TW202222831A - 抗-OX40L抗體、抗OX40L和抗-TNFα雙特異性抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種特異性結合OX40L之新穎抗體及特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，且特定言之關於特異性結合人OX40L以有效抑制OX40與OX40受體結合之抗體或雙特異性抗體；編碼該抗體之核酸；包含該核酸之表現載體；包含該表現載體之轉型體；用於製備該抗體之方法；用於治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之醫藥組合物，其包含該抗體；用於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之組合物，其包含該抗體；藉由使用該抗體診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之診斷；藉由使用該抗體提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的方法；以及用於提供其之套組。

Description

抗-OX40L抗體、抗OX40L和抗-TNFα雙特異性抗體及其用途

本發明係關於一種特異性結合OX40L之新穎抗體及特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，特定言之係關於特異性結合人OX40L以有效抑制OX40與OX40受體結合之抗體或雙特異性抗體；編碼前述抗體之核酸；包括前述核酸之表現載體；包括前述表現載體之轉型體；用於製備前述抗體之方法；用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之醫藥組合物，其包括前述抗體；用於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之組合物，其包括前述抗體；藉由使用前述抗體診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法；藉由使用前述抗體提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊之方法；以及用於提供其之套組。

自體免疫性疾病或發炎性疾病係由人類免疫異常活化引起。在風濕性關節炎(其是自體免疫性疾病之代表性病狀)之情況下，TNFα抑制劑已佔治療市場的68%。

腫瘤壞死因子α (TNFα)係由多種細胞類型(包括單核細胞及巨噬細胞)產生之細胞因子，且首先藉由其誘發某些小鼠腫瘤壞死之能力而被最先鑑別[參見Old, L. (1985) Science230: 630-632]。此後，發現與惡病質相關的名為惡病質素(cachectin)之因子係與TNFα相同之分子。TNFα參與介導休克[參見Beutler, B.及Cerami, A. (1988) Annu. Rev.Biochem. 57: 505-518；Beutler, B.及Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 625-655]。另外，TNFα已牽涉於多種人類疾病及病症的病理生理學中，前述疾病及病症包括敗血症、傳染性疾病、自體免疫性疾病、移植排斥及移植物抗宿主疾病[參見Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 411-452；Tracey, K. J.及Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: 491- 503]。

由於人TNFα (hTNFα)在多種疾病中的有害作用，因此已設計治療策略來抑制或抵消hTNFα活性。特定言之，已使用結合且中和hTNFα之抗體作為抑制hTNFα活性之手段。前述hTNFα中和抗體包括由融合瘤分泌之小鼠單株抗體(mAb)，前述融合瘤係自用hTNFα免疫之小鼠的淋巴細胞獲得[參見Hahn T等人, (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 3814-3818；Liang, C-M.等人, (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:847-854；Hirai, M.等人, (1987) J. Immunol. Methods 96: 57-62；Fendly, B. M.等人, (1987) Hybridoma 6: 359-370；Muller, A.等人, L. (1990) Cytokine 2: 162-169；U.S專利第5,231,024號 (Moeller等人)；EP專利公開案第186833 B1號(Wallach, D.)；EP專利公開案第218 868 Al號 (Old等人.)；EP專利公開案第260 610 B 1號(Moeller, A.等人)]或嵌合抗體[參見Knight, D. M等人, (1993) Mol. Immunol.30: 1443-1453；PCT未經審查公開案WO 92/16553 (Daddona, P. E.等人)]或人源化單株抗體[參見PCT未經審查公開案WO 92/11383 (Adair，JR等人)]或人單株抗體[參見U.S. 10-1142825]或其類似物。此等抗hTNFα抗體可對hTNFα具有高親和力(例如Kd ≤ 10 ^-9M)且中和hTNFα活性。此等抗hTNFα抗體已用作多種自體免疫性疾病、感染、移植排斥、移植物抗宿主病及其類似疾病之治療劑。

然而，患者組之約50%對TNFα抑制劑，諸如此等抗hTNFα抗體難治癒(Nature Reviews Rheumatology 第11卷, 276-289(2015)。此外，最近開發之自體免疫性疾病之標靶係CTLA-4、IL-6、JAK1、JAK2、CD20及其類似物，但自其衍生之藥物未能顯示與TNFα抑制劑一樣的功效(Nature Reviews Rheumatology 第11卷, 276–289(2015)。

特定言之，諸如類風濕性關節炎等自體免疫性疾病並非簡單地由一種類型之免疫細胞的異常引起，而是作為整個免疫系統之問題發生。因此，用於開發僅抑制單個標靶之治療劑的現有方法在增強治療劑功效方面具有局限性。因此，為了克服此類功效局限性，目前已經開發出一種雙特異性或多特異性抗體，其一次性控制兩個或更多個具有不同作用機制的標靶。然而，現有雙特異性抗體對先天或後天性免疫系統中之特異性細胞具有局限性，且因此不能改善免疫系統之整體穩態(homeostasis)。

[技術問題]

本發明之目的係提供與OX40L (OX40配位體)特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段。

本發明之目的係提供識別OX40L之構型抗原決定基(epitope)的與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體，其包括：在由SEQ ID NO： 1表示之OX40L蛋白的胺基酸序列中由SEQ ID NO： 3表示之第93至100號胺基酸序列，以及由SEQ ID NO： 4表示之第141至151號胺基酸序列。

本發明之目的係提供一種雙特異性抗體，其包括與OX40L (OX40配位體)特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段；以及與腫瘤壞死因子α (TNFα)特異性結合之抗體或其抗原結合片段。

本發明之目的係提供編碼抗OX40L抗體、其結合片段或雙特異性抗體之核酸；其中引入前述核酸之表現載體；或其中引入前述表現載體之宿主細胞。

本發明之目的係提供一種藉由使用宿主細胞生產抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體之方法。

本發明之目的係提供一種用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之醫藥組合物，其包括抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。

本發明之目的係提供一種用於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之組合物，其包括抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。

本發明之目的係提供一種用於偵測上述OX40L及TNFα中之至少一者的組合物，包括抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。

本發明之目的係提供一種用於藉由使用抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體來提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的方法。

本發明之目的係提供一種用於提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的套組，其包括抗OX40L抗體、其抗原結合片段或雙特異性抗體。

本發明之目的係提供一種用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法，其包括投與醫藥上有效量之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或雙特異性抗體。

本發明之目的係提供一種抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或雙特異性抗體之用途，其用於製造用以預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之藥物。

本發明之目的係提供一種抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或雙特異性抗體之用途，其用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病。 [技術方案]

本發明中揭示之各描述及實施例可分別應用於其他描述及實施例。換言之，本發明中揭示之各種要素的所有組合均屬於本發明之範疇內。

另外，不能認為本發明之範疇限於下文描述之具體描述。

本發明可提供一種抗OX40L抗體或其結合片段，其與OX40L特異性結合且抑制OX40L與OX40受體之間的相互作用。

如本文所用，術語『抗體』可指用作特異性識別抗原之受體的蛋白分子，所述抗原包括與某些抗原具有免疫反應性之免疫球蛋白分子，且此術語可包括多株抗體、單株抗體、完整抗體，以及所有結合片段。另外，上述術語可包括嵌合抗體(例如人源化鼠類抗體)、人源化抗體、人抗體及二價或雙特異性分子(例如雙特異性抗體)、雙抗體、三抗體或四抗體。

通常，免疫球蛋白可具有重鏈及輕鏈，且重鏈及輕鏈中之每一者可包括恆定區及可變區(此區亦稱為結構域)。重鏈及輕鏈之可變區可包括三個多可變區及四個架構區，其稱為互補決定區(CDR)。CDR可在主要結合抗原之抗原決定基中發揮作用。各鏈之CDR可依序係指CDR1、CDR2及CDR3，通常自N端開始，且亦可由定位有某些CDR之鏈來鑑別。

整個抗體可採取具有兩個全長輕鏈及兩個全長重鏈之結構，其中各輕鏈藉由二硫鍵與重鏈連接。整個抗體可包括IgA、IgD、IgE、IgM及IgG，且IgG可包括作為亞型之IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃及IgG ₄。重鏈恆定區可具有gamma (γ)、mu (μ)、alpha (α)、delta (δ)及epsilon (ε)類型，且亦可具有gamma 1 (γ1)、gamma 2 (γ2)、gamma 3 (γ3)、gamma 4 (γ4)、alpha 1 (α1)及alpha 2 (α2)作為子類。輕鏈恆定區可具有kappa (κ)及lambda (λ)類型。

如本文所用，術語『片段』、『抗體片段』、『抗原結合片段』及『結合片段』可指具有抗原結合功能之本發明抗體的任何片段，且可以彼此互換使用，且可包括Fab、Fab'、F(ab') ₂、Fv及其類似物。

Fab可具有一個抗原結合位點，其採取具有輕鏈及重鏈之可變區、輕鏈之恆定區及重鏈之第一恆定區(CH1結構域)的結構。Fab′可能與Fab有所不同，因為Fab′在重鏈CH1結構域的C末端具有一個鉸鏈區，前述鉸鏈區包括至少一個半胱胺酸殘基。F(ab') ₂抗體可以使Fab'鉸鏈區之半胱胺酸殘基形成二硫鍵之方式產生。可變片段(Fv)可指僅具有重鏈可變區及輕鏈可變區之最小抗體片段。在雙鏈Fv (dsFv)之情況下，重鏈可變區及輕鏈可變區藉由二硫鍵彼此連接。在單鏈Fv (scFv)之情況下，重鏈可變區及輕鏈可變區通常經肽連接子藉由共價鍵彼此連接。結合片段可藉由使用蛋白酶獲得(例如Fab可藉由用木瓜蛋白酶對整個抗體進行限制性消化獲得，而F(ab') ₂片段可藉由用胃蛋白酶進行此舉來獲得)，且可例如藉由基因重組技術製備。

如本文所用，術語『單株抗體』可指自一組實質上相同之抗體獲得的具有單個分子組成之抗體分子，且此單株抗體可顯示出對某些抗原決定基的單一結合特異性及親和力。在本發明之實例中，根據本發明之與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體或與OX40L及TNFα特異性結合之雙特異性抗體可為單分子抗體。特定言之，抗OX40L抗體可指特異性結合OX40L之某一抗原決定基之單一分子組成的抗體，且雙特異性抗體可指同時特異性結合OX40L及TNFα之某些抗原決定基的單一分子組成之雙特異性抗體。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體及與OX40L及TNFα特異性結合之雙特異性抗體可為(但不限於)嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。

如本文所用，術語『嵌合抗體』可為藉由重組小鼠抗體之可變區及人抗體之恆定區產生的抗體，且可為與小鼠抗體相比在免疫反應方面有很大改善之抗體。

如本文所用，術語『人源化抗體』可指以使得源自非人類物種之抗體的蛋白序列變得類似於自人類天然產生之抗體變異體之方式修飾的抗體。舉例而言，可將小鼠來源之CDR與人抗體來源之FR重組以製備人源化可變區，且隨後與所需人抗體之恆定區重組的方式製備人源化抗體。然而，若僅簡單地進行CDR移植，則人源化抗體之親和力可能變低。因此，可使用使得認為對CDR之三維結構有影響的若干重要FR胺基酸殘基對小鼠抗體之彼等更具親和力的方式使此類低親和力升高至與小鼠源抗體之親和力相同的水準。

如本文所用，術語『人抗體』可指源自人免疫球蛋白之分子，其中形成抗體之所有胺基酸序列(包括互補決定區及架構區)均由人免疫球蛋白之胺基酸序列構成。人抗體通常用於治療人類疾病，且可能具有三種或更多種潛在優勢。首先，人抗體可以與人免疫系統更好地相互作用，且因此例如藉由補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)更有效地破壞標靶細胞。其次，優點是人類免疫系統不會將彼等抗體識別為異源的。第三，其優點在於，即使較不頻繁地投與較少量的藥物，人抗體在人類循環系統中之半衰期與天然存在之抗體的半衰期相似。在本發明之實例中，根據本發明之特異性結合OX40L之抗OX40L抗體及特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體可為人抗體。因此，本發明之人抗OX40L抗體及本發明之人雙特異性抗體可顯示出對OX40L之強親和力，從而有效抑制表現OX40L之細胞(例如單核細胞)與OX40受體的結合，且由於重鏈及輕鏈之結構域均來自人類，因此顯示低免疫原性，亦可用於治療諸如自體免疫性疾病或發炎性疾病之疾病。

如本文所用，術語『OX40L』可指作為受體之OX40蛋白的配位體，且具體地係指與OX40受體結合之蛋白。關於OX40L之資訊可自諸如國立衛生研究院的GenBank等公眾已知數據庫獲得，且可包括例如關於OX40L之資訊，其包括SEQ ID NO： 1之胺基酸序列，其中登錄號為Gene ID：54567，NCBI參考序列：NM_003326.5 (TNFSF4 ver1)，及NM_001297562.2 (TNFSF4 ver2)。

OX40L可能在抗原呈現細胞(APC)中過表現，且可能會活化多個免疫細胞。像TNFα及INFγ一樣，尤其觀察到OX40L在患有自體免疫性疾病之患者中過量產生(Eur. J. Immunol. 2000. 30: 2815–2823)。與分佈在全身之TNFα不同，OX40L可能僅在活化之免疫細胞中產生，且可能主要分佈在病變部位。OX40L可能係一種多重免疫調節蛋白，藉由同時參與先天性免疫系統之抗原呈現細胞(APC)及後天性免疫系統之T輔助細胞來參與重新獲得免疫系統的穩態(Nature Reviews Rheumatology 第12卷, 74–76(2016), (Clinic Rev Allerg Immunol, 2016)。

如本文所用，術語『OX40』可指介導OX40/OX40L訊號傳導之蛋白。上述OX40可無限制性的包括任何蛋白，只要前述蛋白介導OX40/OX40L訊號傳導即可。

如本文所用，術語『抑制OX40L與OX40之間的相互作用』或『抑制OX40L與OX40受體之間的相互作用』可意謂以抗OX40L抗體或其特異性結合本發明之OX40L的結合片段結合OX40L的方式遏制或抑制OX40L與OX40之間的相互作用。在抗OX40L抗體或其結合片段與OX40L結合的情況下，可以遏制或抑制OX40L之生物學功能，從而不引起OX40訊號傳導。換言之，可藉由抗OX40L抗體或其結合片段與OX40L之結合來遏制或抑制OX40L與OX40之間的相互作用，從而可遏制或抑制OX40訊號傳導。

在本發明中，『與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體』可指與OX40L特異性結合從而遏制或降低OX40L之生物學活性的抗體。前述抗體可遏制或抑制OX40L之生物學活性，從而遏制或抑制OX40L與OX40受體之間的相互作用。在本說明書中，『與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體』可與『與OX40L特異性結合之抗體』或『抗OX40L抗體』互換使用。

如上所述，抗OX40L抗體之形式可包括完整抗體及其結合片段。本發明之抗OX40L抗體可與人OX40L特異性結合且抑制OX40L與OX40受體之間的相互作用，且因此可用於治療諸如自體免疫性疾病或發炎性疾病的疾病，且亦可與在自體免疫性疾病或發炎性疾病中過表現之人OX40L特異性結合，從而在使副作用降至最低的同時使治療效果最大化。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其與OX40L特異性結合且抑制OX40L與OX40受體之間相互作用的抗原結合片段可以3 × 10 ^-9M或更低之K _D結合人OX40L。特定言之，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可以1.5 × 10 ^-9M、1.3 × 10 ^-9M，特定言之1 × 10 ^-9M或更低之K _D結合。

如本文所用，術語『締合常數(K _on)』可指特異性抗體-抗原相互作用中締合的比率，而術語『解離常數(K _off)』可指特異性抗體-抗原相互作用中的解離比率。另外，如本文所用，術語『對抗原之親和力(K _D)』可指表示為莫耳濃度(M)的K _off：K _on的比率(即K _off/K _on)。抗體之K _D值可藉由使用此項技術中成熟的方法量測。舉例而言，用於量測抗體之K _D值的方法可包括使用但不限於BioCore ^TM系統的表面電漿子共振分析。

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可顯示出對OX40L之高結合力，從而即使在低濃度下亦可遏制或抑制OX40L之活性，且因此可以顯示出對自體免疫性疾病或發炎性疾病的卓越治療效果。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可識別人OX40L之構型抗原決定基。舉例而言，根據本發明之抗OX40L抗體或其抗原結合片段可以3 × 10 ^-9M或更低的K _D結合至由SEQ ID NO： 1表示之人OX40L蛋白的胺基酸序列中之第93至100號及第141至151號胺基酸序列。特定言之，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可以1.5 × 10 ^-9M、1.3 × 10 ^-9M，特定言之1 × 10 ^-9M或更低的K _D結合至由SEQ ID NO： 1表示之人OX40L蛋白的胺基酸序列中之第93至100號及第141至151號胺基酸序列。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可以高結合力，特定言之3 × 10 ^-9M或更低之K _D結合至由SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO： 4表示的人OX40L蛋白的胺基酸序列。特定言之，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可以1.5 × 10 ^-9M、1.3 × 10 ^-9M，特定言之1 × 10 ^-9M或更低之K _D結合。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段之人OX40L的K _D可為藉由表面電漿子共振(Biacore)分析量測之K _D。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段可特定地包括但不限於如下所述之序列。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括： 重鏈可變區，其包括由選自SEQ ID NO： 12、13及14組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 15、16、17及18組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 19、20、21及22組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包括由選自SEQ ID NO： 23及24組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 25及26組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 27、28、29及30組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈CDR3。

如本文所用，術語『重鏈』可包括全長重鏈及其包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3的片段，其包括具有足以賦予抗原特異性之可變區序列的胺基酸序列。

另外，本文所用之術語『輕鏈』可包括全長輕鏈及其包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL之片段，其包括具有足以賦予抗原特異性之可變區序列的胺基酸序列。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可為包括(但不限於)以下之抗體： 重鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 12表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 15表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 19表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 23表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 25表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 27表示之輕鏈CDR3。在本發明之實例中，抗體命名為02C09。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可為包括(但不限於)以下之抗體： 重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3。在本發明之實施例中，抗體命名為hu3F07及I3F07。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可為包括(但不限於)以下之抗體： 重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 17表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 21表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 29表示之輕鏈CDR3。在本發明之實施例中，抗體命名為10H07。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可為包括(但不限於)以下之抗體： 重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 14表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 18表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 22表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 30表示之輕鏈CDR3。在本發明之實例中，抗體命名為21G07。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括： 由選自SEQ ID NO： 37、41、45、49及53組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及 由選自SEQ ID NO： 38、42、46、50及54組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈可變區。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括： (a) 由SEQ ID NO： 37表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 38表示之輕鏈可變區； (b) 由SEQ ID NO： 41表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 42表示之輕鏈可變區； (c) 由SEQ ID NO： 45表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 46表示之輕鏈可變區； (d) 由SEQ ID NO： 49表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 50表示之輕鏈可變區；或 (e) 由SEQ ID NO： 53表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 54表示之輕鏈可變區。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括： 由選自SEQ ID NO： 5、6、7及8組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及 由SEQ ID NO： 10之胺基酸序列表示的輕鏈可變區。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其結合片段可為包括以下之抗體或其結合片段： (a) 由SEQ ID NO： 37表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 38表示之輕鏈可變區；(b) 由SEQ ID NO： 41表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 42表示之輕鏈可變區；(c) 由SEQ ID NO： 45表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 46表示之輕鏈可變區；(d) 由SEQ ID NO： 49表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 50表示之輕鏈可變區；或(e) 由SEQ ID NO： 53表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 54表示之輕鏈可變區；及 由選自SEQ ID NO： 5、6、7及8組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及由SEQ ID NO： 10之胺基酸序列表示的輕鏈可變區。

在此情況下，包括(a)及(b)之可變區的抗體可為人源化抗體，且包括(c)至(d)之可變區的抗體可為嵌合抗體。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可具有足以在人體中顯示足夠作用之物理化學性質，且可具有優異的熱穩定性。舉例而言，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可在高於50℃、特定言之59℃或更高之溫度下熔融，且在人體中可具有約兩週或更長之半衰期。

在本發明之實例中，在本發明之抗OX40L抗體包括恆定區之情況下，此類抗體可包括源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合或其雜合之恆定區。

如本文所用，術語『組合』可意謂在形成二聚體或多聚體之情況下，編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白恆定區之多肽與不同來源之單鏈多肽形成鍵。舉例而言，可由選自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之恆定區組成之群的兩個或更多個恆定區形成二聚體或多聚體。

如本文所用，術語『雜合』可意謂對應於兩個或更多個不同來源之免疫球蛋白重鏈恆定區的序列存在於單鏈免疫球蛋白重鏈恆定區中。舉例而言，可存在包括選自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之CH1、CH2、CH3及CH4組成之群的一至四個結構域的結構域雜合。

同時，可具有作為IgG亞型之IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈恆定區的組合或雜合作用。前述組合或雜合作用可與上述相同。

在本發明之實例中，IgG1重鏈恆定區可為但不限於由SEQ ID NO： 5表示之IgG1重鏈恆定區；IgG1 N297A重鏈恆定區可為由SEQ ID NO： 6表示之重鏈恆定區；IgG4重鏈恆定區可為由SEQ ID NO： 7表示之IgG4重鏈恆定區；及IgG4 S228P重鏈恆定區可為由SEQ ID NO： 8表示之IgG4重鏈恆定區。

另外，在本發明之對OX40L具有特異性之抗OX40L抗體包括輕鏈恆定區的情況下，前述輕鏈恆定區可源自lambda (λ)或kappa (κ)輕鏈。在抗體之輕鏈恆定區源自kappa (κ)輕鏈之情況下，此輕鏈恆定區可為(但不限於)由SEQ ID NO： 10表示之kappa (κ)輕鏈恆定區。

在本發明中，抗體可包括由小鼠產生之小鼠抗體及藉由取代、添加及/或缺失親本抗體之一部分胺基酸序列獲得的其變異體，從而改善前述抗體之親和力、免疫性等。變異體可包括例如(但不限於)嵌合抗體、人源化抗體、親和力最佳化抗體等。如本文所用，術語『親和力最佳化抗體』可為其中某些抗體之一部分CDR序列被取代、添加或缺失之變異體，且可指對抗原具有改善之結合親和力同時與某些抗體結合相同抗原決定基之抗體。

在本發明中，變異體可以廣泛地指其中在包括與親本抗體相同的CDR或靶向相同抗原決定基之條件下，親本抗體之一部分CDR胺基酸序列發生突變(取代、添加或缺失)之抗體。熟習此項技術者可適當地調節此變異體以在保持針對同一抗原決定基之結合能力的範圍內改善抗體之親和力、免疫性及其類似物。

根據本發明，在特異性識別OX40L之範圍內，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括本文所述之抗OX40L抗體的序列以及其生物學等效物。舉例而言，可進一步改變抗體的胺基酸序列，以便進一步改善抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。此類修飾可包括例如抗體之胺基酸序列殘基的缺失、插入及/或取代。可基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如疏水性、親水性、電荷、大小等進行此類胺基酸突變。根據胺基酸側鏈取代基之大小、形狀及類型的分析，可理解精胺酸、離胺酸及組胺酸均為帶正電荷之殘基；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸的大小相似；且苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸具有相似之形狀。因此，基於此等考慮，可理解精胺酸、離胺酸及組胺酸；丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸；以及苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸是生物學功能等效物。舉例而言，在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可包括由本文之SEQ ID NO表示之胺基酸序列的一或多個殘基中的保守胺基酸的變化，且前述保守胺基酸之變化可包括如下表1所示之取代。 [ 表 1]保守胺基酸之取代

鹼性：	精胺酸
離胺酸
組胺酸
酸性：	麩胺酸
天冬胺酸
極性：	麩胺醯胺
天冬醯胺
疏水性：	白胺酸
異白胺酸
纈胺酸
芳族：	苯丙胺酸
色胺酸
酪胺酸
小型：	甘胺酸
丙胺酸
絲胺酸
蘇胺酸
甲硫胺酸

根據本發明之一個實例，製備靶向OX40L之新型抗體。自使用人OX40L (hOX40L)免疫之小鼠製備的基因庫及人類基因庫製備對OX40L特異之抗體，例如02C09、hu3F07、10H07及21G07。證實抗體以0.2至0.7 nM之高親和力特異性結合OX40L (表32，圖4)，且顯示出0.2至0.9 nM的活體外OX40L抑制活性，此明顯比對照抗體優異(圖5)。另外，抗體顯示出阻斷T細胞中的OX40L之免疫活性的結果(圖6)。此等結果表明對本發明之OX40L具有特異性的抗OX40L抗體有效地阻斷與OX40受體之結合且遏制OX40/OX40L訊號傳導，從而在自體免疫性疾病及發炎性疾病的治療方面顯示出極優異之效果，藉此表明此類抗體可使副作用降至最低且選擇性治療自體免疫性疾病及發炎性疾病，同時保持免疫系統之體內平衡。

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可藉由遏制OX40L之功能有效地用於自體免疫性疾病或發炎性疾病的治療。

人類免疫系統可由兩種類型組成：先天性免疫系統及後天性免疫系統，且當先天性及後天性免疫系統被異常活化時可能會發生自體免疫性疾病。

已知當OX40L及OX40受體彼此結合時，先天性及後天性免疫系統之免疫細胞可能過度活化而引起各種疾病。

上述OX40L可能同時參與先天性免疫系統的抗原呈現細胞(APC)及後天性免疫系統的T輔助細胞，且因此參與免疫系統之體內平衡(Nature Reviews Rheumatology 第12卷, 74–76(2016), (Clinic Rev Allerg Immunol, 2016)。此外，由於上述OX40L密集分佈於病灶部位，因此與全身分佈之細胞因子不同，根據本發明之抗OX40L抗體或其結合片段具有與病變周圍之OX40L結合的高度可能性。

因此，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可與密集分佈於病灶周圍之OX40L結合，從而使對自體免疫性疾病及發炎性疾病的治療效果最大化，且減少副作用以提高安全性。

另外，與先天性免疫系統相比，後天性免疫系統可顯示較慢反應速度，但持久性較高，且因此可作為治療由免疫系統過度活性引起之自體免疫性疾病的主要因素。根據本發明之抗OX40L抗體或其抗原結合片段可具有很大優勢，因為其對OX40L之遏制或抑制不僅調節先天性免疫細胞，而且亦調節習知自體免疫治療劑未能產生影響之後天性免疫細胞。

換言之，根據本發明，與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段可有效地遏制及抑制OX40L與OX40之間的相互作用，且因此可有效地用於自體免疫性疾病及發炎性疾病之治療。

本發明可提供編碼抗OX40L抗體或其抗原結合片段之核酸(聚核苷酸)；包括前述核酸之表現載體；及其中引入有表現載體之轉型體。

如本文所用，術語『核酸』或『聚核苷酸』可具有全面包括DNA及RNA分子之含義。核苷酸係核酸分子之基本組成單元，其可包括天然核苷酸以及在其中修飾有糖或鹼基位點之類似物(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, NewYork(1980)；Uhlman及Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584)。

根據本發明，可修飾編碼輕鏈可變區及重鏈可變區之核酸分子的序列，其中前述修飾可包括核苷酸之添加、缺失、或非保守或保守取代。

本發明之核酸可解釋為包括與上述核苷酸序列顯示實質同一性之核苷酸序列。在本發明中，在本發明之上述核苷酸序列及任何其他序列以彼此儘可能多的對應之方式比對且比對序列藉由使用此項技術中通常使用之算法分析的情況下，實質同一性可指顯示至少80%同源性，特定言之至少90%同源性，且更特定言之至少95%同源性之核苷酸序列。

如本文所用，用作在宿主細胞中表現標靶基因之手段的術語『載體』或『表現載體』可包括(但不限於)質體載體；黏質體載體；病毒載體，諸如噬菌體載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體及腺相關病毒載體；及其類似物，且特定言之可為質體載體。

在本發明之載體中，可將編碼輕鏈可變區之核酸分子及編碼重鏈可變區之核酸分子可操作地連接至啟動子。

如本文所用，術語『可操作地連接』可指核酸表現調節序列(例如啟動子、訊號序列或轉錄調節因子結合位點之陣列)與另一核酸序列之間的功能性連接，藉此調控序列可調控上述另一核酸序列之轉錄及/或解碼。

可藉由此項技術中已知之各種方法構建本發明之重組載體系統。舉例而言，其詳細方法揭示於Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，其內容以引用之方式併入本文。

在本發明中，包括編碼抗OX40L抗體或其抗原結合片段之核酸(聚核苷酸)的表現載體可為可以在真核細胞或原核細胞中複製及/或表現前述核酸之載體，前述真核細胞或原核細胞包括(但不特定限於)哺乳動物細胞(例如人、猴、家兔、大鼠、倉鼠、小鼠細胞等)、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(例如大腸桿菌等)。特定言之，表現載體可為包括至少一種選擇標記且與適當啟動子可操作地連接之載體，使得核酸可在宿主細胞中表現，更特定言之可為其中核酸引入至噬菌體、質體、黏質體、微型染色體、病毒、逆轉錄病毒載體等中之載體。

包括編碼抗OX40L抗體之核酸(聚核苷酸)的表現載體可為包括分別編碼抗OX40L抗體之重鏈或輕鏈的核酸的表現載體，或可為包括編碼全部重鏈或輕鏈之核酸的表現載體。

在本發明中，其中引入表現載體之轉型體可包括(但不限於)諸如大腸桿菌(E. coli)、鏈黴菌(streptomyces)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)等細菌細胞，其藉由向其中引入表現載體進行轉型；酵母細胞；真菌細胞，諸如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等；昆蟲細胞，諸如果蠅、斜紋夜蛾Sf9 (spodoptera Sf9)細胞等；動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母細胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、弓形黑色素瘤細胞、HT-1080、幼倉鼠腎細胞(BHK)、人類胚胎腎細胞(HEK)、PERC.6 (人類視網膜細胞)等；或植物細胞。在本發明之實例中，HEK細胞等用作宿主細胞。

如本文所用，術語『引入/轉移』可指用於將包括編碼抗OX40L抗體或其抗原結合片段之核酸(聚核苷酸)的載體遞送至宿主細胞的方法。可藉由此項技術中已知的若干方法進行此類引入，諸如磷酸鈣-DNA共沉澱法、DEAE-葡聚糖介導之轉染法、聚乙烯介導之轉染法、電擊法、顯微注射法、脂質體融合法、脂質轉染胺及原生質體融合法及其類似方法。另外，轉導可指藉由使用病毒顆粒經感染將標靶對象轉移至細胞中。另外，可藉由基因轟擊等將載體引入宿主細胞。在本發明中，引入可與轉型互換地使用。

本發明可提供製備抗OX40L抗體或其抗原結合片段之方法。

根據本發明，可藉由用於製備單株抗體之已知技術容易地製備抗OX40L抗體或其抗原結合片段。例如(但不限於)，製備單株抗體之方法可藉由自獲自免疫動物之B淋巴細胞製備融合瘤進行(Koeher及Milstein, 1976, Nature, 256:495)，或藉由噬菌體展現技術進行。

使用噬菌體展現技術之抗體基因庫可為藉由在不製備融合瘤之情況下直接從B淋巴細胞獲得抗體基因而在噬菌體表面表現抗體之方法。藉由使用噬菌體展現技術，有可能克服與藉由B細胞永生化產生單株抗體相關的許多現有困難。通常，噬菌體展現技術可包括以下步驟：1)將寡核苷酸之隨機序列插入與噬菌體外殼蛋白pIII (或pIV)之N-末端相對應的基因位點；2)表現由寡核苷酸之隨機序列以及部分天然外殼蛋白編碼之多肽的融合蛋白；3)處理能夠與寡核苷酸編碼之多肽結合的受體材料；4)藉由使用pH或結合競爭力低的分子溶離與受體結合之肽噬菌體顆粒；5)擴增在宿主細胞中淘選溶離之噬菌體；6)重複上述方法以獲得所需量；及7)自藉由淘選選擇之噬菌體純系的DNA序列確定活性肽之序列。

在本發明之實例中，根據本發明製備抗OX40L抗體或其抗原結合片段之方法可藉由使用噬菌體展現技術進行。參考噬菌體展現技術，例如Barbas等人 (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991, 及J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9)；Winter等人 (Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994)及其類似物中已知之方法，熟習此項技術者容易執行本發明之製備方法的每個步驟。可用於構建抗體基因庫之噬菌體可包括例如(但不限於)fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3噬菌體作為絲狀噬菌體。另外，可用於在絲狀噬菌體表面上表現異質基因之載體可包括例如(但不限於)噬菌體載體，諸如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1、fdtetDOG或其類似物，或噬菌粒載體，諸如pHEN1、pComb3、pComb8、pSEX或其類似物。另外，可用於提供成功重新感染重組噬菌體以進行擴增所需的野生型外殼蛋白的輔助噬菌體可包括例如(但不限於)M13K07、VSCM13或其類似物。

根據本發明，可以藉由使用習知程序容易地分離及定序編碼噬菌體展現純系的聚核苷酸。舉例而言，可使用設計成自此項技術中之融合瘤或噬菌體模板DNA特異性擴增重鏈及輕鏈編碼區的寡核苷酸引子。一旦分離聚核苷酸，則可將聚核苷酸插入至表現載體中，隨後可將表現載體引入至適合宿主細胞中，從而自經轉型之宿主細胞(即轉型體)產生所需單株抗體。因此，本發明之製備人單株抗體之方法可為製備人單株抗體之方法，包括(但不限於)擴增包括編碼人單株抗體之聚核苷酸的表現載體的步驟。

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可藉由已知重組方法或生物化學方法來製備，且可自轉型體之培養液中回收抗體，其中引入了適當宿主細胞中包括編碼抗體之核酸的載體。

在本發明之實例中，製備(產生)與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段之方法可包括以下步驟： (a) 藉由培養轉型體產生抗OX40L抗體或其抗原結合片段；及 (b) 回收上述步驟(a)中產生之抗OX40L抗體或其抗原結合片段。

在本發明之實例中，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可藉由已知分離方法分離，且可例如藉由習知免疫球蛋白純化程序自培養基適當地分離，前述習知免疫球蛋白純化程序諸如(但不限於)蛋白A-瓊脂糖、凝膠電泳、透析或親和層析法。

本發明可提供一種雙特異性抗體，其包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段；以及與腫瘤壞死因子α (TNFα)特異性結合之抗體或其抗原結合片段。

如本文所用，術語『雙特異性抗體』可指能夠結合兩種不同種類之抗原(標靶蛋白)的抗體。特定言之，雙特異性抗體可能不存在於自然界中，但可呈藉由基因工程或任何方法製備之形式。

本發明之雙特異性抗體可為能夠結合兩個不同標靶之抗體，且雙特異性抗體可結合OX40L及TNFα。

本發明之『雙特異性抗體』可與『雙重靶向之蛋白』、『雙重抗體』或『雙重抗體蛋白』互換使用。

作為本發明之雙特異性抗體之組分的與OX40L特異性結合之抗體或其結合片段可包括能夠與OX40L特異性結合以阻斷OX40L/OX40L訊號傳導路徑之抗體或其結合片段。在本發明之實例中，為本發明之雙特異性抗體之組分的與OX40L特異性結合之抗體或其結合片段可與上文在抗OX40L抗體或其與OX40L特異性結合之結合片段中所述之抗OX40L抗體或其結合片段實質上相同，若彼此不矛盾。另外，在本發明之實例中，為本發明之雙特異性抗體之組分的與OX40L特異性結合之抗體或其結合片段可為與OX40L特異性結合以阻斷OX40L/OX40L訊號傳導路徑之抗體，其包括在WO 2018083248、WO 2009141239、US 2017260279、WO 2006029879或WO 2011073180中描述的抗體或其結合片段。

為本發明之雙特異性抗體之組分的與OX40L特異性結合之抗體或其結合片段可與免疫細胞中過表現之OX40L特異性結合，且因此不僅可將本發明之雙特異性抗體濃縮在表現TNFα之免疫細胞上，亦結合於TNFα，由此提供降低免疫細胞本身之活性的能力。

此外，OX40L可為高層訊號之一，其可能在APC中過表現，且可與T細胞上表現之OX40受體相互作用，從而誘發免疫細胞之增殖/分化/活化且誘發各種發炎性細胞因子之分泌，從而同時活化先天性免疫及後天性免疫。抗OX40L抗體或其抗原結合片段可抑制OX40/OX40L訊號傳導，從而減少在患有自體免疫性疾病及發炎性疾病之患者中過度活化的免疫反應。

另外，抗TNFα抗體或其結合片段亦可對患有自體免疫性疾病及發炎性疾病之患者顯示作用，前述患者對發炎性反應之亞訊號TNFα的治療顯示出抗性。

如本文所用，術語『包括與OX40L特異性結合之抗體或其抗原結合片段及與TNFα特異性結合之抗體或其抗原結合片段的雙特異性抗體』可包括(但不限於)任何雙特異性蛋白，只要前述雙特異性蛋白能夠同時抑制OX40L及TNFα之兩個訊號路徑。特異性結合TNFα之抗體或其抗原結合片段構成雙特異性抗體，且特異性結合OX40L之抗體或其抗原結合片段可包括如上文在抗OX40L抗體或其結合片段中所述的全長抗體及抗體片段的兩種形式。

如本文所用，術語『抑制OX40L與OX40之間的相互作用』可意謂與本發明之OX40L特異性結合之雙特異性抗體與OX40L結合，從而抑制OX40L與OX40之間的相互作用，使得OX40L與OX40之間的相互作用藉由結合特異性抗體來抑制，且OX40L中之結構變化並非由OX40L與OX40之結合引起，藉此不可能引起水解及OX40訊號傳導。

如本文所用，術語『特異性結合TNFα之抗體』可包括任何抗體，只要前述抗體特異性結合體內廣泛範圍的作為抗原之TNFα。在本發明之實例中，特異性結合TNFα之抗體可為靶向TNFα之治療性抗體，包括(但不限於)WO 1997029131、WO 2003045400、WO 2004050683、WO 1998011917、EP 1097945、WO 2001037874、US 2006024310、WO 2006125229、WO 2007056540、WO 1994006476、WO 2000059530或WO 2001000229中描述的抗體或其結合片段。在本發明之實例中，與TNFα特異性結合之抗體可為稱為阿達木單抗(adalimumab)（商品名Humira，abbvie）之治療性抗體，其可如美國FDA、歐洲EMA及其類似機構所批准的那樣穩定使用，但不限於此。如上所述特異性結合TNFα之抗體可為IgG抗體之形式，包括(但不限於)如上所述之全長抗體及抗體片段的兩種形式。

TNFα係調節免疫細胞之細胞因子，在體內充當熱原質，藉由產生熱量來誘發細胞凋亡，且產生發炎性細胞因子，藉此引起自體免疫性疾病及發炎性疾病。TNFα主要由活化之巨噬細胞分泌，但亦由包括神經元之其他各種免疫細胞分泌。TNFα之最重要作用可為調節免疫細胞。遏制過表現之TNFα可能導致遏制自體免疫性疾病及發炎性疾病。

雙特異性抗體可與TNFα結合以遏制或抑制人TNFα與TNFα受體 (TNFα Rc)之間的相互作用。特定言之，為雙特異性抗體之組分的對TNFα具有特異性的雙特異性抗體可與TNFα結合以遏制或抑制TNFα與TNFα受體之間的相互作用，但不限於此。

為了本發明之目的，TNFα受體可包括(但不限於)任何蛋白，只要前述蛋白與哺乳動物之TNFα結合即可，但可特定地指與人TNFα結合之蛋白。

藉由根據本發明之對TNFα具特異性之雙特異性抗體或其結合片段抑制TNFα與TNFα受體之間的相互作用，可遏制由TNFα與TNFα受體的結合引起的TNFα/TNFα受體訊號傳導。在TNFα及TNFα受體在免疫系統中彼此結合之情況下，TNFα/TNFα受體訊號傳導可在免疫細胞中被活化，且因此藉由與OX40L/OX40訊號傳導路徑之作用機制不同的機制來調節免疫細胞之分化等，藉此提供用作各種自體免疫性疾病之治療劑的用途。

因此，根據本發明之對OX40L及TNFα具有特異性之雙特異性抗體可顯示出藉由不同機制遏制過度活性免疫細胞之能力，且因此可用作能夠更優異地治療自體免疫性疾病及發炎性疾病的治療劑。

因此，根據本發明之與OX40及TNFα特異性結合之雙特異性抗體或其抗原結合片段有效遏制OX40L/OX40訊號傳導及TNFα/TNFα受體訊號傳導，其可有效治療自體免疫性疾病及發炎性疾病且使治療效果最大化，同時使副作用降至最低。

在本發明之實例中，與TNFα特異性結合之抗TNFα抗體或其抗原結合片段可包括： 重鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 89表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 90表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 91表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 92表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 93表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 94表示之輕鏈CDR3。

在本發明之實例中，抗TNFα抗體或其特異性結合TNFα之抗原結合片段可包括由SEQ ID NO： 35之胺基酸序列表示的重鏈可變區及由SEQ ID NO： 36之胺基酸序列表示的輕鏈可變區，且可特定地包括Humira之可變區。

在本發明之實例中，雙特異性抗體之形式受特定限制，但可以結合片段藉由連接子與IgG形式之抗體連接的方式提供。特定言之，在本發明之雙特異性抗體的情況下，特異性結合OX40L之抗體或其抗原結合片段及特異性結合TNFα之抗體或其抗原結合片段可藉由連接子彼此連接。

在本發明之實例中，連接子可為由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32之序列表示的肽或非肽。

如本文所用，術語『連接子』基本上係指可藉由使用氫鍵、靜電相互作用、凡得瓦力、二硫鍵、鹽橋、疏水相互作用、共價鍵等將兩個不同融合搭配物(例如生物學聚合物等)彼此連接之連接子，且特定言之可具有至少一個半胱胺酸，其在生理學條件或其他標準肽條件(例如肽純化條件及肽儲存條件)下可參與至少一個二硫鍵，且除了簡單地連接每個融合搭配物之外，起在融合搭配物之間產生一定大小之間隙的作用，或充當為融合體提供可撓性或剛性的鉸鏈。連接子可為非肽連接子或肽連接子，且可包括藉由肽鍵、二硫鍵等直接連接的任一者。

在本發明中，連接子可特定為能夠將特異性結合OX40L之抗體及特異性結合TNFα之抗體彼此連接之多肽，且更特定地可為能夠將特異性結合TNFα之抗體與特異性結合OX40L之抗體的Fc區之C末端或輕鏈區之C末端連接的肽連接子，且更特定言之，可為由重複GGGGS模體形式之胺基酸序列組成的肽連接子，但不特別限於此。GGGGS模體可重複1至10次，且最特定言之，肽連接子可由其中GGGGS模體重複3次的SEQ ID NO： 31的胺基酸序列或其中GGGGS模體重複4次的SEQ ID NO： 32的胺基酸序列組成，但不限於此，且可使用熟習此項技術者容易獲得之範圍內的各種連接子。

在本發明中，術語『非肽連接子』可指其中兩個或更多個重複單元彼此鍵合且重複單元可藉由不是肽鍵的任何共價鍵彼此連接的生物相容性連接子。

本發明之非肽連接子可為可生物降解之聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸或其組合，諸如聚乙二醇(PEG)均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚。特定言之，非肽連接子可為聚乙二醇均聚物，且其在此項技術中已知的衍生物及以此項技術的技術水準容易製備之衍生物亦可包括在本發明之範疇內。

更特定言之，非肽連接子可為分子量為1至5 kDa之聚乙二醇均聚物，且最特定言之，可為能夠在兩個末端連接特異性結合OX40L之抗體及特異性結合TNFα之抗體的約為3.4 kDa且呈雙官能醛形式之連接子。特定言之，在兩端具有反應性醛基之效應子的情況下，非肽連接子可有效地使非特異性反應降至最低。

藉由連接子直接或間接連接之位點可為但不限於Fc部分、Fab'、F(ab') ₂、Fab、Fv或其類似物。雙特異性抗體可採取特異性結合OX40L之抗體的全部或一部分(片段)與特異性結合TNFα之抗體的全部或一部分(片段)連接的形式，但不特定限於此。

另外，雙特異性抗體可採取以下形式：特異性結合OX40L之蛋白的全部或一部分及特異性結合TNFα之抗體的重鏈的全部或一部分藉由肽連接子連接的形式；特異性結合OX40L之蛋白質的全部或一部分與特異性結合TNFα之抗體的輕鏈的全部或一部分藉由肽連接子連接的形式；或其組合。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可採取以下形式：其中呈免疫球蛋白G (IgG)形式之特異性結合OX40L之抗體及呈全長抗體、Fab'、F(ab') ₂、Fab、Fv、rIgG或scFv形式之特異性結合TNFα的抗體藉由連接子連接。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可採取以下形式：呈免疫球蛋白G (IgG)形式之特異性結合TNFα的抗體及呈全長抗體、Fab'、F(ab') ₂、Fab、Fv、rIgG或scFv形式之特異性結合OX40L之抗體藉由連接子連接，但不限於此。

如本文所用，術語『結合片段』可包括抗體之抗原結合形式，包括具有抗原結合能力之片段，例如Fab'、F(ab') ₂、Fab、Fv、rIgG及scFv。特定言之，前述術語可包括單鏈可變片段(scFv)，且可包括二價或雙價抗體、三價抗體及四價抗體。

如本文所用，術語『單鏈可變片段(scFv)』可指具有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段，且包括抗體之VH及VL結構域，其中結構域可存在於單個多肽鏈中。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中抗TNFα抗體或其特異性結合TNFα之抗原結合片段連接至抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個末端。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為其中抗TNFα抗體或其抗原結合片段與抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接的抗體。特定言之，在雙特異性抗體之情況下，抗TNFα抗體或其抗原結合片段可藉由連接子與抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接。舉例而言，在雙特異性抗體之情況下，抗TNFα抗體或其抗原結合片段可藉由具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子連接至抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端，但不特定限於此。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為其中抗OX40L抗體或其特異性結合OX40L之抗原結合片段與抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個末端連接的抗體。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為其中抗OX40L抗體或其抗原結合片段與抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接的抗體。特定言之，雙特異性抗體可為其中抗OX40L抗體或其抗原結合片段藉由連接子與抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接的抗體。舉例而言，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可藉由具有由SEQ ID NO： 31表示之胺基酸序列的連接子與抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接，但不特定限於此。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中特異性結合OX40L之抗OX40L抗體的結合片段及抗TNFα抗體之結合片段藉由連接子連接。連接子可為具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中以下藉由連接子彼此連接： a) 抗OX40L抗體或其與OX40L特異性結合之結合片段，包括：重鏈可變區，其包括由選自SEQ ID NO： 12、13及14組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 15、16、17及18組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 19、20、21及22組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包括由選自SEQ ID NO： 23及24組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 25及26組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 27、28、29及30組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR3；及 b) 抗TNFα抗體或其與TNFα特異性結合的結合片段，包括：重鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 89表示之胺基酸序列的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 90表示之胺基酸序列的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 91表示之胺基酸序列的重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 92表示之胺基酸序列的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 93表示之胺基酸序列的輕鏈CDR2；由SEQ ID NO： 94表示之胺基酸序列的輕鏈CDR3。

連接子可為具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中以下藉由連接子彼此連接： a) (i) 抗OX40L抗體或其結合片段，包括：重鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 12表示的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 15表示的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 19表示的重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 23表示的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 25表示的輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 27表示的輕鏈CDR3； (ii) 抗OX40L抗體或其抗原結合片段，包括：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3； (iii) 抗OX40L抗體或其抗原結合片段，包括：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 17表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 21表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 29表示之輕鏈CDR3；或 (iv) 抗OX40L抗體或其抗原結合片段，包括：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 14表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 18表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 22表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 30表示之輕鏈CDR3；及 b) 抗TNFα抗體或其與TNFα特異性結合的結合片段，包括：重鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 89表示之胺基酸序列的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 90表示之胺基酸序列的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 91表示之胺基酸序列的重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包括由SEQ ID NO： 92表示之胺基酸序列的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 93表示之胺基酸序列的輕鏈CDR2；由SEQ ID NO： 94表示之胺基酸序列的輕鏈CDR3。

連接子可為具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中以下經連接子彼此連接： a) 抗OX40L抗體或其結合片段，包括：由選自SEQ ID NO： 33、37、41、45、49及53組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及由選自SEQ ID NO： 34、38、42、46、50及54組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈可變區；及 b) 抗TNFα抗體或其抗原結合片段，包括由SEQ ID NO： 35表示的重鏈可變區及由SEQ ID NO： 36表示的輕鏈可變區。

連接子可為具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可為如下抗體，其中以下經連接子彼此連接： a) 抗OX40L抗體或其結合片段，包括：(a) 由SEQ ID NO： 37表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 38表示之輕鏈可變區；(b) 由SEQ ID NO： 41表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 42表示之輕鏈可變區；(c) 由SEQ ID NO： 45表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 46表示之輕鏈可變區；(d) 由SEQ ID NO： 49表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 50表示之輕鏈可變區；(e) 由SEQ ID NO： 53表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 54表示之輕鏈可變區；或(f) 具有由SEQ ID NO： 33表示的胺基酸序列的重鏈可變區及具有由SEQ ID NO： 34表示的胺基酸序列的輕鏈可變區，以及 b) 抗TNFα抗體或其抗原結合片段，包括由SEQ ID NO： 35表示的重鏈可變區及由SEQ ID NO： 36表示的輕鏈可變區。

連接子可為具有由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示之胺基酸序列的連接子。

舉例而言，雙特異性抗體之結構可具有如圖1所示的相同形式之結構。

作為另一實例，雙特異性抗體可具有其中抗OX40L抗體之抗原結合片段及抗TNFα抗體之抗原結合片段彼此連接之結構。

在本發明之雙特異性抗體包括恆定區之情況下，雙特異性抗體可特定地包括(但不限於)由選自SEQ ID NO： 5、6、7及8組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈恆定區；及由SEQ ID NO： 10之胺基酸序列表示之輕鏈恆定區的全部或一部分。在雙特異性抗體包括恆定區之情況下，意謂構成雙特異性抗體的抗OX40L抗體或其特異性結合OX40L之結合片段或抗TNFα抗體或其特異性結合TNFα之結合片段包括恆定區之全部或一部分。

本發明的雙特異性抗體可以具有足以在人體中展現足夠作用的物理化學性質，且可具有優異的熱穩定性。舉例而言，雙特異性抗體可在高於50℃(尤其59℃或更高)之溫度下熔融，且可長時間保持其結合，且在人體中可具有約2週或更長的半衰期。

換言之，根據本發明的包括特異性結合TNFα之抗體或其抗原結合片段及特異性結合OX40之抗體或其抗原結合片段的雙特異性抗體可具有針對人源TNFα及OX40L之強親和力，從而有效抑制表現OX40L之細胞(例如免疫細胞)與OX40之結合，且藉由TNFα與TNF受體結合抑制發炎性反應，藉此在諸如自體免疫性疾病之疾病的治療中提供更顯著的治療效果。

在本發明之雙特異性抗體中，特異性結合TNFα之抗體或其抗原結合片段及特異性結合OX40L之抗體或其抗原結合片段可分別維持特異性結合，且特定言之，可同時遏制兩個標靶(抗原)而不會降低對每個標靶之親和力，從而同時遏制兩個訊號，且因此比藉由結合單個標靶進行遏制更有效。

在本發明之實例中，藉由將編碼本發明之雙特異性抗體的核酸(聚核苷酸)插入載體且將其引入動物細胞中以表現及分離結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，製備特異性結合OX40L及TNFα的OX40L及TNFα雙特異性抗體。

雙特異性抗體分子可具有其中OX40L IgG抗體分子及結合TNFα之scFv藉由連接子連接之結構或其中TNFα IgG抗體分子及結合OX40L之scFv藉由連接子連接的結構(圖1)。將引入至動物細胞中且在其中表現之結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體分離，且藉由SDS-PAGE確認其表現及純度(圖2)。

另外，由於藉由酶聯免疫吸附分析法(ELISA)分析針對OX40L及TNFα之雙特異性抗體對OX40L及TNFα的結合分析法，確認結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體與OX40L及TNFα特異性結合，OX40L及TNFα為前述雙特異性抗體之標靶(表32)。

在本發明之實例中，雙特異性抗體可以3 × 10 ^-9M或更低之K _D結合人OX40L。特定言之，抗OX40L抗體或其抗原結合片段可1.5 × 10 ^-9M、1.3 × 10 ^-9M，或1 × 10 ^-9M或更低之K _D結合，且可以1 × 10 ^-9M或更低之K _D結合人TNFα。特定言之，由於藉由Biacore分析法量測作為雙特異性抗體之抗原的OX40L及TNFα之平衡解離常數(K _D)值，確認雙特異性抗體對人OX40L之K _D值為0.4至0.5 nM且對人TNFα之K _D值為0.2至0.5 nM (表32，圖4)。另外，確認活體外OX40L抑制能力為0.2至1.3 nM，且顯著優於對照抗體，且活體外TNFα抑制能力為0.05至0.07 nM，且是優異的(表35，圖5)。另外，雙特異性抗體顯示阻斷T細胞中免疫活性之結果(圖6)。

因此，本發明之雙特異性抗體可藉由同時結合OX40L及TNFα，同時保持對各抗原之結合力來有效治療與標靶有關的疾病。

另外，對於能夠同時結合OX40L及TNFα的本發明之雙特異性抗體，藉由對活體外封鎖分析法進行實驗證實，用前述雙特異性抗體治療，藉由使免疫細胞與OX40L及人OX40結合以及TNFα與TNFα受體結合，有效遏制了每一訊號傳導路徑(表35及圖5)。此等結果顯示本發明之對OX40L及TNFα具有特異性的雙特異性抗體有效地阻斷作為對應受體之OX40及TNFα受體的結合，從而提供減輕免疫系統過度活躍之效果，且亦同時結合OX40L及TNFα從而有效地治療與標靶相關之疾病。

本發明可提供編碼與OX40L及TNFα特異性結合之雙特異性抗體的核酸(聚核苷酸)、包括前述核酸(聚核苷酸)之表現載體，以及其中引入前述表現載體之轉型體。

在本發明中，當彼此不矛盾時，與特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體相關的核酸(聚核苷酸)、表現載體、轉型體及引入與上文所述相同。

本發明可提供製備特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的方法。

特定言之，前述製備方法可提供與OX40L及TNFα雙特異性結合之抗體，前述方法包括以下步驟：(a)藉由培養其中引入有表現載體之轉型體產生雙特異性抗體，前述表現載體包括編碼與OX40L及TNFα特異性結合之雙特異性抗體的核酸(聚核苷酸)；及(b)回收上述步驟(a)中產生的雙特異性抗體。

當彼此不矛盾時，用於製備本發明之特異性結合OX40L及TNFα的雙特異性抗體的方法可與抗OX40L抗體或其抗原結合片段中所描述之製備方法實質上相同。

本發明可提供用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之醫藥組合物，包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或特異性結合OX40L及TNFα的雙特異性抗體。

前述醫藥組合物可進一步包括醫藥上可接受之載劑。

如本文所用，術語『醫藥上可接受之載劑』可指既不刺激生物體亦不抑制注射化合物之生物學活性及特性的載劑或稀釋劑。在調配成液體溶液之組合物中，所使用之醫藥上可接受之載劑可包括適於滅菌及活體的生理鹽水溶液、無菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩衝生理鹽水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇，及其至少一種組分之混合物，且需要時可向其中添加其他習知添加劑，諸如抗氧化劑、緩衝劑溶液、抑菌劑等。同樣，可以向其中另外添加稀釋劑、分散劑、界面活性劑、黏合劑及潤滑劑的方式將此類醫藥組合物調配成可注射劑型，諸如水溶液、懸浮液、乳液等、丸劑、膠囊、顆粒劑或錠劑。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體可與OX40L結合，從而抑制與OX40L受體之結合，且因此可參與遏制過度活躍之免疫細胞。OX40L/OX40受體與上文所述相同。

此外，雙特異性抗體除了結合OX40L之外可結合TNFα，抑制TNFα與TNFα受體之間的相互作用，藉此經與OX40L/OX40訊號傳導路徑之作用機制不同之機制調節免疫細胞之分化等，且亦可參與遏制各種自體免疫性疾病。

因此，本發明之醫藥組合物可顯著且有效地預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病，且可在使副作用降至最低的同時提高安全性。

在本發明中，自體免疫性疾病或發炎性疾病可包括類風濕性關節炎。類風濕性關節炎可分類為發炎性疾病或自體免疫性疾病之疾病。如本文所用，術語『自體免疫性疾病』、『發炎性疾病』或『自體免疫性疾病及發炎性疾病』可包括類風濕性關節炎。

如本文所用，術語『預防』可指遏制或延遲疾病發生，且遏制或延遲疾病已被治療之個體中疾病的復發。

如本文所用，術語『治療』可指藉由投與前述組合物使自體免疫性疾病的症狀變好或好轉的所有行為。

本發明可提供一種藉由使用抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的方法。

本發明可提供一種藉由使用包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的醫藥組合物預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的方法。

預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的方法可包括將抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體投與個體之步驟。

預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的方法可包括將包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的醫藥組合物投與個體之步驟。

該個體可為已經發展或懷疑正在發展自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體，且特定言之，可包括(但不特定)限於哺乳動物、鳥類等，諸如牛、豬、綿羊、雞、犬、人等。

醫藥組合物可為各種口服或非經腸劑型。在調配調配物之情況下，可藉由使用通常使用之稀釋劑或賦形劑，諸如填充劑、增量劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、界面活性劑等來製備調配物。用於口服投與之固體調配物可包括錠劑、丸劑、粉末、顆粒劑、膠囊等，且此固體調配物可藉由在至少一種化合物中混合至少一種賦形劑來製備，例如澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等。另外，除簡單的賦形劑外，亦可使用潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、滑石粉等。用於口服投與的液體調配物可包括懸浮液、內部使用之液體、乳液、糖漿等，但除了水及液體石蠟之外，亦可包括各種賦形劑，例如保濕劑、甜味劑、調味劑、防腐劑等，其為常用之簡單稀釋劑。非經腸投與之調配物可包括無菌水溶液、非水溶劑、懸浮液、乳液、凍乾調配物及栓劑。非水溶劑及懸浮劑可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、可注射酯(如油酸乙酯等)。栓劑的基質可包括Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂油、甘油明膠等。

醫藥組合物可具有選自由以下組成之群的任一種調配物：錠劑，丸劑、粉末、顆粒劑、膠囊、懸浮液、內用液體、乳液、糖漿、無菌溶液、非水溶劑、助懸劑、凍乾調配物及栓劑。

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，或醫藥組合物可以醫藥上有效量投與。如本文所用，術語『醫藥上有效量』可指足以以適用於醫學治療之合理的利益/風險比來治療疾病的量，且可根據包括以下之因素來確定有效劑量水準：個體類型、嚴重程度、年齡、性別、癌症類型、藥物活性、對藥物之敏感性、投與時間、投與途徑及排泄率、治療時間及同時使用之藥物，以及在醫療領域眾所周知的其他因素。本發明之組合物可作為個別治療劑投與或與其他治療劑組合投與，且可與習知治療劑依序或同時投與。且該組合物可以單一方式或多種方式投與。考慮到所有上述因素，重要的是以一定量進行投與，其中可藉由最小量獲得最大效果而不具有副作用，且該量可由熟習此項技術者確定。

在此情況下，可以醫藥上有效量以單一方式或多種方式投與組合物。在此情況下，組合物可以液體、粉末、氣霧劑、膠囊、腸溶包衣錠劑或膠囊或栓劑的形式投與。投與途徑可包括但不限於腹膜內投與、靜脈內投與、肌肉內投與、皮下投與、內皮投與、口服投與、局部投與、鼻內投與、肺內投與、直腸投與等。然而，口服時，肽被消化。因此，在口服組合物之情況下，需要對其活性劑進行包衣或調配以防止其在胃中降解。另外，可藉由能夠將活性物質移動至標靶細胞的任何裝置來投與醫藥組合物。

此外，本發明可提供抗OX40L抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體之用途，其用於製造用以預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的藥物。

本發明可提供包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體之醫藥組合物的用途，其用於製備用以預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病的藥物。

本發明可提供抗OX40L抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體之用途，其用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病。

本發明可提供包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段或雙特異性抗體之醫藥組合物的用途，其用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體、醫藥組合物、自體免疫性疾病或發炎性疾病、預防或治療可與上述相同，只要彼此不矛盾。

本發明可提供一種診斷組合物，其包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，且藉由抗原-抗體反應在自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體分離的生物樣品中偵測OX40L蛋白。

在本發明之實例中，診斷組合物可診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之發生。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體、自體免疫性疾病及發炎性疾病可與上述相同，只要彼此不矛盾。

如本文所用，術語『診斷』可指識別病理狀況之存在或特性。為了本發明之目的，診斷是確認是否已發生自體免疫性疾病或發炎性疾病。

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段或診斷組合物可用於藉由根據本發明之抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體量測自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體中分離出的樣品中的OX40L蛋白含量，且將所量測之OX40L蛋白含量與正常人或患者之對照樣品進行比較來確定自體免疫性疾病或發炎性疾病。

為此目的，量測蛋白質含量之方法可包括但不限於蛋白質印跡法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(otA：badioimmunoassay)、放射免疫擴散(badioimmunodiffusion)、雙向免疫擴散(Ouchterlony immunodiiffusion)、火箭免疫電泳、免疫組織化學染色、免疫沉澱分析法、補體固定分析法、FACS及蛋白質晶片等。藉由上述分析方法，可將懷疑患有自體免疫性疾病之個體中的OX40L蛋白含量與正常對照組的含量進行比較，藉此診斷出疑似患者中自體免疫性疾病之發生。

根據本發明，用於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之組合物除了本發明之抗體之外，亦可包括(但不限於)此項技術已知的用於執行量測蛋白含量之方法所必需的那些。

在本發明之診斷組合物包括特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的情況下，診斷組合物可為用於藉由抗原-抗體反應偵測自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體中分離出的生物樣品中的TNFα蛋白的組合物。特定言之，在本發明之診斷組合物包括特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的情況下，診斷組合物可為用於藉由抗原-抗體反應偵測自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體分離出的生物樣品中的OX40L蛋白及TNFα蛋白中的至少一種的組合物。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體，或診斷組合物可用於藉由量測自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體分離出的樣品中OX40L蛋白及TNFα蛋白的至少一種含量來確定自體免疫性疾病或發炎性疾病。

用於量測蛋白質含量之方法可與上述相同，只要彼此不矛盾。

本發明可提供藉由使用抗OX40L抗體或其抗原結合片段、特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體或包括其之診斷組合物來診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法或提供診斷資訊之方法。特定言之，本發明可提供診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法或提供有關診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的方法，前述方法包括以下步驟：(a)藉由使用抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體量測自懷疑患有自體免疫性疾病或發炎性疾病之個體分離之樣品中OX40L蛋白的含量；及(b)藉由使用在上述步驟(a)中量測之OX40L蛋白之含量來確定自體免疫性疾病或發炎性疾病。

舉例而言，藉由使用所量測之OX40L蛋白含量測定自體免疫性疾病或發炎性疾病之步驟可藉由將所量測之OX40L蛋白含量與正常人及/或患者之含量比較。

本發明可提供診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法或提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的方法，前述方法包括以下步驟：(a)藉由使用特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體自懷疑患有自體免疫性疾病之個體分離出的樣品中的OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者之含量；及(b)藉由使用在上述步驟(a)中量測之OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者之含量來確定自體免疫性疾病或發炎性疾病。

舉例而言，藉由使用OX40L蛋白及TNFα蛋白中之至少一者之量測含量確定自體免疫性疾病或發炎性疾病之步驟可藉由將OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者之所量測含量與正常人及/或患者中OX40L蛋白及TNFα蛋白中至少一者之含量比較來進行。

本發明可提供用於提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的套組，包括抗OX40L抗體或其抗原結合片段，或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體。

抗OX40L抗體或其抗原結合片段或特異性結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體、自體免疫性疾病、發炎性疾病、個體、診斷及蛋白含量之量測步驟(方法)可與上述相同，只要彼此不矛盾。

如本文所用，術語『樣品』可包括(但不限於)諸如全血、血清、血液、血漿、唾液、尿液、痰、淋巴液、腦脊髓液及細胞間液之樣品，其在患有自體免疫性疾病之患者中的OX40L表現水準中顯示出差異。 [有利作用]

根據本發明，抗OX40L抗體或其抗原結合片段與OX40L特異性結合，從而有效地抑制受體之結合，且亦具有優異之免疫抑制能力，藉此提供針對自體免疫性疾病及發炎性疾病之治療及診斷領域的顯著優異效果。

此外，與上述OX40L及TNFα特異性結合之雙特異性抗體不僅對OX40L顯示出強親和力，而且對TNFα亦顯示出強親和力，在體內長時間保持結合，且因此免疫抑制能力優異，藉此顯示出針對自體免疫性疾病及發炎性疾病之治療及診斷領域的顯著優異效果。

在下文中，將參考實例描述本發明。然而，僅出於說明本發明之目的提供以下例示性實施例，且因此本發明不限於此。 [實例1：OX40L特異性抗體純系之選擇] [實例1-1：OX40L抗原之製備]

藉由獲得由Acro Biosystems提供之人OX40L蛋白(Cat# OXL-H52Q8)來使用人OX40L之抗原，其藉由使用暴露於細胞外之結構域將組胺酸標籤融合至登錄號NP_003317之人OX40L之胺基酸序列(SEQ ID NO： 1)的胺基酸序列第51號至第183號(Q51至L183)之N端製備。

上文由Acro Biosystems提供之人OX04L蛋白(抗原)的胺基酸序列在SEQ ID NO： 2中指定。上文提供之抗原在HEK293細胞中產生且大小為16.9 kDa。 [表2] OX40L抗原蛋白

類型	SEQ ID NO ：	序列
OX40L抗原蛋白 (OX40L)	1	MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASV IQGLGLLLCF TYICLHFSAL QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF CVL
OX40L抗原蛋白 (OX40L-his)	2	HHHHHH QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF CVL

[實例1-2：人基因庫噬菌體之製備]

在37℃下在2X YT-葡萄糖-Mgcl2-氯黴素(CM)培養基中培養具有多樣性之7.5 * 10 ¹⁰個人來源之scFv基因庫細胞，直至培養液的吸光度變為OD ₆₀₀=0.5-0.7。

用輔助噬菌體感染細胞，且在37℃下培養約1小時。將培養之細胞離心(5000 rpm，4℃，10分鐘)後，添加2xYT-IPTG-Mgcl ₂-卡那黴素(KM)-CM培養基，且將細胞重新混合且在30℃振盪培育器中培養16小時。將培養之細胞離心(5000 rpm，4℃，10分鐘)，隨後添加4% PEG (Sigma，81253)及3% NaCl (Junsei，1905-0350)且充分溶解於上清液中，且在冰中反應約1小時。再次離心(7500 rpm，4℃，30分鐘)後，將DPBS (Wellgene，LB001-02)添加至離心塊中，溶解且離心(10000 rpm，4℃，10分鐘)，從而獲得含有基因庫噬菌體之上清液，隨後置入新試管中且在5±3℃下儲存。 [實例1-3：免疫基因庫噬菌體之製備]

藉由使用Balb/C小鼠及SD大鼠以及實例1-1的人OX40L抗原(SEQ ID NO： 2)製備免疫基因庫噬菌體。

使十隻Balb/C小鼠(七週大)及四隻雄性SD大鼠(八週大)適應環境，且隨後在第0、21、42及63天用人OX40L抗原免疫，隨後在第84天自其摘除脾臟。藉由使用溶離之RNA合成cDNA，且擴增重鏈可變區及輕鏈可變區。將重鏈可變區及輕鏈可變區混合以scFv形式擴增DNA，隨後將DNA插入噬菌體載體(pYG100)中以製備大鼠來源之免疫scFv基因庫細胞。將所製備之細胞在37℃下在2X YT-葡萄糖-Mgcl2-氯黴素(CM)培養基中培養，直至培養液之吸光度變為OD ₆₀₀=0.5-0.7。

用輔助噬菌體感染培養之細胞，且在37℃下培養約1小時。在將培養之細胞離心(5000 rpm，4℃，10分鐘)後，添加2xYT-IPTG-Mgcl ₂-卡那黴素(KM)-CM培養基，且將細胞重新混合且在30℃振盪培育器中培養16小時。將培養之細胞離心(5000 rpm，4℃，10分鐘)，隨後添加4% PEG (Sigma，81253)及3% NaCl (Junsei，1905-0350)且充分溶解於上清液中，且在冰中反應約1小時。再次離心(7500 rpm，4℃，30分鐘)後，將DPBS (Wellgene，LB001-02)添加至離心塊中且溶解，隨後離心(10000 rpm，4℃，10分鐘)，獲得含有基因庫噬菌體之上清液，隨後置入新試管中且在5±3℃下儲存。 [實例1-4：藉由噬菌體展現淘選]

為了篩選與人OX40L結合之OX40L抗體，將含有實例1-1之人OX40L蛋白的溶液以1至10 μg/mL的濃度添加至免疫試管中，以使OX40L蛋白在5±3℃下吸附至免疫試管之表面上過夜，隨後向試管中添加1%牛血清白蛋白溶液以保護未吸附OX40L之表面。排空試管後，將分散在1%牛血清白蛋白溶液中之10 ¹²CFU人抗體噬菌體基因庫(實例1-2)或免疫噬菌體基因庫(實例1-3)置入試管中且與抗原結合。非特異性結合之噬菌體用PBS-T (磷酸鹽緩衝生理鹽水-0.05% Tween 20)溶液洗滌5至20次，且再用DPBS洗滌1至5次，從而藉由使用0.1 M TAE溶液回收剩餘之抗原特異性噬菌體抗體。

用1M Tris緩衝液(pH 7.5)中和所回收之噬菌體，且在37℃下用XL1Blue 大腸桿菌感染1小時，隨後藉由使用玻璃珠將感染之大腸桿菌塗抹在SOBCG板上且在37℃培育器中培養約16小時。第二天，將培養之大腸桿菌懸浮在4 ml超級肉湯(SB)-羧苄青黴素培養液中，隨後添加15%甘油，從而將其一部分儲存在-80℃下且50 μl殘餘物在37℃下培養，向20 ml SB-羧苄青黴素培養液中添加2%葡萄糖溶液。當培養液在600 nm處的吸光度達到0.6時，藉由離心移除培養液，且將其再次懸浮在20 µl SB-羧苄青黴素培養液中，隨後添加10 ¹²PFU的M13輔助噬菌體，緩慢攪拌且在37℃下培育。第二天，將培養液離心，隨後僅取出培養液，且添加聚乙二醇及氯化鈉(NaCl)，使所得溶液在4℃下沉澱30分鐘且離心。移除上清液，且將沉澱之噬菌體懸浮在1 ml PBS中，隨後將所得懸浮液用作基因庫，重複上述淘選過程3至5次，由此擴增/濃縮抗原特異性純系。 [實例1-5：噬菌體淘選後篩選特異性純系]

為了篩選與人OX40L蛋白結合之抗體(scFv)，使用以下兩種方法之一篩選抗原特異性純系。

首先，淘洗後，藉由在瓊脂培養基上塗片培養物獲得單個菌落，且接種至1至1.5 mL培養液中且培養，隨後用IPTG誘導在大腸桿菌中表現scFv型蛋白。離心大腸桿菌培養液以獲得上清液，隨後將上清液用於藉由ELISA技術來確認重組人OX40L抗原與scFv之結合(Steinberger. Rader及Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. 第11.9頁-第11.12頁)。藉由使用辣根過氧化物酶(HRP)-抗-His抗體及四甲基聯苯胺(TMB)受質偵測結合的scFv。

其次，淘洗後，自SOBCG板獲得單個噬菌體，接種至分別分配有1 mL培養基之深孔板中，且在37℃振盪下培養16小時。將擴增之細胞稀釋10倍，再次接種在深孔板中，且在37℃之振盪培育器中培養直至OD ₆₀₀為0.5。在OD ₆₀₀達到0.5時，將M13輔助噬菌體以10 ⁹CFU含量鋪設，且在37℃靜態培育器中感染30分鐘，且在37℃振盪培育器中感染30分鐘。感染完成後，藉由離心沉澱細胞且獲得上清液，以藉由使用ELISA技術確認scFv與人OX40L抗原之結合。藉由使用辣根過氧化物酶(HRP)-抗-M13抗體及四甲基聯苯胺(TMB)受質偵測結合之scFv。

藉由測序技術分析自以上鑑別之抗原特異性抗體(scFv)純系。 [實例2：抗OX40L抗體之製備]

基於在以上實例1-5中獲得之抗體的可變區(scFv)的序列，重鏈可變區連接至重鏈恆定區(SEQ ID NO： 8)，且輕鏈可變區連接至輕鏈恆定區(SEQ ID NO： 10)，從而製得抗體。抗體命名為02C09、Hu3F07、10H07、21G07及I3F07。 [表3] 重鏈及輕鏈恆定區

恆定區
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 8)	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
輕鏈 (SEQ ID NO： 10)	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 9)	GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
輕鏈 (SEQ ID NO： 11)	CGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

[(1) 抗OX40L抗體02C09]

02C09抗體包括由SEQ ID NO： 12表示的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 15表示的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 19表示的重鏈CDR3；由SEQ ID NO： 23表示的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 25表示的輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 27表示的輕鏈CDR3。

抗OX40L抗體02C09藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備。

使用PEI (一種增強細胞內基因轉移效率的聚合物)用含有編碼抗OX40L抗體02C09之基因的表現載體轉染的漂浮FreeStyle™ 293-F動物細胞以每瓶200 mL在500 mL培養物錐形瓶(Corning)中培養且必要時進行大量培養。

將轉染之FreeStyle™ 293-F細胞在37℃及8% CO ₂之條件下在懸浮液中培養，且使用FreeStyle™ 293表現培養基AGT™ (Invitrogen，AG1000D9P1)培養前述培養基。在過表現時，將500 μg PEI (Polysciences，23966-2)及125 μg待過表現之DNA在5 mL培養基中混合。添加DNA-PEI後約24小時，添加10 mL 10%大豆蛋白(BD，212488)且進一步培養約5天，接著僅獲得上清液且用於純化抗體。

為了純化抗體，首先藉由使用重組Protein-A Sepharose層析管柱自培養液純化抗體。若需要提高純度，則使用第一純化產物進行第二純化。在此情況下，藉由使用Superdex200凝膠過濾層析法或羥基磷灰石層析法進行純化。 [表4] 02C09抗體之CDR序列

類型	編號.	序列	類型	編號.	序列
重鏈	CDR1	12	YAWMS	輕鏈	CDR1	23	RASQSIGRWLA
CDR2	15	RIKGEPDGGTTEYADSVKG	CDR2	25	KATILES
CDR3	19	RRGLDV	CDR3	27	QQYNSYPYT

[表5] 02C09抗體之可變區序列

02C09
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 37)	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFN YAWMSWVRQAPGKGLEWVG RIKGEPDGGTTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVS RRGLDVWGQGTTVTVSS
輕鏈 (SEQ ID NO： 38)	DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITC RASQSIGRWLAWYQQKPGNAPKLLIY KATILESGVPSRFSGSGSGTEFALTISSLQPDDFSAYYC QQYNSYPYTFGQGTKLEIK
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 39)	CAAATGCAGCTTGTTCAATCCGGCGGAGGCCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGAGTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAATTACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGGAAGAATCAAGGGCGAGCCTGATGGCGGAACCACAGAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGTGTCTAGAAGAGGCCTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACAGTTTCTTCT
輕鏈 (SEQ ID NO： 40)	GATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGGGCCAGCCAGTCTATTGGACGGTGGCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCTGGAAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGCCACCATCCTGGAAAGCGGAGTGCCTTCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTTGCCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCAGCGCCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG

[(2) 抗OX40L抗體Hu3F07]

Hu3F07抗體包括由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備抗OX40L抗體Hu3F07。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行特定的培養條件、培養方法及純化方法。 [表6] Hu3F07抗體之CDR序列

Hu3F07	編號.	序列	Hu3F07	編號.	序列
重鏈	CDR1	13	DYWMH	輕鏈	CDR1	24	RSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2	16	EIDPPNGRTNYNEKFKS	CDR2	26	KVSNRFS
CDR3	20	GIYYVDY	CDR3	28	SQSTHVPPT

[表7] Hu3F07抗體之可變區序列

Hu3F07
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 41)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFP DYWMHWVRQAPGQGLEWMG EIDPPNGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR GIYYVDYWGQGTTVTVSS
輕鏈 (SEQ ID NO： 42)	DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPPTFGGGTKLEIK
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 43)	CAAGTTCAACTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTTCACATTCCCCGACTACTGGATGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTAGCTCT
輕鏈 (SEQ ID NO： 44)	GATATCGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGAGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG

[(3) 抗OX40L抗體10H07]

10H07抗體包括由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 17表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 21表示之重鏈CDR3；由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 29表示之輕鏈CDR3。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備抗OX40L抗體10H07。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表8] 10H07抗體之CDR序列

10H07	編號	序列	10H07	編號	序列
重鏈	CDR1	13	DYWMH	輕鏈	CDR1	24	RSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2	17	EIDPGNGRTNYNEKFKN	CDR2	26	KVSNRFS
CDR3	21	EGAGRGFPY	CDR3	29	SQSTHVPWT

[表9] 10H07抗體之可變區序列

10H07
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 45)	QVYLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT DYWMHWVKQRPGQGLEWIG EIDPGNGRTNYNEKFKNKATLSVDKSSNTAYMQFSSLTSEDSAVFYCAS EGAGRGFPYWGQGTLVTVSA
輕鏈 (SEQ ID NO： 46)	DVVLTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPWTFGGGTKLEIK
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 47)	CAGGTTTATCTACAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTGATCCTGGCAACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACACTGAGTGTAGACAAATCCTCCAATACAGCCTACATGCAATTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTACTGTGCAAGCGAGGGAGCTGGACGTGGATTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCCGCA
輕鏈 (SEQ ID NO： 48)	GATGTTGTGCTGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

[(4) 抗OX40L抗體21G07]

21G07抗體包括由SEQ ID NO： 14表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 18表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 22表示之重鏈CDR3；由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 30表示之輕鏈CDR3。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備抗OX40L抗體21G07。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同的方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表10] 21G07抗體之CDR序列

21G07	編號.	序列	21G07	編號.	序列
重鏈	CDR1	14	NYWMQ	輕鏈	CDR1	24	RSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2	18	EIDPSDGRTNYNEKFKN	CDR2	26	KVSNRFS
CDR3	22	EVSLRSMDY	CDR3	30	SQSTHVPFT

[表11] 21G07抗體之可變區序列

21G07
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 49)	QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT NYWMQWVKQRPGQGLEWIG EIDPSDGRTNYNEKFKNKATLTVDRSSSTAYIKLSSLTSEDSAVYYCAR EVSLRSMDYWGQGTSVTVSS
輕鏈 (SEQ ID NO： 50)	DIVLTQSPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPFTFGSGTKLEIK
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 51)	CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCAATGGGTGAAACAGAGGCCCGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTGATCCTAGCGACGGTCGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATAAAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGTTTCACTACGGTCAATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
輕鏈 (SEQ ID NO： 52)	GACATTGTTCTCACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA

[(5) 抗OX40L抗體I3F07]

I3F07抗體包括由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備抗OX40L抗體I3F07。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同的方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表12] I3F07抗體之CDR序列

I3F07	編號.	序列	I3F07	編號.	序列
重鏈	CDR1	13	DYWMH	輕鏈	CDR1	24	RSSQSLVHSNGNTYLH
CDR2	16	EIDPPNGRTNYNEKFKS	CDR2	26	KVSNRFS
CDR3	20	GIYYVDY	CDR3	28	SQSTHVPPT

[表13] I3F07抗體之可變區序列

I3F07
胺基酸 序列	重鏈 (SEQ ID NO： 53)	QIQLAQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFP DYWMHWVKQRPGQGLEWIG EIDPPNGRTNYNEKFKSKATLTVDSSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCAR GIYYVDYWGQGTTLTVSS
輕鏈 (SEQ ID NO： 54)	DIVLTQSPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPPTFGGGSKLEIK
核酸 (DNA)序列	重鏈 (SEQ ID NO： 55)	CAGATTCAGCTGGCTCAGTCTGGCGCCGAACTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCACCTTTCCTGACTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACAGCAGCAGCAATACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGACTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTTTCTTCT
輕鏈 (SEQ ID NO： 56)	GATATCGTGCTGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTTTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGATCCTCTCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTTCTCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAAGCAAGCTGGAAATCAAG

[實例3：靶向OX40L及TNFα之雙特異性抗體之製備]

藉由將實例2中製備的與人OX40L (02C09、Hu3F07、I3FO7)或其片段(scFv)結合之抗體與抗TNFα抗體(TNFαi抗體(Humira))或其片段(scFv)經連接子連接來製備能夠甚至與人TNFα結合之特異性抗體(參見圖1)。

特定言之，製備以下形式之雙特異性抗體：(i)在抗OX40L抗體之重鏈恆定區的C末端處經連接子連接抗TNFα抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區；(ii)經連接子在抗OX40L抗體之輕鏈恆定區的C-末端連接抗TNFα抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區；(iii)經連接子在抗TNFα抗體的重鏈恆定區的C-末端連接抗OX40L抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區；及(iv)經連接子在抗TNFα抗體的輕鏈恆定區的C末端連接抗OX40L抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區，且按IgG-scFv結合位點的順序分別命名為02C09-TNFαi HC、02C09-TNFαi LC、hu3F07-TNFαi HC、hu3F07-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC、TNFαi-02C09 LC、TNFαi-hu3F07 HC、TNFαi-hu3F07 LC、I3F07-TNFαi HC、I3F07-TNFαi LC、TNFαi-I3F07 HC及TNFαi-I3F07 LC。

所用連接子為由SEQ ID NO： 31表示之GGGGSGGGGSGGGGS。 [表14]抗TNFα抗體之CDR

抗TNFα抗體	編號.	序列	抗TNFα抗體	編號.	序列
重鏈	CDR1	89	DYAMH	輕鏈	CDR1	92	RASQGIRNYLA
CDR2	90	AITWNSGHIDYADSVEG	CDR2	93	AASTLQS
CDR3	91	VSYLSTASSLDY	CDR3	94	QRYNRAPYT

[表15] 抗TNFα抗體之可變區序列

抗TNFα抗體
重鏈 (SEQ ID NO： 35)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD DYAMHWVRQAPGKGLEWVS AITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS
輕鏈 (SEQ ID NO： 36)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIY AASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QRYNRAPYTFGQGTKVEIK

藉由與上文實例2之抗OX40L抗體的製造(製備)方法實質上相同的方法，以使TNFα抗體的重鏈可變區與重鏈恆定區(SEQ ID NO： 8)連接，且輕鏈可變區與輕鏈恆定區(SEQ ID NO： 10)連接的方式製備TNFαi抗體。 [(1) 雙特異性抗體02C09-TNFαi HC]

在雙特異性抗體02C09-TNFαi HC的情況下，其中TNFαi抗體(Humira)之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的TNFαi抗體之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體02C09的重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備雙特異性抗體02C09-TNFαi HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同的方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表16] 02C09-TNFαi HC之重鏈

02C09重鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 57)	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFNYAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKGEPDGGTTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSRRGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 58)	CAAATGCAGCTTGTTCAATCCGGCGGAGGCCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGAGTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAATTACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGGAAGAATCAAGGGCGAGCCTGATGGCGGAACCACAGAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGTGTCTAGAAGAGGCCTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACAGTTTCTTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(2) 雙特異性抗體02C09-TNFαi LC]

在02C09-TNFαi LC之情況下，其中Humira之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及Humira之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的TNFαi抗體之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體02C09的輕鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備雙特異性抗體02C09-TNFαi LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表17] 02C09-TNFαi LC之輕鏈

02C09輕鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 59)	DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGNAPKLLIYKATILESGVPSRFSGSGSGTEFALTISSLQPDDFSAYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 60)	GATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGGGCCAGCCAGTCTATTGGACGGTGGCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCTGGAAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGCCACCATCCTGGAAAGCGGAGTGCCTTCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTTGCCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCAGCGCCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(3) 雙特異性抗體Hu3F07-TNFαi HC]

在Hu3F07-TNFαi HC之情況下，其中TNFαi抗體之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及TNFαi之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接之TNFαi抗體的結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體hu3F07之重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備雙特異性抗體Hu3F07-TNFαi HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表18] Hu3F07-TNFαi HC之重鏈

Hu3F07重鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 61)	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFPDYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPPNGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGIYYVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 62)	CAAGTTCAACTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTTCACATTCCCCGACTACTGGATGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTAGCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(4) 雙特異性抗體Hu3F07-TNFαi LC]

在Hu3F07-TNFαi LC之情況下，其中TNFαi抗體之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及TNFαi之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的TNFαi抗體的結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體hu3F07之輕鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F動物細胞系製備雙特異性抗體Hu3F07-TNFαi LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表19] Hu3F07-TNFαi LC之輕鏈

Hu3F07輕鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 63)	DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 64)	GATATCGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGAGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(5) 雙特異性抗體TNFαi-02C09 HC]

在TNFαi-02C09 HC之情況下，其中抗OX40L抗體02C09之重鏈可變區(SEQ ID NO： 37)及抗OX40L抗體02C09之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 38)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體02C09之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在TNFαi抗體(Humira)之重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-02C09 HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表20] TNFαi-02C09 HC之重鏈

TNFαi重鏈-連接子-抗OX40L抗體02C09可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 65)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSQMQLVQSGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFNYAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKGEPDGGTTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSRRGLDVWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGNAPKLLIYKATILESGVPSRFSGSGSGTEFALTISSLQPDDFSAYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 66)	GAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAAATGCAGCTTGTTCAATCCGGCGGAGGCCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGAGTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAATTACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGGAAGAATCAAGGGCGAGCCTGATGGCGGAACCACAGAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGTGTCTAGAAGAGGCCTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACAGTTTCTTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGGGCCAGCCAGTCTATTGGACGGTGGCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCTGGAAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGCCACCATCCTGGAAAGCGGAGTGCCTTCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTTGCCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCAGCGCCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG

[(6) 雙特異性抗體TNFαi-02C09 LC]

在TNFαi-02C09LC之情況下，其中抗OX40L抗體02C09之重鏈可變區(SEQ ID NO： 37)及抗OX40L抗體02C09之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 38)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體02C09的結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在TNFαi抗體之輕鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-02C09 LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表21] TNFαi-02C09 LC之輕鏈

TNFαi輕鏈-連接子-抗OX40L抗體02C09可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 67)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSQMQLVQSGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFNYAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKGEPDGGTTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSRRGLDVWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGNAPKLLIYKATILESGVPSRFSGSGSGTEFALTISSLQPDDFSAYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 68)	GATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAAATGCAGCTTGTTCAATCCGGCGGAGGCCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGAGTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAATTACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGGAAGAATCAAGGGCGAGCCTGATGGCGGAACCACAGAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGTGTCTAGAAGAGGCCTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACAACAGTGACAGTTTCTTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGTCGGGCCAGCCAGTCTATTGGACGGTGGCTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCTGGAAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGCCACCATCCTGGAAAGCGGAGTGCCTTCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGAGTTTGCCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGCCTGACGACTTCAGCGCCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAG

[(7) 雙特異性抗體TNFαi-hu3F07 HC]

在TNFαi-hu3F07 HC之情況下，其中抗OX40L抗體hu3F07之重鏈可變區(SEQ ID NO： 41)及抗OX40L抗體hu3F07之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 42)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體hu3F07之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在TNFαi抗體之重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-hu3F07 HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表22] TNFαi-hu3F07 HC之重鏈

TNFαi重鏈-連接子-抗OX40L抗體hu3F07可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 69)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFPDYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPPNGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGIYYVDYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 70)	GAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAAGTTCAACTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTTCACATTCCCCGACTACTGGATGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTAGCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGAGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG

[(8) 雙特異性抗體TNFαi-hu3F07 LC]

在TNFαi-hu3F07 LC之情況下，其中抗OX40L抗體hu3F07之重鏈可變區(SEQ ID NO： 41)及抗OX40L抗體hu3F07之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 42)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體hu3F07之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在TNFαi抗體之輕鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-02C09 LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表23] TNFαi-hu3F07 LC之輕鏈

TNFαi輕鏈-連接子-抗OX40L抗體hu3F07可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 71)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFPDYWMHWVRQAPGQGLEWMGEIDPPNGRTNYNEKFKSRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGIYYVDYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPPTFGGGTKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 72)	GATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAAGTTCAACTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTTCACATTCCCCGACTACTGGATGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGACAGGGACTCGAATGGATGGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATGACCAGAGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGACTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACAGTTAGCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGAGAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTAGCAGAGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGTAGCCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG

[(9) 雙特異性抗體I3F07-TNFαi HC]

在上述雙特異性抗體I3F07-TNFαi HC之情況下，其中TNFαi抗體(Humira)之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及TNFαi抗體(Humira)之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的TNFαi抗體的結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體I3F07之重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備雙特異性抗體I3F07-TNFαi HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同的方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表24] I3F07-TNFαi HC之重鏈

I3F07重鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 73)	QIQLAQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFPDYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPPNGRTNYNEKFKSKATLTVDSSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCARGIYYVDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 74)	CAGATTCAGCTGGCTCAGTCTGGCGCCGAACTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCACCTTTCCTGACTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACAGCAGCAGCAATACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGACTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTTTCTTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(10) 雙特異性抗體I3F07-TNFαi LC]

在I3F07-TNFαi LC之情況下，其中Humira之重鏈可變區(SEQ ID NO： 35)及Humira之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 36)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的TNFαi抗體之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在抗OX40L抗體I3F07之輕鏈恆定區的C-末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系(Invitrogen)製備雙特異性抗體I3F07-TNFαi LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表25] I3F07-TNFαi LC之輕鏈

I3F07輕鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 75)	DIVLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGSKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 76)	GATATCGTGCTGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTTTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGATCCTCTCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTTCTCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAAGCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[(11) 雙特異性抗體TNFαi-I3F07 HC]

在TNFα1-I3F07 HC的情況下，其中抗OX40L抗體I3F07之重鏈可變區(SEQ ID NO： 53)及抗OX40L抗體I3F07之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 54)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體I3F07之結合片段(ScFv)經連接子(SEQ ID NO： 31)在TNFαi抗體之重鏈恆定區的C末端處連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-I3F07 HC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同的方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表26] TNFαi-I3F07 HC之重鏈

TNFαi重鏈-連接子-抗OX40L抗體I3F07可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 77)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSQIQLAQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFPDYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPPNGRTNYNEKFKSKATLTVDSSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCARGIYYVDYWGQGTTLTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGSKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 78)	GAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAGATTCAGCTGGCTCAGTCTGGCGCCGAACTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCACCTTTCCTGACTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACAGCAGCAGCAATACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGACTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTTTCTTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGCTGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTTTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGATCCTCTCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTTCTCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAAGCAAGCTGGAAATCAAG

[(12) 雙特異性抗體TNFαi-I3F07 LC]

在TNFαi-I3F07 LC之情況下，其中抗OX40L抗體I3F07之重鏈可變區(SEQ ID NO： 53)及抗OX40L抗體I3F07之輕鏈可變區(SEQ ID NO： 54)經連接子(SEQ ID NO： 32)連接的抗OX40L抗體I3F07之結合片段(ScFv)在TNFαi抗體之輕鏈恆定區的C末端經連接子(SEQ ID NO： 31)連接。

藉由使用表現載體pcDNA3.1 (Invitrogen)及FreeStyle™ 293-F之動物細胞系製備雙特異性抗體TNFαi-I3F07 LC。以與上述(1)抗OX40L抗體02C09實質上相同之方式進行詳細的培養條件、培養方法及純化方法。 [表27] TNFαi-I3F07 LC之輕鏈

TNFαi輕鏈-連接子-抗OX40L抗體I3F07可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 79)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSQIQLAQSGAELVKPGASVKLSCKASGFTFPDYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPPNGRTNYNEKFKSKATLTVDSSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCARGIYYVDYWGQGTTLTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGSKLEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 80)	GATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCCAGATTCAGCTGGCTCAGTCTGGCGCCGAACTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCACCTTTCCTGACTACTGGATGCACTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAATGGATCGGCGAGATCGATCCTCCTAACGGCCGGACCAACTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACAGCAGCAGCAATACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGACTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCATCTACTACGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTTTCTTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGCTGACACAGAGCCCTCTGAGCCTGCCTGTTTCTCTGGGAGATCAGGCCAGCATCAGCTGCAGATCCTCTCAGAGCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTAAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACAGGTTCAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATTTCTAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGTTCTCAGTCTACCCACGTGCCACCTACCTTTGGCGGCGGAAGCAAGCTGGAAATCAAG

另外，根據與上述實例2的抗OX40L抗體之製造(製備)方法相同之方法，將作為參照抗體之抗OX40L抗體(下文稱為Ref.Ab或O4L)藉由使用作為抗OX40L抗體之奧昔單抗的VH及VL的序列(SEQ ID NO：33及34)製備，且作為參照抗體之抗TNFα抗體(下文稱為Ref. TNFαi或Humira)藉由使用作為抗TNFα抗體之Humira的VH及VL的序列(SEQ ID NO： 35及36)製備。 [表28] O4L之重鏈及輕鏈序列

O4L
重鏈 (SEQ ID NO： 81)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSRTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLVAPGTFDYWGQGALVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
輕鏈 (SEQ ID NO： 82)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[表29] Ref. TNFαi之重鏈及輕鏈序列

Ref. TNFαi
重鏈 (SEQ ID NO： 83)	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
輕鏈 (SEQ ID NO： 84)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

根據與上述實例3之雙特異性抗體的製造(製備)方法相同之方法，藉由使用所製備之抗體O4L及上文之Ref. TNFαi製備抗OX40L-TNFαi HC及LC抗體(下文分別稱為O4L-TNFαi HC及O4L-TNFαi LC)。 [表30] O4L-TNFαi HC之重鏈序列

O4L重鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 85)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSRTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLVAPGTFDYWGQGALVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 86)	GAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAGCTACGCCATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCATCATCAGCGGCAGCGGCGGCTTTACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCCGGACCACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGGACAGACTGGTGGCCCCAGGCACCTTCGACTATTGGGGACAGGGCGCCCTCGTGACCGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[表31] O4L-TNFαi LC之輕鏈

O4L輕鏈-連接子-TNFαi可變區
胺基酸序列 (SEQ ID NO： 87)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
核酸(DNA)序列 (SEQ ID NO： 88)	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGAGAAGGCCCCCAAGAGCCTGATCTACGCCGCCAGCTCTCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACAGCTACCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCGGCGCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT GGTGGTGGCGGATCTGGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGAAGTGCAACTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAAGAAGCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGCCATCACCTGGAACAGCGGCCACATCGATTACGCCGATAGCGTGGAAGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAAAGTGTCTTACCTGAGCACCGCCTCCAGCCTGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCT GGTGGCGGAGGTTCTGGCGGAGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGAAGTGGTGGCGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCAGAAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCTCTACACTGCAGAGCGGCGTGCCATCTAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGAGATACAACAGAGCCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[實驗實例1：抗體分析]

藉由SDS-PAGE分析實例2中獲得之抗OX40L抗體及實例3中獲得之雙特異性抗體，且其結果示於圖2中。 [實驗實例2：針對抗OX40L抗體之OX40L抗原的抗原決定基]

藉由使用HDX-MS技術分析針對抗OX40L抗體之OX40L抗原的抗原決定基。使用0.12-2.00 M脲、0.12-1.00 M TCEP (pH 2.6)淬滅緩衝液及胃蛋白酶管柱，且使用基於D ₂O之緩衝溶液標記，以在五個時間點進行分析。藉由使用PLGS及DynamX對資料進行處理，以獲得如圖3所示之結果。 [實驗實例3：抗體特性] [實驗實例3-1. 抗OX40L抗體及雙特異性抗體之抗原的平衡解離常數(K _D)分析]

如下分析關於抗OX40L抗體及同時控制OX40L及TNFα之雙特異性抗體的抗原親和力，前述抗體在上文實例2及3中分離及純化。

在上述抗體中，確認抗OX40L抗體對人OX40L (SEQ ID NO： 2)之結合力，且分別確認OX40L及TNFα雙特異性抗體對人OX40L (SEQ ID NO： 2)及人TNFα (Acro Biosystems之TNF-H5228)的結合力(表32)。

藉由使用Bicore T200進行表面電漿子共振(SPR)分析，且所用操作緩衝液為HBS-EP (10 mM HEPES，pH7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.15%界面活性劑P20)。藉由胺偶聯法將人抗體捕獲套組(抗hFc抗體)固定在CM5芯片之表面上。用操作緩衝液將人OX40L或人TNFα稀釋至10 nM，隨後連續1/2倍稀釋，以五個濃度間隔進行分析。藉由將抗體滅菌且經0.2 μm過濾器過濾且量測吸光度(A280)來確認抗體之濃度。製備具有高純度/高濃度之分析樣品，以使最小稀釋因數可為100或更大，藉此使緩衝作用降至最低。在所有分析間隔之間提供一個再生步驟，以便可使實驗之基線保持恆定，且Biacore分析結果如表32及圖4所示。

在圖4中，Ag1表示人OX40L，Ag2表示人TNFα。 [表32]

抗原	抗體	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD(M)	Rmax(RU)	Chi²(RU²)	U值	SE(ka)	SE(kd)
OX40L	Hu3F07	1.27E+06	3.57E-04	2.82E-10	40.4	0.2	3.1	8.00E+02	1.70E-06
10H07	1.69E+06	4.98E-04	2.95E-10	38	0.8	4.1	1.90E+03	3.00E-06
21G07	1.08E+06	6.50E-04	6.03E-10	36.7	0.4	2.4	1.10E+03	2.70E-06
02C09	1.16E+06	4.08E-04	3.52E-10	38	0.7	5.3	1.40E+03	3.10E-06
O4L-TNFαi HC	1.23E+06	5.76E-04	4.67E-10	25.8	0.1	2.4	3.80E+03	2.10E-06
02C09-TNFαi HC	1.07E+06	5.03E-04	4.72E-10	32.4	0.4	3.1	1.20E+03	3.00E-06
Hu3F07-TNFαi HC	1.38E+06	6.19E-04	4.50E-10	26.8	0.1	1.9	1.00E+03	2.00E-06
TNFα	O4L-TNFαi HC	4.38E+05	2.03E-04	4.64E-10	49.1	0.8	6.9	3.40E+02	2.20E-06
02C09-TNFαi HC	4.16E+05	9.55E-05	2.30E-10	85.7	1.9	11.6	1.10E+03	1.90E-06
Hu3F07-TNFαi HC	4.55E+05	2.03E-04	4.46E-10	48	0.7	6.9	3.50E+02	2.20E-06

如自上表32確認，可確認實例2之抗OX40L抗體與OX40L牢固結合，而實例3之雙特異性抗體與OX40L及TNFα均牢固結合。特定言之，確認抗OX40L抗體及雙特異性抗體均在nM水準下顯示出對OX40L之結合力，且特定言之，雙特異性抗體亦顯示nM水準下的對TNFα之結合力。上述結果表明，雙特異性抗體對每種抗原保持高水準之結合能力而不間斷。 [實驗實例3-2.抗OX40L抗體及雙特異性抗體之熱穩定性測試]

進行測試以確認關於實例3之雙特異性抗體及實例2之抗OX40L抗體的熱穩定性質(表33)。

將抗體在DPBS中稀釋至3 μM/45 μL，與5 μL 200x sypro橙色染料(＃S6650，Thermo)混合，卻以50 μL分配至qPCR管(＃B77009，B57651，生物塑料)中。使用Biorad CFX96即時PCR裝置進行qPCR。藉由在25℃下反應30秒，隨後在各溫度下反應1分鐘，且最終在25℃下反應10秒，同時將溫度升高1℃至99℃，從而完成qPCR條件。使用熔融溫度(T _m)作為抗體結構展開之速率常數，且其結果如下表33所示。 [表33]

樣品	Melt T m(℃)	樣品	Melt T m(℃)
Hu3F07	63	Hu3F07-TNFαi HC	64.5
02C09	64	Hu3F07-TNFαi LC	59.5
10H07	59	02C09-TNFαi HC	61.5
21G07	59	02C09-TNFαi LC	60.5

如自上表確認，發現抗OX40L抗體及雙特異性抗體之熔融溫度在59至65℃之間，表明前述雙特異性抗體亦具有與抗OX40L抗體相似之熱穩定性。 [實驗實例3-3.抗OX40L抗體及雙特異性抗體之藥物代謝動力學(PK)分析]

進行分析以確認投與實例3之雙特異性抗體及實例2之抗OX40L抗體時的藥物代謝動力學(表34)。

使用的實驗動物是Sprague-Dawley品系之雄性大鼠，其由於恆定的藥物反應及穩定的供應系統已廣泛用於藥物代謝動力學測試。分別使用三隻未禁食的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(七週齡)，且以5 mpk (2.5-2.4 mg/ml)投與單次靜脈內推注。投與後，在3分鐘、3、8、24、48、72、96、120、144、168小時，藉由頸靜脈以約150 μl/時間點收集血液共10次，且藉由使用抗凝劑肝素鈉分離，且在藉由離心(12,000 rpm，3分鐘)獲得約70 μl血漿後，立即將樣品儲存在低溫冷凍機中。在實驗期間，每天至少觀察一次一般症狀。在最後一次採血後，藉由吸入CO ₂對實驗動物實施安樂死。

藉由稱為Gyrolab xPlore ^®(目錄號P0020300，GYROS PROTEIN)及Gyrolab PK套組(目錄號P0020499，GYROS PROTEIN)分析自PK測試獲得之血漿。自藉由Gyrolab火的之結果值，藉由使用BA Calc 2007 1.0.0或PK Solver 2.0程式獲得諸如AUC(last)、AUC(inf)、C _max、T _max、半衰期等參數值，且其結果如表34中所示。 [表34]

樣品	半衰期 ( 天 )	AUC(Last) (μg hr/mL)	AUC(Inf) (μg hr/mL)	Cmax (μg/mL)
Hu3F07	3.6	5273	7863	107
Hu3F07-TNFαi HC	5.1	5299	8453	101
Hu3F07-TNFαi LC	3.7	4848	6918	91
02C09	4.0	3958	5680	83
02C09-TNFαi HC	6.0	1348	2144	41
02C09-TNFαi LC	3.6	3425	4406	89

觀測到實例2之抗OX40L抗體之半衰期分別為3.6及4.0天，且實例3之雙特異性抗體的半衰期為3.6至6.0天。

因此，可理解的是，人類中之半衰期亦可為約兩週或更久。 [實驗實例4：抗體功效] [實驗實例4-1. 評估抗體之訊號抑制能力(1)]

使用OX40L/OX40封鎖生物分析套組(Promega CS197706)及TNFα/TNFαRc封鎖生物分析套組(Promega CS177503)進行實例2之抗OX40L抗體及實例3之雙特異性抗體(Hu3F07-TNFαi HC、02C09-TNFαi HC、O4L-TNFαi HC)之活性評估實驗(表35，圖5)。 (1) 藉由使用OX40L/OX40封鎖生物分析套組評估實例2之抗OX40L抗體及實例3之雙特異性抗體之活性。

將NFκB-luc2/OX40 Jurkat細胞置於RPMI1640 (10% FBS)培養液中，且在37℃，5% CO ₂培育器中靜置培養過夜。第二天，製備與細胞反應之抗原及抗體。當將OX40L抗原添加至RPMI1640 (10% FBS)培養液中之細胞中時，使得最終濃度可達到15 ng/mL。首先將抗OX40L抗體、雙特異性抗體及對照抗體稀釋至最終濃度33 µg/mL，接著分九步驟連續1/3倍稀釋。第十次濃度為0，且用培養液置換，從而獲得總共10步驟之濃度梯度。將每種製備之抗原稀釋溶液及抗體稀釋溶液分別分配25 µL至細胞中。分配各樣品重複三次。分配後，細胞、抗原稀釋溶液及抗體稀釋溶液總共製成100 µL，且在CO ₂培育器中反應約5小時。

分配75 µL Bio-Glo且反應約10分鐘，隨後在微板讀取器上藉由發光分析樣品，隨後藉由4參數(X軸log(濃度))進行分析。

藉由將IC ₅₀分析結果在µg/mL下轉化為nM(抗體之濃度單位)來計算最終IC ₅₀，使得抗OX40L抗體可用150 kDa表示，且雙特異性抗體可用200 kDa表示。 (2) 藉由使用TNFα/TNFαRc封鎖生物分析套組評估雙特異性抗體活性。

將NFκB-RE HEK293細胞DMEM (10% FBS)置於培養液中，且在37℃，5% CO ₂培育器中靜置培養。製備待與細胞反應之抗原及抗體。TNFα抗體在DMEM (10% FBS)培養液中稀釋，使得與細胞反應時最終濃度可達到3 ng/mL。將雙特異性抗體及作為對照抗體之Humira (Ref. TNFαi)稀釋至DMEM (10% FBS)培養液中，初始濃度為10 nM，隨後分八個步驟依序1/2倍稀釋，藉此獲得 最終濃度，其中當與細胞反應時，初始濃度達到0.8 nM。

將製備的抗原稀釋溶液及抗體稀釋溶液以3：2之比率混合，且以20 µL分配至細胞中。分配各樣品重複兩次，且在分配後在CO ₂培育器中反應約4小時。

分配100 µL Bio-Glo且反應，隨後在微板讀取器上藉由發光分析，隨後藉由4參數(X軸log(濃度))進行分析以計算IC ₅₀。

上述IC ₅₀值如下表35及圖5所示。 [表35]

分析	樣品	IC50 (nM)	IC 50 (µg/mL)
OX40L封鎖分析	Hu3F07	0.20	0.030
02C09	0.78	0.117
21G07	0.85	0.128
10H07	0.41	0.061
Hu3F07-TNFαi HC	0.21	0.041
02C09-TNFαi HC	0.59	0.117
O4L-TNFαi HC	1.23	0.246
Ref. Ab	1.95	0.293
TNFα封鎖分析	Hu3F07-TNFαi HC	0.057	-
02C09-TNFαi HC	0.067	-
O4L-TNFαi HC	0.056	-
Humira (Ref, TNFαi)	0.063	-

如自上表35及圖5可理解，可發現根據實例2及3之雙特異性抗體及抗OX40L抗體在1.3 × 10 ^-9M (nM)或更低之水準顯示OX40L阻斷能力，且特定言之，抗OX40L抗體在0.9 × 10 ^-9M (nM)或更低之水準下顯示OX40L阻斷能力，且雙特異性抗體在1 × 10 ^-9M (nM)或更低之水準下顯示TNFα阻斷能力，藉此提供顯著優異之阻斷能力。換言之，可理解，本發明之抗OX40L抗體顯示優異的OX40L阻斷能力，且使用前述抗體製備之雙特異性抗體亦顯示不僅對OX40L而且對TNFα之優異阻斷能力。 [實驗實例4-2. 評估抗體之訊號抑制能力(2)]

藉由使用TNFα/TNFαRc封鎖生物分析套組(Promega CS177503)評估實例3之雙特異性抗體(02C09-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC、TNFαi 02C09 LC)之活性(表36)。評估的詳細條件及方法與上文在實驗實例4-1中之抗體(1)的訊號抑制能力的評估中所述實質上相同。 [表36]

分析	樣品	IC50 (nM)
TNFα封鎖分析	02C09-TNFαi LC	0.058
TNFαi-02C09 HC	0.057
TNFαi 02C09 LC	0.055

如自上表36可理解，可發現實例3之雙特異性抗體02C09-TNFαi LC、TNFαi-02C09 HC及TNFαi 02C09 LC在1 × 10 ^-9M (nM)或更低之水準下顯示TNFα阻斷能力，藉此提供優異阻斷能力。 [實驗實例4-3. 評估抗體之訊號抑制能力(3)]

藉由使用OX40L/OX40封鎖生物分析套組(Promega CS197706)及TNFα/TNFαRc封鎖生物分析套組(Promega CS177503)評估實例3之雙特異性抗體(I3F07-TNFαi HC、I3F07-TNFαi LC、TNFαi-I3F07 HC、TNFαi-I3F07 LC)之活性(表37)。評估的詳細條件及方法與上文在實驗實例4-1中之抗體(1)的訊號抑制能力的評估中所述實質上相同。 [表37]

分析	樣品	IC50 (nM)
OX40L封鎖分析	I3F07-TNFαi HC	0.91
I3F07-TNFαi LC	0.94
TNFαi-I3F07 HC	0.80
TNFαi-I3F07 LC	0.71
TNFα封鎖分析	I3F07-TNFαi HC	0.055
I3F07-TNFαi LC	0.077
TNFαi-I3F07 HC	0.054
TNFαi-I3F07 LC	0.065

如自上表37可理解，可發現實例3之雙特異性抗體顯示在1 × 10 ^-9M (nM)或更低之水準下的OX40L阻斷能力及在1 × 10 ^-9M (nM)或更低水準下的TNFα阻斷能力，藉此提供優異阻斷能力。 [實驗實例4-4.評估免疫細胞活性之抗體抑制能力]

為了評估實例2之抗OX40L抗體及實例3之雙特異性抗體之功效，藉由使用正常人及患有類風濕性關節炎(RA)之患者的外周血單核細胞(PBMC)來確認抑制免疫細胞活性之能力(圖6)。

藉由上述方法，自正常人及RA患者之PBMC分離T細胞，且對活化T細胞時降低之細胞因子IL-2的分泌水準進行分析。

為了分別在正常及患者PBMC中分裂T細胞，將抗CD3 (R＆D系統，MAB100)以100 ng /孔稀釋，且附著至96孔持續約16小時(5±3)。移除附著之溶液後，將細胞用PBS洗滌。在LGM-3 (10% FBS，1% P/S)中稀釋DNase I達到20 U/mL後，添加正常PBMC以製備混合溶液，離心(200 g，15分鐘)以移除上清液，稀釋且分配，使得使用LGM-3 (10% FBS，1% P/S)可使正常PBMC達到1 × 10 ⁶個細胞/mL。將人OX40L (ACROBIOSYSTEMS，OXL-H52Q8)及人TNFα (SINO BIOLOGICAL，10602-HNA)在LGM-3 (10% FBS，1% P/S)中稀釋，且以50 μL添加至分配的正常PBMC中。用LGM-3 (10% FBS，1% P/S)以800 ng/mL製備抗OX40L抗體及雙特異性抗體，隨後稀釋至1 nM。將稀釋之抗體以50 μL分配至含有自PBMC、人OX40L及人TNFα分離之T細胞的板中，且混合。在約24至72小時後，僅收集上清液且量測IL-2，且結果顯示於圖6中。

在圖6中，A表示正常PBMC來源之T細胞分析的結果，而B表示患者PBMC來源之T細胞分析的結果。

如自圖6可知，確認當投與本發明之雙特異性抗體時，IL-2顯示出降低之趨勢。特定言之，自RA患者中PBMC來源之T細胞的結果可確認，與Humira (Ref. TNFαi)相比，本發明之雙特異性抗體顯著降低RA患者中PBMC來源之T細胞中的IL-2表現。此可能意謂本發明之雙特異性抗體充當RA之有效治療性抗體，且特定言之，在Humira難治癒RA患者中有效地起作用。

因此，可理解本發明之抗OX40L抗體及雙特異性抗體緩解過度活化之免疫系統，且顯示出對自體免疫性疾病的優異治療效果。

無。

圖1顯示抗OX40L抗體及能夠同時結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體之結構。在圖1中，CH1、CH2及CH3表示重鏈之恆定區，CL表示輕鏈之恆定區，且標記有條紋(或陰影線)之部分表示各鏈之可變區(CDR區(白色)及框架區(有色))。

圖2顯示在產生抗OX40L抗體及能夠同時結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體之後用SDS-PAGE對其進行確認之結果。

圖3顯示藉由用HDX-MS分析，抗OX40L抗體之OX40L抗原的抗原決定基定位圖之結果。

圖4顯示藉由Biacore分析方法量測雙特異性抗體是否可同時結合諸如OX40L及TNFα之抗原的結果。圖4顯示其中水平軸係時間(0＝捕獲_水準)且垂直軸係反應(0 ＝ 捕獲_水準)的圖。

圖5顯示抗OX40L抗體及能夠同時結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體的活體外封鎖分析法之結果。

圖6顯示確認抗OX40L抗體及能夠同時結合OX40L及TNFα之雙特異性抗體對T細胞之IL-2分泌之作用的結果。

Claims (35)

1. 一種抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其與OX40L (OX40配位體)特異性結合且抑制OX40L與OX40受體之間的相互作用。
2. 如請求項1所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段與由選自SEQ ID NO： 3及4組成之群的胺基酸序列表示的至少一個抗原決定基結合。
3. 如請求項1或2所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段以1 × 10 ^-9M或更低之K _D與人OX40L結合，且其中前述K _D藉由表面電漿子共振(Biacore)分析來量測。
4. 如請求項1或2所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： 重鏈可變區，其包含由選自SEQ ID NO： 12、13及14組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 15、16、17及18組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 19、20、21及22組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由選自SEQ ID NO： 23及24組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 25及26組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 27、28、29及30組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR3。
5. 如請求項1或2所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： (i) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 12表示的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 15表示的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 19表示的重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 23表示的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 25表示的輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 27表示的輕鏈CDR3； (ii) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3； (iii) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 17表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 21表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 29表示之輕鏈CDR3；及 (iv) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 14表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 18表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 22表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 30表示之輕鏈CDR3。
6. 如請求項1或2所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： 由選自SEQ ID NO： 37、41、45、49及53組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及 由選自SEQ ID NO： 38、42、46、50及54組成之群的一個胺基酸序列表示的輕鏈可變區。
7. 如請求項1或2所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： (a) 由SEQ ID NO： 37表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 38表示之輕鏈可變區； (b) 由SEQ ID NO： 41表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 42表示之輕鏈可變區； (c) 由SEQ ID NO： 45表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 46表示之輕鏈可變區； (d) 由SEQ ID NO： 49表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 50表示之輕鏈可變區；或 (e) 由SEQ ID NO： 53表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 54表示之輕鏈可變區。
8. 如請求項7所述之抗OX40L抗體或其抗原結合片段，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： 由選自SEQ ID NO： 5、6、7及8組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及 由SEQ ID NO： 10之胺基酸序列表示的輕鏈可變區。
9. 一種雙特異性抗體，其包含：與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段；及與TNFα特異性結合的抗TNFα抗體或其抗原結合片段。
10. 如請求項9所述之雙特異性抗體，其中前述雙特異性抗體係其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段與前述抗TNFα抗體或其抗原結合片段彼此連接的雙特異性抗體。
11. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段與由選自SEQ ID NO： 3及4組成之群的胺基酸序列表示的至少一個抗原決定基結合。
12. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： 重鏈可變區，其包含由選自SEQ ID NO： 12、13及14組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 15、16、17及18組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 19、20、21及22組成之群的一個胺基酸序列表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由選自SEQ ID NO： 23及24組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR1；由選自SEQ ID NO： 25及26組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR2；及由選自SEQ ID NO： 27、28、29及30組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈CDR3。
13. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： (i) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 12表示的重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 15表示的重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 19表示的重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 23表示的輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 25表示的輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 27表示的輕鏈CDR3； (ii) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 16表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 20表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 28表示之輕鏈CDR3； (iii) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 13表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 17表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 21表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 29表示之輕鏈CDR3；或 (iv) 抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 14表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 18表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 22表示之重鏈CDR3；及輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 24表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 26表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 30表示之輕鏈CDR3。
14. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： 由選自SEQ ID NO： 33、37、41、45、49及53組成之群的一個胺基酸序列表示的重鏈可變區；及 由選自SEQ ID NO： 34、38、42、46、50及54組成之群的一個胺基酸序列表示之輕鏈可變區。
15. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段包含： (a) 由SEQ ID NO： 37表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 38表示之輕鏈可變區； (b) 由SEQ ID NO： 41表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 42表示之輕鏈可變區； (c) 由SEQ ID NO： 45表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 46表示之輕鏈可變區； (d) 由SEQ ID NO： 49表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 50表示之輕鏈可變區； (e) 由SEQ ID NO： 53表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 54表示之輕鏈可變區；或 (f) 具有由SEQ ID NO： 33表示之胺基酸序列的重鏈可變區及具有由SEQ ID NO： 34表示之胺基酸序列的輕鏈可變區。
16. 如請求項10至15中任一項所述之雙特異性抗體，其中前述抗TNFα抗體或其抗原結合片段包括： 重鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 89表示之重鏈CDR1；由SEQ ID NO： 90表示之重鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 91表示之重鏈CDR3；及 輕鏈可變區，其包含由SEQ ID NO： 92表示之輕鏈CDR1；由SEQ ID NO： 93表示之輕鏈CDR2；及由SEQ ID NO： 94表示之輕鏈CDR3。
17. 如請求項16所述之雙特異性抗體，其中前述抗TNFα抗體或其抗原結合片段包含由SEQ ID NO： 35表示之重鏈可變區及由SEQ ID NO： 36表示之輕鏈可變區。
18. 如請求項16所述之雙特異性抗體，其中前述雙特異性抗體以1.5 × 10 ^-9M或更低之K _D與人OX40L結合，且以1 × 10 ^-9M或更低之K _D與人TNFα結合，且其中前述K _D藉由表面電漿子共振(Biacore)分析來量測。
19. 如請求項16所述之雙特異性抗體，其中前述雙特異性抗體係其中與TNFα特異性結合之抗TNFα抗體或其抗原結合片段與前述抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個末端連接的雙特異性抗體。
20. 如請求項19所述之雙特異性抗體，其中前述雙特異性抗體係其中前述抗TNFα抗體或其抗原結合片段與前述抗OX40L抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接的雙特異性抗體。
21. 如請求項16所述之雙特異性抗體，其中前述雙特異性抗體係其中與OX40L特異性結合之抗OX40L抗體或其抗原結合片段與前述抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個末端連接的雙特異性抗體。
22. 如請求項21所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段與前述抗TNFα抗體之輕鏈及重鏈的至少一個C末端連接。
23. 如請求項16所述之雙特異性抗體，其中前述抗OX40L抗體或其抗原結合片段及前述抗TNFα抗體或其抗原結合片段藉由連接子連接。
24. 如請求項23所述之雙特異性抗體，其中前述連接子由SEQ ID NO： 31或SEQ ID NO： 32表示。
25. 一種核酸，其編碼如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體。
26. 一種表現載體，其包含如請求項25所述之核酸。
27. 一種轉型體，其包含引入其中之如請求項26所述之表現載體。
28. 一種藉由使用如請求項27所述之轉型體生產抗體或其抗原片段或雙特異性抗體之方法。
29. 一種用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體。
30. 如請求項29所述之醫藥組合物，其中前述醫藥組合物預防或治療類風濕性關節炎。
31. 一種用於藉由使用如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體來提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的方法。
32. 一種用於提供關於診斷自體免疫性疾病或發炎性疾病之資訊的套組，其包含如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體。
33. 一種預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之方法，前述方法包含：投與醫藥上有效量之如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體。
34. 一種如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體之用途，其用於製造用以預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病之藥物。
35. 一種如請求項1至8中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項9至24中任一項所述之雙特異性抗體之用途，其用於預防或治療自體免疫性疾病或發炎性疾病。

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