下計算結果：100 - HMW % (藉由CE - SDS) - LMW % (藉由CE - SDS)。 在光應力之前及之後測定純度值。 大部分調配物在光應力後展示高於參考組合物之純度。可負面影響穩定性之條件通常係：在高pH (＞7.0)下之檸檬酸鹽-磷酸鹽及在低pH (4.0)下之甘胺酸緩衝液；最可能使用在低pH下來自Tween 40 / Kollidon 12PF之負面影響來闡釋後者。 發現組胺酸可正面影響純度，從而最大化針對曝光之調配物性能。 藉由ANOVA進行之統計學分析證實了與利用組胺酸作為緩衝液有關之優良行為，其中在使用檸檬酸鹽-磷酸鹽、甘胺酸或琥珀酸鹽緩衝液時獲得相當之性能。
藉由 cIEF 測得之同種型特徵
在時間0時及在曝光之後測定同種型特徵。曝光通常因光氧化現象而導致酸性同種型增加。計算所有DoE調配物之該增加。 若干條件有益於蛋白質穩定化(亦即同種型特徵之變化較低)，例如檸檬酸鹽-磷酸鹽及甘胺酸緩衝液(最通常在較低pH範圍內)。在使用組胺酸作為調配物緩衝液時，觀察到較低性能。 藉由ANOVA針對反應表面線性模型所評估之數據證實了上述內容(緩衝液類型係統計學顯著因子且p值＜ 0.0001)。 統計學分析亦證實在使用L-離胺酸作為穩定劑時具有正面影響(酸性同種型變化減小)。在觀察發現於11、29、31、38號調配物中之變化時，該效應極為明顯，該等遠低於使用替代穩定劑之周圍調配物空間中之彼等變化。
藉由目測檢查測得之可見顆粒
在光應力之前及之後藉由目測檢查來評價可見顆粒之存在。就可見顆粒而言，大部分調配物不受光應力影響。並無特定條件與光應力後之顆粒形成相關。
匯總 ： 曝光應力
根據光應力後之SE - HPLC、OD、CE - SDS、cIEF及目測檢查，可提供有益性能之條件包含： - 緩衝液：甘胺酸緩衝液(較佳地在更具酸性之pH下及最相關地在4.0 - 4.5範圍內)， - 緩衝液濃度：較佳地較低(根據聚集指數結果)， - 穩定劑：離胺酸(單鹽酸鹽)、右旋糖及山梨醇對蛋白質穩定性展示正面影響 - 表面活性劑：據觀察，Kolliphor ELP可有效減少在顯微鏡下才可見的顆粒 2.3.3冷凍-解凍
藉由光學密度測得之聚集指數
在3次冷凍-解凍循環(-80℃ →室溫)之後，再次證實，甘胺酸緩衝液(低pH)提供意指會形成較少顆粒之最低數值。當pH增加，在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液及甘胺酸緩衝液兩者中所觀察到聚集指數會增加(檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之pH效應更加顯著)。通常，在組胺酸及琥珀酸鹽緩衝液中可觀察到高於參考組合物之聚集指數值。 藉由ANOVA進行之統計學分析明確顯示因緩衝液類型、pH及表面活性劑類型之中等顯著影響(0.01 ＜ p值＜ 0.05)，此顯示pH低於6.0之檸檬酸鹽-磷酸鹽及甘胺酸緩衝液係對抗因冷凍-解凍誘導之顆粒形成以用於蛋白質穩定化之最佳選擇，其中琥珀酸鹽及組胺酸緩衝液略差於參考組合物。 比較不同表面活性劑之影響顯示，Tween 80、Kollidon 12PF及Kolliphor ELP (略佳)之性能相當，而Tween 40預計會增加聚集指數。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
在冷凍-解凍應力後，所有調配物皆展示少於參考組合物之總聚集物(相當於時間0之值)。 在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中，聚集物在當pH增加至7.0 - 7.5範圍之主要效應而冷凍-藉凍變化極小/可忽略時會有增加至參考組合物之程度的趨勢 (2.0 - 2.5% HMW)，而在pH ＜ 7.0下總聚集物通常總計係低於1.5% (在應力之前及之後)。 在甘胺酸及組胺酸緩衝液中，在應力之後之所有總聚集物值總計小於1% (與時間0之值相當)。在琥珀酸鹽中，未發現冷凍-解凍相對於時間0會產生顯著變化，然而，總聚集物通常略高於甘胺酸及組胺酸(仍等於或低於1.5%，亦即遠低於在應力之後之參考)。 統計學分析證實，緩衝液類型及pH之顯著影響(p值＜ 0.0001)，其中檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(pH 4.0 - 6.0)、甘胺酸緩衝液(pH 4.0 - 7.0)及組胺酸(5.0 - 6.6)係對抗冷凍-解凍以用於蛋白質穩定化之最佳選擇。 亦明確顯示穩定劑類型因子之顯著影響(p值＜ 0.01)：離胺酸鹽酸鹽最小化時間0聚集及與冷凍-解凍應力相關之效應(參照於檸檬酸鹽緩衝液中之6-9-11-17號試樣)；類似地，蔗糖及右旋糖亦展示穩定性質。
藉由目測檢查測得之可見顆粒
在冷凍-解凍時之目測檢查之結果中，可突出顯示下列一般趨勢： - 在檸檬酸鹽-磷酸鹽中，在較高 pH下很可能形成顆粒， - 在低pH (＜ 5)下之甘胺酸緩衝液中，顆粒形成主要與Tween 40 (去穩定表面活性劑)之存在相關， - 在組胺酸緩衝液中，Tween種類通常與顆粒形成相關， - 在琥珀酸鹽中，似乎並無特定因子與顆粒形成相關，然而，在使用此緩衝液時頻繁發生顆粒形成。
匯總 ： 冷凍 - 解凍應力
根據在3次冷凍-解凍循環(-80℃ →室溫)後之SE - HPLC、OD及目測檢查，可提供有益改良性能之條件包含： - 緩衝液：甘胺酸或檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(較佳地在更具酸性之pH下及最相關地在4.0 - 6.0範圍內)， - 穩定劑：離胺酸(單鹽酸鹽)、右旋糖及蔗糖對蛋白質穩定性展示正面影響(藉由SE - HPLC測得總聚集物減少)， - 表面活性劑：應考慮Tween種類與甘胺酸及組胺酸緩衝調配物之不相容性並加以避免以最小化可見顆粒形成。 2.3.4機械應力
藉由光學密度測得之聚集指數
如先前所展示，使聚集指數值最類似於參考(亦即相對於時間0之增加最小或並不增加)之因子如下： 檸檬酸鹽-磷酸鹽通常產生高於參考之聚集指數值，最尤其在pH增加及存在Tween種類時：2號試樣(Tween 40)、8號試樣(Tween 80)、11號試樣(Tween 40)、19號試樣(Tween 40)、21號試樣(Tween 40)。 甘胺酸在低pH範圍內提供突出之穩定效應(聚集指數值略低於參考)。 組胺酸緩衝液較佳係在接近5.0之pH值及不存在Tween 40及Tween 80下使用，Tween 40及Tween 80似乎與最高聚集指數值相關：50號試樣(Tween 40)、60號試樣(Tween 80)、62號試樣(Tween 40)。 琥珀酸鹽通常產生略高於參考組合物之聚集指數值，不論涉及何種特定因子。 藉由ANOVA證實上述結果，該等結果指示緩衝液類型及pH係統計學顯著因子(p值＜ 0.01)且表面活性劑係中等顯著因子(0.01 ＜ p值＜ 0.05)。 低pH (4.0 - 5.5)下之甘胺酸緩衝液突出顯示為可最小化聚集指數之所選緩衝液。藉由表面反應模型證實，Tween種類往往增加聚集指數(Tween 40差於Tween 80)。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
在大部分調配物中皆觀察到相對於時間0之最小增加，從而指示此類應力具有較小影響。關於總聚集物之差異似乎係緩衝液類型及pH之主要效應，如已突出顯示。 藉由ANOVA證實緩衝液類型及pH (p值＜ 0.0001)以及緩衝液濃度(p值＜ 0.01)及穩定劑類型(0.01 ＜ p值＜ 0.05)係統計學顯著因子。 用以將聚集物最小化至參考組合物程度(＜ 1%)之較佳範圍及條件包含：檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(pH ＜ 5及低離子強度)；甘胺酸緩衝液(全部pH及離子強度範圍)；組胺酸緩衝液(全部範圍)及琥珀酸鹽緩衝液(pH 5.0 - 5.5及低離子強度)。較佳穩定劑係L-離胺酸單鹽酸鹽、麥芽糖、蔗糖及右旋糖。
藉由生物分析儀測得之片段
除22-23-24號試樣(在甘胺酸緩衝液中，pH 4.0，含有Tween 40或Kollidon 12PF)外，剩餘調配物皆在機械應力下展示相當於或低於參考組合物之LMW %，亦應考慮此方法之可變性(LMW %結果之± 2-3%較具特徵性)。因此，可推斷出，所測試大部分條件可幫助改良蛋白質之抗片段化性，條件係應避免諸如甘胺酸緩衝液(低pH) + Tween 40等組合。 統計學詳述突出顯示於琥珀酸鹽及組胺酸緩衝液中之調配物之較佳性能，然而，因上述方法可變性，應謹慎考慮該等性能且將其評估為實質上相當於/略優於於檸檬酸鹽-磷酸鹽及甘胺酸緩衝液中之其他調配物。
藉由目測檢查測得之可見顆粒
在冷凍-解凍時之目測檢查之結果中，可突出顯示下列一般趨勢： - 在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(1 - 21號試樣)中，顆粒形成發生於幾乎所有條件下，不論涉及何種特定因子， - 在甘胺酸緩衝液中，顆粒形成主要與Tween 40 (23、26、28號試樣)及Kollidon 12PF (22、32、37、43號調配物)之存在相關 - 在組胺酸緩衝液中，所有在機械振盪後展示增加之可見顆粒之調配物皆含有Tween 40或Tween 80， - 在琥珀酸鹽中，似乎並無特定因子與顆粒形成相關。
匯總 ： 機械應力
根據機械振盪後之SE - HPLC、OD、生物分析儀及目測檢查，可提供相對於參考組合物之有益性能之條件包含： - 緩衝液：甘胺酸(較佳地在更具酸性之pH下及最相關地在4.0 - 5.5範圍內)、組胺酸及琥珀酸鹽(pH約為5.0)。 - 穩定劑：離胺酸(單鹽酸鹽)、蔗糖、麥芽糖及右旋糖對蛋白質穩定性展示正面影響(藉由SE - HPLC測得總聚集物減少)， - 表面活性劑：應考慮Tween種類與甘胺酸、檸檬酸鹽-磷酸鹽及組胺酸緩衝調配物之不相容性並加以避免以最小化可見顆粒形成。
實例 3 - 調配物最佳化
3.1調配物最佳化組合實例2中所展示之數據以鑑別可適宜地針對熱、冷凍-解凍、機械及光應力穩定阿維魯單抗之調配物空間(評估因子：緩衝液類型、pH及濃度、穩定劑類型及表面活性劑)。 使用下列準則 ‧ 最小化在熱應力、機械振盪、冷凍-解凍及光應力之後之HMW (藉由SE - HPLC)， ‧ 最小化在熱應力及機械振盪之後之LMW (藉由生物分析儀)， ‧ 最大化在光應力之後之純度(藉由CE-SDS)， ‧ 最小化在光應力之後之酸性同種型(藉由cIEF)變化， ‧ 在熱應力、機械振盪、冷凍-解凍及光應力之後之目標聚集指數值(藉由OD)低於2， 對於每一緩衝液類型而言，如表5中所展示外推10種最有前景之調配物。 表5： 候選調配物(DoE外推)
3.2擬進一步評價之主要調配物 在表5之調配物中，表6中所列示之11種調配物似乎最具前景。因此，製造該等調配物並在熱應力及重複冷凍-解凍循環後根據表7中所展示之分析組進行評估。 選擇熱應力作為評估調配物性能且可能預測冷凍條件下之穩定性之最相關應力條件。亦考慮冷凍-解凍以預測任何與溫度偏移/預調配DS材料之儲存相關之問題。 針對該等調配物所實施之實驗之結果闡述於下列段落中。 表6： 源自DoE之主要調配物
表7： 針對主要調配物實施之分析組
3.3源自DoE步驟之主要調配物之製造 組合物之藥物物質材料：藉由切向流過濾(使用Pellicon XL Cassette Biomax，PES中之截止分子量為50 KDa)在三種緩衝液中平衡18.6 mg/mL阿維魯單抗、51 mg/mL D-甘露醇、0.6 mg/mL冰乙酸(pH 5.2) (不含表面活性劑)： 10 mM甘胺酸，pH 4.4， 10 mM組胺酸，pH 5.0， 15 mM檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH 4.2， 10 mM琥珀酸鹽，pH 5.0。 使用上文所提及DS於4種相關緩衝液中之一者中之5倍稀釋液實施緩衝液交換且平衡/濃縮直至獲得初始體積為止。將此操作重複三次。在製造調配物之前，藉由OD測試4種平衡藥物物質材料之蛋白質含量。
調配物 1-5 ( 於甘胺酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(21.8 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(64.2 g)中。然後添加以下穩定劑：離胺酸單鹽酸鹽(3.58克，用於DP1；或1.79 g，用於DP2)或單水合離胺酸(3.22克，用於DP3及DP5)或乙酸離胺酸(2.02 g，用於DP4)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.7 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液(於10 mM pH 4.4甘胺酸中，用於DP 1-2-3-4)或0.7 mL 50 mg/mL Tween 80 (於10 mM pH 4.1甘胺酸中，用於DP5)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(70 g)。
調配物 6-7 ( 於組胺酸緩衝液中 )
將所交換DS材料(23.2 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(60.3 g)中。然後添加以下穩定劑：右旋糖(3.53 g，用於DP6)或蔗糖(6.71 g，用於DP7)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.7 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備液(於10 mM pH 5.0組胺酸緩衝液中，用於DP6及DP7)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值(pH 5.0)。使用相關緩衝液(10 mM組胺酸緩衝液，pH 5.0)使溶液達到最終重量(70 g)。
調配物 8-9 ( 於檸檬酸鹽 - 磷酸鹽緩衝液中 )
將所交換DS材料(23.4 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(59.8 g)中。若需要(DP9)，則藉由添加檸檬酸(單水合物)及磷酸氫二鈉(二水合物)來調節緩衝液濃度。然後添加以下穩定劑：離胺酸單鹽酸鹽(1.79 g，用於DP8)或蔗糖(6.71 g，用於DP9)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：35 mg Kollidon 17PF (用於DP8及DP9)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀正磷酸或氫氧化鈉調節至目標值(pH 4.2，用於DP8；及pH 4.3，用於DP9)。使用相關緩衝液使溶液達到最終重量(70 g)。
調配物 10-11 ( 於琥珀酸鹽緩衝液中 )
將所交換DS材料(24.5 mg/mL)稱量至玻璃燒杯(57.1克)中。然後添加以下穩定劑：離胺酸單鹽酸鹽(1.79 g，用於DP10)或蔗糖(6.71 g，用於DP11)。攪拌溶液直至完全溶解。然後添加以下表面活性劑：0.7 mL 50 mg/mL Kolliphor ELP儲備溶液(於10 mM pH 5.0琥珀酸鹽緩衝液中) (DP10)或35 mg Kollidon 17PF (DP11)。攪拌溶液直至完全溶解。量測pH並使用稀鹽酸或氫氧化鈉調節至目標值(pH 5.0，用於DP10及DP11)。使用10 mM pH 5.0琥珀酸鹽緩衝液使該溶液達到最終重量(70 g)。 3.4結果 3.4.1熱應力
藉由 OD 測得之蛋白質含量 ：
相對於時間0在40℃下保持4週之後未觀察到顯著變化。
pH ：
時間0時之pH值與目標值一致。相對於時間0在40℃下保持4週之後未觀察到顯著變化。
藉由目測檢查測得之可見顆粒
發現所有調配物在時間0時皆不含可見顆粒。在應力後，一種調配物(DP6)展示存在顆粒(可能與調配物相關)。
藉由濁度測定法測得之濁度
大部分調配物之濁度值在澄清或輕微乳白色範圍內且在應力之後具有最小變化(DP 2-4-6-7-9-10-11)。其他調配物展示自輕微乳白色至乳白色範圍(DP1)之較高濁度變化或在時間0時即已展示乳白色範圍內之值，且在應力之後具有極小/可忽略變化(DP 3-8)。調配物DP5展示在應力之後濁度顯著增加(＞ 18 NTU)。
藉由不透光度測得之在顯微鏡下才可見的顆粒
≥ 25微米之顆粒遠低於600個顆粒/容器之藥典限值(通常＜ 100個顆粒)。 ≥ 10微米之顆粒具有略大計數，但仍低於6000個顆粒/容器之限值。在時間0時，於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之DP8及DP9展示高於其他者之計數(仍低於上述限值)，且在應力之後顯著減小。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
對於藉由SE - HPLC在時間0時及在熱應力之後測得之總聚集物而言，DP 1-2-3-4 (甘胺酸緩衝液)具有不同之穩定劑類型及量，但具有相同之緩衝液濃度、表面活性劑及pH：將離胺酸單鹽酸鹽自280 mM (DP1)減少至140 mM (DP2)似乎有益於蛋白質穩定性。在使用280 mM單水合離胺酸時(DP3)，可證實較高聚集速率。乙酸離胺酸(140 mM)提供類似於使用相同濃度之離胺酸單鹽酸鹽(DP2)之性能。 DP5 (甘胺酸緩衝液)展示聚集物顯著增加(可能因為280 mM單水合離胺酸+ Tween 80 (而非Kolliphor ELP)之不利組合)。 DP6-7 (組胺酸緩衝液)展示聚集物並無變化。 DP8-9 (檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液)：DP9中之蔗糖似乎係可相對於DP8 (離胺酸單水合物)顯著改良調配物性能之關鍵因子，其中其他成分/參數極為類似(相同緩衝液類型、相同表面活性劑及類似pH：4.2對4.3)。 DP10-11 (琥珀酸鹽緩衝液)：觀察到聚集並無顯著變化(單水合離胺酸及蔗糖在此緩衝液中具有類似性能)。
藉由生物分析儀測得之較低分子量
藉由生物分析儀在時間0時及在熱應力之後測得之片段： DP 1-2-3-4 (甘胺酸緩衝液)具有不同之穩定劑類型及量，但具有相同之緩衝液濃度、表面活性劑及pH：類似之片段增加(在應力之後+3-5%)。 DP5 (甘胺酸緩衝液)展示較低分子量種類顯著增加(可能因為280 mM單水合離胺酸+ Tween 80 (而非Kolliphor ELP)之不利組合)：在應力之後增加+13%。 DP6-7 (組胺酸緩衝液)展示並無片段變化。 DP8-9 (檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液)：DP9 (在應力之後+6%片段)中之蔗糖似乎係可相對於DP8 (離胺酸單水合物；+11%片段)顯著改良調配物性能之關鍵因子，其中其他成分/參數極為類似(相同緩衝液類型、相同表面活性劑及類似pH：4.2對4.3)。 DP10-11 (琥珀酸鹽緩衝液)：二者具有最小變化(單水合離胺酸及蔗糖在此緩衝液中具有類似性能)：在應力之後+1-3%較低分子量種類。
藉由 cIEF 測得之同種型特徵
在時間0時及在熱應力之後之同種型特徵：在熱應力下，所有試樣通常往往損失一部分主要種類，同時增加酸性種類且鹼性同種型發生微小變化。更詳細而言：DP 1-2-3-4-5 (甘胺酸緩衝液)：觀察到同種型特徵具有類似變化。對於5種試樣而言，主要種類減少約10-12% (酸性同種型增加14 - 17%且鹼性同種型減少-4/-6%)。 DP 6-7 (組胺酸緩衝液)：DP6展示同種型特徵發生重大變化且不能詳述所獲得特徵，此很可能係源於所選組分之不穩定性及/或在分析之前之試樣污染。DP7展示類似於甘胺酸緩衝液中之試樣之變化。 DP8-9 (檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液)：兩種調配物皆具有顯著變化且高於在其他緩衝液中所觀察者。發現在應力之後酸性種類增加至24 - 29%。 DP10-11 (琥珀酸鹽緩衝液)：DP10展示遠低於其他緩衝液中之其他試樣之最小變化：主要種類減少約7% (酸性同種型增加約12%且鹼性同種型減少約-5%)。DP11展示較高變化(酸性同種型在應力之後增加+20%)。
藉由圓偏光二色性測得之三級結構
在應力之前及之後對主要調配物運行圓偏光二色性分析。 使用WFI將試樣稀釋至1.5 mg/mL且然後在具有Jasco J-810分光偏振計之1 cm路徑長度石英比色皿中於250 nm - 320 nm範圍內以20 nm/min之掃描速度(靈敏度：標準；帶寬：1 mm；數據節距：0.2 nm；D.I.T.：8秒；複製4次)在室溫下進行測試。 大部分調配物中之蛋白質構形可有效保留，其中僅在260 - 280 nm區域內發生輕微變化(酪胺酸及苯丙胺酸信號)。然而，可觀察到少數例外，其中可發現可指示結構在熱應力後之部分破壞/去摺疊及損失之較顯著變化：DP5 (可能存在表面活性劑類型之效應)，DP8及DP 9 (檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之調配物；可能存在緩衝液類型及與其他成分之組合之效應)。 3.4.2冷凍-解凍
藉由目測檢查測得之可見顆粒
據觀察，重複FT循環未導致可見顆粒顯著增加。一些調配物在應力下呈現纖維樣顆粒(並非微粒/沈澱物或其他形成，通常與調配物相關)。
藉由濁度測定法測得之濁度
在冷凍-解凍時，在所測試調配物中未發生顯著變化。大部分調配物在時間0時及在應力之後係澄清或輕微乳白色(例外：DP3、5、8在時間0時在乳白色溶液範圍內，且在應力之後具有可忽略變化)。
藉由不透光度方法測得之在顯微鏡下才可見的顆粒
≥ 25微米之顆粒遠低於600個顆粒/容器之藥典限值(通常≤ 100個顆粒)。 ≥ 10微米之顆粒具有較大計數，但仍低於6000個顆粒/容器之限值。在時間0時，於檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之DP8及DP9展示高於其他者之計數(仍低於上述限值)，且在FT應力後並不進一步增加。
藉由 SE - HPLC 測得之總聚集物
在FT應力之前及之後藉由SE - HPLC測得之總聚集物中，所有調配物皆觀察到最小變化(在3個FT循環之後總聚集物增加0.2 - 0.5%)。 3.5結論 在甘胺酸緩衝液中，用於抗體穩定化之最適宜條件包含： 低離子強度(10 mM)， 低pH (4.0 - 4.4)， 離胺酸(單鹽酸鹽)、右旋糖、蔗糖及山梨醇，作為穩定劑， 較佳表面活性劑：Kolliphor ELP及Kollidon 12PF (因可見顆粒問題，可能避免使用Tween 80)。 在琥珀酸緩衝液中，用於抗體穩定化之最適宜條件包含： 低離子強度(10 mM)， pH 5.0 - 5.1 離胺酸(單鹽酸鹽)、右旋糖、蔗糖或山梨醇，作為穩定劑， 較佳表面活性劑：Kolliphor ELP及Kollidon 12PF (因可見顆粒問題，可能避免使用Tween 80)。 在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中，用於抗體穩定化之最適宜條件包含： 低離子強度(10 - 30 mM)， 低pH (4.0 - 4.5)， 離胺酸(單鹽酸鹽)、右旋糖、蔗糖或山梨醇，作為穩定劑， 較佳表面活性劑：Kolliphor ELP及Kollidon 12PF (因可見顆粒問題，可能避免使用Tween 80)。 在組胺酸緩衝液中，用於抗體穩定化之最適宜條件包含： 低離子強度(10 - 15 mM)， pH 5.0 - 5.1， 右旋糖、蔗糖、離胺酸(單鹽酸鹽)、肌醇、山梨醇，作為穩定劑， 較佳表面活性劑：Kolliphor ELP及Kollidon 12PF (因可見顆粒問題，可能避免使用Tween 80)。 發現表6之最有益調配物係DP 2、4、7及10。