ES2553987T3 - Preparación farmacéutica de base acuosa estable que contiene anticuerpo - Google Patents

Abstract

Formulación médica líquida estable, que contiene en un tampón glutamato una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, un sorbitol como agente de isotonización, y polisorbato 80 como tensioactivo y tiene un pH de entre 4,0 y 6,0.

Description

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DESCRIPCION

Preparacion farmaceutica de base acuosa estable que contiene anticuerpo Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una formulacion medica ftquida estable que contiene un anticuerpo.

Antecedentes de la tecnica

Con el avance reciente en la bioingeniena, el uso total de la tecnologfa de recombinacion de ADN ha permitido la produccion en masa de protemas altamente puras para uso medico. Sin embargo, las protemas difieren de las moleculas sintetizadas qmmicamente convencionales en cuanto a sus altos pesos moleculares y estructuras tridimensionales complicadas. El almacenamiento estable de una protema en un estado tal que se mantenga su actividad biologica requiere una tecnologfa especial establecida en vista de las propiedades ffsicas de las protemas. En el caso de una formulacion ftquida que contiene una protema que se mantiene estable, se requiere que se protejan muchos grupos funcionales diferentes contenidos en la protema y que se mantenga su estructura de orden superior, que esta implicada en su actividad. Los anticuerpos se encuentran entre las protemas que son utiles desde un punto de vista medico. Un ejemplo de un metodo para estabilizar un anticuerpo es un metodo mediante el cual se estabiliza una protema mediante liofilizacion tal como se divulga en la publicacion de patente JP (Kohyo) n.° 2001/503781 A (documento WO98/22136). Sin embargo, la administracion y el trabajo preliminar para formulaciones liofilizadas son complicados en centros cftnicos. Por tanto, tal operacion complicada impone cargas mentales y temporales a los profesionales sanitarios. Ademas, existe una preocupacion en cuanto al riesgo de contaminacion bacteriana debido a los procedimientos necesarios. En contraposicion a las formulaciones liofilizadas, las formulaciones en disolucion requieren un trabajo preliminar sencillo antes de la administracion. Asf, se disminuye el riesgo de contaminacion bacteriana. En los centros medicos, se desean formulaciones de protema que sean estables en un estado en disolucion.

Los siguientes documentos se refieren a formulaciones de protema que son estables en un estado en disolucion.

Cleland et al., The Development of Stable Protein Preparation: A Close Look at Protein Aggregation, Deamination and Oxidation (Therapeutic Drug Carrier System vol. l0, n.° 4, 1993, pags. 307-377) proporciona una vision general referente a la degradacion de protemas y opiniones sobre medidas para reducir la degradacion de protemas. Sin embargo, este documento no divulga que una formulacion medica ftquida de un anticuerpo no contenga ninguna sal, ni divulga un tampon glutamato o un tampon citrato con un pH de entre 5,0 y 6,0 usado en ese documento.

El documento WO98/56418 divulga una formulacion medica ftquida no liofilizada que contiene un anticuerpo terapeuticamente eficaz, un tampon acetato, un tensioactivo y un poliol. Sin embargo, el documento no divulga que el acido glutamico o acido cftrico sea adecuado como agente tamponante para mantener el pH.

La patente JP n.° 2547556 divulga una formulacion de y-globulina que contiene un tampon acetato y sorbitol. Sin embargo, el documento no divulga que un agente tamponante para mantener el pH contenga acido glutamico o acido dtrico. Ademas, el documento no divulga que la adicion de un tensioactivo sea adecuada.

El documento WO97/04801 divulga una formulacion liofilizada adecuada para administracion subcutanea despues de reconstituirse. Sin embargo, el documento no divulga ni que la formulacion sea una formulacion no liofilizada ni que se use acido glutamico o acido cftrico con un pH de entre 5,0 y 6,0 como agente tamponante para mantener el pH.

Una “formulacion estable” no contiene componentes que sean toxicos para un paciente al que se le administra la formulacion. Ademas, tal formulacion contiene un principio activo que conserva su estabilidad qmmica y/o ffsica y/o biologica durante el almacenamiento a traves de la adicion de un aditivo distinto del principio activo, que no perturba la homeostasis del paciente en la medida de lo posible. “Aditivos distintos del principio activo, que no perturban la homeostasis del paciente en la medida de lo posible” significa una sustancia con seguridad que se ha confirmado suficientemente basandose en el rendimiento terapeutico anterior real o una sustancia con seguridad que puede predecirse suficientemente a traves de la evaluacion de la toxicidad para celulas o animales o mediante otros metodos incluso cuando la sustancia carece de rendimiento en la administracion anterior real. Ademas, “mantener la homeostasis del paciente” significa que ningun aditivo distinto del principio activo tiene ninguna actividad biologica que sea inaceptable para un paciente y/o que tal aditivo es isotonico (que tiene esencialmente la misma presion osmotica que la de sangre humana), si es posible.

Se mide la estabilidad de protemas mediante diversos metodos de analisis tal como se describe generalmente en New Protein Purification, Principles and Practice, redactado por RK Scopes, Springer-Verlag Tokyo, por ejemplo. Puede someterse a prueba la “estabilidad qmmica” mediante la deteccion y cuantificacion del estado qmmicamente alterado de una protema. Los ejemplos de alteraciones qmmicas incluyen: modificacion del tamano tal como corte que puede evaluarse mediante cromatograffa de exclusion molecular o SDS-PAGE; cambios en la carga electrica

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(provocados por desamidacion, por ejemplo) que puede evaluarse mediante cromatograffa de intercambio ionico; y cambios en estados hidrofilos/hidrofobos (provocados por oxidacion, por ejemplo) que pueden evaluarse mediante cromatograffa hidrofoba. “Estabilidad ffsica” significa que no hay generacion de materia extrana insoluble y/o turbidez y/o agregados, lo que puede evaluarse mediante inspeccion visual del color y/o la transparencia y/o cromatograffa de exclusion molecular. La “estabilidad biologica” puede evaluarse sometiendo a prueba la actividad de union a un anffgeno. Tal actividad de union puede evaluarse mediante cromatograffa de exclusion molecular o ELISA, por ejemplo.

Los anticuerpos estan incluidos entre las protemas que son terapeuticamente utiles. Se ha intentado usar un anticuerpo que tiene la accion de inducir muerte celular o citotoxicidad a traves de la union a una protema expresada en superficies celulares para el tratamiento de cancer o similar. Actualmente, se usan anticuerpos monoclonales tales como un anticuerpo quimerico (rituximab) que selecciona como diana CD20 que es un receptor que existe en membranas celulares y un anticuerpo humanizado que selecciona como diana Her2/neu para enfermedades tales como tumores malignos, y se reconocen sus efectos terapeuticos. Tal como se divulga en el documento WO2003/033538, se cree que tambien es util un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-HLA-DR) contra HLA-DR que es un tipo de moleculas de clase II (CMH) de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Un anticuerpo se caracteriza por una semivida en sangre prolongada y alta especificidad frente a un anffgeno, de modo que es particularmente util como agente antineoplasico. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo que selecciona como diana un anffgeno espedfico de tumor, se deduce que tal anticuerpo se acumula en tumores despues de la administracion. Asf, puede esperarse que el sistema inmunitario ataque a las celulas cancerosas mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Ademas, la union previa de un medicamento tal como un radionuclido o una sustancia citotoxica a un anticuerpo permite el suministro eficaz del medicamento unido a un sitio tumoral. Simultaneamente, tambien puede esperarse el alivio de los efectos secundarios por una reduccion en la cantidad de medicamento que llega a otros tejidos no espedficos. Cuando un anffgeno espedfico de tumor tiene la actividad de inducir muerte celular o similar, se administra un anticuerpo que tiene actividad agonista. Ademas, cuando un anffgeno espedfico de tumor esta implicado en la proliferacion y supervivencia celulares, se administra un anticuerpo que tiene actividad de neutralizacion. Asf, se esperan la acumulacion espedfica de tumor de un anticuerpo y la detencion de la proliferacion del tumor o la degeneracion del tumor debido a una actividad del anticuerpo. Tal como se describio anteriormente, se cree que un anticuerpo seffa apropiado para su uso como agente antineoplasico por sus caractensticas.

Ademas, una molecula de clase II (CMH) de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) se une a un fragmento pepffdico de anffgeno y entonces presenta tal fragmento pepffdico de anffgeno a una celula T cooperadora (CD4+) (celula “Th”) (vease Babbin B. et al., Nature (1985), 317, 359-361). Se ha notificado que un anticuerpo monoclonal espedfico para la molecula de CMH de clase II es un inhibidor selectivo muy fuerte en la respuesta inmunitaria de la celula Th in vitro (vease Baxevanis CN, et al., Immunogenetics (1980), 11, 617-625). Desde el descubrimiento de tales anticuerpos monoclonales, se ha pensado que eran farmacos que podfan usarse para la terapia de inmunosupresion selectiva para enfermedades autoinmunitarias tales como reumatismo cronico. Estudios iniciales in vivo han revelado los efectos utiles de estos anticuerpos monoclonales sobre las respuestas hetero y autoinmunitarias de celulas Th (veanse Rosenbaum JT. et al., J. Exp. Med. (1981), 154, 1694-1702; Waldor MK. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983), 80, 2713-2717; Jonker M. et al., J. Autoimmun. (1988), 1, 399-414; Stevens HP. et. al., Transplant. Proc. (1990), 22, 1783-1784). Estudios adicionales usando primates han revelado que tales anticuerpos monoclonales suprimen reacciones de injerto contra huesped en trasplantes alogenicos (Billing R. & Chatterjee S. (1983), Transplant. Proc., 15, 649-650; Jonker M. et. al., Transplant Proc. (1991), 23, 264-265). Actualmente, agentes inmunosupresores tales como ciclosporina A y FK506 se usan clmicamente para suprimir el rechazo en el momento del trasplante de organos. Estos agentes inmunosupresores son problematicos porque suprimen de manera no espedfica reacciones inmunitarias de modo que provocan fuertes efectos secundarios. Tal como se divulga en el documento WO2003/033538, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-HLA- DR) contra HLA-DR, que es un tipo de molecula de clase II (CMH) de complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), suprime de manera espedfica la inmunoactividad mediada por HLA-DR. Por tanto, se cree que el anticuerpo anti- HLA-DR es muy util. Por consiguiente, los anticuerpos son apropiados para su uso como agentes inmunosupresores que provocan menos efectos secundarios por sus caractensticas.

Tal como se describio anteriormente, se han estudiado muchos anticuerpos adecuados para uso terapeutico, se han desarrollado y aplicado de manera practica, de modo que los anticuerpos se usan mas frecuentemente en centros medicos. En tales circunstancias actuales, se requiere una formulacion medica lfquida estable caracterizada por una operacion conveniente para la administracion y el trabajo preliminar y un bajo riesgo de contaminacion bacteriana. En particular, se requiere en la tecnica una formulacion medica lfquida estable que contenga un anticuerpo adecuado para uso terapeutico, tal como un anticuerpo anti-HLA-DR.

Documento de patente 1: WO98/56418

Documento de patente 2: Patente JP n.° 2547556

Documento de patente 3: WO97/04801

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Documento no de patente 1: Therapeutic Drug Carrier System vol. 10, n.°4, 1993, pags. 307-377 Divulgacion de la invencion

Problemas que han de resolverse por la invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una formulacion medica Kquida estable que contiene un anticuerpo. De manera espedfica, un objeto de la presente invencion es proporcionar una formulacion medica lfquida estable que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo en un tampon glutamato, sorbitol, polisorbato 80, y tiene un pH de entre 4,0 y 6,0.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de intensos estudios referentes a tal formulacion medica lfquida estable que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, los presentes inventores han tenido exito en la estabilizacion del anticuerpo contenido en tal formulacion medica lfquida. Por tanto, los presentes inventores han completado la presente invencion. La presente invencion proporciona:

[1] . Una formulacion medica lfquida estable, que contiene en un tampon glutamato una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, un sorbitol como agente de isotonizacion, y polisorbato 80 como tensioactivo y tiene un pH de entre 4,0 y 6,0.

[2] . La formulacion medica lfquida estable segun [1], en la que la concentracion del tampon es de entre 1 mM y 50 mM.

[3] . La formulacion medica lfquida estable segun [1] o [2], que no contiene ninguna sal como agente de isotonizacion.

[4] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [3], en la que la presion osmotica es de entre 250 mOsm y 350 mOsm.

[5] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [4], en la que la concentracion de polisorbato 80 es de entre 0,02 mg/ml y 0,10 mg/ml.

[6] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [5], en la que el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

[7] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [6], en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

[8] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [7], en la que el anticuerpo es IgG.

[9] . La formulacion medica lfquida estable segun [8], en la que la subclase de IgG es una cualquiera de IgG1, IgG2 o IgG4.

[10] . La formulacion medica lfquida estable segun [8] o [9], en la que el aminoacido en la posicion 331 (numeracion basada en el sistema de numeracion de la UE) en la region constante de cadena pesada se ha sustituido por Ser.

[11] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [10], en la que el anticuerpo es un anticuerpo contra HLA-DR.

[12] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [11], en la que el anticuerpo es un anticuerpo contra CD40.

[13] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [12], en la que la concentracion del anticuerpo es de entre aproximadamente 1 y 200 mg/ml.

[14] . Una formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [13], que tiene un pH de entre 4,5 y 6,0.

[15] . La formulacion medica lfquida estable segun uno cualquiera de [1] a [14], que contiene al menos 1 tipo de agente de estabilizacion seleccionado del grupo que consiste en glicina, metionina, clorhidrato de cistema, leucina, clorhidrato de lisina, clorhidrato de arginina, acido aspartico, acido ascorbico, EDTA, y sales de los mismos.

Segun la presente divulgacion, se proporciona una formulacion medica lfquida estable, que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo y acido glutamico para mantener un pH de entre 4,0 y 6,0. La formulacion es estable al menos a una baja temperatura (de 2°C a 8°C) durante 1 ano o mas. De manera espedfica, la

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formulacion es estable al menos a 25°C durante 3 meses y/o a 40°C durante 1 mes. La formulacion tambien es estable contra la congelacion y descongelacion y la vibracion.

La presente divulgacion tambien se refiere a un producto dotado de un recipiente que conserva una formulacion medica Kquida estable que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo y un tampon glutamato o citrato para mantener un pH de entre 4,0 y 6,0.

Ademas, la presente divulgacion se refiere a un metodo para estabilizar un anticuerpo en una formulacion medica lfquida, que comprende combinar una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo y un tampon glutamato para mantener un pH de entre 4,0 y 6,0.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo terapeutico, preventivo o de diagnostico, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la formulacion medica lfquida divulgada en el presente documento a un mairnfero. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo anti-HLA-DR, los ejemplos de enfermedades que van a prevenirse, tratarse o diagnosticarse incluyen tumores tales como leucemia (incluyendo leucemia linfodtica cronica y leucemia linfodtica aguda), linfomas (incluyendo linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfomas de celulas T, linfomas de celulas B, linfoma de Burkitt, linfoma maligno, linfoma difuso y linfoma folicular) y mielomas (incluyendo mieloma multiple). Los ejemplos adicionales de enfermedades que van a prevenirse o tratarse incluyen inmunosupresion en el momento del trasplante de organos. (Ha de prevenirse o tratarse el rechazo o EICH en el momento del trasplante de islotes del pancreas, rinon, Idgado, corazon, o similar.) Los ejemplos adicionales de enfermedades que van a prevenirse o tratarse incluyen enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, reumatismo, arteriosclerosis, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, trombocitemia idiopatica y enfermedad de Crohn) y alergias tales como asma.

Estos aspectos los entienden claramente los expertos en la tecnica.

Efecto de la invencion

Tal como se describe en los ejemplos, una formulacion que contiene un anticuerpo segun la invencion de la presente solicitud es estable, incluso cuando se almacena la formulacion a 25°C o 40°C durante 1 mes. Es estable sin aumentos en la agregacion, la degradacion, un producto de desamidacion o un producto de oxidacion del anticuerpo durante tal periodo de almacenamiento. Ademas, tambien se confirmo que se conserva la actividad biologica del anticuerpo. Tal como se muestra en los ejemplos, el anticuerpo en la formulacion se mantiene de manera estable a una temperatura de almacenamiento general de 25°C o menos ajustando el pH de la formulacion medica lfquida entre 4,0 y 6,0.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra cambios en la cantidad de agregacion cuando se almacena a 25°C o 40°C cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que una formulacion de tampon glutamato y una formulacion de tampon citrato eran estables.

La figura 2 muestra cambios en la cantidad de agregacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que una formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 6,0.

La figura 3 muestra cambios en la cantidad de degradacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de degradacion mediante HPLC de exclusion molecular.

La figura 4 muestra cambios en la cantidad de un producto de desamidacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad del producto de desamidacion mediante HPLC de intercambio cationico.

La figura 5 muestra cambios en la cantidad de un producto de oxidacion en un sitio Fc cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de producto de oxidacion en el sitio Fc mediante HPLC hidrofoba. Los resultados muestran que una formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 6,0.

La figura 6 muestra cambios en la cantidad de agregacion despues de congelarse y descongelarse repetidamente cada formulacion medica lfquida que contiene un anticuerpo anti-HLA-DR. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que una formulacion que contiene un sorbitol como agente de isotonizacion era estable.

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La figura 7 muestra cambios en la cantidad de agregacion cuando se almacena cada formulacion medica ffquida que contiene un anticuerpo antagonista anti-CD40 a 25°C. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que una formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 6,0.

La figura 8 muestra cambios en la cantidad de degradacion cuando se almacena cada formulacion medica ffquida que contiene un anticuerpo antagonista anti-CD40. Se midio la cantidad de degradacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que una formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 7,0.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

La presente invencion se explica en detalle tal como sigue.

“Formulacion medica ffquida” incluida en esta solicitud de patente significa una formulacion en la que: un principio activo que es un anticuerpo que tiene efectos medicos esta en la forma de estar disuelto en una disolucion ffquida; la forma permite que el principio activo sea claramente eficaz en la disolucion; y la formulacion no contiene ningun componente adicional que pueda perturbar la homeostasis del paciente al que se le administra la formulacion. En este caso, “permite que el principio activo sea claramente eficaz” significa que el principio activo contenido mantiene su actividad y no pierde sus efectos medicos.

“Aditivo distinto del principio activo, que no perturba la homeostasis del paciente en la medida de lo posible” significa una sustancia con seguridad que se ha confirmado suficientemente mediante un rendimiento terapeutico anterior real o una sustancia con seguridad que puede predecirse suficientemente a traves de la evaluacion de la toxicidad frente a celulas o animales o mediante otros metodos incluso cuando la sustancia carece de rendimiento en administracion anterior real. De manera espedfica, la formulacion medica ffquida de la presente invencion puede contener un principio activo que es un anticuerpo que tiene efectos medicos y otros aditivos medica y farmaceuticamente aceptables. Ademas, “mantener la homeostasis del paciente” significa que ningun aditivo distinto del principio activo tiene ninguna actividad biologica que sea inaceptable para un paciente y/o que tal aditivo es isotonico (esencialmente que tiene la misma presion osmotica que la de la sangre humana), si es posible.

“Formulacion estable” significa una formulacion en la que un principio activo que conserva su estabilidad qmmica y/o ffsica y/o biologica durante el almacenamiento. Preferiblemente, la formulacion es estable al menos a una baja temperatura (de entre 2°C y 8°C) durante 1 ano o mas, de manera espedfica preferiblemente a 25°C durante al menos 3 meses y/o a 40°C durante al menos 1 mes. Tal formulacion tambien es estable frente a la congelacion y descongelacion, irradiacion con luz y vibracion. Se mide la estabilidad de protemas mediante diversos metodos de analisis. La “estabilidad qmmica” puede someterse a prueba mediante la deteccion y cuantificacion del estado qmmicamente alterado de una protema. Los ejemplos de alteraciones qmmicas incluyen: modificacion del tamano tal como corte que puede evaluarse mediante cromatograffa de exclusion molecular o SDS-PAGE; cambios en la carga electrica (provocados por desamidacion, por ejemplo) que pueden evaluarse mediante cromatograffa de intercambio ionico; y cambios en estados hidrofilos/hidrofobos (provocados por oxidacion, por ejemplo) que pueden evaluarse mediante cromatograffa hidrofoba. “Estabilidad ffsica” significa que no hay materia extrana insoluble y/o no se generan turbidez y/o agregados. Tal estabilidad ffsica puede evaluarse mediante inspeccion visual del color y/o la transparencia y/o cromatograffa de exclusion molecular. La “estabilidad biologica” puede evaluarse sometiendo a prueba la actividad de union a un anffgeno. Tal actividad de union puede evaluarse mediante cromatograffa de exclusion molecular o ELISA, por ejemplo. Cuando un anticuerpo no esta alterado qmmica ni ffsicamente, el anticuerpo conserva su estabilidad biologica. Por consiguiente, cuando un anticuerpo en una formulacion conserva su estabilidad qmmica y estabilidad ffsica, puede afirmarse que la formulacion es estable. De manera espedfica, puede confirmarse que una formulacion es estable o no midiendo la presencia o ausencia de alteraciones del anticuerpo contenido en cuanto a las propiedades qmmicas y ffsicas. En el caso de una formulacion estable, la agregacion, la degradacion, un producto de desamidacion, un producto de oxidacion, o similar del anticuerpo contenido no aumenta durante el almacenamiento hasta un nivel que reduzca los efectos medicos de la formulacion. Ademas, no se observa materia extrana insoluble ni turbidez. En el caso de la formulacion estable de la presente invencion, la agregacion, la degradacion, un producto de desamidacion o un producto de oxidacion del anticuerpo contenido no aumenta hasta un nivel que reduzca los efectos medicos de la formulacion, incluso cuando se almacena la formulacion al menos a una baja temperatura (de entre 2°C y 8°C) durante 1 ano o mas, al menos a 25°C durante 3 meses, o a 40°C durante 1 mes. Ademas, incluso cuando la formulacion se congela y se descongela o se hace vibrar, la agregacion, la degradacion, un producto de desamidacion o un producto de oxidacion del anticuerpo contenido no aumenta hasta un nivel que reduzca los efectos medicos de la formulacion. La agregacion del anticuerpo contenido en la formulacion estable de la presente invencion no aumenta durante el almacenamiento. Por ejemplo, cuando se almacena la formulacion a 25°C o 40°C durante 1 mes y entonces se mide tal producto mediante HPLC de exclusion molecular, se desea una pequena razon de agregacion con respecto a anticuerpo en la formulacion. Ademas, la degradacion del anticuerpo contenido en la formulacion estable de la presente invencion no aumenta mucho durante el almacenamiento. Por ejemplo, cuando se almacena la formulacion a 25°C o 40°C durante 1 mes, se desea una pequena razon de degradacion con respecto a anticuerpo en la formulacion. Ademas, la cantidad del producto de desamidacion del anticuerpo en la formulacion estable de la presente invencion no

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aumenta mucho durante el almacenamiento. Por ejemplo, cuando se almacena la formulacion a 25°C o 40°C durante 1 mes, se desea una pequena razon de producto de desamidacion con respecto a anticuerpo en la formulacion. Ademas, el producto de oxidacion en el sitio Fc del anticuerpo en la formulacion estable de la presente invencion no aumenta mucho durante el almacenamiento. Por ejemplo, cuando se almacena la formulacion a 25°C o 40°C durante 1 mes, se desea una pequena razon del producto de oxidacion en el sitio Fc con respecto a anticuerpo en la formulacion.

“Cantidad terapeuticamente eficaz” de un anticuerpo en la presente invencion indica una cantidad eficaz para prevenir o tratar enfermedades, cuando el anticuerpo es eficaz para tratar tales enfermedades. “Enfermedad” significa una enfermedad con smtomas arbitrarios con respecto a que beneficios pueden obtenerse mediante el tratamiento usando un anticuerpo. Los ejemplos de tal enfermedad incluyen enfermedades o dolencias cronicas y agudas incluyendo estados patologicos que son factores predisponentes para enfermedades de mairnferos. Una cantidad terapeuticamente eficaz de este tipo de un anticuerpo que existe en la formulacion se determina en vista de la dosis y la forma de dosificacion deseables, por ejemplo. Una concentracion de anticuerpo ilustrativa en la formulacion es de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 200 mg/ml, preferiblemente entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 50 mg/ml, y lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml y/o aproximadamente 20 mg/ml, por ejemplo.

Un “anticuerpo” incluido en esta solicitud de patente se usa en el sentido mas amplio. En particular, los ejemplos de tal anticuerpo incluyen un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespedfico y un fragmento de anticuerpo, siempre que el fragmento conserve la actividad biologica deseada.

La presente invencion se refiere a una formulacion medica lfquida estable que contiene un anticuerpo. El anticuerpo en la formulacion se prepara usando una tecnologfa que puede usarse para la produccion de anticuerpos en la tecnica. De manera espedfica, tal tecnologfa implica las etapas de (1) purificar un biopolfmero que va a usarse como inmunogeno y/o preparar celulas que expresan de manera excesiva una protema antigenica que va a usarse como inmunogeno en las superficies celulares, (2) inmunizar animales con tal antfgeno inyectandoselo a los animales, extraerles sangre, someter a ensayo el tftulo de anticuerpos, determinar el momento de la escision del bazo o similar, y luego preparar celulas productoras de anticuerpos, (3) preparar celulas de mieloma (mieloma), (4) fusionar las celulas productoras de anticuerpos al mieloma, (5) seleccionar un grupo de hibridomas que produzcan un anticuerpo diana, (6) permitir la division en clones celulares individuales (clonacion), (7) cultivar el hibridoma para producir un anticuerpo monoclonal en grandes cantidades o generar animales a los que se ha trasplantado el hibridoma, si es necesario, (8) clonar un gen que codifica para un anticuerpo humano monoclonal a partir de una celula productora de anticuerpos tal como el hibridoma, incorporar el producto resultante en un vector apropiado, introducir el vector en un huesped (por ejemplo, lmeas celulares de mamffero, Escherichia coli, celulas de levadura, celulas de insecto o celulas vegetales), y por tanto preparar un anticuerpo recombinante producido con el uso de tecnologfa de recombinacion genica, (9) purificar el anticuerpo asf obtenido, y (10) examinar la actividad fisiologica y la especificidad de reconocimiento del anticuerpo monoclonal asf producido, sometiendo a prueba la propiedad del anticuerpo como reactivo de marcaje, o similar.

Un ejemplo de tal anticuerpo monoclonal incluido en el presente documento comprende una cadena pesada y/o una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos derivada de cada secuencia de aminoacidos de una cadena pesada y/o una cadena ligera que componen un anticuerpo mediante delecion, sustitucion o adicion de 1 o varios aminoacidos. Tal alteracion parcial de aminoacidos (delecion, sustitucion, insercion o adicion) tal como se describio anteriormente puede llevarse a cabo con referencia a la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo contenido en una formulacion de la presente invencion mediante la alteracion parcial de la secuencia de nucleotidos que codifica para la secuencia de aminoacidos. Tal alteracion parcial de una secuencia de nucleotidos puede introducirse mediante un metodo convencional usando la conocida mutagenesis espedfica de sitio (Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1984, vol. 81: 5662). En este caso, “anticuerpo” significa una inmunoglobulina en la que todas las regiones incluyendo la region variable de cadena pesada, la region constante de cadena pesada, la region variable de cadena ligera y la region constante de cadena ligera que componen la inmunoglobulina derivan de un gen que codifica para una inmunoglobulina. Los anticuerpos incluidos en esta solicitud de patente pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina y tienen isotipos. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen ademas anticuerpos alterados con subclases recombinadas y anticuerpos alterados en los que el aminoacido en la posicion 331 (numeracion basada en el sistema de numeracion de la UE (vease Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication n.° 91-3242)) en la region constante de cadena pesada se ha sustituido por Ser para dar IgG1Ser o IgG2Ser. Ademas, los anticuerpos que tambien estan incluidos en el presente documento tienen efectos terapeuticos potenciados adicionalmente frente a enfermedades tales como cancer a traves de la union con: un radionuclido tal como yodo, itrio, indio o tecnecio (J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: principles and practice, 1993 Academic Press); una toxina bacteriana tal como toxina piocianica, toxina difterica o lisina; un agente quimioterapico tal como metotrexato, mitomicina o calicheamicina (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd.; M. L. Grossbard, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, 1998 Marcel Dekker Inc.); o un profarmaco tal como maitansinoide (Chari et al., Cancer Res., 1992, Vol. 52: 127; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, vol. 93: 8681). Los fragmentos funcionales de tales anticuerpos tambien estan incluidos en el presente documento. “Fragmento funcional” significa una parte (fragmento parcial) de un anticuerpo y significa un fragmento que conserva 1 o mas acciones de un anticuerpo sobre un antfgeno. Los ejemplos espedficos de tal fragmento

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funcional incluyen F(ab')2, Fab', Fab, Fv, Fv con enlaces disulfuro, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpo, y

poKmeros de los mismos (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998, T. J.

International Ltd.). Alternativamente, “fragmento funcional” significa un fragmento de un anticuerpo y puede unirse a un antigeno. Un anticuerpo que va a formularse es preferiblemente esencialmente puro y es de manera deseable esencialmente homogeneo (de manera espedfica, no contiene ninguna protema contaminada o similar). Un

anticuerpo “esencialmente puro” es uno que representa al menos aproximadamente el 90% en peso y

preferiblemente al menos aproximadamente el 95% en peso del peso total de una composicion que contiene el anticuerpo. Un anticuerpo “esencialmente homogeneo” anticuerpo es uno que representa al menos aproximadamente el 99% en peso del peso total de una composicion que contiene el anticuerpo.

Un anticuerpo incluido en esta solicitud de patente es preferiblemente un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico. Ademas, tal anticuerpo es preferiblemente IgG, en el que preferiblemente la subclase de IgG es una cualquiera de IgG1, IgG2 o IgG4. Ademas, IgG puede tener una secuencia de aminoacidos de una region constante, de la que una parte de esa secuencia se ha sometido a delecion y/o sustitucion y/o insercion de aminoacido mediante alteracion genica parcial. Ademas, un anticuerpo incluido en el presente documento es mas preferiblemente un anticuerpo humano monoclonal contra HLA-DR. Todavfa mas preferiblemente, tal anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano anti-HLA-DR divulgado en el documento WO2003/033538, tal como HD3, HD4, HD6, HD7, HD8, HD10, HD4G1, HD4G2Ser, HD4G4, HD8G1, HD8G1Ser, HD8G2, HD8G2Ser o HD8G4. De estos anticuerpos, los hibridomas que producen HD4, HD6, HD8 y HD10 se depositaron a nivel internacional segun FERM BP-7771, FERM BP-7772, FERM BP-7773 y FERM BP-7774, respectivamente, el 11 de octubre de 2001, ante el Organismo Internacional para el Deposito de Patentes (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japon), el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada). Ademas, los hibridomas que producen HD3 y HD7 se depositaron a nivel internacional segun FERM BP- 08534 y FERM BP-08536, respectivamente, el 31 de octubre de 2003, ante el mismo Organismo Internacional para el Deposito de Patentes. Ademas, esta solicitud de patente incluye ademas anticuerpos monoclonales humanos contra CD40. Los ejemplos preferibles de tales anticuerpos monoclonales incluyen: anticuerpos antagonistas anti- CD40 divulgados en el documento WO2002-088186, tales como KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM225-2- 56, KM292-1-24, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411, 3417 y F4-465; y anticuerpos agonistas anti- CD40 tales como KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, F1-102, F2-103, F5- 77 y F5-157. De estos, los clones de hibridoma KM302-1, KM281-1-10 y KM281-2-10-1-2 se depositaron a nivel internacional el 9 de mayo de 2001, segun FERM BP-7578, FERM BP-7579 y FERM BP-7580, respectivamente; los clones KM341-1-19 y 4D11 se depositaron a nivel internacional el 27 de septiembre de 2001, segun FERM BP-7759 y FERM BP-7758, respectivamente; y el clon 2105 se deposito a nivel internacional el 17 de abril 2002, segun FERM BP-8024 ante el Organismo Internacional para el Deposito de Patentes (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japon), el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnologfa Industrial Avanzada) segun el Tratado de Budapest. Ademas, los plasmidos que tienen regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de F2-103, F5-77 y F5-157 se depositaron a nivel internacional el 19 de abril de 2001, segun ATCC PTA-3302 (F2-103 cadena pesada), ATCC PTA-3303 (F2-103 cadena ligera), ATCC PTA-3304 (F5-77 cadena pesada), ATCC PtA-3305 (F5-77 cadena ligera), ATCC PTA-3306 (F5-157 cadena pesada) y ATCC PtA-3307 (F5-157 cadena ligera), respectivamente, y los clones de hibridoma F1-102 y F4-465 se depositaron a nivel internacional el 24 de abril de 2001, segun ATCC PTA-3337 y ATCC PTA-3338, respectivamente, ante la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, EE.UU. segun el Tratado de Budapest.

“Aditivos” incluidos en la presente invencion incluyen todos los componentes contenidos en una formulacion medica lfquida distintos del principio activo. Los ejemplos de tales aditivos incluyen un agente tamponante, un agente de ajuste del pH, un agente de isotonizacion, un agente de estabilizacion, un tensioactivo, un agente antiseptico, una suspension y un emulsionante. Ademas, tambien esta incluido un componente de aditivo de un unico tipo que presenta 2 o mas tipos de efectos.

“Agente tamponante” indica un aditivo que funciona frente a cambios moderados en el pH con el uso de la accion de componentes acido-base conjugados. Un tampon de la presente invencion tiene preferiblemente un intervalo de pH de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,0, mas preferiblemente entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,0, todavfa mas preferiblemente entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,0, e incluso todavfa mas preferiblemente entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,0. Alternativamente, tal tampon tiene un intervalo de pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, preferiblemente entre 5,2 y 5,8, y tiene todavfa mas preferiblemente un pH de aproximadamente 5,5. Cuando se usa un tampon que tiene un pH dentro de tal intervalo de pH, cualquier anticuerpo puede ser estable a 25°C o menos, lo que es una temperatura de almacenamiento general para formulaciones medicas. Ademas, dependiendo de los tipos de anticuerpo, tal intervalo de pH estable puede variarse a una mayor temperatura, tal como de 40°C. Por ejemplo, una disolucion tampon que se usa cuando se usa un anticuerpo anti-HLA-DR tiene preferiblemente un pH de entre aproximadamente 5,0 y 6,0, mas preferiblemente entre 5,2 y 5,8, y todavfa mas preferiblemente un pH de aproximadamente 5,5. Una disolucion tampon que se usa cuando se usa un anticuerpo antagonista anti-CD40 tiene preferiblemente un intervalo de pH de entre aproximadamente 4,0 y 6,0, mas preferiblemente entre aproximadamente 4,5 y 6,0, y todavfa mas preferiblemente entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 5,0. Los ejemplos de un agente tamponante que tiene un pH que se ajusta dentro de tal intervalo de pH incluyen glutamato (por ejemplo, glutamato de sodio), acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de sodio), gluconato, acido dtrico, citrato,

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ascorbato (por ejemplo, ascorbato de sodio), y otros tampones de acidos organicos. Cuando se desea una formulacion estable en cuanto a la congelacion y descongelacion, preferiblemente, el agente tamponante no es fosfato. En la presente divulgacion, el agente tamponante es preferiblemente glutamato. La concentracion del agente tamponante es de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM, preferiblemente entre 5 mM y 20 mM, y de la manera mas adecuada es de aproximadamente 10 mM, dependiendo de la capacidad tamponante y/o la presion osmotica deseada.

“Agente de isotonizacion” indica un agente con el que se prepara una formulacion objeto para que tenga una presion osmotica que es esencialmente la misma que la de la sangre humana. Una formulacion isotonica tiene una presion osmotica de entre aproximadamente 250 y 350 mOsm y la razon de su presion osmotica con respecto a la de la solucion salina fisiologica (que se determina que es de 1) es de aproximadamente 1:1. Como agentes de isotonizacion, generalmente se usan sales o/y un poliol. Un agente de isotonizacion de la presente divulgacion de manera preferiblemente esencial no contiene ninguna sal pero contiene preferiblemente poliol.

“Poliol” significa una sustancia que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo. Los ejemplos de poliol incluyen un azucar (azucar reductor o no reductor), un alcohol de azucar y acido sacarico. Un poliol adecuado que se usa en el presente documento tiene un peso molecular de aproximadamente menos de 600 kD (por ejemplo, dentro de un intervalo entre aproximadamente 120 kD y aproximadamente 400 kD). “Azucar reductor” significa un azucar que es capaz de reducir iones metalicos o un azucar que contiene un grupo hemiacetal que es capaz de reaccionar covalentemente con lisina dentro de una protema y otros grupos amino. El “azucar no reductor” no tiene tales propiedades. Los ejemplos de tal azucar reductor incluyen fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los ejemplos de tal azucar no reductor incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. Los ejemplos de alcohol de azucar incluyen manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol. Los ejemplos de acido sacarico incluyen acido L-gluconico y su sal de metal. Un poliol preferible es un azucar no reductor que no tiene ningun efecto qmmico sobre un anticuerpo en una disolucion. Cuando se desea que una formulacion sea estable en cuanto a la congelacion y descongelacion, un poliol adecuado no se cristaliza a la temperatura de congelacion (por ejemplo, de -20°C) lo que desestabiliza un anticuerpo dentro de una formulacion. Un sorbitol es preferible por su excelente estabilidad en disolucion.

Los ejemplos de un “tensioactivo” incluyen tensioactivos no ionicos tales como polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y 80) y poloxamero (por ejemplo, poloxamero 188). La cantidad de un tensioactivo que va a anadirse en el presente documento es una cantidad que reduce la agregacion de anticuerpos formulados y/o minimiza la formacion de partfculas en una formulacion y/o reduce la adsorcion. Los ejemplos de un tensioactivo en la presente divulgacion incluyen preferiblemente polisorbato y mas preferiblemente polisorbato 80. Un tensioactivo puede estar presente en una formulacion preferiblemente a una concentracion de entre 0,02 mg/ml y 0,10 mg/ml y lo mas preferiblemente a una concentracion de aproximadamente 0,05 mg/ml.

“Agente de estabilizacion” significa un aditivo que potencia adicionalmente la estabilidad qmmica y/o ffsica y/o biologica de un principio activo durante el almacenamiento a traves de su adicion en una pequena cantidad, preferiblemente a 10 mM o menos. La formulacion de la presente invencion puede contener un agente de estabilizacion. Tal agente de estabilizacion se selecciona del grupo que consiste en glicina, metionina, clorhidrato de cistema, leucina, clorhidrato de lisina, clorhidrato de arginina, acido aspartico, acido ascorbico, EDTA, y sales de los mismos, por ejemplo.

Una formulacion usada para la administracion in vivo debe ser esteril. Esto puede lograrse facilmente mediante filtracion (mediante la cual se hace que pasen las formulaciones a traves de membranas de filtracion esteriles) antes o despues de la preparacion de la formulacion.

Se administra una formulacion a un mairnfero o preferiblemente un humano que necesita tratamiento usando un anticuerpo mediante un metodo conocido en una dosis en bolo o mediante la inyeccion continua a lo largo de un cierto periodo de tiempo, por ejemplo. De manera espedfica, se administra una formulacion por una via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intrasubaracnoidea, oral, local o mediante inhalacion. En una realizacion preferida, se administra una formulacion por via intravenosa a un mamffero. Para tal proposito, se inyecta una formulacion usando una jeringa, por ejemplo, o mediante una via intravenosa de infusion por goteo.

En otra realizacion de la presente divulgacion, se proporciona un producto dotado de un recipiente que contiene la formulacion lfquida de la presente invencion. Si es necesario, tambien se proporcionan instrucciones para el uso de tal recipiente. Los ejemplos de un recipiente que es adecuado en el presente documento incluyen un frasco, un vial, una ampolla y una jeringa. Tal recipiente puede formarse usando diversos materiales tales como vidrio o plastico. Un recipiente ilustrativo es un vial de vidrio de 3 ml a 20 ml. Tal recipiente para almacenar una formulacion tiene una etiqueta en el recipiente o incluye una etiqueta con el recipiente. Tal etiqueta muestra instrucciones de uso. Tal producto tambien puede contener otro agente tamponante, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones de uso. Ademas, tal producto puede contener ademas otros materiales deseables en cuanto a la comercializacion y en vista de los usuarios.

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Ejemplos

La presente invencion se entiende ademas suficientemente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invencion.

Ejemplo 1 Formulaciones Kquidas que contienen anticuerpo anti-HLA-DR (examen del agente tamponante)

Este ejemplo describe formulaciones lfquidas que contienen cada una un anticuerpo (anticuerpo anti-HLA-DR) contra HlA-DR divulgado en el documento WO2003/033538.

En este ejemplo, se prepararon las formulaciones enumeradas en la tabla 1 y luego se evaluaron los efectos de los tipos de agente tamponante sobre la estabilidad del anticuerpo.

Tabla 1 Lista de formulaciones sometidas a este estudio

Concentracion de principio activo Agente tamponante Agente de isotonizacion Tensioactivo pH

1

Anticuerpo anti-HLA-DR 10 mg/ml Acido glutamico 10 mM D-sorbitol 262 mM Polisorbato 80 0,05 mg/ml 5,5

2

Acido ascorbico 10 mM

3

Acido dtrico 10 mM

(1) Preparacion de muestras de formulacion

Los reactivos usados en este examen fueron el anticuerpo anti-HLA-DR (aproximadamente 18 mg/ml, preparado segun el metodo divulgado en el documento WO2003/0033538 en CMC R&D Laboratories, Kirin Brewery Co., Ltd.), L-glutamato de sodio monohidratado (el Codigo Farmaceutico Japones), L-histidina (Farmacopea Japonesa), citrato de sodio monohidratado (Farmacopea Japonesa), acido ascorbico (Farmacopea Japonesa), D-sorbitol (Farmacopea Japonesa), D-manitol (Farmacopea Japonesa), acido clorlddrico (Farmacopea Japonesa), polisorbato 80 (Farmacopea Japonesa) y agua para inyeccion (Farmacopea Japonesa).

Se preparo previamente una disolucion de placebo que no contema ningun principio activo para cada muestra de formulacion. Se preparo cada muestra de formulacion sustituyendo la disolucion de placebo de formulacion por una disolucion de anticuerpo anti-HLA-DR usando una columna NAP (producida por Pharmacia Biotech). Se ajustaron las concentraciones de protemas a traves de conversion usando el coeficiente de e = 1,4 a la absorcion de DO280 nm.

Se sometio cada muestra de formulacion a filtracion esteril a traves de un filtro de 0,22 |im (producido por Millipore Corporation) dentro de un banco de trabajo limpio. Se rellenaron viales de vidrio de 5 ml (de acuerdo con la Farmacopea Japonesa) cada uno con 1 ml de la muestra dentro de un banco de trabajo limpio mientras se mantema la esterilidad. Ademas, se sometieron disoluciones (placebo) que no conteman anticuerpo anti-HLA-DR (para la dilucion de muestras que van a analizarse y para muestras de blanco para analisis) a filtracion esteril a traves de un filtro superior de frasco de 0,22 |im (NALGENE, producido por Nalge Nunc International Corporation) dentro de un banco de trabajo limpio.

(2) Condiciones de prueba

Se sometio cada muestra de formulacion a tension segun las siguientes condiciones de modo que se realizase una evaluacion de la estabilidad en este ejemplo. Prueba de termoestabilidad: Se almacenaron muestras de formulacion en un incubador (producido por TABAI ESPEC) controlado a 40°C o 25°C durante 1 mes.

Ademas, se almaceno cada muestra en un recipiente de baja temperatura controlado a 4°C hasta el inicio del analisis despues de cada caso de provision de tension.

(3) Metodo de analisis

Prueba de HPLC de exclusion molecular (SEC): Se calcularon el contenido de agregacion y el contenido de degradacion mediante el metodo de cromatograffa de lfquidos de alta velocidad de exclusion molecular. Si era necesario, se diluyo una muestra a 1 mg/ml seguido por la inyeccion de 15 |il de la muestra diluida a la temperatura atmosferica. Se realizo la separacion usando una columna TSKgel G3000 SWXL 30 cm X 7,8 mm (producida por TOSOH CORPORATION) y fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 500 mM a pH 7,0 como fase movil a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto durante 30 minutos de tiempo de analisis. Se realizo la deteccion a 215 nm. Ademas, los productos que eluyeron antes que el pico principal se definieron como agregaciones y los productos que eluyeron despues que el pico principal se definieron como degradaciones.

Prueba de HPLC de intercambio cationico (IEC): Se calculo el contenido de producto de desamidacion mediante el

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metodo de cromatograffa de Uquidos de alta resolucion de intercambio cationico. Se inyectaron 60 |il de una muestra que se habfa diluido de manera apropiada a 5 mg/ml. Se uso TSKgel BIOAssist S (producido por TOSOH CORPORATION) como columna de separacion y se realizo la deteccion a 280 nm. Se uso acido tartarico 20 mM a pH 4,5 como fase movil A y se usaron acido tartarico 20 mM y cloruro de sodio 1 M a pH 4,5 como fase movil B. Se llevo a cabo el analisis en las condiciones de gradiente mas adecuadas. Ademas, los productos deteriorados que eluyeron antes que el pico principal se definieron como productos de desamidacion.

Prueba de HPLC hidrofoba (HIC): Se calculo el contenido de producto de oxidacion (en el sitio Fc) mediante el metodo de cromatograffa hidrofoba. A 250 |il de una muestra que se habfa diluido de manera apropiada a 1 mg/ml, se le anadieron fosfato de sodio 250 mM, L-cistema 12,5 mM, 20 |il de una disolucion ffquida a pH 7,0 y 2,5 |il de una disolucion de papama 2,5 mg/ml, seguido por 2 horas de tratamiento enzimatico a 37°C. Por tanto, se preparo una muestra de fragmento Fc. Se inyectaron 15 |il de la muestra de fragmento Fc asf preparada. Se uso TSKgel Butyl-NPR 3,5 cm X 4,6 mm (producido por TOSOH CORPORATION) como columna de separacion. Se realizaron el analisis y la deteccion a 215 nm. Se uso Tris-(hidroximetil)aminometano 20 mM a pH 7,0 como fase movil A y se usaron Tris-(hidroximetil)aminometano 20 mM y sulfato de amonio 2 M a pH 7,0 como fase movil B. Se llevo a cabo el analisis en las condiciones de gradiente mas adecuadas. Ademas, los productos deteriorados que eluyeron antes que el pico principal se definieron como productos de oxidacion.

Prueba de SDS-PAGE: Si era necesario, se diluyo una disolucion de prueba a 200 |ig/ml. Se anadio una disolucion de tratamiento de muestra de Tris-SDS (producida por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) a la disolucion de muestra en la mitad del volumen del de la disolucion de muestra, preparando de ese modo una disolucion de muestra sin reduccion. Ademas, se diluyo la disolucion de muestra asf obtenida si era necesario. Se anadio una disolucion de tratamiento de muestra de Tris-SDSpME (producida por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) a la disolucion de muestra en la mitad del volumen del de la disolucion de muestra, seguido por 15 minutos de calentamiento a 65°C. Por tanto, se preparo una disolucion de muestra con reduccion. Se lleno un bano de electroforesis con un tampon Tris/glicina/SDS (producido por Bio-Rad Laboratories) para electroforesis. Se aplicaron 5 |il de cada disolucion de muestra a gel de poliacrilamida al 4%-20% (producido por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). Se realizo la electroforesis con una corriente constante de aproximadamente 20 mA hasta que el azul del azul de bromofenol contenido en cada disolucion de muestra migro hasta las proximidades de la parte de extremo inferior del gel. Despues de la electroforesis, se tino con plata el gel y luego se realizo la deteccion. Ademas, para determinar pesos moleculares aproximados de las muestras y los productos deteriorados, se sometieron a electroforesis simultaneamente marcadores de peso molecular (incluyendo protemas de 200 kDa, 116,2 kDa, 66,3 kDa, 42,4 kDa, 30,0 kDa y 17,2 kDa).

Materia extrana insoluble y turbidez: Se determino visualmente la presencia o ausencia de materia extrana insoluble y turbidez en una posicion directamente por debajo de una fuente de luz blanca con un nivel de luz de aproximadamente 5000 lux.

Razon de presion osmotica: Se midio la presion osmotica usando un medidor automatizado de presion osmotica (OSMO STATION OM-6050 producido por ARKRAY, Inc.). Se calculo la razon de la presion osmotica con respecto a la presion osmotica medida simultaneamente de solucion salina fisiologica.

pH: Se realizo la medicion del pH usando un medidor automatizado de pH (por ejemplo, MP-230 producido por Mettler-Toledo International Inc.). Al inicio de la medicion, se realizo una calibracion usando disoluciones patron con pH 4, pH 7 y pH 9 y luego se realizo la medicion del pH.

(4) Resultados

La figura 1 muestra cambios en la cantidad de agregacion cuando se almaceno cada formulacion medica ffquida a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que la formulacion de tampon glutamato y la formulacion de tampon citrato eran estables. Ademas, en cuanto a otros factores para el analisis (degradacion, producto de desamidacion y producto de oxidacion en el sitio Fc), el tampon ascorbato era inestable, aunque la formulacion de tampon glutamato y la formulacion de tampon citrato eran estables.

Segun la inspeccion visual, la formulacion que contiene un tampon ascorbato era de color amarillo o marron despues del almacenamiento. Las formulaciones de tampon glutamato y citrato eran estables de manera que no se observaron cambios ni antes ni despues del almacenamiento. Se observaron parffculas finas insolubles en un pequeno grado en todas las muestras, y las muestras eran estables de manera que no se observaron cambios ni antes ni despues del almacenamiento. Ademas, con respecto al pH medido tras el almacenamiento a 25°C o 40°C, se observo una tendencia de desplazamiento al lado de menor pH en la formulacion de tampon ascorbato. Las formulaciones de tampon glutamato y citrato eran estables, de manera que no se observaron cambios ni antes ni despues del almacenamiento. En todas las muestras, la razon de presion osmotica de cada muestra con respecto a solucion salina fisiologica era siempre de 1:1. No se observaron cambios ni antes ni despues de la provision de tension.

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Se revelo que la formulacion que contiene un tampon ascorbato usada en ese documento era muy inestable por sus niveles significativamente altos de muchos mdices que indican deterioro tal como se revelo mediante medicion.

Se demostro mediante este ejemplo que el acido glutamico o acido cftrico es adecuado como agente tamponante para estabilizar un anticuerpo. Lo mas preferiblemente, se usa acido glutamico como agente tamponante.

Ejemplo 2 Formulaciones lfquidas que contienen anticuerpo anti-HLA-DR (examen del pH)

Este ejemplo describe formulaciones lfquidas que contienen cada una un anticuerpo contra HLA-DR (anticuerpo anti- HLA-DR) divulgado en el documento WO2003/033538.

En este ejemplo, se prepararon las formulaciones enumeradas en la tabla 2 y luego se evaluo en detalle el pH de la formulacion adecuado.

Tabla 2 Lista de formulaciones sometidas a este estudio

Concentracion de principio activo Agente tamponante Agente de isotonizacion Tensioactivo pH

1

Anticuerpo anti-HLA-DR 10 mg/ml Acido glutamico 10 mM D-sorbitol 262 mM Polisorbato 80 0,05 mg/ml 4,0

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6

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7

7,0

(1) Materiales y metodos

Los materiales y metodos de analisis empleados en este ejemplo son iguales a los descritos en el ejemplo 1.

(2) Condiciones de prueba

Se sometio cada muestra de formulacion a tension segun las siguientes condiciones de modo que se realizase una evaluacion de la estabilidad en este ejemplo.

Prueba de termoestabilidad: Se almacenaron muestras de formulacion en un incubador (producido por TABAI ESPEC) controlado a 40°C o 25°C durante 1 mes.

Prueba de congelacion y descongelacion: Se almaceno cada muestra de formulacion alternativamente en un congelador a -20°C y un recipiente de baja temperatura a 4°C, de modo que se repitieron la congelacion y descongelacion 3 veces. Por tanto, se prepararon muestras. Ademas, se confirmo si cada muestra estaba completamente congelada o descongelada mediante inspeccion visual en cada ciclo.

Prueba de vibracion forzada: Se llevo a cabo la prueba durante 20 minutos usando un aparato de prueba de vibracion (RECIPRO SHAKER SR-II producido por Taiyo Scientific Industrial Co., Ltd.) en condiciones de vibracion de 300 rpm y 40 mm, de modo que se prepararon muestras.

Prueba de fotoestabilidad: Bajo una lampara fluorescente blanca controlada para tener aproximadamente 4000 lux, se irradio cada muestra con luz de modo que se alcanzase un nivel de luz de aproximadamente 1.200.000 lux.

(3) Resultados

La figura 2 muestra cambios en la cantidad de agregacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que la formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 6,0. Ademas, la figura 3 muestra cambios en la cantidad de degradacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de degradacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que la formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 7,0 cuando la formulacion se almaceno a 25°C. Ademas, en el analisis de SDS-PAGE, se obtuvieron imagenes de electroforesis, con las que pudo confirmarse una tendencia similar a la presentada en los resultados obtenidos mediante HPLC de exclusion molecular. La figura 4 muestra cambios en la cantidad de un producto de desamidacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad del producto de desamidacion mediante HPLC de intercambio cationico. Los resultados muestran que la formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 7,0 cuando la formulacion se almaceno a 25°C. La figura 5 muestra cambios en la cantidad de un producto de oxidacion en un sitio Fc cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 25°C o 40°C. Se midio la cantidad de producto de

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oxidacion en el sitio Fc mediante HPLC hidrofoba. Los resultados muestran que la formulacion de tampon glutamato era estable a un pH de entre 4,0 y 6,0. De manera espedfica, la formulacion de tampon glutamato era estable de manera que casi no se observo materia extrana, turbidez ni materia extrana insoluble mediante inspeccion visual y casi no se observaron cambios en las razones de presion osmotica o los pH ni antes ni despues de la provision de tension.

Como resultado de la prueba de fotoestabilidad, en todas las muestras, se observaron aumentos en las cantidades de la agregacion, la degradacion, el producto de desamidacion y el producto de oxidacion en el sitio Fc despues de la irradiacion con luz. Estos cambios pueden suprimirse con proteccion frente a la luz usando una caja de papel. Por tanto, las formulaciones pueden almacenarse de manera estable tomando algunas medidas de proteccion frente a la luz durante el almacenamiento. Ademas, las formulaciones eran estables de manera que no se observaron cambios como resultado de la congelacion y descongelacion ni antes ni despues de la provision de tension de vibracion en cuanto a todos los factores para el analisis.

Ejemplo 3 Formulaciones que contienen anticuerpo anti-HLA-DR (examen del agente de isotonizacion)

Este ejemplo describe formulaciones lfquidas que contienen cada una un anticuerpo (anticuerpo anti-HLA-DR) contra HlA-DR divulgado en el documento WO2003/033538.

En este ejemplo, se prepararon las formulaciones enumeradas en la tabla 3 y luego se evaluaron los efectos de los agentes de isotonizacion en las formulaciones sobre la estabilidad de las formulaciones.

Tabla 3 Lista de formulaciones sometidas a este estudio

Concentracion de principio activo Agente tamponante Agente de isotonizacion Tensioactivo pH

1

Anticuerpo anti-HLA-DR 10 mg/ml Acido glutamico 10 mM Sorbitol 262 mM Polisorbato 80 0,05 mg/ml 5,5

2

Manitol 262 mM

(1) Materiales y metodos

Los materiales y metodos de analisis empleados en este ejemplo son iguales a los descritos en el ejemplo 1.

(2) Condiciones de prueba

Se sometieron las muestras a tension de manera que era igual que en el metodo descrito en el ejemplo 2.

(3) Resultados y consideracion

La figura 6 muestra cambios en la cantidad de agregacion despues de que cada formulacion medica lfquida se congelase y descongelase repetidamente. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que la formulacion que contiene sorbitol como agente de isotonizacion era estable. No se cristaliza el sorbitol ni siquiera en el momento de la congelacion. Sin embargo, se cristaliza el manitol en el momento de la congelacion, de modo que puede perturbar particularmente de manera ffsica las moleculas de anticuerpo en el momento de la congelacion. Se demostro que como poliol que se usa como agente de isotonizacion, una sustancia tal como un sorbitol que no se cristaliza en el momento de la congelacion es mas adecuada. Con respecto a otras condiciones de prueba, no se observaron diferencias en cuanto a la estabilidad. Ademas, los inventores llevaron a cabo un examen preliminar; es decir, una prueba para comparar una sal (cloruro de sodio) como agente de isotonizacion con un azucar (sorbitol) como agente de isotonizacion. En una prueba de termoestabilidad, los presentes inventores tuvieron conocimiento de que las formulaciones son mas estables en cuanto a las cantidades de agregacion, degradacion y productos de desamidacion generados, cuando se usan azucares.

Por tanto, el agente de isotonizacion de la presente divulgacion preferiblemente no contiene esencialmente ninguna sal. Un poliol preferible es un azucar no reductor que no tiene ningun efecto qrnmico sobre un anticuerpo en una disolucion. Cuando se desea que una formulacion sea estable en cuanto a la congelacion y descongelacion, un agente de isotonizacion adecuado no se cristaliza a la temperatura de congelacion (por ejemplo, -20°C), lo que desestabiliza un anticuerpo en la formulacion. Un sorbitol es preferible porque tiene una excelente estabilidad en disolucion.

Ademas, los presentes inventores tambien han usado polisorbato 80 como tensioactivo y estudiaron los efectos de su concentracion sobre la estabilidad del anticuerpo. Como resultado, la adicion del tensioactivo redujo la agregacion del anticuerpo formulado. Sin embargo, se observo una tendencia, mediante la cual la cantidad de producto de oxidacion en el sitio Fc del anticuerpo aumentaba mediante la adicion de una cantidad excesiva (0,20 mg/ml o mas)

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de polisorbato 80. Asf, es preferible que este presente un tensioactivo en una formulacion a una concentracion de entre preferiblemente 0,02 mg/ml y 0,10 mg/ml y lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg/ml

Ademas, los presentes inventores llevaron a cabo un examen preliminar; es decir, un examen referente a la adicion de un agente de estabilizacion (glicina, metionina, clorhidrato de cistema, leucina, clorhidrato de lisina, clorhidrato de arginina, acido aspartico, acido ascorbico o EDTA), ademas de los ejemplos anteriores. Por ejemplo, se observo un efecto adicional de supresion de partfculas finas insolubles con la adicion de glicina. Ademas, se obtuvo un efecto de metionina en la supresion de la generacion de un producto de oxidacion. Por consiguiente, la presente invencion tambien puede contener estos agentes de estabilizacion.

Ademas, los presentes inventores tambien han llevado a cabo un examen similar usando un anticuerpo IgG1 humano completo recombinante (anticuerpo anti-HSA) contra HSA. Por tanto, los presentes inventores han confirmado que la presente invencion puede realizarse de manera satisfactoria con cualquier tipo de anticuerpo. Ademas, los presentes inventores han examinado formulaciones medicas lfquidas usando el anticuerpo anti-HSA. De manera espedfica, los presentes inventores han examinado las formulaciones con concentraciones de anticuerpo que oscilan entre 1 mg/ml y 100 mg/ml. Por tanto, se ha revelado que los metodos revelados por la presente invencion pueden realizarse de manera satisfactoria con cualquier concentracion de anticuerpo.

Ejemplo 4 Preparacion de formulaciones medicas que contienen anticuerpo

Los ejemplos de preparacion de formulaciones medicas lfquidas estables que contienen anticuerpos son tal como se describen a continuacion.

Se transformaron celulas CHO con un gen que codifica para un anticuerpo (HD3, HD4, HD6, HD7, HD8, HD10, HD4G1, HD4G2Ser, HD4G4, HD8G1, HD8G1Ser, HD8G2, HD8G2Ser o HD8G4) usado en la presente invencion de modo que fuese capaz de expresar y producir el anticuerpo. Se purifico cada uno de estos anticuerpos mediante el metodo divulgado en el documento WO2003/033538 a partir de los sobrenadantes de cultivo de las celulas CHO. Se concentro un anticuerpo asf purificado a aproximadamente 10 mg/ml, seguido por la sustitucion por un tampon glutamato 10 mM, D-sorbitol 262 mM y un tampon con un pH de 5,5 usando una membrana de ultrafiltracion. Se concentro el anticuerpo contenido en una disolucion recogida despues de la sustitucion del tampon y se preparo a una concentracion de anticuerpo de 20 mg/ml. Se anadio polisorbato 80 a 0,05 mg/ml, de modo que se obtuvo una formulacion medica lfquida que contema el anticuerpo a 20 mg/ml. Ademas, se diluyo la formulacion de anticuerpo 20 mg/ml anterior con una formulacion medica lfquida (disolucion de tampon glutamato 10 mM, D-sorbitol 262 mM y polisorbato 80 0,05 mg/ml) que no contema anticuerpos. Por tanto, se prepararon formulaciones medicas lfquidas con cualquier concentracion de anticuerpo. La tabla 4 (A a N) a continuacion enumera ejemplos de las composiciones de cada formulacion medica lfquida (1 ml) que contienen anticuerpos a una concentracion de 10 mg/ml.

Tabla 4

A Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD3

HD3

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorlmdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

B Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD4

HD4

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

C Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD6

HD6

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

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D Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD7

HD7

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

E Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8

HD8

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

F Composicion de HD10-que contiene formulacion medica liquida HD10

HD10

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

G Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD4G1

HD4G1

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

H Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD4G2ser

HD4G2ser

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

I Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD4G4

HD4G4

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

J Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8G1

HD8G1

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

K Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8G1ser

HD8G1ser

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

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L Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8G2

HD8G2

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhndrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

M Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8G2ser

HD8G2ser

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhidrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

N Composicion de formulacion medica liquida que contiene HD8G4

HD8G4

10 mg

Glutamato de sodio monohidratado

1,87 mg

Acido clorhfdrico

0,057 mg

D-sorbitol

47,73 mg

Polisorbato 80

0,05 mg

Agua destilada para inyeccion

(1 ml)

Se esterilizaron las formulaciones lfquidas as^ obtenidas usando membranas de filtracion esteriles. Con el uso de una maquina de llenado automatizada en condiciones esteriles o similares, se llenaron viales esterilizados previamente con estas formulaciones. Se sello cada vial con un tapon de goma y luego se enrosco una tapa de aluminio de manera apretada, de modo que se obtuvo una formulacion medica liquida que contiene anticuerpo esteril.

Ejemplo 5

Formulaciones lfquidas que contienen anticuerpo anti-CD40

Este ejemplo describe formulaciones lfquidas que contienen cada una un anticuerpo (anticuerpo antagonista anti- CD40) contra CD40 divulgado en el documento WO 02/088186.

En este ejemplo, se prepararon las formulaciones enumeradas en la tabla 5 y luego se evaluo el efecto del pH sobre la estabilidad del anticuerpo.

Tabla 5 Lista de formulaciones sometidas a este estudio

Concentracion de principio activo Agente tamponante Agente de isotonizacion Tensioactivo pH

1

Anticuerpo antagonista anti- CD40 10 mg/ml Acido glutamico 10 mM D-sorbitol 262 mM Polisorbato 80 0,05 mg/ml 4,0

2

4,5

3

5,0

4

5,5

5

6,0

6

7,0

Preparacion de muestras de formulacion

Los reactivos usados en este examen fueron el anticuerpo antagonista anti-CD40 (aproximadamente 15 mg/ml, preparado segun el metodo divulgado en el documento WO 02-088186 en CMC R&D Laboratories, Kirin Brewery Co., Ltd.), L-glutamato de sodio monohidratado (el Codigo Farmaceutico Japones), D-sorbitol (Farmacopea Japonesa), hidroxido de sodio (Farmacopea Japonesa), acido clorhndrico (Farmacopea Japonesa), polisorbato 80 (Farmacopea Japonesa) y agua para inyeccion (Farmacopea Japonesa).

Se preparo previamente una disolucion de placebo que no contema ningun principio activo para cada muestra de formulacion. Se preparo cada muestra de formulacion sustituyendo la disolucion de placebo de formulacion por un anticuerpo antagonista anti-CD40 usando una columna NAP (producida por Pharmacia Biotech). Se ajustaron las concentraciones de protemas a traves de conversion usando el coeficiente e = 1,65 a la absorcion de DO280 nm.

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Se sometio cada muestra de formulacion a filtracion esteril a traves de un filtro de 0,22 |im (producido por Millipore Corporation) dentro de un banco de trabajo limpio. Se rellenaron viales de vidrio de 5 ml (FUJI GLASS CO., LTD., White U-KB2CS (sin recubrimiento)) cada uno con 1 ml de la muestra dentro de un banco de trabajo limpio mientras se mantema la esterilidad. Ademas, se sometieron disoluciones (placebo) que no conteman anticuerpo antagonista anti-CD40 (para la dilucion de las muestras que van a analizarse y para muestras de blanco para el analisis) a filtracion esteril a traves de un filtro superior de frasco de 0,22 |im (NALGENE, producido por Nalge Nunc International Corporation) dentro de un banco de trabajo limpio.

Condiciones de prueba

Se sometio cada muestra de formulacion a tension segun las siguientes condiciones de modo que se realizase una evaluacion de la estabilidad en este ejemplo.

Prueba de termoestabilidad: Se almacenaron muestras de formulacion en un incubador (producido por TABAI ESPEC) controlado a 40°C o 25°C durante 1 mes.

Ademas, se almaceno cada muestra en un recipiente de baja temperatura controlado a 4°C hasta el inicio del analisis despues de cada caso de provision de tension.

Metodo de analisis

Prueba de HPLC de exclusion molecular (SEC): Se calcularon el contenido de agregacion y el contenido de degradacion mediante el metodo de cromatograffa de lfquidos de alta velocidad de exclusion molecular. Si era necesario, se diluyo una muestra a 1 mg/ml seguido por la inyeccion de 15 |il de la muestra diluida a la temperatura atmosferica. Se realizo la separacion usando una columna TSKgel G3000 SWXL 30 cm X 7,8 mm (producida por TOSOH CORPORATION) y fosfato de sodio 20 mM y cloruro de sodio 500 mM a pH 7,0 como fase movil a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto durante 30 minutos de tiempo de analisis. Se realizo la deteccion a 215 nm. Ademas, los productos que eluyeron antes que el pico principal se definieron como agregaciones y los productos que eluyeron despues que el pico principal se definieron como degradaciones.

Prueba de SDS-PAGE: Si era necesario, se diluyo una disolucion de prueba a 200 |ig/ml. Se anadio una disolucion de tratamiento de muestra de Tris-SDS (producida por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) a la disolucion de muestra en la mitad del volumen del de la disolucion de muestra, preparando de ese modo una disolucion de muestra sin reduccion. Ademas, se diluyo la disolucion de muestra asf obtenida si era necesario. Se anadio una disolucion de tratamiento de muestra de Tris-SDSpME (producida por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) a la disolucion de muestra en la mitad del volumen del de la disolucion de muestra, seguido por 15 minutos de calentamiento a 65°C. Por tanto, se preparo una disolucion de muestra con reduccion. Se lleno un bano de electroforesis con un tampon Tris/glicina/SDS (producido por Bio-Rad Laboratories) para electroforesis. Se aplicaron 5 |il de cada disolucion de muestra a gel de poliacrilamida al 4%-20% (producido por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). Se realizo la electroforesis con una corriente constante de aproximadamente 20 mA hasta que el azul del azul de bromofenol contenido en cada disolucion de muestra migro hasta las proximidades de la parte de extremo inferior del gel. Despues de la electroforesis, se tino con plata el gel y luego se realizo la deteccion. Ademas, para determinar pesos moleculares aproximados de las muestras y los productos deteriorados, se sometieron a electroforesis simultaneamente marcadores de peso molecular (incluyendo protemas de 200,0 kDa, 116,2 kDa, 66,3 kDa, 42,4 kDa, 30,0 kDa y 17,2 kDa).

Razon de presion osmotica: Se midio la presion osmotica usando un medidor automatizado de presion osmotica (OSMO STATION OM-6050 producido por ARKRAY, Inc.). Se calculo la razon de la presion osmotica con respecto a la presion osmotica medida simultaneamente de solucion salina fisiologica.

pH: Se realizo la medicion del pH usando un medidor automatizado de pH (por ejemplo, MP-230 producido por Mettler-Toledo International Inc.). Al inicio de la medicion, se realizo una calibracion usando disoluciones patron con pH 4, pH 7 y pH 9 y luego se realizo la medicion del pH.

Resultados y consideracion

La figura 7 muestra la cantidad de agregacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 25°C. Se midio la cantidad de agregacion mediante HPLC de exclusion molecular. Los resultados muestran que las formulaciones medicas lfquidas eran estables a un pH de entre 4,0 y 6,0. La figura 8 muestra la cantidad de degradacion cuando se almaceno cada formulacion medica lfquida a 40°C. Se midio la cantidad de degradacion mediante HPLC de exclusion molecular. Se detecto degradacion en cantidades traza independientemente del pH. Ademas, en todas las muestras, los pH medidos tras el almacenamiento a 25°C o 40°C eran estables de manera que no se observaron cambios en el pH ni antes ni despues del almacenamiento. En todas las muestras, la razon de presion osmotica con respecto a la de solucion salina fisiologica era siempre de aproximadamente 1:1. No se

observaron cambios ni antes ni despues de la provision de tension.

Claims (12)

2. 2.

   10 3.
3. 4. 15
4. 5.
5. 6.

   20
6. 7.

   25 8.
7. 9. 30
8. 10.

   35 11.
9. 12.

   40
10. 13.
11. 14. 45
12. 15.

    50

    REIVINDICACIONES

    Formulacion medica Ifquida estable, que contiene en un tampon glutamate una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo, un sorbitol como agente de isotonizacion, y polisorbato 80 como tensioactivo y tiene un pH de entre 4,0 y 6,0.

    Formulacion medica lfquida estable segun la reivindicacion 1, en la que la concentracion del tampon es de entre 1 mM y 50 mM.

    Formulacion medica lfquida estable segun la reivindicacion 1 o 2, que no contiene ninguna sal como agente de isotonizacion.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la presion osmotica es de entre 250 mOsm y 350 mOsm.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 concentracion de polisorbato 80 es de entre 0,02 mg/ml y 0,10 mg/ml.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 anticuerpo es IgG.

    Formulacion medica lfquida estable segun la reivindicacion 8, en la que la subclase de IgG es una cualquiera de IgG1, IgG2 o IgG4.

    Formulacion medica lfquida estable segun la reivindicacion 8 o 9, en la que el aminoacido en la posicion 331 (numeracion basada en el sistema de numeracion de la UE) en la region constante de cadena pesada se ha sustituido por Ser.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el anticuerpo es un anticuerpo contra HLA-DR.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el anticuerpo es un anticuerpo contra CD40.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la concentracion del anticuerpo es de entre aproximadamente 1 y 200 mg/ml.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que tiene un pH de entre 4,5 y 6,0.

    Formulacion medica lfquida estable segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que contiene al menos 1 tipo de agente de estabilizacion seleccionado del grupo que consiste en glicina, metionina, clorhidrato de cistema, leucina, clorhidrato de lisina, clorhidrato de arginina, acido aspartico, acido ascorbico, EDTA, y sales de los mismos.

    en la que la en la que el en la que el en la que el