TW201705968A

TW201705968A - 用於治療胰臟癌之ｐｄ－１拮抗劑與基於李斯特菌屬之疫苗的組合

Info

Publication number: TW201705968A
Application number: TW105109634A
Authority: TW
Inventors: 葛雷葛瑞Ｌ比蒂; 道森諾布拉克; 羅伯培堤特; 麥可Ｆ布林錫塔; 阿努瓦勒洽
Original assignee: 賓夕法尼亞大學董事會; 艾德凡斯有限公司
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2017-02-16
Also published as: WO2016154412A2; WO2016154412A9

Abstract

本發明係關於適用於治療癌症之組合療法。特定言之，本發明係關於使用計劃性死亡1蛋白(PD-1)之拮抗劑與活減毒重組李斯特菌屬菌株組合治療胰臟癌，該重組李斯特菌屬菌株包含有含PEST序列之多肽與腫瘤相關抗原融合的融合蛋白。

Description

用於治療胰臟癌之PD-1拮抗劑與基於李斯特菌屬疫苗的組合

政府利益聲明

本發明在政府支持下用由國防部(Department of Defense)授予之補助(Grant)編號W81XWH-12-1-0411及由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之NIH K08CA138907來進行。美國政府具有本發明之某些權利。

本發明係關於適用於治療癌症之組合療法。特定言之，本發明係關於使用計劃性死亡1蛋白(PD-1)之拮抗劑與活減毒重組李斯特菌屬菌株組合治療胰臟癌，該重組李斯特菌屬菌株包含有含PEST序列之多肽與腫瘤相關抗原融合的融合蛋白。

胰臟癌在胰臟中之細胞開始倍增超出控制且形成腫塊時出現。此等癌細胞具有侵入身體其他部分之能力。存在多種類型之胰臟癌，且最常見之類型(胰腺癌)占病例中之約85%。在2012年，所有類型之胰臟癌為第七常見之癌症死亡原因，在全球範圍內導致330,000人死亡。在美國，胰臟癌為最常見因癌症致死之第四位。該疾病最常發生在已開發世界中，其中在2012年，約70%之新病例來源於已開發世界。胰腺癌通常具有極不良預後：在診斷之後，25%之人存活一年，且5%存活五年。對於較早診斷之癌症，五年存活率上升至約20%。胰臟癌風險因素包括抽菸、肥胖、糖尿病及某些罕見基因條件。胰臟癌可用手術、放射線療法、化學療法、安寧療護或此等之組合來治療。手術為僅有的可能治癒該疾病之治療。

PD-1被視為免疫調節及周圍耐受性之維持中的重要參與者。PD-1適當地表現於未處理(naive)之T、B及NKT細胞上且藉由淋巴球、單核球及骨髓細胞上之T/B細胞受體信號傳導上調。

對PD-1、PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)之兩種已知配位體表現於不同組織中出現之人類癌症中。在卵巢癌、腎癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肝癌及黑色素瘤之大樣本集中，顯示與不良預後有關之PD-L1表現及與後續治療無關而降低之整體存活率。類似地，發現在腫瘤浸潤性淋巴球上之PD-1表現標記乳癌及黑色素瘤中之功能異常T細胞且與腎癌中之不良預後有關。因此，已提出PD-L1表現性腫瘤細胞與PD-1表現性T細胞相互作用以減弱T細胞活化及免疫監督之逃避，由此促成削弱針對該腫瘤之免疫反應。存在抑制PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2中之一或兩者之間的相互作用之數種單株抗體，處於臨床開發中以用於治療癌症。

細胞凋亡抑制劑蛋白，存活素由人類中之BIRC5基因編碼。此蛋白質為跨物種高度保守的(人及犬存活素蛋白共有91.5%序列一致性)。存活素為細胞凋亡抑制劑(IAP)家族之成員。存活素蛋白用於抑制卡斯蛋白酶活化，由此引起細胞凋亡或計劃性細胞死亡之負調節。存活素在人類、犬及小鼠中之廣泛成熟組織中可偵測。

存活素在大多數人類癌症中高度表現，且與化學療法抗性、增加之腫瘤復發性及較短患者存活期相關。歸因於其在許多類型之癌症腫瘤(例如乳癌及結腸癌、淋巴瘤、白血病及黑色素瘤)中的存在，咸信存活素可充當抗癌免疫療法之通用標靶抗原。存活素之表現亦已報導於絕大部分犬淋巴瘤以及犬肥胖細胞瘤、血管肉瘤及移行細胞癌中。犬B細胞淋巴瘤中高量之存活素表現與減小之無疾病時間間隔(DFI)及中值存活時間(MST)相關。使用存活素肽對人類患者之免疫接種已在人類診所中顯示一些前景，其僅具有輕度級別I/II不良效應，包括貧血、昏睡及發熱。嚴重不良效應尚未報導。

單核球增多性李斯特菌(L.monocytogenes或Lm)為細胞內病原體，其主要感染抗原呈遞細胞且已適宜於在此等細胞之細胞質中生活。宿主細胞(諸如巨噬細胞)主動吞噬單核球增多性李斯特菌，且大部分細菌在吞噬溶菌體中降解。一些細菌經由溶血素，李斯特菌溶胞素O(listeriolysin O；LLO)之作用藉由穿過吞噬體膜而逃脫至宿主胞溶質中。一旦處於胞溶質中，單核球增多性李斯特菌可使宿主肌動蛋白聚合，且在細胞間直接流通，從而進一步避開宿主免疫系統且導致對單核球增多性李斯特菌之可忽略的抗體反應。因為單核球增多性李斯特菌具有進入吞噬體及胞溶質隔室兩者之途徑，藉由Lm遞送之抗原可在MHC I及II分子兩者之情形下呈現，從而導致較強但優先之細胞免疫反應。

胰臟癌患者之低存活率明顯需要對此類型癌症之更穩健治療。本發明藉由提供包含表現存活素抗原或其免疫原性片段之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑的組合療法來解決罹患胰臟癌之個體的需要。

在一個態樣中，本文揭示一種在個體中引起針對腫瘤或癌症之抗腫瘤或抗癌免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，由此在該個體中引起抗腫瘤或抗癌免疫反應。

在另一態樣中，本文揭示一種在個體中預防腫瘤或癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中治療腫瘤或癌症。在另一個具體例中，腫瘤或癌症為存活素表現性腫瘤或存活素表現性癌症。

在一個態樣中，本文揭示一種在個體中治療腫瘤或癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中治療腫瘤或癌症。在另一個具體例中，腫瘤或癌症為存活素表現性腫瘤或存活素表現性癌症。

在另一態樣中，本文揭示一種在患有腫瘤或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中延遲轉移性疾病。

在另一態樣中，本文揭示一種在患有腫瘤或癌症之個體中破壞對存活素之耐受性的方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中破壞對存活素之耐受性。

在另一態樣中，本文揭示一種延長患有腫瘤或癌症之個體之存活期的方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與延長該個體之存活期。

在另一態樣中，本文揭示一種在患有腫瘤或癌症之個體中刺激抗腫瘤免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中刺激抗腫瘤免疫反應。

在另一態樣中，該拮抗劑為抗體或其功能片段。在另一態樣中，該免疫抑制分子為PD-1B7-1、PD-L1及PD-L2。在另一態樣中，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子，其中該融合多肽包含與存活素抗原或其免疫原性片段融合的含PEST序列之多肽。在另一態樣中，該含PEST之肽或多肽係選自由以下各者組成之群：N端非溶血性李斯特菌溶胞素(LLO)片段、N端ActA片段及含PEST之胺基酸序列。在另一態樣中，該核酸分子包含編碼代謝酶之第二開讀框，且其中該代謝酶與該重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。在另一態樣中，代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在另一態樣中，該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因中之突變。在另一態樣中，該重組減毒李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌。

在另一態樣中，該個體為人類。在另一態樣中，投與包含該重組減毒李斯特菌屬之組成物預防腫瘤或癌症內之逃脫突變，產生無惡化存活期，抑制腫瘤生長，誘導癌症消退，延長無惡化存活期(PFS)，增加疾病進展時間，或其任何組合。在另一態樣中，該腫瘤或癌症包含胰臟腫瘤或胰臟癌。在另一態樣中，該癌症為難治癒之癌症。在另一個具體例中，該腫瘤為存活素表現性腫瘤。在另一個具體例中，該癌症為存活素表現性癌症。

本文所揭示之其他特徵及優勢將自以下實施方式之實例及圖式變得顯而易知。然而，應瞭解，實施方式及特定實例雖然指示本發明之較佳具體例，但僅以說明方式給出，因為熟習此項技術者將由此實施方式而變得顯而易知本發明之精神及範疇內的各種改變及修改。

特別指出視為本發明之主題且在本說明書之結論部分處清楚地主張。然而，關於操作之組織及方法以及其對象、特徵及優點兩方面，本發明可藉由在與隨附圖式一起閱讀時參考以下實施方式來最佳瞭解，在此等隨附圖式中：圖1A-D.呈現在KPC(KrasG12D/+；Trp53R172H/+；Pdx-1Cre)模型中自發出現之腫瘤上藉由免疫螢光法(IF)之Her2染色的代表性影像(圖1A)。源自KPC小鼠之腫瘤細胞株，其藉由流動式細胞量測術顯示Her2表現(圖1B)。來自KPC小鼠之腫瘤細胞株的西方墨點分析(Western blot analysis)顯示Her2表現(圖1C)。藉由syfpethi算法預測，用抗CD40治療皮下植入之胰管癌(PDA)細胞株誘導對Her2特異性肽具有特異性之T細胞(圖1D)。

圖2A-C.顯示選擇用於研究之兩種腫瘤細胞株：7681.PDA，其顯示最小基質隔室，及69.PDA，其具有基質隔室(圖2A)。呈現14天齡之確立腫瘤(7681)，其每週在第0天開始用李斯特菌屬疫苗構築體處理，且其中腫瘤體積在第+14天進行評估(圖2B)。小鼠用69.PDA腫瘤進行攻擊，且在第4天用單次劑量之疫苗處理，且監測腫瘤生長(圖2C)。

圖3A-B.呈現使用李斯特菌屬疫苗之預防療法的示意性處理模型(圖3A)。呈現腫瘤生長曲線，其顯示Lm-LLO-E7及Lm-LLO-Her2處理不影響腫瘤生長(圖3B)。

圖4A-D.呈現對用於存活表現之腫瘤細胞株的流動式細胞量測術分析(細胞內分析)(圖4A)。呈現小鼠腫瘤生長曲線，其用69.PDA進行攻擊，且在第10天開始用單次劑量之李斯特菌屬疫苗處理(圖4B)。呈現具有確立腫瘤之LSL-Kras ^G12D/+ ；LSL-Trp53 ^R172H/+ ；Pdx-1-Cre(KPC)小鼠，其用單次劑量之李斯特菌屬疫苗處理，且其中在14天後對腫瘤組織評估T細胞浸潤(圖4C)。呈現在李斯特菌屬疫苗療法之後14天時T細胞浸潤之代表性IHC圖像(圖4D)。

圖5A-C.呈現自未處理KPC小鼠分離之CD45+Epcam(陰性)白血球對比CD45(陰性)Epcam+腫瘤細胞的離體流動式細胞量測分析。顯示I類MHC分子(H-2Db及H-2Kb)、II類MHC(I-A/I-E)及協同刺激分子CD86及CD40之MFI。ND=與FMO相比較不可偵測(圖5A)。顯示代表性免疫螢光法影像，其顯示來自KPC小鼠之腫瘤中PD-L1之表現(圖5B)。顯示自來自KPC小鼠之腸系膜淋巴結對比瘤周淋巴結分離之T細胞上的PD-1之表現(圖5C)。

圖6A-D.呈現顯示IFN-g處理對表現I類MHC之腫瘤細胞百分比的影響的圖(圖6A)。呈現顯示IFN-g處理對MHC表現量之影響的圖(圖6B)。呈現顯示IFN-g處理對表現PD-L1之腫瘤細胞百分比的影響的圖(圖6C)。呈現顯示IFN-g處理對PD-L1表現量之影響的圖(圖6D)。

圖7A-D.呈現與PD-1阻斷組合之李斯特菌屬疫苗療法的示意性處理模型(圖7A)。呈現個體小鼠生長曲線(圖7B)。呈現平均生長曲線(圖7C)。呈現整體存活率(圖7D)。

在以下實施方式中，闡述許多具體細節以便提供對本發明之透徹瞭解。然而，熟習此項技術者應瞭解，本發明可在無此等特定細節下實踐。在其他情況下，未詳細描述熟知方法、程序及組件，以免混淆本發明。

縮寫. 在本發明之實施方式及實例通篇，將使用以下縮寫：

I. 重組李斯特菌屬菌株

在一個具體例中，本文揭示一種重組減毒李斯特菌屬菌株，其包含編碼融合多肽之核酸分子，其中該融合多肽包含與含PEST之肽或多肽融合的存活素抗原或其免疫原性片段或其免疫原性片段。在另一個具體例中，核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為截短李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白質(tLLO)。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為LLO之片段。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為LLO之N端片段。在另一個具體例中，含PEST之多肽或多肽為截短ActA蛋白質。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為ActA蛋白質之片段。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為ActA之N端片段。在另一個具體例中，含PEST之肽或多肽為含PEST之胺基酸序列。在另一個具體例中，核酸分子進一步包含編碼代謝酶之第二開讀框，其中該代謝酶與重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。

熟練技術人員應瞭解，術語「核酸」或「核苷酸」可涵蓋一串至少兩種鹼基-糖-磷酸酯組合。在一個具體例中，該術語包括DNA及RNA。在一個具體例中，「核苷酸」係指核酸聚合物之單體單元。在一個具體例中，RNA可呈tRNA(轉移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及核糖核酸酶形式。已描述siRNA及miRNA之用途(Caudy AA等人，Genes & Devel 16：2491-96及其中引用之參考文獻)。DNA可呈質體DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或此等基團之衍生物形式。另外，此等形式之DNA及RNA可呈單股、雙股、三股或四股。在另一個具體例中，該術語亦包括可含有其他類型之主鏈但鹼基相同之人工核酸。在一個具體例中，人工核酸為PNA(肽核酸)。PNA含有肽主鏈及核苷酸鹼基且在一個具體例中能夠結合DNA與RNA分子兩者。在另一個具體例中，核苷酸經氧雜環丁烷修飾。在另一個具體例中，核苷酸藉由用一個硫代磷酸酯鍵置換一或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一個具體例中，人工核酸含有此項技術中已知之原生核酸之磷酸酯主鏈的任何其他變異體。硫代磷酸酯核酸及PNA之用途為熟習此項技術者已知且描述於例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9：353-57；及Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun。297：1075-84中。核酸之產生及使用為熟習此項技術者已知，且描述於例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook及Russell編輯及Methods in Enzymology：Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio及G.C.Fareed。各核酸衍生物代表如本文提供之各別具體例。

術語「胺基酸」理解為包括20種天然存在之胺基酸；通常經活體內轉譯後修飾之彼等胺基酸，包括例如羥基脯胺酸、磷酸絲胺酸及磷酸蘇胺酸；及其他非尋常胺基酸，包括(但不限於)2-胺基己二酸、羥基離胺酸、異鎖鏈素、正纈胺酸、正白胺酸及鳥胺酸。此外，術語「胺基酸」可包括D-胺基酸及L-胺基酸兩者。

熟練技術人員應瞭解，術語「開讀框」或「ORF」可涵蓋含有可潛在地編碼蛋白質之鹼基序列的生物體基因組的一部分。在另一個具體例中，ORF之開始及停止末端不同等於mRNA之末端，但其通常含於mRNA內。在一個具體例中，ORF位於基因之開始編碼序列(起始密碼子)與停止密碼子序列(終止密碼子)之間。因此，在一個具體例中，可操作地整合至基因組中具有內源性多肽之開讀框的核酸分子為整合至基因組中與內源性多肽相同開讀框中的核酸分子。

熟練技術人員應瞭解，術語「內源性」可涵蓋在參考有機體內發育或起源或由參考有機體內之原因而出現的項目。舉例而言，內源性係指原生。

熟練技術人員應瞭解，術語「片段」可涵蓋比全長蛋白質或多肽短或包含較少胺基酸之蛋白質或多肽。在一個具體例中，片段為N端片段。在另一個具體例中，LLO片段為C端片段。在又另一個具體例中，片段為蛋白質或肽之序列內區段。在一個具體例中，片段為功能片段。在另一個具體例中，片段為免疫原性片段。在一個具體例中，片段具有10-20個胺基酸，而在另一個具體例中，片段具有超過5個胺基酸，而在另一個具體例中，片段具有100-200個胺基酸，而在另一個具體例中，片段具有100-500個胺基酸，而在另一個具體例中，片段具有50-200個胺基酸，而在另一個具體例中，片段具有10-250個胺基酸。

在一個替代性具體例中，術語「片段」係指比全長核酸短或包含較少核苷酸之核酸。在一個具體例中，片段為5'端片段。在另一個具體例中，片段為3'端片段。在又另一個具體例中，片段編碼蛋白質之序列內區段。在一個具體例中，片段具有10-20個核苷酸，而在另一個具體例中，片段具有超過5個核苷酸，而在另一個具體例中，片段具有100-200個核苷酸，而在另一個具體例中，片段具有100-500個核苷酸，而在另一個具體例中，片段具有50-200個核苷酸，而在另一個具體例中，片段具有10-250個核苷酸。

熟練技術人員應瞭解，在本發明之意義內，術語「功能性」可涵蓋蛋白質、肽、核酸、其片段或變異體展現生物活性或功能之固有能力。在一個具體例中，此類生物功能為其與相互相用搭配物(例如膜相關受體)結合之特性，且在另一個具體例中，其三聚特性。在本發明之功能片段及功能變異體的情況下，此等生物學功能可實際上在例如其特異性或選擇性方面進行變化，但保持基本生物功能。

熟練技術人員應瞭解，術語「功能片段」可涵蓋免疫原性片段，且當單獨或在本文提供之菌株組成物中向個體投與時引起免疫反應。在另一個具體例中，功能片段具有熟練技術人員將理解且如本文進一步提供之生物活性。

熟練技術人員應瞭解，術語「融合」可涵蓋藉由共價鍵可操作連接。在一個具體例中，該術語涵蓋重組融合(核酸序列或其開讀框)。在另一個具體例中，該術語涵蓋化學結合。

在一個具體例中，LLO序列包含截短PEST胺基酸(AA)序列。在另一個具體例中，PEST胺基酸序列為存在於LLO中之推定PEST序列。在另一個具體例中，截短LLO包含PEST胺基酸(AA)序列。在另一個具體例中，PEST AA序列包含截短LLO序列。在另一個具體例中，PEST AA序列包含LLO片段序列。在另一個具體例中，PEST AA序列包含截短ActA序列。在另一個具體例中，截短ActA序列包含PEST序列。在另一個具體例中，PEST AA序列包含ActA片段序列。舉例而言，PEST胺基酸序列可為KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：1)。此外，抗原與來自李斯特菌屬之其他單核球增多性李斯特菌(Lm)PEST AA序列的融合可增強該抗原之免疫原性。

在一個具體例中，「截短LLO」、「N端LLO片段」或「△LLO」在本文中可互換地使用且係指包含推定PEST序列的非溶血性之LLO片段。在另一個具體例中，該等術語係指包含PEST結構域之LLO片段。在另一個具體例中，LLO片段為至少492個胺基酸(AA) 長。在另一個具體例中，LLO片段為492-528個AA長。

在另一個具體例中，LLO片段由LLO蛋白質約前441個AA組成。在另一個具體例中，LLO片段由LLO約前420個AA組成。在另一個具體例中，LLO片段為LLO蛋白質之非溶血性形式。

在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-25組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-50組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-75組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-100組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-125組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-150組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-175組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-200組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-225組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-250組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-275組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-300組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-325組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-350組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-375組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-400組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-425組成。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一個具體例中，LLO片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源LLO蛋白質之殘基。在另一個具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源LLO蛋白質相對於本文所用之LLO蛋白質具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。在另一個具體例中，LLO片段為此項技術中已知之任何其他LLO片段。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的N端 LLO蛋白質片段在一個具體例中包含SEQ ID No：3。在另一個具體例中，LLO片段包含LLO信號肽。在另一個具體例中，LLO片段包含SEQ ID No：4。在另一個具體例中，LLO片段由SEQ ID No：4組成。在另一個具體例中，LLO片段基本上由SEQ ID No：4組成。在另一個具體例中，LLO片段對應於SEQ ID No：4。在另一個具體例中，LLO片段與SEQ ID No：4同源。在另一個具體例中，LLO片段與SEQ ID No：4之片段同源。一些實例中所用之LLO片段(△LLO)為416個AA長(不包括信號序列)。在此截短片段中，來自羧基端之88個殘基(其含有活化結構域，包括半胱胺酸484)被移除。熟習此項技術者將理解，不具有活化結構域且尤其不具有半胱胺酸484之任何△LLO適合於本發明之方法及組成物。在另一個具體例中，異源抗原(諸如存活素抗原或其片段)與任何△LLO之融合增強抗原之細胞介導及抗腫瘤免疫性。在另一個具體例中，異源抗原(諸如存活素抗原或其片段)與PEST胺基酸序列(諸如SEQ ID NO：1中所提供)之融合增強抗原之細胞介導及抗腫瘤免疫性。在另一個具體例中，LLO片段缺乏膽固醇結合域(CBD)。缺乏CBD之LLO突變體揭示於美國專利第8,771,702號中，其以全文引用的方式併入本文中。

熟練技術人員應瞭解，術語「PEST胺基酸序列」、「PEST AA序列」、「含PEST序列之多肽」、「含PEST序列之蛋白質」或「含PEST之肽或多肽」在本文中可互換地使用且可涵蓋PEST序列肽或LLO蛋白質之片段或ActA蛋白質之片段。PEST序列肽為此項技術中已知且描述於美國專利第7,635,479號及美國專利公開案第2014/0186387號中，兩者皆以全文引用的方式併入本文中。

在一個具體例中，抗原與單核球增多性李斯特菌之 PEST序列的融合增強抗原之細胞介導及抗腫瘤免疫性。因此，預期抗原與來自其他原核生物體(包括(但不限於)其他李斯特菌物種)之PEST胺基酸序列的融合具有類似作用。在另一個具體例中，PEST序列包埋於抗原蛋白質內。因此，「融合」係指抗原蛋白質包含抗原及連接於該抗原之一端或包埋於該抗原內之PEST胺基酸序列兩者。源自其他原核生物體之PEST序列亦將增強抗原免疫原性。在另一個具體例中，原核生物體之PEST序列可常規地根據諸如Rechsteiner及Roberts(TBS 21：267-271,1996)針對單核球增多性李斯特菌所描述之方法鑑別。或者，亦可基於此方法鑑別來自其他原核生物體之PEST胺基酸序列。將預期PEST胺基酸序列之其他原核生物體包括(但不限於)其他李斯特菌物種。舉例而言，單核球增多性李斯特菌蛋白質ActA含有四種此類序列。此等為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：7)及RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：8)。來自鏈球菌屬(Streptococcus sp.)之鏈球菌溶血素O亦含有PEST序列。舉例而言，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O在胺基酸35-51處包含PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：9)且馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O在胺基酸38-54處包含PEST序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：10)。另外，咸信PEST序列可包埋於抗原蛋白質內。因此，出於本發明之目的，當涉及PEST序列融合時，「融合」意謂抗原性蛋白質包含抗原與連接於抗原之一端或包埋於抗原內之PEST胺基酸序列。

熟練技術人員應瞭解，術語「免疫原性」或「免疫原性的」可涵蓋蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體當向動物投與該蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體時在該動物中引起免疫反應之固有能力。因此，在一個具體例中，「增強免疫原性」係指增加蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體當向動物投與該蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體時在該動物中引起免疫反應之能力。在一個具體例中，增加的蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體引起免疫反應之能力可藉由以下各者來量測：針對蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體之抗體的更大數目，針對抗原或有機體之抗體的更大多樣性，對蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體具有特異性之T細胞的更大數目，對蛋白質、肽、核酸、抗原或有機體之更大細胞毒性或輔助T細胞反應，及其類似者。

在另一個具體例中，構築體或核酸分子自游離型或質體載體表現，其具有編碼含PEST序列之多肽或PEST序列肽的核酸序列。在另一個具體例中，質體穩定維持在缺乏抗生素選擇之重組李斯特菌屬疫苗菌株中。在另一個具體例中，質體不賦予重組李斯特菌屬以抗生素耐藥性。在另一個具體例中，片段為功能片段。在另一個具體例中，片段為免疫原性片段。

熟練技術人員應瞭解，術語「載體」可涵蓋質體。在另一個具體例中，該術語可涵蓋整合載體，其能夠轉型至李斯特菌屬宿主中且以允許載體所包含之基因表現的方式併入李斯特菌之染色體中。在另一個具體例中，該術語可涵蓋非整合載體，其未整合在李斯特菌之染色體中，而實際上存在於李斯特菌之細胞質中。在另一個具體例中，該術語可涵蓋包含整合載體之質體。在另一個具體例中，整合載體為定點整合載體。

熟練技術人員當配備有本發明時將容易地理解，不同轉錄啟動子、終止子、載體(carrier vector)或特定基因序列(例如市售選殖載體中之彼等)可成功地用於本文提供之方法及組成物中。如本發明中涵蓋的，此等功能性提供於例如稱為pUC系列之市售載體中。在另一個具體例中，非必需DNA序列(例如抗生素抗性基因)被移除。在另一個具體例中，市售之質體用於本發明中。此類質體可購自多種來源，例如Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA)，或可使用此項技術中熟知之方法來構築。另一個具體例為諸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)之質體，其為具有原核複製起點及啟動子/調節元件以促進在原核生物體中表現的原核表現載體。在另一個具體例中，外來核苷酸序列被移除以減小質體的大小且增加可置放於其中之卡匣的大小。此類方法為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)及Ausubei等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green & Wiley,New York)中。

在另一個具體例中，用於構築本文所揭示之疫苗的LLO蛋白質具有以下序列：(GenBank寄存編號P13128；SEQ ID NO：2；核酸序列在Genbank寄存編號X15127中闡述)。對應於此序列的前蛋白之前25 AA為信號序列且當由細菌分泌時自LLO裂解。因此，在此具體例中，全長活性LLO蛋白質為504個殘基長。在另一個具體例中，上述LLO片段用作併入本發明之疫苗中之LLO片段的來源。

在另一個具體例中，用於本文所揭示之組成物及方法中的LLO蛋白質之N端片段具有以下序列：(SEQ ID NO：3)。

在另一個具體例中，LLO片段對應於本文所用之LLO蛋白質的約AA 20-442。

在另一個具體例中，LLO片段具有以下序列：(SEQ ID NO：4)。

如本文所用，「截短LLO」、「tLLO」或「△LLO」係指包含PEST胺基酸序列之LLO片段。在另一個具體例中，該術語係指包含PEST序列之LLO片段。在另一個具體例中，「△LLO」係指如上文所定義之416AA LLO片段。

在另一個具體例中，術語截短LLO、tLLO或△LLO係指在胺基端不含有活化結構域且不包括半胱胺酸484之LLO片段。在另一個具體例中，該等術語係指非溶血性之LLO片段。在另一個具體例中，LLO片段藉由活化結構域之缺失或突變而被賦予非溶血性。在另一個具體例中，LLO片段藉由包含半胱胺酸484之缺失或突變而被賦予非溶血性。在另一個具體例中，LLO片段藉由在另一個位置處之缺失或突變而被賦予非溶血性。在另一個具體例中，LLO藉由膽固醇結合域(CBD)之缺失或突變而被賦予非溶血性，如以引用的方式併入本文中之美國專利第8,771,702號中所詳述。

在另一個具體例中，編碼截短LLO蛋白質之重組核苷酸包含SEQ ID NO：11中闡述之序列。

在另一個具體例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：11中闡述之序列。在另一個具體例中，重組核苷酸包含編碼LLO蛋白質之片段的序列。

在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-25組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-50組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-75組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-100組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-125組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-150組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-175組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-200組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-225組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-250組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-275組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-300組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-325組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-350組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-375組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-400組成。在另一個具體例中，LLO片段由約殘基1-425組成。

在另一個具體例中，本文所揭示之LLO片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源LLO蛋白質之殘基。在另一個具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源LLO蛋白質相對於本文所用之LLO蛋白質具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。其他LLO片段為此項技術中已知。

在另一個具體例中，同源LLO係指與LLO序列(例如與 SEQ ID No：2-4之一)超過70%之一致性。在另一個具體例中，同源LLO係指與SEQ ID No：2-4之一超過72%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過75%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過78%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過80%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過82%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過83%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ IDNo：2-4之一超過85%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過87%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過88%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過90%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過92%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過93%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過95%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過96%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過97%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過98%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一超過99%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：2-4之一為100%之一致性。

在一個具體例中，ActA蛋白質包含SEQ ID NO：12中闡述之序列。

對應於此序列的前蛋白之前29個AA為信號序列且當由細菌分泌時自ActA蛋白質裂解。在一個具體例中，ActA多肽或肽包含信號序列，上述SEQ ID NO：12之AA1-29。在另一個具體例中，ActA多肽或肽不包括信號序列，上述SEQ ID NO：12之AA 1-29。

在一個具體例中，截短ActA蛋白質包含ActA蛋白質之N端片段。在另一個具體例中，截短ActA蛋白質為ActA蛋白質之N端片段。在一個具體例中，截短ActA蛋白質包含SEQ ID NO：13中闡述之序列。

在另一個具體例中，ActA片段包含SEQ ID NO：13中闡述之序列。

在另一個具體例中，截短ActA蛋白質包含SEQ ID NO：14中闡述之序列。

在另一個具體例中，ActA片段為此項技術中已知之任何其他ActA片段。

在另一個具體例中，編碼截短ActA蛋白質之重組核苷酸包含SEQ ID NO：15中闡述之序列：。

在另一個具體例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：15中闡述之序列。在另一個具體例中，重組核苷酸包含編碼ActA蛋白質之片段的其他序列。

在另一個具體例中，「截短ActA」或「△ActA」係指包含至少一個PEST序列之ActA片段。在另一個具體例中，該等術語係指包含超過一個PEST序列之ActA片段。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的N端ActA蛋白質片段包含SEQ ID No：13。在另一個具體例中，ActA片段包含ActA信號肽。在另一個具體例中，ActA片段包含SEQ ID No：14。在另一個具體例中，ActA片段大致由SEQ ID No：13或SEQ ID No：14組成。在另一個具體例中，ActA片段基本上由SEQ ID No：13或SEQ ID No：14組成。在另一個具體例中，ActA片段對應於SEQ ID No：13或SEQ ID No：14。在另一個具體例中，ActA片段與SEQ ID No：13或SEQ ID No：14同源。在另一個具體例中，ActA片段與SEQ ID No：13或SEQ ID No：14之片段同源。

在另一個具體例中，PEST序列為源自原核生物體之另一個PEST-AA序列。PEST序列可為此項技術中已知之其他PEST序列。

在另一個具體例中，ActA片段由ActA蛋白質約前100個AA組成。

在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-25組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-50組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-75組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-100組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-125組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-150組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-175組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-200組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-225組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-250組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-275組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-300組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-325組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-338組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-350組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-375組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基 1-400組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-450組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-500組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-550組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-600組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-639組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-100組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-125組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-150組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-175組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-200組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-225組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-250組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-275組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-300組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-325組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-338組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-350組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-375組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-400組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-450組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-500組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-550組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基1-600組成。在另一個具體例中，ActA片段由約殘基30-604組成。

在另一個具體例中，本文所揭示之ActA片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源ActA蛋白質之殘基。在另一個具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源ActA蛋白質相對於本文所用之ActA蛋白質具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。其他ActA片段為此項技術中已知。

在另一個具體例中，同源ActA係指與ActA序列(例如SEQ ID NO：12之一超過70%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過72%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過75%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過78%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過80%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過82%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過83%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過85%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過87%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過88%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過90%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過92%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過93%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過95%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過96%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過97%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過98%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一超過99%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：12之一為100%之一致性。

熟練技術人員應瞭解，術語「同源」當涉及本文所揭示之任何核酸序列時可涵蓋候選序列中與對應原生核酸序列之核苷酸一致之核苷酸的百分比。

同源性可藉由此項技術中充分描述之方法，藉由用於序列比對之電腦算法測定。舉例而言，核酸序列同源性之電腦算法分析可包括利用多種可獲得之軟體套件，諸如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT及TREMBL套裝。

在另一個具體例中，「同源」係指與選自本文所揭示之序列之序列的一致性超過68%。在另一個具體例中，「同源」係指與選自本文所揭示之序列之序列的一致性超過70%。在另一個具體例中，「同源」係指與選自本文所揭示之序列之序列的一致性超過72%。在另一個具體例中，一致性超過75%。在另一個具體例中，一致性超過78%。在另一個具體例中，一致性超過80%。在另一個具體例中，一致性超過82%。在另一個具體例中，一致性超過83%。在另一個具體例中，一致性超過85%。在另一個具體例中，一致性超過87%。在另一個具體例中，一致性超過88%。在另一個具體例中，一致性超過90%。在另一個具體例中，一致性超過92%。在另一個具體例中，一致性超過93%。在另一個具體例中，一致性超過95%。在另一個具體例中，一致性超過96%。在另一個具體例中，一致性超過97%。在另一個具體例中，一致性超過98%。在另一個具體例中，一致性超過99%。在另一個具體例中，一致性為100%。

在另一個具體例中，供用於本發明中之LLO蛋白質、ActA蛋白質或其片段無需為在本文所闡述之序列中精確闡述的，而是可進行保留如本文其他地方所闡述與抗原融合之LLO或ActA蛋白質之功能特徵的其他改變、修飾或變化。在另一個具體例中，本發明利用LLO蛋白質、ActA蛋白質或其片段之類似物。在另一個具體例中，類似物與天然存在之蛋白質或肽的不同之處在於保守性AA序列差異或不影響序列之修飾，或其兩者。

熟練技術人員應瞭解，術語「經保守修飾之變異體」或「保守取代」可涵蓋用具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構形及剛性等)之其他胺基酸取代蛋白質中之胺基酸，以使得時常可在不改變該蛋白質之生物活性或其他所需特性(諸如抗原親和力及/或特異性)的情況下進行變化。熟習此項技術者認識到，一般而言，多肽非必需區中之單胺基酸取代實質上不改變生物活性(參見，例如，Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。另外，結構上或功能上類似之胺基酸的取代不大可能破壞生物活性。

在另一個具體例中，經由測定候選序列雜交來確定同源性，測定序列雜交之方法為此項技術中充分描述(參見例如「Nucleic Acid Hybridization」Hames,B.D.，及Higgins S.J.編輯(1985)；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；及Ausubel等人，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)舉例而言，可在中等至嚴格條件下進行與編碼原生卡斯蛋白酶肽之DNA的補體雜交之方法。雜交條件為例如在42℃下，在包含以下之溶液中培育隔夜：10%-20%甲醯胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5X登哈特溶液(Denhardt's solution)、10%硫酸葡聚糖及20μg/ml變性修剪鮭魚精子DNA。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株缺乏抗生素抗性基因。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼抗生素抗性基因之核酸的質體。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含不編碼抗生素抗性基因之質體。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌能夠自吞噬溶菌體逃脫。

在一個具體例中，本文所揭示之多肽為包含選自由以下各者組成之群的額外多肽的融合蛋白：非溶血性LLO蛋白質或其N端片段、PEST序列、或ActA蛋白質或其片段。在另一個具體例中，額外多肽與存活素抗原融合。在另一個具體例中，額外多肽為功能性的。在另一個具體例中，額外多肽之片段為免疫原性的。在另一個具體例中，額外多肽為免疫原性的。

在一個具體例中，編碼存活素或其抗原部分之核酸序列與LLO同框整合在李斯特菌染色體中。在另一個具體例中，編碼存活素或其抗原部分之整合核酸序列與ActA同框整合在actA基因座處。在另一個具體例中，編碼ActA之染色體核酸經包含編碼抗原之序列的核酸分子置換。在另一個具體例中，抗原為存活素或其片段。在另一個具體例中，存活素為人類存活素。

熟練技術人員應瞭解，關於蛋白質、肽或多肽之術語「其抗原部分」、「其片段」及「其免疫原性部分」在本文中可互換地使用且可涵蓋如本文所描述，包含當存在於宿主中或(在一些具體例中)由宿主偵測到時單獨或在融合蛋白之情形下引起免疫反應建立之結構域或區段的蛋白質、多肽、肽，包括其重組形式。

在一個具體例中，本文所揭示之核酸分子包含編碼包含存活素或其抗原片段之重組多肽的第一開讀框。在另一個具體例中，重組多肽進一步包含與存活素或其抗原部分融合之截短LLO蛋白質、截短ActA蛋白質或PEST序列肽。在另一個具體例中，截短LLO片段為N端LLO或其片段。在另一個具體例中，截短ActA蛋白質為N端ActA蛋白質或其片段。

在一個具體例中，本文所揭示之核酸分子進一步包含編碼代謝酶之第二開讀框。在另一個具體例中，代謝酶與重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。在另一個具體例中，由第二開讀框編碼之代謝酶為丙胺酸消旋酶(dal)。在另一個具體例中，由第二開讀框編碼之代謝酶為D-胺基酸轉移酶(dat)。在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株包含內源性dal/dat基因之突變。在另一個具體例中，李斯特菌缺乏dal/dat基因。在另一個具體例中，李斯特菌缺乏dal/dat及actA基因。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物之核酸分子可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物之第一開讀框可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物之第二開讀框可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中，開讀框中之每一者可操作地連接於啟動子/調節序列。

熟練技術人員應瞭解，術語「可操作地連接」可涵蓋轉錄及轉譯調節核酸以起始轉錄之方式相對於任何編碼序列定位。一般而言，此將意謂啟動子及轉錄起始或開始序列定位於編碼區之5'。在另一個具體例中，術語「可操作地連接」係指併接，其中如此描述之組件處於允許其以其預期方式起作用之關係中。「可操作地連接」於編碼序列之控制序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下實現的方式接合。

熟練技術人員應瞭解，術語「代謝酶」可涵蓋合成宿主細菌所需營養所涉及的酶。在一個具體例中，該術語係指合成宿主細菌所需營養所需的酶。在另一個具體例中，該術語係指合成宿主細菌所利用營養所涉及的酶。在另一個具體例中，該術語係指合成宿主細菌持續生長所需之營養所涉及的酶。在另一個具體例中，合成營養需要該酶。

在另一個具體例中，重組李斯特菌為減毒之營養缺陷型菌株。在另一個具體例中，重組營養缺陷型李斯特菌包含美國專利第8,114,414號中所描述之菌株，該案以全文引用的方式併入本文中。在一個具體例中，減毒菌株為Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm dal(-)dat(-)△actA(LmddA)。LmddA係基於由於致病性基因actA缺失而減毒之李斯特菌屬疫苗載體，且藉由與dal基因互補而保留用於活體內及活體外存活素抗原融合多肽的質體。

在另一個具體例中，本文所揭示之減毒菌株為ADXS31-265，其包含pAdv 265.5質體(SEQ ID NO：16)。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△actA。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△prfA。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△plcB。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△plcA。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△inlA。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△inlB。在另一個具體例中，減毒菌株為Lm△inlC。在另一個具體例中，菌株為任何上述菌株的二次突變體或三次突變體。在另一個具體例中，此菌株發揮強輔助作用，此為基於李斯特菌屬之疫苗的特性。在另一個具體例中，此菌株自EGD 李斯特菌主鏈構築。在另一個具體例中，本發明中所用之菌株為表現非溶血性LLO或其片段的李斯特菌屬菌株。

在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株為營養缺陷型突變。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏編碼維生素合成基因之基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏編碼泛酸合成酶之基因。

在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株缺乏胺基酸(AA)代謝酶。在另一個具體例中，可例如以熟習此項技術者熟知的許多方式產生缺乏D-丙胺酸之李斯特菌屬營養缺陷型菌株，該等方式包括缺失突變誘發、插入突變誘發及導致產生讀框轉移突變的突變誘發、引起蛋白質提前終止之突變或影響基因表現之調節序列突變。在另一個具體例中，可使用重組DNA技術或使用利用突變誘發化學物質或輻射且隨後選擇突變體的傳統突變誘發技術實現突變誘發。在另一個具體例中，缺失突變體為較佳，因為伴隨營養缺陷型表型逆轉機率低。在另一個具體例中，可在簡單實驗室培養分析法中測試根據本文呈現之方案產生的D-丙胺酸之突變體在無D-丙胺酸存在下生長的能力。在另一個具體例中，選擇不能在無此化合物存在下生長的彼等突變體進行進一步研究。

在另一個具體例中，除上述D-丙胺酸相關基因之外，如本文提供合成代謝酶所涉及之其他基因可用作李斯特菌屬突變誘發的標靶。

在一個具體例中，代謝酶與重組菌株之染色體中的突變互補。在另一個具體例中，內源性代謝基因在染色體中突變。在另一個具體例中，染色體缺失內源性代謝基因。在另一個具體例中，代謝酶為胺基酸代謝酶。在另一個具體例中，代謝酶催化用於重組李斯特菌屬菌株中細胞壁合成的胺基酸形成。在另一個具體例中，代謝酶為丙胺酸消旋酶。在另一個具體例中，代謝酶為D-胺基酸轉移酶。

熟練技術人員應瞭解，術語「游離型表現載體」可涵蓋可為線性或圓形且通常為雙股形式之核酸載體。在一個具體例中，游離型表現載體包含所關注之基因。在另一個具體例中，所關注之插入基因不中斷或經受通常由整合至細胞DNA中引起的調節限制。在另一個具體例中，插入之異源基因的存在不引起細胞自身重要區域的重排或中斷。在另一個具體例中，游離型載體在細菌細胞質中保持多個複本，導致所關注的基因擴增，且在另一個具體例中，必要時提供病毒反式作用因子。在另一個具體例中，在穩定轉染程序中，使用游離型載體常常比使用整合染色體之質體轉染功效更高(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein-Barr virus-derived cDNA expression vector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的游離型表現載體可藉由用於將DNA分子遞送至細胞的多種方法中之任一者活體內、離體或活體外遞送至細胞。載體亦可單獨遞送或以增強向個體細胞之遞送的醫藥組成物形式遞送。

在一個具體例中，本文所揭示之營養缺陷型李斯特菌屬菌株包含具有與營養缺陷型李斯特菌屬菌株之營養缺陷性互補之代謝酶的游離型表現載體。在另一個具體例中，構築體以游離型方式含於 李斯特菌屬菌株中。在另一個具體例中，外來抗原由重組李斯特菌屬菌株所具有之載體表現。在另一個具體例中，游離型表現載體缺乏抗生素抗性標記物。在一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的抗原(例如存活素抗原)與包含PEST序列之多肽融合。在另一個具體例中，包含PEST序列之多肽為截短LLO。在另一個具體例中，包含PEST序列之多肽為ActA。

在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株缺乏胺基酸(AA)代謝酶。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏D-麩胺酸合成酶基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬李斯特菌屬菌株缺乏dat基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏dal基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏dga基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏合成二胺基庚二酸(DAP)所涉及之基因。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏合成半胱胺酸合成酶A(CysK)所涉及之基因。在另一個具體例中，基因為與維生素-B12無關之甲硫胺酸合成酶。在另一個具體例中，基因為trpA。在另一個具體例中，基因為trpB。在另一個具體例中，基因為trpE。在另一個具體例中，基因為asnB。在另一個具體例中，基因為gltD。在另一個具體例中，基因為gltB。在另一個具體例中，基因為leuA。在另一個具體例中，基因為argG。在另一個具體例中，基因為thrC。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株缺乏上文所述之一或多個基因。

在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株缺乏合成酶基因。在另一個具體例中，基因為AA合成基因。在另一個具體例中，基因為folP。在另一個具體例中，基因為二氫尿苷合成酶家族蛋白質。在另一個具體例中，基因為ispD。在另一個具體例中，基因為ispF。在另一個具體例中，基因為磷酸烯醇丙酮酸合成酶。在另一個具體例中，基因為hisF。。在另一個具體例中，基因為hisH。在另一個具體例中，基因為fliI。在另一個具體例中，基因為核糖體大子單元假尿苷合成酶。在另一個具體例中，基因為ispD。在另一個具體例中，基因為雙功能GMP合成酶/麩醯胺酸醯胺轉移酶蛋白質。在另一個具體例中，基因為cobS。在另一個具體例中，基因為cobB。在另一個具體例中，基因為cbiD。在另一個具體例中，基因為尿卟啉-IIIC-甲基轉移酶/尿卟啉原-III合成酶。在另一個具體例中，基因為cobQ。在另一個具體例中，基因為uppS。在另一個具體例中，基因為truB。在另一個具體例中，基因為dxs。在另一個具體例中，基因為mvaS。在另一個具體例中，基因為dapA。在另一個具體例中，基因為ispG。在另一個具體例中，基因為folC。在另一個具體例中，基因為檸檬酸酯合成酶。在另一個具體例中，基因為argJ。在另一個具體例中，基因為3-去氧-7-磷酸庚酮糖合成酶。在另一個具體例中，基因為吲哚-3-丙三醇-磷酸酯合成酶。在另一個具體例中，基因為鄰胺基苯甲酸酯合成酶/麩醯胺酸醯胺轉移酶組分。在另一個具體例中，基因為menB。在另一個具體例中，基因為甲萘醌類特異性異分支酸合成酶。在另一個具體例中，基因為磷酸核糖甲醯甘胺脒合成酶I或II。在另一個具體例中，基因為磷酸核糖胺基咪唑-琥珀羧胺合成酶。在另一個具體例中，基因為carB。在另一個具體例中，基因為carA。在另一個具體例中，基因為thyA。在另一個具體例中，基因為mgsA。在另一個具體例中，基因為aroB。在另一個具體例中，基因為hepB。在另一個具體例中，基因為rluB。在另一個具體例中，基因為ilvB。在另一個具體例中，基因為ilvN。在另一個具體例中，基因為alsS。在另一個具體例中，基因為fabF。在另一個具體例中，基因為fabH。在另一個具體例中，基因為假尿苷合成酶。在另一個具體例中，基因為pyrG。在另一個具體例中，基因為truA。在另一個具體例中，基因為pabB。在另一個具體例中，基因為atp合成酶基因(例如atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。

在另一個具體例中，基因為phoP。在另一個具體例中，基因為aroA。在另一個具體例中，基因為aroC。在另一個具體例中，基因為aroD。在另一個具體例中，基因為plcB。

在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株缺乏肽轉運體。在另一個具體例中，基因為ABC轉運體/ATP結合/透性酶蛋白質。在另一個具體例中，基因為寡肽ABC轉運體/寡肽-結合蛋白。在另一個具體例中，基因為寡肽ABC轉運體/透性酶蛋白質。在另一個具體例中，基因為鋅ABC轉運體/鋅結合蛋白。在另一個具體例中，基因為糖ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為磷酸酯轉運體。在另一個具體例中，基因為ZIP鋅轉運體。在另一個具體例中，基因為EmrB/QacA家族之抗藥性轉運體。在另一個具體例中，基因為硫酸酯轉運體。在另一個具體例中，基因為質子依賴性寡肽轉運體。在另一個具體例中，基因為鎂轉運體。在另一個具體例中，基因為甲酸酯/亞硝酸酯轉運體。在另一個具體例中，基因為亞精胺/腐胺ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為Na/Pi-共轉運體。在另一個具體例中，基因為糖磷酸酯轉運體。在另一個具體例中，基因為麩醯胺酸ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為主要協助轉運蛋白家族轉運體。在另一個具體例中，基因為甘胺酸甜菜鹼/L-脯胺酸ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為鉬ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為磷壁酸ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為鈷ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為銨轉運體。在另一個具體例中，基因為胺基酸ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為細胞分裂ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為錳ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為鐵化合物ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為麥芽糖/麥芽糊精ABC轉運體。在另一個具體例中，基因為Bcr/CflA家族之抗藥性轉運體。在另一個具體例中，基因為上述蛋白質中之一者的子單元。

在一個具體例中，本文揭示用於使李斯特菌屬轉型以獲得重組李斯特菌屬之核酸分子。在另一個具體例中，本文所揭示的用於使李斯特菌屬轉型之核酸缺乏致病性基因。在另一個具體例中，核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中且攜帶非功能性致病性基因。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬中之致病性基因突變。在另一個具體例中，核酸分子用於不活化李斯特菌屬基因組中存在的內源性基因。在又另一個具體例中，致病性基因為actA基因、inlA基因及inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因、或prfA基因。熟練技術人員應瞭解，致病性基因可為此項技術中已知與重組李斯特菌屬之致病性有關的任何基因。

在一個具體例中，本文所揭示之活減毒李斯特菌屬為重組李斯特菌屬。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬包含基因組內化蛋白C(inlB)基因之突變。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬包含基因組actA基因及基因組內化蛋白B基因之突變或缺失。在一個具體例中，藉由過程中涉及的缺失actA基因及/或inlB基因抑制李斯特菌屬至相鄰細胞的移位，由此引起出乎意料高量之減毒，提高免疫原性且用作疫苗主鏈。

熟練技術人員應瞭解，術語「減毒」可涵蓋減弱細菌在動物中引起疾病之能力。換言之，舉例而言，減毒李斯特菌屬菌株之病原性特徵已相較於野生型李斯特菌屬減少，不過減毒之李斯特菌屬能夠在培養物中生長及維持。舉例而言，用減毒之李斯特菌屬靜脈內接種Balb/c小鼠，50%接種動物存活的致死劑量(LD₅₀)較佳比野生型李斯特菌屬的LD₅₀高至少約10倍，更佳至少約100倍，更佳至少約1,000倍，甚至更佳至少約10,000倍且最佳至少約100,000倍。減毒之李斯特菌屬菌株因此為不殺死投與其之動物的菌株，或為僅當所投與細菌的數目極大地大於殺死同一動物所需的野生型非減毒細菌的數目時殺死動物的菌株。減毒細菌亦應理解為意謂在通用環境中不能複製之細菌，因為該環境中不存在其生長所需的營養。因此，細菌限於在提供所需營養之受控環境中複製。因此，本文所揭示之減毒菌株為環境安全的，因為其不能在無控制下複製。

在又另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬菌株為inlA突變體、inlB突變體、inlC突變體、inlJ突變體、prfA突變體、actA突變體、dal/dat突變體、prfA突變體、plcB缺失突變體或缺乏plcA與plcB之雙重突變體。在另一個具體例中，李斯特菌屬包含個別或組合之此等基因之缺失或突變。在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬缺乏基因中之每一者。在另一個具體例中，本文所揭示之李斯特菌屬缺乏本文提供之任何基因中的至少一者及高達十者，包括actA、prfA及dal/dat基因。在另一個具體例中，prfA突變體為D133V prfA突變體。

在一個具體例中，李斯特菌屬菌株之染色體中缺乏代謝基因、致病性基因等。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株之染色體及任何游離型基因元件中缺乏代謝基因、致病性基因等。在另一個具體例中，致病性菌株之基因組中缺乏代謝基因、致病性基因等。在一個具體例中，染色體中之致病性基因突變。在另一個具體例中，染色體之致病性基因缺失。在另一個具體例中，代謝基因、致病性基因等在李斯特菌屬菌株之染色體中突變。在另一個具體例中，代謝基因、致病性基因等在李斯特菌屬菌株之染色體及任何游離型基因元件中突變。在另一個具體例中，代謝基因、致病性基因等在致病性菌株之基因組中突變。在另一個具體例中，染色體之致病性基因缺失。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株經減毒。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬缺乏actA致病性基因。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬缺乏prfA致病性基因。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬乏inlB基因。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬缺乏actA及inlB基因。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性inlB基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性inlC基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA及inlB基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA及inlC基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含內源性actA、inlB及inlC基因之不活化突變。在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含以下基因中任何單個基因或組合中的不活化突變：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。

熟練技術人員應瞭解，術語「突變」及其語法同等物包括序列(核酸或胺基酸序列)的任何類型之突變或修飾，且包括缺失突變、截短、不活化、破壞或移位。此項技術中容易已知此等類型之突變。

在一個具體例中，為選擇包含編碼本文提供之代謝酶或互補基因之質體的營養缺陷型細菌，轉型之營養缺陷型細菌在將針對胺基酸代謝基因或互補基因之表現選擇之培養基上生長。在另一個具體例中，對於D-麩胺酸合成而言為營養缺陷之細菌用包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型，且營養缺陷型細菌將在無D-麩胺酸存在下生長，而未使用質體轉型或不表現編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質的質體之營養缺陷型細菌將不生長。在另一個具體例中，當經轉型且表現本文所揭示之質體時，若質體包含編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶的經分離核酸，則對於D-丙胺酸合成而言為營養缺陷之細菌將在無D-丙胺酸存在下生長。此類用於製備包含或缺乏必要生長因子、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物的適當培養基之方法為此項技術中所熟知，且可購得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。

在另一個具體例中，一旦已基於適當培養基選擇包含本文所揭示之質體的營養缺陷型細菌，則細菌在選擇性壓力存在下繁殖。此類繁殖包含在無營養缺陷型因子之培養基中生長細菌。營養缺陷型細菌中表現胺基酸代謝酶之質體的存在確保質體將與細菌一起複製，因此持續選擇含有質體之細菌。熟練技術人員根據本文之本發明揭示內容及方法將能夠容易地藉由調整生長有包含質體之營養缺陷型細菌的培養基體積來按比例擴大重組李斯特菌屬屬菌株的產量。

熟練技術人員應瞭解，在另一個具體例中，其他營養缺陷型菌株及互補系統用於與本文所揭示之方法及組成物一起使用。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株表現重組多肽。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬菌株包含編碼重組多肽之質體。在另一個具體例中，本文所揭示之重組核酸在本文提供之重組李斯特菌屬菌株中的質體中。在另一個具體例中，質體為未整合至重組李斯特菌屬菌株之染色體中的游離型質體。在另一個具體例中，質體為整合至李斯特菌屬菌株之染色體中的整合性質體。在另一個具體例中，質體為多複本質體。

在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含編碼包含腫瘤相關抗原之融合蛋白的核酸分子。在一個具體例中，腫瘤相關抗原包含存活素多肽或其片段。在另一個具體例中，存活素多肽包含人類存活素。在另一個具體例中，存活素多肽為人類存活素。在另一個具體例中，存活素多肽包含小鼠存活素。在一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株包含編碼包含存活素蛋白質或其片段之融合蛋白的核酸分子。在另一個具體例中，存活素或其抗原部分包含腫瘤特異性抗原。

在一個具體例中，人類存活素蛋白質包含如SEQ ID NO：17中所闡述之胺基序列GAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACAPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：17之同源物。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：17之變異體。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：17之片段。

在一個具體例中，小鼠存活素蛋白質包含如SEQ ID NO：18中所闡述之胺基序列MGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACAPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAA。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：18之同源物。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：17之變異體。在另一個具體例中，存活素蛋白質為SEQ ID No：18之片段。

在另一個具體例中，本文所揭示之存活素片段由約殘基1-25組成。在另一個具體例中，存活素片段由約殘基1-50組成。在另一個具體例中，存活素片段由約殘基1-75組成。在另一個具體例中，存活素片段由約殘基1-100組成。在另一個具體例中，存活素片段由約殘基1-125組成。在另一個具體例中，存活素片段由全長存活素組成。在另一個具體例中，存活素片段缺乏信號序列。

在另一個具體例中，本文所揭示之存活素片段含有對應於上述AA範圍中之一者的同源存活素蛋白質之殘基。在另一個具體例中，殘基數目無需與上文列舉之殘基數目精確對應；例如若同源存活素蛋白質相對於本文所用之存活素蛋白質具有插入或缺失，則殘基數目可據此調整。其他存活素片段為此項技術中已知。

在另一個具體例中，同源存活素具有與存活素序列(例如SEQ ID NO：17或SEQ ID No：18之一)超過70%之一致性。在另一個具體例中，同源存活素係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過 72%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過75%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過78%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過80%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過82%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過83%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過85%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過87%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過88%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過90%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過92%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過93%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過95%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過96%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過97%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過98%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一超過99%之一致性。在另一個具體例中，同源ActA係指與SEQ ID No：17或SEQ ID No：18之一為100%之一致性。

在一個具體例中，人類存活素蛋白質由具有序列SEQ ID NO：19之核苷酸分子編碼： (SEQ ID No：19；GenBank寄存編號CR541740)。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：19之同源物編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：19之變異體編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：19之異構體編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：19之片段編碼。

在另一個具體例中，人類存活素蛋白質為小鼠存活素蛋白質，其由具有序列SEQ ID NO：20之核苷酸分子編碼：。(SEQ ID NO：20；GenBank寄存編號NM_009689)。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：20之同源物編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：20之變異體編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：20之異構體編碼。在另一個具體例中，存活素蛋白質由SEQ ID NO：20之片段編碼。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的存活素蛋白質為人類存活素蛋白質(SEQ ID NO：19)。在另一個具體例中，存活素蛋白質為小鼠存活素蛋白質(SEQ ID NO：20)。在另一個具體例中，存活素蛋白質為大鼠存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為靈長類存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為犬存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為此項技術中已知的人類或其他動物物種之存活素蛋白質或其組合。在另一個具體例中，編碼犬存活素蛋白質之核酸序列闡述於SEQ ID NO：21中。 (SEQ ID NO：21)。在另一個具體例中，編碼犬存活素蛋白質之核酸闡述於GenBank寄存編號AB095108.1中。在另一個具體例中，編碼存活素蛋白質之核酸為SEQ ID NO：21之同源物。在另一個具體例中，核酸序列為SEQ ID NO：21之變異體。

在一個具體例中，編碼犬存活素蛋白質之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：22中：

在另一個具體例中，編碼犬存活素蛋白質之核酸闡述於GenBank寄存編號BAC22748.2中。在另一個具體例中，編碼存活素蛋白質之胺基酸序列為SEQ ID NO：22之同源物。在另一個具體例中，胺基酸序列為SEQ ID NO：22之變異體。

在一個具體例中，本文所揭示之存活素的胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列99%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列至少95%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列至少90%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列至少85%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列至少80%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與人類存活素胺基酸序列至少75%之一致性。

在一個具體例中，本文所揭示之存活素的胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列99%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列95%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列90%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列85%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列80%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與小鼠存活素胺基酸序列75%之一致性。

在一個具體例中，本文所揭示之存活素的胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列99%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列95%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列90%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列85%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列80%之一致性。在另一個具體例中，存活素之胺基酸序列具有與犬存活素胺基酸序列75%之一致性。

在另一個具體例中，本身為用於如本文所揭示之方法及組成物中存活素抗原之來源的存活素蛋白質為含有5個蛋白質之桿狀病毒IAP重複。在另一個具體例中，存活素蛋白質為API4蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為EPR-1蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為細胞凋亡抑制劑4蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為IAP4蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為存活素變異體3α。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的存活素嵌合蛋白質或其片段不包括其信號序列。在另一個具體例中，省略信號序列使得存活素片段能夠成功地李斯特菌中分泌。

在一個具體例中，編碼本文所揭示之重組多肽的核酸亦編碼信號肽或序列。在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的融合蛋白包含LLO信號序列。在一個具體例中，異源抗原可經由使用信號序列來在李斯特菌中表現，該信號序列諸如李斯特菌屬信號序列，例如溶血素信號序列或ActA信號序列。或者，例如，外源基因可在單核球增多性李斯特菌啟動子下游表現而不產生融合蛋白。在另一個具體例中，信號肽為細菌(李斯特菌屬1或非李斯特菌屬)。在一個具體例中，信號肽為細菌原生。在另一個具體例中，信號肽非細菌原有。在另一個具體例中，信號肽為來自單核球增多性李斯特菌之信號肽，諸如secA1信號肽。在另一個具體例中，信號肽為來自雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)之Usp45信號肽或來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)之保護性抗原信號肽。在另一個具體例中，信號肽為secA2 信號肽，注入來自單核球增多性李斯特菌之p60信號肽。另外，重組核酸分子視情況包含編碼p60之第三聚核苷酸序列或其片段。在另一個具體例中，信號肽為Tat信號肽，諸如枯草桿菌Tat信號肽(例如PhoD)。在一個具體例中，信號肽在編碼重組多肽之相同轉譯閱讀框架中。

在另一個具體例中，存活素蛋白質為剪接變異體1存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為剪接變異體2存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為剪接變異體3存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體1存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體2存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體3存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體4存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體5存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體6存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為轉錄變異體7存活素蛋白質。

在另一個具體例中，本身為如本文所揭示之方法及組成物之存活素肽來源的存活素蛋白質為人類存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為靈長類存活素蛋白質。在另一個具體例中，存活素蛋白質為犬存活素蛋白質。其他物種之存活素蛋白質為此項技術中已知。

熟練技術人員應瞭解，術語「同源物」可涵蓋與特定核酸或胺基酸序列共有一定百分比之序列一致性的核酸或胺基酸序列。在一個具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為特定LLO序列或其N端片段之同源物。在另一個具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為抗原多肽之同源物，在一個具體例中，該抗原多肽為存活素或其功能片段。在一個具體例中，本文所揭示的多肽之同系物及在一個具體例中，編碼此類同系物之核酸維持親本多肽之功能特徵。舉例而言，在一個具體例中，本文所揭示的抗原多肽之同源物維持親本多肽之抗原特徵。在另一個具體例中，適用於如本文所揭示之組成物及方法中的序列可為本文所描述之任何序列的同源物。在一個具體例中，同源物與特定序列共有至少70%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少72%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少75%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少78%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少80%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少82%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少83%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少85%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少87%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少88%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少90%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少90.5%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少91%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少92%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少93%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少95%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少96%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少97%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少98%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有至少 99%一致性。在另一個具體例中，同源物與特定序列共有100%一致性。

熟練技術人員應瞭解，術語「抗原多肽」可涵蓋如上文所描述的非宿主原有且當存在於宿主中或(在一些具體例中)由宿主偵測到時引起免疫反應建立的多肽、肽或重組肽。

在一個具體例中，「抗原多肽」可涵蓋如本文所描述的在存在於個體細胞中之I類及/或II類MHC分子上加工及呈現，從而當存在於宿主中或(在一些具體例中)由宿主偵測到時引起免疫反應建立的多肽、肽、重組多肽或重組肽。在一個具體例中，抗原可非宿主所原有。在另一個具體例中，抗原可存在於宿主中，但宿主因為免疫耐受性而不會引起對其之免疫反應。

在一個具體例中，應理解，本文所揭示及/或本文所描述之序列中之任一者的同源物視為由本發明涵蓋。

在另一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的重組李斯特菌屬菌株包含可操作地整合至李斯特菌屬基因組中作為具有內源性ActA序列之開讀框的核酸分子。在另一個具體例中，如本文所揭示之方法及組成物的重組李斯特菌屬菌株包含游離型表現載體，該游離型表現載體包含編碼包含抗原與ActA或截短ActA融合之融合蛋白的核酸分子。在一個具體例中，抗原在actA啟動子及ActA信號序列控制下表現及分泌且其表現為與ActA(截短ActA或tActA)之1-233個胺基酸的融合物。在另一個具體例中，截短ActA由如美國專利第7,655,238號中所述的野生型ActA蛋白之前390個胺基酸組成，該案以全文引用的方式併入本文中。在另一個具體例中，截短ActA為ActA-N100或其經修飾型式(稱為ActA-N100*)，其中PEST基元已缺失且含有非保守QDNKR取代，如美國專利公開案第2014/0186387號中所描述。

在一個具體例中，減毒之營養缺陷型李斯特菌屬疫苗菌株係基於李斯特菌屬疫苗載體，其由於缺失致病性基因actA而減毒且藉由互補dal基因而保留用於活體內及活體外存活素表現之質體。在一個具體例中，李斯特菌屬菌株表現及分泌與李斯特菌溶胞素O(LLO)之前441個胺基酸融合的存活素蛋白質。在另一個具體例中，李斯特菌為在dal、dat及actA內源性基因中具有突變之dal/dat/actA李斯特菌。在另一個具體例中，突變為突變基因之缺失、截短或不活化。在另一個具體例中，融合蛋白LLO-存活素自本文所揭示的在活體內繼代後表現存活素抗原/LLO融合蛋白之減毒營養缺陷型菌株的表現及分泌與Lm-LLO-存活素在TCA沈澱之細胞培養物上清液中活體外生長8小時後相當。

在另一個具體例中，dal/dat/actA突變體李斯特菌屬菌株高度減毒且具有比先前李斯特菌屬疫苗世代更佳之安全型態，因為其自經免疫接種之小鼠之脾臟更快速清除。在另一個具體例中，與基於更具致病性之抗生素抗性菌株的李斯特菌屬疫苗相比，dal/dat/actA突變體李斯特菌屬菌株使得轉殖基因動物中腫瘤發作延遲更長時間(參見美國公開案第2011/0142791號，其以全文引用的方式併入本文中)。在另一個具體例中，dal/dat/actA突變體李斯特菌屬菌株引起腫瘤內T調節性細胞(Tregs)顯著減少。在另一個具體例中，用LmddA疫苗處理之腫瘤中更低頻率之Tregs導致瘤內CD8/Tregs比率增加，表明用LmddA疫苗免疫接種後可獲得更有利之腫瘤微環境。

在另一個具體例中，術語「LmddA」、「Lm△ddA」或dal/dat/actA突變體李斯特菌屬在本文中可互換地使用。

在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其包含與存活素蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白質的N端片段。在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其由與存活素蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白質的N端片段組成。

在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其包含與存活素蛋白質融合或與其片段融合之ActA蛋白質的N端片段。在另一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其由與存活素蛋白質融合或與其片段融合之ActA蛋白質的N端片段組成。

在一個具體例中，含PEST之多肽或肽及存活素抗原或其免疫原性片段直接彼此融合。在另一個具體例中，編碼含PEST之多肽或肽及存活素抗原或其免疫原性片段的基因直接彼此融合。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽及存活素抗原或其免疫原性片段經由連接肽可操作地連接。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽及存活素抗原或其免疫原性片段經由異源肽連接。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽N端連至存活素抗原或其免疫原性片段。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽單獨，亦即以未融合形式表現及使用。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽為融合蛋白之最N端部分。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽為N端LLO蛋白質片段。在另一個具體例中，截短LLO在C端截短以獲得N端LLO。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽為tLLO。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽為ActA多肽或其片段。在另一個具體例中，含PEST之多肽或肽為ActA之N端片段。在另一個具體例中，含PEST之胺基酸序列為PEST肽。

在一個具體例中，本發明提供一種重組多肽，其包含與 PEST胺基酸序列融合之存活素或其片段。在另一個具體例中，重組多肽包含與1-2個PEST胺基酸序列融合之存活素或其片段。在另一個具體例中，重組多肽包含與2-3個PEST胺基酸序列融合之存活素或其片段。在另一個具體例中，重組多肽包含與3-4個PEST胺基酸序列融合之存活素或其片段。

熟練技術人員應瞭解，在另一個具體例中，術語「多肽」、「肽」及「重組肽」可涵蓋任何長度之肽或多肽。在另一個具體例中，如本文所揭示之之肽或重組肽具有上文對HMW-MAA片段所列舉的長度中之一者。

在一個具體例中，術語「肽」係指原生肽(降解產物、以合成方式合成之肽或重組肽)及/或肽模擬物(通常為以合成方式合成之肽)，諸如本身為肽類似物之類肽及半類肽，舉例而言，其可具有使該等肽在身體中更穩定或更能滲透至細胞中的修飾。此類修飾包含(但不限於)N端修飾、C端修飾、肽鍵修飾(包括(但不限於)CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、主鏈修飾以及殘基修飾。用於製備肽模擬化合物之方法為在此項技術中所熟知，且例如說明於Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992)中，其以引用的方式併入，如同本文充分闡述一般。在此方面之其他細節在下文提供。

肽內之肽鍵(-CO-NH-)可例如由以下各者取代：N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)；酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)；酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)；*-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R為任何烷基，例如甲基；碳雜鍵(carba bond)(-CH2-NH-)；羥基伸乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)；硫代醯胺鍵(-CS-NH-)；烯烴雙鍵(-CH=CH-)；逆醯胺鍵(-NH-CO-)；肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R為碳原子上天然呈現之「正常」側鏈。

此等修飾可出現在沿肽鏈之任何鍵處，且甚至可同時出現在數個(2-3)鍵處。天然芳族胺基酸Trp、Tyr及Phe可取代為合成非天然酸，諸如TIC、萘基丙胺酸(Nol)、Phe之環甲基化衍生物、Phe之鹵化衍生物或對甲基-Tyr。

除以上之外，本文所揭示之肽亦可包括一或多個經修飾之胺基酸或一或多個非胺基酸單體(例如脂肪酸、複雜碳水化合物等)。

在一個具體例中，本文中列出之任何胺基酸序列的蛋白質及/或肽同源性藉由此項技術中充分描述之方法，包括免疫墨點分析確定，或經由胺基酸序列之電腦算法分析，利用可獲得之許多軟體套件中之任一者，經由已確立方法來確定。此等套件中之一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps套件，且可採用例如史密斯(Smith)及沃特曼(Waterman)算法，及/或全局/局部或BLOCKS比對用於分析。

在另一個具體例中，本文所揭示之構築體或核酸分子使用同源重組整合至李斯特菌屬染色體中。用於同源重組之技術為此項技術中所熟知且描述於例如Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeriamonocytogenespartial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2)：11-7)；及Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1)：19-24)中。在另一個具體例中，同源重組如美國專利第6,855,320號中所述進行。在另一個具體例中，溫度敏感性質體用於選擇重組體。

熟練技術人員應瞭解，術語「重組位點」或「定點重組位點」可涵蓋核酸分子中由介導側接重組位點之核酸區段之交換或切除的重組酶識別(在一些情況下，與相關蛋白質一起)的鹼基序列。重組酶及相關蛋白質統稱為「重組蛋白」，參見例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics & Development)3：699-707；1993。

在另一個具體例中，本文所揭示之構築體或核酸分子使用轉座子插入整合至李斯特菌屬染色體中。用於轉座子插入之技術為此項技術中所熟知且在DP-L967之構築中尤其由Sun等人(Infection and Immunity 1990,58：3770-3778)描述。在另一個具體例中，轉座子突變誘發具有可形成穩定之基因組插入突變體的優點，但具有異源基因插入其中之基因組中的位置未知的缺點。

在另一個具體例中，構築體或核酸分子使用噬菌體整合位點整合至李斯特菌屬染色體中(Lauer P,Chow MY等人，Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15)：4177-86)。在此方法之某些具體例中，細菌噬菌體(例如U153或PSA李斯特菌噬菌體)之整合酶基因及連接位點用於將異源基因插入至相應連接位點，該位點可為基因組中之任何適當位點(例如arg tRNA基因之comK或3'端)。在另一個具體例中，內源性原噬菌體在整合構築體或異源基因之前自所利用的連接位點固化。在另一個具體例中，此方法產生單複本整合體。在另一個具體例中，本發明進一步包含用於臨床應用之以噬菌體為主之染色體整合系統，其中可使用對於必需酶而言為營養缺陷型之宿主菌株(包括(但不限於)d-丙胺酸消旋酶)，例如Lm dal(-)dat(-)。在另一個具體例中，為避免「噬菌體固化步驟」，使用基於PSA之噬菌體整合系統(Lauer等人，2002 J Bacteriol,184：4177-4186)。在另一個具體例中，此需要藉由抗生素連續選擇以維持整合基因。因此，在另一個具體例中，本發明能夠不需要使用抗生素選擇即形成以噬菌體為主之染色體整合系統。實際上，可與營養缺陷型宿主菌株互補。

熟練技術人員應瞭解，「噬菌體表現載體」或「噬菌粒」可涵蓋任何基於噬菌體之重組表現系統，其用於以下目的：在任何細胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)中活體外或活體內組成性或誘導性表現如本文所揭示之方法及組成物的核酸序列。噬菌體表現載體通常可在細菌細胞中再生且在適當條件下產生噬菌體粒子。該術語包括線性或圓形表現系統且涵蓋保持游離型或整合至宿主細胞基因組中的兩種基於噬菌體之表現載體。

在另一個具體例中，結合用於將遺傳物質及/或質體引入細菌中。用於結合之方法為此項技術中所熟知且描述於例如Nikodinovic J等人(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3)：223-7)及Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35)：12554-9)中。

抗生素抗性基因用於分子生物學及疫苗製備中通常採用之習知選擇及選殖過程。本發明中涵蓋之抗生素抗性基因包括(但不限於)賦予對安比西林(ampicillin)、青黴素(penicillin)、二甲氧苯青黴素(methicillin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、康黴素 (kanamycin)、四環素(tetracycline)、氯黴素(cloramphenicol，CAT)、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、慶大黴素(gentamicin)之抗性的基因產物及此項技術中熟知之其他基因產物。

適用於本發明中之質體及其他表現載體描述於本文其他地方，且可包括諸如以下各者之特徵：啟動子/調節序列、用於革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌之複製起點、編碼融合蛋白之經分離核酸及編碼胺基酸代謝基因之經分離核酸。此外，編碼融合蛋白及胺基酸代謝基因之經分離核酸將具有適合於驅動此類經分離核酸之表現的啟動子。適用於驅動細菌系統中表現之啟動子為此項技術中所熟知，且包括噬菌體λ、pBR322之β-內醯胺酶基因的bla啟動子及pBR325之氯黴素乙醯基轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子之其他實例包括5噬菌體λ之主要右及左啟動子(PL及PR)；大腸桿菌之trp、recA、lacZ、lad及gal啟動子；α-澱粉酶(Ulmanen等人，1985.J.Bacteriol.162：176-182)及枯草桿菌(B.subtilis)之S28特異性啟動子(Gilman等人，1984 Gene 32：11-20)；芽孢桿菌屬之噬菌體的啟動子(Gryczan,1982,在：The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York中)及鏈黴菌啟動子(Ward等人，1986,Mol.Gen.Genet.203：468-478)。本發明中涵蓋之其他原核啟動子綜述於例如Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1：277-282)；Cenatiempo,(1986,Biochimie,68：505-516)；及Gottesman,(1984,Ann.Rev.Genet.18：415-442)中。本發明中涵蓋之啟動子/調節元件的其他實例包括(但不限於)李斯特菌屬prfA啟動子、李斯特菌屬hly啟動子、李斯特菌屬p60啟動子及李斯特菌屬actA啟動子(GenBank寄存編號NC_003210)或其片段。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的質體包含編碼融合蛋白之基因。在另一個具體例中，對子序列進行選殖，且適當子序列使用適當限制酶來裂解。在另一個具體例中，隨後將該等片段接合以產生所需DNA序列。在另一個具體例中，編碼抗原之DNA使用DNA擴增方法，例如如下文所論述之聚合酶鏈反應(PCR)來產生

在另一個具體例中，對編碼本文所揭示之融合蛋白或重組蛋白的DNA使用DNA擴增方法，諸如聚合酶鏈反應(PCR)進行選殖。因此，舉例而言，對用於非溶血性LLO之基因使用包含適合之限制位點的有義引子及包含另一個限制位點(例如促進選殖之不相同限制位點)的反義引子進行PCR擴增。對編碼抗原之經分離核酸重複相同過程。非溶血性LLO與抗原序列接合及插入至質體或載體中產生編碼接合於抗原一端之非溶血性LLO的載體。兩個分子直接接合或藉由限制位點引入之短間隔子接合。

包含存活素抗原或其免疫原性片段之融合蛋白可藉由任何適合之方法製備，包括例如適當序列之選殖及限制或直接化學合成。或者，可對子序列進行選殖，且適當子序列使用適當限制酶來裂解。片段可隨後經過接合以產生所需DNA序列。在一個具體例中，編碼抗原之DNA可使用DNA擴增方法，例如聚合酶鏈反應(PCR)來產生。首先，使原生DNA在新端任一側之區段單獨擴增。一個經過擴增之序列的5'端編碼肽連接子，而另一個經過擴增之序列的3'端亦編碼肽連接子。因為第一片段之5'端與第二片段之3'端互補，所以兩個片段(在部分純化之後，例如在LMP瓊脂糖上純化)可在第三PCR反應中用作重疊模板。經過擴增之序列將含有密碼子、開口位點羧基側之區段(現形成胺基序列)、連接子及開口位點胺基側之序列(現形成羧基序列)。將抗原接合至質體。

在另一個具體例中，將編碼融合或重組蛋白之核酸序列轉型至多種宿主細胞中，包括大腸桿菌；其他細菌宿主，諸如李斯特菌屬；酵母及各種高等真核細胞，諸如COS、CHO及HeLa細胞株及骨髓瘤細胞株。重組融合蛋白基因將可操作地連接於各宿主之適當表現控制序列。啟動子/調節序列詳細地描述於本文其他地方。在另一個具體例中，質體進一步包含其他啟動子調節元件以及核糖體結合位點及轉錄終止信號。對於真核細胞，控制序列將包括源自例如免疫球蛋白基因、SV40、細胞巨大病毒等之啟動子及強化子，及聚腺苷酸化序列。在另一個具體例中，序列包括剪接供體及受體序列。

「穩定維持」係指在不存在選擇(例如抗生素選擇)達10代的情況下維持核酸分子或質體而無可偵測之喪失。在另一個具體例中，週期為15代。在另一個具體例中，週期為20代。在另一個具體例中，週期為25代。在另一個具體例中，週期為30代。在另一個具體例中，週期為40代。在另一個具體例中，週期為50代。在另一個具體例中，週期為60代。在另一個具體例中，週期為80代。在另一個具體例中，週期為100代。在另一個具體例中，週期為150代。在另一個具體例中，週期為200代。在另一個具體例中，週期為300代。在另一個具體例中，週期為500代。在另一個具體例中，週期超過500代。在另一個具體例中，核酸分子或質體活體外穩定維持(例如在培養物中)。在另一個具體例中，核酸分子或質體活體內穩定維持。在另一個具體例中，核酸分子或質體活體外及活體內皆穩定維持。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的重組李斯特菌屬菌株為重組單核球增多性李斯特菌菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為重組斯氏李斯特菌Listeria seeligeri)菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為重組格氏李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為重組依氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為重組默氏李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為重組威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株為另一種李斯特菌屬物種之重組菌株。

在一個具體例中，減毒李斯特菌屬菌株，諸如Lm δ-actA突變體(Brundage等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90：11890-11894)、單核球增多性李斯特菌δ-plcA(Camilli等人，1991,J.Exp.Med.,173：751-754)或δ-actA、δ-inlB(Brockstedt等人，2004,PNAS,101：13832-13837)用於本發明中。在另一個具體例中，如一般技術者在配備有本文本發明時應理解的，減毒李斯特菌屬菌株藉由引入一或多個減毒用突變來構築。此類菌株之實例包括(但不限於)對於芳族胺基酸為營養缺陷型之李斯特菌屬菌株(Alexander等人，1993,Infection and Immunity 10 61：2245-2248)及用於形成脂磷壁酸之突變體(Abachin等人，2002,MoL.Microbiol.43：1-14)及藉由缺乏致病性基因而減毒之彼等菌株(參見本文實例)。

在另一個具體例中，本文所揭示之重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。在另一個具體例中，繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大。在另一個具體例中，繼代使李斯特菌屬菌株之免疫原性穩定。在另一個具體例中，繼代使李斯特菌屬菌株之致病性穩定。在另一個具體例中，繼代提高李斯特菌屬菌株之免疫原性。在另一個具體例中，繼代提高李斯特菌屬菌株之致病性。在另一個具體例中，繼代移除李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株。在另一個具體例中，繼代降低李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株的發生率。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株含有編碼含有抗原之重組肽的基因的染色體組插入。在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株攜帶包含編碼含有抗原之重組肽的基因的質體。在另一個具體例中，如本文所述進行繼代。在另一個具體例中，繼代藉由此項技術中已知之其他方法進行。

在另一個具體例中，本文所揭示之重組核酸可操作地連接於驅動李斯特菌屬菌株中的經過編碼之肽表現的啟動子/調節序列。適用於驅動基因之組成性表現的啟動子/調節序列為此項技術中所熟知且包括(但不限於)例如李斯特菌之P_hlyA、P_ActA及p60啟動子、鏈球菌bac啟動子、灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)sgiA啟動子及蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)phaZ啟動子。

在另一個具體例中，編碼本文所揭示之肽的核酸之誘導型及組織特異性表現藉由將編碼肽之核酸置於誘導型或組織特異性啟動子/調節序列控制下來實現。適用於達成目的之組織特異性或誘導型啟動子/調節序列的實例包括(但不限於)MMTV LTR誘導型啟動子及SV40晚期強化子/啟動子。在另一個具體例中，使用回應於誘導劑(諸如金屬、糖皮質激素及其類似物)誘導之啟動子。因此，應瞭解本發明包括使用任何啟動子/調節序列，其已知或未知且能夠驅動與其可操作地連接之所要蛋白質的表現。

熟練技術人員應瞭解，術語「異源」涵蓋源自與參考物種不同之物種的核酸、胺基酸、肽、多肽或蛋白質。因此，例如，表現異源多肽之李斯特菌屬菌株在一個具體例中將表現並非李斯特菌屬菌株原生或內源之多肽，或在另一個具體例中，李斯特菌屬菌株通常不表現之多肽，或在另一個具體例中，來自除李斯特菌屬菌株之外的來源之多肽。在另一個具體例中，異源可用於描述某物源自同一物種內之不同生物。在另一個具體例中，異源抗原由李斯特菌之重組菌株表現，且當藉由重組菌株感染哺乳動物細胞時經加工及呈現至細胞毒性T細胞。在另一個具體例中，李斯特菌物種表現之異源抗原無需精確匹配腫瘤細胞或感染物中相應未經修飾之抗原或蛋白質，只要其產生識別哺乳動物中天然表現之未經修飾之抗原或蛋白質的T細胞反應即可。術語異源抗原可在本文中稱作「抗原多肽」、「異源蛋白」、「異源蛋白質抗原」、「蛋白質抗原」、「抗原」及其類似物。在一個具體例中，本文所揭示之異源抗原為存活素多肽或其抗原部分。

在一個具體例中，融合蛋白之兩個分子(舉例而言，LLO、ActA片段或PEST序列及抗原，例如存活素或其部分)直接接合。在另一個具體例中，兩個分子由短間隔子肽接合，該間隔子肽由一或多個胺基酸組成。在一個具體例中，除接合蛋白質或在其間保持一定最小距離或其他空間關係之外，間隔子不具有特定生物活性。在另一個具體例中，選擇間隔子之構成胺基酸以影響分子之某種特性，諸如摺疊、淨電荷或疏水性。在另一個具體例中，蛋白質之兩個分子(舉例而言，LLO片段及抗原)單獨合成或未融合。在另一個具體例中，蛋白質之兩個分子與同一核酸分開合成。在又另一個具體例中，兩個分子與單獨核酸分別地合成。

II. 組成物

在一個具體例中，本發明提供一種組成物，其包含免疫抑制信號傳導分子之拮抗劑。在一個具體例中，免疫抑制信號傳導分子介導腫瘤對宿主之免疫反應的抗性。在另一個具體例中，免疫抑制信號傳導分子包含CD28/CTLA-4受體超家族。在另一個具體例中，免疫抑制信號傳導分子包含B7受體家族。

在另一個具體例中，免疫抑制分子包含PD-1。在另一個具體例中，免疫抑制分子包含PD-L1。在另一個具體例中，免疫抑制分子包含PD-L2。在另一個具體例中，免疫抑制分子包含B7-1。

在又另一個具體例中，本文所揭示之拮抗劑為阻斷免疫抑制分子與此等分子之受體相互相用的任何化合物或生物學分子。在一個具體例中，拮抗劑為小分子。在另一個具體例中，拮抗劑為抗體。在另一個具體例中，拮抗劑為單株抗體(mAb)。在另一個具體例中，拮抗劑為多株抗體。在又另一個具體例中，拮抗劑為抗原結合抗體片段。因此，在一個具體例中，本文所揭示之組成物包含拮抗劑抗體。

熟練技術人員應瞭解，術語「抗體」可涵蓋展現所需生物學或結合活性的任何形式之免疫球蛋白分子。因此，其以最廣泛意義使用且特定地涵蓋(但不限於)單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類化、全人類抗體、嵌合抗體及駱駝化單結構域抗體。「親本抗體」為藉由使免疫系統暴露於抗原所獲得之抗體，接著針對預期用途修飾該等抗體，諸如進行抗體之人類化以用作人類治療劑。在一個具體例中，術語「抗體」不僅涵蓋完整多株或單株抗體，且除非另外說明，否則亦涵蓋其中與完整抗體競爭進行特異性結合之任何抗原結合部分、包含抗原結合部分之融合蛋白、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之結構(configuration)。抗原結合部分包括例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、結構域抗體(dAb，例如鯊魚及駱駝抗體)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈可變片段抗體(scFv)、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv，及含有免疫球蛋白中足以賦予與多肽之特異性抗原結合之至少一部分的多肽。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且該抗體不必為任何特定類別。免疫球蛋白可視其重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列而歸為不同類別。存在五個主要免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之數者可進一步分成子類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白的子單元結構及三維結構(configuration)為人所熟知。

熟練技術人員應瞭解，術語「抗體片段」或「抗原結合片段」可涵蓋抗體之抗原結合片段，亦即保留特異性地結合於與全長抗體結合之抗原之能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區之片段。抗體結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；奈米抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。

熟練技術人員應瞭解，術語「CDR」可涵蓋免疫球蛋白可變區中之互補決定區，除非另有指示，否則其使用Kabat編號系統來界定。

如本文所用之「Kabat」意謂由Elvin A.Kabat開創之免疫球蛋白比對及編號系統((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)。

熟練技術人員應瞭解，術語「單株抗體」或「mAb」或「Mab」可涵蓋實質上均質抗體之群體，亦即，除可少量存在的可能天然存在之突變以外，構成群體之抗體分子在胺基酸序列中一致。相比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括在其可變結構域、尤其在其CDR中具有不同胺基酸序列之眾多不同抗體，其通常對不同抗原決定基具有特異性。修飾物「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler等人(1975)Nature 256：495首先描述之融合瘤方法製造，或可藉由重組DNA方法製造(參見例如，美國專利第4,816,567號)。舉例而言，單株抗體亦可使用以下各者中所描述之技術自噬菌體抗體文庫分離：Clackson等人(1991)Nature 352：624-628及Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597。亦參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731.

在另一個具體例中，mAb可為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體，且可包括人類恆定區。在一些具體例中，人類恆定區係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恆定區組成之群，且在一些具體例中，人類恆定區為IgG1或IgG4恆定區。在一些具體例中，抗原結合片段係選自由Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、scFv及Fv片段組成之群。

熟練技術人員應瞭解，術語「嵌合抗體」可涵蓋以下抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種(例如人類)或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，同時鏈之其餘部分與源自另一物種(例如小鼠)或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，以及此類抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可。

熟練技術人員應瞭解，術語「人類抗體」可涵蓋僅包含人類免疫球蛋白蛋白質序列之抗體。若人類抗體產生於小鼠中、小鼠細胞中或源自小鼠細胞之融合瘤中，則該人類抗體可含有鼠類碳水化合物鏈。類似地，「小鼠抗體」或「大鼠抗體」分別係指僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列之抗體。

熟練技術人員應瞭解，術語「人類化抗體」可涵蓋含有來自非人類(例如鼠類)抗體以及人類抗體之序列的抗體形式。此類抗體含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。一般而言，人類化抗體將包含至少一個及通常兩個可變結構域中實質上全部，其中所有或實質上所有高變環與非人類免疫球蛋白之彼等區相對應且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等區。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常，人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。當有必要區分人類化抗體與親本嚙齒動物抗體時，抗體純系名稱中添加字首「hum」、「hu」或「h」。嚙齒動物抗體之人類化形式一般將包含親本嚙齒動物抗體之相同CDR序列，不過可包括某些胺基酸取代以提高親和力、增加人類化抗體之穩定性或為了其他原因。

在另一個具體例中，本文所揭示之免疫抑制拮抗劑分子包含PD-1拮抗劑。在另一個具體例中，PD-1拮抗劑與PD-1相互作用且阻斷在癌細胞上表現之人類PD-L1與在免疫細胞(T細胞、B細胞或NKT細胞)上表現之人類PD-1的結合，且較佳亦阻斷在癌細胞上表現之人類PD-L2與免疫細胞表現之PD-1的結合。PD-1之替代性名稱或同義語包括：PDCD1、PD1、CD279及SLEB2。例示性人類PD-1胺基酸序列可見於NCBI基因座編號：NP_005009中。

結合於人類PD-1且適用於本發明之治療方法、藥劑及用途中的mAb之實例描述於US7488802、US7521051、US8008449、US8354509、US8168757、WO2004/004771、WO2004/072286、 WO2004/056875及US2011/0271358中。在本文所揭示之治療方法、藥劑及用途中適用作PD-1拮抗劑的特異性抗人類PD-1mAb包括：納武單抗(nivolumab)(BMS-936558)，具有WHO Drug Information，第27卷，第1期，第68-69頁(2013)中所描述之結構且包含圖7中所示之重鏈及輕鏈胺基酸序列的人類IgG4 mAb；人類化抗體h409A11、h409A16及h409A17，其描述於WO2008/156712中；及AMP-514，其由MedImmune研發。

在另一個具體例中，本文所揭示之免疫抑制拮抗劑分子包含PD-L1拮抗劑。在另一個具體例中，PD-L1拮抗劑與PD-L1相互作用，且阻斷在免疫細胞(T細胞、B細胞或NKT細胞)上表現之人類PD-1與在癌細胞上表現之人類PD-L1的結合。PD-L1之替代性名稱或同義語包括：PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274及B7-H。例示性人類PD-L1胺基酸序列可見於NCBI基因座編號：NP_054862中。

結合於人類PD-1且適用於本發明之治療方法、藥劑及用途中的mAb之實例描述於WO2013/019906、W02010/077634 A1及US8383796中。

熟練技術人員應瞭解，術語「可變區」或「V區」可涵蓋IgG鏈中序列在不同抗體之間可變的區段。其延伸至輕鏈中之Kabat殘基109及重鏈中之Kabat殘基113。抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式的抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。通常，重鏈及輕鏈之可變區包含三個高變區，亦稱為互補決定區(CDR)，其位於相對保守構架區(FR)內。該等CDR通常藉由該等構架區比對，使得能夠結合於特異性抗原決定基。一般而言，自N端至C端，輕鏈及重鏈可變結構域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。將胺基酸歸入各結構域一般根據以下各者之定義進行：Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH出版物編號91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883。

熟練技術人員應瞭解，術語「高變區」可涵蓋抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」(亦即輕鏈可變結構域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3，及重鏈可變結構域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)之胺基酸殘基。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(由序列界定抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(由結構界定抗體之CDR區)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除在本文中定義為CDR殘基之高變區殘基以外的可變結構域殘基。

熟練技術人員應瞭解，術語「構架區」或「FR」可涵蓋不包括CDR區之免疫球蛋白可變區。

在另一個具體例中，拮抗劑包含PD-L2拮抗劑。在另一個具體例中，PD-L2拮抗劑與PD-L2相互作用，且阻斷在免疫細胞(T細胞、B細胞或NKT細胞)上表現之人類PD-1與在癌細胞上表現之人類PD-L2的結合。PD-L2之替代性名稱或同義語包括：PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc及CD273。例示性人類PD-L2胺基酸序列可見於NCBI基因座編號：NP_079515中。

在另一個具體例中，拮抗劑包含B7-1拮抗劑。

適用於本文所揭示之治療方法、藥劑及用途中之任一者中的其他PD-1拮抗劑包括特異性結合於人類PD-1或人類PD-L1之免疫黏附素，例如含有PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分與恆定區(諸如免疫球蛋白分子之Fc區)融合的融合蛋白。特異性結合於PD-1之免疫黏附分子的實例描述於WO2010/027827及WO2011/066342中。在本文所揭示之治療方法、藥劑及用途中適用作PD-1拮抗劑的特定融合蛋白包括AMP-224(亦稱為B7-DCIg)，其為PD-L2-FC融合蛋白且結合於人類PD-1。在另一個具體例中，其他PD-1/PD-L1結合拮抗劑包括阻斷PD-1及其配位體之關鍵性結合或信號傳導或在此結合之後向效應細胞之信號傳導或與其競爭的小分子或生物分子。

熟練技術人員應瞭解，「特異性結合於」指定標靶蛋白之抗體可涵蓋展現相比於其他蛋白質優先結合於該標靶之抗體，但此特異性不需要絕對結合特異性。若抗體之結合決定樣本中標靶蛋白之存在，例如不產生非所需結果(諸如假陽性結果)，則該抗體視為對其預期標靶具「特異性」。適用於本發明之抗體或其結合片段將以與非標靶蛋白之親和力的至少2倍大、較佳地至少10倍大、更佳地至少20倍大且最佳地至少100倍大之親和力結合於標靶蛋白。在一個具體例中，若抗體結合於包含既定胺基酸序列(例如成熟人類PD-1、人類PD-L1、人類PD-L2或人類B7-1分子之胺基酸序列)之多肽但不結合於缺乏該序列之蛋白質，則其稱為特異性地結合於包含該序列之多肽。

在本發明之治療方法、藥劑及用途的一些具體例中，PD-1拮抗劑為單株抗體或其抗原結合片段。

在本發明之治療方法、藥劑及用途的其他具體例中，PD-1拮抗劑為單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於人類PD-1且包含(a)重鏈可變區及(b)輕鏈可變區。

在本發明之治療方法、藥劑及用途的另一個具體例中，PD-1拮抗劑為特異性結合於人類PD-1之單株抗體。

在本文所揭示之治療方法、藥劑及用途的又另一個具體例中，PD-1拮抗劑為特異性結合於人類PD-1之單株抗體。

如本文所用之「PD-L1」或「PD-L2」表現意謂細胞表面上之指定PD-L蛋白或細胞或組織內之指定PD-L mRNA的任何可偵測表現量。PD-L蛋白表現可用診斷性PD-L抗體在腫瘤組織切片之IHC分析中或藉由流動式細胞量測術偵測。或者，腫瘤細胞之PD-L蛋白表現可藉由PET成像使用特異性結合於所需PD-L標靶(例如PD-L1或PD-L2)之結合劑(例如抗體片段、抗體及其類似物)來偵測。用於偵測及量測PD-L mRNA表現之技術包括RT-PCR及即時定量RT-PCR。

已描述數種用於在腫瘤組織切片之IHC分析中量化PD-L1蛋白質表現之方法。參見例如Thompson,R.H.等人，PNAS 101(49)；17174-17179(2004)；Thompson,R.H.等人，Cancer Res. 66：3381-3385(2006)；Gadiot,J.等人，Cancer 117：2192-2201(2011)；Taube,J.M.等人，Sci Transl Med 4,127ra37(2012)；及Toplian,S.L.等人，New Eng.J Med. 366(26)：2443-2454(2012)。

一種方法採用關於PD-L1表現呈陽性或陰性之簡單二元端點，其中陽性結果關於展現細胞-表面膜染色之組織學跡象之腫瘤細胞的百分比定義。若在至少1%且較佳5%之總腫瘤細胞中觀測到IHC染色，則腫瘤組織切片視為關於PD-L1表現呈陽性。在一個具體例中，若胰臟腫瘤樣本中1%至49%之總腫瘤細胞展現膜染色，則該樣本指定為具有弱PD-L1表現，且若樣本中至少50%之腫瘤細胞展現膜染色，則其指定為具有強PD-L1表現，在各情況下皆如藉由IHC分析使用WO2014/100079中所描述之抗體22C3所測定。

在另一種方法中，腫瘤組織切片中之PD-L1表現在腫瘤細胞中以及在浸潤性免疫細胞中量化，該等細胞主要包含淋巴球。展現膜染色之腫瘤細胞及浸潤性免疫細胞之百分比分別量化為<5%、5%至9%，且隨後以10%增量直至100%。關於腫瘤細胞，若記分為<5%記分，則PD-L1表現視為陰性，且若記分為5%，則PD-L1表現視為陽性。免疫浸潤中之PD-L1表現報導為半定量量測值，稱為經調節之發炎記分(AIS)，其藉由膜染色細胞之百分比乘以浸潤之強度來測定，浸潤之強度分級為無(0)、輕度(記分1，罕有淋巴球)、中等(記分2，由淋巴組織細胞集合體局部浸潤腫瘤)或嚴重(記分3，擴散浸潤)。若AIS為5，則藉由免疫浸潤將腫瘤組織切片視為關於PD-L1表現呈陽性。

PD-L mRNA表現量可與頻繁地用於定量RT-PCR之一或多種參考基因(諸如泛素C)之mRNA表現量相比。

在一些具體例中，基於與適當對照之PD-L1表現量(蛋白及/或mRNA)相比，腫瘤內惡性細胞及/或浸潤性免疫細胞之PD-L1表現量(蛋白及/或mRNA)測定為「過度表現」或「升高」。舉例而言，對照PD-L1蛋白質或mRNA表現量可為在相同類型之非惡性細胞中或在來自匹配正常組織之切片中量化之量。在一些具體例中，若樣本中之PD-L1蛋白質(及/或PD-L1 mRNA)比對照中高至少10%、20%或30%，則腫瘤樣本中之PD-L1表現測定為升高。

在一個具體例中，本文揭示一種組成物，其包含融合多肽，其中該融合多肽包含與額外多肽融合之存活素抗原或其免疫原性片段，且該組成物進一步包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且其中向患有存活素表現性癌症之個體投與該組成物治療癌症、改善癌症或誘導其消退。在另一個具體例中，本文揭示一種醫藥組成物，其包含編碼融合多肽之核酸，其中該融合多肽包含與額外多肽融合之存活素抗原或其免疫原性片段，且該醫藥組成物進一步包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑。在另一個具體例中，本文揭示一種醫藥組成物，其包含有包含編碼融合多肽之核酸的重組李斯特菌屬疫苗菌株，其中該融合多肽包含與額外多肽融合之存活素抗原或其免疫原性片段，該組成物進一步包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑。在另一個具體例中，額外多肽為含PEST之肽或多肽。在另一個具體例中，額外多肽為其N端李斯特菌溶胞素O(LLO)片段。在另一個具體例中，額外多肽為其N端ActA片段。在另一個具體例中，額外多肽為含PEST之胺基酸序列。

熟練技術人員應瞭解，術語「投與」及「治療」在其應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時可涵蓋使外源性醫藥、治療劑、診斷劑或組成物接觸動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體。細胞處理涵蓋使試劑接觸細胞，以及使試劑接觸流體，其中該流體與細胞接觸。「投與」及「治療」亦可涵蓋對例如一種細胞用試劑、診斷劑、結合化合物或用另一種細胞活體外及離體進行處理。術語「個體」包括任何生物體，較佳為動物，更佳為哺乳動物(例如大鼠、小鼠、犬、貓、家兔)且最佳為人類。

熟練技術人員應瞭解，術語「醫藥組成物」可涵蓋治療有效量的包含李斯特菌屬菌株、免疫抑制分子拮抗劑或兩者之一或多種活性成分以及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。

熟練技術人員應瞭解，關於腫瘤治療之術語「治療有效量」可涵蓋能夠引起以下作用中之一或多者的量：(1)在一定程度上抑制腫瘤生長，包括減緩及完全生長遏制；(2)減少腫瘤細胞數目；(3)減小腫瘤大小；(4)抑制(亦即減少、減緩或完全遏止)腫瘤細胞浸潤至周邊器官中；(5)抑制(亦即減少、減緩或完全遏止)癌轉移；(6)增強抗腫瘤免疫反應，其可(但不一定)導致腫瘤消退或排斥反應；及/或(7)在一定程度上緩解一或多種與病症相關之症狀。本文所揭示之疫苗出於治療腫瘤之目的之「治療有效量」可憑經驗及以常規方式確定。

熟練技術人員應瞭解，術語「免疫原性組成物」、「組成物」及「醫藥組成物」可互換地使用。亦應理解，如本文進一步提供，此類組成物之投與增強免疫反應，或提高T效應細胞與調節性T細胞比率或引起抗腫瘤免疫反應。

在另一個具體例中，本文所揭示之抗腫瘤組成物的核酸分子進一步包含編碼代謝酶之第二開讀框，其中該代謝酶與重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。

在另一個具體例中，由本文所揭示之方法及組成物引起的免疫反應包含針對抗原之至少一個亞優勢(subdominant)抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中，免疫反應不包含針對亞優勢抗原決定基之免疫反應。在另一個具體例中，免疫反應主要由針對至少一個亞優勢抗原決定基之免疫反應組成。在另一個具體例中，免疫反應僅有的可測量組分為針對至少一個亞優勢抗原決定基之免疫反應。在又另一個具體例中，針對存活素表現性癌症之免疫反應包含針對存活素蛋白質之至少一個優勢抗原決定基的免疫反應。

在一個具體例中，本文所揭示之組成物包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含有包含核酸分子之重組李斯特菌屬菌株，其中該核酸分子包含編碼多肽之第一開讀框，其中該多肽包含與異源抗原融合的含PEST之肽或多肽，其中該含PEST之肽或多肽包含李斯特菌溶胞素O(LLO)之N端片段、ActA之N端片段或含PEST之胺基酸序列，且其中該異源抗原包含存活素抗原或其免疫原性片段。

在另一個具體例中，本文所揭示之組成物的投與增加抗原特異性T細胞之數目。在另一個具體例中，組成物之投與活化T細胞上的協同刺激受體。在另一個具體例中，組成物之投與誘導記憶及/或效應T細胞之增殖。在另一個具體例中，組成物之投與提高T細胞之增殖。在另一個具體例中，本文所揭示之組成物的投與使腫瘤免疫抑制信號傳導無效。在另一個具體例中，組成物之投與遏制PD-1介導之免疫抑制信號傳導。在另一個具體例中，組成物之投與對抗腫瘤介導的T細胞活化之減弱。在另一個具體例中，組成物之投與抵消腫瘤之免疫監督逃避機制。

在另一個具體例中，本文所揭示之組成物的投與增加活性抗原特異性T細胞之數目。在另一個具體例中，組成物之投與增強T細胞上協同刺激受體之活化。在另一個具體例中，組成物之投與誘導記憶及/或效應T細胞之增殖。在另一個具體例中，組成物之投與提高T細胞之增殖。

本文所揭示之組成物可用於本文所揭示之方法中以在個體中引起增強之抗腫瘤T細胞反應，以在個體中抑制腫瘤介導之免疫抑制，或提高個體脾臟及腫瘤中T效應細胞與調節性T細胞(T_regs)比率，或其任何組合。

在另一個具體例中，包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑及上文所描述之重組減毒李斯特菌屬菌株的組成物進一步包含佐劑。在另一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物中所用之佐劑為顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一個具體例中，佐劑包含GM-CSF蛋白質。在另一個具體例中，佐劑為編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一個具體例中，佐劑包含編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一個具體例中，佐劑為皂素QS21。在另一個具體例中，佐劑包含皂素QS21。在另一個具體例中，佐劑為單磷醯基脂質A。在另一個具體例中，佐劑包含單磷醯基脂質A。在另一個具體例中，佐劑為SBAS2。在另一個具體例中，佐劑包含SBAS2。在另一個具體例中，佐劑為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一個具體例中，佐劑包含含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一個具體例中，佐劑為免疫刺激細胞激素。在另一個具體例中，佐劑包含免疫刺激細胞激素。在另一個具體例中，佐劑為編碼免疫刺激細胞激素的核苷酸分子。在另一個具體例中，佐劑包含編碼免疫刺激細胞激素的核苷酸分子。在另一個具體例中，佐劑為quill醣苷或包含quill醣苷。在另一個具體例中，佐劑為細菌有絲分裂原或包含細菌有絲分裂原。在另一個具體例中，佐劑為細菌毒素或包含細菌毒素。其他佐劑為此項技術中已知。

熟練技術人員應瞭解，術語「寡核苷酸」與術語「核酸」可互換，且可涵蓋可包括(但不限於)以下各者之分子：原核序列、真核mRNA、來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如哺乳動物)DNA之基因組DNA序列及甚至合成DNA序列。該術語可涵蓋包括DNA及RNA之任何已知鹼基類似物的序列。

在一個具體例中，本發明提供一種組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含表現抗原之重組李斯特菌屬菌株。在另一個具體例中，抗原為存活素或其抗原部分。在另一個具體例中，PD-1拮抗劑為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，PD-L1拮抗劑為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，PD-L2拮抗劑為抗PD-L2抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，B7-1拮抗劑為抗B7-1抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，本發明提供免疫原性組成物，其包含PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含本文提供之重組李斯特菌屬。在另一個具體例中，本發明提供醫藥組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含本文提供之重組李斯特菌屬。

在本發明之方法及組成物的另一個具體例中，融合蛋白包含存活素抗原或其免疫原性片段及額外多肽。在另一個具體例中，本文所揭示之額外多肽為N端李斯特菌溶胞素O(LLO)片段。在另一個具體例中，額外多肽為N端ActA片段。在另一個具體例中，額外多肽為含PEST之胺基酸序列。在一些具體例中，額外多肽或額外佐劑多肽以與LLO類似之方式加強抗原呈遞及免疫性。

在另一個具體例中，PD-L1拮抗劑為抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，PD-L2拮抗劑為抗PD-L2抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，B7-1拮抗劑為抗B7-1抗體或其抗原結合片段。在另一個具體例中，PD-1拮抗劑阻斷PD-1與其任何配位體之相互相用。在另一個具體例中，PD-1拮抗劑阻斷PD-1與PD-L1、PD-L2或其兩者之相互相用。在另一個具體例中，PD-L1拮抗劑阻斷PD-L1與PD-1、B7-1或其兩者之相互相用。在另一個具體例中，PD-L2拮抗劑阻斷PD-L2與PD-1之相互相用。在另一個具體例中，B7-1拮抗劑阻斷B7-1與PD-L1之相互相用。

在一個具體例中，本文揭示一種組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含本發明之重組李斯特菌屬。在另一個具體例中，本文揭示一種組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，包含表現本發明之融合多肽的重組減毒李斯特菌屬。在另一個具體例中，組成物進一步包含適合於向個體投與之調配物緩衝液。

在一個具體例中，本文揭示一種醫藥組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含本發明之重組李斯特菌屬。在另一個具體例中，本文揭示一種組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，包含表現本發明之融合多肽的重組減毒李斯特菌屬。在另一個具體例中，醫藥組成物進一步包含適合於向個體投與之調配物緩衝液。

在一個具體例中，本文揭示一種免疫原性組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含本發明之重組李斯特菌屬。在另一個具體例中，本文揭示一種組成物，其包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，包含表現本發明之融合多肽的重組減毒李斯特菌屬。在另一個具體例中，該免疫原性組成物進一步包含適合於向個體投與之調配物緩衝液。

組合療法亦可包含一或多種額外治療劑。額外治療劑可為例如化學治療劑、生物治療劑(包括(但不限於)針對VEGF、VEGFR、EGFR、Her2/neu、其他生長因子受體、CD20、CD40、CD-40L、CTLA-4、OX-40、GITR、4-1BB及ICOS之抗體)、免疫原性劑(舉例而言，減毒癌細胞、腫瘤抗原、抗原呈遞細胞(諸如脈衝輸送腫瘤源性抗原或核酸之樹突狀細胞)、免疫刺激細胞激素(舉例而言，IL-2、IFNα2、GM-CSF)及用編碼免疫刺激細胞激素(諸如(但不限於)GM-CSF)之基因轉染的細胞。

熟練技術人員應瞭解，術語「生物治療劑」可涵蓋阻斷任何支撐腫瘤維持及/或生長或遏制抗腫瘤免疫反應之生物學路徑中之配位體/受體信號傳導的生物分子，諸如抗體或融合蛋白。

化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲蜜胺；多聚乙醯(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin))；念珠藻環肽(cryptophycins)(尤其克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素φI1，參見例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994)；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素；以及新抑癌蛋白色素體及相關色蛋白烯二炔抗生素色素體)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycins)、放線菌素d、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素d、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)(包括(N-嗎啉基)-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺藥，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine))；尿烷；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西他賽(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；及以上各者中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。亦包括用於調節或抑制腫瘤上之激素作用之抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中之雌激素產生，諸如4(5)-咪唑、胺格魯米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)、來曲唑(letrozole)及阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上各者中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。

熟練技術人員應瞭解，術語「化學治療劑」可涵蓋可引起癌細胞死亡或干擾癌細胞生長、分裂、修復及/或功能之化學或生物學物質。化學治療劑之類別包括(但不限於)：烷基化劑、抗代謝物、激酶抑制劑、紡錘體毒物植物鹼、細胞毒性/抗腫瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、光敏劑、抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、抗孕酮、雌激素受體下調劑(ERD)、雌激素受體拮抗劑、黃體生成激素釋放性激素促效劑、抗雄激素、芳香酶抑制劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、抑制異常細胞增殖或腫瘤生長中所牽涉基因之表現的反義寡核苷酸。適用於本文所揭示之治療方法中德化學治療劑包括細胞生長抑制劑及/或細胞毒性劑。

根據標準醫藥實踐，本發明之組合療法中之各治療劑可單獨或在包含該治療劑及一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及稀釋劑的藥劑(在本文中亦稱為醫藥組成物)中投與。

熟練技術人員應瞭解，術語「醫藥學上可接受之載劑」可涵蓋適合用於用以向人類投與PD-1拮抗劑及/或活減毒李斯特菌屬菌株或活減毒單核球增多性李斯特菌菌株之調配物的任何無活性物質，該活減毒李斯特菌屬菌株用於刺激能夠驅動針對存活素表現性細胞之細胞免疫反應的APC，該活減毒單核球增多性李斯特菌菌株藉由用表現載體使其轉型成表現與tLLO或ADXS31-265(10403S dal ^(-) dat ^(-) actA ^(-) pADV265)菌株融合之存活素抗原或其免疫原性片段來生物工程改造。

熟練技術人員應瞭解，術語「轉型」可涵蓋對細菌細胞進行工程改造以接受質體或其他異源DNA分子。在另一個具體例中，「轉型」係指工程改造細菌細胞以表現質體之基因或其他異源DNA分子。

III. 所用治療方法

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中治療腫瘤或癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中治療腫瘤或癌症。在另一個具體例中，腫瘤或癌症為存活素表現性腫瘤或存活素表現性癌症。

在另一個具體例中，本文揭示如上文所描述之免疫原性組成物，其用於治療癌症。舉例而言，本文所揭示之方法中所用的免疫原性組成物包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑，且進一步包含表現如通篇所描述之融合多肽的李斯特菌屬菌株，其中該融合多肽包含存活素抗原。

熟練技術人員應瞭解，在一個具體例中，術語「治療」可涵蓋治癒疾病。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋預防疾病。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋降低疾病發生率。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋改善疾病症狀。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋提高患者之無效能存活率或整體存活率。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋穩定疾病進展。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋誘導緩解。在另一個具體例中，「治療」可涵蓋減緩疾病進展。術語「減少」、「遏制」及「抑制」係指減輕或降低。

熟練技術人員應瞭解，術語「治療」可涵蓋治療性治療及預防性(prophylactic)或防治性(preventative)措施，其中目標為預防或減輕如本文所描述之標的病理性病狀或病症。因此，在一個具體例中，治療可包括直接影響或治癒、遏制、抑制、預防疾病、病症或病狀，降低其嚴重性、延遲其發作、減少與其相關之症狀，或其組合。因此在一個具體例中，「治療」可尤其涵蓋延遲進展、加速緩解、誘導緩解、加強緩解、加快恢復、增加替代性治療劑功效或減小對替代性治療劑之抗性，或其組合。在一個具體例中，「預防」或「阻礙」可尤其涵蓋延遲症狀發作、預防疾病復發、降低復發事件之數目或頻率、增加症狀發作之間的潛伏期，或其組合。在一個具體例中，「遏制」或「抑制」可尤其涵蓋降低症狀嚴重性、降低急性發作嚴重性、減少症狀數目、降低疾病相關症狀之發病率、降低症狀之潛伏性、減輕症狀、減少繼發性症狀、減少二次感染、延長患者存活期，或其組合。

在一個具體例中，症狀為原發性的，而在另一個具體例中，症狀為繼發性的。在一個具體例中，「原發性」係指症狀為特定疾病或病症之直接結果，而在一個具體例中，「繼發性」係指症狀來源於原發性原因或為由其所致。在一個具體例中，用於本發明之化合物治療原發性或繼發性症狀或繼發性併發症。在另一個具體例中，「症狀」可為疾病或病理性病狀之任何表現。

在一個具體例中，所治療之腫瘤或癌症為存活素表現性腫瘤或存活素表現性癌症。在另一個具體例中，所治療之癌症為乳癌、中樞神經系統(CNS)癌、頭頸癌、骨肉瘤(OSA)、犬骨肉瘤(OSA)或尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma，ES)。在另一個具體例中，癌症為胰臟癌。在另一個具體例中，癌症為卵巢癌。在另一個具體例中，癌症為胃癌。在另一個具體例中，癌症為胰臟之癌性病變在另一個具體例中，癌症為肺腺癌。在另一個具體例中，癌症為結腸直腸腺癌。在另一個具體例中，癌症為肺鱗狀腺癌。在另一個具體例中，癌症為胃腺癌。在另一個具體例中，癌症為卵巢表面上皮細胞贅瘤(例如其良性、增生或惡性變體)。在另一個具體例中，癌症為口腔鱗狀細胞癌。在另一個具體例中，癌症為非小細胞肺癌。在另一個具體例中，癌症為CNS癌。在另一個具體例中，癌症為子宮內膜癌。在另一個具體例中，癌症為膀胱癌。在另一個具體例中，癌症為間皮瘤。在另一個具體例中，癌症為惡性間皮瘤(MM)。在另一個具體例中，癌症為黑色素瘤。在另一個具體例中，癌症為神經膠質瘤。在另一個具體例中，癌症為生殖細胞腫瘤。在另一個具體例中，癌症為絨膜癌。在另一個具體例中，癌症為淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或此項技術中已知之任何存活素表現性癌症。

在另一個具體例中，癌症為胰臟癌。在另一個具體例中，癌症為胰管癌。在另一個具體例中，癌症為胰臟腺泡細胞癌或囊腺癌。在另一個具體例中，癌症為胰臟神經內分泌腫瘤。在另一個具體例中，癌症為胰島素瘤或胃泌素瘤。在另一個具體例中，癌症為此項技術中已知之前列腺癌。

在另一個具體例中，癌症為難治性癌症。在另一個具體例中，癌症為晚期癌症。在另一個具體例中，癌症為癌轉移。在另一個具體例中，癌症已轉移。在另一個具體例中，胰臟癌之癌轉移，其在一個具體例中包含向骨骼轉移，且在另一個具體例中包含向其他器官轉移。在另一個具體例中，癌症為任何存活素表現性胰臟癌。在另一個具體例中，癌症或實體腫瘤為復發或轉移性疾病之結果。

在另一個具體例中，由本文所揭示之方法及組成物靶向之腫瘤的細胞表現存活或其片段。在另一個具體例中，腫瘤與存活素相關。在另一個具體例中，由腫瘤細胞表現之存活素為由本發明之方法及組成物誘導之免疫反應的標靶。在另一個具體例中，由本文所揭示之方法及組成物靶向之腫瘤的細胞表現低量之MHC。在另一個具體例中，由本文所揭示之方法及組成物靶向之腫瘤的細胞表現高量之PD-L1。在另一個具體例中，PD-L1遏制T效應細胞對存活素之反應或使其減弱。在另一個具體例中，PD-L1介導之免疫抑制由本文所揭示之方法及組成物抵消。

在一個具體例中，可在已知易患特定癌症或腫瘤之特定群體中預防癌症或腫瘤。在一個具體例中，此類易感性可歸因於環境因素，諸如抽菸，其在一個具體例中可能使群體經受肺癌，而在另一個具體例中，此類易患病性可歸因於基因因子，例如具有BRCA1/2突變之群體在一個具體例中可能易患乳癌且在另一個具體例中可能易患卵巢癌。在另一個具體例中，如此項技術中已知，染色體8q24、染色體17q12及染色體17q24.3上之一或多個突變可能增加胰臟癌易感性。導致癌症易感性之其他基因及環境因素為此項技術中已知。

在投與本文提供之免疫原性組成物之後，本文所揭示之方法誘導T效應細胞在周邊淋巴器官中擴展，導致腫瘤位點處T效應細胞之存在增加。在另一個具體例中，本文所揭示之方法誘導T效應細胞在周邊淋巴器官中擴展，導致周邊的T效應細胞之存在增加。T效應細胞之此類擴展導致周邊及腫瘤部位之T效應細胞與調節性T細胞之比率增加而不影響Tregs之數目。熟習此項技術者應瞭解周邊淋巴器官包括(但不限於)脾臟、派爾集合淋巴結(peyer's patch)、淋巴結、腺等。在一個具體例中，周邊中發生T效應細胞與調節性T細胞之比率增加而不影響Tregs數目。在另一個具體例中，周邊、淋巴器官及腫瘤部位的T效應細胞與調節性T細胞之比率增加，而不影響此等部位之Tregs數目。在另一個具體例中，T效應細胞之比率增加降低Tregs之頻率，但不降低此等部位之Tregs的總數。

在一個具體例中，投與本文所揭示之免疫原性組成物刺激T效應細胞之抗腫瘤活性。在另一個具體例中，投與本文所揭示之免疫原性組成物使腫瘤介導的抗存活素T效應細胞反應之免疫抑制無效。在又另一個具體例中投與本文所揭示之免疫原性組成物抵消腫瘤介導之免疫抑制信號傳導。在另一個具體例中，投與本文所揭示之免疫原性組成物使T效應細胞對腫瘤介導之免疫抑制不敏感。

在一個具體例中，本文揭示一種用於在個體中治療存活素表現性癌症之方法，其包含向該個體投與包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑且進一步包含活減毒李斯特菌屬菌株之組合療法，該活減毒李斯特菌屬菌株用於刺激能夠驅動針對存活素表現性細胞之細胞免疫反應的APC。在另一個具體例中，本文揭示一種在個體中治療存活素表現性癌症之方法，該方法包含以下步驟：向該個體投與包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑且進一步包含重組李斯特菌屬的組合療法，該重組李斯特菌屬包含編碼融合多肽之核酸，其中該融合多肽包含與含PEST之肽或多肽融合的存活素抗原或其免疫原性片段。在本發明之另一個具體例中，本文揭示一種用於在個體中治療存活素表現性癌症之方法，其包含向該個體投與包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑且進一步包含活減毒單核球增多性李斯特菌菌株之組合療法，該活減毒單核球增多性李斯特菌菌株包含編碼與tLLO融合之存活素抗原或其免疫原性片段的表現載體。在本發明之又另一個具體例中，本文揭示一種用於在個體中治療癌症之方法，其包含向該個體投與包含PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、PD-L2拮抗劑或B7-1拮抗劑且進一步包含ADXS-31-265(10403S dal ^(-) dat ^(-) actA ^(-) pADV265)菌株之組合療法。

在一個具體例中，本文揭示在個體中引起針對存活素表現性癌症之免疫反應增強的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在另一個具體例中，本文揭示一種在個體中預防腫瘤或癌症之方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，腫瘤或癌症為存活素表現性腫瘤或存活素表現性癌症。在另一個具體例中，本文揭示一種在個體中預防存活素表現性腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與組合療法之步驟。在另一個具體例中，在融合蛋白具有截短LLO之情形下，投與存活素表現性李斯特菌屬由於抗原決定基擴散而引起針對其他腫瘤相關抗原之免疫反應。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中治療存活素表現性腫瘤生長之方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中延遲存活素表現性癌症之進展的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中延遲存活素表現性腫瘤生長之進展的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之組合的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種延長在個體中患有存活素表現性癌症之個體之存活期的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之組合的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種延長在個體中具有存活素表現性腫瘤生長之個體之存活期的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在於個體中具有存活素表現性腫瘤生長之個體中抑制、阻礙或延遲轉移性疾病的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導抗存活素免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中加強抗存活素免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在治療存活素過度表現性癌症中預防逃脫突變之方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中誘導存活素抗原表現性癌症之消退的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種降低腫瘤內T調節細胞之頻率的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中治療來自存活素表現性腫瘤之轉移性疾病的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中破壞該個體對存活素表現性腫瘤之耐受性的方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中阻礙存活素表現性癌症生長之方法，該方法包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在另一個具體例中，本文所揭示的誘導抗存活素免疫反應之方法允許在個體中治療存活素表現性腫瘤。在另一個具體例中，本文提供的誘導抗存活素免疫反應之方法允許延長罹患存活素表現性癌症之個體的存活期。在另一個具體例中，本文所揭示的誘導抗存活素免疫反應之方法在罹患存活素表現性癌症之個體中誘導腫瘤或癌症之消退。在另一個具體例中，本文所揭示的誘導抗存活素免疫反應之方法在罹患存活素表現性腫瘤之個體中破壞對存活素之耐受性。在另一個具體例中，本文所揭示的誘導抗存活素免疫反應之方法在個體中遏制存活素表現性癌症形成。在另一個具體例中，治療方法進一步包含在復發或癌轉移後在個體中投與該組合療法。

在一個具體例中，包含本文所描述之免疫抑制分子拮抗劑及李斯特菌屬菌株的任何組成物可用於本發明之方法中。上文已詳細描述包含免疫抑制分子拮抗劑李斯特菌屬菌株之組成物。

在一個具體例中，本發明提供一種用於抗腫瘤反應之「抗原決定基擴散」的方法。在另一個具體例中，使用本文所揭示之組成物及方法的免疫接種誘導抗原決定基擴散至攜有除本發明疫苗中帶有之抗原以外之抗原的其他腫瘤上。

在另一個具體例中，在所治療之個體中，優勢抗原決定基或亞優勢抗原決定基分別為優勢或亞優勢的。在另一個具體例中，在所治療之群體中，優勢抗原決定基或亞優勢抗原決定基為優勢或亞優勢的。

在一個具體例中，本文揭示一種在個體中藉由抗原決定基擴散來治療、遏制或抑制癌症或腫瘤生長之方法，其中且在另一個具體例中，該癌症係與包含於本發明組成物中之抗原或其片段的表現相關。在另一個具體例中，該方法包含向個體投與本發明之組合療法。在又另一個具體例中，個體建立針對抗原表現性癌症或抗原表現性腫瘤之免疫反應，由此在個體中治療、遏制或抑制癌症或腫瘤生長。

在一個具體例中，本文揭示一種提高個體之脾臟及腫瘤微環境中T效應細胞與調節性T細胞(Tregs)之比率的方法，其包含投與本文提供之免疫原性組成物。在另一個具體例中，提高個體之脾臟及腫瘤微環境中的T效應細胞與調節性T細胞(Tregs)之比率允許個體中更深入之抗腫瘤反應。

在另一個具體例中，T效應細胞包含CD4+FoxP3-T細胞。在另一個具體例中，T效應細胞為CD4+FoxP3-T細胞。在另一個具體例中，T效應細胞包含CD4+FoxP3-T細胞及CD8+ T細胞。在另一個具體例中，T效應細胞為CD4+FoxP3-T細胞及CD8+ T細胞。在另一個具體例中，調節性T細胞為CD4+FoxP3+T細胞。

在一個具體例中，本發明提供治療腫瘤或癌症、保護免遭腫瘤或癌症及誘導針對腫瘤或癌症之免疫反應的方法，其包含向個體投與本文提供之組合療法的步驟。

在一個具體例中，本發明提供一種在人類個體中預防或治療腫瘤或癌症之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法菌株，包含有包含LLO蛋白質之N端片段及腫瘤相關抗原之重組多肽的重組李斯特菌屬菌株的步驟，藉此重組李斯特菌屬菌株誘導針對腫瘤相關抗原之免疫反應，由此在人類個體中治療腫瘤或癌症。在另一個具體例中，免疫反應為T細胞反應。在另一個具體例中，T細胞反應為CD4+FoxP3-T細胞反應。在另一個具體例中，T細胞反應為CD8+ T細胞反應。在另一個具體例中，T細胞反應為CD4+FoxP3-及CD8+ T細胞反應。在另一個具體例中，本發明提供一種保護個體免於腫瘤或癌症之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中誘導腫瘤之消退的方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種降低腫瘤或癌症之發生率或復發的方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中遏制腫瘤形成之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中誘導癌症緩解之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中延長癌症之緩解的方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中減小腫瘤大小之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法的步驟。在一個具體例中，包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中。在另一個具體例中，核酸在重組李斯特菌屬疫苗菌株中的質體中。在另一個具體例中，核酸分子在重組李斯特菌屬疫苗菌株中之細菌人工染色體中。

在另一個具體例中，治療方法減小腫瘤大小。腫瘤大小減小可為部分減小或減小100%。在另一個具體例中，本文所揭示之方法使腫瘤大小減小90%。在另一個具體例中，本文所揭示之方法使腫瘤大小減小80%。在另一個具體例中，方法使腫瘤大小減小70%。在另一個具體例中，方法使腫瘤大小減小60%。在另一個具體例中，方法使腫瘤大小減小50%。

在另一個具體例中，治療方法增加疾病進展時間。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少2個月。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少4個月。在另一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少6個月。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少1年。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少2年。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少3年。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少4年。在一個具體例中，相比於未經治療之個體，疾病進展時間增加至少5年。

在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中阻礙存活素表現性癌症生長之方法，其包含向該個體投與本文提供之組合療法，其中重組多肽包含與存活素抗原融合的LLO蛋白質之N端片段，且其中該抗原具有一或多個亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基。在另一個具體例中，抗原不含有任何優勢CD8+T細胞抗原決定基。

「優勢CD8+ T細胞抗原決定基」係指由超過30%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基，該等CD8+ T細胞藉由蛋白質或含有該蛋白質之病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起。在另一個具體例中，該術語係指由超過35%之由此引起之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過40%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過45%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過50%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過55%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過60%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過65%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過70%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過75%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過80%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過85%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過90%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過95%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過96%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過97%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過98%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。

「亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基」係指由少於30%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基，該等CD8+ T細胞藉由蛋白質或含有該蛋白質之病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起。在另一個具體例中，該術語係指由少於28%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過26%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於24%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過22%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於20%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過18%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於16%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過14%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過12%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於10%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過8%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於6%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於5%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由超過4%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於3%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於2%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於1%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。在另一個具體例中，該術語係指由少於0.5%之抗原特異性CD8+ T細胞識別的抗原決定基。

在一個具體例中，用本文所揭示的表現LLO-抗原融合體之重組李斯特菌屬進行疫苗接種誘導抗原決定基擴散。在另一個具體例中，即使在無存活素之情形下，用LLO-抗原融合體進行疫苗接種亦誘導抗原決定基擴散。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物中的抗原在個體之非腫瘤細胞上以可偵測量表現。在另一個具體例中，抗原在個體之非腫瘤細胞的至少某一百分比(例如0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、2%、3%或5%)上以可偵測量表現。在一個具體例中，「非腫瘤細胞」係指腫瘤體外側之細胞。在另一個具體例中，「非腫瘤細胞」係指非惡性細胞。在另一個具體例中，「非腫瘤細胞」係指未經轉型之細胞。在另一個具體例中，非腫瘤細胞為體細胞。在另一個具體例中，非腫瘤細胞為生殖細胞。

在一個具體例中，「可偵測量」係指在使用標準分析時可偵測之量。在一個具體例中，分析為免疫學分析。在一個具體例中，分析為酶聯免疫分析(ELISA)。在另一個具體例中，分析為西方墨點分析。在另一個具體例中，分析為FACS。在又另一個具體例中，分析為西方墨點分析。在另一個具體例中，分析為PCR。熟練技術人員應理解，此項技術中可獲得之其他分析可用於本文提供之方法中。在另一個具體例中，相對於特定分析之背景量測定可偵測量。用於進行此等技術中之每一者的方法為熟習此項技術者所熟知。

在另一個具體例中，本發明提供一種用於在患有癌症之宿主中誘導細胞毒性T細胞形成的方法，其包含向該宿主投與本發明之組合療法，由此在患有癌症之宿主中誘導細胞毒性T細胞形成。

在一個具體例中，本文揭示一種投與本發明之組成物的方法。在另一個具體例中，本文揭示一種投與本發明之疫苗的方法。在另一個具體例中，本文揭示一種投與本發明之重組多肽或重組核苷酸的方法。在另一個具體例中，投與本文所揭示之組成物、重組多肽或重組核苷酸的步驟使用包含重組核苷酸或表現重組多肽之李斯特菌屬或毒重組形式來進行，其各自處於其自身之分立具體例中。在另一個具體例中，投與使用不同減毒細菌載體來進行。在另一個具體例中，投與使用DNA疫苗(例如裸DNA疫苗)來進行。在另一個具體例中，投與本文所揭示之重組多肽藉由重組地產生蛋白質，隨後向個體投與該重組蛋白來執行。

在一個具體例中，向個體之細胞離體投與組成物；在另一個具體例中，向供體之細胞離體投與組成物；在另一個具體例中，向供體之細胞活體內投與組成物，且隨後轉移至個體中。

本發明涵蓋各種投藥方案。本發明之組合療法中的各治療劑可同時投與(亦即，在相同藥劑中)，並行投與(亦即，在單獨藥劑中以任何次序一個接一個投與)或以任何次序依序投與。當組合療法中之治療劑呈不同劑型(一種藥劑為錠劑或膠囊且另一種藥劑為無菌液體)及/或以不同給藥時程投與，例如化學治療劑至少每天投與且生物治療劑較不頻繁地投與，諸如每週一次、每兩週一次或每三週一次時，依序投與為尤其適用的。

熟練技術人員應瞭解，與藥劑投與有關之術語「同時投與」可涵蓋以使得個別藥劑經由相同或不同投與途徑同時向個體遞送的方式投與藥劑。

本發明涵蓋劑量範圍之各種具體例。用於免疫抑制分子拮抗劑(例如PD-1拮抗劑抗體)之劑量單位可表示為均一劑量，亦即100mg、200mg、300mg，或表示為患者特異性劑量，亦即mg/kg(每公斤體重之治療劑毫克數)或mg/m²(每平方米體表面積之毫克數)。

在一個具體例中，本文所揭示之免疫原性組成物所包含之減毒李斯特菌屬菌株的劑量以1×10⁷-3.31×10¹⁰CFU之劑量向個體投與。在另一個具體例中，劑量為1×10⁸-3.31×10¹⁰CFU。在另一個具體例中，劑量為1×10⁹-3.31×10¹⁰CFU。在另一個具體例中，劑量為5-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為7-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為10-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為20-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為30-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為50-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為70-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為100-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為150-500×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-300×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-200×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-150×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-100×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-70×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-50×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-30×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為5-20×10⁸CFU。在另一個具體例中，劑量為1-30×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為1-20×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為2-30×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為1-10×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為2-10×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為3-10×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為2-7×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為2-5×10⁹CFU。在另一個具體例中，劑量為3-5×10⁹CFU。

在另一個具體例中，劑量為1×10⁷個生物體。在另一個具體例中，劑量為1×10⁸個生物體。在另一個具體例中，劑量為1×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為1.5×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為2×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為3×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為4×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為5×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為6×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為7×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為8×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為10×10⁹個生物體。在另一個具體例中，劑量為1.5×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為2×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為2.5×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為3×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為3.3×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為4×10¹⁰個生物體。在另一個具體例中，劑量為5×10¹⁰個生物體。各劑量及劑量範圍代表本發明之各別具體例。

在一個具體例中，本發明之組成物的重複投與(劑量)可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之時間間隔之後進行以實現腫瘤消退。在另一個具體例中，重複劑量可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之時間間隔之後進行以實現腫瘤生長抑制。評定可藉由此項技術中已知之任何技術測定，包括診斷方法，諸如成像技術、血清腫瘤標記物分析、生檢，或腫瘤相關症狀之存在、不存在或改善。

熟練技術人員應瞭解，術語「追加」可涵蓋向個體投與單獨或組合形式之額外菌株或免疫原性組成物或重組李斯特菌屬菌株劑量或免疫檢查點抑制劑。在本發明之方法的另一個具體例中，投與2次追加(或總計3次接種)。在另一個具體例中，投與3次追加。在另一個具體例中，投與4次追加。在另一個具體例中，投與5次追加。在另一個具體例中，投與6次追加。在另一個具體例中，投與超過6次追加。各可能性代表本發明之各別具體例。

在另一個具體例中，本發明之方法進一步包含向個體追加如本文提供之重組李斯特菌屬菌株或免疫檢查點抑制劑的步驟。在另一個具體例中，用於追加劑接種之重組李斯特菌屬菌株與起始「初」接種所用之菌株相同。在另一個具體例中，追加劑菌株與初菌株不同。在另一個具體例中，用於追加劑接種之免疫檢查點抑制劑與起始「初」接種所用之菌株相同。在另一個具體例中，追加劑抑制劑與初抑制劑不同。在另一個具體例中，初接種及追加接種使用相同劑量。在另一個具體例中，追加劑使用較大劑量。在另一個具體例中，追加劑使用較小劑量。在另一個具體例中，本文所揭示之方法進一步包含向個體投與追加劑疫苗接種之步驟。在一個具體例中，追加劑疫苗接種在單次初疫苗接種之後。在另一個具體例中，在初疫苗接種之後投與單次追加劑疫苗接種。在另一個具體例中，在初疫苗接種之後投與兩次追加劑疫苗接種。在另一個具體例中，在初疫苗接種之後投與三次追加劑疫苗接種。在一個具體例中，初菌株與追加菌株之間的週期由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一個具體例中，初菌株與追加菌株之間的週期為1週，在另一個具體例中，其為2週，在另一個具體例中，其為3週，在另一個具體例中，其為4週，在另一個具體例中，其為5週，在另一個具體例中，其為6-8週，在另一個具體例中，在初菌株之後8-10週投與追加菌株。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法進一步包含向個體追加包含本文提供之減毒李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物。在另一個具體例中，本文所揭示之方法包含投與追加劑量的包含本文提供之減毒李斯特菌屬菌株之免疫原性組成物的步驟。在另一個具體例中，追加劑量為該免疫原性組成物之替代形式。在另一個具體例中，本文所揭示之方法進一步包含向個體投與追加劑免疫原性組成物之步驟。在一個具體例中，在單次初劑量之該免疫原性組成物之後為追加劑量。在另一個具體例中，在初劑量之後投與單次追加劑量。在另一個具體例中，在初劑量之後投與兩次追加劑量。在另一個具體例中，在初劑量之後投與三次追加劑量。在一個具體例中，包含本文所揭示之減毒李斯特菌屬的免疫原性組成物的初劑量與追加劑量之間的週期由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一個具體例中，劑量由熟練技術人員以實驗方式測定。在另一個具體例中，初劑量與追加劑量之間的週期為1週，在另一個具體例中，其為2週，在另一個具體例中，其為3週，在另一個具體例中，其為4週，在另一個具體例中，其為5週，在另一個具體例中，其為6-8週，在另一個具體例中，追加劑量在免疫原性組成物的初劑量之後8-10週投與。

異源「初追加」策略已有效提高免疫反應及針對許多病原體提供保護。Schneider等人，Immunol.Rev.170：29-38(1999)； Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2：239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人，Strain 20：1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69：3041-7(2001)。在初注射與追加注射中提供不同形式之抗原似乎使對抗原之免疫反應最大化。DNA菌株初打，隨後用佐劑中之蛋白質追加或病毒載體遞送編碼抗原之DNA似乎分別為提高抗原特異性抗體及CD4+ T細胞反應或CD8+ T細胞反應的最有效方式。Shiver J.W.等人，Nature 415：331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人，Strain 20：1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人，Strain 19：95-102(2000)；Sin,J.I.等人，DNA Cell Biol.18：771-9(1999)。來自猴疫苗接種研究之近期資料表明向編碼HIV gag抗原之DNA添加CRL1005泊洛沙姆(poloxamer)(12kDa，5% POE)會提高用HIV gag DNA初打，隨後用表現HIV gag之腺病毒載體(Ad5-gag)追加對猴進行疫苗接種時的T細胞反應。DNA/泊洛沙姆初打，接種Ad5-gag追加之細胞免疫反應大於用DNA(無泊洛沙姆)初打，接種Ad5-gag追加或僅Ad5-gag誘導之反應。Shiver,J.W.等人Nature 415：331-5(2002)。美國專利申請公開案第US 2002/0165172 A1號描述同時投與編碼抗原之免疫原性部分之載體構築體與包含抗原之免疫原性部分的蛋白質，以使產生免疫反應。文獻限於B型肝炎抗原及HIV抗原。此外，美國專利第6,500,432號係針對藉由同時投與聚核苷酸及所關注之多肽提高核酸疫苗接種之免疫反應的方法。根據專利，同時投與意謂在同一免疫反應期間(較佳彼此在0-10或3-7天內)投與聚核苷酸及多肽。專利涵蓋之抗原尤其包括肝炎(全部形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰質炎(polio)、流感、寄生蟲(例如來自瘧原蟲屬)及病原菌(包括(但不限於)結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、衣原體(Chlamydia)、志賀桿菌屬(Shigella)、伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)、腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli)、傷寒沙氏桿菌(S.typhosa)、幽門螺旋桿菌(H.pylori)、霍亂弧菌(V.cholerae)、百日咳鮑特菌(B.pertussis)等)之抗原。上述全部參考文獻以全文引用的方式併入本文中。

在另一個具體例中，本文所揭示之方法的重組多肽由重組李斯特菌屬菌株表現。在另一個具體例中，表現由重組李斯特菌屬菌株所帶有之核苷酸分子介導。各可能性代表本發明之各別具體例。

在一些情況下，將免疫抑制分子拮抗劑及活減毒李斯特菌屬菌株在單個劑型中組合，該活減毒李斯特菌屬菌株用於刺激能夠驅動針對存活素表現性細胞之細胞免疫反應的APC。在一些情況下，免疫抑制分子拮抗劑及活減毒單核球增多性李斯特菌菌株在單個劑型中組合，該活減毒單核球增多性李斯特菌菌株藉由用表現載體使其轉型成表現與tLLO融合之存活素抗原來生物工程改造。在一些情況下，免疫抑制分子拮抗劑及ADXS31-265(10403S dal ^(-) dat ^(-) actA ^(-) pADV265)菌株在單個劑型中組合。

在一個具體例中，投與免疫抑制分子拮抗劑及本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株在整個治療或預防時段中維持，該活減毒李斯特菌屬菌株用於刺激能夠驅動針對存活素表現性細胞之細胞免疫反應的APC。在另一個具體例中，抗癌活性藉由後續投與分離之任一組分，亦即免疫抑制分子拮抗劑或活減毒李斯特菌屬菌株(或包含任一組分之組成物)來實現。

在一些具體例中，在投與免疫抑制分子拮抗劑之前投與用於刺激能夠驅動針對存活素表現性細胞之細胞免疫反應之APC的活減毒李斯特菌屬菌株(例如ADXS31-265(10403S dal ^(-) dat ^(-) actA ^(-) pADV265)菌株)，而在其他具體例中，在投與免疫抑制分子拮抗劑之後投與活減毒李斯特菌屬菌株中之一者。各可能性代表如本文提供之方法及組成物的各別具體例。

本發明涵蓋各種依序投與模式。在一個具體例中，投藥方案包含投與本文所揭示之免疫抑制分子拮抗劑，接著投與本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株。在另一個具體例中，投與組合療法之組分的次序被反轉。在又另一個具體例中，投與一種組分後，緊接著投與另一種組分。在又另一個具體例中，在組分投與之間存在時間間隔。在一個具體例中，時間間隔為至少1-2小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少2-3小時。在又另一個具體例中，時間間隔為至少3-4小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少4-5小時。在又另一個具體例中，時間間隔為至少5-6小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少6-8小時。在又另一個具體例中，時間間隔至少為8-10小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少10-12小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少一天。在另一個具體例中，時間間隔為至少兩天。在另一個具體例中，時間間隔為至少三天。在另一個具體例中，時間間隔為至少四天。在另一個具體例中，時間間隔為至少五天。在另一個具體例中，時間間隔為至少六天。在另一個具體例中，時間間隔為至少七天。在又另一個具體例中，時間間隔超過七天。

在一些具體例中，組合療法中之至少一種治療劑使用當該藥劑用作治療相同癌症之單一療法時通常採用之相同給藥方案(治療之劑量、頻率及持續時間)來投與。在其他具體例中，患者接受的組合療法中之至少一種治療劑之總量低於當該藥劑用作單一療法時，例如較小劑量、不太頻繁給藥及/或較短治療持續時間。

在一個具體例中，該方法包含共投與包含重組李斯特菌屬之組成物與額外療法的步驟。在另一個具體例中，額外療法為手術、化學療法、免疫療法、放射療法、本文所提供的基於抗體之免疫療法或其組合。在另一個具體例中，額外療法在投與包含重組李斯特菌屬之組成物之前。在另一個具體例中，額外療法在投與包含重組李斯特菌屬之組成物之後。在另一個具體例中，額外療法為抗體療法。在另一個具體例中，包含重組李斯特菌屬之組成物以遞增之劑量投與以提高T-效應細胞與調節性T細胞之比率及產生更強效之抗腫瘤免疫反應。熟習此項技術者應瞭解抗腫瘤免疫反應可藉由向具有腫瘤之個體提供細胞激素，包括(但不限於)IFN-γ、TNF-α及此項技術中已知增強細胞免疫反應之之其他細胞激素進一步加強，其中一些細胞激素可見於美國專利第6,991,785號，該專利以引用的方式併入本文中。在另一個具體例中，單獨地投與免疫抑制分子、重組李斯特菌屬及額外療法。

本發明涵蓋各種依序投與模式。在一個具體例中，投藥方案包含經由上文所描述之任何方案投與本文所揭示之組合療法，接著投與上文所描述之額外療法中之一者。在另一個具體例中，投與組合療法及額外療法中之一者的次序被反轉。在又另一個具體例中，緊接在投與組合療法之後或在其之前為投與額外療法中之一者。在又另一個具體例中，在投藥療法之間存在時間間隔。在一個具體例中，時間間隔為至少1-2小時。在另一個具體例中，時間間隔為2-3小時。在另一個具體例中，時間間隔為3-4小時。在另一個具體例中，時間間隔為4-5小時。在另一個具體例中，時間間隔為5-6小時。在另一個具體例中，時間間隔為6-8小時。在另一個具體例中，時間間隔為7-10小時。在另一個具體例中，時間間隔為9-12小時。在另一個具體例中，時間間隔為至少一天。在另一個具體例中，時間間隔為二至三天。在另一個具體例中，時間間隔為三至五天。在另一個具體例中，時間間隔為五至七天。在另一個具體例中，時間間隔為七至十天。在又另一個具體例中時間間隔為十至十五天。

在另一個具體例中，本文揭示一種在罹患癌症或具有腫瘤之個體中增加抗原特異性T細胞之方法，該方法包含向該個體投與包含有包含核酸分子之重組李斯特菌屬疫苗菌株之免疫原性組成物的步驟，該核酸分子包含編碼融合多肽之第一開讀框，其中該融合多肽包含如本文所描述的與存活素抗原或其片段融合的含PEST序列之多肽或含PEST序列之肽。

在一些具體例中，本發明之組合療法向先前未經生物治療劑或化學治療劑治療之患者，亦即未治療之患者投與。在其他具體例中，該組合療法向在使用生物治療劑或化學治療劑之先前療法之後未能實現持續反應之患者，亦即經歷治療之患者投與。

熟練技術人員應瞭解，視需要基於量測反應之情形，術語「RECIST 1.1反應準則」可涵蓋Eisenhauer等人，E.A.等人，Eur.J Cancer 45：228-247(2009)中對標靶病變或非標靶病變所闡述之定義。

熟練技術人員應瞭解，術語「持續反應」可涵蓋在停止用治療劑或本文所描述之組合療法治療之後的持續性治療作用。在一些具體例中，持續反應具有至少與治療持續時間相同或至少為治療持續時間之1.5、2.0、2.5或3倍長的持續時間。

熟練技術人員應瞭解，兩個具有作用A及B之單個化合物的布利斯非依賴性組合反應(Bliss independence combined response)C為C=A+B-A×B，其中各作用表示為0與1之間的抑制分率。(參考文獻：Bliss(1939)Annals of Applied Biology)布利斯值定義為實驗反應與布利斯非依賴性計算值之間的差值，其指示組合形式之兩種化合物是累加性還是協同性的。

布利斯值為零(0)視為累加性的。術語「累加性」意謂兩種標的藥劑之組合的結果為各藥劑個別之總和。

熟練技術人員應瞭解，術語「Chothia」可涵蓋Lazikani等人，JMB 273：927-948(1997)中所描述之抗體編號系統。

熟練技術人員應瞭解，術語「協同作用」或「協同性」可涵蓋兩種藥劑之組合的反應為超過各藥劑個別反應之總和。更特定言之，在活體外情況下，協同作用之一個量度稱為「布利斯協同作用(Bliss synergy)」。布利斯協同作用可涵蓋「超過布利斯非依賴性」，如藉由上文所定義之布利斯值所確定。當布利斯值大於零(0)，或更佳大於0.2時，其視為指示協同作用。當然，本文中使用「協同作用」亦涵蓋如藉由額外及/或替代方法所量測之活體外協同作用。本文中提及組合之活體外生物學作用(包括(但不限於)抗癌作用)大於或等於組合之個別組分之總和可與布利斯值相關。再次，本文中使用「協同作用」(包括組分之組合是否展現等於或大於組個別分之總和的活性)可藉由額外及/或替代方法量測且為熟習此項技術者已知或將顯而易見的。

本發明之組合療法通常用於治療大至足以藉由觸診或藉由此項技術中熟知之成像技術，諸如MRI、超音波或CAT掃描發現的腫瘤。在一些具體例中，本發明之組合療法用於治療尺寸為至少約200mm³、300mm³、400mm³、500mm³、750mm³或高達1000mm³之晚期腫瘤。

在一個具體例中，向診斷為患有對PD-L1表現測試呈陽性之胰臟癌的患者投與本發明之組合療法。在一些具體例中，PD-L1表現使用診斷性抗人類PD-L1抗體或其抗原結合片段在對自患者移出之腫瘤樣本之FFPE或冷凍組織切片的IHC分析中偵測。通常，在開始利用PD-1拮抗劑或PD-L1拮抗劑及本文提供之活減毒李斯特菌屬菌株之治療之前，患者之醫師應要求進行診斷測試以在自患者移除之腫瘤組織樣本中測定PD-L1表現，但可預想，醫師可在治療開始之後任何時間，諸如治療週期完成之後要求進行第一或後續診斷測試。

在一些具體例中，選擇用於本發明之組合療法之給藥方案(在本文中亦稱為投與方案)視數個因素而定，包括實體之血清或組織周轉率、症狀之程度、實體之免疫原性及所治療個體中之標靶細胞、組織或器官之可接近性。較佳地，給藥方案根據副作用之可接受量來使遞送至患者之各治療劑之量最大化。因此，組合中之各生物治療劑及化學治療劑的劑量及給藥頻率部分地視特定治療劑、所治療癌症之嚴重性及患者特徵而定。關於選擇抗體、細胞激素及小分子之適當劑量的指導為可獲得的。參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602；Physicians' Desk Reference 2003(Physicians' Desk Reference，第57版)；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版本(2002年11月)。適當給藥方案之確定可由臨床醫師例如使用此項技術中已知或疑似影響治療或預測影響治療之參數或因素來進行，且將視例如患者之臨床病史(例如先前療法)、待治療癌症之類型及階段以及具有對組合療法中一或多種治療劑之反應的生物標記物而定。

本發明之組合療法中的生物治療劑可藉由連續輸注或藉由以例如每天、每隔一天、每週三次或每週、每兩週、每三週、每月、每兩月一次等時間間隔分劑投與。總每週劑量一般為至少0.05μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg體重或更大。參見例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144。

在採用抗人類PD-1 mAb作為組合療法中之PD-1拮抗劑的一些具體例中，給藥方案將包含在整個治療時程中以約14天(±2天)或約21天(±2天)或約30天(±2天)之時間間隔用100至500mg之均一劑量或1至10mg/kg基於重量之劑量投與抗人類PD-1 mAb。

在採用抗人類PD-1 mAb作為組合療法中之PD-1拮抗劑的其他具體例中，給藥方案將包含在患者內劑量遞增下以約0.005mg/kg至約10mg/kg之劑量投與抗人類PD-1 mAb。在其他遞增劑量具體例中，劑量之間的時間間隔將逐漸地縮短，例如在第一與第二劑量之間為約30天(±2天)，在第二與第三劑量之間為約14天(±2天)。在某些具體例中，對於第二劑量之後的劑量，給藥時間間隔將為約14天(±2天)。

在一個具體例中，術語「治療方案」、「給藥計畫(dosing protocol)」及「給藥方案(dosing regimen)」在本文中可互換使用且涵蓋本發明之組合中之各治療劑之投與的劑量及時序。

在某些具體例中將向個體投與包含本文所描述之任何免疫抑制分子拮抗劑之藥劑的靜脈內(IV)輸注。

在本發明之一個具體例中，組合療法中之PD-1拮抗劑為納武單抗，其以選自由以下各者組成之群的劑量靜脈內投與：1mg/kg Q2W、2mg/kg Q2W、3mg/kg Q2W、5mg/kg Q2W、10mg Q2W、1mg/kg Q3W、2mg/kg Q3W、3mg/kg Q3W、5mg/kg Q3W及10mg Q3W。

在本發明之另一個具體例中，組合療法PD-1拮抗劑中之PD-1拮抗劑以液體藥劑形式以選自由以下各者組成之群的劑量投與：200mg Q3W、1mg/kg Q2W、2mg/kg Q2W、3mg/kg Q2W、5mg/kg Q2W、10mg Q2W、1mg/kg Q3W、2mg/kg Q3W、3mg/kg Q3W、5mg/kg Q3W及10 mg Q3W或任何此等劑量之等效物(例如PD-1拮抗劑之PK模型估計200mg Q3W之固定劑量提供與用2mg/kg Q3W所獲得之暴露相符的暴露)。在一些具體例中，以於10mM組胺酸緩衝液(pH 5.5)中包含25mg/mlPD-1拮抗劑、7%(w/v)蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80之液體藥劑形式投與PD-1拮抗劑，且歷經30分鐘+/- 10分鐘之時間段藉由IV輸注投與所選劑量之藥劑。

在本發明之另一個具體例中，組合療法中之減毒細菌性或減毒李斯特菌屬為本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株(例如ADXS31-265)，其以液體藥劑形式以選自由1×10⁹、5×10⁹及1×10¹⁰ CFU組成之群的劑量投與。在一些具體例中，劑量在約1×10⁹CFU直至3.31×10¹⁰CFU、約5×10⁸CFU直至5×10¹⁰CFU、約7×10⁸CFU直至5×10¹⁰CFU、約1×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約2×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約3×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約5×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約7×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約1×10¹⁰CFU直至5×10¹⁰CFU、約1.5×10⁹CFU直至5×10¹⁰CFU、約5×10⁸CFU-直至3×10¹⁰CFU、約5×10⁸CFU直至2×10¹⁰CFU、約5×10⁸CFU直至1.5×10⁹CFU、約5×10⁸CFU直至1×10¹⁰CFU、約5×10⁸CFU直至7×10⁹CFU、約5×10⁸CFU直至5×10⁹CFU、約5×10⁸CFU直至3×10⁹CFU、約5×10⁸CFU直至2×10⁹CFU、約1×10⁹CFU直至3×10¹⁰CFU、約1×10⁹CFU直至2x 10¹⁰CFU、約2×10⁹CFU直至3×10¹⁰CFU、約1×10⁹CFU直至1x 10¹⁰CFU、約2×10⁹CFU直至1×10¹⁰CFU、約3×10⁹CFU直至1×10¹⁰CFU、約2×10⁹CFU直至7×10⁹CFU、約2×10⁹CFU直至5×10⁹CFU範圍內。各可能性代表本發明之各別具體例。

在其他具體例中重組李斯特菌屬之劑量在約1×10⁷個生物體至約1.5×10⁸個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在1×10⁸個生物體至約1.5×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在1×10⁹個生物體至約2×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在2×10⁹個生物體至約5×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在2×10⁹個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在3×10⁹個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在4×10⁹ 個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在6×10⁹個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在7×10⁹個生物體至約1×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在1×10⁹個生物體至約5×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在1×10⁹個生物體至約4×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在1×10⁹個生物體至約3×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約8×10⁹個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約1.5×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約2×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約2.5×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約3×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約3.5×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約4×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，重組李斯特菌屬之劑量在5×10⁹個生物體至約5×10¹⁰個生物體範圍內。在另一個具體例中，劑量在1×10⁷個生物體-5×10¹⁰個生物體範圍內。

在另一個具體例中，含有本文所揭示之菌株及組成物的醫藥組成物藉由熟習此項技術者已知之任何方法向個體投與，諸如非經腸、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或瘤內。

本發明提供之抗體及組成物可經由投與的任何適合之腸內途徑或非經腸途徑來投與。熟練技術人員應瞭解，投與之術語「腸內途徑」可涵蓋經由胃腸道之任何部分投與。腸內途徑之實例包括經口、經黏膜、頰內及經直腸途徑，或胃內途徑。熟練技術人員亦應瞭解，投與之術語「非經腸途徑」可涵蓋除腸內途徑之外的投與途徑。投與之非經腸途徑的實例包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、瘤內、膀胱內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、經氣管、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內、皮下或局部投與。本發明之抗體及組成物可使用任何適合之方法投與，諸如藉由口服攝取、鼻胃管、胃造口管、注射、輸注、可植入輸注泵及滲透泵。適合之投與途徑及方法可視多種因素而變化，諸如所使用之具體抗體、所需吸收速率、所用具體調配物或劑型、所治療之病症的類型或嚴重性、具體作用位點及患者條件，且可由熟習此項技術者容易地選擇。

在本文提供之方法及組成物的另一個具體例中，經口投與菌株或組成物，且因此調配成適於經口投與之形式，亦即固體或液體製劑。適合固體經口調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、球粒及其類似物。適合液體經口調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在本發明之另一個具體例中，活性成分調配成膠囊。根據此具體例，本文所揭示之組成物除活性化合物及惰性載劑或稀釋劑之外亦包含硬明膠膠囊。

在另一個具體例中，藉由靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑投與包含李斯特菌屬菌株之組成物。適合液體調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在一個具體例中，醫藥組成物靜脈內投與，且因此以適用於靜脈內投與之形式調配。在另一個具體例中，醫藥組成物動脈內投與，且因此以適用於動脈內投與之形式調配。在另一個具體例中，醫藥組成物肌肉內投與，且因此以適用於肌肉內投與之形式調配。

在另一個具體例中，藉由靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑投與本文所揭示之疫苗或組成物。適合液體調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在一個具體例中，醫藥組成物靜脈內投與，且因此以適用於靜脈內投與之形式調配。在另一個具體例中，醫藥組成物動脈內投與，且因此以適用於動脈內投與之形式調配。在另一個具體例中，醫藥組成物肌肉內投與，且因此以適用於肌肉內投與之形式調配。

在一個具體例中，本文所揭示之方法及組成物的疫苗可單獨或與醫藥學上可接受之載劑組合向宿主脊椎動物，較佳哺乳動物，且更佳人類投與。在另一個具體例中，疫苗以有效誘導針對李斯特菌屬菌株自身或李斯特菌屬物種已經修飾以表現之異源抗原之免疫反應的量。在另一個具體例中，待投與之疫苗或免疫原性組成物的量可由熟習此項技術者在擁有本發明時常規地測定。在另一個具體例中，醫藥學上可接受之載劑可包括(但不限於)無菌蒸餾水、鹽水、磷酸鹽緩衝溶液或碳酸氫鹽緩衝溶液。在另一個具體例中，所選擇的醫藥學上可接受之載劑及待使用之載劑的量將視數種因素而定，包括投與模式、李斯特菌屬之菌株及接種疫苗者之年齡及疾病病況。在另一個具體例中，疫苗之投與可藉由經口途徑，或其可為非經腸、鼻內、肌內、血管內、直腸內、腹膜內或多種熟知投與途徑中之任一者。在另一個具體例中，投與途徑可根據待治療之感染物或腫瘤的類型來選擇。

在另一個具體例中，本發明提供一種在個體中治療、遏制或抑制至少一種腫瘤之方法，其包含投與本文提供之免疫原性組成物。

在一些具體例中，以液體藥劑形式投與減毒細菌或減毒李斯特菌屬或ADXS31-265，且歷經30分鐘+/-10分鐘之時間段藉由IV輸注投與所選劑量之藥劑。

包含本文所揭示之抗PD-1抗體與本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株組合之組合療法的最佳藉由此等藥劑中之一或兩者的劑量遞增來鑑別。在另一個具體例中，包含本文所揭示之抗PD-1抗體或本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株之組成物的最佳劑量藉由此等藥劑中之一或兩者的劑量遞增來鑑別。

在一個具體例中，用本文所揭示之組合療法在12週週期中之第1週、第4週及第7週之第1天治療患者，開始於以50、100、150或200mg之起始劑量投與抗PD-1抗體及以介於約1×10⁷CFU至約3.5×10¹⁰CFU範圍內之起始劑量投與本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株。

在一個具體例中，首先投與抗PD-1抗體輸注，接著NSAIDS(例如萘普生(naproxen)或布洛芬(ibuprofen))，且在投與本文提供之活減毒李斯特菌屬菌株之前預定時間量內投與口服止吐藥物。在另一個具體例中，預定時間量為5-10分鐘、11-20分鐘、21-40分鐘、41-60分鐘。在另一個具體例中，預定時間量為至少一小時。在另一個具體例中，預定時間量為1-2小時、2-4小時、4-6小時、6-10小時。在另一個具體例中，在投與本文提供之活減毒李斯特菌屬菌株之前，視需要向個體重複投與NSAIDS(例如萘普生或布洛芬)及口服止吐藥物。

在另一個具體例中，以50、100、150或200mg之起始劑量Q3W投與抗PD-1抗體，且以介於1×10⁷與3.5×10¹⁰CFU之間的起始劑量Q3W投與本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株。

在另一個具體例中，以5×10⁹之起始劑量Q3W投與本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株，且以200mg之起始劑量Q3W投與抗PD-1抗體，且若患者不耐受組合之起始劑量，則將本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株的劑量減小至1×10⁹cfu Q3W，或將抗PD-1抗體之劑量減小至150mg Q3W。熟練技術人員應理解，如本文進一步提供的，基於個體對組合療法之反應，本文所揭示之組合療法之任何組分的劑量可遞增地調節至較低或較高劑量。

在一些具體例中，低於前述範圍之下限之劑量可為已足夠的，而在其他情況下仍可採用更大劑量，如由熟習此項技術者所確定。

在一些具體例中，治療週期自組合治療之第一天開始且持續至少12週、24週或48週。在共投與藥物之治療週期之任何天，本文所揭示之抗PD1抗體與活減毒李斯特菌屬菌株的單獨IV輸注之間的時間為約15分鐘至約45分鐘之間。本發明涵蓋，本文所揭示之抗PD-1抗體及活減毒李斯特菌屬菌株可以任何次序或藉由同時IV輸注投與。

在一些具體例中，在患者實現CR之後，投與組合療法持續至少2至4週。

在一些具體例中，針對利用本發明之組合療法之治療所選的患者已診斷出患有轉移性前列腺癌且患者已進展或變得對不超過 2種先前全身性治療方案具有抗性。在一些具體例中，針對利用本發明之組合療法之治療所選的患者已診斷出患有轉移性前列腺癌且患者已進展或變得對不超過3種先前全身性治療方案具有抗性。

本發明亦提供一種藥劑，其包含本文所揭示之PD-1拮抗劑及醫藥學上可接受之賦形劑。當PD-1拮抗劑為生物治療劑(例如mAb)時，拮抗劑可在此項技術中已知之產生用細胞株(諸如(但不限於)CHO細胞)中使用習知細胞培養及回收/純化技術來產生。

在一些具體例中，包含本文所揭示之抗PD-1抗體的藥劑可以液體調配物形式提供，或藉由在使用之前用注射用無菌水復原凍乾粉末來製備。WO 2012/135408描述適用於本發明之包含抗PD-1抗體之液體及凍乾藥劑的製備。在一些具體例中，包含抗PD-1抗體之藥劑提供於含有約50mg抗PD-1抗體之玻璃瓶中。

本發明亦提供一種藥劑，其包含本文所揭示之活減毒李斯特菌屬菌株及醫藥學上可接受之賦形劑。

本文所揭示之PD-1拮抗劑藥劑及活減毒李斯特菌屬菌株藥劑可以套組形式提供，該套組包含第一容器及第二容器及藥品說明書。第一容器含有至少一個劑量的包含抗PD-1抗體之藥劑，第二容器含有至少一個劑量的包含本文提供之活減毒李斯特菌屬菌株之藥劑，及藥品說明書或標籤，其包含用於使用藥劑治療患者前列腺癌之說明書。第一及第二容器可包含相同或不同形狀(例如小瓶、注射器及瓶子)及/或材料(例如塑膠或玻璃)。該套組可進一步包含可適用於投與藥劑之其他材料，諸如稀釋劑、過濾器、IV袋及管線、針及注射器。在該套組之一些具體例中，抗PD-1拮抗劑為抗PD-1抗體且說明書表明該等藥劑意欲用於治療患有藉由IHC分析對PD-L1表現測試呈陽性之前列腺癌的患者。

熟練技術人員應瞭解，如醫藥行業中已知，術語「包含」或其語法形式可涵蓋包括所指示之活性劑(諸如本發明之Lm菌株)以及包括其他活性劑(諸如抗體或其功能片段)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、潤膚劑、穩定劑等。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」可涵蓋僅有之活性成分為所指示之活性成分的組成物，然而，可包括用於穩定化、保存調配物等但不直接涉及所指示之活性成分的治療作用的其他化合物。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」可涵蓋經由不同於所指示活性成分之機制的機制發揮治療作用的組分。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」可涵蓋發揮治療作用且屬於不同於所指示之活性成分之化合物類別的化合物類別的組分。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」可涵蓋發揮治療作用且可能不同於所指示之活性成分，不同之處在於經由不同作用機制起作用的組分。在一些具體例中，術語「基本上由......組成」可涵蓋進活性成分釋放之組分。在一些具體例中，術語「組成」可涵蓋含有活性成分及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的組成物。

應理解，每當在本文中用語言「包含」描述具體例時，亦提供用術語「由......組成」及/或「基本上由......組成」所描述的在其他方面類似之具體例。

在一個具體例中，除非上下文另外明確指示，否則單詞之單數形式，諸如「一個」及「該」包括其相應複數參考物。

在本申請案通篇，本文所揭示之各種具體例可以範圍格式呈現。應瞭解，範圍格式中之描述僅為求方便及簡潔且不應解釋為對本發明範疇之固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能之子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍的描述應認為係已特定揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及彼範圍內之個別數值，例如1、2、3、4、5及6。不管範圍之寬度如何，此均適用。

每當在本文中指示數值範圍時，其均意圖包括所指示範圍內之任何引用數值(分數或整數)。短語「在第一指示數字與第二指示數字之間的範圍變化/範圍」以及「自第一指示數字至第二指示數字之範圍變化/範圍」在本文中互換使用且打算包括第一指示數字及第二指示數字以及其間的所有分數及整數數字。

熟練技術人員應瞭解，術語「約」在用於修飾數值界定之參數(例如PD-1拮抗劑之劑量或用本文所描述之組合療法治療時間之長度)時可涵蓋定量術語中參數相對於對該參數所陳述之數值加或減5%的變化，或在另一個具體例中，加或減10%的變化，或在另一個具體例中，加或減15%的變化，或在另一個具體例中，加或減20%的變化。舉例而言，PD-1拮抗劑的約200mg之劑量可在180mg與220mg之間變化。

熟練技術人員應理解，術語「個體」可涵蓋需要治療病狀或其後遺症之療法或對病狀或其後遺症敏感的包括成人或人類兒童、少年或青年之哺乳動物，且亦可包括非人類哺乳動物，諸如犬、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠。亦應瞭解術語可涵蓋家畜。術語「個體」不排除所有方面均正常之個體。

熟練技術人員應瞭解，出於治療之目的，術語「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括(但不限於)人類、家畜及農畜、以及動物園、運動或寵物動物，諸如犬(包括狗)、及馬、貓、牛、豬、綿羊等。

在以下實施例中，闡述眾多具體細節以便提供對本發明之透徹理解。然而，熟習此項技術者應瞭解，本發明可在無此等特定細節下實踐。在其他情況下，未詳細描述熟知方法、程序及組件，以免混淆本發明。因此，此等實施例決不應解釋為限制本發明之寬廣範疇。

實施例 材料及方法

pADV265.5

質體pAdv265.5之DNA序列包含(SEQ ID NO：16)。

序列圖例說明：

-正常大寫字母序列：hly啟動子。

- 斜體體大寫字母序列：p15來源。

-加粗大寫字母序列：t-LLO ORF。

- 斜體且帶下劃線之大寫字母序列 ：存活素。

小鼠

LSL-Kras ^G12D/+ ；LSL-Trp53 ^R172H/+ ；Pdx-1-Cre(KPC)小鼠如先前所描述產生(Hingorani SR等人Cancer Cell 2005 7：469)。實驗中所用之正常健康野生型同胎仔畜(LSL-Trp53 ^R172H/+ ,Pdx1-Cre)在KPC小鼠常規育種期間產生。自Jackson Laboratories訂購C57BL/6小鼠。所有動物方案皆由賓夕法尼亞州立大學(University of Pennsylvania)之動物照護及使用委員會研究所(Institute of Animal Care and Use Committee；IACUC)審查及核準，且收容在賓夕法尼亞州立大學之無病原體條件中。

皮下腫瘤模型

使6週齡雌性C57BL/6小鼠在動物設施中適應新環境一週，隨後進行腫瘤細胞移植。向小鼠皮下植入(s.c.)自維持繼代低於10次之KPC源性腫瘤細胞株獲得的200,000個細胞。每3-4天用測徑規縱向量測腫瘤。腫瘤體積以體積(V)=½(L×S²)計算，其中L=最長尺寸，且S=最短尺寸。對於整體存活率研究，當腫瘤達到1000mm³時，對小鼠進行安樂死。若小鼠變為瀕死或展現大於IACUC批准之動物方案中可允許之潰瘍，則亦對其進行安樂死。

收集來自小鼠之組織樣本

製備單細胞懸浮胰臟腫瘤：自在KPC小鼠中自發出現之原發性胰臟腫瘤採集腫瘤塊。將腫瘤絞碎成1×1mm塊，且與膠原蛋白酶(1mg/mL)及DNA酶I(75ug/mL，Roche #10104159001)一起在37℃及5% CO_{2下培育30分鐘。}使經過消化之腫瘤均質化，且穿過70μm過濾器，且用杜爾貝科氏經修飾伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium；DMEM)洗滌。

自脾臟製備單細胞懸浮液：切除脾臟且將其置放於補充有10%胎牛血清(FCS)之 DMEM中。隨後使脾臟溫和地均質化以產生單細胞懸浮液，其穿過70μM細胞過濾器，接著用ACK溶胞緩衝液(Cambrex/BioWhittaker)進行紅血球裂解。用補充有10% FCS之DMEM洗滌細胞。

自瘤周及腸系膜淋巴結(MLN)製備單細胞懸浮液：瘤周LN定義為以物理方式連接至KPC小鼠中之胰臟腫瘤的淋巴結。自腫瘤移除來自個別小鼠之瘤周LN，且合併以用於藉由在70μM細胞過濾器上溫和磨碎來均質化。切除腸系膜淋巴結，且藉由在70μM細胞過濾器上溫和磨碎來均質化。洗滌單細胞懸浮液，且將其再懸浮於補充有10% FCS之DMEM中。

李斯特菌屬感染及活體內抗體投與

單核球增多性李斯特菌(Lm)儲備液由Advaxis Inc.好心提供，LmddA-265(編碼人類存活素蛋白質)、ADXS11-001(編碼HPV-E7蛋白質)。對於腹膜內注射，在注射之前，洗滌Lm儲備液，且將其再懸浮於無菌PBS中。對小鼠腹膜內注射1×10⁸CFU之Lm，且第二免疫接種注射2×10⁸CFU之Lm。KPC小鼠接受1×10⁸CFU之1 Lm免疫接種。對於PD-1阻斷，將100μg之抗小鼠PD-1(純系RMP1-14；BioXCell BE0146)或對照2A3抗體(BioXCe1l BE0089)稀釋於無菌PBS中且腹膜內投與。

間接免疫螢光顯微鏡檢查

將組織在Tissue-Tek O.C.T.Compound(V.W.R.25608-930)中急驟冷凍，且儲存在-80℃下。冷凍組織切片由賓夕法尼亞州立大學癌症組織學中心(Cancer Histology Core)製備。對於PD-L1 及Her2染色，使組織樣本解凍，且立即在室溫下用3%緩衝甲醛固定5分鐘。隨後用PBST(含0.1% Tween-20之PBS)洗滌載片2次，每次洗滌持續2分鐘。隨後在室溫下用含10%山羊血清之PBS使載片阻斷45分鐘，接著在PBST中洗滌。將初級大鼠抗小鼠B7-H1抗體(純系MIH5；eBioscience14-5982-81)以1：50稀釋於10%山羊血清+PBST中。在室溫下進行初級抗體培育持續60分鐘。對於對照「無初級」抗體染色，將載片僅在10%山羊血清+TBST中培育。隨後洗滌載片，接著在室溫下與以1：200稀釋於10%山羊血清+PBST中之二級山羊抗大鼠AF488抗體(Life Technologies)一起培育30分鐘。用TBST洗滌載片。隨後在暗處用0.2ug/mL之DAPI(4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)溶液對載片進行對比染色持續八分鐘。洗滌載片，且用VECTASHIELD封固劑(Mounting Medium)(Vector Laboratories)進行封固。在Olympus IX83倒置顯微鏡上使用CellSensDigital成像軟體(Olympus)收集影像。相同暴露時間及獲取設定應用於所有影像以允許比較螢光。

免疫組織化學

將組織在Tissue-Tek O.C.T.Compound(V.W.R.25608-930)中急驟冷凍，且儲存在-80℃下。冷凍組織切片由賓夕法尼亞州立大學癌症組織學中心及賓夕法尼亞州立大學分子病理學成像中心(Molecular Pathology Imaging Core)製備。使組織樣本解凍，且立即在室溫下用3%緩衝甲醛固定15分鐘(對於CD45及m存活素染色)或在-20℃下用甲醇固定10分鐘(對於CD3、CD4、CD8及Foxp3染色)。隨後用PBST(含0.1% Tween-20之PBS)洗滌載片2次，每次洗滌持續2分鐘。在室溫下藉由在0.3%過氧化氫溶液(稀釋於蒸餾H₂O中)中培育載片10分鐘來阻斷內源性過氧化酶活性。如上文所描述洗滌載片。隨後在室溫下用含10%山羊血清之PBS使載片阻斷45分鐘。將以下初級抗體稀釋於含10%山羊血清之PBST中：大鼠抗小鼠CD45(純系30-F11；BD 550539)、以1：50稀釋之大鼠抗小鼠CD3抗體(純系KT3；Serotec/Bio-Rad MCA500GA)、以15ug/mL稀釋之大鼠抗小鼠CD4抗體(純系GK1.5；BioXCell)、以15ug/mL稀釋之大鼠抗小鼠CD8抗體(純系2.43；BioXCell)、以1：100稀釋之大鼠抗小鼠Foxp3抗體(純系FJK-16s；eBioscience 14-5773-82)、大鼠抗小鼠存活素(CST 71G4B7)。所有初級培育皆在4℃下進行隔夜。隨後在TBST中洗滌載片兩次，每次持續2分鐘。對於對照「無初級」抗體染色，將載片僅在10%山羊血清+TBST中培育。與以1：200稀釋於10%山羊血清+PBST中之二級生物素化山羊抗大鼠抗體(多株；BD 559286)一起培育在室溫下進行1小時。在PBS中洗滌載片2次，持續2分鐘。根據製造商之說明書製備VECTASTAIN ABC試劑(Vector Laboratories PK-6100)，且在室溫下施用於載片持續30分鐘。在PBS中洗滌載片2次。偵測用根據製造商說明書製備之DAB(3,3'-二胺基聯苯胺)HRP受質(Vector Laboratories SK-4100)來進行。在蒸餾H₂O中洗滌載片，且用以1：1稀釋於蒸餾H₂O中之蘇木精(Hematoxylin)(蘇木精染劑-哈里斯(Hematoxylin Stain-Harris)；Sigma-Aldrich HHS16)對比染色四十秒。用H₂O沖洗載片，且藉由依序用95%乙醇、100%乙醇及二甲苯洗滌來脫水。在乾燥之後，使用Cytoseal 60(Fisher 23-244257)對載片進行封固。在Olympus BX43顯微鏡上使用CellSens數位成像軟體(Olympus)獲取影像。量化藉由對在4個高倍視野(40×放大)中計數之陽性事件數目進行平均來進行。

產生腫瘤細胞株及細胞培養物

自在C57BL/6基因背景上回交之KPC小鼠中自發出現之原發性PDA腫瘤採集腫瘤塊。將腫瘤絞碎成1×1mm塊，且與膠原蛋白酶(1mg/mL)一起在37℃及5% CO_{2下培育30分鐘。}使經過消化之腫瘤均質化，且穿過70μm過濾器，且用DMEM洗滌。細胞以1600RPM旋轉5分鐘，且用DMEM洗滌2次。將細胞再懸浮於無血清培養基中，且以6孔培養盤上1-3×10⁶個細胞/孔之密度接種。在培養兩週之後，將細胞在補充有5%胎牛血清、1%L-麩醯胺及慶大黴素之DMEM中培養。在至少5次繼代之後，細胞用於活體外研究。對於細胞株之IFN-γ處理，在IFN-γ添加之前24小時，將細胞接種在12孔培養盤中。以100ng/mL添加小鼠重組IFN-γ(R&D 485 M1/CF)，且培育12-72小時。

流動式細胞量測術

針對細胞表面抗原之抗體及流動式細胞量測分析：流動式細胞量測分析PDA腫瘤細胞株藉由以下來進行：用0.05%胰蛋白酶/EDTA(Gibco Life Technologies)使黏附細胞解離，接著在DMEM及PBS中洗滌。如上文所描述製備來自組織樣本之單細胞懸浮液。向用於抗體培育之圓底96孔培養盤中添加1×10⁶個細胞。首先根據製造商說明書用活/死可固定水性死細胞染劑(Fixable Aqua Dead Cell Stain)(Life Technologies L34957)對細胞進行染色。以下抗體用於對表面抗原進行染色：1：400之MHC1 FITC(H-2Db純系KH95；BD 553573)、1：200之MHCII PE(I-A/I-E純系M5/115.15.2；BD 557000)、1：100之PD-L1 PE(純系MIH5；BD 558091)、1：150之CD3ζPerCP/Cy5.5(純系145-2C11；eBioscience 561008)、CD4 PE/Cy7 (純系GK1.5；eBioscience 25-0041-82)、1：200之CD44 APCe-Fluor 780(純系IM7；eBioscience 47-0441-80)、1：100之PD1 PE/Cy7(純系RMP1-30；Biolegend 109110)、1：150之CD8b PE(純系H35-17.2；eBio 53-0083-82)或1：100之CD8α Pacific Blue(純系53-6.7；eBio 48-0081082)、CD86(純系GL1；BD 553692；1：200)、CD40(純系30-F11；BD 553791；1：200)、1：800之CD45 APC(純系30-F11；BD 559864)或1：800之CD45 PE(純系30-F11；BD 553081)。所有抗體皆在FACS緩衝液(PBS+2% FCS+2mM EDTA)中稀釋，且在室溫下添加至細胞中持續20分鐘。將細胞再懸浮於FACS緩衝液中以用於在BD FACSCanto上分析。使用FloJo軟體(Tree Star Inc.)分析資料。

細胞內存活素染色：首先用活/死可固定水性死細胞染劑對細胞進行染色，隨後固定/滲透。Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組(eBioscience 00-5523-00)用於細胞內存活素染色。隨後根據製造說明書在室溫下且在暗處進行固定及滲透持續1小時。將初級大鼠抗小鼠存活素(CST 71G4B7)以1：200稀釋於滲透緩衝液中，且與細胞一起在室溫下培育20分鐘。「無初級」對照樣本中未添加初級抗體。用滲透緩衝液洗滌細胞2次。將二級生物素化山羊抗大鼠抗體(多株；BD 559286)以1：200稀釋於滲透緩衝液中，且在室溫下進行培育持續20分鐘。在滲透緩衝液中洗滌細胞2次。在室溫下向細胞中添加以1：300稀釋於滲透緩衝液中之抗生蛋白鏈菌素PE(BD 554061)持續20分鐘。在滲透緩衝液中洗滌細胞2次，接著在FACS緩衝液中洗滌。將細胞再懸浮於FACS緩衝液中以用於在BD FACSCanto上分析。使用FloJo軟體(Tree Star Inc.)分析資料。

統計學分析

用Prism軟體(GraphPad)進行統計學分析。皮下腫瘤生長曲線藉由在各時間點對各組小鼠取得平均腫瘤體積來計算。除非另外指出，否則p值使用史都登氏t測試(Student’s t-test)來計算，且F測試用於測定變量之相等性。使用對數等級測試(曼特爾-考克斯(Mantel-Cox)測試)來比較存活率曲線。

結果 實施例1：KPC小鼠及PDA細胞株中之HER2/NEU表現

使用誘導對Her2特異性肽具有特異性之T細胞的抗CD40治療，在KPC小鼠中出現之自發腫瘤中且在皮下植入之PDA細胞株中皆觀測到Her 2/Neu之高表現量(圖1A-D)。

實施例2：在小鼠中植入之PDA腫瘤的LM-LLO HER2/NEU處理

將7861.PDA細胞植入小鼠中。用Lm-LLO及Lm-LLO-cHER2處理所得腫瘤，且歷經20天時段觀測腫瘤大小。處理對腫瘤大小無明顯作用(圖2B及C)。

實施例3：在小鼠中植入之PDA腫瘤的預防性LM-LLO HER2/NEU及LM-LLO-CHER2處理

在PDA腫瘤移植之前用Lm-LLO及Lm-LLO-cHER2處理小鼠(圖3A)，且評估隨後植入之PDA腫瘤的生長。預防性治療對在小鼠中引入之7861.PDA細胞株源性腫瘤的生長無可觀測到之作用(圖3B)。

實施例4：PDA腫瘤之LM-LLO存活素及LM-LLO-E7處理刺激T細胞浸潤

檢測PDA腫瘤細胞之存活素表現，且發現其表現高量之存活素(圖4A)。檢測Lm-LLO-存活素處理對腫瘤生長及T細胞浸潤之作用。出乎意料地，儘管該處理明顯增加T細胞向在小鼠中確立之69.PDA細胞株源性腫瘤中的浸潤(圖4C及D)，但該處理對此等腫瘤之生長無作用(圖4B)。

實施例5：PD-L1/PD-1信號傳導在KPC小鼠腫瘤中很可能具有活性

研究PD-L1/PD-1信號傳導路徑之組分的表現。雖然小鼠腫瘤表現高量之PD-L1(圖5B)，但對比瘤周淋巴結，自腸系膜淋巴結分離之T細胞顯示高量之PD-1表現(圖5C)。

實施例6：腫瘤細胞之干擾素-γ處理誘導MHC及PD-L-1表現

監測IFN-γ處理對腫瘤細胞中MHC及PD-L1表現之作用。觀測到該處理強烈地刺激兩種分子之表現(圖6A-D)。

實施例7：PDA腫瘤及小鼠之組合LM-LLO-存活素-抗PD1處理

在小鼠中監測涉及Lm-LLO-存活素-抗PD1抗體之組合處理的作用。如在(圖7A)中所概述，用組合療法對小鼠進行預處理。觀測到腫瘤生長速率顯著降低(圖7B及C)且存活期延長(Fig.7D)。

儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵，但一般熟習此項技術者現將想到多種修改、替代、變化及同等物。因此，應瞭解，所附申請專利範圍意欲涵蓋如屬於本發明之真實精神內的所有此類修改及變化。

<110> 賓夕法尼亞大學董事會艾德凡斯公司

<120> PD-1拮抗劑與基於李斯特菌屬之疫苗的組合用於治療胰臟癌

<130> P-78765-TW

<150> 62/138,644

<151> 2015-03-26

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PEST胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GenBank寄存編號P13128

<400> 2

<210> 3

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LLO蛋白質之N端片段

<400> 3

<210> 4

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LLO片段

<400> 4

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 其中將預期存在PEST胺基酸序列之原核生物體

<400> 5

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 其中將預期存在PEST胺基酸序列之原核生物體

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 其中將預期存在PEST胺基酸序列之原核生物體

<400> 7

<210> 8

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 其中將預期存在PEST胺基酸序列之原核生物體

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PEST序列

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PEST序列

<400> 10

<210> 11

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼截短LLO蛋白質之重組核苷酸

<400> 11

<210> 12

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ActA蛋白質

<400> 12

<210> 13

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短ActA蛋白質

<400> 13

<210> 14

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短ActA蛋白質

<400> 14

<210> 15

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼截短ActA蛋白質之重組核苷酸

<400> 15

<210> 16

<211> 6235

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pAdv265.5之DNA序列

<400> 16

<210> 17

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類存活素蛋白質

<400> 17

<210> 18

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠存活素蛋白質

<400> 18

<210> 19

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼人類存活素蛋白質之核苷酸分子

<400> 19

<210> 20

<211> 425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼小鼠存活素蛋白質之核苷酸分子

<400> 20

<210> 21

<211> 1630

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼犬存活素蛋白質之核酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼犬存活素蛋白質之胺基酸序列

<400> 22

Claims

一種在個體中引起針對腫瘤或癌症之抗腫瘤或抗癌免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，由此在該個體中引起抗腫瘤或抗癌免疫反應。
如請求項1之方法，其中，該免疫抑制分子拮抗劑為抗體或其功能片段。
如請求項2之方法，其中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
如請求項1至3中任一項之方法，其中，該免疫抑制分子包含CD28/CTLA-4受體超家族之成員或B7受體家族之成員。
如請求項4之方法，其中，該CD28/CTLA-4受體超家族成員為PD-1。
如請求項4之方法，其中，該B7受體家族成員係選自由B7-1、PD-L1及PD-L2組成之群。
如請求項1至6中任一項之方法，其中，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子，其中該融合多肽包含與存活素抗原或其免疫原性片段融合的含PEST序列之多肽。
如請求項1至7中任一項之方法，其中，該存活素抗原由如SEQ ID NO：17中所闡述之核酸序列編碼。
如請求項1至8中任一項之方法，其中，該存活素抗原包含如SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列。
如請求項1至9中任一項之方法，其中，該核酸分子包含編碼代謝酶之第二開讀框，且其中該代謝酶與該重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。
如請求項10之方法，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項1至11中任一項之方法，其中，該核酸分子整合至該李斯特菌屬基因組中。
如請求項1至12中任一項之方法，其中，該核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中，且其中該質體穩定維持在缺乏抗生素選擇之該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項1至13中任一項之方法，其中，該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因中之突變。
如請求項1至14中任一項之方法，其中，該含PEST之多肽係選自由以下各者組成之群：N端李斯特菌溶胞素O(Listeriolysin O；LLO)片段、N端ActA片段及含PEST之肽。
如請求項1至15中任一項之方法，其中，該重組減毒李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌。
如請求項1至16中任一項之方法，其中，該重組減毒李斯特菌屬為ADXS31-265。
如請求項1至17中任一項之方法，其中，該個體為人類。
如請求項1至18中任一項之方法，其進一步包含投與非依賴性佐劑。
如請求項19之方法，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
如請求項1至20中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症包含胰臟腫瘤或癌症。
如請求項21之方法，其中，該癌症為惡性或反覆性癌症。
如請求項22之方法，其中，該惡性癌症為胰管癌。
如請求項23之方法，其中，該癌症為胰臟腺泡細胞癌或囊腺癌。
如請求項21之方法，其中，該癌症為胰臟神經內分泌腫瘤。
如請求項21之方法，其中，該癌症為胰島素瘤或胃泌素瘤。
如請求項1至26中任一項之方法，其中，該免疫抑制分子拮抗劑在投與該重組減毒李斯特菌屬菌株之前，與其並行或在其之後投與。
如請求項1至27中任一項之方法，其中，該投與包含至少兩次投與該組合療法。
如請求項1至28中任一項之方法，其進一步包含在該癌症復發或癌轉移後在該個體中投與該組合療法的步驟。
如請求項1至29中任一項之方法，其進一步包含投與該組合療法之任一組分或兩種組分的追加劑。
一種在個體中預防或治療腫瘤或癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中預防或治療存活素表現性腫瘤或癌症。
如請求項31之方法，其中，該免疫抑制分子拮抗劑為抗體或其功能片段。
如請求項32之方法，其中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
如請求項31至33中任一項之方法，其中，該免疫抑制拮抗劑分子包含CD28/CTLA-4受體超家族之成員或B7受體家族之成員。
如請求項34之方法，其中，該CD28/CTLA-4受體超家族成員為PD-1。
如請求項34之方法，其中，該B7受體家族成員係選自由B7-1、PD-L1及PD-L2組成之群。
如請求項31至36中任一項之方法，其中，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子，其中該融合多肽包含與存活素抗原或其免疫原性片段融合的含PEST序列之多肽。
如請求項31至37中任一項之方法，其中，該存活素抗原由如SEQ ID NO：17中所闡述之核酸序列編碼。
如請求項31至38中任一項之方法，其中，該存活素抗原包含如SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列。
如請求項31至39中任一項之方法，其中，該核酸分子包含編碼代謝酶之第二開讀框，且其中該代謝酶與該重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。
如請求項40之方法，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項31至41中任一項之方法，其中，該核酸分子整合至該李斯特菌屬基因組中。
如請求項31至42中任一項之方法，其中，該核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中，且其中該質體穩定維持在缺乏抗生素選擇之該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項31至43中任一項之方法，其中，該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因中之突變。
如請求項31至44中任一項之方法，其中，該含PEST之多肽係選自由以下各者組成之群：N端李斯特菌溶胞素O(LLO)片段、N端ActA片段及含PEST之胺基酸序列。
如請求項31至45中任一項之方法，其中，該重組減毒李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌。
如請求項31至46中任一項之方法，其中，該重組減毒李斯特菌屬為ADXS31-265。
如請求項31至47中任一項之方法，其中，該個體為人類。
如請求項31至48中任一項之方法，其進一步包含投與非依賴性佐劑。
如請求項49之方法，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
如請求項31至50中任一項之方法，其中，該腫瘤或癌症包含胰臟腫瘤或癌症。
如請求項51之方法，其中，該癌症為惡性或反覆性癌症。
如請求項52之方法，其中，該惡性癌症為胰管癌。
如請求項53之方法，其中，該癌症為胰臟腺泡細胞癌或囊腺癌。
如請求項54之方法，其中，該癌症為胰臟神經內分泌腫瘤。
如請求項55之方法，其中，該癌症為胰島素瘤或胃泌素瘤。
如請求項31至56中任一項之方法，其中，該免疫抑制拮抗劑分子在投與該包含該重組減毒李斯特菌屬菌株之組成物之前，與其並行或在其之後投與。
如請求項31至57中任一項之方法，其中，該投與包含至少兩次投與該組合療法。
如請求項31至58中任一項之方法，其進一步包含在該癌症復發或癌轉移後在該個體中投與該組合療法的步驟。
如請求項31至59中任一項之方法，其進一步包含投與該組合療法之任一組分或兩種組分的追加劑。
如請求項31至60中任一項之方法，其中，該治療產生無惡化存活期。
如請求項1至61中任一項之方法，其中，該方法包含在患有該腫瘤或癌症之個體中破壞對存活素之耐受性。
如請求項1至62中任一項之方法，其中，該方法包含在該個體中延遲癌轉移發作。
如請求項1至63中任一項之方法，其中，該方法包含延長患有該腫瘤或癌症之個體的存活期。
一種用於在個體中引起針對腫瘤或癌症之抗腫瘤或抗癌免疫反應的組合療法，該組合療法包含向該個體投與有效量的表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑的步驟，由此在該個體中引起抗腫瘤或抗癌免疫反應。
如請求項65之用途，其中，該免疫抑制分子拮抗劑為抗體或其功能片段。
如請求項66之用途，其中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
如請求項65至67中任一項之用途，其中，該免疫抑制分子包含CD28/CTLA-4受體超家族之成員或B7受體家族之成員。
如請求項68之用途，其中，該CD28/CTLA-4受體超家族成員為PD-1。
如請求項69之用途，其中，該B7受體家族成員係選自由B7-1、PD-L1及PD-L2組成之群。
如請求項65至70中任一項之用途，其中，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子，其中該融合多肽包含與存活素抗原或其免疫原性片段融合的含PEST序列之多肽。
如請求項65至71中任一項之用途，其中，該存活素抗原由如SEQ ID NO：17中所闡述之核酸序列編碼。
如請求項65至72中任一項之用途，其中，該存活素抗原包含如SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列。
如請求項65至73中任一項之用途，其中，該核酸分子包含編碼代謝酶之第二開讀框，且其中該代謝酶與該重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。
如請求項74之用途，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項65至75中任一項之用途，其中，該核酸分子整合至該李斯特菌屬基因組中。
如請求項65至76中任一項之用途，其中，該核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中，且其中該質體穩定維持在缺乏抗生素選擇之該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項65至77中任一項之用途，其中，該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因中之突變。
如請求項65至78中任一項之用途，其中，該含PEST之多肽係選自由以下各者組成之群：N端李斯特菌溶胞素O(LLO)片段、N端ActA片段及含PEST之肽。
如請求項65至79中任一項之用途，其中，該重組減毒李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌。
如請求項65至80中任一項之用途，其中，該重組減毒李斯特菌屬為ADXS31-265。
如請求項65至81中任一項之用途，其中，該個體為人類。
如請求項65至82中任一項之用途，其進一步包含投與非依賴性佐劑。
如請求項20之用途，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
如請求項65至84中任一項之用途，其中，該腫瘤或癌症包含胰臟腫瘤或癌症。
如請求項85之用途，其中，該癌症為惡性或反覆性癌症。
如請求項86之用途，其中，該惡性癌症為胰管癌。
如請求項87之用途，其中，該癌症為胰臟腺泡細胞癌或囊腺癌。
如請求項88之用途，其中，該癌症為胰臟神經內分泌腫瘤。
如請求項89之用途，其中，該癌症為胰島素瘤或胃泌素瘤。
如請求項65至90中任一項之用途，其中，該免疫抑制分子拮抗劑在投與該重組減毒李斯特菌屬菌株之前，與其並行或在其之後投與。
如請求項65至91中任一項之用途，其中，該投與包含至少兩次投與該組合療法。
如請求項65至92中任一項之用途，其進一步包含在該癌症復發或癌轉移後在該個體中投與該組合療法的步驟。
如請求項65至93中任一項之用途，其進一步包含投與該組合療法之任一組分或兩種組分的追加劑。
一種組合療法用於在個體中預防或治療腫瘤或癌症之用途，該用途包含向該個體投與有效量的包含表現存活素抗原之重組李斯特菌屬菌株及免疫抑制分子拮抗劑之組合療法的步驟，其中該投與在該個體中預防或治療存活素表現性腫瘤或癌症。
如請求項95之用途，其中，該免疫抑制分子拮抗劑為抗體或其功能片段。
如請求項96之用途，其中，該抗體或其片段包含多株抗體、單株抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體(SCA)或其任何組合。
如請求項95至97中任一項之用途，其中，該免疫抑制拮抗劑分子包含CD28/CTLA-4受體超家族之成員或B7受體家族之成員。
如請求項98之用途，其中，該CD28/CTLA-4受體超家族成員為PD-1。
如請求項99之用途，其中，該B7受體家族成員係選自由B7-1、PD-L1及PD-L2組成之群。
如請求項95至100中任一項之用途，其中，該重組李斯特菌屬菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸分子，其中該融合多肽包含與存活素抗原或其免疫原性片段融合的含PEST序列之多肽。
如請求項95至101中任一項之用途，其中，該存活素抗原由如SEQ ID NO：17中所闡述之核酸序列編碼。
如請求項95至102中任一項之用途，其中，該存活素抗原包含如SEQ ID NO：19中所闡述之胺基酸序列。
如請求項95至103中任一項之用途，其中，該核酸分子包含編碼代謝酶之第二開讀框，且其中該代謝酶與該重組李斯特菌屬菌株之染色體中的突變互補。
如請求項104之用途，其中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
如請求項95至105中任一項之用途，其中，該核酸分子整合至該李斯特菌屬基因組中。
如請求項95至106中任一項之用途，其中，該核酸分子在該重組李斯特菌屬菌株中之質體中，且其中該質體穩定維持在缺乏抗生素選擇之該重組李斯特菌屬菌株中。
如請求項95至107中任一項之用途，其中，該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因中之突變。
如請求項95至108中任一項之用途，其中，該含PEST之多肽係選自由以下各者組成之群：N端李斯特菌溶胞素O(LLO)片段、N端ActA片段及含PEST之胺基酸序列。
如請求項95至109中任一項之用途，其中，該重組減毒李斯 特菌屬為單核球增多性李斯特菌。
如請求項95至110中任一項之用途，其中，該重組減毒李斯特菌屬為ADXS31-265。
如請求項95至111中任一項之用途，其中，該個體為人類。
如請求項95至112中任一項之用途，其進一步包含投與非依賴性佐劑。
如請求項113之用途，其中，該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
如請求項95至114中任一項之用途，其中，該腫瘤或癌症包含胰臟腫瘤或癌症。
如請求項115之用途，其中，該癌症為惡性或反覆性癌症。
如請求項116之用途，其中，該惡性癌症為胰管癌。
如請求項117之用途，其中，該癌症為胰臟腺泡細胞癌或囊腺癌。
如請求項118之用途，其中，該癌症為胰臟神經內分泌腫瘤。
如請求項119之用途，其中，該癌症為胰島素瘤或胃泌素瘤。
如請求項95至120中任一項之用途，其中，該免疫抑制拮抗劑分子在投與該包含該重組減毒李斯特菌屬菌株之組成物之前，與其並行或在其之後投與。
如請求項95至121中任一項之用途，其中，該投與包含至少兩次投與該組合療法。
如請求項95至122中任一項之用途，其進一步包含在該癌症復發或癌轉移後在該個體中投與該組合療法的步驟。
如請求項95至123中任一項之用途，其進一步包含投與該組合療法之任一組分或兩種組分的追加劑。
如請求項95至124中任一項之用途，其中，該治療產生無惡化存活期。
如請求項95至125中任一項之用途，其中，該用途包含在患有該腫瘤或癌症之個體中破壞對存活素之耐受性。
如請求項95至126中任一項之用途，其中，該用途包含在該個體中延遲癌轉移發作。
如請求項95至127中任一項之用途，其中，該用途包含延長患有該腫瘤或癌症之個體的存活期。