TW201713691A - 新穎抗人類ＮＧＦ抗體Ｆａｂ片段 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種可保持較高的中和活性，可展現在局部之藥效，而且可降低因全身暴露所引起之全身性的副作用的優良之抗人類NGF抗體片段、及、使用該抗體片段之術後疼痛之治療手段。 一種抗人類NGF抗體Fab片段，其係包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈。

Description

新穎抗人類NGF抗體Fab片段
本發明係有關於一種新穎的抗人類NGF抗體Fab片段。本發明又有關於一種包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段的鹼基序列之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之表現載體、及、經該表現載體轉形之宿主細胞、以及、生產該抗人類NGF抗體Fab片段之方法。本發明另有關於一種包含該抗人類NGF抗體Fab片段之醫藥組成物、及、使用該抗人類NGF抗體Fab片段來治療術後疼痛之方法。
神經成長因子(nerve growth factor；NGF)係總稱為神經營養因子(neurotrophic factor)之體液因子的一種，於生物體內係在神經元之發育、分化、功能維持上擔負著重要作用。作為NGF之受體，已知有高親和性之trkA(tropomyosin receptor kinase A)與低親和性之p75NTR(p75 neurotrophin receptor)。其中p75NTR雖被報導與全部之神經營養因子結合，於神經元之發育過程中與細胞凋亡有所相關，但其作用仍未充分闡明。另一方面， 已知在NGF與trkA之基因剔除小鼠之間可看出同樣的表現型(非專利文獻1)，可認為NGF之生理作用主要係透過trkA表現。
有人報導對大鼠投予NGF則會誘發疼痛(非專利文獻2)，再者，有人報導對人類靜脈內投予NGF會產生全身性的肌肉痛、且藉由NGF的局部投予，除了全身性的疼痛外，也會在投予部位誘發痛覺過敏及異常性疼痛(非專利文獻3)。以動物而言，已知NGF的表現量會因大鼠之術後疼痛模型等肌肉(非專利文獻4)及皮膚(非專利文獻5)組織的切開時等的組織傷害而上昇。就人類疼痛病態而言，已證實在變形性關節炎(osteoarthritis；OA)的關節軟骨NGF及trkA的表現發生亢進(非專利文獻6)；在剖腹生產時的切開部滲出液中NGF水平上昇(非專利文獻7)；風濕性關節炎(非專利文獻8)或間質性膀胱炎(非專利文獻9)的患者，其NGF水平上昇。
迄今已報導在各種的疼痛動物模型中，若阻礙NGF訊號則可抑制疼痛(非專利文獻10、專利文獻1~3)。
作為迄今已報導之對人類NGF的抗體，已報導屬完全人類型抗人類NGF抗體的REGN475(專利文獻2)、1-15(N52D-A)-Fab’-PEG(專利文獻3)、Fulranumab(專利文獻4)、及MEDI-578(專利文獻5)、屬人類化抗人類NGF抗體的Tanezumab(專利文獻6)及PG110(專利文獻7)。其中，已報導在臨床上藉由Tanezumab的靜脈內投 予，以及皮下投予，對於伴隨變形性關節炎而生的關節痛、慢性腰痛、伴隨間質性膀胱炎而生的膀胱痛等的疼痛均顯示出廣泛的鎮痛效果(非專利文獻11~13)。
就醫藥品而言，已報導多數醫藥品具有副作用，如此在抗NGF抗體中也不例外。作為因抗NGF抗體之對人類的投予而表現的不良反應，在Tanezumab的臨床試驗中報導有頭痛、上呼吸道感染、感覺異常等(非專利文獻11)；在Fulranumab的臨床試驗中報導有知覺障礙、頭痛、鼻咽炎等(非專利文獻14)，甚而在REGN475的臨床試驗中報導有關節痛、知覺過敏、肌肉痛、末梢水腫、及關節腫脹等(非專利文獻15)。
一般而言，當暴露於醫藥品所作用之標的組織以外的組織時，在此等組織中會產生對人體而言為不佳的副作用。
一般而言，已開發出將醫藥品直接投予至標的組織，來提高在該部位的組織濃度，而降低經由全身循環血之標的以外的組織的暴露，由此避免副作用的局部投予劑。
多數抗體醫藥品，除對靜脈等血管內的投予者外，也存在有多種對皮下或者肌肉內等部位投予者。此等係對皮下或者肌肉內投予後，經由淋巴管迅速轉移至血中。多數抗體醫藥品係於轉移至血中後經由血流循環運送至標的組織而發揮藥理作用。又，多數抗體醫藥品的分布，在血液中較高，從血中向標的組織的轉移性(組織/血 液濃度比)較低。因此，就多數抗體醫藥品而言，為了維持標的組織的作用濃度，則需維持較高的血中濃度(非專利文獻16)。再者，多數抗體醫藥品係具有數日至1個月左右的血中半衰期，顯示長時間的血中濃度持續性，由此可維持長時間藥理作用。從而，即使將一般的抗體醫藥品投予至皮下或者肌肉內之局部部位，抗體醫藥品的大部分仍會殘留於血液中進行全身循環而表現全身性的藥效及副作用。
就抗體醫藥品等的生物醫藥品而言，二聚體化等的多聚體化在確保穩定且均等的品質上屬較大的課題。
已知Fab’之二聚體的F(ab’)2其體內動態係與Fab’相異(非專利文獻17，18)。
有人報導對Fab’之二聚體的F(ab’)2的自然抗體會引起抗體的消失(非專利文獻19)。此種抗原-抗體反應除了會影響藥劑的體內動態而加速消失外，也會產生過敏性反應等的風險。如此，F(ab’)2有數種風險存在。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2013/183032號
[專利文獻2]國際公開第2009/023540號
[專利文獻3]國際公開第2013/022083號
[專利文獻4]國際公開第2005/019266號
[專利文獻5]國際公開第2006/077441號
[專利文獻6]國際公開第2004/058184號
[專利文獻7]美國專利第8435523號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Reviews in the Neurosciences, 1997, Vol.8, p.13-27
[非專利文獻2]The Journal of Neuroscience, 1993, Vol.13, p.2136-2148
[非專利文獻3]Annals of Neurology, 1994, Vol.36, p.244-246
[非專利文獻4]Anesthesiology, 2009, Vol.110, p.140-149
[非專利文獻5]Pain, 2005, Vol.117, p.68-76
[非專利文獻6]Rheumatology, 2002, Vol.41, p.1413-1418
[非專利文獻7]The Journal of Pain, 2008, Vol.9, p.650-657
[非專利文獻8]Clinical and Experimental Rheumatology, 1997, Vol.15, p.433-438
[非專利文獻9]British Journal of Urology, 1997, Vol.79, p.572-577
[非專利文獻10]Trends in Pharmacological Sciences, 2006, Vol.27, p.85-91
[非專利文獻11]The New England Journal of Medicine, 2010, Vol.363, p.1521-1531
[非專利文獻12]The Journal of Urology, 2011, Vol.185, p.1716-1721
[非專利文獻13]Pain, 2011, Vol.152, p.2248-2258
[非專利文獻14]Pain, 2013, Vol.154, p.1910-1919
[非專利文獻15]Pain, 2014, Vol.155, p.1245-1252
[非專利文獻16]Bioanalysis, 2013, Vol.5, p.2003-2014
[非專利文獻17]The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1997, Vol.281, p.1-8
[非專利文獻18]Cancer Research, 1986, Vol.46, p.3969-3978
[非專利文獻19]European Journal of Immunology, 1995, Vol.25, p.3128-3133
本發明課題在於提供一種可保持較高的中和活性，可展現在局部之藥效，而且可降低因全身暴露所引起之全身性的副作用的優良之抗人類NGF抗體Fab片段。
本發明係包含以下之發明作為醫學上或產業上有用之物質‧方法者。
亦即，於一態樣中，本發明可如下所述。
(1)一種抗人類NGF抗體Fab片段，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段；及(b)藉由(a)之抗人類NGF抗體Fab片段的轉譯後修飾而生成的抗人類NGF抗體Fab片段。
(2)如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段，其係包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈。
(3)如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段，其中轉譯後修飾為重鏈可變區域N端的焦麩胺醯基化。
(4)如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段，其係包含由序列編號5之胺基酸編號1的麩醯胺酸經修飾成焦麩胺酸的序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈。
(5)一種聚核苷酸，其係包含編碼如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列。
(6)一種表現載體，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)包括包含編碼如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片 段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體；及(b)包括包含編碼如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體。
(7)一種宿主細胞，其係經如上述(6)之表現載體轉形。
(8)如上述(7)之宿主細胞，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)經包括包含編碼如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞；及(b)經包括包含編碼如上述(1)之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與包括包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞。
(9)一種生產抗人類NGF抗體Fab片段之方法，其係包含培養如請求項8之宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab片段表現的步驟。
(10)一種抗人類NGF抗體Fab片段，其能以如上述(9)之方法生產。
(11)一種醫藥組成物，其係包含如上述(1)~(4)及(10)中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段、及藥學上可容許 的載體。
(12)如上述(11)之醫藥組成物，其為術後疼痛之治療用局部醫藥組成物。
(13)一種醫藥組成物，其係包含如上述(2)之抗人類NGF抗體Fab片段、如上述(4)之抗人類NGF抗體Fab片段、及藥學上可容許的載體。
(14)如上述(13)之醫藥組成物，其為術後疼痛之治療用局部醫藥組成物。
(15)一種如上述(1)~(4)及(10)中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段的使用，其係用於術後疼痛之治療用局部醫藥組成物的製造。
(16)一種如上述(1)~(4)及(10)中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段之藉由局部投予的使用，其係用於術後疼痛之治療。
(17)一種如上述(1)~(4)及(10)中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段，其係用於對術後疼痛之治療以局部投予使用。
(18)一種術後疼痛之治療方法，其係包含將如上述(1)~(4)及(10)中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段的有效量投予至對象的局部。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段對人類NGF參與病態形成的術後疼痛之治療係屬有用。此種本發 明之抗人類NGF抗體Fab片段，藉由其中和活性及局部滯留性較高且從血中的消失較快之優良的體內動態，而顯示投予量的減少以及藥效持續性的延長，而且可望顯示可降低因全身暴露所引起之全身性的副作用的在臨床應用上藥效、安全性均極為優良的改善。本發明之抗人類NGF抗體Fab片段在人類NGF相關之術後疼痛之治療上有極大的貢獻。
以下，就本發明詳細加以敘述，惟本發明不限定於此等。於本說明書中除非特別定義，否則有關本發明而使用的科學用語及技術用語係具有可由所屬技術領域中具有通常知識者一般所理解之意義。
本案發明人等就抗人類NGF抗體或其抗原結合片段的製作重複相當程度之創意檢討的結果，成功製作可保持較高的中和活性，且可展現在局部之藥效，而且可降低因全身暴露所引起之全身性的副作用的優良之抗人類NGF抗體Fab片段。
抗體分子之基本構造，各類型共通地係由分子量5萬~7萬之重鏈與2萬~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常係由含有約440個胺基酸之多肽鏈所構成，各類型具有特徵構造，對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE而稱作γ、μ、α、δ、ε鏈。進而，IgG中存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別稱為γ1、γ2、γ3、γ4。輕鏈通常係由含 有約220個胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型與K型此2種，分別稱作λ、κ鏈。抗體分子之基本構造的胜肽構成，各自相同的2條重鏈及2條輕鏈係經由雙硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵鍵結，分子量為15萬~19萬。2種輕鏈無論與何種重鏈均可成對。個別的抗體分子，經常由相同的輕鏈2條與相同的重鏈2條所成。
鏈內S-S鍵，重鏈有四個(μ、ε鏈有五個)、輕鏈有二個，按胺基酸每100~110個殘基形成一個環(loop)，此立體構造在各環間係類似，稱作構造單元或者結構域(domain)。位於N端之結構域，在重鏈、輕鏈皆然，縱為來自同種動物之同一類型(亞類型)之樣品，其胺基酸序列並非固定，而稱作可變區域，各結構域則分別稱作重鏈可變區域(VH)及輕鏈可變區域(VL)。由可變區域往C端側之胺基酸序列，在各個類型或者亞類型中大致固定，而稱作恆定區域，各結構域分別以CH1、CH2、CH3或者CL表示。
抗體之抗原決定部位係由VH及VL構成，結合之特異性係依此部位之胺基酸序列而定。另一方面，與補體或各種細胞之結合等之生物學活性，係反映了各類型Ig之恆定區域構造的差別。重鏈與輕鏈之可變區域的可變性，已知大致侷限在於重輕鏈均存在之3個小的超可變區域，該等區域稱作互補性決定區域(CDR；由N端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區域之剩餘部分稱作框架區域(FR)，其較為固定。
在抗體之重鏈恆定區域之CH1結構域與CH2結構域之間的區域稱為鉸鏈(hinge)區域，此區域係含有多數之脯胺酸殘基，且包含連結2條重鏈之複數個鏈間S-S鍵。例如，於人類之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之各鉸鏈區域，係包含構成重鏈間之S-S鍵的分別為2個、4個、11個、2個之半胱胺酸殘基。鉸鏈區域係對於木瓜酵素或胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素的感受性較高的區域。以木瓜酵素消化抗體時，重鏈會在比鉸鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠N端側之位置被切斷，而分解為2個Fab片段與1個Fc片段。Fab片段係由輕鏈；與包含重鏈可變區域(VH)、CH1結構域與鉸鏈區域之一部分的重鏈片段所構成。以胃蛋白酶消化抗體時，重鏈會在比鉸鏈區域之重鏈間S-S鍵更靠C端側之位置被切斷，生成F(ab’)2片段。F(ab’)2片段係2個Fab’片段以鉸鏈區域中之重鏈間S-S鍵鍵結之二聚體構造的片段。Fab’片段係由輕鏈；與包含重鏈可變區域(VH)、CH1結構域與鉸鏈區域之一部分的重鏈片段所構成，此鉸鏈區域之部分係包含構成重鏈間S-S鍵之半胱胺酸殘基。Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段均包含可變區域，而具有抗原結合活性。
本案發明人等成功製作的本發明之抗人類NGF抗體Fab片段為具有以下之特徵的Fab片段： 包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段。
具體而言，本案發明人等改變完全人類型抗人類NGF抗體1-15(N52D-A)-Fab’片段(專利文獻3；於該文獻中亦稱1-15(N52D-A)-Fab’)，藉由使用各種生物學的活性試驗及物性試驗之抗體的篩選，成功鑑定出本發明之抗人類NGF抗體Fab片段作為穩定且可保持較高的中和活性及局部滯留性的抗人類NGF抗體Fab片段。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段可由所屬技術領域中具有通常知識者基於本案說明書所揭示之序列資訊，使用該領域中周知之方法容易地製作。例如，本發明之抗人類NGF抗體Fab片段係藉由合成包含編碼其重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸，再連結於適當的表現載體。接著，將該表現載體導入於培養細胞中。最後培養該培養細胞，可由培養上清液獲得單株Fab片段。
包含編碼本發明之Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼本發明之Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸可例如基於根據該重鏈片段及輕鏈之胺基酸序列而設計的鹼基序列，利用該領域中周知之基因合成方法來合成。作為如此之基因合成方法，可使用國際公開第90/07861記載之抗體基因之合成方法等所屬技術領域中具有通常知識者所周知之各種方法。
於一實施形態中，作為包含編碼由序列編號5所示之胺基酸序列構成的抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸，可舉出例如包含序列編號 1所示之鹼基序列的聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號8所示之胺基酸序列構成的抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸，可舉出例如包含序列編號4所示之鹼基序列的聚核苷酸。
緊接著包含編碼本發明之Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸及包含編碼本發明之Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的製作之後，對於該聚核苷酸對表現載體的導入、表現載體對培養細胞的導入、培養細胞的培養、Fab片段的純化等，可使用該領域中周知的各種方法來進行。
作為使用之表現載體，可舉出例如GS載體pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)，只要是可表現包含編碼本發明之Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸，而產生藉由此等編碼的多肽者則不特別限制。
上述之表現載體係藉由例如磷酸鈣法、電穿孔法等導入培養細胞中。
作為導入表現載體之培養細胞，例如可使用CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等的培養細胞，只要是藉由一般方法培養即可。
上述培養後，累積於培養上清液中之Fab片段可藉由各種管柱層析來純化，例如可使用KappaSelect等之管柱層析。
作為本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的實 例，可舉出後述實施例所記載之hlf.6抗體。
使抗體在細胞中表現時，已知有使抗體在轉譯後經受修飾者。作為轉譯後修飾的實例，可舉出重鏈C端之離胺酸之藉由羧肽酶的切斷、重鏈及輕鏈N端之麩醯胺酸或麩胺酸之藉由焦麩胺醯基化衍生成焦麩胺酸的修飾、糖化(glycosylation)、氧化、脫醯胺、醣化(glycation)等，已知對於各種的抗體，會產生此種轉譯後修飾(J.Pharm.Sci.,2008,Vol.97,p.2426-2447)。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段亦可包含藉由轉譯後修飾而生成的抗人類NGF抗體Fab片段。作為可藉由轉譯後修飾而生成的本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的實例，可舉出重鏈可變區域N端經焦麩胺醯基化的抗人類NGF抗體Fab片段。此種N端經焦麩胺醯基化的轉譯後修飾不會對抗體的活性造成影響為該領域中周知者(Anal.Biochem.,2006,Vol.348,p.24-39)。
例如，本發明之抗人類NGF抗體Fab片段亦包含以下之抗人類NGF抗體Fab片段：包含由序列編號5之胺基酸編號1的麩醯胺酸經修飾成焦麩胺酸的序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段係結合於人類NGF。作為測定所得之抗人類NGF抗體Fab片段對人類NGF的結合活性之方法，係有ELISA或FACS等方 法。例如，使用ELISA的情況時，係將人類NGF固定於ELISA盤，對其添加Fab片段而使其反應後，使以生物素等標記之抗kappa抗體等二次抗體及鹼性磷酸酶標記鏈親和素反應後，藉由使用了檢測其活性之試劑(例如，若為鹼性磷酸酶標記時，為化學發光鹼性磷酸酶基質)等的活性測定，來鑑定二次抗體之結合。又，本發明之抗人類NGF抗體Fab片段中，除了人類NGF外，亦可結合於來自其他動物之NGF(例如小鼠NGF)，亦可測定對該等蛋白質之結合活性。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段係具有對人類NGF之中和活性。於本說明書中使用時，抗人類NGF抗體Fab片段之「中和活性」，意指藉由對NGF之結合，來阻礙透過NGF帶來之任意之生物活性的活性，能夠以NGF之1個或複數個生物活性作為指標來評估。如此之中和活性，可舉出例如人類NGF與屬其受體之人類trkA的結合阻礙活性，可透過使用如後述實施例記載之方法來評估。
為了更詳細地評估本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的效果，亦可採用在in vivo的試驗。例如，如後述實施例所記載，可採用使用大鼠腳掌切開術後痛模型之鎮痛效果試驗等，來評估抗人類NGF抗體Fab片段在in vivo的藥效。又，亦可藉由進行將抗人類NGF抗體Fab片段對大鼠的大腿肌肉局部投予後使用其組織均漿之與NGF的結合活性評估試驗、或NGF與屬其受體之trkA 的結合阻礙活性評估試驗，來確認組織中之抗人類NGF抗體Fab片段的藥理活性。再者，也可藉由進行血漿中及組織中的藥物濃度評估試驗，來評估Fab片段之局部曝露量的維持及全身血中曝露量的降低。
此外，作為評估本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的各種穩定性(例如熱穩定性、長期保存穩定性、高濃度穩定性)的方法，可舉出例如利用藉由尺寸排除層析之保存中的凝聚物形成的測定之方法。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段可視需求經純化後，依循一般方法製劑化，而使用於術後疼痛之治療。
「術後疼痛」係指起因於切割、穿刺、切開、裂傷、或個體之組織內的創傷等的外部之外傷或由此產生的疼痛(無論為侵襲性或非侵襲性，包含所有因外科處理所引起者)。本說明書中使用的術後疼痛不包含未伴有來自外部之物理性外傷而引起(非起因於外傷、或非由外傷衍生者)的疼痛。術後疼痛為內部或外部(含末梢)之疼痛，創傷、切割、外傷、裂傷或切開可能偶發性(若為外傷創傷時)或意圖性(若為手術時之切開時)地引起。疼痛可採用疼痛評分及該領域中周知的其他方法客觀及主觀性地評估。本說明書中使用的術後疼痛係包含痛覺超敏(亦即，通常為屬非侵害性之對刺激之反應的增加)及痛覺異常過敏(亦即，通常為對侵害性或不適之刺激之反應的增加)，而此等有時為熱或機械性之性質。疼痛係依據熱感受性、 對機械刺激之感受性及/或靜止時疼痛來表徵。術後疼痛係包含對機械刺激所誘發之疼痛及靜止時疼痛。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段可作為術後疼痛之治療劑使用。作為此治療劑之劑型的實例，可舉出注射劑、點滴用劑、持效性注射劑等的非口服劑，較佳藉由對標的組織局部的肌肉內注射、皮下注射等投予。又，於製劑化之際，在藥學上可容許的範圍內，可使用對應此等劑型的載體或添加劑。
上述製劑化時之本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的添加量係隨患者症狀的程度或年齡、使用之製劑的劑型、或者抗體的結合力價等而異，例如，只要使用0.001mg/kg至100mg/kg左右即可。
又，本發明亦有關於一種包含本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物亦可包含藥學上可容許的載體或添加劑。藥學上可容許的載體或添加劑的種類不特別限定，可使用所屬技術領域中具有通常知識者所周知之載體或添加劑。本發明亦有關於一種供使用於術後疼痛之治療的本發明之抗人類NGF抗體Fab片段、及、用於術後疼痛之治療用醫藥組成物的製造的本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的使用。本發明亦有關於一種包含將本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的有效量投予至對象的局部的術後疼痛之治療方法。此外，「對象」係需要該治療的人類或其他的哺乳動物，作為某一形態，為需要該治療的人類。本發明之治療方法中 的抗人類NGF抗體Fab片段的有效量可為與上述製劑化時之Fab片段的添加量相同的量。又，本發明之局部醫藥組成物係指對待治療的部位、或與該區域相鄰的部位，尤為外科手術時之切開組織等的標的組織、或者其附近投予、使用的醫藥組成物。例如，如上述所記載，可藉由對標的組織局部的肌肉內注射、皮下注射等投予。又，包含本發明之抗人類NGF抗體Fab片段在標的組織局部滯留一定時間，較佳為72小時，更佳為24小時。
本發明之醫藥組成物可包含複數種本發明之抗人類NGF抗體Fab片段。例如，含有未經受轉譯後修飾的抗人類NGF抗體Fab片段及經由轉譯後修飾而生成的抗人類NGF抗體Fab片段的醫藥組成物亦包含於本發明中。
於一實施形態中，本發明之醫藥組成物亦包含含有以下之(a)及(b)之抗人類NGF抗體Fab片段的醫藥組成物。
(a)包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段；及(b)藉由(a)之抗人類NGF抗體Fab片段的轉譯後修飾而生成的抗人類NGF抗體Fab片段。
於一實施形態中，本發明之醫藥組成物亦包含含有以下之(a)及(b)之抗人類NGF抗體Fab片段的醫藥組成物。
(a)包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段；及(b)包含由序列編號5之胺基酸編號1的麩醯胺酸經修飾成焦麩胺酸的序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段。
本發明又有關一種包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸、及包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸(以下，亦總稱為「本發明之聚核苷酸」)、以及包含彼等其中一者或兩者之表現載體(以下，亦稱為「本發明之表現載體」)。
本發明之表現載體，只要是可在原核細胞及/或真核細胞之各種的宿主細胞中表現包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸，而產生藉由此等編碼的多肽者則不特別限制。作為使用之表現載體，可舉出質體載體、病毒載體(例如腺病毒、反轉錄病毒)等，可使用例如GS載體pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。於一實施形態中，本發明之表現載體為包括包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體。於另一實施形態中，本發明之表現載體為包括包含編 碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體。
本發明之表現載體可包含連結於可對本發明之聚核苷酸發揮功能的啟動子。作為用以於細菌中表現編碼本發明之Fab片段或者其重鏈可變區域及/或輕鏈可變區域之基因的啟動子，宿主為大腸桿菌屬菌的情況時，可舉出例如Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、tac啟動子等。作為於酵母中之表現用啟動子，可舉出例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子；作為於芽孢桿菌屬菌中之表現用啟動子，可舉出SL01啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。又，宿主為哺乳動物細胞等真核細胞時，可舉出來自SV40之啟動子、反轉錄病毒之啟動子、熱休克啟動子等。
使用細菌，特別是大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體可進一步包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域及可複製單元。另一方面，使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞作為宿主的情況時，本發明之表現載體可包含起始密碼子、終止密碼子。又，此時，亦可包含增強子(enhancer)序列、編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之基因的5’側及3’側非轉譯區域、分泌訊息序列、剪接(splicing)接合部位、聚腺苷酸化部位、或可複製單元等。又，亦可依照目的而包含通常所使用之篩選標記(例 如四環黴素抗性基因、安比西林抗性基因、卡那黴素抗性基因、新黴素抗性基因、二氫葉酸還原酵素基因)。
本發明又有關於一種經本發明之表現載體轉形之宿主細胞。作為轉形體之製造所使用的宿主細胞，只要是適合前述表現載體而可被轉形者則不特別限定，可舉例本發明之技術領域中通常使用之天然細胞或者人工建立之細胞等各種細胞(例如細菌(大腸桿菌屬菌、芽孢桿菌屬菌)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)、動物細胞(CHO-K1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞等)或昆蟲細胞(例如Sf9)等)。轉形可藉由本身周知之方法進行。
作為本發明之宿主細胞，可舉出以下之(a)及(b)：(a)經包括包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸、與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞；及(b)經包括包含編碼本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體、與包括包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞。
本發明又有關於一種包含培養本發明之宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab片段表現的步驟之生產抗人類NGF抗體Fab片段之方法。較佳的是，作為該方法中所使用的宿主細胞，可舉出前述本發明之宿主細胞(a)及 (b)。
在本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的生產中，經轉形之宿主細胞可於營養培養基中培養。營養培養基較佳含有宿主細胞之生育所必須之碳源、無機氮源或者有機氮源。作為碳源，可舉例例如葡萄糖、聚葡萄糖、可溶性澱粉、蔗糖等；作為無機氮源或者有機氮源，可舉例例如銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆餅、馬鈴薯萃取液等。又，亦可依照期望而含有其他營養素(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維生素類等)、抗生素(例如四環黴素、新黴素、安比西林、卡那黴素等)。
宿主細胞之培養本身係藉由周知之方法進行。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間係適當選擇。例如，宿主為動物細胞時，培養基可使用含約5~20%之胎牛血清的MEM培養基(Science,1955,Vol.122,p.501-504)、DMEM培養基(Virology,1959,Vol.8,p.396-397)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.,1967,Vol.199,p.519-524)、199培養基(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1950,Vol.73,p.1-8)等。培養基之pH較佳為約6~8，培養通常在約30~40℃進行約15~72小時，亦可視需求進行通氣或攪拌。宿主為昆蟲細胞時，可舉出例如含胎牛血清的Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,Vol.82,p.8404-8408)等，其pH較佳為約5~8。培養通常在約20~40℃進行15~100小時，亦可視需求進行通氣或攪拌。 宿主為細菌、放線菌、酵母、絲狀菌時，例如，含有上述營養源之液體培養基較為適宜。較佳為pH為5~8之培養基。宿主為E.coli時，較佳之培養基可舉例LB培養基、M9培養基(Mol.Col.,Cold Spring Harbor Laboratory,Vol.3,A2.2)等。該情況時，培養可視需求一邊通氣、攪拌，同時在通常14~43℃進行約3~24小時。宿主為Bacillus屬菌時，可視需求一邊通氣、攪拌，同時在通常30~40℃進行約16~96小時。宿主為酵母時，作為培養基，可舉出例如Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1980,Vol.77,p.4504-4508)，pH較佳為5~8。培養係通常在約20~35℃進行約14~144小時，亦可視需求進行通氣、攪拌。
生產本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的方法，除了培養本發明之經轉形的宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab片段表現的步驟外，進而，亦可由該宿主細胞回收抗人類NGF抗體Fab片段，較佳為進行單離、純化。作為單離或純化方法，可舉出例如鹽析、溶劑沉澱法等利用溶解度之方法；透析、超微過濾、膠體過濾、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺膠體電泳等利用分子量之差的方法；離子交換層析或羥磷灰石層析等利用電荷之方法；親和性層析等利用特異性親和性之方法；逆相高效液相層析等利用疏水性差異的方法；等電點電泳等利用等電點差異的方法等。
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段亦包含能 以生產本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之方法生產的抗人類NGF抗體Fab片段。
關於本發明已概括記載，於此提供為了進一步理解而參照之特定實施例，但該等僅為舉例的目的，並非限定本發明。
[實施例]
關於使用市售套組或試劑等之部分，若無特別指明，係遵照所附實驗流程(protocol)來進行實驗。
(實施例1：抗人類NGF抗體Fab片段的製作)
本案發明人等改變完全人類型抗人類NGF抗體1-15(N52D-A)-Fab’片段(專利文獻3；於該文獻中亦稱1-15(N52D-A)-Fab’)，進行3種抗人類NGF抗體Fab片段的製作。
首先，以包含1-15(N52D)-Fab’片段(專利文獻3)之重鏈的表現載體為模板，使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes公司，F-530L)將VH至鉸鏈區域的基因片段擴增成3種。擴增之區域的5’側含有HindIII、3’側含有EcoRI。以HindIII與EcoRI(皆為NEB公司)消化如此所得之重鏈基因片段，插入於作為表現載體的pEE6.4。
將此等表現質體藉由一般方法導入於大腸菌而得到轉形殖株，其後使用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega公司，A1460)調製質體DNA。另一方面，輕鏈基因為與1-15(N52D-A)-Fab’片段之輕鏈基因相同的鹼基序列(序列編號4)，以其編碼的胺基酸序列為序列編號8。使用包含該輕鏈基因片段的pEE12.4。
將插入有抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈基因片段的GS載體(pEE6.4)、及插入有抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈基因片段的GS載體(pEE12.4)，使用作為限制酶的NotI與PvuI(均為NEB公司)分別予以切斷。其後，使用DNA Ligation Mix(TAKARA BIO公司，6023)進行接合作用，建構出插入有抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈及輕鏈此兩基因片段的GS載體。以所得質體DNA為模板進行定序反應，在待選殖之重鏈確認出VH至鉸鏈區域，在輕鏈確認出VL至CL區域的鹼基序列。將3種重鏈之該VH至鉸鏈區域的鹼基序列表示為序列編號1、序列編號2及序列編號3。又，將以此編碼的胺基酸序列分別表示為序列編號5、序列編號6及序列編號7。3種抗人類NGF抗體Fab片段係組合製作序列編號1之重鏈與序列編號4之輕鏈、序列編號2之重鏈與序列編號4之輕鏈及序列編號3之重鏈與序列編號4之輕鏈，分別將其稱為hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體。
使用該GS載體，以暫時表現及恆定表現此2種方法使抗人類NGF抗體Fab片段表現。對於暫時表現，係對以CD-CHO medium(Invitrogen公司)培養的 CHO-K1SV細胞(Lonza公司)，將該GS載體藉由MaxCyte電穿孔裝置(MaxCyte公司)進行轉染，培養7天。由其培養上清液，使用KappaSelect(GE Healthcare公司，17-5458-02)將抗人類NGF抗體Fab片段純化。對於恆定表現，則使用電穿孔法將以作為限制酶的PvuI切斷的該GS載體對CHO-K1SV細胞進行轉染而使抗人類NGF抗體Fab片段表現。由其培養上清液，使用KappaSelect將抗人類NGF抗體Fab片段純化，並以尺寸排除層析及SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳進行確認。此外，為確認純化之hlf.6抗體的轉譯後修飾而進行質譜分析的結果，其大部分產生被視為N端之焦麩胺醯基化的峰。
(實施例2：各抗人類NGF抗體Fab片段的人類NGF機能阻礙活性評估)
為進行所製作之各抗人類NGF抗體Fab片段的人類NGF機能阻礙活性評估，而進行以人類NGF與其受體trkA之結合阻礙為指標的人類NGF-trkA拮抗ELISA。將人類trkA(R&D Systems公司，175-TK-050)以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)稀釋成2000ng/mL，對Nunc MaxiSorp白色96孔盤(plate)(Nunc公司，436110)按每1孔添加50μL，於4℃對孔盤進行培養一夜而進行固相化。藉由逆離心去除人類trkA固相液，將Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每1孔添加200μL。對孔盤在室溫下進行培養30分鐘後，藉由逆離心去除Blocker Casein in TBS。將使用含有0.1%來自牛血清之白蛋白(BSA)的PBS，在約200000ng/mL至約2ng/mL之間稀釋成7至11階段的純化抗體試樣分別與700ng/mL的生物素化人類NGF各以等量混合，在室溫下培養30分鐘而得到試樣，將其按每1孔添加100μL。此外，此處所使用的生物素化人類NGF係採用將人類NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)使用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo公司，21329)予以生物素化者。人類NGF的生物素化係藉由對250μL的0.4mg/mL人類NGF溶液添加1.25μL的5mM NHS-PEG4-Biotin溶液，在冰上、遮光條件下使其反應2小時後，遵循手冊使用Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore公司，UFC500324)2次，將反應液回收作為PBS溶液來進行。作為控制組係準備含有0.1%BSA的PBS。在室溫下培養30分鐘後，將孔盤以清洗液(含有0.05%之Tween-20的三羥甲基胺基甲烷緩衝生理食鹽水(TBS))清洗3次，將使用以PBS稀釋20倍之Blocking One(nacalai tesque公司，03953-95)溶液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標記鏈親和素(Thermo公司，21324)按每1孔添加100μL。在室溫下培養30分鐘後，將孔盤以清洗液清洗3次，將以含有0.1mM氯化鎂之2mM三羥甲基胺基甲烷(pH9.8)緩衝液稀釋5倍的鹼性磷酸酶基質(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate，Super Sensitive，450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每1孔添加100μL。在室溫下培養30分鐘，以 EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定其訊號值。
實施1-15(N52D-A)-Fab’片段、hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體的試驗2次(trial)。在算出各抗體的人類NGF-trkA結合阻礙率之際，係將含有0.1%BSA的PBS的測定值設為0%，將各抗體之最大濃度的測定值設為100%。解析算出之人類NGF-trkA結合阻礙率，根據3參數邏輯或4參數邏輯曲線回歸算出抗體的IC50值。將實施2次所得之IC50值進行幾何平均的結果，1-15(N52D-A)-Fab’片段、hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體的人類NGF-trkA結合阻礙IC50值各為0.30μg/mL、0.32μg/mL、0.30μg/mL、0.28μg/mL，此等人類NGF-trkA結合阻礙能力係大致相等。
(實施例3：各抗人類NGF抗體Fab片段之依據50℃、14天保存的二聚體形成評估)
將1-15(N52D-A)-Fab’片段、hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體的各溶液取代為pH5，6，7的緩衝液(pH5，6為20mM檸檬酸‧120mM NaCl，pH7為PBS)，調整成10mg/mL並以50℃、14天保存，評估穩定性。
以50℃、14天保存前後之試樣中的二聚體的形成係利用LC1100(Agilent Technologies公司)，使用作為管柱的TSK gel Super Sw3000(TOSOH公司，2mmID×300mm)尺寸排除層析來評估。作為移動相係使用對0.1M磷酸氫二鈉、0.2M L(+)精胺酸鹽添加鹽酸調整成 pH6.8的溶液，以流速0.075mL/分、溫度25℃使用，並以檢測波長280nm、參考波長360nm進行測定。測定係各實施2次並將二聚體形成率進行算術平均，由保存後的二聚體形成率減去保存前的二聚體形成率來算出二聚體增加率。其結果，1-15(N52D-A)-Fab’片段的二聚體增加率在pH5，6，7的條件下各為5.4%、17.0%、18.2%，在任一種pH下皆可看出顯著的二聚體之形成。另一方面，hlf.6抗體的二聚體增加率在pH5，6，7的條件下各為0.1%、0.3%、0.5%；hlf.7抗體的二聚體增加率在pH5，6，7的條件下各為0.1%、0.3%、0.4%；hlf.8抗體的二聚體增加率在pH5，6，7的條件下各為0.1%、0.5%、0.7%。hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體，比起1-15(N52D-A)-Fab’片段，二聚體的增加率顯著降低，顯示其較為穩定。
(實施例4：各抗人類NGF抗體Fab片段之依據50℃、14天保存的人類NGF機能阻礙活性穩定性評估)
使用實施例2所記載的人類NGF-trkA拮抗ELISA評估在pH6以50℃、14天保存的1-15(N52D-A)-Fab’片段、hlf.6抗體、hlf.7抗體、及hlf.8抗體之保存後的人類NGF-trkA結合阻礙活性的變化。將實施2次所得之IC50值進行幾何平均的結果，1-15(N52D-A)-Fab’片段、hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體之50℃、14天保存後的人類NGF-trkA結合阻礙IC50值各為0.47μg/mL、0.38μg/mL、0.56μg/mL、0.47μg/mL。各抗體之50℃、14天保存後相 對於保存前的IC50增加率各為59%、21%、87%、68%。
由以上可看出，可使hlf.6抗體、hlf.7抗體、hlf.8抗體在50℃、14天的保存下由1-15(N52D-A)-Fab’片段引起的二聚體增加顯著減少。hlf.6抗體其保存中的活性減弱亦較少，而為具有高穩定性的抗NGF抗體Fab片段。
(實施例5：使用ELISA之抗人類NGF抗體的人類NGF結合評估)
為測定hlf.6抗體的抗原結合活性，而使用ELISA。於此，為評估對人類NGF的結合能力，而使用將人類NGF固相化的孔盤進行試驗。此時，作為比較對照係使用先前抗體Tanezumab。
將人類NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)以PBS稀釋成1000ng/mL，對Nunc MaxiSorp白色96孔盤(Nunc公司，436110)按每1孔添加100μL，於4℃對孔盤進行培養一夜而進行固相化。藉由逆離心去除人類NGF固相液，將Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每1孔添加200μL，在室溫下對孔盤進行培養30分鐘。其後藉由逆離心去除Blocker Casein in TBS，使用含有0.1%BSA的PBS，將純化抗體試樣從1000ng/mL至0.01ng/mL稀釋成11階段，按每1孔添加100μL，在室溫下對孔盤進行培養30分鐘。作為控制組係準備含有0.1%BSA的PBS。將孔盤以清洗液(含有0.05% 之TBS的TBS)清洗3次，將使用以PBS稀釋20倍之Blocking One(nacalai tesque公司，03953-95)溶液稀釋1000倍的生物素化抗人類Kappa輕鏈抗體(IBL公司，17249)按每1孔添加100μL，在室溫下培養30分鐘。將孔盤以清洗液清洗3次，使用以PBS稀釋20倍之Blocking One溶液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標記之Streptavidin(Thermo公司，21324)按每1孔添加100μL，將孔盤於室溫下培養0.5小時。以清洗液清洗3次，將以含有0.1mM氯化鎂之2mM三羥甲基胺基甲烷(pH9.8)緩衝液稀釋5倍的鹼性磷酸酶基質(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate，Super Sensitive，450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每1孔添加100μL。在室溫下培養30分鐘，以EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定其訊號值。
以複製進行各抗體之試驗，算出算術平均。在算出各抗體的人類NGF結合率之際，係將含有0.1%BSA的PBS的測定值設為0%，將各抗體之最大濃度的測定值設為100%。解析算出之人類NGF結合率，根據3參數邏輯曲線回歸算出抗體的EC50值。針對hlf.6抗體將實施2次所得之EC50值進行幾何平均的結果，相對於hlf.6抗體的EC50值為73.0ng/mL，Tanezumab的EC50值為146ng/mL。
(實施例6：抗人類NGF抗體的人類NGF機能阻礙活性評 估)
為測定hlf.6抗體的人類NGF機能阻礙活性，而使用供評估實施例2中所採用之NGF-trkA結合阻礙的拮抗ELISA。此時，作為比較對照係使用先前抗體Tanezumab。
hlf.6抗體係實施4次、Tanezumab係實施3次，算出算出之IC50值的幾何平均。其結果，相對於hlf.6抗體的人類NGF-trkA結合阻礙IC50值為0.31μg/mL，Tanezumab的人類NGF-trkA結合阻礙IC50值為0.86μg/mL。
(實施例7：組織中之抗體的局部滯留性、人類NGF結合活性及人類NGF機能阻礙活性的評估)
局部投予hlf.6抗體後，為評估抗體的局部滯留，而評估投予組織中的抗體濃度。對正常大鼠，以各n=4將hlf.6抗體以0.3及3mg/kg對大腿肌肉內局部投予，藉由Electrochemiluminescence(ECL)分析法測定投予6小時後之大腿肌肉中的抗體濃度。局部投予係藉由將抗體，以PBS作為溶媒以0.2mL/kg的投予容量注射至大腿肌肉內來進行。
採取之大腿肌肉組織係添加2.5倍量的組織均漿液(10mM三羥甲基胺基甲烷，137mM NaCl，cOmplete，Mini(Roche公司)，pH8.0)，製成大腿肌肉均漿。ECL分析法中的測定係使用對VelocImmune小鼠將人類NGF免 疫而得到1-15抗體(專利文獻3)，將其對小鼠免疫而取得的2種抗1-15抗體，即ANA-IBL-13A與生物素化ANA-IBL-52A。此外，此處所使用的生物素化ANA-IBL-52A係採用將ANA-IBL-52A使用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學，LK03)，遵循技術手冊予以生物素化者。
以下示出ECL分析法之方法。將作為抗1-15抗體的ANA-IBL-13A以TBS稀釋成1000ng/mL，對Multi-array 96-well Plate(Meso Scale Discovery公司，L15XA-6)按每1孔添加25μL。藉由在室溫下對孔盤進行培養1小時，而使ANA-IBL-13A固相化。藉由逆離心去除ANA-IBL-13A固相液，將孔盤以清洗液(含有0.05%之Tween-20的TBS)清洗3次，將Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每1孔添加150μL。在室溫下培養1小時後，藉由逆離心去除Blocker Casein in TBS，將孔盤以清洗液清洗3次，大腿肌肉均漿係以稀釋液(含有0.05%之Tween-20的Blocker Casein in TBS)稀釋100倍，進而對需要稀釋的試樣，使用含有1%的未投予抗體之大腿肌肉均漿的稀釋液予以稀釋成檢量線的範圍內，按每1孔添加25μL。大腿肌肉均漿之檢量線作成用係準備將使用稀釋液從10000ng/mL至0.51ng/mL稀釋成10階段的hlf.6抗體，使用含有1%的未投予抗體之大腿肌肉均漿的稀釋液稀釋100倍的試樣。作為控制組，係準備含有1%的未投予抗體之大腿肌肉均漿的稀釋液。在室溫下培養1小時後，藉由逆離心去除溶液，將孔盤以清洗 液清洗3次，將使用稀釋液稀釋成300ng/mL的生物素化ANA-IBL-52A按每1孔添加25μL。在室溫下培養1小時後，藉由逆離心去除溶液，將孔盤以清洗液清洗3次，添加25μL之使用稀釋液稀釋成1000ng/mL的MSD SULFO-TAG labeled Streptavidin(Meso Scale Discovery公司，R32AD-1)。在室溫下培養1小時後，藉由逆離心去除溶液，將孔盤以清洗液清洗3次。添加150μL之以超純水(MilliQ(註冊商標)，Merck公司)稀釋2倍的MSD Read Buffer T(4x)with Surfactant(Meso Scale Discovery公司，R92TC-2)，以SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery公司)測定其電化學發光。
於算出抗體濃度之際，作成檢量線。回歸式係以4參數邏輯曲線回歸進行解析。由檢量線算出各點下的大腿肌肉中的抗體濃度。對各個體進行複製，求出濃度的算術平均。
將hlf.6抗體以0.3及3mg/kg對大腿肌肉內局部投予，測定投予6小時後之大腿肌肉中濃度的結果，在hlf.6抗體的0.3及3mg/kg投予群中各為2.66μg/mL及67.9μg/mL。
其次，為測定在大腿肌肉中之具有人類NGF結合活性的hlf.6抗體量，而使用人類NGF結合ELISA。
將人類NGF(R&D Systems公司，256-GF/CF)以PBS稀釋成1000ng/mL，對Nunc MaxiSorp白色384孔盤(Nunc公司，460372)按每1孔添加20μL，於4℃對孔盤 進行培養一夜而進行固相化。藉由逆離心去除人類NGF固相液，將Blocking One(nacalai tesque公司，03953-95)溶液按每1孔添加80μL，在室溫下對孔盤進行培養1小時。將孔盤以清洗液(含有0.05%之Tween-20的TBS)清洗3次，使用以含有0.05%之Tween-20的TBS稀釋10倍的Blocking One，在0.3mg/kg投予群係將大腿肌肉均漿稀釋10倍，在3mg/kg投予群則稀釋100倍，按每1孔添加20μL。
又，0.3mg/kg投予群及3mg/kg投予群之大腿肌肉均漿的檢量線作成用係以對以含有0.05%之Tween-20的TBS稀釋10倍的Blocking One添加10%及1%的未投予抗體之大腿肌肉均漿的稀釋液，分別將hlf.6抗體從3000ng/mL至0.03ng/mL稀釋成11階段，按每1孔添加20μL。
在室溫下培養1小時後，將孔盤以清洗液清洗3次，使用以含有0.05%之Tween-20的TBS稀釋10倍的Blocking One將生物素化抗人類Kappa輕鏈抗體(IBL公司，17249)稀釋2500倍，按每1孔添加20μL。在室溫下培養1小時後，將孔盤以清洗液清洗3次，使用以含有0.05%之Tween-20的TBS稀釋10倍的Blocking One將高感度鏈親和素-HRP(Thermo公司，21130)稀釋8000倍，按每1孔添加20μL並在室溫下對孔盤進行培養1小時。將孔盤以清洗液清洗3次，將化學發光基質(BM Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)；Roche公司， 11582950001)按每1孔添加20μL，以EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定其訊號值。試驗係以複製，為算出具有人類NGF結合活性的抗體量而作成檢量線。回歸式係根據4參數邏輯曲線回歸，由檢量線算出各點下之具有人類NGF結合活性的抗體量。就0.3及3mg/kg投予群，透過使其成為35倍及350倍而求出在大腿肌肉中之具有人類NGF結合活性的hlf.6抗體量，算出算術平均。
其結果，在0.3mg/kg投予群中具有人類NGF結合活性的hlf.6抗體為2.12μg/mL，在3mg/kg投予群中為77.9μg/mL。此值為實施例2中測得之NGF-trkA結合阻礙IC50值之分別高6.6倍及243倍的濃度。
從而，由上述之大腿肌肉中的hlf.6抗體濃度及具有人類NGF結合活性的hlf.6抗體量的結果顯示，存在於大腿肌肉中的抗體幾乎全部具有人類NGF結合活性，殘留有可充分阻礙NGF-trkA結合的抗體。
因此，其次，為進行大腿肌肉中的人類NGF機能阻礙活性評估，而進行以人類NGF與其受體trkA之結合阻礙為指標的人類NGF-trkA拮抗ELISA。
將人類trkA(R&D Systems公司，175-TK-050)以PBS稀釋成2000ng/mL，對Nunc MaxiSorp白色384孔盤按每1孔添加20μL，於4℃培養一夜而進行固相化。藉由逆離心去除人類trkA固相液，將Blocker Casein in TBS按每1孔添加80μL。在室溫下對孔盤進行培養30分鐘。將孔盤以清洗液(含有0.05%之Tween-20的TBS)清洗3次，以 去除Blocker Casein in TBS。將使用含有0.1% BSA的PBS在0.3mg/kg投予群稀釋5倍、在3mg/kg投予群稀釋50倍的大鼠大腿肌肉均漿，分別與0.4μg/mL的生物素化人類NGF各以等量混合，在室溫下培養30分鐘而得到試樣，將其按每1孔添加20μL。此外，由於大鼠大腿肌肉均漿係將採取之大腿肌肉組織以2.5倍量的組織均漿液製作，因此，0.3及3mg/kg投予群係使用原本的大腿肌肉組織濃度之分別稀釋35倍及350倍的溶液來評估。
此處所使用的生物素化人類NGF係採用將人類NGF(R&D Systems公司，256-GF-100/CF)使用EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(Thermo公司，21329)予以生物素化者。人類NGF的生物素化係藉由對1mL的0.4mg/mL人類NGF溶液添加5μL的5mM NHS-PEG4-Biotin溶液。在冰上、遮光條件下使其反應2小時後，遵循手冊使用Amicon Ultra-0.5mL 3K(Millipore公司，UFC500324)2次，將反應液回收作為PBS溶液來進行。
作為控制組係準備0.1%含有BSA的PBS、與使用0.1%含有BSA的PBS稀釋的hlf.6抗體10μg/mL。0.3mg/kg投予群及3mg/kg投予群之控制組試樣係使用對含有0.1% BSA的PBS添加10%及1%的未投予抗體之大腿肌肉均漿的稀釋液分別調製。在室溫下培養30分鐘後，將孔盤以清洗液清洗3次，將使用以含有0.05% Tween-20的TBS稀釋20倍之Blocking One溶液稀釋1000倍的鹼性磷酸酶標記鏈親和素(Thermo公司，21324) 按每1孔添加20μL。在室溫下培養30分鐘後，將孔盤以清洗液清洗3次，將與含有10mM氯化鎂之200mM三羥甲基胺基甲烷(pH9.8)緩衝液經稀釋10倍的溶液以1：1混和的鹼性磷酸酶基質(Chemiluminescent AP Microwell/Membrane Substrate，Super Sensitive，450nm；SurModics公司，APU4-0100-01)按每1孔添加20μL。在室溫下培養30分鐘，以EnVision計數器(PerkinElmer公司)測定其訊號值。
於算出各濃度下的人類NGF機能阻礙活性之際，係將添加有含有0.1% BSA的PBS之試樣的測定值設為0%，將10μg/mL的測定值設為100%。試驗係以複製(控制組為4或者8孔)進行，算出算術平均。
其結果，就0.3mg/kg投予群，在大腿肌肉內抗體濃度稀釋35倍的條件下亦顯示出21.2%的阻礙活性。又，就3mg/kg投予群，在大腿肌肉內抗體濃度稀釋350倍的條件下顯示出59.9%的阻礙活性。亦即，在投予0.3及3mg/kg的hlf.6抗體之群的大腿肌肉組織中，可確認具有藉由阻礙人類NGF與其受體trkA之結合所產生的人類NGF機能阻礙活性。
由以上可知，屬本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的hlf.6抗體係藉由對局部而確保在標的組織的抗體濃度及人類NGF結合活性，由此阻礙可人類NGF與其受體的結合。屬本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的hlf.6抗體其可作為以更少的局部投予量表現標的組織之 局部藥效的優良之醫藥品的可能性可望提高。
(實施例8：大鼠腳掌切開術後痛模型中的鎮痛效果評估)
採用被視為反映臨床上的術後疼痛之大鼠腳掌切開術後痛模型(Pain,2005,Vol.117,p.68-76)，來評估將hlf.6抗體對術部局部投予時對術後疼痛的鎮痛效果。專利文獻3中揭示，完全人類型抗人類NGF抗體1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG藉由靜脈內投予的全身投予而具有本模型中的鎮痛效果。於本試驗中，於評估hlf.6抗體的局部投予所產生之對術後疼痛的鎮痛效果之際，作為比較對照係採用1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG的局部投予及全身投予。
具體而言，手術群係採各群10隻、非手術群採用5隻，設定非手術群、溶媒(20mM Citrate，120mM NaCl，pH6)群、將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、及將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群共計5群。腳掌局部投予係藉由使30mg/mL抗體溶液30μL浸透膨潤於約2mg小片的Spongel(註冊商標)薄片(Astellas製藥)後予以埋入至切開之腳底的肌肉部分來進行。又，就溶媒群及將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群係埋入使溶媒浸透膨潤的Spongel薄片。於本評估中係在異氟烷麻醉下將左後肢腳掌，以距腳跟前端約5mm部分為起點朝約10mm腳尖方向直線地切開，並將露出之腳底肌肉朝縱方 向切開後，回復肌肉的位置，埋入Spongel薄片以尼龍縫線於2處進行褥線縫合。測定手術結束24小時、48小時、72小時後的疼痛閾值。疼痛閾值係使用Dynamic plantar aesthesiometer(Ugo Basile公司)，測定顯示抵抗對大鼠的腳掌之加壓的逃避行動的壓力。
作為疼痛閾值係算出引起各群之個體的回避行動的壓力閾值之3次的算術平均，將非手術群的疼痛閾值設為100%，將溶媒群的疼痛閾值設為0%算出各藥劑群之疼痛閾值的改善率。其結果，術後24小時後之將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群的疼痛閾值改善率各為34%、49%、46%，各藥劑投予群的疼痛閾值在Student-t檢定中對於溶媒群均可看出p<0.05之顯著的改善作用。又，術後48小時後之將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群的疼痛閾值改善率各為38%、31%、34%，各藥劑投予群的疼痛閾值在Student-t檢定中對於溶媒群均可看出p<0.05之顯著的改善作用；術後72小時後之將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群的疼痛閾值 改善率各為26%、33%、28%，各藥劑投予群的疼痛閾值在Student-t檢定中對於溶媒群均可看出p<0.05之顯著的改善作用。此時，就術後24小時後、48小時後、72小時後任一者，於Tukey多重比較檢定中，在將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群此3群之間疼痛閾值未看出p<0.05之顯著的差異，可判明於此3群間觀察到的鎮痛藥效在術後24小時後、48小時後、72小時後任一者均為藥理學上同等者。
(實施例9：藉由局部投予之血漿中及組織中的藥物濃度評估)
為評估實施例8中之評估時的各抗體之腳底肌肉中及血漿中的濃度，而以與實施例8同樣的方法將大鼠以各n=3設定為將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群，並藉由ECL分析法測定24小時後之腳底肌肉中及血漿中的抗體濃度。腳掌局部投予係與實施例8同樣地藉由使30mg/mL抗體溶液30μL浸透膨潤於約2mg小片的Spongel(註冊商標)薄片(Astellas製藥)後予以埋入至切開之腳底的肌肉部分並予以縫合來進行。
腳底肌肉中的抗體濃度係測定將採取之腳底 肌肉以9倍量的腳掌組織均漿液(10mM三羥甲基胺基甲烷，137mM NaCl，1% Triton X-100，10% Glycerol，cOmplete，Mini(Roche公司)，pH8.0)均勻化後的試樣中濃度，採用使其濃度成為10倍的值。ECL分析法中的測定係使用作為2種抗1-15抗體的ANA-IBL-13A與生物素化ANA-IBL-52A。此外，此處所使用的生物素化ANA-IBL-52A係採用將ANA-IBL-52A使用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學，LK03)，遵循技術手冊予以生物素化者。
以下示出ECL分析法之方法。將ANA-IBL-13A以TBS稀釋成5000ng/mL，對Multi-array 96-well Plate(Meso Scale Discovery公司，L15XA-3)按每1孔添加25μL。藉由在室溫下對孔盤進行培養1小時，而使ANA-IBL-13A固相化。藉由逆離心去除ANA-IBL-13A固相液，將孔盤以清洗液(含有0.05%之Tween-20的TBS)清洗3次，將Blocker Casein in TBS(Thermo公司，37532)按每1孔添加150μL。對孔盤在室溫下進行培養1小時後，藉由逆離心去除Blocker Casein in TBS，將孔盤以清洗液清洗3次，將血漿試樣及腳底肌肉均漿以稀釋液(含有0.05%之Tween-20的Blocker Casein in TBS)稀釋10倍，按每1孔添加25μL。血漿試樣之檢量線作成用係準備使用含有10%的未投予抗體之血漿的稀釋液，從333ng/mL至0.017ng/mL稀釋成10階段的hlf.6抗體及1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG。作為控制組，係準備含有10% 的未投予抗體之血漿的稀釋液。腳底肌肉均漿之檢量線作成用係準備使用含有10%的未投予抗體之腳底肌肉均漿的稀釋液，從333ng/mL至0.017ng/mL稀釋成10階段的hlf.6抗體及1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG。作為控制組，係準備含有10%的未投予抗體之腳底肌肉均漿的稀釋液。在室溫下對孔盤進行培養1小時後，藉由逆離心去除溶液。將孔盤以清洗液清洗3次，將使用稀釋液稀釋成1000ng/mL的生物素化ANA-IBL-52A按每1孔添加25μL，對孔盤在室溫下進行培養1小時。藉由逆離心去除溶液，以清洗液清洗3次，添加25μL之使用稀釋液稀釋500倍的MSD SULFO-TAG labeled Streptavidin(Meso Scale Discovery公司，R32AD-1)。對孔盤在室溫下進行培養1小時後，藉由逆離心去除溶液，將孔盤以清洗液清洗3次。添加150μL之以超純水(MilliQ(註冊商標)，Merck公司)稀釋2倍的MSD Read Buffer T(4x)(Meso Scale Discovery公司，R92TC-1)，以SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery公司)測定其電化學發光。
於算出抗體濃度之際，作成檢量線。回歸式係藉由4參數邏輯或者5參數邏輯曲線回歸進行解析。由檢量線算出各點下的血漿中及腳底肌肉中的抗體濃度。以三重複進行各試驗，求出算出之濃度的算術平均。本試驗中的hlf.6抗體的定量極限，血漿中濃度為0.2ng/mL、腳底肌肉中濃度為2ng/mL；完全人類型抗NGF抗體1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG的定量極限，血漿中濃度為 0.5ng/mL、腳底肌肉中濃度為2ng/mL。
測定將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群之分別投予24小時後的腳底肌肉中濃度的結果，各為132ng/mL、46.2ng/mL、24.1ng/mL。將hlf.6抗體對腳掌內投予的群的腳底肌肉中濃度為最高者。另一方面，投予24小時後的血漿中濃度各為未達0.230ng/mL(3例中1例為未達0.230ng/mL，2例為未達0.2ng/mL)、65.1ng/mL、396ng/mL，將hlf.6抗體對腳掌內投予的群的血漿中濃度為最低者。
基於各抗體的腳底肌肉中濃度及血漿中濃度，分別針對將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群算出投予24小時後之腳底肌肉中/血漿中的濃度比。此時，將900μg的未達定量極限之hlf.6抗體對腳掌局部投予的個體之投予24小時後的血漿中濃度係取定量極限之0.2ng/mL。
將900μg的hlf.6抗體對腳掌局部投予的群、將900μg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對腳掌局部投予的群、將1mg/kg的1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG對靜脈內投予的群之分別投予24小時後的腳底肌肉中/血漿中的濃度比各為628、0.71、0.061。1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG 透過進行腳掌內投予，比起靜脈內投予腳底肌肉中/血漿中的濃度比高10倍以上。在對腳掌之局部投予群的比較中，hlf.6抗體與1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG相比，腳底肌肉中/血漿中的濃度比為800倍以上。
由以上顯示，屬本發明之抗人類NGF抗體Fab片段的hlf.6抗體的局部投予可保持在目的之局部的藥劑濃度，並降低全身血流中的抗體濃度，並且顯示比起完全人類型抗人類NGF抗體1-15(N52D-A)-Fab’-10kPEG，可極有效地保持在局部的藥劑濃度並降低全身血流中的藥劑濃度。從而，本發明之抗人類NGF抗體Fab片段其可作為可表現在局部之藥效並同時降低全身性的副作用的優良之醫藥品的可能性可望提高。
[產業上可利用性]
本發明之抗人類NGF抗體Fab片段可望有用於術後疼痛之治療。本發明之抗人類NGF抗體Fab片段在作為可展現在局部之藥效並同時降低基於全身性的血中暴露之副作用的優良之藥劑方面可望特別有用。
[序列表自由文字]
以下之序列表的數字標號<223>中係記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號1所示之鹼基序列為hlf.6抗體之重鏈片段的鹼基序列，序列表之序列編號5所示之胺基酸序列為藉由序列編 號1編碼的重鏈片段之胺基酸序列。序列表之序列編號2所示之鹼基序列為hlf.7抗體之重鏈片段的鹼基序列，序列表之序列編號6所示之胺基酸序列為藉由序列編號2編碼的重鏈片段之胺基酸序列。序列表之序列編號3所示之鹼基序列為hlf.8抗體之重鏈片段的鹼基序列，序列表之序列編號7所示之胺基酸序列為藉由序列編號3編碼的重鏈片段之胺基酸序列。序列表之序列編號4所示之鹼基序列為1-15(N52D-A)-Fab’片段之輕鏈的鹼基序列，序列表之序列編號8所示之胺基酸序列為藉由序列編號4編碼的輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號9所示之鹼基序列為本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈可變區域的鹼基序列，序列表之序列編號10所示之胺基酸序列為藉由序列編號9編碼的重鏈可變區域之胺基酸序列。序列表之序列編號11所示之鹼基序列為本發明之抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈可變區域的鹼基序列，序列表之序列編號12所示之胺基酸序列為藉由序列編號11編碼的輕鏈可變區域之胺基酸序列。
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<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding hlf.6 heavy chain fragment
<400> 1
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding hlf.7 heavy chain fragment
<400> 2
<210> 3
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding hlf.8 heavy chain fragment
<400> 3
<210> 4
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding 1-15(N52D-A)-Fab fragment light chain
<400> 4
<210> 5
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hlf.6 heavy chain fragment
<400> 5
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<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hlf.7 heavy chain fragment
<400> 6
<210> 7
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hlf.8 heavy chain fragment
<400> 7
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<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1-15(N52D-A)-Fab fragment light chain
<400> 8
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<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH gene of anti-human NGF antibody
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 9
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
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<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL gene of anti-human NGF antibody
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<400> 11
<210> 12
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12

Claims (18)

  1. 一種抗人類NGF抗體Fab片段，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈的抗人類NGF抗體Fab片段；及(b)藉由(a)之抗人類NGF抗體Fab片段的轉譯後修飾而生成的抗人類NGF抗體Fab片段。
  2. 如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段，其係包含由序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈。
  3. 如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段，其中轉譯後修飾為重鏈可變區域N端的焦麩胺醯基化。
  4. 如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段，其係包含由序列編號5之胺基酸編號1的麩醯胺酸經修飾成焦麩胺酸的序列編號5所示之胺基酸序列構成的重鏈片段及由序列編號8所示之胺基酸序列構成的輕鏈。
  5. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列。
  6. 一種表現載體，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)包括包含編碼如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表 現載體；及(b)包括包含編碼如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體。
  7. 一種宿主細胞，其係經如請求項6之表現載體轉形。
  8. 如請求項7之宿主細胞，其係選自由以下之(a)及(b)所成之群：(a)經包括包含編碼如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞；及(b)經包括包含編碼如請求項1之抗人類NGF抗體Fab片段之重鏈片段的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體與包括包含編碼該抗人類NGF抗體Fab片段之輕鏈的鹼基序列之聚核苷酸的表現載體轉形的宿主細胞。
  9. 一種生產抗人類NGF抗體Fab片段之方法，其係包含培養如請求項8之宿主細胞，使抗人類NGF抗體Fab片段表現的步驟。
  10. 一種抗人類NGF抗體Fab片段，其能以如請求項9之方法生產。
  11. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項1~4及10中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段、及藥學上可容許的載體。
  12. 如請求項11之醫藥組成物，其為術後疼痛之治 療用局部醫藥組成物。
  13. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項2之抗人類NGF抗體Fab片段、如請求項4之抗人類NGF抗體Fab片段、及藥學上可容許的載體。
  14. 如請求項13之醫藥組成物，其為術後疼痛之治療用局部醫藥組成物。
  15. 一種如請求項1~4及10中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段的使用，其係用於術後疼痛之治療用局部醫藥組成物的製造。
  16. 一種如請求項1~4及10中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段之藉由局部投予的使用，其係用於術後疼痛之治療。
  17. 一種如請求項1~4及10中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段，其係用於對術後疼痛之治療以局部投予使用。
  18. 一種術後疼痛之治療方法，其係包含將如請求項1~4及10中任一項之抗人類NGF抗體Fab片段的有效量投予至對象的局部。
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