BR112019018401A2 - formulação aquosa de anticorpo anti-pd-l1 - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma nova formulação de anticorpo anti-pd-l1. em particular, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica aquosa do anticorpo anti-tp-l avelumab.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para FORMULAÇÃO AQUOSA DE ANTICORPO ANTI-PD-L1.

[001] A presente invenção refere-se a uma nova formulação de anticorpo anti-PD-L1. Em particular, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica aquosa do anticorpo anti-PD-L1 Avelumab.

Antecedentes da Invenção [002] O receptor (PD-1) de morte programada 1 e ligantes PD-11 e 2 (PD-L1, PD-L2) desempenham papéis integrantes na regulação imune. Expresso em células T ativadas, PD-1 é ativado por PD-L1 e PDL2 expressos pelas células estremais, células tumorais, ou ambas, iniciando a morte das células T e supressão imune localizada (Dong H, Zhu L, Tamada K., Chen L. B7-H1, a third member of the B7 family, costimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med 1999;5:1365-69; Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med 2000;192:102734; Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 2002; 8:793-800. Erratum, Nat Med 2002;8:1039; Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012;24:207-12), potencialmente proporcionando um ambiente imunotolerante para o desenvolvimento e crescimento do tumor. Por outro lado, a inibição desta interação pode aumentar as respostas de células T locais e mediar atividade antitumoral em modelos animais não clínicos (Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Nat Med 2002; 8:793-800. Erratum, Nat Med 2002;8:1039; Iwai Y, Ishida Μ, Tanaka Υ, et al. Involvement of PDL1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:12293-97). Na prática clínica, o tratamento com anticorpos que

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2/61 bloqueiam a interação PD-1 - PD-L1 foram relatados como produzindo taxas de resposta objetiva de 7% a 38% em pacientes com tumores sólidos avançados ou metastáticos, com perfis de segurança toleráveis (Hamid O, Robert C, Daud A, et al. Safety and tumor responses with lambrolizumab (Anti-PD-1) in melanoma. N Engl J Med 2013;369:13444; Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of antiPD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2455-65; Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012;366(26):2443-54; Herbst RS, Soria J-C, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 2014;515:563-67). Notavelmente, as respostas apareceram prolongadas, com duração de 1 ano ou mais para a maioria dos pacientes.

[003] Avelumab (também conhecido como MSB0010718C) é um anticorpo monoclonal completamente humano do isotipo G1 de imunoglobulina (Ig). Avelumab se liga seletivamente a PD-L1 e competitivamente bloqueia a sua interação com DP-1.

[004] Comparado com os anticorpos anti-DP-1 que têm como alvo as células T, Avelumab tem como alvo células tumorais, e portanto, espera-se que tenha menos efeitos colaterais, incluindo um menor risco de problemas de segurança relacionada à autoimunidade, assim como o bloqueio de PD-L1 deixa a via PD-L2 - PD-1 intacta para promover autotolerância periférica (Latchman Y, Wood CR, Chernova T, et al. PDL1 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol 2001 ;2(3):261-68).

[005] Avelumab está atualmente sendo testado na clínica em um número de tipos de câncer incluindo câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma urotelial, mesotelioma, carcinoma de células de

Merkel, câncer gástrico ou de junção gastroesofágica, câncer de ovário

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3/61 e câncer de mama.

[006] As sequências de aminoácidos de Avelumab e variantes de sequência e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, são divulgados em WO2013079174, onde o anticorpo que possui a sequência de aminoácidos de Avelumab é referido como A09-246-2. São também divulgados métodos de fabricação e certos usos médicos. Outros usos médicos de Avelumab são descritos em WO2016137985, WO2016181348, WO2016205277, PCT/US2016/053939, pedido de patente U.S. Ser. No. 62/423,358. WO2013079174 também descreve na seção 2.4 uma formulação aquosa de um anticorpo humano tendo a sequência de aminoácidos de Avelumab. Esta formulação compreende o anticorpo em uma concentração de 10 mg/ml, metionina como um antioxidante e tem um pH de 5,5. Formulações de Avelumab não contendo um antioxidante são descritas em PCT/EP2016/002040.

[007] Um estudo de formulação para um anticorpo anti-PD-L1 do tipo lgG1 aglicosilado é descrito em WO2015048520, onde uma formulação com um pH de 5.8 foi selecionada para estudos clínicos.

Descrição da Invenção [008] Como Avelumab é geralmente administrado a um paciente através de infusão intravenosa, e é, assim, provida em uma forma aquosa, a presente invenção refere-se a novas formulações aquosas que são adequadas para estabilizar Avelumab com as suas modificações pós-translacionais, e em concentrações mais elevadas, como divulgado em WO2013079174.

[009] Figura 1a (SEQ ID NO: 1) mostra a sequência de cadeia pesada de comprimento completo de Avelumab, tal como expresso pelas células CHO usadas como o organismo hospedeiro. É frequentemente observado que, no entanto, no decurso da produção de anticorpos a lisina C-terminal (K) da cadeia pesada é clivada. Localizada na parte Fc, esta modificação não tem qualquer influência sobre o

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4/61 anticorpo - antígeno de ligação. Portanto, em algumas modalidades a lisina C-terminal (K) da sequência de cadeia pesada de Avelumab está ausente. A sequência de cadeia pesada de Avelumab sem a lisina Cterminal é mostrada na Figura 1 b (SEQ ID NO: 2). Figura 2 (SEQ ID NO: 3) mostra a sequência de cadeia leve de comprimento completo de Avelumab.

[010] A modificação pós-translacional de alta relevância é glicosilação. A maior parte das proteínas solúveis e ligadas à membrana que são feitas no reticule endoplasmático de células eucariotas sofrem glicosilação, em que as enzimas chamadas glicosiltransferases ligam uma ou mais unidades de açúcar a sítios de glicosilação específicos das proteínas. Mais frequentemente, os pontos de fixação são grupos NH2 ou OH, que levam a glicosilação N-ligada ou O-ligada. Isto aplica-se também às proteínas, tais como anticorpos, que são produzidas de forma recombinante em células hospedeiras eucarióticas. Anticorpos IgG recombinantes contêm um sítio de glicosilação ligado a N conservado em um determinado resíduo de asparagina da região Fc no domínio CH2. Existem muitas funções físicas conhecidas de glicosilação ligada a N em um anticorpo, tais como afetar a sua solubilidade e estabilidade, resistência à protease, ligação a receptores Fc, transporte celular e uma meia-vida circulatória in vivo (Hamm M. et al., Pharmaceuticals 2013, 6, 393-406). Estruturas de anticorpos IgG de N-glicanos são predominantemente estruturas do tipo complexo biantenárias, compreendendo b-D-N-acetilglucosamina (GlcNAc), manose (Man) e, frequentemente unidades de galactose (Gal) e fucose (Fuc).

[011] Em Avelumab 0 único sítio de glicosilação é Asn300, localizado no domínio CH2 de ambas as cadeias pesadas. Detalhes da glicosilação são descritos no Exemplo 1.

[012] Uma vez que a glicosilação afeta a solubilidade e a

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5/61 estabilidade de um anticorpo, é prudente considerar este parâmetro, quando, uma formulação farmaceuticamente adequada estável do anticorpo está sendo desenvolvida.

[013] Surpreendentemente, foi descoberto pelos inventores do presente pedido de patente que é possível estabilizar Avelumab, totalmente caracterizado pela sua sequência de aminoácidos e as suas modificações pós-translacionais, em várias formulações aquosas, sem a presença de um antioxidante, em valores de pH até abaixo de 5,2. Figuras [014] Figura 1a: Sequência de cadeia pesada de Avelumab (SEQ ID NO: 1) [015] Figura 1b: Sequência de cadeia pesada de Avelumab, faltando o K C-terminal (SEQ ID NO: 2) [016] Figura 2: Sequência de cadeia leve de Avelumab (SEQ ID NO: 3) [017] Figura 3: Estrutura secundária de Avelumab [018] Figura 4: Cromatograma 2AB HILIC-UPLC de Avelumab Glicanos [019] Figura 5: Numeração dos picos da Figura 4

Definições [020] A menos que indicado de outra forma, os seguintes termos utilizados na especificação e reivindicações têm os seguintes significados estabelecidos abaixo.

[021] Referências aqui feitas a Avelumab incluem o anticorpo anti-PD-L1 do tipo IgG 1, tal como definido em WQ2013079174 pela sua sequência de aminoácidos, e tal como definido no presente pedido de patente pela sua sequência de aminoácido e pela suas modificações pós-translacionais. As referências aqui feitas a Avelumab podem incluir biossimilares que, por exemplo, podem partilhar pelo menos 75%, adequadamente pelo menos 80%, adequadamente pelo menos 85%,

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6/61 adequadamente pelo menos 90%, adequadamente pelo menos 95%, adequadamente pelo menos 96%, adequadamente pelo menos 97%, adequadamente pelo menos 98% ou mais adequadamente pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos descritas em WO2013079174. Alternativamente ou adicionalmente, as referências aqui feitas a Avelumab podem incluir biossimilares que diferem nas modificações pós-translacionais, especialmente no padrão de glicosilação, aqui divulgado.

[022] O termo biossimilar (também conhecido como biológicos subsequentes) é bem conhecido na técnica, e o versado na técnica iria facilmente apreciar quando uma substância de droga seria considerada um biossimilar de Avelumab. O termo biossimilares é geralmente usado para descrever versões posteriores (geralmente a partir de uma fonte diferente) de produtos biofarmacêuticos inovadores (biológicos, cuja substância de droga é feita por um organismo vivo ou derivada de um organismo vivo ou por meio de DNA recombinante ou metodologias de expressão de genes controlada) que tenham sido previamente oficialmente concedidas autorização de comercialização. Uma vez que biológicos têm um elevado grau de complexidade molecular, e são geralmente sensíveis a alterações no processo de fabricação (por exemplo, se diferentes linhagens celulares são utilizadas para a sua produção), e uma vez que fabricantes de biológicos subsequentes, geralmente, não têm acesso ao clone molecular do originador, banco de células, know-how sobre a fermentação e processo de purificação, nem à própria substância de droga ativa (somente medicamento comercializado do inovador), é improvável que qualquer biossimilar seja exatamente o mesmo que o produto inovador de drogas. Aqui, o termo tampão ou solução tampão refere-se a uma solução, geralmente aquosa, compreendendo uma mistura de um ácido (normalmente um ácido fraco, por exemplo, ácido acético, ácido cítrico,

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7/61 forma imidazólio de histidina) e a sua base conjugada (por exemplo, um acetato ou sal de citrato, por exemplo, acetato de sódio, citrato de sódio, ou histidina) ou, alternativamente, uma mistura de uma base (geralmente uma base fraca, por exemplo, histidina) e o seu ácido conjugado (por exemplo sal de histidina protonada). O pH de uma solução tampão mudará apenas muito ligeiramente após a adição de uma pequena quantidade de ácido forte ou base devido ao efeito tamponante transmitido pelo agente tamponante.

[023] Aqui, um sistema tamponante compreende um ou mais agente(s) tamponante (s) e/ou um conjugado de ácido / base (s) do mesmo, e mais adequadamente compreende um ou mais agente(s) tamponante (s) e um conjugado de ácido / base (s) do mesmo, e mais apropriadamente ainda compreende um agente tamponante único e um ácido / base conjugado do mesmo. A menos que indicado de outra forma, todas as concentrações aqui estipuladas em relação a um sistema tamponante (ou seja, uma concentração de tampão) adequadamente refere-se à concentração combinada do(s) agente(s) tamponante (s) e/ou conjugado (s) de ácido / base do mesmo. Em outras palavras, as concentrações aqui estipuladas em relação a um sistema tamponante referem-se adequadamente à concentração combinada de todas as espécies tamponantes relevantes (isto é, as espécies em equilíbrio dinâmico umas com as outras, por exemplo, citrato / ácido cítrico). Como tal, uma dada concentração de um sistema tamponante de histidina, geralmente refere-se à concentração combinada de histidina e a forma imidazólio de histidina. No entanto, no caso de histidina, tais concentrações são geralmente simples para calcular em função das grandezas de entrada de histidina ou um seu sal. O pH global da composição que compreende o sistema tamponante relevante é geralmente um reflexo da concentração de equilíbrio de cada uma das espécies relevantes de tamponamento (isto é, o equilíbrio de agente (s)

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8/61 tamponante(s) para o conjugado do ácido I base (s) do mesmo).

[024] Aqui, o termo agente tamponante refere-se a um componente de ácido ou de base (geralmente um ácido fraco ou base fraca) de um tampão ou solução tampão. Um agente tamponante ajuda a manter o pH de uma dada solução em ou perto de um valor predeterminado, e os agentes tamponantes são geralmente escolhidos para complementar o valor predeterminado. Um agente tamponante é, adequadamente, um único composto que dá origem a um efeito tamponante desejado, especialmente quando o referido agente tamponante é misturado com (e apropriadamente capaz de troca de prótons com) uma quantidade adequada (dependendo do pH predeterminado desejado) do seu correspondente conjugado de ácido / base, ou se a quantidade necessária de seu conjugado de ácido / base correspondente é formada in situ - isto pode ser conseguida através da adição de ácido forte ou base até o pH desejado ser atingido. Por exemplo, no sistema tamponante de acetato de sódio, é possível começar com uma solução de acetato de sódio (básico) que é depois acidificada com, por exemplo, ácido clorídrico, ou uma solução de ácido acético (ácido), hidróxido de sódio ou acetato de sódio é adicionado até que o pH desejado é alcançado.

[025] De um modo geral, um estabilizador refere-se a um componente que facilita a manutenção da integridade estrutural da droga biofarmacêutica, particularmente durante o congelamento e/ou liofilização e/ou armazenamento (especialmente quando exposto ao estresse). Este efeito de estabilização pode ocorrer devido a uma variedade de razões, embora tipicamente estes estabilizadores possam atuar como osmolitos que mitigam contra a desnaturação das proteínas. Tal como aqui utilizado, os estabilizadores podem ser álcoois de açúcar (por exemplo, inositol, sorbitol), dissacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose), monossacarídeos (por exemplo, dextrose (glicose D)), ou as

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9/61 formas do aminoácido lisina (por exemplo, monocloridrato de lisina, acetate ou mono-hidrato), ou seus sais (por exemplo, cloreto de sódio). [026] Agentes utilizados como agentes tamponantes, antioxidantes ou tensoativos de acordo com a invenção, são excluídos do significado do termo estabilizadores, tal como aqui utilizado, mesmo que eles possam apresentar, i.a. atividade estabilizadora.

[027] Aqui, o termo tensoativo refere-se a um agente de superfície ativa, preferivelmente um tensoativo não iônico. Exemplos de tensoativos usados neste documento incluem polissorbato, por exemplo, polissorbato 80 (mono-oleato de sorbitano de de polioxietileno (80), também conhecido sob o nome comercial de Tween 80); óleo de rícino de polioxila, tais como óleo de rícino de polioxila 35, feito por reação de óleo de rícino com óxido de etileno em uma razão molar de 1:35, também conhecido sob o nome comercial Kolliphor ELP; ou Kollidon 12PF ou 17PF, que são povidonas (polivinilpirrolidonas) de baixo peso molecular, conhecidas sob o número de CAS 9003-39-8 e tem pesos moleculares ligeiramente diferentes (12PF: 2000-3000 g/mol, 17PF: 7000-11000 g/mol).

[028] Agentes utilizados como agentes tamponantes, antioxidantes ou estabilizadores de acordo com a invenção, são excluídos do significado do termo tensoativos como aqui utilizado, mesmo que eles possam apresentar, i.a, atividade tensoativo.

[029] Aqui, o termo estável refere-se geralmente para a estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou estabilidade biológica de um componente, tipicamente um ativo ou composição dos mesmos, durante a conservação / armazenamento.

[030] Aqui, o termo antioxidante refere-se a um agente capaz de prevenir ou diminuir a oxidação da droga biofarmacêutica a ser estabilizada na formulação. Antioxidantes incluem sequestrantes de radicais (por exemplo, ácido ascórbico, BHT, sulfite de sódio, ácido pPetição 870190086942, de 04/09/2019, pág. 27/120

10/61 aminobenzoico, glutationa ou gaiato de propila), agentes quelantes (per exemplo EDTA ou ácido cítrico) ou terminadores de cadeia (por exemplo, metionina ou N-acetilcisteína). Os agentes utilizados como agentes tamponantes, estabilizadores ou tensoativos de acordo com a invenção, são excluídos do significado do termo antioxidantes como é aqui utilizado, mesmo que eles possam apresentar, i.a., atividade antioxidante.

[031] Um diluente é um agente que constitui o equilíbrio dos ingredientes em qualquer composição farmacêutica líquida, por exemplo, de modo que as percentagens em peso somam 100%. Aqui, a composição farmacêutica líquida é uma composição aquosa farmacêutica, de modo que um diluente tal como aqui utilizado é a água, de preferência água para injeção (WFI).

[032] Aqui, o termo tamanho de partícula ou tamanho de poro refere-se, respectivamente, ao comprimento da maior dimensão de uma determinada partícula ou poro. Ambos os tamanhos podem ser medidos utilizando um analisador de tamanho de partículas a laser e/ou microscópios eletrônicos (por exemplo, microscópio de tunelamento de elétrons, MET, ou microscópio eletrônico de varrimento, SEM). A contagem de partículas (para qualquer dimensão dada) pode ser obtida utilizando os protocolos e equipamentos descritos nos exemplos, que se relacionam com a contagem de partículas de partículas subvisíveis.

[033] Aqui, o termo cerca de refere-se ao intervalo de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelos versados na técnica neste campo. A referência a cerca de um valor ou parâmetro inclui aqui (e descreve) modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro, por si só. Em caso de dúvida, ou caso não haja entendimento comum reconhecido na técnica sobre o intervalo de erro para um determinado valor ou parâmetro, cerca de significa ± 5% desse valor ou parâmetro.

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11/61 [034] Aqui, o termo parte de porcentagem em conexão com espécies de glicano refere-se diretamente ao número de espécies diferentes. Por exemplo, o termo o referido FA2G1 tem uma parte de 25% - 41% de todas as espécies de glicano significa que em 50 moléculas de anticorpo analisadas, tendo 100 cadeias pesadas, 25-41 das cadeias pesadas irão expor o padrão de glicosilação FA2G1.

[035] Deve ser apreciado que referência a tratar ou tratamento inclui a profilaxia bem como o alívio de sintomas estabelecidos de uma condição. Tratar ou Tratamento de um estado, distúrbio ou condição inclui, portanto: (1) prevenir ou retardar o aparecimento de sintomas clínicos do estado, distúrbio ou condição em desenvolvimento em um ser humano que pode ser atingido com ou ser predisposto ao estado, distúrbio ou condição, mas que ainda não sofre ou exibe sintomas clínicos ou subclínicos do estado, distúrbio ou condição, (2) inibir o estado, distúrbio ou condição, ou seja, interromper, reduzir ou retardar o desenvolvimento da doença ou uma recaída (no caso do tratamento de manutenção) ou, pelo menos, um sintoma clínico ou subclínico, ou (3) aliviar ou atenuar a doença, isto é, causando regressão do estado, distúrbio ou condição, ou pelo menos um de seus sintomas clínicos ou subclínicos.

Formulação Aquosa de Anticorpo Anti-PD-L1 [036] Em um primeiro aspecto, a invenção proporciona uma nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreendendo: [037] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a 30 mg/mL como o anticorpo;

[038] (ii) glicina, succinate, fosfato de citrato ou histidina em uma concentração de 5 mM a 35 mM como o agente tamponante;

[039] (iii) monocloridrato de lisina, lisina mono-hidratada, acetato de lisina, dextrose, sacarose, sorbitol ou inositol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como o estabilizador;

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12/61 [040] (iv) povidona, óleo de rícino de polioxila ou polissorbato em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como o tensoativo;

[041] em que a formulação não inclui a metionina, e [042] adicionalmente em que a formulação tern urn pH de 3,8 a 5,2.

[043] Em uma modalidade preferida, a formulação não compreende qualquer antioxidante.

[044] Em uma modalidade a concentração de Avelumab na referida formulação é de cerca de 10 mg/mL a cerca de 20 mg/mL.

[045] Em ainda outra modalidade a concentração de glicina, succinato, fosfato citrato ou histidina na referida formulação é de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM. Em modalidades adicionais, na referida formulação, a concentração de monocloreto de lisina é de cerca de 140 mM a cerca de 280 mM, ou a concentração da referida lisina monohidratada é de cerca de 280 mM, ou a concentração do referido acetato de lisina é de cerca de 140 mM. Em ainda outra modalidade a concentração de dextrose, sacarose, sorbitol ou inositol na referida formulação é de cerca de 280 mM. Em ainda outra modalidade a concentração de povidona, óleo de rícino de polioxila ou inositol polissorbato na referida formulação é de cerca de 0,5 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a referida povidona na referida formulação é a polivinilpirrolidona de baixo peso molecular Kollidon 12PF ou 17PF de número CAS 9003-39-8. Em outra modalidade preferida, o referido óleo de rícino de polioxila é de óleo de rícino polioxil 35. Em ainda outra modalidade preferida, o referido polissorbato é polissorbato 80.

[046] Em uma modalidade mais preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[047] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[048] (ii) glicina em uma concentração de 5 mM a 15 mM como

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13/61 agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[049] (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[050] (iv) Kollidon 12PF, óleo de rícino de polioxila 35 ou Polissorbato 80 em uma concentração de 0,25 mg/ml a 0,75 mg/ml, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo; em que a formulação tem um pH de 3,8 a 4,6, e não compreendendo um antioxidante.

[051] Em uma modalidade igualmente preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[052] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[053] (ii) succinate em uma concentração de 5 mM a 15 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[054] (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[055] (iv) Kollidon 12PF ou óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,25 mg/ml a 0,75 mg/ml, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[056] em que a formulação tem um pH de 4,9-5,2, e não compreende um antioxidante.

[057] Em uma modalidade igualmente preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[058] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[059] (ii) fosfato de citrato em uma concentração de 10 mM a 20

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14/61 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[060] (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[061] (iv) Kollidon 12PF ou óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,25 mg/ml a 0,75 mg/ml, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[062] em que a formulação tem um pH de 3,8 a 4,7, e não compreende um antioxidante.

[063] Em uma modalidade igualmente preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[064] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[065] (ii) glicina em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[066] (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[067] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/ml como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[068] em que a formulação tem um pH de 4,2 a 4,6, e não compreende um antioxidante.

[069] Em uma modalidade mais preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[070] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[071] (ii) glicina em uma concentração de cerca de 10 mM como

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15/61 agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[072] (iii) acetato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[073] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/ml como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[074] em que a formulação tem um pH de 4,2 a 4,6, e não compreende um antioxidante.

[075] Em uma modalidade igualmente preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[076] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/ml a cerca de mg/ml como o anticorpo;

[077] (ii) histidina em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

[078] (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 280 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador; [079] (iv) Kollidon 12PF em uma concentração de cerca de 0,5 mg/ml como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[080] em que a formulação tem um pH de 4,8 a 5,2, e não compreende um antioxidante.

[081] Em uma modalidade igualmente preferida, a nova formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, compreende:

[082] (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de mg/mL como o anticorpo;

[083] (ii) succinate em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente

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16/61 tamponante;

[084] (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

[085] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

[086] em que a formulação tem um pH de 4,8 a 5,2, e não compreende um antioxidante.

[087] Em uma modalidade mais preferida das modalidades descritas acima, a concentração de Avelumab é cerca de 20 mg/ml.

[088] Em modalidades ainda mais preferidas a referida formulação consiste em:

[089] (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

[090] (ii) glicina em uma concentração de 10 mM;

[091] (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de 140 mM;

[092] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/mL;

[093] (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

[094] (vi) água (para injeção) como solvente;

[095] e tem um pH de 4,4 (± 0,1);

[096] ou [097] (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

[098] (ii) glicina em uma concentração de 10 mM;

[099] (iii) acetato de lisina em uma concentração de 140 mM;

[100] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/mL;

[101] (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

[102] (vi) água (para injeção) como solvente;

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17/61 [103] e tern um pH de 4,4 (± 0,1);

[104] ou [105] (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/ml;

[106] (ii) histidina em uma concentração de 10 mM;

[107] (iii) sacarose em uma concentração de 280 mM;

[108] (iv) Kollidon 12PF em uma concentração de 0,5 mg/ml;

[109] (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

[110] (vi) água (para injeção) como solvente;

[111] e tern um pH de 5,0 (± 0,1);

[112] ou [113] (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/ml;

[114] (ii) succinate em uma concentração de 10 mM;

[115] (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de 140 mM;

[116] (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/ml;

[117] (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

[118] (vi) água (para injeção) como solvente;

[119] e tern um pH de 5,0 (± 0,1).

[120] Em outra modalidade preferida, a formulação tem uma osmolalidade entre 270 e 330 mOsm/kg.

[121] Em uma modalidade, o referido Avelumab nas formulações tal como descrito acima tem a sequência de cadeia pesada de qualquer uma das Figura 1a (SEQ ID NO: 1) ou Fig 1b (SEQ ID NO: 2), a sequência de cadeia leve da Figura 2 (SEQ ID NO: 3), e carrega uma glicosilação em Asn300 compreendendo FA2 e FA2G1 como as principais espécies de glicano, tendo uma parte conjunta > 70% de todas as espécies de glicano.

[122] Em uma modalidade preferida, na glicosilação de Avelumab o referido FA2 tem uma percentagem de 44% - 54% e o referido FA2G1

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18/61 tem uma percentagem de 25% - 41% de todas as espécies de glicano. Em uma modalidade preferida, na glicosilação de Avelumab a referida FA2 tem uma quota de 47% - 52% e o referido FA2G1 tem uma percentagem de 29% - 37% de todas as espécies de glicano.

[123] Em uma modalidade preferida, na glicosilação de Avelumab o referido FA2 tem uma quota de cerca de 49% e o referido FA2G1 tem uma quota de cerca de 30% - cerca de 35% de todas as espécies de glicano.

[124] Em uma modalidade preferida, a glicosilação de Avelumab compreende ainda quanto menor as espécies de glicano A2 com uma quota de < 5%, A2G1 com uma quota de < 5%, A2G2, com uma quota de < 5% e FA2G2 com uma quota de < 7% de todas as espécies de glicano.

[125] Em uma modalidade preferida, na glicosilação de Avelumab o referido A2 tem uma quota de 3% - 5%, o referido A2G1 tem uma quota de <4%, o referido A2G2 tem uma quota de < 3% e o referido FA2G2 tem uma quota de 5% - 6% de todas as espécies de glicano.

[126] Em uma modalidade preferida, na glicosilação Avelumab disse A2 tem uma quota de cerca de 3,5% - cerca de 4,5%, o referido A2G1 tem uma quota de cerca de 0,5% - cerca de 3,5%, o referido A2G2 tem uma parte de <2,5% e o referido FA2G2 tem uma quota de cerca de 5,5% de todas as espécies de glicano.

[127] Em uma modalidade o referido Avelumab na formulação, como descrito acima tem a sequência de cadeia pesada da Figura 1b (SEQ ID NO: 2).

[128] Em uma modalidade a formulação de Avelumab como descrita acima é para a administração intravenosa (iv).

Dispositivo de Entrega de Droga [129] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um dispositivo de entrega de droga compreendendo uma composição

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19/61 farmacêutica líquida, tal como aqui definido. Adequadamente, o dispositivo de entrega da droga compreende uma câmara dentro da qual a composição farmacêutica reside. Adequadamente, o dispositivo de entrega de droga é estéril. O dispositivo de entrega de droga pode estar em um frasco, ampola, seringa, canetas de injeção (por exemplo, essencialmente, incorporando uma seringa), ou saco i.v. (intravenosa). As formulações farmacêuticas aquosas são administradas parentericamente, de preferência por meio de injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intravenosa ou infusão i.v. A maneira mais preferida de administração é a infusão i.v. Em uma modalidade preferida, o dispositivo de entrega de droga é um frasco contendo a formulação, como descrito acima. Em uma modalidade mais preferida, o referido frasco contém 200 mg de avelumab em 10 mL de solução para uma concentração de 20 mg/ml. Em uma modalidade ainda mais preferida, o frasco é um frasco de vidro.

Tratamento Médico [130] Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de câncer compreendendo a administração da formulação, como descrito acima a um paciente. Em uma modalidade o câncer a ser tratado é selecionado a partir de câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma urotelial, câncer de bexiga, mesotelioma, carcinoma de células de Merkel, câncer gástrico ou junção gastroesofágica, câncer de ovário, câncer de mama, timoma, adenocarcinoma do estômago, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, melanoma, e/ou linfoma de Hodgkin clássico.

Métodos de Fabricação [131] A presente invenção também fornece um método de fabricação de uma formulação aquosa farmacêutica tal como aqui definido. O método adequadamente compreende a mistura em

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20/61 conjunto, em qualquer ordem particular considerada apropriada, quaisquer componentes relevantes necessários para formar a formulação farmacêutica aquosa. O versado na técnica pode referir-se aos exemplos ou técnicas bem conhecidos na técnica para a formação de formulações farmacêuticas aquosas (especialmente aquelas para injeção através de uma seringa, ou infusão i.v.).

[132] O método pode envolver primeiro a preparação de uma prémistura (ou pré-solução) de alguns ou todos os componentes (opcionalmente com algum ou todo o diluente) excluindo Avelumab, e Avelumab pode então ele próprio (opcionalmente com ou pré-dissolvido em algum diluente) ser misturado com a pré-mistura (ou pré-solução) para se obter a formulação farmacêutica aquosa, ou uma composição em que os componentes finais são então adicionados para fornecer a formulação farmacêutica aquosa final. De preferência, o método envolve a formação de um sistema tamponante, adequadamente um sistema tamponante compreendendo um agente tamponante, tal como aqui definido. O sistema tamponante é formado apropriadamente em uma pré-mistura antes da adição de Avelumab. O sistema tamponante pode ser formado simplesmente misturando o agente tamponante (fornecido pronto) com o seu conjugado ácido / base (adequadamente em quantidades relativas apropriadas para proporcionar o pH desejado - isto pode ser determinado pela pessoa versada ou de forma teórica ou experimental). No caso de um sistema tamponante de acetato, isto significa, por exemplo, misturar acetato de sódio com HCI, ou misturar ácido acético com NaOH ou acetato. O pH de qualquer pré-mistura de formulação farmacêutica aquosa final pode ser judiciosamente ajustado adicionando a quantidade necessária de base ou ácido, ou uma quantidade de agente tamponante ou conjugado de ácido / base.

[133] Em certas modalidades, o agente tamponante e/ou sistema tamponante é pré-formado como uma mistura separada, e o sistema

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21/61 tamponante é transferido para um precursor da formulação farmacêutica aquosa (compreendendo alguns ou todos os componentes exceto para o agente tamponante e/ou sistema tamponante, compreendendo adequadamente Avelumab e potencialmente apenas Avelumab) através de permuta de tampão (por exemplo, usando diafiltração até que as concentrações relevantes ou da osmolalidade sejam atingidos). Excipientes adicionais podem ser adicionados em seguida, se necessário, a fim de produzir a composição farmacêutica líquida final. O pH pode ser ajustado uma vez ou antes de todos os componentes estarem presentes.

[134] Qualquer, alguns, ou todos os componentes podem ser prédissolvidos ou pré-misturados com um diluente antes da mistura com outros componentes. A formulação farmacêutica aquosa final pode ser filtrada, adequadamente para remover a matéria particulada. Filtração é, adequadamente, através de filtros de tamanho igual ou inferior a 1 pm, adequadamente a 0.22 pm. Adequadamente, a filtração é, quer através de filtros PES ou filtros PVDF, adequadamente com filtros PES de 0,22 pm.

[135] A pessoa especialista na técnica está bem ciente como uma formulação farmacêutica aquosa pode ser utilizada para preparar uma solução I.V., de modo que a substância de droga e anticorpo podem ser administrados por via intravenosa. A preparação da solução I.V. consiste tipicamente em uma certa quantidade de solução a ser retirada a partir de sacos de solução salina (por exemplo, 0,9% ou 0,45% de solução salina) com uma seringa de plástico (PP) e uma agulha e substituída com a formulação aquosa farmacêutica. A quantidade de solução substituída irá depender do peso corporal dos pacientes. Abreviaturas

ANOVA Análise de variância

CD Dicroísmo circular

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CE - SDS Dodecilsulfato de sódio para capilar de eletroforese clEF Isoeletrofocalização capilar

DoE Projeto do Experimento

DP Produto da Droga

DS Substância da droga

FT Congelamento - descongelamento

HMW Elevado Peso Molecular

LMW Baixo Peso Molecular

SE-HPLC Cromatografia Líquida de Alto Desempenho por Exclusão de Tamanho

OD Densidade óptica

PES Polietersulfona

PVDF Fluoreto de polivinilideno

RH Umidade Relativa

SE - HPLC Cromatografia de Alto Desempenho por Exclusão de Tamanho

UV Ultravioleta

WFI Água para injeção

Exemplos

Exemplo 1 - Estrutura de Avelumab

1.1 Estrutura primária [136] Avelumab é um IgG com duas moléculas de cadeia pesada e duas de cadeia leve. As sequências de aminoácidos das duas cadeias são apresentadas nas Figuras 1a (SEQ ID NO: 1) / 1b (SEQ ID NO: 2) e 2 (SEQ ID NO: 3), respectivamente.

1.2 Estrutura Secundária [137] Métodos de LC-MS e MS/MS foram utilizados para confirmar as cadeias intactas da molécula e a presença de modificações póstranslacionais para as proteínas. A estrutura secundária das subunidades da molécula Avelumab é mostrada na Figura 3.

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23/61 [138] Tal como confirmado por espectrometria de massa UPLC-QTOF de peptídeos obtidos por digestão com tripsina, as ligações dissulfureto Cys21-Cys96, Cys21-Cys90, Cys147-Cys203, Cys138Cys197, Cys215-Cys223, Cys229-Cys229, Cys232-Cys232, Cys264Cys324 e Cys370-Cys428 formam o padrão de ligação de IgG típico nove.

1.3 Glicosilação [139] A molécula contém um sítio de N-glicosilação em Asn300 da cadeia pesada. Tal como determinado por mapeamento de peptídeos, a estrutura principal identificada por MALDI-TOF foi um complexo, oligossacarídeo fucosilado de núcleo tipo biantenário com zero (GOF), um (G1F), ou dois (G2F) resíduos de galactose. As principais espécies são GOF e G1F. Fluorescência de Avelumab glicanos marcada por 2aminobenzamida foi analisada por HILIC-UPLC-ESI-Q-TOF. A Figura 4 mostra o perfil de UPLC das espécies de glicano encontrado.

Tabela 1: Identificação dos picos de cromatograma2AB HILIC-UPLC [140] As formas geométricas que representam os blocos de construção de glicano correspondem às seguintes entidades moleculares:

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4	7.77	1SSS.S7 !.VH	1355 El .LU-’		J®	Manualmente identificado por MS
5	2 1·..	1588.77	1β80Λ2 AUH	OQ^^HZZHZl·^	A3G1	Manualmente identificado por MS
6		1744 JB	171467		MS em ____ ! fraamAntacão
	fonte por GlycoworkBench
		1462.»	1462,54		FAZ	GlycoworkBench identificado por MS

; 7 ;	‘2 J7	1M8D	744(5’ ;		(FA2GT	MS em fragmentação fonte por GlycoworkBench
1«2,W	’432 34 ;		RW fráéEnd	GlycoworkBench identificado por MS
i « i	10.44	1«2,»			FA2 tweEntf	GlycoworkBench identificado por MS
1744 7?	1SMJ37 :		FA2G1	Manualmente identificado por MS
9 i		..... J—	1’77.40 ( '.1— ;		FH3	GlycoworkBench identificado por MS

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	Í6,6ii	mssò	infesto
it	13.42	10,33	1072		ws:	MS em fragmentação fonte por GlycoworkBench
162471	1624.56		FA2G1	GlycoworkBench identificado por MS
12	mi	$54,46 (WW	354,36		F42G3	Manualmente identificado por MS
	10.51		FA2G1	GlycoworkBench identificado por MS
13		(WHiíS	hWJl um		FA2G2S	MS em fragmentação fonte por GlycoworkBench
14		10.21 íW	1376.63 02^X2		(pequenos vestígios prováveis)	Manualmente identificado por MS
ts			WU31		FA2GO	Manualmente identificado por MS

[141] Os formatos geométricos representando os blocos de construção de glicanos correspondem às seguintes entidades moleculares:

O Mán Δ Fuc O Gal □ GalNAc □ GlcNAc <$> NANA [142] A nomenclatura de glicano utilizada segue a Notação Oxford como proposto por Harvey et al. (Proteomics 2009, 9, 3796-3801). Em espécies contendo fucose (FA2, FA2G1, FA2G2), a conectividade de Fuc-GIcNAc é a1-6. Em espécies tendo um terminal GlcNAc, a conectividade GlcNAc-Man é β1-2. Em espécies contendo galactose, a conectividade Gal-GIcNAc é β1-4.

[143] O perfil cromatográfico relatado foi integrado e que produziu a Distribuição de Espécies de Glicano de Avelumab como mostrado na Tabela 2a.

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Tabela 2a

A2	FA2	A2G1	FA2G1	A2G2	FA2G2	M5**
3,6	48,7	3,4	35,6	2,3	5,4	1,0

**Provavelmente Manose 5, coeluição com espécies monogalactosilados biantenários [144] A análise de mapeamento de glicano confirmou a identificação efetuada por mapeamento do peptídeo (que permitiu identificar as duas principais espécies de glicano), em adição espécies secundárias e menores foram também caracterizadas por este método, específico para análise de glicano.

[145] Em uma outra medição foi observado a seguinte Distribuição de Espécies de Glicano.

Tabela 2b:

A2	FA2	A2G1	FA2G1	A2G2	FA2G2
4,0	50,2	1,0	30,0	0,1	5,6

Exemplo 2 - Triagem DoE [146] Um projeto da triagem da Experiência a 20 mg/ml de

Avelumab avaliou o impacto de vários fatores, tais como tipo tampão de variação / pH, estabilizadores, tipo de tensoativo e concentração relevante. O estudo, testando 80 formulações diferentes, levaram à seleção das condições adequadas que podem maximizar a estabilidade da proteína.

[147] Quatro tampões diferentes foram examinados neste DoE cobrindo diferentes tipos de tampões e faixa tamponante de pH eficaz: Tampões de aminoácidos, tais como Glicina (pH efetivo 4,0 a 7,5) e histidina (pH efetivo 5,0 a 6,6 cm). Tampão quelante iônico, tal como citrato (pH efetivo 4,0 a 7,5). Succinate (pH efetivo 5,0 a 6,0).

[148] Sete estabilizantes foram selecionados no DoE na base da sua estrutura química. Incluído no DoE estavam açúcares, polióis, sais, e aminoácidos. A composição é a seguinte:

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27/61 [149] Açúcares: Os dissacarídeos de sacarose e maltose foram selecionados, bem como a dextrose monossacarídeo (D-glucose).

[150] Álcoois de açúcar: Dois álcoois de açúcar / polióis foram selecionados para o DoE - sorbitol e inositol.

[151] Sal: Cloreto de sódio foi investigado como um estabilizador autônomo neste DoE.

[152] Aminoácido: Lisina, um aminoácido carregado positivamente foi investigado.

[153] A Tabela 3 lista as amostras e as suas respectivas composições.

Tabela 3: Formulações de triagem DoE

ID de Amostra	PH	Tampão	Intensidade do Tampão (mM)	Estabilizador (280 mM)	Tensoativo (0.5 mg/mL)
1	4	Citratofosfato	10	Sorbitol	Kollidon 12PF
2	4	Citratofosfato	50	Dextrose	Tween 40
3	4.5	Citratofosfato	20	Dextrose	Tween 40
4	4.5	Citratofosfato	30	Inositol	Kollidon 12PF
5	4.8	Citratofosfato	40	Maltose	Kolliphor ELP
6	4.8	Citratofosfato	40	Lisina	Tween 80
7	5.2	Citratofosfato	50	Dextrose	Kolliphor ELP
8	5.2	Citratofosfato	10	Cloreto de sódio	Tween 80
9	5.2	Citratofosfato	20	Lisina	Kolliphor ELP
10	5.5	Citratofosfato	20	Sacarose	Kollidon 12PF
11	5.5	Citratofosfato	30	Lisina	Tween 40
12	6	Citratofosfato	20	Maltose	Tween 40
13	6	Citratofosfato	30	Cloreto de sódio	Kolliphor ELP
14	6.5	Citratofosfato	30	Dextrose	Tween 80

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ID de Amostra	pH	Tampão	Intensidade do Tampão (mM)	Estabilizador (280 mM)	Tensoativo (0.5 mg/mL)
15	6.5	Citratofosfato	30	Sorbitol	Tween 80
16	7	Citratofosfato	50	Sacarose	Tween 80
17	7	Citratofosfato	10	Lisina	Kollidon 12PF
18	7	Citratofosfato	10	Inositol	Tween 80
19	7	Citratofosfato	30	Cloreto de sódio	Tween 40
20	7.5	Citratofosfato	50	Inositol	Kolliphor ELP
21	7.5	Citratofosfato	50	Sorbitol	Tween 40
22	4	Glicina	10	Cloreto de sódio	Kollidon 12PF
23	4	Glicina	10	Dextrose	Tween 40
24	4	Glicina	30	Sorbitol	Tween 40
25	4.3	Glicina	50	Sorbitol	Kolliphor ELP
26	4.3	Glicina	50	Inositol	Tween 40
27	4.3	Glicina	50	Dextrose	Tween 80
28	4.5	Glicina	30	Cloreto de sódio	Tween 40
29	4.8	Glicina	40	Lisina	Tween 80
30	4.8	Glicina	40	Maltose	Tween 80
31	5.8	Glicina	50	Lisina	Kollidon 12PF
32	5.8	Glicina	30	Maltose	Kollidon 12PF
33	6	Glicina	30	Sacarose	Kolliphor ELP
34	6.5	Glicina	30	Cloreto de sódio	Tween 80
35	6.8	Glicina	40	Dextrose	Kolliphor ELP
36	6.8	Glicina	10	Inositol	Tween 80
37	6.8	Glicina	10	Sorbitol	Kollidon 12PF
38	7	Glicina	10	Lisina	Kolliphor ELP
39	7	Glicina	10	Inositol	Tween 40
40	7	Glicina	30	Cloreto de sódio	Tween 80

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ID de Amostra	pH	Tampão	Intensidade do Tampão (mM)	Estabilizador (280 mM)	Tensoativo (0.5 mg/mL)
41	7.5	Glicina	30	Inositol	Kolliphor ELP
42	7.5	Glicina	50	Dextrose	Kollidon 12PF
43	7.5	Glicina	10	Sacarose	Kollidon 12PF
44	5	Histidina	10	Maltose	Kolliphor ELP
45	5	Histidina	10	Sorbitol	Kolliphor ELP
46	5	Histidina	20	Dextrose	Kollidon 12PF
47	5.2	Histidina	50	Inositol	Kolliphor ELP
48	5.2	Histidina	50	Maltose	Kolliphor ELP
49	5.2	Histidina	10	Maltose	Kollidon 12PF
50	5.5	Histidina	50	Maltose	Tween 40
51	5.5	Histidina	20	Cloreto de sódio	Tween 40
52	5.8	Histidina	10	Inositol	Kollidon 12PF
53	5.8	Histidina	10	Inositol	Tween 80
54	5.8	Histidina	50	Lisina	Kolliphor ELP
55	6	Histidina	50	Cloreto de sódio	Tween 80
56	6	Histidina	10	Sacarose	Kolliphor ELP
57	6	Histidina	10	Sorbitol	Tween 40
58	6	Histidina	30	Cloreto de sódio	Kollidon 12PF
59	6.5	Histidina	40	Sorbitol	Kollidon 12PF
60	6.5	Histidina	40	Maltose	Tween 80
61	6.5	Histidina	50	Sacarose	Kollidon 12PF
62	6.5	Histidina	50	Dextrose	Tween 40
63	6.6	Histidina	30	Lisina	Tween 80
64	5	Succinato	50	Inositol	Kollidon 12PF
65	5	Succinato	10	Maltose	Kollidon 12PF

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ID de Amostra	PH	Tampão	Intensidade do Tampão (mM)	Estabilizador (280 mM)	Tensoativo (0.5 mg/mL)
66	5	Succinato	50	Cloreto de sódio	Tween 80
67	5.2	Succinato	30	Cloreto de sódio	Tween 40
68	5.2	Succinato	50	Lisina	Kolliphor ELP
69	5.2	Succinato	50	Dextrose	Kollidon 12PF
70	5.4	Succinato	10	Maltose	Tween 80
71	5.4	Succinato	30	Inositol	Tween 40
72	5.4	Succinato	10	Dextrose	Tween 40
73	5.5	Succinato	30	Cloreto de sódio	Kollidon 12PF
74	5.5	Succinato	30	Sacarose	Kollidon 12PF
75	5.5	Succinato	40	Dextrose	Tween 80
76	5.8	Succinato	10	Lisina	Tween 40
77	5.8	Succinato	20	Inositol	Kolliphor ELP
78	5.8	Succinato	50	Sacarose	Kolliphor ELP
79	6	Succinato	30	Sorbitol	Tween 80
80	6	Succinato	50	Cloreto de sódio	Tween 40
[154]	A Ta	bela 4 lista os ensaios analíticos realizados (estabilidade

a curto prazo, esforço mecânico, exposição à luz, F/T), no âmbito desta triagem DoE e aqui apresentados.

Tabela 4 Painel de análises conduzidas em formulações de triagem DoE

Análise	Tempo zero	Estudo de Estabilidade (4 semanas a 40±2Ό 75%RH)	Estresse de luz	Estresse Mecâni CO	Estresse por Congelamento/descongela mento
Teor de proteína por OD	X	-	-	-	-
Agregação por Densidade Óptica	X	x	x	x	x
Inspeção Visual	x	x	x	x	x
Fragmentos LMW por Bioanalisador1 (NR)	x	x	-	x	-

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Análise	Tempo zero	Estudo de Estabilidade (4 semanas a 40±2Ό 75%RH)	Estresse de luz	Estresse Mecâni CO	Estresse por Congelamento/descongela mento
LMW e HMW por CE-SDS (NR)	X	-	X	-	-
HMW por SE-HPLC	X	X	X	X	X
Isoformas por clEF	X	-	X	-	-

(1) Bioanalisador 2100 (Agilent)

2.1 Métodos utilizados para determinar a estabilidade

Estabilidade Térmica [155] A estabilidade térmica das formulações foi examinada após quatro semanas de armazenamento a 40 ± 2 ^QC (75% de HR) para o seguinte:

[156] · índice de agregação: calculado por densidade óptica para rastrear a agregação e formação de impurezas HMW [157] · Inspeção visual quanto à presença de partículas visuais [158] · Teor HMW por SE-HPLC (para controlar a agregação) [159] · Teor LMW por Bioanalisador (para rastrear fragmentação) Estresse de luz [160] As formulações foram expostas a 7 horas de luz com uma intensidade de 765 W/m², que satisfaz os requisitos de orientação ICHQ1B. As formulações foram analisadas pelas seguintes técnicas:

[161] · índice de agregação: calculada por OD, mede o grau de formação agregada que resulta do estresse de luz [162] · Inspeção Visual: para presença de partículas visíveis resultantes da agregação [163] · CE-SDS: para produção de impurezas LMW, também indicativo de impurezas HMW [164] · SE-HPLC: quantificação de impurezas HMW resultante da agregação [165] · clEF: fornece uma visão em quantidade relativa de

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32/61 variantes de carga, pode monitorar a oxidação (pelo produto da tensão de luz)

Estresse mecânico [166] Estresse mecânico (agitação) é muitas vezes associado com uma produção de agregados devido à autoassociação e interação de proteína entre as regiões hidrofóbicas da proteína na solução. As formulações DoE no presente estudo foram examinadas quanto à resistência ao estresse de agitação depois de 24 horas de agitação a 200 rpm à temperatura ambiente. As formulações de estresse por agitação foram analisadas como segue:

[167] · índice de agregação: calculado por densidade óptica para rastrear agregação e formação de impurezas HMW [168] · Inspeção visual quanto à presença de partículas visuais [169] · Conteúdo HMW por SE-HPLC (para rastrear a geração de impureza HMW e, por conseguinte, monitorar agregações) [170] · Teor LMW por Bioanalisador (para rastrear fragmentação) Estresse por congelamento / descongelamento [171] Conforme uma formulação de proteína congela, uma interface é formada como microrregiões quando a solução começa a solidificar. Nestes microambientes há uma alteração na polaridade conforme diferente componente do tampão de formulação é excluído ou incluído a partir da matriz líquida que está solidificando. O resultado é a precipitação de proteína enquanto interações hidrofílicas / hidrofóbicas são forçadas sobre as moléculas nestes microambientes em alteração. Para determinar a eficácia dos vários estabilizadores e tensoativos no DoE as amostras foram expostas a três ciclos de congelamentodescongelamento. As amostras foram, em seguida, examinadas pela seguinte análise para determinar a sua resistência à precipitação / agregação / degradação por congelamento-descongelamento:

[172] · índice de agregação: calculado por densidade óptica para

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33/61 controlar a agregação e formação de impurezas HMW [173] · Inspeção visual quanto à presença de partículas visuais [174] · Teor HMW por SE-HPLC (para controlar a geração de impureza HMW e, por conseguinte, monitorizar agregações)

2.2 Fabricação [175] Um material de substância de droga da composição: 20,6 mg/ml Avelumab, 51 mg/ml de D-manitol, 0,6 mg/ml de ácido acético glacial, pH 5,2 (tensoativo - livre) foi equilibrado por filtração de fluxo tangencial (usando um cutoff Pellicon XL Cassette Biomax 10 kDa em PES) nos três tampões:

[176] - 10 mM de Citrato - fosfato pH 5.2, [177] - 10 mM de glicina pH 5.2, [178] - 10 mM de Histidina pH 5.2, [179] - 10 mM de succinato pH 5.2.

[180] A troca de tampão foi realizada com uma diluição de 5 vezes do DS acima mencionado em um dos quatro tampões relevantes e equilibrando / concentrando até obter o volume inicial. A operação foi repetida três vezes. Os quatro materiais de substância da droga equilibrados foram testados quanto ao teor proteico por OD antes para formulações de fabricação.

Formulações 1-21 (em tampão de citrato - fosfato) [181] O material DS trocado (26,4 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (30,30 gramas). Se necessário, a intensidade do tampão foi ajustada (molaridade inicial do DS trocado: 10 mM; faixa de molaridade nas fórmulas DoE: 10-50 mM) pela adição de di-hidrato de hidrogeno-fosfato dissódico e ácido cítrico mono-hidratado. A solução foi agitada até a dissolução completa. O estabilizador foi então adicionado: Sorbitol (2,04 gramas) ou dextrose (2,02 g) ou inositol (2,02 g) ou maltose mono-hidratada (4,04 g) ou monocloridrato de lisina (2,02 g) ou cloreto de sódio (0,327 g) ou sacarose (3,83 g). A solução foi

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34/61 agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi, em seguida, adicionado: 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 40 ou 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 80 ou 0,4 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP ou 20 mg de Kollidon 12PF (sem solução estoque necessária). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido o-fosfórico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (40 g) com o tampão relevante.

Formulações 22-31 (em tampão de g liei na) [182] O material DS trocado (24,5 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (32,65 g). Se necessário, a intensidade do tampão foi ajustada (molaridade inicial do DS trocado: 10 mM; faixa de molaridade nas fórmulas DoE: 10-50 mM) por adição de glicina. A solução foi agitada até a dissolução completa. O estabilizador foi então adicionado: Sorbitol (2,04 g) ou dextrose (2,02 g) ou inositol (2,02 g) ou maltose mono-hidratada (4,04 g) ou monocloridrato de lisina (2,02 g) ou cloreto de sódio (0,327 g) ou sacarose (3,83 g). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi, em seguida, adicionado: 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 40 ou 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 80 ou 0,4 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP ou 20 mg de Kollidon 12PF (sem solução estoque necessária). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (40 g) com o tampão relevante.

Formulações 32-43 (em tampão de glicina) [183] O material DS trocado (23,2 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (34,48 g). Se necessário, a intensidade do tampão foi ajustada (molaridade inicial do DS trocado: 10 mM; faixa de molaridade nas fórmulas DoE: 10-50 mM) por adição de glicina. A

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35/61 solução foi agitada até a dissolução completa. O estabilizador foi então adicionado: Sorbitol (2,04 g) ou dextrose (2,02 g) ou inositol (2,02 g) ou maltose mono-hidratada (4,04 g) ou monocloridrato de lisina (2,02 g) ou cloreto de sódio (0,327 g) ou sacarose (3,83 g). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi, em seguida, adicionado: 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 40 ou 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 80 ou 0,4 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP ou 20 mg de Kollidon 12PF (sem solução estoque necessária). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (40 g) com o tampão relevante.

Formulações 64-80 (em tampão succínico) [184] O material DS trocado (22,5 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (35,55 gramas). Se necessário, a intensidade do tampão foi ajustada (molaridade inicial do DS trocado: 10 mM; faixa de molaridade nas fórmulas DoE: 10-50 mM) por adição de ácido succínico. A solução foi agitada até a dissolução completa. O estabilizador foi então adicionado: Sorbitol (2,04 g) ou dextrose (2,02 g) ou inositol (2,02 g) ou maltose mono-hidratada (4,04 g) ou monocloridrato de lisina (2,02 g) ou cloreto de sódio (0,327 g) ou sacarose (3,83 g). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi, em seguida, adicionado: 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 40 ou 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 80 ou 0,4 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP ou 20 mg de Kollidon 12PF (sem solução estoque necessária). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (40 gramas) com o tampão relevante. Formulações 44-63 (em tampão de histidina)

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36/61 [185] 0 material DS trocado (24,4 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (32,80 g). Se necessário, a intensidade do tampão foi ajustada (molaridade inicial do DS trocado: 10 mM; faixa de molaridade nas fórmulas DoE: 10-50 mM) por adição de histidina. A solução foi agitada até a dissolução completa. O estabilizador foi então adicionado: Sorbitol (2,04 g) ou dextrose (2,02 g) ou inositol (2,02 g) ou maltose mono-hidratada (4,04 g) ou monocloridrato de lisina (2,02 g) ou cloreto de sódio (0,327 g) ou sacarose (3,83 g). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi, em seguida, adicionado: 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 40 ou 0,4 mL de um estoque de 50 mg/ml de Tween 80 ou 0,4 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP ou 20 mg de Kollidon 12PF (sem solução estoque necessária). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (40 gramas) com o tampão relevante.

Filtração e preenchimento [186] Cada formulação foi filtrada através de um filtro de 0,22 micron montado sobre uma seringa de 50 ml (Millex GP de 0,22 _m de membrana Express PES ou Millex GV de 0,22 _m de membrana de PVDF Durapore) foram usados. A solução filtrada foi então preenchida no recipiente relevante (2 ml/recipiente).

2.3 RESULTADOS

Verificação de teor de proteína por OD sobre fabricação [187] O teor de proteína foi determinado por OD no tempo 0 (sobre a fabricação). Valores em linha com o alvo pretendido foram encontrados (20 mg/ml).

2.3.1 Estresse térmico índice de agregação por OD [188] O índice de agregação foi determinado por OD. Informações

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37/61 adicionais sobre o índice de agregação como uma ferramenta para detectar partículas subvisíveis / agregadas maiores não detectáveis por SE-HPLC são providas na seção anexo. Verificou-se que o tampão de histidina está geralmente associado a aumentos mais elevados do índice de agregação sobre o estresse (isto é, maior aumento em partículas), de forma mais significativa quando o pH é aumentado 5,0-

6,6 (efeito dependente do pH). Nos outros tampões, alterações no índice de agregação são geralmente mais baixas, indicando assim aumentos menores em partículas subvisíveis. Os aumentos no índice de agregação observados em algumas (poucas) amostras formuladas em tampão de citrato-fosfato e glicina não são diretamente atribuíveis a um fator específico (por exemplo, estabilizante ou tensoativo do tipo). Os dados foram analisados estatisticamente por ANOVA para Modelo Linear de Superfície de Resposta, que forneceu o seguinte resultado:

[189] Impacto estatisticamente significativo de tipo de tampão, intensidade e pH (todos têm um valor de p < 0,001): a fim de minimizar de índice de agregação, baixas intensidades de tampão devem ser direcionadas (10 mM), em associação com faixas de pH baixas em citrato-fosfato (4,0-5,0) e glicina (4,0-5,8) e succinato (5,0-5,5), ao passo que a histidina geralmente determina um impacto negativo sobre as partículas subvisíveis / formação de agregados maior.

Total de agregados por SE-HPLC [190] Total de agregados (HMWs) foi determinado por SE-HPLC no tempo 0 e após o estresse térmico. Citrato - fosfato geralmente leva à agregação mais elevada do que a fórmula de referência (limite de referência sinalizado como uma barra horizontal vermelha no gráfico), mais particularmente conforme o pH aumenta. Em tampão de glicina, faixas de pH baixas devem ser preferidas (inferior a 5,0), sendo os valores de pH mais elevados associados a uma maior agregação (semelhante a quando tampão de citrato é utilizado). Succinato

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38/61 geralmente conduz a valores de agregação mais elevados do que a referência em todas as condições, enquanto tampão de histidina a pH baixo (5,0-5,5) parece fornecer valores de agregação comparáveis para a referência. Os dados também foram avaliados estatisticamente por ANOVA para Modelo Linear de Superfície de Resposta e tipo de tampão foi confirmado ser um fator significativo (valor p = 0,02). Em geral, a fim de reduzir agregados sobre o estresse térmico, citrato - fosfato (faixa de pH 4,0 - 5,0), glicina (faixa de pH 4,0 - 6,8) e histidina (faixa de pH 5,05,8) deve ser preferido em relação a tampão succinato.

[191] Combinações como aquelas presentes em formulações #2 (Tween 40 + Dextrose em tampão fosfato - citrato, pH 4,0), a formulação #22 (Kollidon 12PF + cloreto de sódio em tampão de glicina, pH 4,0) e formulação #28 (Tween 40 + cloreto de sódio em tampão de glicina, pH 4,5) parecem ser desfavoráveis para a estabilização de proteínas (aumento significativo na agregação, apesar das condições de pH / tampão ideais aplicadas), possivelmente devido a incompatibilidade de Kollidon 12PF e Tween 40 com um pH baixo (cerca de 4,0-4,5) / interação com estabilizadores específicos, como o cloreto de sódio. Fragmentos por Bioanalizador [192] Níveis de fragmentação foram avaliados por Bioanalisador. Embora não haja resultados estatisticamente significativos que poderíam ser destacados por avaliação ANOVA, condições que eram mais eficazes na minimização de fragmentação proporcionando percentagens de LMW em linha com a composição de referência podem ser realçadas:

[193] - Tampão de citrato - fosfato, na faixa de pH 4,5 - 7,0 [194] - Tampão de glicina na faixa de pH 4,0-5,8.

[195] Considerando-se a variabilidade do método (até ± 2-3% em LMWs é comum quando Bioanalisador é aplicado), outras condições (como as composições restantes em tampões de histidina e succinato)

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39/61 foram observadas para manter os % de LMW relativamente baixa e são, portanto, passíveis de investigação adicional.

Partículas visíveis por inspeção visual [196] A presença de partículas visíveis foi avaliada através de inspeção visual antes e após o estresse térmico. Condições variáveis em tampão de citrato - fosfato pode gerar a presença de partículas visíveis (mais tipicamente em partículas - como suspensões) seguindo o estresse térmico. Em tampão de glicina, a formação de partículas é mais frequentemente associada com a presença de espécies Tween (ID de Amostra # 23, 24, 26, 28, contendo Tween 40) e a formulação # 30 contendo Tween 80. Outras formulações em tampão de glicina (ID de Amostra de # 32 a # 39) mostrou a presença de partículas no tempo 0, o que tende a diminuir após estresse (possíveis aglomerados reversíveis). Em histidina, espécies Tween são geralmente associadas à formação de partículas visíveis sobre estresse (todas as formulações mostrando partículas visíveis após o estresse contêm uma das duas alternativas de Tween). Em tampão de succinate, partículas observadas no tempo 0 na maioria das formulações foram consideradas diminuindo após o estresse térmico (possível perturbação das associações reversíveis ao longo do tempo).

Resumo: Estresse térmico [197] De acordo com SE-HPLC, OD e Bioanalisador sobre o estresse térmico, condições que possam proporcionar desempenho favorável incluem:

[198] Tampões: Citrato - fosfato ou glicina (de preferência a um pH mais ácido e mais relevante na faixa de 4,0-5,0 para o fosfato citrato e 4,0 - 5,8 para glicina), [199] - Intensidade do tampão: preferivelmente baixa (como por resultado de índice de agregação), [200] - Estabilizador: nenhuma indicação específica obtida,

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40/61 [201] - Tensoativo: Kolliphor ELP observado para ser eficaz na redução de partículas subvisiveis.

2.3.2 Estresse de luz índice de agregação por OD [202] índice de agregação na maior parte das composições DoE em tampão de citrato - fosfato foi considerado para ser mais elevado do que na fórmula de referência (mais significativamente na faixa de pH mais elevada). O efeito do pH também foi confirmado em tampão de glicina, que foi, no entanto, verificado reduzir consideravelmente o índice de agregação em relação ao tampão de citrato - fosfato (na faixa de pH 4,0 - 4,5 valores comparáveis com composições de referência ou inferiores foram destacados). A histidina pode geralmente causar aumentos consideráveis no índice de agregação, bem como um tampão de succinato (histidina notavelmente pior do que o succinato). A análise estatística por análise de variância confirmou o impacto significativo do tipo de tampão, pH e intensidade (Valor p < 0,0001), indicando que as melhores condições para minimizar a formação de partículas incluem a uso de tampão de fosfato citrato (na faixa de 4,0 - 5,0 e em tampão de baixa intensidade), glicina (no intervalo 4,0-5,8). Tensoativo também foi observado para ter algum impacto na estabilidade, sendo Kolliphor ELP a melhor opção para ser considerado quando visando à redução de partículas.

Total de agregados por SE-HPLC [203] Total de agregados (HMWs) foi determinado por SE-HPLC no tempo 0 e após o estresse de luz. Citrato - fosfato geral mente leva à agregação mais elevada do que a fórmula de referência, mais particularmente conforme o pH aumenta. Em tampão de glicina, faixas de pH baixas devem ser preferidas (inferior a 4,8), sendo os valores de pH mais elevados associados a uma maior agregação (semelhante a quando tampão de citrato é utilizado). Succinato geralmente conduz a

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41/61 valores de agregação mais elevados do que a referência em todas as condições, enquanto tampão de histidina (faixa inteira além de poucas exceções) parece fornecer valores de agregação comparáveis para a referência.

[204] Os dados também foram avaliados estatisticamente por ANOVA para Modelo Linear de Superfície de Resposta e tipo de tampão e o pH foi confirmado para ser fatores significativos (p < 0,0001). Em geral, a fim de reduzir agregados sobre o estresse térmico, glicina (faixa de pH 4,0-5,0) e histidina (faixa de pH 5,0-6,0) devem ser preferidas em relação a tampões de succinato e fosfato e citrato. Importante, estabilizadores como lisina, dextrose, sorbitol e sacarose proporcionam uma melhor estabilização contra o estresse de luz do que o cloreto de sódio, maltose e Inositol (valor p < 0,01).

Pureza por CE - SDS [205] Pureza, conforme determinado pela CE - SDS carrega a informação de ambas as espécies HMWs e LMW como é os resultados do cálculo: 100 -% de HMWs por CE - SDS -% de LMW por CE - SDS. Valores de pureza foram determinados antes e após o estresse de luz. A maioria das formulações mostra pureza mais elevada do que as composições de referência sobre o estresse de luz. Condições que podem ter um impacto negativo sobre a estabilidade são tipicamente: fosfato citrato a pH elevado (> 7,0) e tampão de glicina a pH baixo (4,0); o último é o mais provavelmente para ser explicado com o impacto negativo de Tween 40 / Kollidon 12PF a pH baixo. Histidina foi considerada ter um impacto positivo sobre a pureza, maximizando desempenhos de formulação contra a exposição à luz. A análise estatística por ANOVA confirmou comportamento superior associado para uso de histidina como um tampão, com desempenhos comparáveis obtidos quando se utiliza citrato fosfato, glicina ou succinato.

Perfil de isoformas por clEF

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42/61 [206] Perfis de isoformas foram determinados no tempo 0 e após a exposição à luz. A exposição à luz em geral, determina um aumento em isoformas ácidas devido a fenômenos de foto-oxidação. Tal aumento foi calculado para todas as formulações DoE. Várias condições são favoráveis para a estabilização de proteínas (isto é, alterações inferiores no perfil de isoformas), tais como tampão de citrato - fosfato e glicina (mais tipicamente na faixa de pH mais baixo). Desempenhos inferiores observados quando histidina é utilizada como tampão de formulação. Os dados, avaliados por ANOVA para Modelo Linear de Superfície de Resposta confirmou o acima (fator de estatisticamente significativo do tipo de tampão com valor p < 0,0001). A análise estatística também confirmou um impacto positivo (redução em alteração de isoformas ácidas) quando L-lisina é usada como estabilizador. O efeito é bastante claro ao observar as mudanças encontradas em formulações # 11,29, 31, 38, consideravelmente mais baixas do que aquelas no espaço de formulação circundante com estabilizadores alternativos.

Partículas visíveis por inspeção visual [207] A presença de partículas visíveis foi avaliada através de inspeção visual antes e após o estresse de luz. A maioria das formulações não é afetada pelo estresse de luz em termos de partículas visíveis. Sem condições específicas relacionadas com a formação de partículas sobre o estresse de luz.

Sumário: Estresse de exposição à luz [208] De acordo com SE-HPLC, OD, CE-SDS, clEF e inspeção visual sobre o estresse de luz, condições que possam proporcionar desempenho favorável incluem:

[209] - Tampões: tampão de glicina (de preferência a um pH mais ácido e mais relevante na faixa 4,0-4,5), [210] - Intensidade do tampão: preferivelmente baixa (como por resultado de índice de agregação),

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43/61 [211] - Estabilizador: Lisina (monocloridrato), dextrose e sorbitol mostraram um impacto positivo sobre a estabilidade da proteína [212] - Tensoativo: Kolliphor ELP observado para ser eficaz na redução de partículas subvisíveis

2.3.3 Congelamento - descongelamento índice de agregação por densidade óptica [213] Após ciclos de congelamento - descongelamento 3X (-80 ^QC temperatura ambiente), mais uma vez, é confirmado que tampão de glicina (pH baixo) fornece os valores mais baixos indicando a formação de partículas inferiores. Um aumento do índice de agregação é observado tanto em tampão de citrato - fosfato quanto tampão de glicina como aumento do pH (efeito de pH mais crítico em tampão de citrato fosfato). Geralmente os valores do índice de agregação mais elevados do que a composição de referência são observados em histidina e succinato. A análise estatística por ANOVA destacou um impacto moderadamente significativo de tipo de tampão, pH e tipo de tensoativo (0,01 < valor p < 0,05), indicando que os tampões de citrato - fosfato e glicina a pH inferior a 6,0 é a melhor opção para a estabilização de proteínas contra formação de partículas induzida por congelamento descongelamento, sendo tampão de succinato e histidina ligeiramente agressivo no que refere-se a composição de referência. Uma comparação do impacto de diferentes tensoativos mostra desempenhos comparáveis de Tween 80, Kollidon 12PF e Kolliphor ELP (ligeiramente preferível), enquanto que espera-se de Tween 40 um aumento do índice de agregação.

Total de agregados por SE-HPLC [214] Todas as formulações apresentam agregados totais inferiores do que a composição de referência sobre o estresse por congelamento -descongelamento (valores comparáveis ao tempo 0). Em tampão de citrato - fosfato, agregados tendem a aumentar até ao

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44/61 nível da composição de referência como o principal efeito do pH (2,0 2,5% de HMWs) sendo aumentado até a faixa 7,0-7,5 com alterações menores / insignificantes sobre congelamento - descongelamento, enquanto a pH < 7,0 agregados totais tipicamente ascendem para mais baixo do que 1,5% (antes e depois do estresse). Em tampão de glicina e histidina todos os valores agregados totais após quantidade de estresse para menos do que 1% (comparável com valores no tempo 0). Em succinato, congelamento - descongelamento não foi considerado como determinante de alterações críticas no que refere-se ao tempo 0, contudo agregados totais são geralmente um pouco maiores do que na glicina e histidina (ainda igual a ou inferior a 1,5%, isto é, consideravelmente mais baixo do que a referência, após o estresse). A análise estatística confirmou o impacto significativo do tipo de tampão e pH (valor p < 0,0001), sendo tampão de citrato - fosfato (pH 4,0 - 6,0), tampão de glicina (pH 4,0 - 7,0) e histidina (5,0 - 6,6) as melhores opções para estabilização de proteínas contra congelamentodescongelamento. Um impacto significativo (valor p < 0,01) também foi destacado para o fator do tipo de estabilizador: Cloridrato de lisina minimiza a agregação no tempo 0 e os efeitos relacionados com o estresse por congelamento-descongelamento (cf. ID de Amostra # 6-911-17 em tampão de citrato); sacarose e dextrose, de forma semelhante, exibem propriedades de estabilização.

Partículas visíveis por inspeção visual [215] Nos resultados da inspeção visual após congelamento descongelamento as tendências gerais que podem ser destacadas:

[216] - Em citrato - fosfato, formação de partículas é mais provável que a pH mais elevado, [217] - Em tampão de glicina a pH baixo (<5), formação de partículas está essencialmente relacionada com a presença de Tween 40 (tensoativo desestabilizante),

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45/61 [218] - Em tampão de histidina, espécies Tween estão geralmente relacionadas com a formação de partículas, em succinate, nenhum fator específico parece estar relacionado com a formação de partículas, que é no entanto quase uma ocorrência frequente quando este tampão é utilizado.

Resumo: Estresse por congelamento - descongelamento [219] De acordo com SE-HPLC, OD e inspeção visual após ciclos de congelamento 3X - descongelamento (-80 ^QC temperatura ambiente), as condições que podem proporcionar desempenhos melhorados favoráveis incluem:

[220] - Tampões: glicina ou tampões de citrato - fosfato (de preferência a um pH mais ácido e mais relevante na faixa de 4,0 - 6,0), [221] - Estabilizador: Lisina (monocloridrato), dextrose e sacarose apresentaram um impacto positivo sobre a estabilidade da proteína (redução do total de agregados por SE-HPLC), [222] - Tensoativo: incompatibilidades de espécies Tween com as formulações de glicina e histidina tamponadas devem ser consideradas e evitadas para minimizar a formação de partículas visíveis.

2.3.4 Estresse mecânico índice de agregação por Densidade óptica [223] Como mostrado previamente, os fatores que permitem que os valores do índice de agregação mais semelhantes ao de referência (isto é, um mínimo ou nenhum aumento em relação ao tempo 0) são:

[224] Citrato - fosfato geralmente conduz a valores de índice de agregação mais elevados do que a referência, mais particularmente como aumentos de pH e em presença de espécies Tween: ID de Amostra # 2 (Tween 40), # 8 (Tween 80), # 11 (Tween 40), # 19 (Tween 40), # 21 (Tween 40).

[225] Glicina proporciona um efeito notável estabilizante na faixa de pH baixo (valores de índice de agregação ligeiramente mais baixos

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46/61 do que a referência).

[226] Tampão de histidina deve ser preferivelmente utilizado a valores de pH próximos de 5,0 e sem Tween 40 e Tween 80, que parecem estar relacionados com os valores de índice de agregação mais elevados: ID de Amostra # 50 (Tween 40), # 60 (Tween 80), # 62 (Tween 40).

[227] Succinato geralmente leva a valores de índice de agregação um pouco mais elevados do que a composição de referência, independentemente dos fatores específicos envolvidos.

[228] Os resultados acima foram confirmados por análise de variância, que indicou tipo de tampão e o pH como fatores estatisticamente significativas (valor p < 0,01) e tensoativo como fator moderadamente significativo (0,01 < valor p < 0,05).

[229] Tampão de glicina a pH baixo (4,0-5,5) é realçado como o tampão de escolha para minimizar o índice de agregação. A tendência no sentido de um aumento do índice de agregação determinado por espécies de Tween (Tween 40 pior do que Tween 80) é confirmada pelos modelos de resposta de superfície.

Total de agregados por SE-HPLC [230] Aumento mínimo em relação ao tempo 0 foram observados na maioria das formulações, indicando um impacto menor a partir deste tipo de estresse. Diferenciação em termos de agregados totais parece ser o efeito primário do tipo de tampão e pH, como os já realçados tipo de tampão e pH confirmaram como sendo fatores estatisticamente significativos por ANOVA (valor p < 0,0001); assim como a intensidade de tampão (valor p < 0,01) e o tipo de estabilizador (0,01 < valor p < 0,05).

[231] As faixas preferidas e condições para minimizar agregados para o nível de composição de referência (< 1%) incluem: tampão de citrato - fosfato (pH < 5 e uma intensidade iônica baixa); tampão de

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47/61 glicina (pH completo e faixa da intensidade iônica); tampão de histidina (faixa completa) e um tampão de succinate (pH 5,0-5,5 e uma intensidade iônica baixa). Estabilizadores preferidos são monocloridrato de L-lisina, maltose, sacarose e dextrose.

Fragmentos por Bioanalisador [232] Exceto para ID de Amostra # 22-23-24 (em tampão de glicina, pH 4,0, contendo Tween 40 ou Kollidon 12PF), as formulações restantes mostraram % de LMW comparável a ou menor do que a composição de referência sobre o estresse mecânico, também considerando a variabilidade deste método (± 2-3% em % DE LMW de resultados é característica). Portanto, pode concluir-se que a maioria das condições testadas pode ajudar a melhorar a resistência da proteína contra a fragmentação desde que combinações como tampão de glicina (pH baixo) + Tween 40 sejam evitadas. A elaboração estatística destacou os melhores desempenhos das formulações em tampões de succinate e histidina, como sendo cuidadosamente considerados e avaliados como substancialmente comparáveis à / ligeiramente melhores do que as outras fórmulas em tampão citrato - fosfato e glicina devido à variabilidade do método acima discutido.

Partículas visíveis por inspeção visual [233] Nos resultados da inspeção visual sobre congelamento descongelamento estão as tendências gerais que podem ser destacadas:

[234] - Em tampão de citrato - fosfato (ID de Amostra #1 - 21), a formação de partículas ocorre em quase todas as condições, independentemente de fatores específicos envolvidos, [235] - Em tampão de glicina, a formação de partículas está essencialmente relacionada com a presença de Tween 40 (ID de Amostra # 23, 26, 28 e Kollidon 12PF (Formulações # 22, 32, 37, 43) [236] - Em tampão de histidina, todas as fórmulas que mostram

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48/61 aumento de partículas visíveis após agitação mecânica contêm qualquer um de Tween 40 ou Tween 80, [237] - Em succinato, não há fatores específicos relacionados com a formação de partículas.

Resumo: Estresse mecânico [238] De acordo com SE-HPLC, OD, Bioanalisador e inspeção visual quando da agitação mecânica, condições que podem proporcionar desempenhos favoráveis no que refere-se a composições de referência incluem:

[239] - Tampões: glicina (de preferência a um pH mais ácido e mais relevante na faixa de 4,0 - 5,5), histidina e succinato a pH de cerca de 5,0.

[240] - Estabilizador: Lisina (monocloridrato), sacarose, maltose e dextrose mostraram um impacto positivo sobre a estabilidade da proteína (redução do total de agregados por SE-HPLC), [241] - Tensoativo: incompatibilidades de espécies Tween com formulações tamponada de glicina, citrato-fosfato e histidina devem ser consideradas e evitadas para minimizar a formação de partículas visíveis.

Exemplo 3 - Optimizacão de formulações

3.1 Otimização de formulação [242] Os dados apresentados no Exemplo 2 foram combinados para identificar o espaço de formulação que podería estabilizar adequadamente Avelumab (fatores avaliados: Tipo de tampão, pH e força, tipo de estabilizador e tensoativo) contra estresses térmico, congelamento - descongelamento, mecânico e de luz.

Utilizar os seguintes critérios [243] Minimizar HMWs (por SE-HPLC) após estresse térmico, agitação mecânica, congelamento - descongelamento e estresse de luz, [244] · Minimizar LMWs (por Bioanalisador) após estresse térmico

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49/61 e agitação mecânica, [245] · Maximizar pureza (por SDS-CE), após estresse de luz, [246] · Minimizar isoformas ácidas (por CLEF) após alteração de estresse de luz, [247] · Valores de índice de agregação alvo (por OD) inferior a 2 após estresse térmico, agitação mecânica, congelamento descongelamento e estresse de luz, [248] para cada tipo de tampão as 10 formulações mais promissoras foram extrapoladas como mostrado na Tabela 5.

Tabela 5: Formulações candidatas (extrapolação DoE)

Número	pH de tampão	Intensidade de tampão (mM)	Tensoativo (0,5 mg/mL)	Estabilizador (280 mM)	Tipo de tampão
1	4,4	10	Kolliphor ELP	Lisina	Glicina
2	4,1	10	Tween 80	Lisina	Glicina
3	4,0	10	Tween 80	Lisina	Glicina
4	4,0	10	Kolliphor ELP	Dextrose	Glicina
5	4,0	10	Kolliphor ELP	Dextrose	Glicina
6	4,0	10	Kolliphor ELP	Dextrose	Glicina
7	4,0	10	Kollidon 12PF	Lisina	Glicina
8	4,0	10	Kolliphor ELP	Sorbitol	Glicina
9	4,0	10	Kolliphor ELP	Sacarose	Glicina
10	4,0	10	Kolliphor ELP	Sacarose	Glicina

Número	pH de tampão	Intensidade de tampão (mM)	Tensoativo (0,5 mg/mL)	Estabilizador (280 mM)	Tipo de tampão
1	4,0	10	Kollidon 12PF	Sorbitol	Citratofosfato
2	4,2	15	Kollidon 12PF	Lisina	Citratofosfato
3	4,3	17	Kollidon 12PF	Sacarose	Citratofosfato

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Número	pH de tampão	Intensidade de tampão (mM)	Tensoativo (0,5 mg/mL)	Estabilizador (280 mM)	Tipo de tampão
4	4,1	20	Kollidon 12PF	Lisina	Citratofosfato
5	4,1	15	Tween 80	Lisina	Citratofosfato
6	4,0	27	Kollidon 12PF	Sacarose	Citratofosfato
7	4,1	19	Kolliphor ELP	Sacarose	Citratofosfato
8	4,1	22	Kolliphor ELP	Dextrose	Citratofosfato
9	4,2	13	Tween 80	Sorbitol	Citratofosfato
10	4,2	17	Kolliphor ELP	Dextrose	Citratofosfato

Número	pH de tampão	Intensidade de tampão (mM)	Tensoativo (0,5 mg/mL)	Estabilizador (280 mM)	Tipo de tampão
1	5,0	10	Kolliphor ELP	Dextrose	Histidina
2	5,0	10	Kolliphor ELP	Dextrose	Histidina
3	5,0	10	Kolliphor ELP	Sorbitol	Histidina
4	5,0	10	Kolliphor ELP	Sacarose	Histidina
5	5,0	11	Kolliphor ELP	Sacarose	Histidina
6	5,1	10	Kolliphor ELP	Sorbitol	Histidina
7	5,1	10	Kolliphor ELP	Sacarose	Histidina
8	5,0	10	Kolliphor ELP	Inositol	Histidina
9	5,0	15	Kolliphor ELP	Sorbitol	Histidina
10	5,0	10	Kolliphor ELP	Lisina	Histidina

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Número	pH de tampão	Intensidade de tampão (mM)	Tensoativo (0,5 mg/mL)	Estabilizador (280 mM)	Tipo de tampão
1	5,0	10	Kollidon 12PF	Sacarose	Succinato
2	5,0	10	Kolliphor ELP	Lisina	Succinato
3	5,0	10	Kolliphor ELP	Lisina	Succinato
4	5,0	12	Kolliphor ELP	Lisina	Succinato
5	5,1	10	Kolliphor ELP	Lisina	Succinato
6	5,1	10	Kollidon 12PF	Sacarose	Succinato
7	5,0	10	Kollidon 12PF	Sorbitol	Succinato
8	5,0	10	Kollidon 12PF	Lisina	Succinato
9	5,0	10	Kollidon 12PF	Dextrose	Succinato
10	5,0	14	Kollidon 12PF	Sacarose	Succinato

3.2 Formulações líderes a serem ainda avaliadas [249] Além das formulações da Tabela 5, as onze formulações listadas na Tabela 6 pareceram mais promissoras. Por isso, elas foram fabricadas e avaliadas após o estresse térmico e ciclos de congelamento e descongelamento repetidos como pelo painel analítico mostrado na Tabela 7.

[250] O estresse térmico foi selecionado como as condições de estresse mais relevantes para avaliar o desempenho da formulação e, eventualmente, prever estabilidade em condições de refrigeração. Congelamento - descongelamento também foi considerado a fim de antecipar quaisquer questões relacionadas com excursões de temperatura / armazenamento de materiais DS pré-formulados. Os resultados das experiências efetuadas com estas formulações estão descritos nos parágrafos seguintes.

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Tabela 6: Formulações líderes resultantes de DoE

DP	PH (± 0.1	Tampão	Intensidade de tampão (mM)	Estabilizador	Surfactant (0.5 mg/mL)
1	4.4	Glicina	10	Lisina (monocloridrato) 280 mM	Kolliphor ELP
2	4.4	Glicina	10	Lisina (monocloridrato) 140 mM	Kolliphor ELP
3	4.4	Glicina	10	Lisina (monohidrato) 280 mM	Kolliphor ELP
4	4.4	Glicina	10	Acetato de lisina 140 mM	Kolliphor ELP
5	4.1	Glicina	10	Lisina (monohidrato) 280 mM	Tween 80
6	5.0	Histidina	10	Dextrose 280 mM	Kolliphor ELP
7	5.0	Histidina	10	Sacarose 280 mM	Kolliphor ELP
8	4.2	Citrato- Fosfato	15	Lisina (monocloridrato) 140 mM	Kollidon 17PF
9	4.3	Citrato- Fosfato	17	Sacarose 280 mM	Kollidon 17PF
10	5.0	Succinato	10	Lisina (monocloridrato) 140 mM	Kolliphor ELP
11	5.0	Succinato	10	Sacarose 280 mM	Kollidon 17PF

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Tabela 7: Painel de análises conduzidas em formulações líderes

Teste	Tempo 0	Estresse Térmico (4 semanas a 40±2O 75%RH)	CongelamentoDescongelamento 3X
Partículas Visíveis (visual)	X	X	X
pH	X	X	-
Turvação (O D)	X	X	X
Partículas subvisíveis (PAMAS)	X	X	X
Teor de proteína (OD)	X	X	-
HMWs por SE-HPLC	X	X	X
LMWs por Bioanalisador	X	X	-
Perfil de isorformas por iCE	X	X	-
Estrutura Terciária por CD	X	X	-

3.3 Fabricação de formulações líderes resultantes da etapa DoE [251] Um material de substância de droga da composição: 18,6 mg/mL de Avelumab, 51 mg/mL de D-manitol, 0,6 mg/mL de ácido acético glacial, a pH 5,2 (tensoativo - livre) foi equilibrado por filtração de fluxo tangencial (usando um cortador Pellicon XL Cassete Biomax 50 kDa em PED) nos três tampões:

[252] 10 mM de glicina, pH 4,4, [253] 10 mM de histidina, pH 5,0, [254] 15 mM de citrato-fosfato, pH 4,2, [255] 10 mM de succinato, pH 5,0.

[256] A troca de tampão foi realizada com uma diluição de 5 vezes do DS acima mencionado em um dos quatro tampões relevantes e equilibrando / concentrando até se obter o volume inicial. A operação foi repetida três vezes. Os quatro materiais de substância de droga equilibrados foram testados quanto ao teor proteico pelo OD antes de fabricação de formulações.

Formulações 1-5 (em tampão de glicina)

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54/61 [257] 0 material DS trocado (21,8 mg/mL) foi pesado em um recipiente de vidro (64,2 g). O estabilizador foi então adicionado: monocloridrato de lisina (3,58 gramas para DP1 ou 1,79 g para DP2) ou lisina mono-hidratada (3,22 gramas para DP3 e DP5) ou acetato de lisina (2,02 g, para DP4). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi então adicionado: 0,7 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP (em 10 mM de glicina de pH 4,4 para DP 12-3-4) ou 0,7 mL de um de 50 mg/ml de Tween 80 (em 10 mM de glicina pH 4,1 para DP5). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (70 g) com o tampão relevante.

Formulações 6-7 (em tampão de histidina) [258] O material DS trocado (23,2 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (60,3 g). O estabilizador foi então adicionado: Dextrose (3,53 g para DP6) ou sacarose (6,71 g, para DP7). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi então adicionado: 0,7 ml de um estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP (em 10 mM de tampão de histidina a pH 5,0 para DP6 e 7). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento (pH 5,0) com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (70 g) com tampão relevante (10 mM de tampão de histidina a pH 5,0).

Formulações 8-9 (em tampão de citrato-fosfato) [259] O material DS trocado (23,4 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (59,8 g). Se necessário (DP9), a intensidade do tampão foi ajustada por adição de ácido cítrico (mono-hidrato) e hidrogeno fosfato dissódico (di-hidrato). O estabilizador foi então adicionado: monocloridrato de lisina (1,79 g, para DP8) ou sacarose (6,71 g, para DP9). A solução foi agitada até a dissolução completa. O

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55/61 tensoativo foi, em seguida, adicionado: 35 mg de Kollidon 17PF (tanto para DP8 e 9). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento (pH 4,2 para DP8 e 4,3 para DP9) com ácido diluído o-fosfórico ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (70 g) com o tampão relevante.

Formulações 10-11 (em tampão succinato) [260] O material DS trocado (24,5 mg/ml) foi pesado em um recipiente de vidro (57,1 gra g ms). O estabilizador foi então adicionado: monocloridrato de lisina (1,79 g para DP10) ou sacarose (6,71 g, para DP 11). A solução foi agitada até a dissolução completa. O tensoativo foi então adicionado: 0,7 ml de uma solução estoque de 50 mg/mL de Kolliphor ELP em 10 mM de tampão de succinato, pH 5,0 (DP10) ou 35 mg de Kollidon 17PF (DP11). A solução foi agitada até a dissolução completa. O pH foi medido e ajustado para direcionamento (pH 5,0 para DP10 e 11) com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de sódio. A solução foi levada ao peso final (70 g) com 10 mM de tampão de succinato, pH 5,0.

3.4 Resultados

3.4.1 Estresse térmico [261] Teor de proteína por OD\ Nenhuma alteração principal observada em relação ao tempo 0, após 4 semanas a 40 ^QC.

[262] pFl·. Os valores de pH no tempo 0 estavam em conformidade com o alvo. Nenhuma alteração principal observada em relação ao tempo 0, após 4 semanas a 40 ^QC.

Partículas visíveis por inspeção visual [263] Todas as formulações foram consideradas livres de partículas visíveis no tempo 0. Após o estresse, uma formulação (DP6) mostrou a presença de partículas (possivelmente formulação relacionada).

Turbidez por Nefelometria

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56/61 [264] A maioria das formulações têm valores de turbidez na faixa transparente ou ligeiramente opalescente com alterações mínimas após o estresse (DP 2-4-6-7-9-10-11). Outras formulações mostram ambas mudanças de turvação mais elevadas do que as ligeiramente opalescentes na faixa opalescente (DP1) ou valores na faixa opalescente já no tempo 0 com pequenas modificações / desprezíveis ao fim de estresse (DP 3-8). Formulação DP5 mostra um aumento significativo na turbidez (> 18 NTU) após o estresse.

Partículas subvisíveis por obscurecimento de luz [265] Partículas > 25 microns estavam bem abaixo do limite da Farmacopeia de 600 partículas / recipiente (tipicamente < 100 partículas).

[266] Partículas > 10 microns tinham contagens um pouco maiores, mas ainda estavam abaixo do limite de 6000 partículas / recipiente. DP8 e 9, em tampão de citrato-fosfato, apresentaram contagens mais elevadas do que os outros (ainda abaixo do limite acima) no tempo 0, com uma redução significativa após o estresse. Total de agregados por SE-HPLC [267] No que refere-se ao total de agregados por SE-HPLC no tempo 0 e após o estresse térmico, DP 1-2-3-4 (tampão de glicina) variou para o tipo de estabilizante e quantidade, mas tinham a mesma intensidade de tampão, tensoativo e pH): redução em monocloridrato de lisina de 280 mM (DP1) para 140 mM (DP2) parece favorecer a estabilidade da proteína. A taxa de agregação mais elevada foi confirmada quando Lisina mono-hidratada a 280 mM foi usada (DP3). Acetato de lisina (140 mM) proveu desempenhos similares a monocloridrato de lisina utilizado na mesma concentração (DP2). DP5 (tampão de glicina) mostrou um aumento significativo nos agregados (provavelmente devido a uma combinação desfavorável de Lisina mono-hidratada a 280 mM + Tween 80 em vez de Kolliphor ELP). DP6-

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57/61 (tampão de histidina) não mostrou alterações em agregados. DP8-9 (tampão de citrato-fosfato): sacarose em DP9 parece ser um fator crítico que pode melhorar significativamente o desempenho da formulação no que refere-se a DP8 (lisina mono-hidratada) sendo os outros ingredientes / parâmetros muito semelhantes (o mesmo tipo de tampão, mesmo tensoativo e pH semelhante: 4,2 vs. 4,3). DP10-11 (tampão de succinato): nenhuma mudança significativa na agregação foi observada (desempenhos semelhantes de Lisina mono-hidratada e Sacarose neste tampão).

Pesos moleculares mais baixos por Bioanalisador [268] Fragmentos por Bioanalisador no tempo 0 e após estresse térmico:

[269] DP 1-2-3-4 (tampão de glicina) variou para o tipo de estabilizante e quantidade, mas tinham a mesma intensidade de tampão, tensoativo e pH): aumento semelhante em fragmentos (+3-5% após estresse). DP5 (tampão de glicina) apresentou aumento significativo em espécies de peso molecular inferior (provavelmente devido a uma combinação desfavorável de Lisina mono-hidratada a 280 mM + Tween 80 em vez de Kolliphor ELP): aumento de + 13%, após o estresse. DP6-7 (tampão de histidina) não mostrou alterações em fragmentos. DP8-9 (tampão de citrato-fosfato): sacarose em DP9 (+ 6% em fragmentos, após estresse) parece ser um fator crítico que pode melhorar significativamente o desempenho da formulação no que refere-se a DP8 (Lisina mono-hidratada; 11% em fragmentos) sendo os outros ingredientes / parâmetros muito semelhantes (o mesmo tipo de tampão, mesmo tensoativo e pH semelhante: 4,2 vs. 4,3). DP10-11 (tampão de succinato): alterações mínimas para ambos (desempenhos semelhantes de Lisina mono-hidratada e Sacarose neste tampão): 13% em espécies de baixo peso molecular após o estresse.

Perfil de Isoformas por clEF

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58/61 [270] Perfil de isoformas no tempo 0 e após o estresse térmico: Após o estresse térmico todas as amostras geralmente tendiam a perder parte das principais espécies com aumento concomitante em espécies ácidas e pequenas alterações nas isoformas básicas. Mais em detalhe: DP 1-2-3-4-5 (tampão de glicina): foram observadas alterações semelhantes em perfil de isoformas. Para as cinco amostras, as principais espécies diminuíram em cerca de 10-12% (aumento em isoformas ácidas de 14 - 17% e diminuição em isoformas básicas de -4 / -6%). DP 6-7 (tampão de histidina): DP6 apresentou grandes alterações em perfil de isoformas e os perfis obtidos não poderíam ser elaborados devido à instabilidade provável a partir dos componentes escolhidos e/ou contaminação da amostra antes da análise. DP7 mostrou alterações semelhantes às amostras em tampão de glicina. DP8-9 (tampão de citrato-fosfato): alteração significativa em ambas as formulações, mais elevados do que os observados em outros tampões. Espécies ácidas foram encontradas para aumentar até 24-29% após o estresse.

[271] DP10-11 (tampão de succinato): DP10 apresentou alterações mínimas, mesmo mais baixas do que as outras amostras nos outros tampões: espécies principais diminuíam cerca de 7% (aumento em isoformas ácidas de cerca de 12% e diminuição em isoformas básicas de cerca de -5%). DP11 mostrou alterações superiores (aumento em isoformas ácidas após o estresse foi de + 20%). Estrutura terciária por dicroísmo circular [272] Dicroísmo circular foi realizado antes e após estresse nas formulações líderes. As amostras foram diluídas com WFI a 0,5 mg/ml e, em seguida, testadas em cuvetas de quartzo com 1 cm de comprimento de trajetória com um espectropolarímetro Jasco J-810, na faixa de 250 nm - 320 nm, a uma velocidade de varrimento de 20 nm/min (sensibilidade: padrão; largura de banda: a 1 mm; passo de dados 0,2

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59/61 nm; D.I.T.: 8 segundos; 4 réplicas) à temperatura ambiente. Conformação da proteína na maioria das formulações podería ser eficazmente retida, com apenas ligeiras alterações na região 260-280 nm (sinais de tirosina e fenilalanina). No entanto, algumas exceções podem ser observadas, onde as mudanças mais significativas poderíam ser encontradas o que pode indicar ruptura parcial / desdobramento e perda de estrutura após estresse térmico: DP5 (possível efeito do tipo de tensoativo presente), DP8 e 9 (formulações em tampão de citrato fosfato; possível efeito do tipo de tampão e combinação com outros ingredientes presentes).

3.4.2 Congelamento - descongelamento

Partículas visíveis por inspeção visual [273] Ciclos FT repetidos não foram observados como causando aumento significativo em partículas visíveis. Algumas formulações apresentaram partículas tipo fibras quando do estresse (não particulado / precipitado ou outras formas de formulação tipicamente relacionadas). Turbidez por Nefelometria [274] Após o congelamento - descongelamento, nenhuma alteração significativa ocorre nas formulações testadas. A maioria das formulações é transparente ou ligeiramente opalescente no tempo 0 e após estresse (exceção: DP 3, 5, 8, faixa de solução opalescente no tempo 0, com modificações insignificantes após estresse).

Partículas subvisíveis por método de obscurecimento [275] Partículas > 25 microns estavam bem abaixo do limite da Farmacopeia de 600 partículas / recipiente (tipicamente < 100 partículas). Partículas > 10 microns tinham contagens maiores, mas ainda abaixo do limite de 6000 partículas / recipiente. DP8 e 9, em tampão de citrato-fosfato, mostram as contagens mais elevadas do que os outros (ainda abaixo do limite acima) no tempo 0, sem nenhum aumento quando do estresse FT.

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Total de agregados por SE-HPLC [276] Nos agregados totais por SE-HPLC antes e após estresse FT, foram observadas alterações mínimas para todas as formulações (agregados total aumentaram de 0,2 - 0,5% ao fim de 3 ciclos de FT).

3.5 Conclusão [277] Em tampão de glicina, as condições mais adequadas para a estabilização de anticorpo incluem:

[278] Intensidade iônica baixa (10 mM), [279] pH baixo (4,0-4,4), [280] Lisina (monocloridrato), dextrose, sacarose e sorbitol como estabilizadores, [281] Tensoativos preferidos: Kolliphor ELP e Kollidon 12PF (Tween 80 a ser possivelmente evitado devido a preocupações de partículas visíveis).

[282] Em tampão de succinato, as condições mais adequadas para a estabilização de anticorpo incluem:

[283] Intensidade iônica baixa (10 mM), [284] pH 5,0-5,1 [285] Lisina (monocloridrato), dextrose, sacarose ou sorbitol como estabilizadores, [286] Tensoativos preferidos: Kolliphor ELP e Kollidon 12PF (Tween 80 a ser possivelmente evitado devido a preocupações de partículas visíveis).

[287] Em tampão de citrato - fosfato, as condições mais adequadas para a estabilização de anticorpo incluem:

[288] Intensidade iônica baixa (10-30 mM), [289] pH baixo (4,0-4,5), [290] Lisina (monocloridrato), dextrose, sacarose ou sorbitol como estabilizadores, [291] Tensoativos preferidos: Kolliphor ELP e Kollidon 12PF

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61/61 (Tween 80 a ser possivelmente evitado devido a preocupações de partículas visíveis).

[292] Em tampão de histidina, as condições mais adequadas para a estabilização de anticorpo incluem:

[293] Intensidade iônica baixa (10-15 mM), [294] pH 5,0-5,1, [295] Dextrose, sacarose, Lisina (monocloridrato), inositol, sorbitol como estabilizadores, [296] Tensoativos preferidos: Kolliphor ELP e Kollidon 12PF (Tween 80 a ser possivelmente evitado devido a preocupações de partículas visíveis).

[297] As formulações mais favoráveis da Tabela 6 foram consideradas ser DP 2, 4, 7, e 10.

Claims (35)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Formulação aquosa farmacêutica de anticorpo, caracterizada pelo fato de que compreende:

   (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a 30 mg/mL como o anticorpo;

   (ii) glicina, succinate, fosfato citrato ou histidina em uma concentração de 5 mM a 35 mM como o agente tamponante;

   (iii) monocloridrato de lisina, lisina monohidratada, acetato de lisina, dextrose, sacarose, sorbitol ou inositol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como o estabilizador;

   (iv) povidona, óleo de rícino de polioxila ou polissorbato em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como o tensoativo;

   sendo que a formulação não inclui a metionina, e ainda sendo que a formulação apresenta um pH de 3,8 a 5,2.
2. 2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que não inclui um antioxidante.
3. 3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração de Avelumab é cerca de 10 mg/mL a cerca de 20 mg/mL.
4. 4. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração dos referidos glicina, succinate, fosfato citrato ou histidina é de cerca de 10 mM a cerca de 20 mM.
5. 5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que concentração do referido monocloreto de lisina é de cerca de 140 mM a cerca de 280 mM, ou a concentração da referida lisina mono-hidratada é de cerca de 280 mM, ou a concentração do referido acetato de lisina é de cerca de 140 mM.
6. 6. Formulação, de acordo com qualquer uma das

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   2/9 reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração dos referidos dextrose, sacarose, sorbitol ou inositol é de cerca de 280 mM.
7. 7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração dos referidos povidona, óleo de rícino de polioxila ou polissorbato é de cerca de 0,5 mg/mL.
8. 8. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida povidona é a povidona de baixo peso molecular Kollidon 12PF ou 17PF, ou sendo que o referido óleo de rícino de polioxila é óleo de rícino de polioxila 35, ou sendo que o referido polissorbato é polissorbato 80.
9. 9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a concentração de Avelumab é cerca de 20 mg/mL.
10. 10. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) glicina em uma concentração de 5 mM a 15 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) Kollidon 12PF, óleo de rícino de polioxila 35 ou Polissorbato 80 em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo; sendo que a formulação apresenta um pH de 3,8 a 4.6.
11. 11. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende:

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    3/9 (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) succinato em uma concentração de 5 mM a 15 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) Kollidon 12PF ou óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,9 a 5,2.
12. 12. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) fosfato de citrato em uma concentração de 10 mM a 20 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose ou sorbitol, em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) Kollidon 12PF ou óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 3,8 a 4.7.
13. 13. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de

    20 mg/mL como o anticorpo;

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    4/9 (ii) histidina em uma concentração de 5 mM a 15 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina, dextrose, sacarose, inositol ou sorbitol em uma concentração de 100 mM a 320 mM como agente estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) Kollidon 12PF ou óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,25 mg/mL a 0,75 mg/mL, como tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,8 a 5,2.
14. 14. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) glicina em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,2 a 4,6.
15. 15. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) glicina em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente

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    5/9 tamponante;

    (iii) acetato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,2 a 4,6.
16. 16. Formulação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) histidina em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 280 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro estabilizador;

    (iv) Kollidon 12PF em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,8 a 5,2.
17. 17. Formulação, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) Avelumab em uma concentração de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL como o anticorpo;

    (ii) succinato em uma concentração de cerca de 10 mM como agente tamponante, e não compreendendo qualquer outro agente tamponante;

    (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de cerca de 140 mM como estabilizador, e não compreendendo qualquer outro

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    6/9 estabilizador;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL como o tensoativo, e não compreendendo qualquer outro tensoativo;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,8 a 5,2.
18. 18. Formulação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que consiste em:

    (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

    (ii) glicina em uma concentração de 10 mM;

    (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de 140 mM;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/mL;

    (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

    (vi) água (para injeção) como solvente;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,4 (± 0,1).
19. 19. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que consiste em:

    (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

    (ii) glicina em uma concentração de 10 mM;

    (iii) acetato de lisina em uma concentração de 140 mM;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/mL;

    (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

    (vi) água (para injeção) como solvente;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 4,4 (± 0,1).
20. 20. Formulação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que consiste em:

    (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

    (ii) histidina em uma concentração de 10 mM;

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    7/9 (iii) sacarose em uma concentração de 280 mM;

    (iv) Kollidon 12PF em uma concentração de 0,5 mg/mL;

    (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

    (vi) água (para injeção) como solvente;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 5,0 (± 0,1).
21. 21. Formulação, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que consiste em:

    (i) Avelumab em uma concentração de 20 mg/mL;

    (ii) succinato em uma concentração de 10 mM;

    (iii) monocloridrato de lisina em uma concentração de 140 mM;

    (iv) óleo de rícino de polioxila 35 em uma concentração de 0,5 mg/mL;

    (v) HCI de NaOH para ajustar o pH;

    (vi) água (para injeção) como solvente;

    sendo que a formulação apresenta um pH de 5,0 (± 0,1).
22. 22. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o referido Avelumab apresenta a sequência de cadeia pesada de quer (SEQ ID NO: 1) ou (SEQ ID NO: 2), a sequência de cadeia leve de (SEQ ID NO: 3), e carrega uma glicosilação em Asn300 compreendendo FA2 e FA2G1 como as principais espécies de glicano, tendo uma quota conjunta de > 70% de todas as espécies de glicano.
23. 23. Formulação, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que, na glicosilação de Avelumab, o referido FA2 apresenta uma quota de 44% - 54% e o referido FA2G1 apresenta uma quota de 25% - 41% de todas as espécies de glicano.
24. 24. Formulação, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que, na glicosilação de Avelumab, o referido FA2 apresenta uma quota de 47% - 52% e o referido FA2G1 apresenta

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    8/9 uma quota de 29% - 37% de todas as espécies de glicano.
25. 25. Formulação, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que, na glicosilação de Avelumab, o referido FA2 apresenta uma quota de cerca de 49% e o referido FA2G1 apresenta uma quota de cerca de 30% - cerca de 35% de todas as espécies de glicano.
26. 26. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que a glicosilação de Avelumab adicionalmente compreende como menores espécies de glicano A2 com uma quota de < 5%, A2G1 com uma quota de < 5%, A2G2 com uma quota de < 5% e FA2G2 com uma quota de < 7% de todas as espécies de glicano.
27. 27. Formulação, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que na glicosilação de Avelumab o referido A2 apresenta uma quota de 3%-5%, o referido A2G1 apresenta uma quota de < 4%, o referido A2G2 apresenta uma quota de < 3% e o referido FA2G2 apresenta uma quota de 5%-6% de todas as espécies de glicano.
28. 28. Formulação, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que na glicosilação de Avelumab o referido A2 apresenta uma quota de cerca de 3,5% - cerca de 4,5%, o referido A2G1 apresenta uma quota de cerca de 0,5% - cerca de 3,5%, o referido A2G2 apresenta uma quota de < 2,5% e o referido FA2G2 apresenta uma quota de cerca de 5,5% de todas as espécies de glicano.
29. 29. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizada pelo fato de que o referido Avelumab apresenta a sequência de cadeia pesada de (SEQ ID NO: 2).
30. 30. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que é para administração intravenosa (iv).

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    9/9
31. 31. Frasco, caracterizado pelo fato de que contém a formulação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
32. 32. Frasco, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que contém 200 mg de Avelumab em 10 mL de solução para uma concentração de 20 mg/mL.
33. 33. Frasco, de acordo com as reivindicações 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que é um frasco de vidro.
34. 34. Uso de uma formulação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de câncer em um paciente.
35. 35. Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma urotelial, câncer da bexiga, mesotelioma, carcinoma de células de Merkel, câncer gástrico ou junção gastroesofágica, câncer de ovário, câncer de mama, timoma, adenocarcinoma do estômago, carcinoma adrenocortical, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, melanoma, e/ou linfoma de Hodgkin clássico.