KR101667227B1 - 인간화된 ｋ33ｎ 단일 클론 항체의 제조, 발현 및 해석 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 α9 인테그린을 면역 특이적으로 인지하는 인간화된 항체를 제공한다. 상기 항체들 중 일부는 α9 인테그린의 생물학적 기능을 저해함으로써, 암, 예컨대 암 세포의 증식 또는 전이, 및 염증 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 진성 당뇨병, 암 전이, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론 질환), 자기면역 질환 등에 대해 치료학적 효과를 나타낸다.

Description

인간화된 Ｋ33Ｎ 단일 클론 항체의 제조, 발현 및 해석{GENERATION, EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF THE HUMANIZED K33N MONOCLONAL ANTIBODY}

본 발명은 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 인간화된 항체, 및 암, 염증성 질환, 자기면역 질환, α9 인테그린에 의해 유도되는 질환 상태 등의, α9 인테그린과 관련있거나 또는 α9 인테그린이 관여하는 다양한 질환 또는 장애에 대한 치료 및 진단에 있어서의 상기 항체의 사용에 관한 것이다.

세포는 인테그린이라고 하는 일군의 세포 표면 수용체를 통해 세포외 매트릭스(이하, ECM으로 약칭함)와 접착한다. 인테그린은 α쇄와 β쇄로 이루어진 1:1 이형이량체를 형성함으로써 그 기능을 수행한다. 지금까지, 적어도 18 종의 α쇄와, 8 종의 β쇄, 그리고 24 종의 αβ 이형이량체가 동정되었고, 확인되었다. 각각의 인테그린은 특이적인 리간드를 인지하는 것으로 알려져 있다. 인테그린은 리간드 특이성이나 기능에 따라 서브 패밀리로 분류되며, 콜라겐 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴이나 비트로넥틴 등에 존재하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 인지하는 RGD 수용체 및 백혈구에만 존재하는 백혈구에 특이적인 수용체로 나눌 수 있다(Hynes, R. O., 2002, Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87; Miyasaka, M., 2000, New edition of Adhesion Molecule Handbook, Shujunsya). α4 인테그린과 α9 인테그린은 이러한 타입의 어디에도 속하지 않는 서브 패밀리에 속하는 것으로서, α4 인테그린 서브 패밀리로 지칭된다(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D., 1993, Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of β1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology, 123: 1289-97). 한편, ECM은 세포들 간을 고정하는 물질로서 기능하는 것에 지나지 않는 것으로 간주되었다. 그러나, 현재, 인테그린-매개의 ECM-세포 상호작용이 세포의 증식, 접착, 이동 등을 조절하는데 상당히 관여하며, 암의 진행, 염증의 악화 등의 질환 개시와 관련있는 것으로 밝혀지고 있다.

예를 들어, ECM 중 하나인 오스테오폰틴(이하, OPN으로 약칭함)은, 분자량이 약 41 kDa인, 분비형의 산성 인산화 당단백질로서, 모유, 뇨, 뇨세관, 파골세포, 골모세포, 대식세포, 활성화된 T세포, 종양 조직 등에서의 광범위한 발현이 관찰되고 있는 분자이다. OPN은 분자의 중심에 접착 서열들, 즉 GRGDS(서열번호 1), 인간 OPN의 경우 SVVYGLR(서열번호 2) 서열, 마우스 OPN의 경우 SLAYGLR(서열번호 3) 서열과, 이에 상당히 근접한 위치에 트롬빈-절단 부위를 가지고 있으며, OPN은 GRGDS(서열번호 1) 서열을 통해 RGD 인테그린에 결합하거나, 또는 SVVYGLR(서열번호 2) 서열 또는 SLAYGLR(서열번호 3) 서열을 통해 α4(α4β1) 인테그린 및 α9(α9β1) 인테그린에 결합한다.

WO 02/081522호는 OPN 넉아웃 마우스 또는 OPN에 대한 중화 항체의 사용에 의한 OPN의 기능 저해를 통한, 류마티스 관절염 또는 간염 치료 효과를 기술하고 있다. 또한, 상기 문헌에는, SVVYGLR(서열번호 2) 서열이, α9 인테그린 및 α4 인테그린을 인지하기 때문에, 염증성 질환의 발병에 필연적이며, OPN 수용체가 면역적격(immunocompetent) 세포 등에서 발현되며, 염증성 질환과 관련있다고 기술되어 있다.

결합 프로파일에서의 차이를 통해, α4β1은 트롬빈으로 절단되지 않은 OPN(미절단형 OPN)과 트롬빈으로 절단된 OPN의 N 말단 단편(절단형 OPN) 둘다에 결합하지만, α9β1은 절단형 OPN에만 결합하는 것이 확인되었다(Y. Yokosaki, et al., (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274: 36328-36334; P. M. Green, et al., (2001) FEBS Letters, 503: 75-79; S. T. Barry, et al., (2000) Experimental Cell Research, 258: 342-351).

α4 인테그린과 α9 인테그린은 OPN 이외에도 많은 리간드들을 공유하고 있다. 공지된 리간드로는 피브로넥틴의 EDA 도메인, 프로펩타이드-폰 빌레브란트 인자(pp-vWF), 조직 트랜스글루타미나제(tTG), 혈액 응고 인자 XIII, 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM-1) 등을 들 수 있다. 또한, 피브로넥틴의 CS-1 도메인, MadCAM-1(α4β7) 등도 α4 인테그린에 의해 특이적으로 인지되는 리간드인 것으로 알려져 있다. 테나신-C, 플라스민 등은 α9 인테그린에 의해 특이적으로 인지되는 리간드인 것으로 알려져 있다.

인테그린 서브 유닛들, 즉 α9, α4 및 β1의 아미노산 서열들이 공지되어 있다. 예를 들면, 인간 α9은 NM_002207로, 마우스α9은 NM_133721로, 인간α4는 NM_000885로, 마우스α4는 NM_010576으로, 인간 β1은 X07979로, 마우스 β1은 NM_010578로, GenBank에 등록되어 있다. 이들 인테그린은 종 간 아미노산 서열 유사성이 높은 것으로 알려져 있다.

현재, 암, 염증성 질환 및 자기면역 질환을 치료하기 위한 많은 종류의 약물들이 알려져 있지만, 암, 염증성 질환 및 자기면역 질환에 대한 치료 효과가 보다 개선된 예방제 및/또는 치료제 등의 개발이 요구되고 있다. 본 발명은 부분적으로는 α9 인테그린에 대한 특이적인 저해 항체가 암 억제 효과 및 항염증 효과가 있다는 본 발명자들의 발견을 기초로 한다.

지금까지, 본 발명자들은, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하며, 하이브리도마 클론 K33N(수탁 번호 FERMBP-10830)에 의해 생산되는, 마우스 단일 클론 항체를 분리하였다. 본원에서, 상기 하이브리도마 클론의 명칭은, 클론에 의해 생산되는 단일 클론 항체의 명칭과 공통적으로 사용한다. 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체는 IgG1 아이소타입이다. 또한, 상기 단일 클론 항체는 인간 및/또는 마우스의 α9 인테그린과 오스테오폰틴 등의 α9 인테그린의 리간드 간의 결합을 저해한다. 즉, 상기 항-α9 인테그린 항체는 α9 인테그린의 기능을 저해하며, 예컨대 암 세포의 증식 또는 전이 등의, 암과, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론 질환), 자기면역 질환, α9 인테그린에 의해 유도되는 질환 상태 등의, 염증성 질환에 대해, 치료 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 항-α9 인테그린 항체는 개체에서 α9 인테그린 발현의 존재 및 발현 수준 검출하고, 그것에 의해 α9 인테그린이 관여하는 장애 또는 질환을 진단하기 위한, 생체내 진단제로서 사용할 수 있다.

그러나, 단일 클론 항체는 마우스 유래이기 때문에, 인간에 있어서는 그 면역원성으로 인해 부작용이 발생할 수 있으며, 이러한 이유로 인간에서 진단용 또는 치료용으로 직접 사용하는데에는 걸림돌이 되고 있다. 면역원성을 낮추기 위해, 본 발명자들은 오리지날 마우스 항-α9 인테그린 항체에 의해 나타나는 활성과 동등한 생물학적 활성을 가지고 있는, 상기 오리지날 항체로부터 유래된, 인간화된 항체를 제조하였다.

즉, 본 발명은, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 일부는 비-인간 기원으로부터 유래되고, 일부는 인간 기원으로부터 유래된, 항원 결합 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, K33N 단일 클론 항체 등의 비-인간 소스(공여체)로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 소스(수여체)로부터 유래된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 α9 인테그린과 인간 α9 인테그린의 리간드 간의 결합을 저해한다.

구체적인 구현예에서, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 인간 중쇄(H-쇄)의 가변 영역(V 영역)으로부터 유래되는 하나 이상의 H-쇄 FR(FRH)와, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 비-인간 항체 K33N의 CDRH들 중 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 H-쇄 상보성 결정 영역(CDRH)을 포함하는 중쇄(H-쇄); 또는 (ii) 인간 경쇄(L-쇄)의 V 영역으로부터 유래되는 하나 이상의 L-쇄 FR(FRL)와, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 비-인간 항체 K33N의 CDRL들 중 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 L-쇄 상보성 결정 영역(CDRL)을 포함하는 경쇄(L-쇄); 또는 상기의 (i)과 (ii) 둘다를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 항체의, CDRH 중 적어도 1개 및/또는 CDRL 중 적어도 1개가 유래되어진, 상기 비-인간 항체는, 수탁 번호 FERMBP-10830의 하이브리도마에 의해 생산되는 단일 클론 항체이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 인간 FRH로부터 유래되는 하나 이상의 FRH와, 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDRH; 또는 (ii) 인간 FRL로부터 유래되는 하나 이상의 FRL과, 서열번호 11, 12 및 13의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDRL; 또는 (iii) 상기의 (i)과 (ii) 둘다를 포함한다. 본 발명의 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 포함하는, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3를 포함할 수도 있다. 다른 구현예로, 본 발명의 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 11, 12 및 13의 아미노산 서열을 포함하는, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 각각, 서열번호 4, 5, 6, 11, 12 및 13의 아미노산 서열을 포함하는, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, GenBank 등재 번호 DA980102(서열번호 18)에 의해 코딩된 인간 H-쇄의 가변 영역으로부터 유래되는 FRH, 또는 GenBank 등재 번호 X72441(서열번호 23)에 의해 코딩된 인간κ-L-쇄의 가변 영역으로부터 유래되는 FRL을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체의 FRH는, 서열번호 19, 20, 21 및 22의 아미노산 서열(각각 DA980102내 대응되는 영역에 의해 코딩되는 FRH1, FRH2, FRH3 및 FRH4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체의 FRL는, 서열번호 24, 25, 26및 27의 아미노산 서열(각각 X72441의 대응되는 영역에 의해 코딩되는 FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 H-쇄 가변 영역(VH 영역); 또는 (ii) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 L-쇄 가변 영역(VL 영역); 또는 (iii) 상기의 (i)과 (ii) 둘다를 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, (i) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 γ-1 H-쇄; 또는 (ii) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 κL-쇄; 또는 (iii) 상기의 (i)과 (ii) 둘다를 포함한다.

또한, 본 발명은 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은, 서열번호 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 H-쇄, 또는 서열번호 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 L-쇄, 또는 상기 인간화 H-쇄와 상기 인간화 L-쇄 둘다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구체적인 구현예에서, 이와 같이 분리된 핵산 분자는, VH 영역을 코딩하는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체적인 구현예에서, 이와 같은 분리된 핵산 분자는, VL 영역을 코딩하는 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체적인 구현예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는, 서열번호 28 및 30 둘다의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체적인 구현예에서, 이와 같은 분리된 핵산 분자는 γ-1 H-쇄를 코딩하는 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 37의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체적인 구현예에서, 이와 같은 분리된 핵산 분자는 κL-쇄를 코딩하는 서열번호 38의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 39의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체적인 구현예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는, 서열번호 36과 38 둘다의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체적인 구현예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 예를 들면, 각각, 서열번호 10 및 17의 아미노산 서열 등의 공여체 기원의 신호 펩타이드 또는 이종 기원의 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

또한, 본 발명은, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의, H-쇄, L-쇄 또는 이 둘다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예컨대, 발현 벡터를 제공한다. 상기 벡터에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 조절 요소와 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 CDR가 유래되어진 비-인간 공여 항체의 천연 신호 펩타이드 또는 이종 기원의 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터 등의, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 인간화된 H-쇄를 코딩하는 제1 핵산 분자와 본 발명의 인간화된 L-쇄를 코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는, 분리된 숙주 세포를 제공하며, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 본 발명의 생물학적으로 기능적인 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 발현되는 방식으로 각각 조절 인자에 작동가능하게 연결되어 있다.

따라서, 본 발명은, 또한, 인간화된 항체가 발현되는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생산된 인간화된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 인간화된 항체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 인간화된 항체 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은, 본 발명의 인간화된 항체 하나 이상과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, α9 인테그린과 관련있는 장애나 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 전술한 어떠한 조성물도 상기 장애나 질환을 상가적으로 또는 상승적으로 개선할 수 있는 다른 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 활성 물질로는 항-염증 화합물, 화학치료 화합물 등과, 예컨대 인간 α4 인테그린에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 같은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

다른 구현예에서, 본 발명은, α9 인테그린과 관련있거나 또는 α9 인테그린이 관여하는 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 본 발명의 인간화된 항체 하나 이상을 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이를 위해, 본 발명의 인간화된 항체는 인간화된 항체의 생물학적 효과를 강화하는 치료학적 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 치료학적 모이어티의 예로는, (예를 들면, 이중 특이성 항체를 형성하기 위한) 항-α4 항체 등의 다른 항체, 세포 증식 억제성 또는 세포 파괴성 세포 독소, 방사성 원소, 및/또는 항-염증제, 항생 물질 등의 그외 치료제를 들 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 개체에서 α9 인테그린과 관련있거나 또는 α9 인테그린이 관여하는 질환 또는 장애를 진단하는 방법으로서, 진단학적 유효량의 본 발명의 인간화된 항체를 검사 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이를 위해, 본 발명의 인간화된 항체는 방사성 원소 등의 검출가능한 마커로 표지할 수도 있다.

3.1. 정의

본 명세서에서, 용어 "항체"는 α9 인테그린과 같이 원하는 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 항체 분자를 지칭하며, 완전한 항체 분자나 또는 항원 결합 단편 등의 이의 단편을 포함한다.

본원에서 "면역 특이적으로 인지한다"라는 표현은, 타겟 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 인간 α9 인테그린에 대한, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 특이적인 결합력을 지칭한다. 이러한 항체는 다른 폴리펩타이드나 단백질에는 비특이적으로 결합하지 않는다. 그러나, 타겟 폴리펩타이드나 단백질(예, 인간 α9 인테그린)에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 다른 항원들과 교차 반응할 수도 있다. 예를 들어, 인간 α9 인테그린을 면역 특이적으로 인지하는 본 발명의 인간화된 항체 또는 항원 결합 단편은, 예컨대 다른 종의 α9 인테그린과 교차 반응할 수도 있다. 바람직하게는, 인간 α9 인테그린과 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 다른 항원들에 대해 교차 반응하지 않는다.

본원에서 용어 "항원 결합 단편"은, 타겟 폴리펩타이드나 단백질, 특히, 인간 α9 인테그린 및/또는 비-인간 α9 인테그린과 면역 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고 있는, 항체의 임의 단편을 지칭하며, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, 다이설파이드-결합된 Fv, 및 타겟 폴리펩타이드 또는 단백질과 특이적으로 결합하는 경쇄(VL)의 가변 영역 및/또는 중쇄(VH)의 가변 영역 또는 심지어 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단편을 포함한다. 즉, 인간화된 항체의 이러한 항원 결합 단편은 일부분의 또는 전체 길이의 인간 불변 영역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 전술한 항체 단편을 수득하기 위한 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.

본원에서 "인간 소스로부터 유래된" 또는 "비-인간 소스로부터 유래된"이라는 표현은, 항체의 일부 아미노산 서열이 인간 항체 또는 비-인간 항체에서 대응되는 영역으로부터 유래된 것을 의미한다.

본원에서, 용어 "억셉터(acceptor) 서열"은 통상적으로 비-인간 항체인 공여 항체로부터 유래된 CDR에 대해 억셉터로서 작용하는, 인간 항체 VH 영역 또는 VL 영역으로부터 유래되는 프레임워크 영역의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다.

도 1은 항-인간 α9 인테그린 항체(즉, 본 발명의 2개의 클론(즉, K33N 및 M35A), 5개의 다른 클론(1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 및 28S1), 및 Y9A2)의 세포 접착 저해 활성을, 인간 α9 인테그린 발현 세포(인간 흑색종 세포 G361)와 OPN α9 인테그린 결합 부위 펩타이드(SVVYGLR)를 이용하여 측정한 실험 결과를 나타낸 것이다. 인간 오스테오폰틴에 대한 단일 클론 항체(5A1)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 항-인간 α9 인테그린 항체(즉, 본 발명의 2개의 클론(즉, K33N 및 M35A), 5개의 다른 클론(1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 및 28S1), 및 Y9A2)의 세포 접착 저해 활성을, 인간 α9 인테그린 발현 세포(인간 흑색종 세포 G361)와 테나신 C 단편의 α9 인테그린 결합 부위 펩타이드를 이용하여 측정한 실험 결과를 나타낸 것이다. 인간 오스테오폰틴에 대한 단일 클론 항체(5A1)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3은 마우스 K33N VH cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 7)과 추정한 아미노산 서열(서열번호 8)을 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열(서열번호 10)은 이탤릭체로 표시한다. 성숙 VH의 N 말단 아미노산 잔기(Q)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)의 정의에 따른, CDR 서열은 밑줄로 표시된다.
도 4는 마우스 K33N VL cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 14)과 이의 추정되는 아미노산 서열(서열번호 15)을 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열(서열번호 17)은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙 VL의 N 말단 아미노산 잔기(D)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 표시된다.
도 5는 SpeI 부위와 HindIII 부위(밑줄)가 양측에 있도록 디자인된 K33N H(ChK33N H) 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 32)과 이의 추정되는 아미노산 서열(서열번호 8)을 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열(서열번호 10)은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙 VH의 N 말단 아미노산 잔기(Q)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 표시된다. 인트론 서열은 이탤릭체로 표시한다.
도 6은 NheI 부위와 EcoRI 부위(밑줄)가 양측에 있도록 디자인된 K33N VL(ChK33N VL) 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 33)과 이의 추정되는 아미노산 서열(서열번호 15)을 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열(서열번호 17)은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙 VL의 N 말단 아미노산 잔기(D)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 표시된다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 7은 pChK33N 및 pHuK33N(총칭하여 발현 벡터라 함)의 도식적인 구조를 나타낸 것이다. 플라스미드에는, 가장 위 SalI 부위에서부터 시계 방향으로, 항체 중쇄 유전자의 전사를 개시하기 위한 인간 사이토메가로위르스(CMV) 주요 전 초기 프로모터 및 인핸서(CMV 프로모터)로부터 시작되는 중쇄 전사 유닛이 포함되어 있다. CMV 프로모터 다음으로 VH 엑손과, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 엑손과 개재된 인트론을 포함하는, 인간 γ-1 중쇄 불변 영역을 함유하는 게놈 서열이 배치되어 있고, CH3 다음에 mRNA 프로세싱을 위한 γ-1 유전자의 폴리아데닐화 부위가 배치되어 있다. 중쇄 유전자 서열 다음에, 경쇄 전사 유닛이 CMV 프로모터에서 시작하여, VL 엑손과 인간 κ쇄 불변 영역 엑손(CL)을 앞에 위치하는 인트론 일부와 함께 포함하는 게놈 서열, 및 κ유전자의 폴리 A 신호가 배치되어 있다. 다음으로, 경쇄 유전자 다음에, SV40 초기 프로모터(SV40 프로모터), 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt) 및 SV40 폴리아데닐화 부위(SV40 폴리(A) 부위)를 포함하는 세그먼트가 배치되어 있다. 마지막으로, 플라스미드에는, 박테리아 복제 오리진(pUC ori)과 β-락타마제 유전자(β-락타마제)로 구성된, 플라스미드 pUC19의 일부가 포함되어 있다.
도 8은 K33N VH(서열번호 9), 인간화된 K33N(HuK33N) VH(서열번호 29) 및 GenBank 등재 번호 DA980102의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열으로부터 유래된, 인간 억셉터 서열의 FRH1(서열번호 19), FRH2(서열번호 20), FRH3(서열번호 21) 및 FRH4(서열번호 22)의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 서열 상의 숫자는 Kabat 등(1991)에 따른 위치를 나타낸다. Kabat 등(1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 이중 밑줄 친 잔기는 CDR과 접촉할 것으로 예측되며, 인간화된 형태에서는 이 위치들에는 마우스 잔기가 유지된다. 인간 VH 서열내 이 위치에서는, 비전형적인 DA980102의 82번 Met(밑줄)가 전형적인 잔기 Leu로 치환되어, 잠재적 면역원성을 낮추었다. DA980102에서 CDR 잔기는 도면에서 생략하였다.
도 9는 K33N VL(서열번호 16), 인간화된 K33N(HuK33N) VL(서열번호 31) 및 GenBank 등재 번호 X72441의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열으로부터 유래되는, 인간 억셉터 서열의 FRL1(서열번호 24), FRL2(서열번호 25), FRL3(서열번호 26) 및 FRL4(서열번호 27)의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 서열 상의 숫자는 Kabat 등(1991)에 따른 위치이다. Kabat 등(1991)에 따라 정의된 CDR 서열은 밑줄로 표시된다. 이중 밑줄친 잔기는 CDR와 접촉하게 될 것으로 예상되며, 인간화된 형태에서는 이 위치에는 마우스 잔기가 유지된다. X72441내 CDR 잔기는 도면에서 생략하였다.
도 10은 HuK33N VH 유전자의 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드이다.
도 11은 HuK33N VL 유전자의 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드이다.
도 12는 HuK33N VH 유전자의 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드이다. 화살표시는 각 올리고뉴클레오티드의 위치와 방향(5' -> 3')을 표시한다. VH 영역(서열번호 29)의 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다.
도 13은 HuK33N VL 유전자의 구축에 사용된 올리고뉴클레오티드이다. 화살표시는 각 올리고뉴클레오티드의 위치와 방향(5' -> 3')을 표시한다. VL 영역(서열번호 31)의 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다.
도 14는 SpeI 부위와 HindIII 부위(밑줄)가 양측에 있는, HuK33N VH 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 34)을, 신호 펩타이드(서열번호 58; 이탤릭체로 표시)와 VH 영역(서열번호 29)의 추정 아미노산 서열과 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙 VH의 N 말단 아미노산 잔기(Q)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 15는 NheI 부위와 EcoRI 부위(밑줄)가 양측에 있는, HuK33N VL 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 35)을, 신호 펩타이드(서열번호 59; 이탤릭체임) 및 VL 영역(서열번호 31)의 추정 아미노산 서열과 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙 VL의 N 말단 아미노산 잔기(D)는 이중 밑줄로 표시된다. Kabat 등(1991)의 정의에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 16은 키메라 K33N 항체와 인간화된 K33N 항체의 인간 α9 인테그린 친화성을 비교한 것이다. 1 ㎍/mL 및 0.5 ㎍/mL의 키메라 K33N 및 인간화된 K33N의 CHO/9 세포의 결합성을 세포 ELISA로 조사하였다. 실험은 3세트로 실시하였다. 도면에 흡광도의 평균값과 표준 오차를 함께 나타낸다.
도 17은 HuK33N 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열 분석에 사용한 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 44-50)을 나타낸 것이다.
도 18은 pHuK33N내 HuK33N γ-1 중쇄 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 36)을 이의 추정되는 아미노산 서열(서열번호 37)과 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 종결 코돈은 "·"으로 표시한다.
도 19는 pHuK33N내 HuK33N κ 경쇄 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 38)을 이의 추정되는 아미노산 서열(서열번호 39)과 함께 나타낸 것이다. 아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타낸다. 종결 코돈은 "·"으로 나타낸다.
도 20은 정제된 항체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 6 ㎍의 키메라 IgG1/κ 항체 및 인간화된 IgG1/κ 항체(각각, ChK33N 및 HuK33N라 함)를, Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)에 따라, 환원 조건 하 SDS 존재 하에 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 광역 단백질 마커(MW; New England Biolabs, Ipswich, MA)를 크기 마커로 사용하였다. 우측에 나타내는 숫자는 마커의 크기를 킬로달톤(kDa) 단위로 나타낸 것이다.
도 21은 인간 α9 인테그린에 대한 마우스 K33N 항체의 결합을 FACS로 분석한 결과이다. 1.67 ㎍/mL에서 시작하여 연속 3배수 희석한 다양한 농도의 마우스 K33N 항체에 대해 CHO/huα9 세포 결합을 테스트하였다. 도에, 테스트한 각 항체 농도(X 축)에서의 기하 평균 채널 형광 값(MCF; Y 축)을 표시하였다. EC₅₀ 값을 GraphPad Prism(GraphPad Software, SanDiego, CA)을 사용하여 산출하였다.
도 22는 인간 α9 인테그린에 대한 키메라 K33N 항체와 인간화된 K33N 항체의 결합을 FACS 분석한 결과이다. 5 ㎍/ml에서 시작하여 연속 3배수 희석한 다양한 농도의 각 항체에 대하여, CHO/huα9 세포 결합을 테스트하였다. 도면에, 테스트한 각 항체 농도(X 축)에서의 기하 평균 채널 형광 값(MCF; Y 축)을 표시하였다. EC50 값은 GraphPad Prism(GraphPad Software, SanDiego, CA)를 사용하여 산출하였다.
도 23은 인간 α9 인테그린에 대한 마우스 K33N 항체, 키메라 K33N 항체 및 인간화된 K33N 항체, 및 마우스 항-인간 α9 인테그린 항체 Y9A2의, 용량-반응적인 세포 접착 저해율을 나타낸 것이다. 각각의 항체를 5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 및 0.0016 ㎍/mL의 농도에서 인간 α9 인테그린 발현 세포주 G-361의 세포 접착에 대해 테스트하였다. 실험은 4세트로 실시하였다. 평균 저해율의 값을 도에 나타내었다.

5.1. 인간 α9 인테그린에 대한 항체 제조

인간 α9 인테그린 또는 그것의 임의의 에피토프를 면역 특이적으로 인지하는 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 바람직한 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에서 항원으로 사용되는 α9 인테그린은, (1) α9 인테그린을 발현하는 인간 유래의 모든 세포, 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직으로부터 유래되는 단백질, (2) α9 인테그린 코딩 유전자 DNA, 바람직하게는 cDNA에 의해, 박테리아, 효모, 동물 세포 등의 세포주 등을 형질전환시키고 이를 발현시킨, 재조합 단백질, 또는 (3) 합성 단백질일 수 있다.

α9 인테그린은, 인간 α9 인테그린(서열번호 55, 여기서, 1번에서 29번의 잔기들이 신호 펩타이드임)의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서, "실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드"라는 표현은, 천연 인간 α9 인테그린과 실질적으로 동등한 생물학적 특성을 가지는 한, 복수 개의 아미노산, 바람직하게는 1∼10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1∼수개(예, 1∼5개)의 아미노산이 치환, 결여 및/또는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 변이 폴리펩타이드; 및 복수 개의 아미노산, 바람직하게는 1∼10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1∼수개(예, 1∼5개)의 아미노산이 천연 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열에 부가된 아미노산 서열을 포함하는 변이 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, 변이 폴리펩타이드는 이러한 아미노산 치환, 결여, 변형 및 부가를 복수로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 항원으로서의 인간 α9 인테그린은, 유전자 재조합 기법 외에도, 화학 합성법, 세포 배양법 등의 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 생산할 수 있다.

변이 폴리펩타이드의 생산 방법의 예로는, 합성 올리고뉴클레오티드 부위 특이적 돌연변이 유발(갭 형성 듀플렉스 방법), 아질산 또는 아황산 처리에 의한 랜덤 점 돌연변이 도입을 포함하는 점 돌연변이 유발법, Bal31 효소 또는 다른 효소를 이용한 결여 돌연변이를 제조하는 것을 포함하는 방법, 카세트 돌연변이 유발, 링커 스캐닝 방법, 미스 병합법, 미스매치 프라이머법, DNA 단편 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 항원으로서 사용되는 인간 α9 인테그린은 상기 α9 인테그린의 "일부분"도 포함한다. 본원에서, "일부분"은 α9 인테그린의 리간드, 예를 들면, OPN, VCAM-1, 테나신 C 등과의 결합에 필요한 영역을 포함하는 부분; 특히, 성숙 인간 α9 인테그린(서열번호 55의 30번째에서 1035번째까지의 아미노산 잔기)의, 14번째부터 980번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 부분, 및 11번째로부터 981번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 부분을 지칭한다. 상기 α9 인테그린의 "일부분"은 아래에 기술된 당업계에 공지된 방법에 따른 유전자 재조합 또는 화학 합성에 의해, 또는 이의 변형에 의해 제조하거나, 또는 세포 배양법에 의해 분리한 인간 α9 인테그린을 단백질 분해 효소 등으로 적절하게 절단함으로써 만들 수 있다.

항원으로서 세포막 상에 α9 인테그린을 과다 발현하는 세포 자체나 이의 막 분획을 사용할 수도 있다. 인간 α9 인테그린을 과다 발현하는 세포는 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.

상기와 같이 제조된 적절한 항원을 사용하여, 인간 α9 인테그린 또는 이의 임의의 에피토프에 특이적인 항체를, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법에 따라 제조할 수 있다. 인간 α9 인테그린의 다클론 항체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법으로 만들 수 있다. 예를 들면, 목적 항원을, 비제한적으로, 토끼, 마우스, 랫 등의 다양한 숙주 동물에 투여하여, 항원에 특이적인 다클론 항체를 함유하는 항혈청의 생산을 유도할 수 있다. 숙주의 종에 따라 다양한 보강제를 사용하여 면역학적 반응성을 증가시킬 수 있으며, 보강제로는 프로이드(완전 및 불완전) 보강제, 수산화 알루미늄 등의 미네랄 겔, 리조렉시틴 등의 계면 활성 물질, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 폴리 음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키폴 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간용 보강제, 예컨대, BCG(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파붐을 들 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 보강제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

단일 클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합을 이용한 방법 등의, 당해 기술 분야에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대, 단일 클론 항체는 당해 기술 분야에서 공지된 기법 등의 하이브리도마 기법을 이용하여 제조할 수 있으며, 이는 예를 들면, Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(이들 문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기술되어 있다. 본원에서 "단일 클론 항체"라는 용어는, 하이브리도마 기법을 통해 생산되는 항체만을 한정하는 것은 아니다. 용어 "단일 클론 항체"는 임의의 진핵 생물, 원핵 생물, 또는 파지 클론 등의, 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하며, 이의 생산 방법을 지칭하는 것은 아니다.

하이브리도마 기법을 이용한 특이 항체의 생산 및 스크리닝 방법은 당해 기술 분야에서 일상적이며 잘 공지되어 있다. 비제한적인 예로, 마우스를 목적 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 마우스 혈청에서 항원에 특이적인 항체가 검출되면, 마우스 비장을 회수하여 비장세포를 분리한다. 그 후, 비장세포를 주지의 기법으로 임의의 적합한 골수종 세포(예, P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등)와 융합한다. 하이브리도마를 선별하고, 제한 희석에 의해 클로닝한다. 그 후, 하이브리도마 클론에 대해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포인지를 평가한다. 일반적으로 항체를 높은 수준으로 포함하는 복수는, 양성의 하이브리도마 클론을 마우스 복강에 접종함으로써 만들 수 있다.

특이적인 에피토프를 인지하는 항체 단편은, 공지의 기술로 제조할 수 있다. 예를 들면, Fab 및 F(ab')₂ 단편은, 면역글로불린 분자를 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신(F(ab')₂ 단편을 생산하기 위해) 등의 효소를 사용하여 단백질 분해에 의해 잘라 만들 수 있다. F(ab')₂ 단편은, 완전한 경쇄와, 중쇄의 가변 영역, CH1 영역 및 힌지 영역을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 항체 합성에 대한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학 합성, 또는 바람직하게는, 재조합 발현 기법에 의해 제조할 수도 있다.

항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업자가 이용가능한 임의의 정보로부터(즉, GenBank, 문헌, 또는 일상적인 클로닝 및 서열 분석을 통해) 입수할 수 있다. 특정 항체 또는 그의 에피토프 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 클론은 입수 불가하지만, 항체 분자 또는 그의 에피토프 결합 단편의 서열이 공지되어 있다면, 면역 글로불린을 코딩하는 핵산은 화학 합성이나, 또는 항체 서열의 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 또는 예컨대 항체를 코딩하는 cDNA 라이브로리로부터 cDNA 클론을 동정하기 위한 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 바람직한 공급원(예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 선택된 하이브리도마 세포 등의 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 이로부터 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A＋RNA)으로부터 입수할 수 있다. 그 후, PCR에 의해 제조한 증폭된 핵산을, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 임의의 방법을 이용하여, 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.

5.2. 재조합 항체의 제조

항체의 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 뉴클레오티드의 서열 조작에 대한 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법, 예를 들면, 재조합 DNA 기법, 부위 특이적인 돌연변이 유발법, PCR 등(예, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 본원에 그 전체가 원용에 의해 포함됨)으로, 항체의 뉴클레오티드 서열을 조작하여, 예컨대 항체의 에피토프 결합 도메인 영역 또는 항체의 생물학적 활성을 증강시키거나 감소시킬 수 있는 항체의 임의의 영역에, 아미노산의 치환, 결여 및/또는 삽입을 도입함으로써, 다양한 아미노산 서열을 가진 항체를 제조할 수 있다.

항체를 재조합 발현시키기 위해서는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 발현 벡터를 구축하여야 한다. 항체 분자 또는 항체의 중쇄나 경쇄, 또는 이들의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 수득되면, 전술한 섹션에서 논의된 바와 같이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여, 재조합 DNA 기술에 의해 항체 분자를 생산하기 위한 벡터를 제조할 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여, 항체 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호가 포함된 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예컨대, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합이 있다. 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄와 경쇄의 가변 영역 둘다, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 에피토프 결합 단편, 또는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을, 이러한 발현용 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 서열은 오리지날 항체의 천연 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합시킬 수 있다. 그 후, 이렇게 제조한 발현 벡터는 항체 발현에 적절한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 즉, 본 발명은 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.

숙주 세포에, 중쇄 유래의 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터와 경쇄 유래의 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터인, 본 발명의 2종의 발현 벡터를 공동-형질전환시킬 수 있다. 이러한 2종의 벡터는, 중쇄 폴리펩타이드와 경쇄 폴리펩타이드를 동등하게 발현시킬 수 있는 동일한 선택 마커, 또는 2종의 플라스미드의 유지를 보증하기 위해 상이한 선택 마커를 포함할 수 있다. 다른 예로, 중쇄와 경쇄 폴리펩타이드 둘다를 코딩하며, 이를 발현할 수 있는, 단일 벡터를 사용할 수도 있다. 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 항체는 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법으로 제조할 수도 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하고 있는 파지 입자의 표면 상에 제시된다. 구체적인 구현예에서, 이러한 파지를 이용하여, 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예, 인간 또는 마우스)로부터 발현되는, Fab 및 Fv 또는 다이설파이드-결합 안정화된 Fv 등의 항원 결합 도메인을 제시할 수 있다. 대상 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는, 예컨대, 표지된 항원 또는 고형 표면이나 비드에 결합 또는 포착된 항원을 사용하여, 항원으로서 선별 또는 동정할 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 전형적으로는, fd 및 M13 등의 필라멘트형 파지이다. 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합으로 융합된 단백질로서 발현시킨다. 본 발명의 면역글로불린 또는 그 단편의 제조에 사용할 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는, Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994; Persic et al., Gene, 187:9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology, 57:191-280, 1994; PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 기재된 방법이 있으며, 상기 문헌들은 각각 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

전술한 참고 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 파지를 선별한 다음, 파지 유래의 항체 코딩 영역을 분리하고, 아래에서 상세하게 기술된 바와 같이, 이를 이용하여, 인간 항체 등의 완전한 항체 또는 임의의 다른 바람직한 단편을 제조한 다음, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 대장균 등의 임의의 적절한 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 기법으로 제조하기 위한 기법은, 예컨대 PCT 공개 공보 WO 92/22324; Mu; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6):864-869, 1992; Sawai et al., AJRI, 34:26-34, 1995; Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988에 개시된 방법(각 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 비롯하여, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여, 적용할 수도 있다. 단쇄 Fv 및 항체의 제조에 이용할 수 있는 기법의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498과; Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991; Shu et al., PNAS, 90:7995-7999, 1993; Skerra et al., Science, 240:1038-1040, 1988에 기술된 방법이 있다.

본 발명의 항체 분자를 전술한 임의의 방법으로 제조한 후, 면역글로불린 분자의 정제에 대한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 따라, 예컨대, 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 특히 프로테인 A 또는 프로테인 G 정제 후 특이 항원에 대한 친화성, 및 크기 분리 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이(differential solubility) 또는 임의의 그외 표준적인 단백질 정제 기법으로 정제할 수 있다. 아울러, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 정제 용이성을 위해, 본 명세서에 기재되어 있거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 이종 폴리펩타이드 서열과 융합시킬 수도 있다.

항체의 인간 생체내 사용 및 시험관내 검출 분석을 비롯한 일부 사용을 위해, 키메라 항체, 인간화된 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메라 항체와 인간화된 항체에 대한 내용은 아래 5.3 단락에 상세하게 설명되어 있다.

다른 화합물이나 이종 폴리펩타이드에 융합되어 있거나 접합된 항체들은, 시험관내 면역분석, 정제법(예, 친화성 크로마토그래피) 뿐만 아니라 생체내 치료적 또는 진단적 용도로 이용할 수 있다. 예로, PCT 공개 공보 WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett., 39:91-99, 1994; 미국 특허 5,474,981; Gillies et al., PNAS, 89:1428-1432, 1992; Fell et al., J. Immunol., 146:2446-2452, 1991을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예컨대, 항체는 공지된 방법이나 시판 중인 키트(예, 비오틴 표지, FITC 표지, APC 표지)를 사용하여 다양한 방법으로 표지할 수 있다. 다른 예로, 생체내에서 항체의 생물학적 효과를 강화하는 치료학적 모이어티를, 항체에 접합시킬 수도 있다. 이러한 치료학적 모이어티의 예로는, 다른 항체, 세포 증식 억제성 또는 세포 파괴성 세포 독소, 방사성 원소, 및/또는 항-염증제, 항생제 등의 기타 치료제를 들 수 있다. 본 발명에서, 인간화된 항-인간 α9 인테그린에, 항-α4 항체 등의 다른 항체를 접합(예, 2중 특이성 항체를 형성할)시킬 수도 있다. 다른 예로, 본 발명의 인간화된 항체는 생체내 진단학적 용도로, 예컨대 방사성 원소 등의 검출가능한 마커로 표지될 수도 있다.

5.3. 키메라 항체 및 인간화된 항체

키메라 항체는, 뮤라인 단일 클론 항체로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 가지고 있는 항체와 같이, 항체의 여러 영역들이 상이한 동물 종들로부터 유래된, 분자이다. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예로, Morrison, Science, 229:1202, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4:214 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125:191-202, 1989; 미국 특허 5,807,715; 4,816,567; 4,816,397을 참조하며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

인간화된 항체는 원하는 항원에 결합하는 분자로서, 비-인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 면역글로불린 분자으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 영역을 포함하는 가변부를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 전형적인 방법은, 다양한 참고 문헌들, 예를 들어 Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 미국 특허 5,585,089; 5,693,762; Riechmann et al., Nature, 332:323, 1988; Tsurushita et al., Methods 36:69-83, 2005에 기술되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예컨대, Tsurushita 등(2005, 상기 참조; 이하, "Tsurushita"라고 함)의 문헌에는, 본래 Queen(1989)에 의해 개발된 항체 인간화 방법을 기초로 한 마우스 단일 클론 항체의 실용적이고 유익한 인간화 프로토콜이 기술되어 있다. Tsurushita에 기술된 전체 프로토콜을 아래에서 간략하게 설명한다.

5.3.1. 일반적인 인간화된 항체 제조 프로토콜

마우스 V 유전자의 클로닝 및 서열분석

타겟 마우스 단일 클론 항체의 VH 영역 및 VL 영역을 코딩하는 cDNA를 클로닝하기 위해 다양한 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들어, SMART RACE cDNA 증폭 키트(BD Biosciences, CA) 또는 GeneRacer 키트(Invitrogen, CA)를 이용한, 5' RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭) 방법이 일반적으로 사용되고 있다. 5' RACE용 유전자 특이 프라이머는 H-쇄와 L-쇄 각각의 가변 영역의 바로 하류에 결합되게, 타겟 단일 클론 항체의 H-쇄와 L-쇄의 아이소타입에 따라 제조할 수 있다. 따라서, 5' RACE 프라이머는 γ1, γ2a, γ2b 또는 γ3와 같이 마우스의 각 서브 타입에 특이적으로 설계할 수 있다. 다른 예로, 서브타입들 간의 컨센서스 영역이나 상동성이 높은 영역을 기초로 모든 서브타입들에 공통된 프라이머를 설계할 수도 있다. Tsurushita에는, 아래 5' RACE 프라이머가 예로서 개시되어 있다:

(i) 5'-GCCAGTGGATAGACTGATGG-(서열번호 56)(마우스 γ1, γ2a, γ2b 및 γ3 H-쇄의 클로닝용)

(ii) 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(서열번호 57)(마우스κ 경쇄의 클로닝용).

PCR로 증폭된 V 유전자 단편은, 예컨대, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)와 결정된 DNA 서열을 이용하여, 플라스미드 벡터에 직접 클로닝할 수 있다. 예를 들면, 입수한 DNA 서열은, 이를 코딩하는 아미노산 서열을, 예컨대 Model 241 단백질 서열분석기(Hewlett-Packard, CA)를 이용한 N-말단 아미노산 서열분석에 의해 결정된 타겟 단일 클론 항체의 서열과 비교함으로써, 검증하여야 한다. 전형적으로, 예컨대, 에드만 분해에 의한 타겟 항체의 N-말단에서 적어도 15-20개의 아미노산 잔기를 결정하는 것으로도, 클로닝된 DNA 서열의 진위를 충분히 확인할 수 있다. Tsurushita는, 마우스에서 가장 공통된 N-말단 아미노산 2개 중 하나인 글루타민이 N 말단 아미노산인 경우, 이것이 피로글루타민으로 변환되어, N-말단의 서열분석을 차단시킬 수 있다고 주의를 요하였다. 이 경우, 서열 분석을 위해 N-말단을 디블록킹하여야 한다.

V 영역의 3차원 모델링

VH 영역 및 VL 영역의 서열을 기초로, CDR의 입체 구조를 유지하는데 잠재적으로 중요한 타겟 항체의 프레임워크 잔기를, 예를 들면, R. Levy et al., 1989, Biochemistry 28:7168-7175; B. Zilber et al., 1990, Biochemistry 29:10032-10041에 기술된 방법에 의해 먼저 동정한다. 전형적으로, VH 영역과 VL 영역 각각을 14개의 구조적으로 의미 있는 세그먼트로 나누는데, 이는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 도메인 구조를 포함하는 β 가닥들과 루프형 구조를 취한다. 타겟 항체 유래의 각각의 세그먼트의 아미노산 서열을 PDB 데이터베이스에 저장된 구조가 공지된 항체에서의 대응되는 세그먼트와 정렬한다(H.M. Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:235-342를 참조). 다중 서열 정렬에 의해, 각 타겟 세그먼트와 서열 상동성이 가장 높은 대응되는 세그먼트를 선택하고, V 영역의 3차원 모델을 구축한다. 구조 최적화를 위해, 이 모델로, (예, ENCAD를 이용하거나, 또는 Press et al., 1990, in "Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridge; AMBER, Weiner et al., 1981, J. Comp. Chem. 2:287-303; 영국 암 연구소가 운영하는 BioMolecularModelling 또는 "BMM" 사이트에서 이용가능한 3D-JIG-SAW; 또는 제노바에 있는 스위스 바이오인포메틱스 연구소가 운영하는 ExPASy Proteomics Server 웹사이트에서 이용가능한 SWISS-MODEL을 이용하여) 컨쥬게이트 구배 에너지 최소화를 여러번의 주기로 수행한다.

인간 프레임워크의 선택

V 영역의 구조 모델링과 병행하여, 마우스 VH 영역 및 VL 영역의 cDNA 클로닝으로 추정되는 아미노산 서열을 각각, 예컨대, Kabat 데이터베이스(Johnson et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:214-218을 참조), GenBank 등에 등재된 인간 V 영역 서열과 비교한다. 마우스 서열에 대한 전체 서열 동일성이 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 95%인 인간 프레임워크 영역을, 예컨대 Smith-Waterman 알고리즘(Gusfield, 1997, "Algorithms on Strings, Trees, and Sequences", Cambridge University Press, Cambridge), BLAST (Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268) 등을 이용하여 검색할 수 있다. 이러한 인간 서열은 cDNA 기반의 서열과 단백질 유래 서열을 기초로 할 수 있지만, cDNA 기반의 단백질 유래 서열은, 체세포의 과다돌연변이와 관련있는 잠재적인 면역원성을 배제하는데 유리할 수 있으므로, 생식 계열을 사용하는 것이 대게 바람직하다. 다른 예로, Queen 등(1989, 상기 참조)에 기술된 바와 같이, 컨센서스 프레임워크 서열을 이용하여, cDNA 기반의 서열 또는 단백질 유래 서열로부터 수득되는 프레임워크에서 상기한 과다돌연변이 잔기를 동정 및 제거할 수도 있다. 생식 계열의 VH 세그먼트를 억셉터 프레임워크로 사용하는 경우, 14번 염색체 상의 VH 세그먼트만 기능적인 VH 영역을 형성시키기 때문에, 15번 및 16번 염색체가 아닌 14번 염색체 상에 코딩된 VH 세그먼트를 사용하여야 한다.

인간화된 V 영역의 설계

Queen 등(1989, 상기 참조)에 따르면, CDR의 약 4∼6Å 이내에 있는 프레임워크 아미노산 잔기들이 정확한 CDR 구조를 뒷받침하는 잠재적으로 중요한 프레임워크 잔기인 것으로 보이므로, 이들 프레임워크 아미노산을 동정하여야 한다. 이러한 과정은, 예컨대, 미국 국립 과학 재단(NSF)이 지원하는 Molecular Visualization Freeware 웹 사이트에서 입수가능한 RASMOL 등의, 원자 좌표로부터 원자간 거리를 계산하는 컴퓨터 프로그램을 사용하거나, 또는 수작업으로 컴퓨터 모델을 조사함으로써 달성할 수 있다. 중요한 프레임워크 위치에 있는 아미노산이 마우스 공여 서열과 인간 수여 서열 간에 차이가 있다면, 통상적으로 인간 잔기를 마우스 공여 서열로 치환한다. 그러나, 이러한 잔기가 CDR 구조 유지에 최소한으로만 기여한다면, 대응되는 인간 잔기를 통상적으로 사용한다. 또한, 선택된 인간 억셉터에, V 영역 서열의 약 10∼20% 미만으로 "비전형적인" 아미노산이 함유되어 있다면, 이는 친화성 성숙 기간 동안에 체세포에서의 과다돌연변이이 발생된 결과일 수 있으며, 인간에서 잠재적 면역원성을 방지하기 위해서는 공여 잔기로 치환하여야 한다.

또한, 인간화된 V 영역을 설계하기 위해서는, 잠재적인 N-연결된 당화 신호 잔기와 같은 다른 인자들을 주의깊게 고려해 볼 필요가 있다(상세한 내용은 Tsurushita를 참조함).

인간화된 항체는, 치료 목적으로 필요하거나 또는 없애야 하는 작동자 기능에 따라, 인간 κ 또는 λ 경쇄 유래의 인간 불변 영역 또는 그 일부, 및/또는 인간 항체의 γ1, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ, 또는 ε중쇄나 이의 변이체를 포함할 수 있다. 예컨대, 돌연변이가 가미된 불변 영역의 Fc 부분을, 항체의 Fc 수용체와의 결합을 저하시키거나, 및/또는 이의 보체 고정력을 낮추기 위해, 본 발명의 키메라 항체 또는 인간화된 항체의 가변 영역에 융합시킬 수도 있다(예, Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142, Morgan et al., WO 94/29351). 이러한 항체 분자의 조작은 섹션 5.2에 기술된 재조합 DNA 기법에 의해 수행할 수 있다.

바람직하게는, 제조되는 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 비-인간 공여 항체와 동일한 특이성을 가지거나, 비-인간 공여 항체에 대해 적어도 약 1/3, 적어도 약 1/2, 또는 적어도 약 2/3의 친화성 유사성을 가진다. 다른 측면에서, 제조되는 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 적어도 약 1 x 10⁷ M^-1, 바람직하게는 적어도 약 1 x 10⁸ M^-1, 가장 바람직하게는 적어도 약 1 x 10⁹ M^-1의 친화성 상수를 가진다.

전술한 일반적인 프로토콜 외에도, 항체는 CDR 그래프팅(EP 239,400; PCT 공개공보 WO 91/09967; U.S. 5,225,539; 5,530,101 및 5,585,089), 베니아링(veneering) 또는 재표면화 방법(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814, 1994; Roguska et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973, 1994), 및 체인 셔플링 방법(미국 특허 5,565,332)을 비롯하여, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간화할 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

5.3.2. 인간화된 항체를 의약품으로서 제조하기 위한 추가적인 고려 사항

인간화된 항체를 의약품으로서 제공하기 위해서는, 효율적이고 안정적인 생산 시스템을 확립할 필요가 있다. 예를 들어, H-쇄 및 L-쇄 서열을 삽입함으로써 인간화된 항체에 적합한 발현 벡터를 제조하고, 이 발현 벡터로 형질전환시킨 고생산성의 세포주를 마스터 세포 뱅크(MCB)용 시드 세포로서 수득하여, 워킹 세포 뱅크(WCB)에 대한 안정적이고 반영구적인 공급원으로 이용할 수 있다. 그런 후, WCB 유래의 워킹 세포를 배양하고, 배양 배지를 회수함으로써, 인간화된 항체를 제조할 수 있다.

적절한 조절 유전자를 포함하는 다양한 발현 벡터를, 이러한 생산 세포주의 제조에 사용할 수 있다. 숙주 세포로서 포유동물의 단백질을 발현시키기 위해 일반적으로 사용되는 세포를, 인간화된 항체의 발현에 이용할 수 있다. 이러한 숙주 세포의 예로는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, SP2/0-Ag14.19 세포, NSO 세포 등이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 인간화된 항체의 생산성은 발현 벡터와 숙주 세포의 최상의 조합을 선택함으로써 최대화할 수 있다. 또한, 다양한 무혈청 배양 배지 및 첨가물들로부터 적합한 배지를 선택하여, 숙주 세포에 의한 인간화된 항체의 발현을 최적화할 수 있도록, 배양 배지의 조성을 조사해야 한다.

숙주 세포에 의해 생산되는 인간화된 항체는, 효율과 최종 수율에 따라, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등의, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법을 이용하여 배양 상층액으로부터 정제할 수 있다.

5.4. 약학 조성물 및 치료 용도

본 발명은 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는, 전술한 인간화된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 인간화된 항체를 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물은, 비제한적으로 암, 예컨대, 암 세포의 증식 또는 전이, 및 염증 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 진성 당뇨병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론 질환), 자기면역 질환 등을 비롯하여, α9 인테그린과 관련있는 장애 또는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 제제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 약학 조성물은 장기 이식 후 만성적인 거부 반응과, 자가면역 질환, 예컨대 전신 자기면역 질환, 낭창(erythematosus), 포도막염, 베체트 질환, 다발성 근염, 증식성 사구체 신염, 유육종증, α9 인테그린에 의해 유도되는 질환 상태 등의 치료에 사용할 수 있다.

전술한 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한, 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는, 예방제 및/또는 치료제는, 저독성이며, 적정 용매 중에서 혼합함으로써 액체 조제물로서 직접 또는 적절한 제형(dosage form)의 약학 조성물로서 인간에게 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있다.

전술한 투여에 사용되는 약학 조성물은 전술한 항체 또는 그의 염과 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 경구 또는 비경구 투여에 바람직한 제형으로 제공된다.

투여량은 투여 대상의 연령과 신체 크기, 타겟 질환, 증상, 투여 경로 등에 따라 바뀔 수 있다. 항체를, 예를 들면, 성인 환자의 류마티스 관절염 예방 및/또는 치료용으로 사용하는 경우, 본 발명의 항체는 1회 당 통상 약 0.01 내지 약 20 mg/kg(체중), 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 mg/kg(체중), 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 mg/kg(체중)의 용량으로, 하루에 약 1-5회, 바람직하게는 하루에 1-3회로, 정맥내 투여하는 것이 좋다. 그외 비경구 투여 및 경구 투여하는 경우에는, 항체는 상기 주어진 용량에 대응되는 용량으로 투여할 수 있다. 증상이 특히 심각하다면, 증상에 따라 용량을 늘일 수 있다.

다양한 전달 시스템, 예컨대 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐내 캡슐화, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개의 엔드사이토시스 등이 공지되어 있으며, 이를 이용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다(예, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). 투여 방법으로는, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 코내, 경막외 및 경구 경로를 들 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 화합물은 임의의 편리한 경로, 예컨대, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 또는 표피 또는 피부 점막 내층(예, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물 활성 제제와 함께 투여할 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소 중 어느 한가지일 수 있다. 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 네불라이저와 에어로졸화제를 사용한 제형화를 이용하여, 폐 투여를 적용할 수도 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수도 있으며, 이는 예컨대 비제한적으로, 수술 중의 국소 주입, 예컨대 수술 후 상처 드레싱과 조합하여 국소 도포, 주사, 카테터 사용, 좌제, 코 스프레이 또는 임플란트에 의해 행할 수 있으며, 상기 임플란트는, 시알라스틱막 또는 섬유와 같은 막을 비롯한, 다공성, 무공성 또는 젤라틴성 물질이다. 일 구현예에서, 감염된 조직 부위(또는, 예전 부위(former site))에 직접 주사함으로써 투여할 수도 있다.

다른 구현예에서, 약학 조성물은 비지클, 특히 리포솜 형태로 전달할 수 있다(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로는 동일한 문헌 참조).

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 조절된 방출 시스템 형태로 전달할 수 있다. 일 구현예에서는, 펌프를 사용할 수도 있다(Langer, 상기 참조; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al.,1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 다른 구현예에서, 폴리머성 물질을 사용할 수도 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983) 참조; 또한, Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구현예에서, 조절된 방출 시스템을 조성물의 타겟 가까이에 배치하여, 전신 투여량에 비해 소량만 필요하게 할 수 있다(예, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 조절된 방출 시스템들은 Langer(Science 249: 1527-1533(1990)에 의해 개괄적으로 논의되어 있다.

경구 투여용 조성물의 예로는 고체 또는 액체 제형, 특히, 정제(당의정 및 막-코팅 정제), 환제, 과립제, 분말 조제물, 캡슐제(연질 캡슐제 포함), 시럽제, 에멀젼제, 현탁제 등을 들 수 있다. 이러한 조성물은 공지의 방법으로 제조되며, 약제 제조 분야에 기존에 사용되고 있는 비히클, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 정제에 대한 비히클 또는 부형제의 예로는 락토스, 전분, 슈크로스, 스테아린산 마그네슘 등이 있다.

주사용 조제물은 정맥내, 피하, 진피내 및 근육내 주사, 드립 주입 등의 제형을 포함할 수 있다. 이들 주사용 조제물은 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 주사용 조제물은 예컨대 전술한 항체 또는 그 염을 기존에 주사용으로 사용되고 있는 멸균 수성 매질이나 유성 매질 중에, 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써, 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질의 예로는 생리 식염수, 포도당과 그외 보조제가 포함된 등장액이 있으며, 이들은 알코올(예, 에탄올), 다가 알코올(예, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제(예, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화 피마자 오일의 폴리옥시에틸렌(50 mol) 부가산물) 등의 적절한 용해제와 조합하여 사용할 수 있다. 유성 매질의 예로는, 예컨대 참기름, 콩기름 등을 이용할 수 있으며, 이는 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등의 용해제와 조합 사용할 수 있다. 이렇게 제조되는 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 충전한다. 직장 투여용 좌제는 전술한 항체 또는 그의 염을 종래의 좌제용 베이스와 혼합함으로써 제조할 수 있다.

유익하게는, 전술한 경구 또는 비경구 용도의 약학 조성물은 활성 성분의 투여량에 맞게 조절된 단위 용량으로 제형을 제조한다. 이러한 단위 용량의 제형으로는, 예컨대, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등이 있다. 전술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 용량의 제형 당 약 5-500 mg이며; 특히, 주사제의 경우, 전술한 항체는 약 5-100 mg으로 포함되는 것이 바람직하며, 그외 제형의 경우에는 약 10-250 mg으로 포함되는 것이 바람직하다.

전술한 각 조성물은, 포뮬레이션이 전술한 항체와 임의의 유해한 상호작용을 야기하지 않는 한 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 α9 인테그린 결합성 기능 분자(예, OPN, VCAM-1, 테나신 C, 피브로넥틴, pp-vWF, tTG 등)를 활성 성분으로 포함하는 세포 및/또는 조직 리모델링 저해제 및/또는 촉진제; 및 α9 인테그린 발현 세포 및/또는 조직(예, 종양 세포, 호중구, 평활근 등)을 α9 인테그린 결합성 기능 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 및/또는 조직의 리모델링을 저해 및/또는 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이러한 치료제에 있어서, 활성 성분의 투여량, 투여 방법, 약학적 제조 방법 등은, 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 의약품에 관한 전술한 설명을 참조하여 적절히 결정할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 유효량의 본 발명의 인간화된 항체 하나 이상을 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 α9 인테그린과 관련 있거나 또는 α9 인테그린이 관여하는 장애 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

5.5. 진단적 용도

본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 약학 조성물은, 암, 예컨대 암 세포의 증식 또는 전이, 및 염증 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 진성 당뇨병, 암 전이, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종에 대한 진단제로서, 또는 장기 이식 후 만성적인 거부 반응, 자가면역 질환, 예컨대 전신성 자기면역 질환, 낭창, 포도막염, 베체트 질환, 다발성 근염, 증식성 사구체 신염, 유육종증, α9 인테그린에 의해 유도되는 질환 상태 등의 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 α9 인테그린을 특이적으로 인지할 수 있어, 테스트 유체내 α9 인테그린을 정량하고, 특히, 샌드위치 면역분석, 경쟁 어세이, 이뮤노메트리, 네프로메트리(nephrometry) 등, 면역 염색 등으로 정량하는데 사용할 수 있다. 이러한 면역학적 방법을 본 발명의 분석법에 적용하는 경우, 특별한 조건, 공정 등에 대한 설명은 필요없다. 당해 기술 분야의 통상적인 기술적인 고려 사항들을 종래의 조건 및 공정에 부가함으로써, 분석 시스템을 충분히 구축할 수 있다. 이들 일반적인 기술적 수단에 대한 상새한 설명은 리뷰, 교과서 등을 참조할 수 있다.

전술한 바와 같이, α9 인테그린은 본 발명의 항체를 이용하여 고감도로 정량할 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 α9 인테그린을 생체내에서 정량하는 방법을 적용함으로써 α9 인테그린과 관련있는 다양한 질환을 진단하는데 특히 유용하다. 예를 들어, α9 인테그린의 발현 수준에 증가 또는 감소가 검출되는 경우, 개체를 α9 인테그린과 관련있는 질환, 예컨대, 암 또는 염증 질환을 지금 앓고 있을 가능성이 매우 높거나, 또는 향후 이러한 질환을 앓을 가능성이 매우 높은 것으로 진단할 수 있다. 즉, 본 발명은, 본 발명의 인간화된 항체 하나 이상 또는 둘다를 유효량으로 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, α9 인테그린과 관련있거나 또는 α9 인테그린이 관여하는 장애 또는 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 생체내 진단에 필요한 투여량은 치료적 용도에 필요한 용량 보다 적을 수 있으며, 일상적인 절차에 따라 당업자가 결정할 수 있다.

본 발명의 인간화된 항체는 체액 등의 피검액, 조직 등에 존재하는 α9 인테그린을 특이적으로 검출하는데 사용할 수도 있다. 인간화된 항체는 α9 인테그린을 정제하기 위한 항체 컬럼의 제조에, 정제시 각 분획에 포함된 α9 인테그린의 검출에, 또는 피검 세포내 α9 인테그린의 행태 분석에, 이용할 수도 있다.

6. 실시예

하기 실시예에서는 인간 및/또는 마우스의 α9 인테그린을 면역 특이적으로 인지하는 단일 클론 항체의 제조, 상기 단일 클론 항체의 가변 영역의 서열 결정, 및 상기 항체의 그외 특정화, 상기 항체의 키메라화 및 인간화, 뿐만 아니라 제조되는 키메라 항체 및 인간화된 항체의 특정화에 대해 설명한다. 이들 실시예는 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.

6.1. 인간 α9 인테그린에 대한 마우스 항체의 제조

인간 α9 인테그린에 대한 마우스 단일 클론 항체는, 섭트랙티브 면역화법(subtractive immunization method)(Williams C.V., et al., 1992, Biotechniques 12:842-847)으로 제조하였다. 간략하게, 3 마리의 Balb/c 마우스에, 마우스 1마리 당 3 x 10⁶ 개의 인간 α9 인테그린 발현성 NIH-3T3 세포(인간 α9/NIH-3T3 세포)를 복막내 주사하였다. 주사 후 1주일째와 2주일째에, 마우스 당 3 x 10⁶ 개의 인간 α9/NIH-3T3 세포를 복막내 주사한 다음, 1주일 후 동일 세포를 마우스 당 2 x 10⁶ 개로 정맥내 주사하였다. 하이브리도마는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 제조하였다(예, H, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)). 인간 α9 인테그린을 발현하는 인간 α9/CHO-K1 세포와 인간 α9 인테그린을 내인적으로 발현하는 인간 흑색종 세포와는 면역 특이적으로 반응하지만, 인간 α4 인테그린을 발현하는 CHO-K1 세포와는 면역 특이적으로 반응하지 않는, 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 확립하였고, 인간 α9 인테그린을 면역 특이적으로 인지하는 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론(즉, K33N)을 분리하였다.

6.2. 항-인간 α9 인테그린 항체의 CDR 분석

해당 하이브리도마에서 추출한 mRNA를 역전사하여 cDNA를 제조함으로써, 단일 클론 항체(즉, K33N)의 CDR 아미노산 서열을 결정하였다. cDNA를 주형으로 사용하고, H-쇄와 L-쇄의 가변 영역을 ScFv-클로닝 프라이머(Light Primer Mix and Heavy Primer Mix; Amersham Biosciences Corp., IL)를 사용하여 PCR에 의해 연장시킴으로써, 증폭하였다. PCR 산물은 pCRII TOPO 벡터에 클로닝하고, 서열 분석하여, 아미노산 서열을 결정하였다. 이 과정을 3번 반복하였다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.

CDR	아미노산 서열	서열번호
CDRH1	SYYMN	4
CDRH2	WIFPGSGNTKYNEKFKG	5
CDRH3	SWVSYERGYYFDY	6
CDRL1	RASENIYYSLA	11
CDRL2	NANSLED	12
CDRL3	KQAYDVPYT	13

6.3. 세포 접착 저해 활성

(1) 세포 접착에는 α9 인테그린의 그것의 리간드, 즉 OPN, 피브로넥틴, 테나신-C, VCAM-1 등을 비롯한 다양한 ECM과의 결합이 수반되는 것으로 알려져 있으므로, 인간 α9 인테그린을 발현하는 세포(인간 흑색종 G361 세포)의 리간드와의 결합을 이용하여, 분리된 항-인간 α9 인테그린 항체의 세포 접착 저해 활성을 조사하였다.

간략하게, OPN 펩타이드를 소 혈청 알부민(BSA)-융합 SVVYGLR(서열번호 2) 펩타이드로 제조하였다. 펩타이드의 GRD 서열이 E. coli 숙주 세포에서의 발현에 의해 RAA 서열로 치환된, TN-C fn3(RAA)를 인간 테나신-C에서 피브로넥틴 타입 III 리피드의 3번째 영역으로서 제조하였다.

OPN 펩타이드와 테나신-C 단편(TN-C fn3(RAA)을 96웰 플레이트에 5 ㎍/mL로 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션하여, 플레이트를 코팅한 후, 플레이트를 블록킹 용액(0.5% BSA/PBS)으로 블록킹하였다. 인간 흑색종 G361 세포를 0.25% BSA/DMEM에 현탁하고(1 x 10⁵ 세포/mL), 각각의 농도의 항-인간 α9 인테그린 항체를 상기 세포 현탁물에 첨가하였다. 0.25% BSA/DMEM 중의, 인간 흑색종 G361 세포(1 x 10⁵ 세포/mL) 및 항체 혼합물을 96웰 플레이트에 웰 당 200 ㎕ 씩 넣고, 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건에서 1시간 인큐베이션하였다. 비-접착 세포를 PBS로 헹구어 제거하고, 접착된 세포는 고정하여 0.5% 크리스탈 바이올렛(일본 오사카, WAKO)/20% 메탄올로 염색하였다. 염색된 세포를 증류수로 3회 세정한 다음, 20% 아세트산 용액을 첨가하여 용해시켰다. 이를 590 nm 파장에서 OD를 측정하여, 접착 활성을 정량하였다. 음성 대조군으로는 항-인간 OPN 단일 클론 항체(5A1)를 사용하고, 양성 대조군으로는 이전에 제조한 항-인간 α9 인테그린 항체(1K11, 21C5, 24I11, 25B6 및 28S1)를 사용하였다.

G361 세포에 OPN 펩타이드의 결합에 대한, 항-인간 α9 인테그린 항체의 효과는 도 1에 나타내며, 테나신-C 단편의 결합에 대한 효과는 도 2에 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, OPN가 참여한 세포 접착은, 양성 대조군 21C5 및 24I11와 비교하여, 낮은 농도의 K33N에 의해 저해되었고, Y9A2와 동일한 농도에서 저해되었다. 테나신-C가 참여한 세포 접착은, K33N에 의해 낮은 농도에서 저해되었으며, Y9A2와 동일한 농도에서 저해되었으며, 이러한 저해 효과는 양성 대조군인 21C5와 24I11 보다 현저하게 강하였다.

6.4. 비-인간 항체의 인간화

6.4.1. 마우스 K33N의 V 유전자 클로닝 및 서열분석

마우스 K33N 하이브리도마 세포를 7.5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone, Logan, UT)이 포함된 TIL 배지 I(일본, 군마, 면역 생물 연구소)을 이용하여 증식시켰다. TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 약 10⁷개의 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 올리고 dT로 프라이밍된 cDNA를 GeneRacer 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 합성하였다. K33N의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA는, 각각, 마우스 γ1쇄 및 κ쇄 불변 영역에 어닐링하는 3' 프라이머와 GeneRacer 키트에 제공되는 GeneRacer 5' 프라이머(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3')(서열번호 51)를 이용하여, Phusion DNA 중합효소(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 중쇄 가변 영역(VH)의 PCR 증폭에는, 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(서열번호 52) 서열의 3' 프라이머를 사용하였다. 경쇄 가변 영역(VL)의 PCR 증폭에는, 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(서열번호 53) 서열의 3' 프라이머를 사용하였다. 증폭된 VH와 VL의 cDNA는, 서열 결정을 위해, pCR4Blunt-TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브 클로닝하였다. 가변 영역의 DNA 서열분석은 Tocore(MenloPark, CA)에서 실시하였다. 몇개의 중쇄 및 경쇄 클론의 서열을 분석하고, 전형적인 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 상동성을 보이는 고유 서열을 동정하였다. 컨센서스 cDNA 서열은 K33N VH 및 VL의 추정 아미노산 서열과 함께 각각 도3 및 도 4에 나타낸다.

6.4.2. 키메라 K33N IgG1/κ 항체의 구축

K33N VH를 코딩하는 유전자는, 주형으로서 K33N VH cDNA를 이용하고, 5'-GGGACTAGTACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTC-3'(밑줄은 SpeI 부위)(서열번호 40)를 5' 프라이머로, 5'-GGGAAGCTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTGGTGCC-3'(서열번호 41)(밑줄은 HindIII 부위)를 3' 프라이머로 사용하여, PCR를 행하여, 스플라이스 공여 신호와 적절한 측면 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 제작하였다(도 5). 마찬가지로, K33N VL 코딩 유전자는, 주형으로 K33N VL cDNA를 이용하고, 5'-GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-3'(서열번호 42)(밑줄은 NheI 부위)를 5' 프라이머로, 5'-GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3'(서열번호 43)(밑줄은 EcoRI 부위)를 3' 프라이머로 사용하여 PCR를 행하여, 스플라이스 공여 신호와 적절한 측면 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 제작하였다(도 6). K33N의 VH 엑손과 VL 엑손의 스플라이스 공여 신호는 각각 마우스 생식 계열 JH4 서열과 Jκ2 서열로부터 유래된 것이다. PCR 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 겔로부터 정제하고, SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI및 EcoRI(VL의 경우)으로 효소 절단한 다음, 키메라 K33N IgG1/κ 항체를 생산하기 위해 인간 γ1 불변부와 κ 불변부를 가지고 있는 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. 제조한 발현 벡터 pChK33N의 도식적인 구조는 도 7에 나타낸다.

6.4.3. 인간화된 K33NV 유전자의 제작

K33N 가변 영역의 인간화는 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989)에 의해 개괄적으로 개시된 바와 같이 수행하였다. 먼저, 컴퓨터 프로그램을 활용하여 K33N 가변 영역의 분자 모델을 구축하였다. 다음으로, 인간 가변부 서열에 대한 상동성 검색 결과를 기초로, K33N VH에 대해 높은 상동성을 가지는, DA980102(GenBank 등재 번호) 유래의 인간 아미노산 서열을, 인간화된 K33N VH에 대한 프레임워크를 제공하는 억셉터로서 선택하였다. 마우스 K33N VH 영역과 DA980102 VH 영역 간에 프레임워크 아미노산 동일성은 74.7%(65/87)이다. 마찬가지로, X72441(GenBank 등재 번호)의 인간 아미노산 서열을 K33N VL의 인간화를 위한 억셉터 로서 선택하였다. 마우스 K33N VL 영역과 X72441 VL 영역 간에 프레임워크 아미노산 동일성은 76.3%(61/80)이다.

컴퓨터 모델에서 상보성 결정 영역(CDR)과 유의한 접촉이 시사된 프레임워크 위치에, 인간 프레임워크 아미노산 대신 K33N 가변부의 아미노산을 사용하였다. 28, 48, 66, 67 및 71번 위치에서 이러한 치환을 수행하여, 인간화된 K33N(HuK33N) VH를 제작하였다(도 8). 또한, 인간 DA980102 억셉터 82번 위치의 Met는 인간 VH 서열의 동일 서브 그룹에서 비전형적인 것으로 확인되어, 가장 일반적인 아미노산 잔기(Leu)로 치환하여, 잠재적인 면역원성을 낮추었다. 경쇄의 경우에는, 70번과 71번 잔기에 대한 치환을 행하여 HuK33N VL를 제작하였다(도 9). K33N, 제작한 HuK33N 및 인간 억셉터 아미노산 서열의 정렬을, VH는 도 8에, VL은 도 9에 나타낸다.

HuK33N의 각 VH 및 VL을 코딩하는 유전자를, 신호 펩타이드, 스플라이스 공여 신호 및 이후 포유동물 발현 벡터에 클로닝하기 위한 적절한 제한 효소 부위를 포함하고 있는, 엑손으로 설계하였다. HuK33N의 VH 엑손과 VL 엑손의 스플라이스 공여 신호는 각각 인간 생식 계열 JH4 서열과 Jκ1 서열로부터 입수하였다. SIG-Pred 신호 펩타이드 예측 소프트웨어(http:/bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html)에 따라, 마우스 K33N VH 유전자의 신호 펩타이드 서열이 정확한 절단에 준 최적인 것으로 나타났다. 이에, SIG-Pred 소프트웨어에서 효과적이고 정확하게 절단될 것으로 예측된, 마우스 항-인간 α9 인테그린 단일 클론 항체 24I11(Gene Techno Science)의 VH 유전자의 신호 펩타이드 서열을, HuK33N VH 유전자에 사용하였다. 인간화된 K33N VL 엑손내 신호 펩타이드 서열은 대응되는 마우스 K33N VL 서열로부터 유래된 것이다. SIG-Pred 소프트웨어에서는, HuK33N VL 유전자의 신호 펩타이드가 효과적이고 정확하게 절단되는 것으로 예측되었다.

He et al. (J. Immunol. 160: 1029-1035, 1998)에 개괄적으로 기술된 바와 같이, ThermalAce DNA 중합효소(Invitrogen)와 몇 종의 중복되는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 신장과 PCR 증폭에 의해, HuK33N의 VH 유전자와 VL유전자를 구축하였다. HuK33N의 VH 유전자와 VL 유전자의 구축에 사용한 올리고뉴클레오티드는 도 10과 도 11에 나타낸다. HuK33N의 VH 유전자와 VL 유전자에서의 상기 올리고뉴클레오티드의 위치는 각각 도 12과 도 13에 나타낸다. PCR 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 겔 정제하고, 서열 결정을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝하였다. SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI 및 EcoRI(VL의 경우)로 효소 절단한 다음, 인간 IgG1/κ 형태로 생산하기 위한 포유동물 발현 벡터내 해당 부위에 HuK33N의 VH 유전자와 VL 유전자를 서브 클로닝하였다. 제조되는 발현 벡터 pHuK33N의 도식적 구조는 도 7에 나타낸다. 제조되는 HuK33N의 VH 유전자와 VL 유전자의 뉴클레오티드 서열은 추정되는 아미노산 서열과 함께 도 14 및 도 155에 나타낸다.

6.4.4. 키메라 및 인간화된 K33N IgG1/κ의 일시적 발현

Durocher et al.(Nucl. Acids Res. 30: e9, 2002)에 따라, pChK33N 및 pHuK33N의 플라스미드 DNA 각각을 폴리에틸렌이민을 사용하여 HEK293 세포에 형질전환하여, 키메라 및 인간화된 K33N IgG1/κ 항체를 일시적으로 발현시켰다. 일시적으로 형질전환된 HEK293 세포는 7.5% 이산화탄소 인큐베이터에서, 37℃에서, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 4일간 유지시켰다. 배양 상층액내 ChK33N IgG1/κ 항체 및 HuK33N IgG1/κ 항체 각각의 발현 수준을 샌드위치 ELISA로 측정하였다. ELISA 플레이트를 PBS에 1/2,000으로 희석한 염소 항-인간 IgG Fcγ-쇄 특이적인 다클론 항체(SouthernBiotech, Birmingham, AL)를 100 ㎕/웰로 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 세정 완충액(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 세정한 다음, 블록킹 완충액(2% 탈지유 및 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS)을 300 ㎕/웰로 사용하여 실온에서 1시간 블록킹하였다. 세정 완충액으로 세정한 후, ELISA 완충액(1% 탈지유 및 0.025% Tween 20이 첨가된 PBS)으로 적절하게 희석한 시료를 100㎕/웰로 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 인간 골수종 혈청(SouthernBiotech)으로부터 정제한 인간 IgG1/κ 항체를 표준물질로 사용하였다. ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 인큐베이션하고, 세정 완충액으로 세정한 다음, 1/2,000으로 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 κ쇄 다클론 항체(SouthernBiotech)를 100 ㎕/웰로 첨가하여, 결합된 항체를 검출하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션하고, 세정 완충액으로 세정한 다음, 100 ㎕/웰로 ABTS 기질(bioWORLD, Dublin, OH)을 첨가하여, 발색시켰다. 2% 옥살산을 100 ㎕/웰로 첨가하여, 발색을 정지시켰다. 흡광도를 405 nm에서 측정하였다.

일시적으로 발현된 ChK33N 항체와 HuK33N 항체의 인간 α9 인테그린과의 결합성을, 세포 ELISA로 조사하였다. 재조합 인간 α9 인테그린을 표면에 발현하는 안정적인 CHO-K1 형질전환주(CHO/huα9; Gene Techno Science)를, 10% FBS가 첨가된 50 ㎕의 F12/DMEM(HyClone) 배지에 웰 당 세포 2 x 10⁵개로 96웰 조직 배양 플레이트에 접종하여, 7.5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서 하룻밤 증식시켰다. 인간 α9 인테그린과의 결합성을 테스트하기 위해, 10% FBS가 포함된 F12/DMEM 배지 중의 ChK33N, HuK33N 또는 무관한 인간 IgG1/골수종 항체(SouthernBiotech) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션하고, 세포를 빙랭한 PBS로 2회 세정한 다음, 1/1,000로 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG 다클론 항체(SouthernBiotech) 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 세포를 빙랭한 PBS로 3회 세정하였다. 발색을 위해 ABTS 기질 100 ㎕를 첨가하였다. 2% 옥살산 100 ㎕를 첨가하여, 발색을 정지시켰다. 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 결과에서, 0.5 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL 둘다에서, ChK33N 항체의 인간 α9 인테그린과의 결합성이 HuK33N 항체의 인간 α9 인테그린과의 결합성과 거의 동일한 것으로 나타났다(도 16).

6.4.5. ChK33N 및 HuK33N IgG1/κ 항체를 각각 생산하는 안정적인 NS0 형질전환주의 제조

ChK33N IgG1/κ 항체와 HuK33N IgG1/κ 항체를 안정적으로 생산하는 세포주를 입수하기 위해, 발현 벡터 pChK33N 및 pHuK33N을 각각 마우스 골수종 세포주 NS0(European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK)의 염색체에 도입하였다. NS0 세포는 7.5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서, 10% FBS가 첨가된 DME 배지에서 증식시켰다. Bebbington et al. (Bio/Technology 10: 169-175, 1992)에 기재된 바와 같이, 전기충격에 의해 NS0로의 안정적인 형질전환을 수행하였다. 형질전환 전에, 발현 벡터를 FspI를 사용하여 선형화하였다. 약 10⁷개의 세포를 10 ㎍의 선형화된 플라스미드로 형질전환하고, 이를 10% FBS가 첨가된 DME 배지에 현탁한 다음, 수개의 96웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 선택 배지(10% FBS, HT 배지 보충물(Sigma, St.Louis, MO), 0.25 mg/mL 크산틴 및 1 ㎍/mL 미코페놀산이 포함된 DME 배지)를 첨가하였다. 선별 개시 후 약 10일 후에, 배양 상층물로 항체 생산을 분석하였다.

ChK33N IgG1/κ 항체와 HuK33N IgG1/κ 항체의 발현은 기본적으로는 6.4.3 섹션에 기술된 과정에 따라 샌드위치 ELISA로 측정하였다. ChK33N 항체를 고수준으로 생산하는 안정적인 NS0 형질전환주(NS0-ChK33N 3D11)를 Hybridoma SFM(Invitrogen)로 사용하여 무혈청 배지에서 증식되게 적응시켰다. HuK33N 항체를 고수준으로 생산하는 안정적인 NS0 형질전환주를 또한 제한 희석에 의해 96웰 플레이트에서 서브 클로닝하였다. 이들 서브 클론 중 1개(NS0-HuK33N 8G8-11)를 Hybridoma-SFM에서 증식되게 적응시켰다. PCR 미코플라스마 검출 세트(Takara Bio USA, Madison, WI)를 이용한 검사를 통해, NS0-ChK33N 3D11과 NS0-HuK33N 8G8-11 둘다 미코플라스마가 없는 것으로 확인되었다.

NS0-HuK33N 6D5-11에서 생산된 HuK33N의 중쇄 및 경쇄의 진정성을 cDNA 서열분석으로 검증하였다. 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 NS0-HuK33N 6D5-11 세포로부터 추출하고, 올리고 dT로 프라이밍된 cDNA를 GeneRacer 키트(Invitrogen)를 제조사의 프로토콜에 따라 합성하였다. γ1 중쇄의 코딩부는 프라이머로서 CMV2 및 JNT098(도 17)를 사용하고, Phusion 중합효소(NewEnglandBiolabs)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 단편을 겔 정제한 다음, CMV2, JNT082, JNT097 및 JNT098를 프라이머로 사용하여 서열분석하였다(도 17). 마찬가지로,κ 경쇄의 코딩부는 CMV2와 JNT026를 프라이머로 사용하여 증폭시켰다(도 17). 겔에서 정제한 DNA 단편을 CMV2, JNT026, JNT080 및 JNT084를 프라이머로 사용하여 서열분석하였다(도 17). HuK33N의 중쇄와 경쇄 각각의 코딩부에서 수득한 뉴클레오티드 서열은 pHuK33N 벡터내 대응되는 서열과 완전히 일치되었다(각각, 도 18 및 도 19).

6.4.6. ChK33N 항체와 HuK33N 항체의 정제

NS0-ChK33N 3D11 세포와 NS0-HuK33N 8G8-11 세포를 롤러병 안에서 Hybridoma-SFM를 고갈시킬 때까지 증식시켰다. 원심분리 및 여과를 행한 후, 배양 상층액을 프로테인-A 세파로스 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 주입하였다. 컬럼을 PBS로 헹군 후, 항체를 0.1 M의 글리신-HCl(pH3.0)으로 용출하였다. 1 M Tris-HCl(pH8)로 중화한 후, 용출시킨 항체의 완충액을 투석을 통해 PBS로 교체하였다. 항체 농도를 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 정하였다(1 mg/mL = 1.4 OD). 항체 발현 수준은 NS0-ChK33N 3D11 세포가 50 ㎍/mL이었고, NS0-HuK33N 8G8-11 세포가 12 ㎍/mL이었다.

정제한 ChK33N 항체와 HuK33N 항체를 표준적인 절차에 따라 SDS-PAGE로 특정화하였다. 환원 조건 하에서의 분석으로, ChK33N 항체와 HuK33N 항체는 각각 분자량 약 50 kDa의 중쇄와 분자량 약 25 kDa의 경쇄로 구성되어 있음이 확인되었다(도 20). 각 항체의 순도는 95%를 넘는 것 같았다.

6.4.7. ChK33N 항체와 HuK33N 항체의 특정화

마우스 K33N 항체, 키메라 K33N 항체 및 인간화된 K33N 항체와 인간 α9 인테그린과의 결합을, CHO/huα9 세포를 이용한 FACS 결합 분석으로 평가하였다. 테스트 당 약 5 x 10⁵개의 CHO/huα9 세포를 FACS 결합 완충액(0.5% BSA 및 0.05% NaN₃가 첨가된 PBS)로 헹구고, 테스트 항체가 다양한 함량으로 포함된 FACS 결합 완충액 200 ㎕에 현탁하였다. 얼음 위에 30분간 둔 후, 세포를 FACS 결합 완충액으로 헹구었다. 그런 다음, 마우스 K33N로 염색된 세포를, FACS 결합 완충액 중의 1/200로 희석된 FITC- 표지된 염소 항-마우스 IgG 다클론 항체(SouthernBiotech) 용액 100 ㎕에 현탁하였다. 키메라 K33N 또는 인간화된 K33N로 염색된 세포를 1/200로 희석된 FITC 표지된 염소 항-인간 IgG 다클론 항체(SouthernBiotech)가 첨가된 FACS 결합 완충액 100 ㎕에 현탁하였다. 이를 얼음 위에 30분간 둔 후, 세포를 FACS 결합 완충액으로 헹구고, FACS 결합 완충액 200 ㎕에 현탁한 다음, FACScan 플로우 세포측정기(BD Biosciences, FranklinLakes, NJ)에서 분석하였다. 마우스 K33N 항체의 CHO/huα9 세포 결합에 대한 EC50 값은 104 ng/mL이었다(도 21). ChK33N 항체와 HuK33N 항체 간에 결합 패턴은 서로 매우 비슷하였다(도 22). 또한, ChK33N 항체와 HuK33N 항체의 EC50 값은 서로 거의 동일하였다(ChK33N 항체는 143 ng/mL, HuK33N 항체는 151 ng/mL). 이러한 결과는, 마우스 K33N 항체가 항원 결합 친화성을 소실하지 않으면서 성공적으로 인간화되었음을 의미한다.

6.4.8. 세포 접착 어세이

바닥이 평평한 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 5 ㎍/mL hTNC(AEIDGIEL)-BSA 용액 50 ㎕을 넣고, 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 두어 웰을 코팅하였다. 대조군 웰은 5 ㎍/mL BSA 용액 50 ㎕로 코팅하였다. 코팅 반응 후, 웰내 용액을 0.5 w/v% BSA(블록킹) 용액 200 ㎕으로 교체하여, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 블록킹 반응을 수행한 후, 웰을 PBS로 세정하였다. 0.25 w/v% BSA가 포함된 TIL 배지에 2.5 x 10⁵ 세포/mL로 G-361 세포를 현탁하고, 현탁액 150 ㎕와 테스트 항체 용액(0.25 w/v% BSA/TIL) 50 ㎕를 상기 웰에 넣은 다음, 37℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 다음, 비-접착 세포를 제거하기 위해, 각 웰을 PBS 용액으로 3회 조심스럽게 헹구었다. 0.5 w/v% 크리스탈 바이올렛 용액 50 ㎕를 첨가하여, 접착된 세포를 고정하고 염색하였다. 30 분후, 수조에서 3번 헹구어 여분의 색소를 제거하고, 웰내 염료를 20 v/v% 아세트산 50 ㎕로 용해시켰다. 각 웰은 595 nm에서 흡광도를 흡광도 스펙트로미터로 측정하였다. 세포 접착 저해율은 식; (1-(A-B)/(C-B) x 100(%)으로 산출하였다. A: 항체의 존재 하의, hTNC-BSA로 코팅된 웰의 흡광도, B: 어떤 테스트 항체도 존재하지 않는, BSA로 코팅된 웰의 흡광도, C: 정상적인 인간 IgG의 존재 하의, hTNC-BSA로 코팅된 웰의 흡광도(음성 대조군)(도 23).

결과

Y9A2의 IC₅₀은 0.053 ㎍/mL(95% CI: 0.032 - 0.089)이었다. K33N, ChK33N 및 HuK33N의 IC₅₀은 각각 0.075 μM(0.053 - 0.106), 0.090 ㎍/mL(0.063 - 0.128), 0.084 ㎍/mL(0.055 - 0.129)이었으며, 테스트 항체의 IC₅₀ 값은 Y9A2의 값과 동일한 수준인 것으로 확인되었다.

7. 기탁

마우스 항-인간 α9 인테그린 단일 클론 항체를 생산하는, 본 명세서에서 K33N으로 표기된 하이브리도마는, 2007년 5월 29일자로 미생물의 기탁에 관한 부다페스트 조약에 의거하여, 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 센터럴 6 (우편 번호 305-8566)에 소재한 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁하였고, 기탁 번호 FERMBP-10830을 부여받았으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 인간화된 단일 클론 항체는, α9 인테그린의 기능을 저해하여, 암, 예컨대 암 세포의 증식 또는 전이, 및 염증 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절증, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 진성 당뇨병, 암 전이, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론 질환), 자기면역 질환 등에 대해 치료학적 효과를 나타낸다.

본 명세서 전체에 언급되는 서열을 아래와 같이 종합하였다.

서열번호	타입	설명	서열
1	aa	OPN 접착 서열	GRGDS
2	aa	HuOPN의α4β1/α9β1-결합부	SVVYGLR
3	aa	HuOPN의α4β1/α9β1-결합부	SLAYGLR
4	aa	K33N(FERM BP-10830)의 CDRH1	SYYMN
5	aa	K33N (FERM BP-10830)의 CDRH2	WIFPGSGNTKYNEKFKG
6	aa	K33N (FERM BP-10830)의 CDRH3	SWVSYERGYYFDY
7	DNA	K33N(FERM BP-10830)의 VH, 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함함(1-57) 도 3	ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGAAGAAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGGTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGCACCAGTCTCACAGTCTCCTCA
8	aa	K33N (FERM BP-10830)의 VH, 신호 펩타이드 포함 (1-19) 도 3	MGWSWIFLFLLSGTAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYMNWVKKRPGQGLEWIGWIFPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQVSSLTSEDSAVYFCARSWVSYERGYYFDYWGQGTSLTVSS
9	aa	K33N (FERM BP-10830)의 성숙 VH	QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYMNWVKKRPGQGLEWIGWIFPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQVSSLTSEDSAVYFCARSWVSYERGYYFDYWGQGTSLTVSS
10	aa	K33N H-쇄의 신호 펩타이드	MGWSWIFLFLLSGTAGVHC
11	aa	K33N (FERM BP-10830)의 CDRL1	RASENIYYSLA
12	aa	K33N (FERM BP-10830)의 CDRL2	NANSLED
13	aa	K33N (FERM BP-10830)의 CDRL3	KQAYDVPYT
14	DNA	K33N (FERM BP-10830)의 VL, 신호 펩타이드 코딩 서열 포함함 (1-60) 도 4	ATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCAGGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCCTCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCAAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATTCTATGAAGATCAACAGCATGCAGCCTGAAGATACCGCAACTTATTTCTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
15	aa	K33N의 VL(FERM BP-10830), 신호 펩타이드 포함함 (1-20) 도 4	MSVPTQLLGLLLLWLTDAGCDIQMTQSPASLAASVGETVTLTCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQAYDVPYTFGGGTKLEIK
16	aa	K33N (FERM BP-10830)의 성숙 VL	DIQMTQSPASLAASVGETVTLTCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQAYDVPYTFGGGTKLEIK
17	aa	K33N L-쇄의 신호 펩타이드	MSVPTQLLGLLLLWLTDAGC
18	DNA	DA980102	AACCACATCCCTCCTCAGAAGCCCCCAGAGCACAACTCCTTACCATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTTTTGGTGGCAGCAGCCACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTATGCTCTGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCCTTACCAGTGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGATGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGAGCAGTGGCTGGTACGTTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTTTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAA
19	aa	DA980102의 FRH1	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
20	aa	DA980102의 FRH2	WVRQAPGQRLEWMG
21	aa	DA980102의 FRH3	RVTLTSDTSASTAYMEMSSLRSEDTAVYYCAR
22	aa	DA980102의 FRH4	WGQGTLV TVSS
23	DNA	X72441	cgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
24	aa	X72441의 FRL1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
25	aa	X72441의 FRL2	WYQQKPGKAPKLLIY
26	aa	X72441의 FRL3	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
27	aa	X72441의 FRL4	FGQGTKVEIK
28	DNA	HuK33N의 VH, 신호 펩타이드 포함함 (16-72) 도 12	GGGACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCACAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCACAAAAGCTTCCC
29	aa	HuK33N의 VH, 신호 펩타이드 포함함 (1-19) 도 12	MKCSWVIFFLMAVVTGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMNWVRQAPGQRLEWIGWIFPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWVSYERGYYFDYWGQGTLVTVSS
30	DNA	HuK33N의 VL, 신호 펩타이드 포함함 (16-75) 도 13	GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCACGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTGAGTAGAATTTAAAGAATTCCCC
31	aa	HuK33N의 VL, 신호 펩타이드 포함함 (1-20) 도 13	MSVPTQLLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYYSLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCKQAYDVPYTFGQGTKVEIK
32	DNA	SpeI와 HindIII 사이트가 양단에 배치된 ChK33N VH 유전자, 신호 펩타이드 코딩 서열 포함함 (1-57) 도 5	ACTAGTACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGAAGAAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGGTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGCACCAGTCTCACAGTCTCCTCAGGTGAGTCCTTAAAAC AAGCTT
33	DNA	NheI와 EcoRI 사이트가 양단에 배치된 ChK33N VL 유전자, 신호 펩타이드 코딩 서열 포함함 (1-60) 도 6	GCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCAGGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCCTCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCAAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATTCTATGAAGATCAACAGCATGCAGCCTGAAGATACCGCAACTTATTTCTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTAAGTAGTCTTCTCA GAATTC
34	DNA	SpeI와 HindIII 사이트가 양단에 배치된 HuK33N VH유전자 도 14	ACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCACAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCGCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCACAA AAGCTT
35	DNA	NheI와 EcoRI 사이트가 양단에 배치된 HuK33N VL 유전자 도 15	GCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCACGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTGAGTAGAATTTAAA GAATTC
36	DNA	pHuK33N내 HuK33N γ-1 중쇄 도 18	ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCACAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCGCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
37	AA	HuK33N γ-1 중쇄 도 18	MKCSWVIFFLMAVVTGVNSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMNWVRQAPGQRLEWIGWIFPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWVSYERGYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
38	DNA	pHuK33N에서 HuK33N κ-경쇄 도 19	ATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCACGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
39	AA	HuK33N κ-경쇄 도 19	MSVPTQLLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYYSLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCKQAYDVPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
40	DNA	SpeI 부위가 포함된 K33N VH용 5' 프라이머	GGGACTAGTACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTC
41	DNA	HindIII 부위가 포함된 K33N VH용 3' 프라이머	GGGAAGCTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTGGTGCC
42	DNA	NheI 부위가 포함된 K33N VL용 5' 프라이머	GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG
43	DNA	EcoRI 부위가 포함된 K33N VL용 3' 프라이머	GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC
44	DNA	CMV2	GAACCGTCAGATCGCCTGGAGACG
45	DNA	JNT026	TGAAAGATGAGCTGGAGGAC
46	DNA	JNT080	GAACTGTGGCTGCACCATC
47	DNA	JNT082	CTTTCTTGTCCACCTTGGTG
48	DNA	JNT084	GTTGAAGCTCTTTGTGACGG
49	DNA	JNT097	GCTGTCCTACAGTCCTCAG
50	DNA	JNT098	ACGTGCCAAGCATCCTCG
51	DNA	GeneRacer 5' 프라이머	CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
52	DNA	중쇄 가변부(VH) PCR 증폭용 3' 프라이머	GCCAGTGGATAGACAGATGG
53	DNA	경쇄 가변부(VL) PCR 증폭용 3' 프라이머	GATGGATACAGTTGGTGCAGC
54	aa	테나신 C 33-35	AEIDGIEL
55	aa	인간 α9 인테그린(신호 펩타이드 1-29 잔기; 이탤릭체)	MGGPAAPRGAGRLRALLLALVVAGIPAGAYNLDPQRPVHFQGPADSFFGYAVLEHFHDNTRWVLVGAPKADSKYSPSVKSPGAVFKCRVHTNPDRRCTELDMARGKNRGTSCGKTCREDRDDEWMGVSLARQPKADGRVLACAHRWKNIYYEADHILPHGFCYIIPSNLQAKGRTLIPCYEEYKKKYGEEHGSCQAGIAGFFTEELVVMGAPGSFYWAGTIKVLNLTDNTYLKLNDEVIMNRRYTYLGYAVTAGHFSHPSTIDVVGGAPQDKGIGKVYIFRADRRSGTLIKIFQASGKKMGSYFGSSLCAVDLNGDGLSDLLVGAPMFSEIRDEGQVTVYINRGNGALEEQLALTGDGAYNAHFGESIASLDDLDNDGFPDVAIGAPKEDDFAGAVYIYHGDAGGIVPQYSMKLSGQKINPVLRMFGQSISGGIDMDGNGYPDVTVGAFMSDSVVLLRARPVITVDVSIFLPGSINITAPQCHDGQQPVNCLNVTTCFSFHGKHVPGEIGLNYVLMADVAKKEKGQMPRVYFVLLGETMGQVTEKLQLTYMEETCRHYVAHVKRRVQDVISPIVFEAAYSLSEHVTGEEERELPPLTPVLRWKKGQKIAQKNQTVFERNCRSEDCAADLQLQGKLLLSSMDEKTLYLALGAVKNISLNISISNLGDDAYDANVSFNVSRELFFINMWQKEEMGISCELLESDFLKCSVGFPFMRSKSKYEFSVIFDTSHLSGEEEVLSFIVTAQSGNTERSESLHDNTLVLMVPLMHEVDTSITGIMSPTSFVYGESVDAANFIQLDDLECHFQPINITLQVYNTGPSTLPGSSVSISFPNRLSSGGAEMFHVQEMVVGQEKGNCSFQKNPTPCIIPQEQENIFHTIFAFFTKSGRKVLDCEKPGISCLTAHCNFSALAKEESRTIDIYMLLNTEILKKDSSSVIQFMSRAKVKVDPALRVVEIAHGNPEEVTVVFEALHNLEPRGYVVGWIIAISLLVGILIFLLLAVLLWKMGFFRRRYKEIIEAEKNRKENEDSWDWVQKNQ
56	DNA	5' RACE 프라이머	GCCAGTGGATAGACTGATGG
57	DNA	5' RACE 프라이머	GATGGATACAGTTGGTGCAGC
58	AA	HuK33N H-쇄의 신호 펩타이드	MKCSWVIFFLMAVVTGVNS
59	AA	HuK33N L-쇄의 신호 펩타이드	MSVPTQLLGLLLLWLTDARC
60	AA	HuK33N의 성숙 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMNWVRQAPGQRLEWIGWIFPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWVSYERGYYFDYWGQGTLVTVSS
61	AA	HuK33N의 성숙 VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYYSLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCKQAYDVPYTFGQGTKVEIK
62	DNA	HuK33N VH 유전자	CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACAAGTTACTATATGAATTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTTGAGTGGATTGGTTGGATCTTTCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCGCCAGTACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATCGTGGGTTAGCTACGAGAGGGGGTATTATTTTGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
63	DNA	HuK33N VL 유전자	GACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

독립 행정법인산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터 FERM10830 20070529

SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd. Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. <120> GENERATION, EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF THE HUMANIZED K33N MONOCLONAL ANTIBODY <130> PCT10-0006 <150> US 61/158,885 <151> 2009-03-10 <150> US 61/251,072 <151> 2009-10-13 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> OPN adhesion sequence <400> 1 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Trp Val Ser Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 423 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccattgccag 60 gtccaactgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggctacag ctttacaagt tactatatga attgggtgaa gaagaggcct 180 ggacagggac ttgagtggat tggttggatc tttcctggaa gtggtaatac taagtacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacactgacg gcagacacat cctccagtac agcctacatg 300 caggtcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgtgggtt 360 agctacgaga gggggtatta ttttgactac tggggtcaag gcaccagtct cacagtctcc 420 tca 423 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Trp Val Ser Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Val Ser Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Cys <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 14 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 atgagtgtgc ccactcaact cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga cgcaggatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120 ctcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacagtttag catggtatca gcagaagcaa 180 gggaaatctc ctcagctcct gatctataat gcaaacagct tggaagatgg tgtcccatcg 240 aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctatga agatcaacag catgcagcct 300 gaagataccg caacttattt ctgtaaacag gcttatgacg ttccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa a 381 <210> 15 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Gly Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Met Gln Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr 100 105 110 Asp Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Gly Cys 20 <210> 18 <211> 563 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aaccacatcc ctcctcagaa gcccccagag cacaactcct taccatggac tggacctgga 60 ggatcctctt tttggtggca gcagccacag gtgcccactc ccaggtccag cttgtgcagt 120 ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct cagtgaaggt ttcctgcaag gcttctggat 180 acaccttcac taactatgct ctgcattggg tgcgccaggc ccccggacaa aggcttgagt 240 ggatgggatg gatcaacact ggcaatggta acacaaaata ttcacagaag ttccagggca 300 gagtcaccct taccagtgac acatccgcga gcacagccta catggagatg agcagcctga 360 gatctgaaga cacggctgtg tattactgtg cgaggagcag tggctggtac gtttggttcg 420 acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag ggcccatcgg 480 ttttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc 540 tggtcaagga ctacttcccc gaa 563 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Val Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 370 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cgctcagctc ctggggctcc tgctactctg gctccgaggt gccagatgtg acatccagat 60 gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg 120 ggcaagtcag agcattagca gctatttaaa ttggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc 180 taagctcctg atctatgctg catccagttt gcaaagtggg gtcccatcaa ggttcagtgg 240 cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcagt ctgcaacctg aagattttgc 300 aacttactac tgtcaacaga gttacagtac ccctcggacg ttcggccaag ggaccaaggt 360 ggaaatcaaa 370 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 462 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> VH of HuK33N including signal peptide <400> 28 gggactagta ccaccatgaa atgcagctgg gttatcttct tcctgatggc agtggttaca 60 ggggtcaatt cacaggtcca actggtgcag tctggagctg aggttaagaa gcctggggct 120 tcagtgaagg tttcctgcaa ggcttctggc tacagcttta caagttacta tatgaattgg 180 gtgcgccagg cccctggaca gaggcttgag tggattggtt ggatctttcc tggaagtggt 240 aatactaagt acaatgagaa gttcaagggc aaggccacac tgacggcaga cacatccgcg 300 agcacagcct acatggagct cagcagcctg agatctgagg acactgccgt ctattactgt 360 gcaagatcgt gggttagcta cgagaggggg tattattttg actactgggg tcaaggaacc 420 ctggtcaccg tctcctcagg tgagtcctca caaaagcttc cc 462 <210> 29 <211> 141 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VH of HuK33N including signal peptide <400> 29 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Val Ser Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 30 <211> 422 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> VL of HuK33N including signal peptide <400> 30 ggggctagca ccaccatgag tgtgcccact caactcctgg ggttgctgct gctgtggctt 60 acagacgcac gatgtgacat ccagatgact cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 120 ggagacagag tcaccatcac atgtcgagca agtgagaaca tttactacag tttagcatgg 180 tatcagcaga agccagggaa agcccctaag ctcctgatct ataatgcaaa cagcttggaa 240 gatggtgtcc catcgaggtt cagtggcagt ggatctggga cacagtatac tctcaccatc 300 agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgta aacaggctta tgacgttccg 360 tacacgttcg gacaagggac caaggtggaa atcaaacgtg agtagaattt aaagaattcc 420 cc 422 <210> 31 <211> 127 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VL of HuK33N including signal peptide <400> 31 Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 85 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RACE primer <400> 56 gccagtggat agactgatgg 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5? RACE primer <400> 57 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal peptide of HuK33N H-chain <400> 58 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Signal peptide of HuK33N L-chain <400> 59 Met Ser Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20 <210> 60 <211> 122 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Mature VH of HuK33N <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Val Ser Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Mature VL of HuK33N <400> 61 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 62 <211> 366 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HuK33N VH gene <400> 62 caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gttaagaagc ctggggcttc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggcta cagctttaca agttactata tgaattgggt gcgccaggcc 120 cctggacaga ggcttgagtg gattggttgg atctttcctg gaagtggtaa tactaagtac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acggcagaca catccgccag tacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc aagatcgtgg 300 gttagctacg agagggggta ttattttgac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 63 <211> 321 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> HuK33N VL gene <400> 63 gacatccaga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacagtttag catggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaaacagct tggaagatgg tgtcccatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tatactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtaaacag gcttatgacg ttccgtacac gttcggacaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

Claims (19)

1. 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 H-쇄, 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 L-쇄를 포함하는, 면역 특이적으로 인간 α9 인테그린을 인지하는, 인간화된 항체.
2. 서열번호 60의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서,
   상기 서열번호 60의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 62의 뉴클레오티드 서열을 가지는, 분리된 핵산 분자.
4. 제2항에 있어서,
   상기 서열번호 61의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 63의 뉴클레오티드 서열을 가지는, 분리된 핵산 분자.
5. 제2항에 있어서,
   신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 분리된 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서,
   상기 신호 펩타이드가 서열번호 58 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 핵산 분자.
7. 제2항의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서,
   상기 핵산 분자는 하나 이상의 조절 인자와 작동가능하게 연결되어 있는, 벡터.
8. 제7항의 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
9. 인간화된 항체가 발현되는 조건 하에, 제8항의 숙주 세포를 배양하고, 발현된 인간화된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 인간화된 항체의 제조 방법.
10. 제1항에 따른 인간화된 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암, 염증성 질환, 장기 이식 후 만성적인 거부 반응, 또는 자기면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 제1항에 따른 인간화된 항체를 포함하는, 암, 염증성 질환, 장기 이식 후 만성적인 거부 반응, 또는 자기면역 질환의 진단용 키트.
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