TW201506039A - 新穎抗人類ｔｗｅａｋ抗體 - Google Patents

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Masahito Sato
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Astellas Pharma Inc
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Abstract

本發明之課題為提供一種與以往之抗人類TWEAK抗體比較，具有優異活性之抗人類TWEAK抗體，以及使用該抗體來預防或治療，人類TWEAK參與病態形成之各種疾病之手段。作為本發明之解決手段，其係提供一種抗人類TWEAK抗體，其特徵為分別包含：由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列、由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列、或由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列、由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列、或由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。

Description

新穎抗人類TWEAK抗體
本發明係關於新穎之抗人類TWEAK抗體。詳細而言，本發明之新穎抗人類TWEAK抗體係與以往之抗人類TWEAK抗體相比較，即使相對於人類sTWEAK及人類mTWEAK之任一種亦具有優異活性之抗人類TWEAK抗體。
TWEAK(TNF-like weak inducer of apoptosis)係廣泛表現於包含巨噬細胞、T細胞等之免疫活性細胞或腎間質細胞(Renal mesangial cell)等之細胞及組織之單次跨膜型蛋白質。TWEAK之受體為Fn14蛋白質，TWEAK係藉由形成Fn14蛋白質與複合體而活性化，並於細胞內傳達訊息。TWEAK訊息之活性化，例如透過NF-κB轉錄因子之活性化，誘導單球走化活性因子(MCP-1)等發炎性之趨化激素(Chemokine)的表現，而引起發炎反應(Nat Rev Drug Discov.2008；7(5)：411-425)。
TWEAK係作為膜型TWEAK(mTWEAK)存在於 細胞膜上，細胞外區域係藉由furin型絲胺酸蛋白分解脢而切斷時，成為可溶型TWEAK(sTWEAK)(J Biol Chem.2010；285(23)：17432-17441)。任一種TWEAK皆可形成Fn14蛋白質與複合體，雖於細胞內傳達訊息，但傳達訊息之最大活性與sTWEAK相比較，mTWEAK較強(J Immunol.2010；185(3)：1593-1605、Br J Pharmacol.2013；170(4)：748-764)。
TWEAK已知有參與全身性紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis)、發炎性腸道疾病、多發性硬化症、乾癬、硬皮病等自我免疫疾病、腦中風、動脈硬化症、由於缺血性導致之急性腎衰竭、慢性腎衰竭、癌症、肌肉萎縮症(Muscular dystrophy)等疾病。
全身性紅斑性狼瘡係將藉由DNA-抗DNA抗體等免疫複合體之組織沉積所引起之全身性發炎性病變作為特徵之自我免疫疾病。症狀以採取重複緩解與惡化之慢性病程為多。又，由於侵入多數臟器故於臨床所見亦豐富多彩，觀察有腎障礙、中樞神經病變、血管病變、血液異常、關節症狀、皮膚病變等。全身性紅斑性狼瘡病態中，已報告有由於各種細胞引起細胞凋亡(Apoptosis)，故雖從細胞之DNA或RNA所釋放出，藉由表現於自我反應性T細胞之mTWEAK分子，促進單球之細胞凋亡(J Immunol.2002；169(10)：6020-6029)。
狼瘡性腎炎係多數全身性紅斑性狼瘡患者所 發病之腎炎，為有關係到生命之危險性高的疾病。小鼠之狼瘡性腎炎病態模型中，報告有藉由抗TWEAK抗體之給藥，改善蛋白尿，抑制在腎臟之MCP-1等趨化激素或細胞素(Cytokine)的產生(J Immunol.2007；179(11)：7949-7958)。進而，即使在Fn14之遺傳性缺陷動物(基因剔除小鼠(Knockout mouse))之狼瘡性腎炎病態模型，亦報告有由於發現蛋白尿等腎病態改善作用，TWEAK及Fn14係有參與狼瘡性腎炎病態(J Immunol.2007；179(11)：7949-7958)。又，藉由TWEAK之刺激，報告有人類腎間質細胞細胞系中，誘導MCP-1等發炎介質(Inflammatory mediator)之表現，或藉由TWEAK刺激之細胞素的產生透過NF-κB的活性化，抑制藉由抗TWEAK抗體之細胞素的產生(Cytokine 2009；46(1)：24-35)。進而，狼瘡性腎炎患者中，報告有在腎臟之TWEAK基因表現增大及對尿中之TWEAK蛋白質的分泌增大(Nephrology (Carlton).2011；16(4)：426-432、J Autoimmun..2006 Dec；27(4)：242-50)。
風濕性關節炎係藉由存在於關節內之滑膜組織的異常增殖，於關節內產生慢性發炎之疾病，藉由進行引起關節破壞等各式各樣之機能障礙之自我免疫疾病。報告有於使用對於TWEAK之拮抗劑或對於Fn14之拮抗劑之試驗，由於被認為對於關節炎評分等有改善效果，故TWEAK及Fn14有參與風濕性關節炎之病態(J Immunol.2006；177(4)：2610-2620、Rheumatology(Oxford). 2008；47(4)：442-450)。
發炎性腸道疾病係與腸管內之免疫異常關連，將腸管作為主要之原因不明的難病。有腹痛、下痢、血便、下血、發熱、或體重減少等症狀，代表性者包含有克羅恩病或潰瘍性大腸炎等。於使用TWEAK之基因剔除小鼠(Knockout mouse)及對於TWEAK之拮抗劑之試驗，報告有由於被認為有發炎之改善效果，參與TWEAK訊息(Gastroenterology.2009；136(3)：912-923)。
多發性硬化症係將發炎及髓磷脂(Myelin)損耗作為特徵之中樞神經系疾病。於小鼠EAE模型(實驗性自我免疫性腦炎模型)，已報告由於被認為藉由對於TWEAK之拮抗劑，有症狀的改善效果，在多發性硬化症病態有TWEAK的參與(Clin Immunol.2005；117(1)：15-23)。
腦中風係由於缺血性導致缺氧及次要情況，而引起腦中神經細胞的壞死及損傷之疾病。小鼠腦缺血模型中，已報告有由於藉由對於TWEAK之拮抗劑，有症狀的改善，在腦中風有TWEAK的參與(J Cereb Blood Flow Metab.2007；27(3)：534-544)。
急性腎衰竭係藉由外傷性或伴隨手術之出血、血壓急遽下、脫水症、藥的副作用等各式各樣因子而發病，數日當中就降低腎機能之嚴重病情，和細胞障礙與缺血性障礙大為不同。Fn14已報告在人類缺血性腎中增大表現，又，小鼠急性腎衰竭模型中，已報告有由於被認為於使用對於TWEAK之拮抗劑或對於Fn14之拮抗劑之 試驗，對腎機能或生存率有改善效果，故於急性腎衰竭有TWEAK及Fn14參與(Kidney Int.2011；79(2)：179-188、J Am Soc Nephrol.2008；19(4)：695-703)。
TWEAK或Fn14已知於各種腫瘤增大表現(PLOS ONE.2013；8(3)e57436)。又，亦報告有TWEAK之過剩表現細胞持有形質轉換能(Cancer Res.2004；64(24)：8968-8972)。進而，已報告有對於TWEAK之拮抗劑在Xenograft模型(罹癌移植模型)，抑制癌細胞增殖(Clin Cancer Res.2010；16(2)：497-508)。
TWEAK已知與肌肉萎縮惡化有深度關係。例如，報告有肌肉萎縮模型中，於TWEAK基因缺陷小鼠減輕肌肉萎縮，反而於TWEAK過剩表現小鼠促進肌肉萎縮(J Clin Invest.2007；117：889-901、International myotonic dystrophy consortium meeting 9：O-39、2013、Am J Pathol.2012；180(4)：1603-1613)。
據此，若能開發與TWEAK特異性鍵結，抑制TWEAK作用之單株抗體，TWEAK被期待有用在參與病態形成之各種疾病的治療、預防。
作為到目前為止對於研究一直在進行之顯示人類TWEAK之功能抑制作用之抗體，已報告有係小鼠單株抗體之mP2D10與其人類化單株抗體之huP2D10-1及huP2D10-2(專利文獻1)、或係小鼠單株抗體之MTW-1(非專利文獻1)。又，亦已報告有係倉鼠單株抗體之TW212與其人類化單株抗體(專利文獻2)、或係兔子單株抗體之 TW305與其人類化單株抗體(專利文獻3)。惟，以往之抗體對於人類TWEAK之中和活性可說是不足夠的。
又，作為規定抗體醫藥的有效給藥量的主要原因，雖可列舉對於具有抗體之抗原之鍵結活性或中和活性、存在於體內之抗原的量，但提昇鍵結活性或中和活性與給藥量的減低相關聯，作為結果可說是亦與患者經濟性負擔或醫療成本的減低相關聯係極為有益的改良。
由於這些原因，與以往之抗人類TWEAK抗體進行比較之活性中，取得優異之抗人類TWEAK抗體，但為了利用在給藥人類之各種疾病的治療、預防係有必要。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2006/130374號
[專利文獻2]國際公開第2010/115555號
[專利文獻3]國際公開第2012/045671號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]「(Biochemical and Biophysical Research Communications)」、(美國)、2003、Vol.306(4)、p.819-825
本發明之課題係提供一種與以往之抗人類TWEAK抗體相比較具有優異活性之抗人類TWEAK抗體。
本發明者們在抗人類TWEAK抗體之製作中重複相當之創意檢討的結果，發現：製作1)包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TWEAK抗體、2)包含由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TWEAK抗體、以及3)包含由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之抗人類TWEAK抗體(實施例1~8)，此等之抗體具有對於人類sTWEAK之鍵結活性(實施例9)、對於人類mTWEAK之鍵結活性(實施例10)、人類sTWEAK刺激NF-κB活性化抑制活性(實施例11)、人類mTWEAK刺激NF-κB活性化抑制活性(實施例12)、人類sTWEAK刺激MCP-1表現抑制活性(實施例13)、及人類mTWEAK刺激MCP-1表現抑制活性(實施例14)。此等之結果提供前述抗人類TWEAK抗 體，而完成本發明。
亦即，本發明作為醫學上或產業上有用之物質及方法係包含以下之發明。
(1)選自以下之1)~3)之任一種之抗人類TWEAK抗體。
1)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區；2)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區；3)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
(2)如上述(1)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
(3)如上述(1)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號7之胺基酸編號1至108 之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
(4)如上述(1)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
(5)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之重鏈恆定區為人類Igγ1恆定區。
(6)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之輕鏈恆定區為人類Igκ恆定區。
(7)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之重鏈恆定區為人類Igγ1恆定區，前述抗體之輕鏈恆定區為人類Igκ恆定區。
(8)如上述(2)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(9)如上述(3)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號5所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號7所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(10)如上述(4)所記載之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號9所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號11所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(11)一種聚核苷酸，其係包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基 序列。
(12)一種聚核苷酸，其係包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列。
(13)一種表現載體，其係包含上述(11)及/或(12)所記載之聚核苷酸。
(14)一種上述(13)所記載之經表現載體而形質轉換之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所成之群。
(a)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(b)一種經兩表現載體而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(c)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；及(d)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷 酸。
(15)如上述(13)所記載之經表現載體而形質轉換之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所成之群：(a)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(8)~(10)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸；(b)一種經兩表現載體而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼如上述(8)~(10)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸；(c)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(8)~(10)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸；及(d)一種經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼如上述(8)~(10)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
(16)一種生產抗人類TWEAK抗體之方法，其係包含培養上述(14)或(15)所記載之宿主細胞，使抗人類TWEAK抗體表現之步驟。
(17)一種抗人類TWEAK抗體，其係以上述(16)所記載之方法所生產。
(18)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號 1之胺基酸編號1至447之胺基酸序列所構成、且胺基酸編號1之麩醯胺酸被焦麩胺酸修飾之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(19)一種醫藥組成物，其係包含如上述(1)~(10)、(17)、及(18)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體及藥學上所容許之賦形劑。
(20)一種全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防用或治療用醫藥組成物，其係包含如上述(1)~(10)、(17)、及(18)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體。
(21)一種用以預防或治療全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之方法，其係包含給藥如上述(1)~(10)、(17)、及(18)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之治療有效量之步驟。
(22)如上述(1)~(10)、(17)、及(18)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體，其係用以使用在全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療。
(23)一種如上述(1)~(10)、(17)、及(18)中任一項所記載之抗人類TWEAK抗體之使用，其係在全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療用醫藥組成物之製造。
藉由本發明，提供一種與以往抗人類TWEAK抗體相比較，相對於人類sTWEAK及人類mTWEAK之任一種皆具有優異活性之抗人類TWEAK抗體。本發明之抗 人類TWEAK抗體具有抑制人類sTWEAK與人類mTWEAK兩者機能之作用，有用於人類TWEAK參與病態形成之各種疾病之預防或治療。而且，如此之本發明之抗人類TWEAK抗體，帶來在給藥量的減低、給藥間隔的擴大、給藥方法的改善(例如皮下注射劑)等臨床適用之優異改善，對治療有效性及患者順應性的改善有顯著貢獻。
[圖1]表示對於人類mTWEAK刺激NF-κB活性之抑制活性。
[圖2]表示對於人類sTWEAK刺激MCP-1表現之抑制活性。
[圖3]表示對於人類mTWEAK刺激MCP-1表現之抑制活性。
以下對於本發明進行詳述。
抗體分子的基本構造以各類型共通係由分子量5萬~7萬之重鏈與2~3萬之輕鏈所構成。重鏈通常約由包含440個胺基酸之多肽鏈所構成，每個類型都具有特徵性構造，被稱為對應IgG、IgM、IgA、IgD、IgE之γ、μ、α、δ、ε鏈。進而IgG中，存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分別對應之重鏈被稱為γ 1、γ2、 γ3、γ4。輕鏈通常由包含約220個之胺基酸之多肽鏈所構成，已知有L型與K型2種，分別稱為λ、κ鏈。抗體分子之基本構造的肽構成係分別相同之2條重鏈及2條輕鏈藉由二硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵而鍵結，分子量為15萬~19萬。2種之輕鏈可與任一重鏈成對。各個抗體分子通常可由同一輕鏈2條與同一重鏈2條所構成。
鏈內S-S鍵係於重鏈四個(μ、ε鏈五個)、於輕鏈二個、胺基酸每100~110殘基形成一個環(loop)，此立體構造於各環間類似，被稱為構造單位或結構域。重鏈、輕鏈同時位於胺基末端(N末端)側之結構域，即使為來自同種動物之同一類型(次類型)的標品，其胺基酸序列亦並非一定，已被稱為可變區，各結構域分別被稱為重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。由可變區之羧基末端(C末端)側之胺基酸序列，各類型或每一次類型幾乎一定故被稱為恆定區。
抗體之抗原決定部位係藉由VH及VL所構成，鍵結之特異性係因此部位之胺基酸序列而異。另外，與補體或各種細胞的鍵結之生物學的活性係反映各類型Ig恆定區之構造的差異。輕鏈與重鏈之可變區的可變性已瞭解幾乎被限制在存在於任一鏈之3個小的超可變區，將此等之區域稱為相補性決定區域(CDR；分別來自N末端側之CDR1、CDR2、CDR3)。可變區之殘留部分稱為框架區域(FR)，相對上係恆定。
<本發明之抗人類TWEAK抗體>
本發明之抗人類TWEAK抗體中，係包含具有以下1)~3)之任一種特徵之抗人類TWEAK抗體。
1)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
2)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
3)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
較佳為本發明之抗人類TWEAK抗體具有以下1)~3)之任一種特徵，進而包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區。作為恆定區，雖然什麼樣次類型之恆定區(例如作為重鏈恆定區之γ 1、γ2、γ3或γ 4之恆定區，作為輕鏈恆定區之λ或κ鏈之恆定區)皆可選擇，但作為重鏈恆定區，較佳為人類Igγ1恆定區，作為輕鏈恆定區，較佳為人類Igκ恆定區。
作為人類Igγ1恆定區，例如可列舉由從序列編號1之胺基酸編號119至448之胺基酸序列所構成之人 類Igγ1恆定區。
作為人類Igκ恆定區，例如可列舉由從序列編號3之胺基酸編號109至214之胺基酸序列所構成之人類Igκ恆定區。
作為本發明之抗人類TWEAK抗體係具有以下1)~3)之任一種特徵，重鏈恆定區為人類Igγ1恆定區，輕鏈恆定區為人類Igκ恆定區，更佳為抗人類TWEAK抗體。
1個實施形態中，本發明之抗人類TWEAK抗體係具有以下i)~iii))之任一種特徵之抗人類TWEAK抗體。
i)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
ii)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號5所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號7所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
iii)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號9所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號11所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
將抗體於細胞表現時，已知有抗體轉譯後接受修飾。作為轉譯後修飾之例，可列舉藉由重鏈C末端之離胺酸之羧胜酶(Carboxypeptidase)切斷，藉由重鏈及輕鏈N末端之麩醯胺酸或麩胺酸之焦谷氨酸化 (Pyroglutamylated)對焦麩胺酸的修飾等，各種抗體中，已知有重鏈C末端之離胺酸缺失或重鏈N末端之麩醯胺酸的大部分受到對焦麩胺酸之修飾(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426)。又，如此轉譯後修飾會對抗體之活性造成影響亦為該領域所知悉(Analytical Biochemistry、2006、Vol.348、p.24-39)。
本發明之抗體中，不僅具有完全長之重鏈之抗體，亦包含欠缺C末端之離胺酸之具有重鏈之抗體、重鏈N末端之麩醯胺酸或麩胺酸藉由焦麩胺酸化(Pyroglutamylated)受到對焦麩胺酸之修飾之抗體等、於細胞內之表現時收到轉譯後修飾之抗體。
例如，前述i)~iii)所記載之本發明之抗人類TWEAK抗體中，亦分別包含以下1)~3)所記載之抗人類TWEAK抗體。
1)一種抗人類TWEAK抗體，其係由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈，惟，包含序列編號1之胺基酸編號1之麩醯胺酸被焦麩胺酸修飾及/或欠缺序列編號1之胺基酸編號448之離胺酸之重鏈、以及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
2)一種抗人類TWEAK抗體，其係由序列編號5所示之胺基酸序列所構成之重鏈，惟，包含序列編號5之胺基酸編號1之麩胺酸被焦麩胺酸修飾及/或欠缺序列編號5之胺基酸編號455之離胺酸之重鏈、以及由序列編號7所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
3)一種抗人類TWEAK抗體，其係由序列編號9所示之胺基酸序列所構成之重鏈，惟，包含序列編號9之胺基酸編號1之麩醯胺酸被焦麩胺酸修飾及/或欠缺序列編號9之胺基酸編號451之離胺酸之重鏈、以及由序列編號11所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
本發明中亦包含具有以下1)~3)之任一種特徵之抗人類TWEAK抗體。
1)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含：包含由序列編號1之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號1之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號1之胺基酸編號99至107之胺基酸序列所構成之CDR3之重鏈可變區、以及包含由序列編號3之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號3之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號3之胺基酸編號89至97之胺基酸序列所構成之CDR3之輕鏈可變區。
2)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含：包含由序列編號5之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號5之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號5之胺基酸編號99至114之胺基酸序列所構成之CDR3之重鏈可變區、以及包含由序列編號7之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號7之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號7之胺基酸編號89 至97之胺基酸序列所構成之CDR3之輕鏈可變區。
3)一種抗人類TWEAK抗體，其係包含：包含由序列編號9之胺基酸編號31至35之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號9之胺基酸編號50至66之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號9之胺基酸編號99至110之胺基酸序列所構成之CDR3之重鏈可變區、以及包含由序列編號11之胺基酸編號24至34之胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號11之胺基酸編號50至56之胺基酸序列所構成之CDR2、及由序列編號11之胺基酸編號89至97之胺基酸序列所構成之CDR3之輕鏈可變區。
本發明之抗人類TWEAK抗體係鍵結於人類mTWEAK及人類sTWEAK之抗體。抗體是否鍵結於人類mTWEAK或人類sTWEAK，可使用公知之鍵結活性測定方法進行確認。作為測定鍵結活性之方法，例如可列舉Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay(ELISA)或Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS)等方法。
對於人類mTWEAK之鍵結活性之測定，例如可使用FACS進行實施。例示性之方法中，將表現人類mTWEAK(由序列編號16所示之胺基酸序列所構成)或人類mTWEAK變異體(由序列編號13所示之胺基酸序列所構成)之細胞(例如HEK293細胞)添加被驗抗體於分注之支管使其進行反應。反應後並洗淨，將以藻紅素(PE)等螢光蛋白質標識之抗IgG抗體等二次抗體使其反應，藉由進行使用BD FACSArray Bioanalyzer(BD Biosciences)等之螢光 值的測定，可確認被驗抗體是否鍵結於人類mTWEAK。
對於人類sTWEAK之鍵結活性之測定，例如可使用ELISA進行實施。例示性之方法中，將人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司、310-06)(序列編號15；附加蛋胺酸(Methionine)於序列編號16所示之野生型人類mTWEAK之胺基酸編號97至249之胺基酸序列之N末端者)固定化於ELISA平板，對於此添加被驗抗體使其反應。反應後，使以辣根過氧化酶(HRP)等酶標識之抗IgG抗體等二次抗體反應，並洗淨後，藉由使用檢出其活性之試藥(例如為HRP標識時，為BM-Chemiluminescence ELISA Substrate(POD)(羅氏診斷公司))等進行活性測定，可確認被驗抗體是否鍵結於人類sTWEAK。
本發明之抗人類TWEAK抗體中，若為鍵結於人類mTWEAK及人類sTWEAK之抗體，除了對人類mTWEAK及人類sTWEAK的鍵結之外，亦包含鍵結於來自其他動物之mTWEAK及sTWEAK(例如猴子mTWEAK及猴子sTWEAK)之抗體。
較佳為本發明之抗人類TWEAK抗體鍵結於人類mTWEAK及人類sTWEAK，對於人類mTWEAK及人類sTWEAK具有中和活性。所謂對於人類mTWEAK及人類sTWEAK之中和活性，係意味著藉由對人類mTWEAK及/或人類sTWEAK之鍵結，透過人類TWEAK而帶來抑制任意之生物活性之活性，可評價將人類TWEAK之1個或複數之生物活性作為指標。作為如此之中和活性，例如 可列舉藉由人類TWEAK刺激之NF-κB之活性化抑制活性、及藉由人類TWEAK刺激之MCP-1表現抑制活性，作為活性之具體評價方法，可使用如後述實施例11~14所記載之方法。
本發明之抗人類TWEAK抗體係揭示於本說明書，根據本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之序列情報，使用於該領域所周知之方法，可藉由本發明領域具有通常知識者輕易製作。本發明之抗人類TWEAK抗體雖並未特別限定，但例如可依據後述之<本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法>所記載之方法進行製造。
本發明之抗人類TWEAK抗體藉由必要進一步純化之後，依照常法被製劑化，可使用在全身性紅斑性狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕性關節炎、發炎性腸道疾病、多發性硬化症、乾癬、硬皮病等自我免疫疾病、腦中風、動脈硬化症、由於缺血性之急性腎衰竭、慢性腎衰竭、癌症、Duchenne型肌肉萎縮症、強直型肌肉萎縮症(Myotonic dystrophy)、包含體肌炎等人類TWEAK參與病態形成之疾病的預防或治療。
<本發明之聚核苷酸>
本發明之聚核苷酸中，係包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸、及包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之 鹼基序列之聚核苷酸。
1個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸、或包含編碼由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸。
作為包含編碼由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所示之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號2之鹼基序號1至354之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號6之鹼基序號1至375之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號10之鹼基序號1至363之鹼基序列之聚核苷酸。
較佳之實施形態中，包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號5所示之胺基 酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸、或包含編碼由序列編號9所示之胺基酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
作為包含編碼由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號2所示之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號5所示之胺基酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號6所示之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號9所示之胺基酸序列所構成之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號10所示之鹼基序列之聚核苷酸。
1個實施形態中，包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸、或包含編碼由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸。
作為包含編碼由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號4之鹼基序號1至324之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區 之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號8之鹼基序號1至324之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含由序列編號12之鹼基序號1至324之鹼基序列之聚核苷酸。
較佳之實施形態中，包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，係包含編碼由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸、包含編碼由序列編號7所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸、或包含編碼由序列編號11所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
作為包含編碼由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號4所示之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號7所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號8所示之鹼基序列之聚核苷酸。作為包含編碼由序列編號11所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸，例如，可列舉包含序列編號12所示之鹼基序列之聚核苷酸。
本發明之聚核苷酸係根據其鹼基序列，使用於該領域所周知之方法，可藉由本發明領域具有通常知識者輕易製作。例如本發明之聚核苷酸可利用於該領域所周 知之基因合成方法進行合成。作為如此之基因合成方法，可列舉WO90/07861所記載之抗體基因之合成方法等本發明領域具有通常知識者所周知之各種方法。
<本發明之表現載體、本發明之形質轉換之宿主細胞、本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法、及藉由該方法所生產之抗人類TWEAK抗體>
本發明之表現載體係包含後述兩種聚核苷酸之表現載體，該兩種聚核苷酸為包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸。
作為較佳之本發明之表現載體，可列舉包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體、包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體、或包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸之表現載體。
作為用以表現本發明之聚核苷酸所使用之表現載體，係於真核細胞(例如動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)及/或原核細胞(例如大腸菌)之各種宿主細胞中，表現包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸及/或包含編碼本發明之抗人 類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，藉由此等若為可產生經編碼之多肽者，並未特別限制。作為如此之表現載體，例如，可列舉質體載體、病毒載體(例如腺病毒、逆轉錄病毒)等，較佳可使用pEE6.4或pEE12.4(Lonza公司)。又，亦可於AG-γ1或AG-κ(例如參照WO94/20632)等預先具有人類Ig恆定區基因之表現載體，表現導入可變區基因斷片之抗體基因。
本發明之表現載體係可包含可與具本發明之聚核苷酸機能連結之基因啟動子。作為用以在動物細胞表現本發明之聚核苷酸之基因啟動子，例如，可列舉來自CMV、RSV、SV40等病毒之基因啟動子、肌動蛋白基因啟動子、EF(elongation factor)1α基因啟動子、熱休克基因啟動子等。作為用以在細菌(例如大腸桿菌屬菌)表現之基因啟動子，例如，可列舉trp基因啟動子、lac基因啟動子、λ PL基因啟動子、tac基因啟動子等。又，作為用以在酵母表現之基因啟動子，例如，可列舉GAL1基因啟動子、GAL10基因啟動子、PH05基因啟動子、PGK基因啟動子、GAP基因啟動子、ADH基因啟動子等。
本發明之經形質轉換之宿主細胞中，包含選自由以下之(a)~(d)所成之群之本發明之經表現載體而形質轉換之宿主細胞。
(a)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈可變區之 鹼基序列之聚核苷酸；(b)經兩表現載體而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(c)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(d)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸。
1個實施形態中，本發明之經形質轉換之宿主細胞係選自由以下之(a)~(d)所成之群之本發明之經表現載體而形質轉換之宿主細胞。
(a)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸；(b)經兩表現載體而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸；(c)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基 序列之聚核苷酸；(d)經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
使用動物細胞、昆蟲細胞、或酵母作為宿主細胞時，本發明之表現載體可包含起始密碼子及終止密碼子。此時，本發明之表現載體可包含增強序列、編碼本發明之抗體或其重鏈可變區或者輕鏈可變區之基因之5’側及3’側之非轉譯區域、分泌訊息序列、細胞剪接接合部、多聚腺苷酸化(Polyadenylation)部位、或可複製之單位等。使用大腸菌作為宿主細胞時，本發明之表現載體可包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域、及可複製之單位。此時，本發明之表現載體因應目的，可包含通常所使用之篩選標記(例如四環素耐性基因、安比西林(Ampicillin)耐性基因、康黴素耐性基因、新黴素耐性基因、二氫葉酸還原酶基因)。
作為較佳之本發明之經形質轉換之宿主細胞，可列舉經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包合：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸、以及經表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體係包含：包含編碼本發明之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
作為經形質轉換之宿主細胞，適合於使用之表現載體，以該表現載體被形質轉換，若為可表現抗體者，並未特別限定。作為經形質轉換之宿主細胞，例如，可列舉本發明之技術領域中通常所使用之天然細胞或人工所樹立之細胞等各種細胞(例如動物細胞(例如CHOK1SV細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9)、細菌(大腸桿菌屬菌等)、酵母(酵母菌屬、畢赤酵母菌屬等)等)，較佳可使用CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、293細胞、NS0細胞等培養細胞。
形質轉換宿主細胞之方法，雖並未特別限定，但例如，可使用磷酸鈣法、電穿孔法等。
本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法中係包含：包含培養本發明之經形質轉換之宿主細胞，使抗人類TWEAK抗體表現之步驟之生產抗人類TWEAK抗體之方法。
本發明之抗人類TWEAK抗體中亦包含：以本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法所生產之抗人類TWEAK抗體。
本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法若為包含培養本發明之經形質轉換之宿主細胞，使抗人類TWEAK抗體表現之步驟，並未特別限定。作為於該方法所使用較佳之宿主細胞，可列舉前述較佳之本發明之經形質轉換之宿主細胞。
經形質轉換之宿主細胞之培養可藉由周知之 方法進行。培養條件、例如可適當選擇溫度、培養基之pH、及培養時間。宿主細胞為動物細胞時，作為培養基，例如可使用包含約5~20%之胎兒牛血清之MEM培養基(Science、1959、Vol.130、No.3373、p.432-7)、DMEM培養基(Virology、1959、Vol.8、p.396)、RPMI1640培養基(J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol.199、p.519)、199培養基(Exp.Biol.Med.、1950、Vol.73、p.1-8)等。培養基之pH較佳約為6~8，培養由於必要可一邊通氣或攪拌，一邊通常於約30~40℃下進行約15~72小時。宿主細胞為昆蟲細胞時，作為培養基，例如可使用包含胎兒牛血清之Grace’s培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1985、Vol.82、p.8404)等。培養基之pH較佳約為5~8，培養由於必要可一邊通氣或攪拌，一邊通常於約20~40℃下進行約15~100小時。宿主細胞為大腸菌或酵母時，作為培養基，例如含有營養源之液體培養基為適當。營養培養基較佳為包含於經形質轉換之宿主細胞之生育所必需之碳源、無機氮源或有機氮源。作為碳源，例如可列舉葡萄糖、葡聚醣、可溶性澱粉、蔗糖等，作為無機氮源或有機氮源，例如可列舉銨鹽類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸液、蛋白陳、酪蛋白、肉類萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等。依照所期望之其他營養素可包含(例如無機鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維他命類、抗生物質(例如、四環素、新黴素、安比西林、康黴素等)等)。培養基之pH較佳約為5~8。宿主細胞為大腸菌時，作為較佳之培養基，例如可 使用LB培養基、M9培養基(Mol.Clo.、Cold Spring Harbor Laboratory、Vol.3、A2.2)等。培養由於必要可一邊通氣或攪拌，一邊通常於約14~43℃下進行約3~24小時。宿主細胞為酵母時，作為培養基，例如可使用Burkholder最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1980、Vol.77、p.4505)等。培養由於必要可一邊通氣或攪拌，一邊通常於約20~35℃下進行約14~144小時。藉由如上述般之培養，可使本發明之抗人類TWEAK抗體進行表現。
本發明之生產抗人類TWEAK抗體之方法，除了培養本發明之經形質轉換之宿主細胞，使抗人類TWEAK抗體表現之步驟之外，進一步從該經形質轉換之宿主細胞回收抗人類TWEAK抗體，較佳係可包含進行單離或純化之步驟。作為單離或純化方法，例如可列舉鹽析、溶媒沈澱法等利用溶解度之方法；透析、限外過濾、凝膠過濾等利用分子量差異之方法：離子交換層析法、氫氧基磷灰石層析法等利用荷電之方法；親和層析法等利用特異性親和性之方法；逆相高速液體層析法等利用疏水性差異之方法；等電點電泳等等利用電點差異之方法等。較佳為累積於培養上清液中之抗體可藉由各種層析法、例如使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱層析法進行純化。
<本發明之醫藥組成物>
本發明之醫藥組成物中，系包含：包含本發明之抗人類TWEAK抗體及藥學上所容許之賦形劑之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物通常是在該領域所使用之賦形劑，亦即，使用藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，可藉由通常使用之方法進行調製。作為此等醫藥組成物劑型之例，例如可列舉注射劑、點滴用劑等非經口劑，可藉由靜脈內給藥、皮下給藥等進行給藥。當製劑化時，於藥學性所容許的範圍，因應此等劑型可使用賦形劑、載體、添加劑等。
本發明之醫藥組成物可包含複數種之本發明之抗人類TWEAK抗體。例如本發明亦包含重鏈C末端離胺酸之缺失抗體、受到N末端轉譯後修飾之抗體、受到缺失重鏈C末端離胺酸之N末端轉譯後修飾之抗體、及/或含有具重鏈C末端離胺酸之未受到N末端轉譯後修飾之抗體之醫藥組成物。
例如，於含有前述i)所記載之抗人類TWEAK抗體(亦即，包含由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈之抗人類TWEAK抗體)之本發明之醫藥組成物中，亦包含含有以下(1)~(4)當中2種以上之抗人類TWEAK抗體之醫藥組成物。
(1)一種抗人類TWEAK抗體，係包含由序列編號1之胺基酸編號1至477之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(2)一種抗人類TWEAK抗體，係包含由序列編號1所 示之胺基酸序列所構成、胺基酸編號1之麩醯胺酸係由被焦麩胺酸修飾之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(3)一種抗人類TWEAK抗體，係包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸序列所構成、胺基酸編號1之麩醯胺酸被焦麩胺酸修飾之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
(4)一種抗人類TWEAK抗體，係包含由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
即使對於含有前述ii)及iii)所記載之抗人類TWEAK抗體之本發明之醫藥組成物亦相同。
在製劑化之本發明之抗人類TWEAK抗體之添加量雖因患者的症狀程度或年齡、所使用製劑之劑型、或抗體之鍵結力價等而不同，但例如可使用0.001mg/kg~100mg/kg程度。
本發明之醫藥組成物係人類TWEAK參與病態形成之疾病，例如可作為全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療用醫藥組成物使用。
本發明中係包含本發明之抗人類TWEAK抗體，包含全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療用醫藥組成物。又，本發明中，包含給藥本發明之抗人類TWEAK抗體之治療有效量之步驟，包含預防或治療全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之方法。又，本發明中用以使 用在全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療，係包含本發明之抗人類TWEAK抗體。又，本發明中，在全身性紅斑性狼瘡或狼瘡性腎炎之預防或治療用醫藥組成物的製造，包含本發明之抗人類TWEAK抗體之使用。
對於本發明雖全盤性記載，但為了進一步得到理解，雖提供所參照之特定實施例，但此等成為例示目的者，並非被限定於本發明者。
[實施例]
對於使用市售之套組或試藥等之部分，若沒有特別限制係依照附加之協定進行實驗。
(實施例1：人類mTWEAK表現HEK293細胞之取得)
本發明者們取得人類mTWEAK表現載體及人類mTWEAK表現細胞。將人類mTWEAK變異體基因(序列編號14(編碼序列編號13所示之胺基酸序列之鹼基序列))重組為哺乳細胞表現用載體之pcDNA3.1載體(Life Technologies公司)(於本說明書中亦稱為「人類mTWEAK表現載體」)。將此載體使用係轉染試藥之Fugene HD(Promega公司)導入基因於人類腎臟細胞系HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)。序列編號13所示之人類mTWEAK變異體係缺失由序列編號16所示之野生型人類mTWEAK之胺基酸編號90至93之胺基酸序列(藉由蛋白分解脢之切斷部位)之人類mTWEAK，確認即使缺失此等 之胺基酸，亦活性化TWEAK訊息。將此細胞在含有Hygromycin之DMEM培養基進行選擇性培養之後，在極限稀釋法進行單株化。之後，藉由使用抗人類TWEAK抗體(PE標識CARL-1；BD公司)之流式細胞儀(Flow cytometry)測定選別顯示高度蛋白質表現之選殖。
(實施例2：抗人類TWEAK抗體產生融合瘤(Hybridoma)之製作)
本發明者們為了取得抗人類TWEAK抗體，使用人類單株抗體開發技術「VelocImmune」(VelocImmune antibody technology：Regeneron公司(美國專利6596541號))小鼠以製作抗體。於VelocImmune小鼠，與誘發免疫反應之佐劑一起，免疫人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司、310-06)及於實施例1所取得之人類mTWEAK表現HEK293細胞。數次免疫小鼠，確認血中抗體價的上昇，進行最終免疫。依常法，收集經免疫小鼠之脾臟或摘出淋巴節之淋巴球，藉由將此與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合來製作融合瘤。製作融合瘤之界限稀釋樣品，進行單株化。對於各選殖，進行擴大培養之後，培養基變更為無血清培養基之CD融合瘤培養基(Life Technologies公司)，培養5天。從所得之培養上清液使用Protein G Purification kit(Generon公司)來純化抗體。
(實施例3：細胞ELISA鍵結抑制分析)
本發明者們，為了測定抗體之抗原鍵結抑制活性，評價對於藉由抗體之人類大腸癌細胞系HT29細胞(ATCC：HTB-38)(內在表現人類TWEAK受體)之人類sTWEAK蛋白質的鍵結抑制。將HT29細胞於384孔培養板(Greiner公司)每1孔播種1×104個。去除培養基後，添加10μL之生物素標識人類sTWEAK蛋白質(經生物素化(Biotinylation)之Peprotech公司之人類sTWEAK蛋白質；終濃度200ng/mL)與融合瘤之培養上清液30μL。在設定為37℃之CO2培養箱培養1小時後，在洗淨液(加入0.1%牛血清之HEPES緩衝液)洗淨，添加30μL以稀釋液(加入1%牛血清之HEPES緩衝液)稀釋成2000倍之辣根過氧化酶標識卵白素(Streptavidin)(HRP-Streptavidin；Life Technologies公司)。在設定為37℃之CO2培養箱培養1小時後，以洗淨液洗淨。加入化學發光檢出試藥之POD(Roche公司)，將其化學發光量以EnVision計數器(Perkin Elmer公司)測定。
(實施例4：抗原ELISA鍵結分析)
本發明者們，為了測定抗體之抗原特異性鍵結活性，使用抗原ELISA。將於人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司)0.5μg/mL固相化於384孔培養板(Nunc公司)。添加封鎖劑(Blocking One；NACALAITESQUE公司)並在室溫靜置1小時後，以洗淨液(TBS-T：含有0.05% Tween-20之Tris緩衝液生理食鹽水(TBS)(pH7.4))洗淨，添加30μL之 融合瘤之培養上清液。室溫培養1小時後，在洗淨液洗淨，添加30μL以稀釋液(將Blocking One以磷酸緩衝液稀釋成2倍者)稀釋成2000倍之辣根過氧化酶標識山羊抗小鼠Ig抗體(HRP-goat anti-mouse Ig antibody；DAKO公司)。室溫培養1小時後，以洗淨液洗淨。加入化學發光檢出試藥之POD(Roche公司)，將其化學發光量以EnVision計數器(Perkin Elmer公司)測定。
(實施例5：人類sTWEAK刺激NF-κB活性化抑制分析)
藉由TWEAK之刺激，從活性化NF-κB，誘導MCP-1等趨化激素的表現，而誘發發炎反應(Nat Rev Drug Discov.2008；7(5)：411-425)，本發明者們，將NF-κB之活性化抑制作為指標，評價對於人類sTWEAK之抗體之中和活性。
將HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)(內在表現人類TWEAK受體)於實驗之3日前，以成為4×106細胞/10cm皿的方式，以DMEM培養基(Life Technologies公司)於10cm皿(IWAKI公司)以17mL/皿播種，1小時後，將pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector(Promega公司)使用Fugene HD(Promega公司)導入細胞。藉此，可將NF-κB之活性化評價為螢光素酶(Luciferase)之活性指標。兩天後，回收細胞，以1×104細胞/孔於384孔培養板(Greiner公司)以DMEM培養基播種30μL。加入15μL之來自融合瘤之抗體溶液(將融合瘤之培養上清液以蛋白質 G管柱(Generon公司)純化，以DMEM培養基稀釋之溶液)，在設定為37℃之CO2培養箱靜置5分鐘。進而，添加以DMEM培養基調製之15μL人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司)溶液(終濃度100ng/mL)、在設定為37℃之CO2培養箱培養5小時。將培養上清液去除20μL之後，添加40μL之One-Glo Luciferase Assay溶液(Promega公司)，於室溫攪拌10分鐘。之後，將化學發光量以EnVision計數器(Perkin Elmer公司)測定。
(實施例6：人類mTWEAK刺激NF-κB活性化抑制分析)
藉由TWEAK之刺激，活性化NF-κB，誘導MCP-1等趨化激素的表現而誘發發炎反應，又，傳達訊息之最大活性與sTWEAK相比較，由於mTWEAK較強(J Immunol.2010；185(3)：1593-1605、Br J Pharmacol.2013；170(4)：748-764)，故本發明者們，將NF-κB之活性化抑制作為指標，評價對於人類mTWEAK之抗體之中和活性。
將HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)於實驗之3天前以成為4×106細胞/10cm皿的方式，於DMEM培養基(Life Technologies公司)以10cm皿(IWAKI公司)以17mL/皿播種，1小時後，將pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector(Promega公司)使用Fugene HD(Promega公司)導入細胞。藉此，可將NF-κB之活性化作為評價螢光素酶活性之指標。又，於實驗之3天前將HEK293細胞 (ATCC：CRL-1573)以成為4×106細胞/10cm皿的方式，於DMEM培養基(Life Technologies公司)以10cm皿(IWAKI公司)以17mL/皿播種，1小時後，將於實施例1所製作之人類mTWEAK表現載體使用Fugene HD(Promega公司)導入細胞。兩天後，導入pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector回收HEK293細胞，以1×104細胞/孔於384孔培養板(Greiner公司)以DMEM培養基播種30μL。加入15μL之來自融合瘤之抗體溶液(將融合瘤之培養上清液以蛋白質G管柱(Generon公司)純化，並以DMEM培養基稀釋之溶液)，在設定為37℃之CO2培養箱靜置5分鐘。進而，將導入人類mTWEAK表現載體之HEK293細胞懸濁在DMEM培養基以成為5×104細胞/孔的方式添加15μL，在設定為37℃之CO2培養箱培養5小時。去除20μL培養上清液後，添加40μL之One-Glo Luciferase Assay溶液(Promega公司)，於室溫攪拌10分鐘。之後，將化學發光量以EnVision計數器(Perkin Elmer公司)測定。
於實施例3、4、5、及6之抗體的評價結果，清楚可知命名為TBA3-25、TBA3-35、及TBA4-1之抗體(嵌合抗體)，對於人類sTWEAK及人類mTWEAK係具有高度鍵結活性及中和活性。
(實施例7：抗體之序列決定)
對於藉由前述之分析而被鑑定之抗體，本發明者們選 殖從融合瘤編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因。從各融合瘤萃取RNA，使用cDNA擴增套組(SMARTer RACE cDNA Amplification kit；Clontech公司)，製作cDNA。其次，使用PCR，伸長及擴增重鏈及輕鏈之可變區。將此PCR產物以直接定序器(ABI PRISM 3100；Applied Biosystems公司)進行序列解析。又，將PCR產物對pCR2.1-TOPO(Life Technologies公司)等PCR產物次選殖用載體進行重組後，解析基因序列以進行序列決定。
抗體之序列決定後，為了提昇抗體之物性及安定性，對於前述之抗體TBA3-35，於其重鏈及輕鏈之可變區導入胺基酸變異，製作抗體之改變體(TBA3-35.1)。
(實施例8：完全人類型抗體之製作)
前述之抗體係可變區為來自人類，恆定區為來自小鼠之抗體。因此，本發明者們，使用GS載體(Lonza公司)，構築包含重鏈及輕鏈二基因之表現載體，製作完全人類型抗體。具體而言，於TBA3-25、TBA3-35.1及TBA4-1之各抗體之重鏈可變區基因之5’側，將編碼訊息序列(Nigel Whittle們、Protein Engineering 1987；1(6)：499-505.)之基因，且於3’側分別連接人類Igγ1之恆定區基因(由序列編號2之鹼基序號355至1347之鹼基序列所構成)，將此重鏈基因插入於GS載體pEE6.4。又，於各抗體之輕鏈可變區基因之5’側，將編碼訊息序列(Nigel Whittle們，前出)之基因，且於3’側分別連接人類κ鏈之 恆定區基因(由序列編號4之鹼基序號325至645之鹼基序列所構成)，此輕鏈基因插入於GS載體pEE12.4。
分別將所製作TBA3-25之完全人類型抗體(完全人類型TBA3-25)之重鏈的鹼基序列示於序列編號2，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號1，將該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號4，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號3。序列編號1所示之重鏈之可變區係由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號1之胺基酸編號31至35、50至66、99至107之胺基酸序列所構成。序列編號3所示之輕鏈的可變區係由從序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號1之胺基酸編號24至34、50至56、89至97之胺基酸序列所構成。
分別將所製作之TBA3-35.1之完全人類型抗體(完全人類型TBA3-35.1)之重鏈的鹼基序列示於序列編號6，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號5，將該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號8，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號7。序列編號5所示之重鏈之可變區係由序列編號5之胺基酸編號1至125之胺基酸序列所構成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號5之胺基酸編號31至35、50至66、99至114之胺基酸序列所構成。序列編號7所示之輕鏈之可變區係由序列編號7之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成，輕鏈之 CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號7之胺基酸編號24至34、50至56、89至97之胺基酸序列所構成。
分別將所製作之TBA4-1之完全人類型抗體(完全人類型TBA4-1)之重鏈的鹼基序列示於序列編號10，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號9，將該抗體之輕鏈之鹼基序列示於序列編號12，藉此將所編碼之胺基酸序列示於序列編號11。序列編號9所示之重鏈之可變區係由序列編號9之胺基酸編號1至121之胺基酸序列所構成，重鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號9之胺基酸編號31至35、50至66、99至110之胺基酸序列所構成。序列編號11所示之輕鏈之可變區係由序列編號11之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成，輕鏈之CDR1、CDR2、CDR3係分別由序列編號11之胺基酸編號24至34、50至56、89至97之胺基酸序列所構成。
使用分別插入各抗體之重鏈與輕鏈基因之前述之GS載體，以一次性表現及恆常性表現之2種方法進行抗體表現。對於一次性表現，對於以FreeStyle 293 Expression medium(Life Technologies公司)培養成約1×106個/mL之FreeStyle 293細胞(Life Technologies公司)，將前述之重鏈及輕鏈之雙表現載體使用轉染試藥之293fectin(Life Technologies公司)進行轉染，培養7天。或者，對於約1×107萬個之CHO-K1SV細胞，將前述之重鏈及輕鏈之雙表現載體使用電穿孔法進行轉染，於CD- CHO medium(Life Technologies公司)中培養14天。將培養上清液使用蛋白質A或蛋白質G(GEHealthcare Japan公司)進行純化，得到各完全人類型抗體之純化抗體。對於恆常性表現，將分別插入各抗體之重鏈與輕鏈之基因之前述之GS載體以NotI與PvuI限制酶切斷，使用Ligation-Convenience Kit(NIPPONGENE公司)或Ligation-high(TOYOBO公司)進行結紮，構築插入重鏈與輕鏈之兩基因之GS載體。此表現載體已編碼完全長之重鏈及輕鏈與麩醯胺酸合成酶(Glutamine synthetase)，於CHO-K1SV細胞藉由轉染使抗體表現。將培養上清液以蛋白質A或蛋白質G管柱(GEHealthcare Japan公司)純化，得到各完全人類型抗體之純化抗體。分析經純化之完全人類型TBA3-25之胺基酸修飾之結果，純化抗體之大部分中，對重鏈N末端之麩醯胺酸的焦麩胺酸之修飾、及產生重鏈C末端離胺酸的缺失。
(實施例9：完全人類型抗體之對於人類sTWEAK之鍵結活性評價)
本發明者們，對於各完全人類型抗體，評價對於人類sTWEAK之鍵結活性。於本實施例，使用huP2D10-2(專利文獻1)作為比較抗體。
將人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司)以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS(-))(未包含鈣與鎂之磷酸緩衝生理食鹽水)調製成0.5μg/mL，固相化於384孔培養板(Nunc 公司)。將封鎖劑(Blocking One；NACALAITESQUE公司)添加120μl並於室溫靜置1小時後，以洗淨液(TBS-T(pH7.4))洗淨。添加30μL以PBS(-)調製完全人類型抗體(完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1或完全人類型TBA4-1)或huP2D10-2之稀釋系列(最終濃度為從80nM至0.0000003nM範圍為15階段)。室溫培養1小時後，在洗淨液洗淨，添加30μL以稀釋液(將Blocking One以磷酸緩衝液稀釋成2倍者)稀釋成2000倍之辣根過氧化酶標識山羊抗小鼠Ig抗體(HRP-goat anti-mouse Ig antibody；DAKO公司)。室溫培養1小時後，以洗淨液洗淨。加入30μL化學發光檢出試藥之POD(Roche公司)，將其化學發光量以EnVision計數器(Perkin Elmer公司)測定，算出EC50值(表1)。
其結果，非常清楚雖為完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1、及完全人類型TBA4-1之任一種，但具有與比較抗體huP2D10-2為同等以上之對於人類sTWEAK之鍵結活性。
(實施例10：完全人類型抗體之對於人類mTWEAK之鍵結活性評價)
本發明者們，對於各完全人類型抗體，評價對於人類mTWEAK之鍵結活性。於本實施例，使用huP2D10-2作為比較抗體。
具體而言，在使用BD FACSArray Bioanalyzer(Becton Dickinson公司)之鍵結分析算出EC50值。將HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)於實驗之3天前以成為4×106細胞/10cm皿的方式，於DMEM培養基(Life Technologies公司)以10cm皿(IWAKI公司)以17mL/皿播種，1小時後，將於實施例1所製作之人類mTWEAK表現載體使用Fugene HD(Promega公司)導入細胞。實驗當天，將導入人類mTWEAK表現載體之HEK293細胞以1×105細胞/孔進行分注。並添加30μL以FACS緩衝液(加入0.1%疊氮化鈉及10%牛血清之磷酸緩衝液)調製完全人類型抗體(完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1或完全人類型TBA4-1)或huP2D10-2之稀釋系列(最終濃度為80nM至0.001355nM範圍為11階段)。於4℃培養6小時後，以FACS緩衝液洗淨，加入50μL以FACS緩衝液稀釋成100倍之PE標識山羊抗人類IgG(PE-goat anti-human IgG antibody；Jackson公司)，於4℃培養1小時。使用BD FACSArray Bioanalyzer測定MFI(median fluorescence intensity)值，算出EC50值(表2)。
其結果，清楚可知完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1、及完全人類型TBA4-1之任一種係具有與比較抗體huP2D10-2同等以上之對於人類mTWEAK之鍵結活性。
(實施例11：人類sTWEAK刺激NF-κB活性化抑制分析)
本發明者們，對於各完全人類型抗體，使用HEK293細胞，評價對於人類sTWEAK之抗體之中和活性。於本實施例使用huP2D10-2作為比較抗體。本實施例除了取代來自融合瘤之抗體溶液，改添加15μL以DMEM培養基調製之各完全人類型抗體(完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1或完全人類型TBA4-1)或huP2D10-2之稀釋系列(最終濃度從10000ng/mL至2.44ng/mL之範圍為7階段)，其他依實施例5之方法進行。
測定化學發光量後，算出對於各抗體之人類sTWEAK刺激NF-κB活性之IC50值(表3)。
其結果，清楚可知完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1、及完全人類型TBA4-1之任一種對於人類sTWEAK刺激NF-κB活性，具有較比較抗體huP2D10-2更高的抑制作用。
(實施例12：人類mTWEAK刺激NF-κB活性化抑制分析)
本發明者們，對於各完全人類型抗體，使用HEK293細胞，評價對於人類mTWEAK之抗體之中和活性。於本實施例，使用huP2D10-2作為比較抗體。本實施例除了取代來自融合瘤之抗體溶液，改添加15μL以DMEM培養基所調製之各完全人類型抗體(完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1或完全人類型TBA4-1)或huP2D10-2之稀釋系列(最終濃度為從2000ng/mL至0.48ng/mL之範圍為7階段)，依實施例6之方法進行。
測定化學發光量後，算出對於各抗體之人類mTWEAK刺激NF-κB活性之IC50值(表4)。
其結果，如表4及圖1所示，清楚可知相對於比較抗體huP2D10-2僅部分性抑制人類mTWEAK刺激NF-κB活性，完全人類型TBA3-25、完全人類型TBA3-35.1、及完全人類型TBA4-1之任一種係完全抑制人類mTWEAK刺激NF-κB活性。
(實施例13：人類sTWEAK刺激MCP-1表現抑制分析)
本發明者們，將MCP-1基因之表現抑制作為指標，評價對於人類sTWEAK之抗體之中和活性。於本實施例，使用huP2D10-2及TW305之人類化抗體(專利文獻3之Table 6B所記載之Antibody34)作為比較抗體。
將人類近位尿細管上皮細胞系HK-2細胞(ATCC：CRL-2190)(內在表現人類TWEAK受體)，於實驗當天以成為1×105細胞/孔的方式，以RPMI1640培養基(Life Technologies公司)於96孔培養板(IWAKI公司)以120μL/孔來播種。添加15μL以RPMI1640培養基調製完全人類型TBA3-25、huP2D10-2、或Antibody34之稀釋系列(最終濃度為從10000ng/mL至3.2ng/mL之範圍為6階 段)。添加15μL以RPMI1640培養基所調製之人類sTWEAK蛋白質(Peprotech公司)溶液(終濃度300ng/mL)，在設定為37℃之CO2培養箱培養8小時。去除培養上清液後，在Cells-to-CT套組(Life Technologies公司)調製逆轉錄產物。對於其逆轉錄產物，使用Taqman Gene Expression system(Life Technologies公司)及Prism(Life Technologies公司)進行MCP-1基因(ccl2)量之測定。又，測定作為內在性對照之甘油醛-3-磷酸去氫酶(gapdh)基因量，修正MCP-1基因量。於此，使用Hs00234140_m1作為ccl2之啟動子，使用Hs02758991_g1(皆為Life Technologies公司)作為gapdh之啟動子。
測定MCP-1基因量後，算出對於各抗體之人類sTWEAK刺激MCP-1表現之IC50值(表5)。
其結果，如表5及圖2所示，清楚可知完全人類型TBA3-25相對於人類sTWEAK刺激MCP-1表現，係具有較比較抗體huP2D10-2及Antibody34更高的抑制作用。
(實施例14：人類mTWEAK刺激MCP-1表現抑制分析)
本發明者們，將MCP-1基因之表現抑制作為指標，評價對於人類mTWEAK之抗體之中和活性。於本實施例，使用huP2D10-2及Antibody34作為比較抗體。
於實驗之3天前將HEK293細胞(ATCC：CRL-1573)以成為4×106細胞/10cm皿的方式，於RPMI1640培養基(Life Technologies公司)以10cm皿(IWAKI公司)以17mL/皿播種，1小時後，將於實施例1所製作之人類mTWEAK表現載體使用Fugene HD(Promega公司)導入細胞。將HK-2細胞(ATCC：CRL-2190)於實驗當天以成為1×105細胞/孔的方式，於RPMI1640培養基(Life Technologies公司)於96孔培養板(IWAKI公司)以120μL/孔來播種。添加15μl於RPMI1640培養基調製完全人類型TBA3-25、huP2D10-2、或Antibody34之稀釋系列(最終濃度為從10000ng/mL至3.2ng/mL之範圍為6階段)。將導入人類mTWEAK表現載體之HEK293細胞懸濁在RPMI1640培養基以成為5×105細胞/孔的方式添加15μL，在設定為37℃之CO2培養箱培養8小時。去除培養上清液後，在Cells-to-CT套組(Life Technologies公司)調製逆轉錄產物。對於其逆轉錄產物，使用Taqman Gene Expression system(Life Technologies公司)及Prism(Life Technologies公司)進行MCP-1基因(ccl2)量之測定。又，測定作為內在性對照之內gapdh基因量，修正MCP-1基因量。於此，使用Hs00234140_m1作為 ccl2之啟動子，使用Hs02758991_g1(皆為Life Technologies公司)作為gapdh之啟動子。
測定MCP-1基因量後，算出對於各抗體之人類mTWEAK刺激MCP-1表現之IC50值(表6)。
其結果，如表6及圖3所示，清楚可知相對於比較抗體huP2D10-2及Antibody34僅部分抑制人類mTWEAK刺激MCP-1表現，完全人類型TBA3-25係完全抑制人類mTWEAK刺激MCP-1表現。
[產業上之可利用性]
本發明之抗人類TWEAK抗體係有用於人類TWEAK參與病態形成之各種疾病之預防或治療。
[序列表自由文字]
於發現以下序列表之數字<223>，記載「Artificial Sequence」之說明。具體而言，序列表之序列編號2及4所示之鹼基序列，係分別完全人類型TBA3-25之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列編號1及3所示之胺基酸序列係分別藉由序列編號2及4所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列 。序列表之序列編號6及8所示之鹼基序列係分別為完全人類型TBA3-35.1之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列編號5及7所示之胺基酸序列係分別藉由序列編號6及8所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號10及12所示之鹼基序列係分別為完全人類型TBA4-1之重鏈及輕鏈之鹼基序列，序列編號9及11所示之胺基酸序列係分別藉由序列編號10及12所編碼之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。序列表之序列編號14所示之鹼基序列係人類mTWEAK變異體之鹼基序列，序列編號13所示之胺基酸序列係人類mTWEAK變異體之胺基酸序列。序列表之序列編號15所示之胺基酸序列係本實施例所使用之人類sTWEAK蛋白質之胺基酸序列。
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<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 1
<210> 2
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 2
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 3
<210> 4
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 4
<210> 5
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 5
<210> 6
<211> 1368
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 6
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 7
<210> 8
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 8
<210> 9
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 9
<210> 10
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 10
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain of anti-human TWEAK antibody
<400> 11
<210> 12
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-chain gene of anti-human TWEAK antibody
<400> 12
<210> 13
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human mTWEAK mutant
<400> 13
<210> 14
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gene of human mTWEAK mutant
<400> 14
<210> 15
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human sTWEAK
<400> 15
<210> 16
<211> 249
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16

Claims (14)

  1. 一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至118之胺基酸序列所構成之重鏈可變區、及由序列編號3之胺基酸編號1至108之胺基酸序列所構成之輕鏈可變區。
  2. 如請求項1之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之重鏈恆定區為人類Igγ1恆定區。
  3. 如請求項1之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之輕鏈恆定區為人類Igκ恆定區。
  4. 如請求項1之抗人類TWEAK抗體，其中，前述抗體之重鏈恆定區為人類Igγ1恆定區，前述抗體之輕鏈恆定區為人類Igκ恆定區。
  5. 如請求項1之抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  6. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列。
  7. 一種聚核苷酸，其係包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列。
  8. 一種表現載體，其係包含如請求項6及/或7之聚核苷酸。
  9. 一種經如請求項8之表現載體而形質轉換之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所構成之群；(a)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載 體為包含：包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(b)經下述兩表現載體，而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；(c)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體為包含：包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之重鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸；及(d)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體為包含：包含編碼如請求項1之抗人類TWEAK抗體之輕鏈可變區之鹼基序列之聚核苷酸。
  10. 一種經如請求項8之表現載體而形質轉換之宿主細胞，其係選自由以下之(a)~(d)所構成之群；(a)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體為包含：包含編碼如請求項5之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸與包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸；(b)經下述兩表現載體，而形質轉換之宿主細胞，該兩表現載體之一為包含：包含編碼如請求項5之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸，另一為包含：包含編碼該抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸； (c)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體為包含：包含編碼如請求項5之抗人類TWEAK抗體之重鏈之鹼基序列之聚核苷酸；及(d)經下述表現載體而形質轉換之宿主細胞，該表現載體為包含：包含編碼如請求項5之抗人類TWEAK抗體之輕鏈之鹼基序列之聚核苷酸。
  11. 一種生產抗人類TWEAK抗體之方法，其係包含培養如請求項9或10之宿主細胞，使其表現抗人類TWEAK抗體之步驟。
  12. 一種抗人類TWEAK抗體，其係以如請求項11之方法生產。
  13. 一種抗人類TWEAK抗體，其係包含由序列編號1之胺基酸編號1至447之胺基酸序列所構成，且胺基酸編號1之麩醯胺酸被焦麩胺酸修飾之重鏈、及由序列編號3所示之胺基酸序列所構成之輕鏈。
  14. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項1、12或13之抗人類TWEAK抗體及藥學上所容許之賦形劑。
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