KR102553752B1 - 인터페론 알파 및 오메가 항체 길항제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터페론-α 및 인터페론-ω를 광범위하게 중화시키는 항체, 그러한 항체 또는 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

인터페론 알파 및 오메가 항체 길항제{INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTIBODY ANTAGONISTS}
본 발명은 인터페론-α 및 인터페론-ω를 광범위하게 중화시키는 항체, 그러한 항체 또는 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
I형 인터페론(IFN)(IFN-I)은, 편재적으로 발현되는 이종이량체성 수용체 IFNAR(IFNAR1 및 IFNAR2의 이종이량체)을 통해 신호를 전달하여 항바이러스 효과, 항증식 효과 및 면역조절 효과를 가져오는 사이토카인들의 패밀리이다. 인간에서, I형 IFN은 적어도 12개의 IFN-α 단백질 아형과 IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, 및 IFN-ω 각각에 대한 1개씩의 아형으로 구성된다. IFN-I 방출은 미생물성 리간드 및 무균성(sterile) 리간드 둘 모두에 반응하여 일어난다. 수용체 결합 시에, IFN-I은 JAK1 및 TYK2의 활성화를 통해 신호전달 캐스케이드를 개시하며, 이는 STAT 1 내지 6을 포함한 몇몇 STAT 패밀리 구성원들의 인산화로 이어진다. STAT1 및 STAT2 활성화는 IFN-조절 인자 9(IRF9)와의 복합체의 형성으로 이어지고, IFN-자극 유전자 인자 3(ISGF3) 복합체로도 알려진 이 복합체는 핵 내의 IFN-자극 반응 요소(ISRE)에 결합하며, 그 결과 IRF7 및 CXCL10(IP-10)을 포함한 많은 인터페론-자극 유전자(ISG)의 전사를 가져온다(문헌[Gonzalez-Navajas et al., Nature reviews. Immunology 12, 125 (Feb, 2012)]). IFN-I은 또한 v-crk 육종 바이러스 CT10 발암유전자 호모로그(조류)-유사(CRKL), 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK), 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K)를 포함한 다른 경로를 통해, 그리고 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(NF-κβ)를 통해 세포 기능을 조절한다(문헌[Hervas-Stubbs et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 17, 2619 (May 1, 2011)]).
몇몇 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 피부 홍반성 루푸스(CLE)를 포함한 루푸스, I형 당뇨병, 건선, 쇼그렌병(
Figure 112017005865411-pct00001
), 전신 경화증, 류마티스성 관절염, 면역성 혈소판감소증(ITP), 에이카르디-고우티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres syndrome, AGS), 근염, 공통 가변성 면역 결핍증(common variable immune deficiency, CVID) 및 자가면역 갑상선 질병은 전혈 및/또는 조직에 존재하는 IFN 시그너처로 일반적으로 불리는 IFN-유도성 유전자 전사체의 과발현을 갖거나 상승된 IFN-I을 갖는 환자들의 하위집단에 적어도 관련되어 있다.
SLE는 병원성 자가항체 및 면역 복합체의 생성으로 다수의 기관계에 걸쳐 조직 손상이 발생되는 만성 자가면역 또는 면역-매개 염증성 질병이다. 이 질병은 이종성 임상 제시(heterogeneous clinical presentation)를 갖는 광범위한 증상을 나타내고, 전신 징후, 피부 징후, 신장 징후, 근골격 징후, 신경학적 징후 및 혈액학적 징후를 포함할 수 있다. SLE는 중증도에 있어서 크게 다양하고, 수주, 수개월, 또는 수년간 지속될 수 있는 개선 또는 관해의 기간을 가지면서 활성 사이클링의 플레어(flare)와 함께 만성적인 관해 또는 재연(relapsing)을 나타낸다. IFN-α는 SLE 환자에서 상승되고, 자신에 대한 내성의 손실을 촉진시키는 것으로 여겨진다. IFN-α는 지속적인 수지상 세포 활성화 및 이에 따른 항원 제시, 및 SLE에 기여하는 Treg 기능의 억제에 기여하는 것으로 밝혀져 있다. IFN-α는 또한 BLyS 발현을 유도하는데, 이는 시판 SLE 치료제인 벤리스타(BENLYSTA)™에 대한 표적이다. IFN-I의 생성 또는 그에 대한 반응과 관련된 다수의 다형성이 확인되어 있으며, 이들은 SLE와 관련된 것으로 확인된 다형성들의 과반수를 차지한다(문헌[Ghodke-Puranik & Niewold, International journal of clinical rheumatology 8, doi:10.2217/ijr.13.58 (2013)]). 다양한 IFN-α 아형을 중화시키는 항체(pan-IFN-α 항체)는 SLE에 대한 임상 시험에서 평가되고 있는 중이다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO02/066649호, 국제 특허 출원 공개 WO05/059106호, 국제 특허 출원 공개 WO06/086586호, 국제 특허 출원 공개 WO09/135861호 참조).
IFN-ω는 바이러스 감염 후에 생성된 인간 백혈구 IFN 조제물에서의 총 IFN-I 활성의 대략 15%를 구성한다(문헌[Adolf, Virology 175, 410 (Apr, 1990)]). IFN-ω 유전자 발현은 SLE 환자에서 상승되는 것으로 보고되어 있고(문헌[Han et al., Genes and immunity 4, 177 (Apr, 2003)]; 문헌[Yao et al., Hum Genomics Proteomics 2009, (2009)]), IFN-ω가 DC 분화를 유도하는 능력이 보고되어 있다(문헌[Walker and Tough, European journal of immunology 36, 1827 (Jul, 2006)]). 현재 임상 시험 중인 항-IFN-α 항체(시팔리무맙(MEDI-545), 론탈리주맙 및 AGS-009)는 IFN-ω를 중화시키지 못한다. 이들 항체에 대한 임상 시험 데이터는 항-IFN-α 항체에 의한 치료 후의 환자에서 I형 IFN 시그너처의 부분적인 감소를 나타내고(문헌[Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011]; 문헌[Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009]), 론탈리주맙(pan-항-IFN-α 항체)에 대한 2상 시험 데이터는 인터페론 시그너처 메트릭(Interferon Signature Metric, ISM)-저중등도 내지 중증으로 활성인 루프스 대상체의 미리 지정된 바이오마커 규정 그룹에서 주수(week) 24에서 SLE의 징후 및 증상, 발적률, 및 스테로이드 부하에 있어서 개선을 나타내었다. ISM-High로서 미리 규정된 고수준의 IFN-유도성 유전자 발현을 갖는 환자에서는 효능이 관찰되지 않았다(문헌[Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012]).
항-IFN 항체에 더하여, 항-IFNAR1 항체가 루푸스의 치료에 대해 연구 중이다(문헌[Wang et al., 2013; Clinical Pharmacology & Therapeutics accepted article preview 14 February 2013; doi: 10.1038/clpt.2013.35]). IFNAR1 차단제(blockage)는 IFN-β를 포함한 모든 I형 IFN에 의해 유도된 IFN 신호전달을 전폐시킬 가능성이 높다. IFN-β는 항바이러스 방어에서 더 중대한 역할을 할 수 있는데, IFN-β를 인코딩하는 유전자의 특정 결실이, 기능적 IFN-β를 갖는 유사하게 노출된 마우스와 대비하여, 바이러스의 숙주에 대한 사실상의 감수성을 초래하기 때문이다(문헌[Lazear et al., J Virol 85:7186-7194]; 문헌[Deonarain et al., J Virol 74(7): 3404-340, 2000]; 문헌[Deonarain et al., Circulation 110: 3540-3543, 2004]; 문헌[Gerlach, et al., J Virol 80: 3438-3444, 2006]). 따라서, 항-IFNAR1 항체는 부작용의 위험을 증가시킬 수 있다.
SLE에 대한 현재의 표준 치료는 코르티코스테로이드, 항말라리아 약물, 면역억제제 또는 B 세포 조절제를 포함한다. 이들 치료제는 독성 및 다른 심각한 부작용을 나타낼 수 있고, 모든 루푸스 환자의 치료에 적합한 것은 아닐 수 있다. 따라서, 루푸스 및 다른 면역-매개 염증성 또는 자가면역 질병에 대한 추가적인 치료적 치료(therapeutic treatment)에 대한 필요성이 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 단일클론 항체이다.
본 발명의 다른 실시 형태는, 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 단일클론 항체로서, 본 항체는 적어도 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-11 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시킨다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 적어도 약 2×10-10 M 이하, 약 1.5 × 10-10 M 이하, 또는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시킨다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 각각 서열 번호 109, 114 및 121의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2) 및 3(HCDR3) 아미노산 서열, 및 서열 번호 118, 119 및 120의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 2(LCDR2) 및 3(LCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 각각 서열 번호 109, 114, 121, 159, 119 및 160의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 10개의 인간 IFN-α 아형을 중화시킨다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 적어도 아미노산 잔기 F27, L30 및 R33에서 서열 번호 1의 인간 IFN-ω와 결합한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 각각 서열 번호 109, 114, 121, 161, 119 및 162의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 적어도 인간 IFN-α 아형 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 서열 번호 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 150과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 HCDR 및 LCDR 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 소정의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 VH 및/또는 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체를 생성하는 방법이며, 본 방법은 항체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법이며, 본 방법은 본 발명의 단리된 항체의 치료적 유효량을 질병을 치료 또는 예방하기에 충분한 시간 동안 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병은 루푸스, 건선, 면역성 혈소판감소증(ITP), 에이카르디-고우티에레스 증후군(AGS), 전신 경화증, 쇼그렌 증후군(
Figure 112017005865411-pct00002
), 근염, 공통 가변성 면역 결핍증(CVID), 자가면역 갑상선 질병, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질병(GVHD)이다.
도 1a는 중국인 SLE 환자로부터의 혈장 중의 IFN-ω 및 IFN-α 수준(pg/ml)을 나타낸다. 이 도면에서의 수평 바는 반복 샘플들의 평균 ELISA 값을 나타내고, 수직 바는 표준 편차(SD)를 나타낸다.
도 1b는 백인 SLE 환자로부터의 혈청 중의 IFN-ω 및 IFN-α 수준(pg/ml)을 나타낸다. 다양한 공여자들에 걸쳐, 어두운 채워진 원은 최고의 IFN-α 수준을 나타내고, 점선으로 된 원은 최고의 IFN-ω 혈장 수준을 나타낸다. 이 도면에서의 수평 바는 반복 샘플들의 평균 ELISA 값을 나타내고, 수직 바는 SD를 나타낸다.
도 1c는 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 측정된 인터페론 신호전달 경로 하류에서 환자 혈청이 활성화됨을 나타낸다. 최대량의 IFN-α 단백질(어두운 채워진 원) 및 IFN-ω(점선으로 된 원)을 나타내는 공여자는 또한 리포터 유전자 검정에서 ISRE 유도의 최대 수준을 보여주었다. 결과는 각각의 혈청 샘플에 대한 단일 웰로부터의 판독치이다.
도 2는 증가하는 농도(0.4 내지 100 ㎍/ml)의 항-IFN-α 항체 단독에 의한, 또는 항-IFN-ω 항체(20 μ/ml)와 병용된 100 ㎍/ml의 항-IFN-α 항체에 의한 SLE 면역 복합체-유도 IFN의 억제를 나타낸다. 2명의 상이한 공여자(SLE 공여자 232 또는 293)로부터 SLE 면역 복합체(SLE IC)를 제조하였다. IFN-α와 IFN-ω의 조합 차단은, ISRE 검정을 사용하여 측정된 바와 같이, SLE IC-유도 IFN 활성의 향상된 억제를 가져왔다. HV IC 컨디셔닝된 배지 = 건강한 공여자로부터의 면역 복합체로 자극된 PBMC로부터의 컨디셔닝된 배지.
도 3은 지시된 바와 같이 IFN-αA 또는 IFN-ω로 자극된 6명의 건강한 개인으로부터의 PBMC로부터의 IP-10 분비의 유도를 나타낸다.
도 4a는 지시된 바와 같이 IFN-ω, IFN-α, IFN-ω와 항-IFN-ω 항체, 또는 IFN-α와 항-IFN-α 항체, 또는 동종형 대조군(iso)의 존재 하에서 분화된 DC의 존재 하에서의 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 나타낸다. IFN-ω 또는 IFN-α의 존재 하에서 분화된 DC는 동일한 정도로 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하였으며, 한편 항-IFN-ω 또는 항-IFN-α 중화 항체의 존재 하에서 분화된 DC는 CD4+ T 세포 분화를 유도하지 않았다. 분화된 DC를 정제된 CD4+ T 세포와 함께, 1:20의 DC: CD4+ T 세포 비로 배양하였다. 분비된 IFN-γ를 일수 6에 측정하였다. 데이터는 2개의 연구를 대표한다. 에러 바는 3회 반복된 루미넥스의 SD를 나타낸다. CONC: 농도.
도 4b는 지시된 바와 같이 IFN-ω, IFN-α, IFN-ω와 항-IFN-ω 항체, 또는 IFN-α와 항-IFN-α 항체, 또는 동종형 대조군(iso)의 존재 하에서 분화된 DC의 존재 하에서의 CD4+ T 세포에 의한 IL-17의 분비를 나타낸다. IFN-ω 또는 IFN-α의 존재 하에서 분화된 DC는 동일한 정도로 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하였으며, 한편 항-IFN-ω 또는 항-IFN-α 중화 항체의 존재 하에서 분화된 DC는 CD4+ T 세포 분화를 유도하지 않았다. 분화된 DC를 정제된 CD4+ T 세포와 함께, 1:20의 DC: CD4+ T 세포 비로 배양하였다. 분비된 IL-17을 일수 6에 측정하였다. 데이터는 2개의 연구를 대표한다. 에러 바는 3회 반복된 루미넥스의 SD를 나타낸다. CONC: 농도.
도 5a는 IFN-ω가 IFN-α와 동일한 정도로 T-세포 비의존성 B 세포 활성화를 유도함을 나타낸다. 형광 표지화된 항-CD86 항체를 사용하여 CD86 표면 발현에 의해 B 세포 활성화를 평가하였다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, CpG(ODN2006) 및/또는 항-B 세포 수용체(aBCR) 항체에 의해 T-세포 비의존성 B 세포 활성화를 유도하였다. IFN-ω 또는 IFN-α(IFN-αB2)를 지시된 농도로 사용하였다. 중위 형광을 측정하였다. 한 명의 공여자로부터 B 세포를 획득하였다. 결과를 2개의 반복 샘플의 평균값 ± SD로서 표현하였다.
도 5b는 IFN-ω가 IFN-α와 동일한 정도로 T 세포 비의존적 방식으로 활성화된 B 세포로부터 IL-6 분비를 유도함을 나타낸다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, CpG(ODN-2006) 및/또는 항-BCR 항체(aBCR)에 의해 T-세포 비의존성 B 세포 활성화를 유도하였다. IFN-ω 또는 IFN-α(IFN-α2B)를 지시된 농도로 사용하였다. IL-6 농도는 pg/ml로 나타나 있다. 한 명의 공여자로부터 B 세포를 획득하였다. 결과를 2개의 반복 샘플의 평균값 ± SD로서 표현하였다.
도 6은 IFN-ω가 IFN-α(IFN-αB2)와 동일한 정도로 인간 PBMC로부터 BLyS 분비를 유도함을 나타낸다. PBMC를 자극하기 위해 사용된 IFN-ω 또는 IFN-α의 농도는 X-축에 나타나 있다. BLyS 농도는 pg/ml로 나타나 있다. 결과는 2개의 반복 샘플의 평균값 ± SD로서 표현되어 있다.
도 7a는 IFN-ω/Fab IFWM371 복합체(항체에 대해서는 단지 Fv만이 도시되어 있음)의 전체 분자 구조를 나타낸다. 박스로 표시된 영역은 도 7b에 확대되어 있다. IFN-ω의 IFN-ω AB 루프(AB), E 나선(E) 및 D 나선(D)이 나타나 있다. 작은 원은 물 분자를 나타낸다. VL 및 VH 또는 IFWM371이 나타나 있다.
도 7b는 도 7a의 박스로 표시된 영역의 확대를 나타내는데, 이는 IFN-ω/Fab IFWM371 계면에서의 물 분자를 통해 매개된 수소 결합 네트워크(물 복합체(WC) 1, 2, 및 3)를 보여준다.
도 8a는 IFN-ω/Fab IFWM371 복합체 내의 에피토프를 나타낸다. IFN-ω 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 따른다.
도 8b는 IFN-ω/Fab IFWM371 복합체 내의 파라토프를 나타낸다. 잔기 Y32, Y92, T94 및 L96은 VL 내의 잔기이고, 잔기 W33, I50, D57, T58, R59, H99, P100, G101, L102, N103, W104, A105 및 D107은 IFN-ω와 접촉된 VH 내의 잔기이다. VL: 서열 번호 29; VH: 서열 번호 28. T94 및 A105는 이 도면에 나타나 있지 않다.
도 8c는 IFN-ω와 Fab IFWM371 사이의 2-차원 상호작용 맵을 나타낸다.박스로 표시된 잔기는 VL 파라토프 잔기이고, 원으로 표시된 잔기는 VH 파라토프 잔기이다. 회색으로 강조된 잔기는 IFN-ω 에피토프 잔기이다. VL, VH 및 IFN-ω 잔기의 넘버링은 각각 서열 번호 29, 28 및 1에 따른다. 반데르 발스(VDW) 상호작용 및 소수성 상호작용은 실선으로 나타나 있고, 정전기 결합 및 H 결합은 파선으로 나타나 있고, 화살표는 골격 상호작용을 나타내며, 이때 화살표는 골격 원자를 가리킨다. 대부분의 상호작용은 3개의 IFN-ω 에피토프 잔기 F27, L30 및 R33에 의해 형성된다.
도 9는 다양한 IFN-α 아형과의 IFN-ω의 정렬을 나타낸다. 화살표는 IFWM371이 결합하는 에피토프 잔기 나타낸다. F27, L30 및 R33은 IFWM371이 결합하지 않는 IFN-αD에서를 제외하고는, I형 IFN에 걸쳐 보존된다. 잔기 넘버링은 인간 IFN-ω 서열 번호 1(도면에서는 IFNω-01)에 따른다. IFNα-01/D/1: 서열 번호 18; IFNα-02/A: 서열 번호 5; IFNα-04/a/b: 서열 번호 15; IFNα-07/J: 서열 번호 13; IFNα-10/C: 서열 번호 7; IFNα-17/I: 서열 번호 12; IFNα-21/F: 서열 번호 9; IFNα-14/H: 서열 번호 11; IFNα-16/WA: 서열 번호 16; IFNα-08/B2: 서열 번호 6; IFNα-05/G: 서열 번호 10; IFNα-06/K: 서열 번호 14.
도 10은 ISRE 검정에서 다양한 I형 IFN에 대한 선택된 항체들에 대한 IC50 값을 나타낸다.
도 11a는 항-IFN-α/ω 항체에 의한, 인간 전혈 중에의 백혈구 IFN-유도 IP10 방출의 중화를 나타낸다. 백혈구 IFN(Lk)을 사용하여, 2명의 대상자로부터의 건강한 공여자 전혈에서 IP-10 분비를 유도하였다. 이 도면에 나타낸 바와 같이 다양한 농도(10 ㎍/ml 내지 10 pg/ml)의 항-IFN-α/ω 항체 IFWM3522 또는 IFWM3525와 함께 또는 이것 없이 백혈구 인터페론(LK)과 전혈을 인큐베이션하였다. 바는 2개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. 데이터는 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 전혈을 사용한 2개의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 11b는 항-IFN-α/ω 항체에 의한, 인간 전혈 중에의 백혈구 IFN-유도 IP-10 방출의 중화를 나타낸다. 백혈구 IFN(Lk)을 사용하여, 2명의 대상자로부터의 건강한 공여자 전혈에서 IP-10 분비를 유도하였다. 이 도면에 나타낸 바와 같이 다양한 농도(10 ㎍/ml 내지 10 pg/ml)의 항-IFN-α/ω 항체 IFWM3399 또는 동종형 대조군과 함께 또는 이것 없이 백혈구 인터페론(LK)과 전혈을 인큐베이션하였다. 바는 2개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. 데이터는 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 전혈을 사용한 2개의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 12a는 항-IFN-α/ω 항체에 의한, 인간 전혈 중에의 SLE 면역 복합체-유도 IP-10 방출의 중화를 나타낸다. 이 도면에 나타낸 바와 같이 다양한 농도(10 ㎍/ml 내지 10 pg/ml)의 항-IFN-α/ω 항체 IFWM3522 또는 IFWM3525와 함께 또는 이것 없이 SLE 면역 복합체-유도 인터페론 조제물과 전혈을 인큐베이션하였고, ELISA 키트를 사용하여 혈장으로부터 IP-10을 분석하였다. 바는 2개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. 데이터는 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 전혈을 사용한 4개의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 12b는 항-IFN-α/ω 항체에 의한, 인간 전혈 중에의 SLE 면역 복합체-유도 IP-10 방출의 중화를 나타낸다. 이 도면에 나타낸 바와 같이 다양한 농도(10 ㎍/ml 내지 10 pg/ml)의 항-IFN-α/ω 항체 IFWM3399 또는 동종형 대조군과 함께 또는 이것 없이 SLE 면역 복합체-유도 인터페론 조제물과 전혈을 인큐베이션하였고, ELISA 키트를 사용하여 혈장으로부터 IP-10을 분석하였다. 바는 2개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. 데이터는 2명의 상이한 인간 공여자로부터의 전혈을 사용한 4개의 독립적인 실험의 대표적인 결과이다.
도 13a는 이 도면에 나타낸 바와 같은 다양한 농도(㎍/ml)에서 24시간 동안 IFN-α/ω 항체 IFWM2423 또는 동종형 대조군에 대한 SLE 환자 혈액의 시험관내 노출 후에 혈액에서의 MX1 유전자 발현의 정규화를 나타낸다. 바는 3개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. MX1 유전자 발현을 β-액틴에 대해 정규화하였다.
도 13b는 이 도면에 나타낸 바와 같은 다양한 농도(㎍/ml)에서 24시간 동안 IFN-α/ω 항체 IFWM3522 및 IFWM2525 또는 동종형 대조군에 대한 SLE 환자 혈액의 시험관내 노출 후에 혈액에서의 MX1 유전자 발현의 정규화를 나타낸다. 바는 3개의 반복 웰로부터의 평균을 나타내고, 에러 바는 그들로부터의 SD를 나타낸다. MX1 유전자 발현을 β-액틴에 대해 정규화하였다.
도 14a는 IFN-ω/M341 구조에서 항체/항원 계면에서의 물 분자 및 M371의 VH와 에피토프 잔기 R33 사이의 수소(H) 결합 상호작용을 나타낸다.
도 14b는 IFN-ω/M3421 구조에서 물 분자 및 M3421의 VH와 에피토프 잔기 R33 사이의 변형된 H 결합 상호작용을 나타낸다.
도 14c는 M371의 성숙 시에의 서열 변화(L96I 돌연변이) 및 구조 변화를 나타낸다. M371 구조에서, VH의 F108은 2개의 대안적인 입체구조를 갖는 것으로 가장 잘 기재되어 있다. M3421 구조에서, 이들은 하나의 입체구조로 전환되는데, 이는 VH와 VL 사이의 더 조밀한 패킹을 시사한다. 게다가, VH의 W47의 측쇄 회전이성질체 플립(flip)이 존재한다.
도 14d는 M371 성숙 시에의 서열 변화 및 구조 변화를 나타낸다. VL Y32를 더 소수성인 F로 돌연변이시켜서(Y32F), M371 내의 Y32와 IFN-ω 사이의 2개의 H 결합을 제거하였다. VL A50을 F로 돌연변이시켰다(A50F). 이 잔기는 항원과 직접 접촉하지 않고, 항원과 접촉하는 VH의 W104에 대해 스택(stack)한다. 2개의 다른 변화(S31G 및 S30D)는 항원 결합에 관여하지 않거나 또는 A50F와 같은 결합 잔기에 직접 영향을 주지 않는다. 이들 잔기 변화는 국소 소수성에 영향을 주고 용매 상호작용을 최적화할 가능성이 높다.
도 15는 IFN-ω와 Fab IFWM3421 사이의 2-차원 상호작용 맵을 나타낸다.박스로 표시된 잔기는 VL 파라토프 잔기이고, 원으로 표시된 잔기는 VH 파라토프 잔기이다. 회색으로 강조된 잔기는 IFN-ω 에피토프 잔기이다. VL, VH 및 IFN-ω 잔기의 넘버링은 각각 서열 번호 28, 71 및 1에 따른다. 반데르 발스(VDW) 상호작용 및 소수성 상호작용은 실선으로 나타나 있고, 정전기 결합 및 H 결합은 파선으로 나타나 있고, 화살표는 골격 상호작용을 나타내며, 이때 화살표는 골격 원자를 가리킨다. 대부분의 상호작용은 3개의 IFN-ω 에피토프 잔기 F27, L30 및 R33에 의해 형성된다.
도 16은 IFN-ω와 IFWM3525의 Fab 사이의 2-차원 상호작용 맵을 나타낸다.박스로 표시된 잔기는 VL 파라토프 잔기이고, 원으로 표시된 잔기는 VH 파라토프 잔기이다. 회색으로 강조된 잔기는 IFN-ω 에피토프 잔기이다. VL, VH 및 IFN-ω 잔기의 넘버링은 각각 서열 번호 28, 71 및 1에 따른다. 반데르 발스(VDW) 상호작용 및 소수성 상호작용은 실선으로 나타나 있고, 정전기 결합 및 H 결합은 파선으로 나타나 있고, 화살표는 골격 상호작용을 나타내며, 이때 화살표는 골격 원자를 가리킨다. 대부분의 상호작용은 3개의 IFN-ω 에피토프 잔기 F27, L30 및 R33에 의해 형성된다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이로 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 기재된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "결합한다"는 항체가 항원 또는 항원 내의 에피토프(epitope)에 대해 다른 항원들에 대한 친화성보다 더 큰 친화성으로 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 1×10-8 M 이하, 예를 들어 1×10-9 M 이하, 1×10-10 M 이하, 1×10-11 M 이하, 또는 1×10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 항원 또는 항원 내의 에피토프에 결합하며, 이때 전형적으로 KD는 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하기 위한 그의 KD보다 적어도 10배 더 적다. 해리 상수는 표준 절차를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나, 항원 또는 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 관련 항원들과의, 예를 들어 다른 종(호모로그), 예컨대 인간 또는 원숭이, 예를 들어 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)(사이노몰거스(cynomolgus), 사이노(cyno)) 또는 판 트로글로디테스(Pan troglodytes)(침팬지, 침프(chimp))로부터의 동일한 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있다. 항원 또는 항원 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 적어도 하나의 인터페론 알파(IFN-α) 아형 및 인터페론 오메가(IFN-ω)와 같은 2개 이상의 별개의 항원들 사이에서 공유되는 에피토프와 추가로 결합할 수 있으며; 즉, 항체는 IFN-α 아형 및 IFN-ω와 교차-반응한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중화시키는" 또는 "중화시킨다" 또는 "중화 항체" 또는 "항체 길항제"는 재조합 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및/또는 적어도 하나의 재조합 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 IFN-α 및/또는 IFN-ω 생물학적 활성에 대한 검정을 사용하여 중화 항체가 확인될 수 있다. IFN-α 및/또는 IFN-ω 중화 항체는 측정된 IFN-α 및/또는 IFN-ω 생물학적 활성을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%만큼 억제할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인터페론-α"(IFN-α)는 인간 알파 인터페론의 모든 천연 아형을 지칭한다. 천연 IFN-α는 고도의 구조적 상동성을 갖는 별개의 유전자들에 의해 인코딩되는 적어도 12개의 근연 단백질 아형으로 이루어진다(문헌[Weissmann and Weber, Prog Nucl Acid Res Mol Biol.,33: 251, 1986]; 문헌[Roberts et al.,J Interferon Cytokine Res.18: 805-816, 1998]). 인간 인터페론에 대한 명명법은 http://www_genenames_org/genefamilies/_IFN에서 확인된다. 표 4는 본 명세서에 사용된 IFN-α 아형의 서열과, 이에 더하여 다른 I형 IFN의 서열을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 IFN-ω는 서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 IFN-ω 및 유니프로트(UniProt) 기탁 번호 P05000을 지칭한다. 인간 IFN-ω는 또한 위치 80에서의 트레오닌(T80)의 글루탐산으로의 치환을 갖는 서열 번호 2의 변이체를 포함한다.
용어 "I형 인터페론" 또는 "IFN-I"은 인간 인터페론-α의 모든 천연 아형 및 인터페론-β, 인터페론-ε, 인터페론-ω 및 인터페론-κ의 하나의 아형을 지칭하며, 이들은 공통 인터페론 수용체 IFNAR에 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IFNAR"은 잘 알려진 인터페론 수용체를 지칭하며, 이는 이종이량체 또는 IFNAR1 및 IFNAR2이다. IFNAR1 및 IFNAR2 단백질 서열은 각각 서열 번호 26 및 27에 나타나 있다. IFNAR1 성숙 세포외 도메인은 서열 번호 26의 잔기 28 내지 436에 걸쳐 이어지고, IFNAR2 성숙 세포외 도메인은 서열 번호 27의 잔기 27 내지 243에 걸쳐 이어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 광의를 의미하며, 다중클론 항체, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함한 단일클론 항체, 항체 단편, 적어도 2개의 온전한 항체 또는 항체 단편으로부터 형성된 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 단일쇄 항체, 도메인 항체를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류화된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄들은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개의 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예컨대 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 2 및 3, 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 2 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부분을 지칭한다.항체 단편은 잘 알려진 Fab, F(ab')2, Fd, 및 Fv 단편뿐만 아니라, 하나의 VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb)도 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에 분자내에서, 또는 분자간에 쌍을 이루어서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성하며, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO1998/44001호, 국제 특허 출원 공개 WO1988/01649호, 국제 특허 출원 공개 WO1994/13804호, 국제 특허 출원 공개 WO1992/01047호에 기재되어 있다.
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 항원-결합 부위는 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR) - VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3) - 은 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970]; 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]).(ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV" - VH 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개(L1, L2, L3) - 는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조 내에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987]). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]) 및 "특이성 결정 잔기 용법(Specificity Determining Residue Usage)"(SDRU)(문헌[Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004])을 포함한다. 인터내셔널 이뮤노진틱스(International ImMunoGeneTics, IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 넘버링과 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 도해 사이의 관련성은 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일클론 항체"는 단일 분자 조성을 갖는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 단일클론 항체는 비특이성 또는 다중특이성일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "초티아 잔기"는 알-라지카니(Al-Lazikani)에 따라 넘버링된 항체 VL 및 VH 잔기이다(문헌[Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997]).
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 것 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위가 전술된 바와 같은 다양한 용어로 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원-결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.
"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다.
"인간-적응화" 항체 또는 "인간 프레임워크 적응화(human framework adapted, HFA)" 항체는 미국 특허 출원 공개 제2009/0118127호에 기재된 방법에 따라 적응된 인간화 항체를 지칭한다. 인간-적응화 항체는 최대 CDR 및 FR 유사성, 길이 적합성(length compatibility), 및 CDR1 및 CDR2 루프와 경쇄 CDR3 루프의 일부분의 서열 유사성에 기초하여 억셉터 인간 프레임워크를 선택함으로써 인간화된다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 영역 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 이 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.
인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 예시적인 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자도입 인간 이외의 동물, 예컨대 마우스를 포함한다. "인간 항체"는 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 서열과 비교할 때 아미노산 차이를 포함할 수 있는데, 이는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 치환의 의도적 도입에 기인한다. 전형적으로, "인간 항체"는 아미노산 서열이 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 또는, 예를 들어 문헌[Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96, 2010] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다.
단리된 인간화 항체는 합성 항체이다. 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 도입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 또는 시험관내 돌연변이생성(in vitro mutagenesis)을 거쳐서 항체 특성을 개선하여, 그 결과 생체내(in vivo)에서 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에는 천연적으로 존재하지 않는 항체를 생성할 수 있다.
인간 항체는 프레임워크 내에 또는 항원 결합 부위 내에 치환을 포함할 수 있어서, 이는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있다. 그러나, 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 또는 단리된 항체 및 다른 단백질, 예컨대, 다양한 IFN-α 아형 또는 IFN-ω를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이중특이성"은 2개의 별개의 항원 또는 항원 내의 2개의 별개의 에피토프와 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 다른 관련 항원들과의 교차-반응성을 가질 수 있거나 또는 적어도 하나의 IFN-α 아형 및 IFN-ω와 같은 2개 이상의 별개의 항원들 사이에서 공유되는 에피토프와 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "와 병용하여"는 약물 또는 치료제가 동물 종, 예컨대 인간에게 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 또는 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IFN-α 생물학적 활성" 및 "IFN-ω 생물학적 활성"은 각각 IFN-α 및 IFN-ω가 그의 수용체 IFNAR에 결합한 결과로서 일어나는 임의의 활성을 지칭한다. 하나의 IFN-α 및 IFN-ω 생물학적 활성은, 표준 방법을 사용하여 신호 전달물질 및 전사 활성화인자 2(signal transducer and activator of transcription 2, STAT2), 인터페론 조절 인자 9(interferon regulatory factor, IRF9) 및 분비 배아 알칼리성 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서 ISG54와 같은 인터페론 유도성 프로모터 하에서 IFN-α 및 IFN-ω가 SEAP 발현을 유도하는 능력이다. 다른 IFN-α 및 IFN-ω 생물학적 활성은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 또는 전혈로부터의 케모카인 IP-10(CXCL10) 생성의 유도이다.
용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있는 또는 그러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 돕는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템을 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-포스페이트 골격 또는 다른 등가의 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
표 1에 나타낸 바와 같은 종래의 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다:
[표 1]
Figure 112017005865411-pct00003
대상 조성물
본 발명은 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 다수의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 활성을 중화시키는 단일클론 항체(항-IFN-α/ω 항체)를 제공한다. 본 발명은 IFN-α 단독의 면역조절 효과와 유사한 면역조절 효과에 의한 루푸스 발병기전에서의 INF-ω의 역할에 대한 이해에 적어도 부분적으로 기초한다. IFN-ω는 루푸스 환자의 혈청에 존재하고 거기서 활성인 것으로 밝혀졌으며, IFN-ω는 IFN-α와 대비하여 유사한 사이토카인 방출 및 유전자 발현 프로파일, 수지상 세포 분화, 및 T-세포 비의존성 B 세포 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌으며; 이는 치료적 효과를 최대화하기 위하여 IFN-α 및 IFN-ω 둘 모두의 중화에 대한 이론적 근거의 기초를 마련해준다. 본 발명은 또한 본 발명의 IFN-α/ω 항체가 결합하는 IFN-ω 및 다수의 IFN-α 아형에 의해 공유되는 최소한의 중화 에피토프의 확인에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 발명의 IFN-α/ω 항체는 IFN-ω 및 다수의 IFN-α 아형을 고효능으로 중화시킬 수 있으며, 이에 따라 이는, I형 IFN 및 IFN 시그너처의 SLE-관련 조제물을 중화시키는 데 있어서, 다수의 IFN-α 아형은 중화시키지만 IFN-ω는 중화시키지 않는 항체보다 더 강력할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 면역-매개 염증성 질병, 또는 루푸스를 포함한 자가면역 질병을 치료하는 데 더 효능이 있을 수 있다. 본 발명의 IFN-α/ω 항체는 IFN-β를 중화시키지 않기 때문에, 모든 I형 IFN을 차단할 것으로 예상되는 항-IFNAR 요법과 대비하여, 이는 더 유리한 안전성 및 PK 프로파일을 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 일 실시 형태는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 단일클론 항체이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 인간 IFN-ω의 활성이 신호 전달물질 및 전사 활성화인자 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9) 및 분비 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서의 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에서의 SEAP의 인간 IFN-ω-유도 발현인 경우에, 적어도 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-11 M 이하의 IC50으로 인간 IFN-ω의 활성을 중화시킨다(본 명세서에 기재된 바와 같은 "ISRE 검정").
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형을 중화시키며, 이때 이들 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형은 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αG, IFN-αH2 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-αK를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αWA 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IFN-ω, 및 IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항체는 IFN-ω를 중화시키는 것에 더하여 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 IFN-α 아형과 결합하여 이들을 중화시킬 수 있다. IFN-α 아형 및 IFN-ω는 표준 방법을 사용하여 재조합 발현에 의해 생성될 수 있다. 분비를 유도하는 데 사용될 수 있는 예시적인 신호 서열은 서열 번호 21-25에 나타나 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항체는, 인터페론 반응성 프로모터 하에서 리포터 유전자를 발현하는 세포주를 사용하고, 다양한 IFN-α 아형 및/또는 IFN-ω로 세포를 자극하는 리포터 유전자 검정에서 IFN-α 및 IFN-ω를 중화시키는 그들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, (STAT2 및 IRF9를 안정적으로 발현하는) 완전 활성 I형 IFN 신호전달 경로를 발현하도록 조작되고 IFNα/β 유도성 ISG54 프로모터의 제어 하에서 SEAP 리포터 유전자로 형질감염된 HEK-블루(HEK-Blue)™ IFN-α/β 세포(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비보젠(InvivoGen))가 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 알칼리성 포스파타제로부터의 신호가 검출될 수 있고, 잘 알려진 방법을 사용하여 억제에 대한 IC50이 계산될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 본 명세서에서 실시예 1에 기재된 바와 같은 검정 "ISRE 리포터 유전자 검정"을 사용하여, 인간 IFN-ω의 생물학적 활성이 신호 전달물질 및 전사 활성화인자 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9) 및 분비 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서의 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에서의 SEAP 발현의 억제인 경우에, 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-11 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"에서 측정될 때, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"에서 측정될 때, 약 1×10-10 M 내지 약 6×10-12 M의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시킨다. 당업자는 ISRE 리포터 유전자 검정에 대한 검정 편차(assay deviation)가 전형적으로 약 0.28 (log (M))의 pIC50 내에 대략적으로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "약"은 이 검정에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10-9 M의 IC50에 대한 전형적인 SD는 약 0.53×10-9 내지 1.9×10-9이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 적어도 약 2×10-10 M 이하, 약 1.5 × 10-10 M 이하, 또는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 IFN-α 아형의 생물학적 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50 값이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"을 사용하여 측정될 때, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 활성을, 그리고 약 2×10-10 M 이하, 약 1.5 × 10-10 M 이하, 또는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 6개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50 값이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"을 사용하여 측정될 때, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 활성을, 그리고 약 2×10-10 M 이하, 약 1.5 × 10-10 M 이하, 또는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 10개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50 값이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"을 사용하여 측정될 때, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 활성을, 그리고 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 6개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, IC50 값이 본 명세서에 기재된 "ISRE 리포터 유전자 검정"을 사용하여 측정될 때, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 활성을, 그리고 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 10개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 250 U/ml의 인터페론에 의해 유도되는 전혈 중에의 백혈구 인터페론-유도 IP-10 방출을, 10 ㎍/ml의 항체의 존재 하에서는 그러한 항체의 부재 하에서보다 약 50% 이상 억제한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 전혈 중에의 전신 홍반성 루푸스(SLE) 면역 복합체-유도 IP-10 방출을, 10 ㎍/ml의 항체의 존재 하에서는 그러한 항체의 부재 하에서보다 약 50% 이상 억제한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항체는, IFN-유도 사이토카인 방출, 예컨대 IFN-유도 말초 혈액 단핵구(PBMC) 또는 전혈로부터의 IP-10 방출을 억제하는 그의 능력을 평가함으로써, 그의 중화 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 표준 프로토콜을 사용하여 건강한 지원자로부터의 헤파린 첨가 전혈로부터 PBMC를 단리하고, 시험하고자 하는 항체와 IFN의 사전형성된 복합체로 처리하고, 밀리플렉스(Milliplex) 사이토카인/케모카인 키트(밀리포어(Millipore), 프리믹스드 39 플렉스(Premixed 39 plex))와 같은 표준 방법을 사용하여 IP-10 방출을 측정한다. 본 발명의 항체는, 그러한 항체의 부재 하에서의 IFN-유도 IP-10 방출과 대비하여, IP-10 방출을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 억제할 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 약 1×10-11 M 이하 또는 약 5×10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 인간 IFN-ω와 결합한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 약 5×10-10 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 약 1×10-11 M 이하, 또는 약 5×10-12 M 이하의 KD로 IFN-ω 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형과 결합하며, 이때 이들 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형은 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IFN-ω에 대한 또는 다양한 IFN-α 아형에 대한 항체의 친화도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 알려진 프로테온(ProteOn) XPR36, 바이아코어(Biacore) 3000 또는 KinExA 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 검정을 이용할 수 있다. 특정 항체/IFN-ω 또는 항체/IFN-α 아형 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 오스몰 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 표준화된 조건, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다.예를 들어, 바이아코어 3000 또는 프로테온을 사용하는 친화도 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)는 전형적인 검출 한계 내에서의 측정에 대해 전형적으로 5 내지 33% 이내일 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 용어 "약"은 이 검정에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10-9 M의 KD에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33×10-9 M이다.
원하는 친화도 및 중화 프로파일로 인간 IFN-ω 및 IFN-α 아형과 결합하는 항체는, 인간 IFN-ω 및/또는 IFN-α 아형을 사용하여 패닝(panning)함으로써 그리고 선택적으로 추가의 항체 친화도 성숙에 의해 변이체 또는 단편의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예시적인 패닝 캠페인에서는, 침팬지 IFN-ω 및 인간 IFN-α 아형 IFN-α2, IFN-α1, IFN-αH2, IFN-αG 및 IFN-αF의 혼합물을 사용하거나 또는 순차적으로 파지 라이브러리들이 패닝될 수 있다. 대안적으로는, 침팬지 및 사이노몰거스 IFN-ω, 인간 IFN-α 아형 IFN-αD, IFN-αJ1, IFN-αC, IFN-αB2, IFN-αH2, IFN-αA, IFN-α4a, IFN-αG, IFN-αF, IFN-αWA 및 IFN-αI로 마우스를 면역화하고, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 IFN-ω 및 다양한 IFN-α 아형에 대한 결합에 대하여 이들 하이브리오마(hybrioma)를 스크리닝하고, 이어서 이들 항체의 중화 능력을 평가함으로써 본 발명의 항체가 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 각각 서열 번호 109, 114 및 121의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2) 및 3(HCDR3) 아미노산 서열, 및 서열 번호 118, 119 및 120의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 2(LCDR2) 및 3(LCDR3) 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 그러한 항체는 항체 IFWM3308, IFWM3307, IFWM3410, IFWM3322, IFWM3385, IFWM3416, IFWM3310, IFWM3400, IFWM3321, IFWM3522, IFWM3524, IFWM3320, IFWM3304, IFWM3520, IFWM3399, IFWM3314, IFWM3331, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 및 IFWM3421이다. 이들 항체는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω 및 적어도 3개의 IFN-α 아형을 중화시키고, 공통 LCDR1(서열 번호 118), LCDR2(서열 번호 119), LCDR3(서열 번호 120), HCDR2(서열 번호 114) 및 HCDR3(서열 번호 121) 아미노산 서열 및 불변 HCDR1(서열 번호 109) 아미노산 서열을 포함한다. 적어도 서열 번호 28, 31, 157 또는 158의 VH 잔기 위치 103에서, 서열 번호 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 71, 73, 75 또는 135의 VL 잔기 위치 30, 31, 32, 50, 91-94 또는 96에서, 그리고 서열 번호 57, 61, 62, 68 및 150의 VL 잔기 위치 30, 31, 32, 50, 51, 92-95 또는 97에서 치환을 갖는 항체는 모 IFWM371 항체와 대비하여 개선된 효력을 갖는 항체를 생성하였다.
서열 번호 118
QSIX1X2X3X4; 여기서,
X1은 G, D, A, R, E, S, 또는 N이고;
X2는 D, G, N, S, R, E 또는 K이고;
X3은 F, A, N, T, S 또는 V이고;
X4는 Y, N이거나 또는 결실된다.
서열 번호 119
X5AS; 여기서,
X5는 F, W 또는 G이다.
서열 번호 120
QQX6X7X8X9PX10T; 여기서,
X6은 A, G, S 또는 W이고;
X7은 L, Y, H, W, F 또는 I이고;
X8은 D 또는 S이고;
X9는 F, T, L, N 또는 W이고;
X10은 L, F 또는 I이다.
서열 번호 114
IX11X12SDSDT; 여기서,
X11은 D 또는 A이고;
X12는 P 또는 A이다.
서열 번호 121
ARHPGLX13WAPDFDY; 여기서,
X13은 A 또는 N이다.
서열 번호 109
GYSFTSYW
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 114, 121, 159, 119 및 160의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 그러한 항체는 항체 IFWM3400, IFWM3321, IFWM3522, IFWM3524, IFWM3320, IFWM3304, IFWM3520, IFWM3399, IFWM3314, IFWM3331, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 및 IFWM3421이다. 이들 항체는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω 및 적어도 6개의 IFN-α 아형을 중화시키고, 공통 LCDR1(서열 번호 159), LCDR2(서열 번호 119), LCDR3(서열 번호 160), HCDR2(서열 번호 114) 및 HCDR3(서열 번호 121) 아미노산 서열 및 불변 HCDR1(서열 번호 109) 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 159
QSIX14X15X16X17; 여기서,
X14는 G, D, A, E, S, 또는 N이고;
X15는 D, G, N, S 또는 R이고;
X16은 F, A, N, S 또는 V이고;
X17은 Y, N이거나 또는 결실된다.
서열 번호 160
QQX18X19X20X21PX22T; 여기서,
X18은 A, G 또는 S이고;
X19는 Y, H, W 또는 F이고;
X20은 D 또는 S이고;
X21은 F, T, L 또는 W이고;
X22는 L, F 또는 I이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 114, 121, 161, 119 및 162의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 그러한 항체는 항체 IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 및 IFWM3421이다. 이들 항체는 적어도 약 2×10-10 M 이하, 약 1.5×10-10 M 이하, 또는 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω 및 적어도 10개의 IFN-α 아형을 중화시키고, 공통 LCDR1(서열 번호 161), LCDR2(서열 번호 119), LCDR3(서열 번호 162), HCDR2(서열 번호 114) 및 HCDR3(서열 번호 121) 서열 및 불변 HCDR1(서열 번호 109) 서열을 포함한다.
서열 번호 161
QSIX23X24X25X26; 여기서,
X23은 A 또는 D이고;
X24는 N 또는 G이고;
X25는 F, N 또는 S이고;
X26은 Y, N이거나 또는 결실된다.
서열 번호 162
QQX27X28X29X30PX31T; 여기서,
X27은 G 또는 S이고;
X28은 Y이고;
X29는 D이고;
X30은 F, T 또는 L이고;
X31은 L, F 또는 I이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 IFN-ω 및 적어도 10개의 인간 IFN-α 아형을 중화시키며, 이때 이들 인간 IFN-α 아형은 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 IFN-ω 및 적어도 인간 IFN-α 아형 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-α4a를 중화시킨다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 IFN-αD 또는 IFN-α1과 결합하지 않거나 이를 중화시키지 않는다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 IFN-β와 결합하지 않거나 이를 중화시키지 않는다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는
서열 번호 109의 HCDR1 아미노산 서열;
서열 번호 111, 112 또는 113의 HCDR2 아미노산 서열;
서열 번호 115 또는 116의 HCDR3 아미노산 서열;
서열 번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 또는 91의 LCDR1 아미노산 서열;
서열 번호 93, 94 또는 95의 LCDR2 아미노산 서열; 및
서열 번호 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107의 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는,
a) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 77, 93 및 104;
b) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 85, 93 및 96;
c) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 79, 95 및 107;
d) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 76, 93 및 103;
e) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 85, 93 및 96;
f) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 89, 95 및 100;
g) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 86, 93 및 105;
h) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 76, 93 및 103;
i) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 80, 93 및 97;
j) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 84, 93 및 97;
k) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 90, 93 및 97;
l) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 88, 93 및 102;
m) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 87, 93 및 105;
n) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 91, 93 및 106;
o) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 80, 93 및 97;
p) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 83, 93 및 101;
q) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 98;
r) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 78, 95 및 100;
s) 각각 서열 번호 109, 111, 116, 81, 93 및 106;
t) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 99;
u) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 81, 93 및 106;
v) 각각 서열 번호 109, 112, 116, 81, 93 및 106; 또는
w) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 77, 93 및 104의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 85, 93 및 96의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 79, 95 및 107의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 76, 93 및 103의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 85, 93 및 96의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 89, 95 및 100의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 86, 93 및 105의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 76, 93 및 103의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 80, 93 및 97의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 84, 93 및 97의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 90, 93 및 97의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 88, 93 및 102의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 87, 93 및 105의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 91, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 80, 93 및 97의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 83, 93 및 101의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 98의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 78, 95 및 100의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 111, 116, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 99의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 115, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 112, 116, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 각각 서열 번호 109, 113, 116, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VH는 서열 번호 28, 31, 157 또는 158의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VL은 서열 번호 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 또는 150의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 28, 31, 157 또는 158의 VH, 및 서열 번호 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 또는 150의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28 및 40, 28 및 39, 31 및 62, 28 및 54, 31 및 39, 31 및 68, 28 및 42, 31 및 54, 28 및 53, 28 및 73, 28 및 75, 28 및 52, 28 및 35, 28 및 135, 31 및 53, 28 및 46, 28 및 61, 31 및 57, 157 및 71, 28 및 150, 31 및 71, 158 및 71, 또는 28 및 71의 VH 및 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VH는 서열 번호 28, 30, 31, 157 또는 158의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 28, 30, 31, 157 또는 158의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열, 및 서열 번호 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 또는 153의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 CDR은 카밧(Kabat), 초티아 및/또는 IMGT에 따라 정의된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VL은 서열 번호 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 또는 153의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 여기서 VH는 서열 번호 28, 30, 31, 157 또는 158의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호 29, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 74, 148, 149, 150, 151, 152 또는 153의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 29의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 32의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 33의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 34의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 35의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 36의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 37의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 38의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 39의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 40의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 41의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 42의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 43의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 44의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 45의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 46의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 47의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 48의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 49의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 50의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 51의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 53의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 54의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 55의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 56의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 57의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 58의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 59의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 60의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 61의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 62의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 63의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 64의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 65의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 66의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 68의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 69의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 32의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 33의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 34의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 35의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 36의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 37의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 38의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 39의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 40의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 41의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 42의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 43의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 44의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 45의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 46의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 47의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 48의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 49의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 50의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 51의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 53의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 30의 VH 및 서열 번호 54의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 33의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 47의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 49의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 50의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 51의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 52의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 53의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 54의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 56의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 57의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 58의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 59의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 60의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 61의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 66의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 67의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 68의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 70의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 31의 VH 및 서열 번호 71의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 123의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 124의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 125의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 126의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 127의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 128의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 129의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 130의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 131의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 132의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 133의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 134의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 135의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 136의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 137의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 138의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 139의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 140의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 141의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 73의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 142의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 143의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 74의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 75의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 144의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 145의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 146의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 147의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 148의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 149의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 150의 VL을 포함한다.
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본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 152의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 153의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 157의 VH 및 서열 번호 71의 VL을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 158의 VH 및 서열 번호 71의 VL을 포함한다.
표 9, 표 13, 표 15, 표 17, 표 19 및 표 21에 나타낸 VH 또는 VL 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 항-IFN-ω/α 항체의 변이체는 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 변이체는, 항체 특성에 불리한 영향을 주지 않는, VH 및/또는 VL 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 서열 동일성은 본 발명의 VH 또는 VL 아미노산 서열에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 수 있다. 퍼센트 동일성은, 예를 들어 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인엑스(AlignX) 모듈(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))의 기본 설정을 사용하여 쌍별 정렬(pairwise alignment)에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 변형은, 예를 들어, 항체의 특성을 불리하게 변경시키지 않는, 항원-결합 부위 내의 또는 프레임워크 내의 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 또한 항체 특성, 예를 들어 안정성 또는 친화성을 개선하도록 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 측쇄에서 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것들이다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 하기 4개의 패밀리로 나눌 수 있다: (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘); (3) 비극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 및 (4) 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 공동으로 분류된다. 대안적으로, 아미노산 레퍼토리(repertoire)는 하기로 그룹화될 수 있다: (1) 산성(아스파르테이트, 글루타메이트); (2) 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘), (3) 지방족(글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌) - 이때, 세린 및 트레오닌은 별도로 지방족-하이드록실로서 선택적으로 분류함 -; (4) 방향족(페닐알라닌, 티로신, 트립토판); (5) 아미드(아스파라긴, 글루타민); 및 (6) 황-함유(시스테인 및 메티오닌)(문헌[Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981]). 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al (1998) Adv. Biophys. 35:1-24]) 원하는 아미노산 치환은 그러한 치환이 요구되는 때에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 생성되는 항체 변이체들은 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 그들의 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 71과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 150과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 71과 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 95% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 150과 적어도 95% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 97% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 71과 적어도 97% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 서열 번호 28과 적어도 97% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 150과 적어도 97% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산 치환은, 예를 들어 PCR 돌연변이생성에 의해 행해질 수 있다(미국 특허 제4,683,195호). 대안적으로, 변이체의 라이브러리를 알려진 방법을 사용하여 생성할 수 있는데, 예를 들어 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 DVK 코돈 - 이는 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 인코딩함 - 을 사용하고, 원하는 특성을 갖는 변이체에 대해 라이브러리를 스크리닝하여 생성할 수 있다.
실시예에 예시된 실시 형태가 중쇄로부터의 하나의 가변 영역 및 경쇄로부터의 하나의 가변 영역으로 된 가변 영역들의 쌍을 포함할지라도, 숙련자는 대안적인 실시 형태가 단일의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역들을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일의 가변 영역을 사용하여, 예를 들어, 인간 IFN-ω 또는 다양한 인간 IFN-α 아형들에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인들에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO92/01047호에 개시된 계통적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 접근법에서는, H 또는 L 쇄 클론 중 하나를 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여, 다른 쇄(L 또는 H)를 인코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-쇄 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다. 따라서, 개별 VH 및 VL 폴리펩티드 쇄는 국제 특허 출원 공개 WO92/01047호에 개시된 방법을 사용하여 인간 IFN-ω 또는 다양한 IFN-α 아형에 특이적으로 결합하는 추가적인 항체를 확인하는 데 유용하다.
본 발명의 항체는 항체를 생성하는 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법이 단일클론 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터, 래트 또는 원숭이를 인간 IFN-ω 및/또는 다양한 IFN-α 아형 또는 이들 단백질의 단편으로 면역화한 후, 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 표준 방법을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 단일 불멸화(immortalized) 하이브리도마 세포로부터 발생되는 콜로니를 원하는 특성, 예컨대 항원에 대한 결합의 특이성, 교차-반응성 또는 그의 결여, 및 친화성을 갖는 항체의 생성에 대해 스크리닝한다.
본 발명의 IFN-α/ω항체를 생성하기 위해 다양한 숙주 동물이 사용될 수 있다.예를 들어, 마우스 항-인간 IFN-α/ω 항체를 생성하기 위해 Balb/c 마우스가 사용될 수 있다. Balb/c 마우스 및 다른 인간 이외의 동물에서 제조된 항체는 더 인간-유사한 서열을 생성하기 위하여 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 인간 억셉터 프레임워크의 선택을 포함한 예시적인 인간화 기법은 당업자에게 알려져 있고, CDR 이식(grafting)(미국 특허 제5,225,539호), SDR 이식(미국 특허 제6,818,749호), 재표면화(Resurfacing)(문헌[Padlan, Mol Immunol 28:489-499, 1991]), 특이성 결정 잔기 재표면화(Specificity Determining Residues Resurfacing)(미국 특허 출원 공개 제20100261620호), 인간-적응화(또는 인간 프레임워크 적응화)(미국 특허 출원 공개 제2009/0118127호), 초인간화(Superhumanizatio)(미국 특허 제7,709,226호) 및 유도된 선택(guided selection)(문헌[Osbourn et al (2005) Methods 36:61-68, 2005]; 미국 특허 제5,565,332호)을 포함한다.
인간화 항체는, 국제 특허 출원 공개 WO90/007861호에 그리고 국제 특허 출원 공개 WO92/22653호에 기재된 바와 같이 개시된 것들과 같은 기법들에 의해, 변경된 프레임워크 지지 잔기를 도입시켜 결합 친화도를 보존함으로써(복귀 돌연변이(backmutation)) 원하는 항원에 대한 그의 선택성 또는 친화성을 개선하도록 추가로 최적화될 수 있다.
게놈 내에 인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 보유하는 유전자도입 마우스가 표적 단백질에 대한 인간 항체를 생성하는 데 사용될 수 있고, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO90/04036호, 미국 특허 제6150584호, 국제 특허 출원 공개 WO99/45962, 국제 특허 출원 공개 WO02/066630호, 국제 특허 출원 공개 WO02/43478호, 문헌[Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9]; 문헌[Green et al (1994) Nature Genet. 7:13-21]; 문헌[Green & Jakobovits (1998) Exp. Med. 188:483-95]; 문헌[Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93]; 문헌[Bruggemann et al (1991) Eur. J. Immunol. 21:1323- 1326]; 문헌[Fishwild et al (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851]; 문헌[Mendez et al (1997) Nat. Genet. 15:146-156]; 문헌[Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23]; 문헌[Yang et al (1999) Cancer Res. 59:1236-1243]; 문헌[
Figure 112017005865411-pct00004
(1997) Curr . Opin . Biotechnol. 8:455-458]; 국제 특허 출원 공개 WO02/043478호에 기재되어 있다. 그러한 마우스 내의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴 또는 결실될 수 있고, 적어도 하나의 완전한 또는 부분적인 인간 면역글로불린 유전자좌가 상동적 또는 비상동적 재조합을 사용하거나, 도입염색체(transchromosome)를 사용하거나, 또는 미니유전자(minigene)를 사용하여 마우스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 리제너론(Regeneron)(http://_www_regeneron_com), 하버 안티바디즈(Harbour Antibodies)(http://_www_harbourantibodies_com), 오픈 모노클로널 테크놀로지, 인크.(Open Monoclonal Technology, Inc., OMT)(http://_www_omtinc_net), KyMab(http://_www_kymab_com), 트리아니(Trianni)(http://_www.trianni_com) 및 아블렉시스(Ablexis)(http://_www_ablexis_com)와 같은 회사와 제휴하여, 전술된 바와 같은 기술을 사용하여, 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 부분들, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이룬 항체 가변 영역들을 발현하도록 조작된다(문헌[Knappik et al (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86]; 문헌[Krebs et al (2001) J. Immunol. Meth. 254:67-84]; 문헌[Vaughan et al (1996) Nature Biotechnology 14:309-314]; 문헌[Sheets et al (1998) PITAS (USA) 95:6157-6162]; 문헌[Hoogenboom and Winter, (1991) J. Mol. Biol. 227:381]; 문헌[Marks et al (1991) J. Mol. Biol. 222:581]). 본 발명의 항체는, 예를 들어 문헌[Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96] 및 국제 특허 출원 공개 WO09/085462호에 기재된 바와 같이 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 이러한 라이브러리는 인간 IFN-ω 및 IFN-α에 결합하는 파지에 대해 스크리닝될 수 있고, 획득된 양성 클론은 추가로 특성화될 수 있고, Fab가 클론 용해물로부터 단리되어 전장(full length) IgG로서 발현될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은, 예를 들어 래드너(Ladner) 등에게 허여된 미국 특허 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; 도워(Dower) 등에게 허여된 미국 특허 제5,427,908호 및 제5, 580,717호; 맥카퍼티(McCafferty) 등에게 허여된 미국 특허 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 그리피스(Griffiths) 등에게 허여된 미국 특허 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호에 기재되어 있다.
면역원성 항원의 제조 및 단일클론 항체 생성은 임의의 적합한 기법, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 수행될 수 있다. 면역원성 항원은 정제된 단백질, 또는 전 세포 또는 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태로 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 항원은 상기 항원 또는 그의 일부분을 인코딩하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 드 노보(de novo)로 형성될 수 있다.
예시적인 방법에서는, 파지 디스플레이 라이브러리를 비오티닐화 인간 IFN-α2 또는 비오티닐화 인간 IFN-αG에 대해 패닝할 수 있다. 3 라운드의 패닝 후에, 항원으로서 인간 IFN-α2, IFN-αG 및 IFN-ω를 사용하는 다중클론 파지 ELISA를 수행하여 개별 패닝 실험들의 특이적 농축(specific enrichment)을 검출할 수 있다. IFN-α2, IFN-αG 및 IFN-ω에 대한 바인더의 농축을 보여주는 파지를 수집하고, Fab 포맷으로 추가적인 IFN-α 아형에 대한 결합에 대하여 표준 ELISA 검정에서 추가로 스크리닝할 수 있다. 확인된 Fab 클론을 전장 항체로 클로닝하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로테온 및 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 인간 IFN-ω 및 다양한 IFN-α 아형에 대한 그의 친화성 및 중화 능력에 대해 추가로 특성화할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 IFN-α/ω 항체는 인간 생식세포계열 유전자 IGHV5-51(서열 번호 155)로부터 유래되는 VH 프레임워크를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 IFN-α/ω 항체는 인간 생식세포계열 유전자 IGKV1D-39(서열 번호 156)로부터 유래되는 VL 프레임워크를 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 유형의 것일 수 있다.본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 유형의 것일 수 있다.
당업자에게 알려진 기술에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 효과기 특성을 증진하거나 억제할 수 있다. 예를 들어, Fc 효과기 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 본 발명의 항체의 약동학적 특성이 향상될 수 있다(문헌[Strohl (2009) Curr Opin Biotechnol 20:685-91]). 예시적인 Fc 변형은 IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E(문헌[Dall'Acqua et al (2006) J. Biol. Chem. 281:23514―24]); 또는 IgG2에 대해서는, IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 또는 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(국제 특허 출원 공개 WO11/066501호)이며, 이들은 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 것들이다(잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따름).
추가적으로, 본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항체는 글리코실화, 이성질체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 비-천연 발생 공유적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 부가(페길화(pegylation)) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(PEG화), 그의 약동학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려진 기법에 의해 수행될 수 있다. 치료적 항체와 PEG의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약력학적 특성을 향상시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Knigh et al (2004)Platelets 15:409-18]; 문헌[Leong et al (2001) Cytokine 16:106-19]; 문헌[Yang et al (2003) Protein Eng. 16:761-70]).
안정성, 선택성, 교차-반응성, 친화성, 면역원성 또는 다른 바람직한 생물학적 또는 생물물리학적 특성을 개선하도록 변형된 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 범주 내에 있다. 항체의 안정성은 (1) 개별 도메인들의 고유의 안정성에 영향을 미치는 그들의 코어 패킹(core packing), (2) HC 및 LC 쌍형성(pairing)에 영향을 주는 단백질/단백질 계면 상호작용, (3) 극성 및 하전된 잔기의 매몰(burial), (4) 극성 및 하전된 잔기에 대한 H-결합 네트워크; 및 (5) 다른 분자내 및 분자간 힘 중에서의 표면 전하 및 극성 잔기 분포를 비롯한 수많은 인자에 의해 영향을 받는다(문헌[Worn et al (2001) J. Mol. Biol. 305:989-1010]). 잠재적인 구조 불안정화 잔기는 항체의 결정 구조에 기초하거나 또는 소정 경우에는 분자 모델링에 의해 확인할 수 있으며, 확인된 잔기 내에 돌연변이를 갖는 변이체를 생성하고 평가함으로써, 항체 안정성에 대한 잔기의 영향을 시험할 수 있다. 항체 안정성을 증가시키기 위한 방법들 중 하나는 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의해 측정되는 바와 같은 열 전이 중간점(Tm)을 상승시키는 것이다. 일반적으로, 단백질Tm은 그의 안정성과는 상관관계에 있고, 용액 중에서의 풀림(unfolding) 및 변성, 그리고 단백질이 풀리는 경향에 따라 좌우되는 분해 과정에 대한 그의 감수성과는 역상관관계에 있다(문헌[Remmele et al (2000) Biopharm 13:36-46]). 수많은 연구로부터 DSC에 의해 열 안정성으로서 측정된 제형의 물리적 안정성과 다른 방법에 의해 측정된 물리적 안정성의 순위 간의 상관관계가 밝혀졌다(문헌[Gupta et al (2003) AAPS PharmSci 5E8]; 문헌[Zhang et al (2004) J. Pharm. Sci. 93:3076-89]; 문헌[Maa et al (1996) Int. J. Pharm. 140:155-68]; 문헌[Bedu-Addo et al (2004) Pharm. Res. 21:1353-61]; 문헌[Remmele et al (1997) Pharm. Res. 15:200-8]). 제형 연구는 Fab Tm이 상응하는 mAb의 장기간 물리적 안정성에 대해 영향을 준다는 것을 제시한다. 프레임워크 또는 CDR 내의 아미노산의 차이는 Fab 도메인의 열 안정성에 대해 상당한 영향을 미칠 수 있다(문헌[Yasui et al (1994) FEBS Lett. 353:143-6]).
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 IFN-ω에 대한 결합에 대하여 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 71의 VL을 포함하는 단리된 항체와 경쟁한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 IFN-ω에 대한 결합에 대하여 서열 번호 28의 VH 및 서열 번호 150의 VL을 포함하는 단리된 항체와 경쟁한다.
소정의 VH 및 VL 서열을 포함하는 본 발명의 항체들과의 인간 IFN-ω에 대한 특이적 결합 간의 경쟁이 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 비표지화된 항체의 존재 하에서의 인간 IFN-ω에 대한 MSD 설포-태그(Sulfo-Tag)™ NHS-에스테르―표지화된 항체의 결합이 ELISA에 의해 평가될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체들과의 경쟁을 보여주기 위해 바이아코어 분석 또는 유세포측정이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키며, 여기서 항체는 적어도 잔기 F27, L30 및 R33에서 서열 번호 1의 IFN-ω와 결합한다.
잔기 F27, L30 및 R33 IFN-ω는 본 발명의 IFN-α/ω 항체의 광범위 중화 활성에 필요한 최소한의 에피토프를 규정한다. 몇몇 항체/IFN-α 또는 항체/IFN-ω 복합체의 결정 구조는 이들 3개의 잔기가 항체 결합에 대한 우세한 기여를 제공함을 보여주었다. F27 잔기는 IFN-αD(α1)를 제외하고는 모든 인간 IFN-α에 보존되어 있으며, IFN-αD(α1)에 본 발명의 항체는 결합되지 않는다. L30 및 R33 둘 모두는 모든 인간 IFN-α뿐만 아니라 인간 IFN-ω에도 보존되어 있다. 에피토프에 대한 F27의 기여에 대한 추가의 확인이 다양한 사이노 IFN-α 아형을 사용한 결합 연구로부터 명백하다: 본 발명의 항체는 사이노 IFN-α13에 결합하지 않는데, 이는 인간 IFN-αD와 마찬가지로, 위치 27에 세린(S27)을 갖는다.
본 명세서에 기재된 다른 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 적어도 잔기 S25, P26, F27, L28, L30, K31, R33, R34 및 D35에서 서열 번호 1의 인간 IFN-ω와 결합한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키며, 여기서 항체는 F27을 포함한 하나 이상의 잔기에서 서열 번호 1의 인간 IFN-ω와 결합한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는, 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형과 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키고, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL 또는 IFN-γ와 결합하는 이중특이성 항체이다.
SLE 환자에서의 상승된 IFN-ω의 존재, 및 IFN-ω가 시험관내에서 PBMC 중에의 BLyS 분비를 유도할 수 있다는 실증을 고려해 볼 때, SLE 환자에서의 IFN-α/ω의 조합 차단(combined blockade)이 항 IFN-α 특이적 접근과 대비하여 BLyS 수준을 감소시키는 데 있어서 더 효과적일 수 있다. SLE 환자에서의 IFN-시그너처 및 IFN 활성의 정도는 가용성 BLyS 수준과 상관관계를 갖는 것으로 나타난다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 IFN-α/ω 항체는 이중특이성 항체로 조작될 수 있으며, 이러한 이중특이성 항체 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역은 공개된 방법을 사용하여 탠드에이비(TandAb)® 설계와 같은 구조로서 단일쇄 이중특이성 항체로 조작될 수 있거나(국제 특허 출원 공개 WO99/57150호; 미국 특허 출원 공개 제2011/0206672호), 또는 미국 특허 제5869620호; 국제 특허 출원 공개 WO95/15388호, 국제 특허 출원 공개 WO97/14719호 또는 국제 특허 출원 공개 WO11/036460호에 개시된 것들과 같은 구조로서 이중특이성 scFV로 조작될 수 있다.
본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역은 이중특이성 전장 항체로 조작될 수 있으며, 여기서 각각의 항체 아암(arm)은 별개의 항원 또는 에피토프와 결합한다. 전형적으로, 그러한 이중특이성 항체는 미국 특허 제7,695,936호; 국제 특허 출원 공개 WO04/111233호; 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 제2007/0287170호; 국제 특허 출원 공개 WO2008/119353호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 제2010/0286374호; 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/143545호; 또는 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호에 기재된 것들과 같은 기술을 사용하여 2개의 항체 중쇄들 사이의 CH3 상호작용을 조절하여 이중특이성 항체를 형성함으로써 제조된다.
예를 들어, 본 발명의 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모(parent) 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이들 방법에서는, 제1 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체) 및 제2 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 항-BLyS, 항-CD40L, 항- IL-6, 항-CD27, 항-BDCA2, 항- IL-12, 항-IL-23, 항-IFN-αD, 항-IL-17, 항-CD20, 항-IL-10, 항-CD22, 항-IL-21, 항-ICOS, 항- ICOSL 또는 항-IFN-γ 항체)를, 이종이량체 안정성을 촉진시키는 CH3 도메인에서 소정의 치환을 갖도록 조작하고; 항체들을 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션하여; 그럼으로써, Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
이중특이성 항체의 제1 중쇄에 그리고 제2 중쇄에 사용될 수 있는 예시적인 CH3 돌연변이는 K409R 및/또는 F405L이다.
본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역이 도입될 수 있는 추가의 이중특이성 구조는, 예를 들어 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD)(국제 특허 출원 공개 WO2009/134776호), 또는 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체 아암을 연결시키기 위한 다양한 이량화 도메인, 예컨대 류신 지퍼 또는 콜라겐 이량화 도메인을 포함하는 구조(국제 특허 출원 공개 WO2012/022811호, 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호)이다. DVD는 구조 VH1-링커-VH2-CH를 갖는 중쇄 및 구조 VL1-링커-VL2-CL을 갖는 경쇄를 포함하는 전장 항체이며; 링커는 선택적이다.
이중특이성 항-IFN-α/ω 항체 내로 도입시키고자 하는, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL 또는 IFN-γ와 결합하는 VH 및 VL은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 드 노보로 생성될 수 있거나, 또는 기존 단일특이성 항체로부터 조작될 수 있다. 본 발명의 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있는 예시적인 항-BLyS 항체는 벤리스타(BENLYSTA)®이다. 사용될 수 있는 예시적인 CD40L 항체는 미국 특허 제5,474,771호; 미국 특허 제5,747,037호, 국제 특허 출원 공개 WO01/68860호, 국제 특허 출원 공개 WO06/033702호 또는 국제 특허 출원 공개 WO08/118356호에 기재된 것들이다. 사용될 수 있는 예시적인 항-IL-6 항체는 국제 특허 출원 공개 WO06/119115호, 국제 특허 출원 공개 WO10/056948호, 국제 특허 출원 공개 WO10/088444호 또는 국제 특허 출원 공개 WO07/076927호에 기재된 것들이다. 사용될 수 있는 예시적인 항-CD27 항체는 국제 특허 출원 공개 WO13/138586호, 국제 특허 출원 공개 WO11/130434호 또는 국제 특허 출원 공개 WO12/004367호에 기재된 것들이다. 사용될 수 있는 예시적인 IL-12 및 IL-23 항체는 스텔라라(STELARA)®이다. 사용될 수 있는 예시적인 IL-23 항체는 국제 특허 출원 공개 WO07/005955호, 국제 특허 공개 WO07/027714호, 국제 특허 출원 공개 WO08/103432호, 국제 특허 출원 공개 WO07/106769호, 국제 특허 출원 공개 WO07/147019호 또는 국제 특허 출원 공개 WO08/134659호에 기재된 것들이다. 사용될 수 있는 예시적인 IL-17 항체는 국제 특허 출원 공개 WO06/013107호, 국제 특허 출원 공개 WO06/054059호, 국제 특허 출원 공개 WO07/070750호, 국제 특허 출원 공개 WO08/134659호, 국제 특허 공개 WO07/149032호, 국제 특허 출원 공개 WO08/021156호, 국제 특허 출원 공개 WO08/047134호, 국제 특허 출원 공개 WO09/130459호, 국제 특허 출원 공개 WO10/025400호, 국제 특허 공개 WO11/053763호 및 국제 특허 출원 공개 WO12/095662호에 기재된 것들이다.
본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 다른 실시 형태는, 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는, 소정의 VH 및 VL 서열을 갖는 항체이며, 여기서 항체 VH는 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, 항체 VL은 제2 합성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 폴리뉴클레오티드는 상보적 데옥시핵산(cDNA)일 수 있고, 적합한 숙주에서의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 잘 알려진 기술이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체 VH 또는 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 72, 92, 108, 110, 117 또는 122의 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 중쇄 가변 영역 및/또는 항체 경쇄 가변 영역 중 임의의 것을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되지만, 주어진 발현 시스템에서의 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체를 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 서열 번호 72, 92, 108, 110, 117 또는 122에 나타낸 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 항체의 VH 또는 VL 또는 그의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 의도된 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 cDNA일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 발현용 벡터, 트랜스포손 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 예를 들어, 불변 영역에 선택적으로 연결된, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및/또는 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 인코딩하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 제어 서열은 신호 서열, 프로모터(예를 들어, 천연 관련 프로모터 또는 이종 프로모터), 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하며, 항체를 발현하도록 선택된 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되었으면, 숙주는 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질의 고수준 발현에 적합한 조건 하에서 유지된다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 선택 마커, 예컨대 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성을 함유하여 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 한다.
적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 알려져 있다. 세균 세포에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 lacl, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함한다. 진핵 세포에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 거대세포바이러스 전초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 초기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 당업계에 알려진 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 효모 세포에서의 발현을 위하여, 예시적인 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터, 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PH05 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1(예를 들어, 피키아(Pichia)에서의 사용을 위함)이다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 충분히 당업자의 수준 내에 있다.
다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 알려져 있으며; 많은 것들이 대상 재조합 작제물을 생성하기 위해 구매가능하다. 하기 벡터는 예로서 제공된다. 세균 벡터: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5(스웨덴 웁살라 소재의 파르마시아(Pharmacia)). 진핵세포 벡터: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(파르마시아).
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 용어 "숙주 세포"는 벡터가 내부에 도입된 세포를 지칭한다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손, 그리고 또한 특정 대상 세포로부터 생성된 안정한 세포주도 지칭하고자 함이 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 후손은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균강(bacilli), 예컨대 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 원핵 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아이(S. cerevisiae)) 및 피키아가 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC(European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다.예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1SV(미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자 바이올로직스(Lonza Biologics)), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체를 생성하는 방법이며, 본 방법은 항체가 발현되는 조건에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 항체의 제조 방법 및 이들의 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일단 (화학적으로 또는 재조합적으로) 합성되면, 전 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 다른 항체 단편, 예컨대 VH 및/또는 VL은 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제, 겔 전기영동 등을 포함한 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(전반적으로 문헌[Scopes, Protein 정제 (Springer- Verlag, N.Y., (1982)] 참조). 대상 항체는 사실상 순수할 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 80% 내지 85% 순수하거나, 적어도 약 85% 내지 90% 순수하거나, 적어도 약 90% 내지 95% 순수하거나, 또는 적어도 약 98% 내지 99%, 또는 그 이상으로 순수할 수 있는데, 예를 들어 대상 항체 이외의 세포 잔해, 거대분자 등과 같은 오염물이 없다.
본 발명의 다른 실시 형태는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α)에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 항체를 생성하기 위한 방법으로서, 본 방법은
항체의 VH를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 항체의 VL을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 도입시키는 단계;
숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환시키는 단계;
VL 및 VH가 발현되고 항체를 형성하는 조건 하에서 배양 배지 중에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 소정의 VH 또는 VL 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 벡터 내로 도입된다. 숙주 세포 형질전환, 배양, 항체 발현 및 정제는 잘 알려진 방법을 사용하여 행해진다.
치료 방법
본 발명의 IFN-α/ω 항체는 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스(CLE)를 포함한 루푸스, 또는 다른 면역-매개 염증성 질병, 예컨대 건선, 면역성 혈소판감소증(ITP), 에이카르디-고우티에레스 증후군(AGS), 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 근염, 공통 가변성 면역 결핍증(CVID), 자가면역 갑상선 질병, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질병(GVHD)을 치료하는 데 이용될 수 있다. 이들 질병은 IFN-α 및/또는 IFN-ω 또는 I형 IFN 시그너처의 증가된 생성과 관련될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 항체의 치료적 유효량을 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병을 치료하기에 충분한 시간 동안 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 루푸스를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 항체의 치료적 유효량을 루푸스를 치료하기에 충분한 시간 동안 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 루푸스는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스(CLE)이다.
일부 실시 형태에서, 환자는 루푸스 신염을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병은 건선, 면역성 혈소판감소증(ITP), 에이카르디-고우티에레스 증후군(AGS), 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 근염, 공통 가변성 면역 결핍증(CVID), 자가면역 갑상선 질병, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질병(GVHD)이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 만성 바이러스 감염을 치료하는 방법으로서, 본 방법은 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 단리된 항체의 치료적 유효량을 만성 바이러스 감염을 치료하기에 충분한 시간 동안 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
IFN-I은 급성 바이러스 감염에서 보호 역할을 갖는 것으로 잘 알려져 있다. 최근에, IFN-I은 IL-10 및 프로그래밍된 세포사 1 리간드 1(programmed cell death 1 ligand 1, PDL1)에 의해 적어도 부분적으로 매개된 기전을 통해 만성 바이러스 감염에서 면역억제 역할을 갖는 것으로 입증되었다(문헌[Teijaro et al., Science 340, 207-211, (2013)]; 문헌[Wilson et al., Science 340, 202-207, 2013]). 다수의 IFN-α 아형과 IFN-ω의 조합 차단은 바이러스 존속으로 이어지는 면역억제 환경을 하향-조절함으로써 HIV 및 C형 간염을 포함한 만성 바이러스 감염을 갖는 환자에서 유익한 효과를 제공할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 만성 바이러스 감염은 HIV 또는 C형 간염이다.
"치료" 또는 "치료하다"는 치료적 치료를 지칭한다. 치료될 수 있는 환자는 또한, 장애를 예방하고자 하는 환자들 중에서, 장애를 갖는 경향이 있거나 갖기 쉬운 환자를 포함한다. 치료를 필요로 하는 개체는 장애 또는 장애의 증상을 이미 갖고 있는 자를 포함한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질병 정도의 저하, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예측되는 생존과 비교할 때 연장되는 생존을 의미할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항체는 표 9, 표 13, 표 15, 표 17, 표 19, 표 21, 표 22, 표 23, 표 24, 표 25, 표 26 또는 표 27에 나타낸 바와 같은 VH, VL, HCDR 및/또는 LCDR 영역, 및 항체 IFWM3308, IFWM3307, IFWM3410, IFWM3322, IFWM3385, IFWM3416, IFWM3310, IFWM3400, IFWM3321, IFWM3522, IFWM3524, IFWM3320, IFWM3304, IFWM3520, IFWM3399, IFWM3314, IFWM3331, IFWM3405, IFWM3442, IFWM3525, IFWM3423, IFWM3444 및 IFWM3421을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에 사용될 수 있는 다른 예시적인 항체는 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는 항체이며, 여기서 항체는 적어도 잔기 F27, L30 및 R33에서 서열 번호 1의 IFN-ω와 결합한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에 사용될 수 있는 다른 예시적인 항체는 적어도 잔기 S25, P26, F27, L28, L30, K31, R33, R34 및 D35에서 서열 번호 1의 인간 IFN-ω와 결합하는 항체이다.
본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 동물의 예에는 포유동물, 예컨대 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다.
본 발명의 항체는 그러한 치료를 위한 약제의 제조에 유용할 수 있으며, 여기서 약제는 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하기 위해 제조된다. SLE는 만성 다기관 자가면역 질병으로, 이 질병은 유전자적 및 환경적 인자 둘 모두가 그의 발생에 기여한다.
SLE는, 다수의 기관에 걸친 조직 손상을 가져오는, 병원성 자가항체의 생성 및 면역 복합체의 조직 침착에 의해 특성지어진다. 피부, 근골격, 혈액학적, 신경학적 및 신장 합병증의 조합이, 플레어-업(flare-up) 및 관해의 기간을 가지면서 환자에서 관찰된다. 루푸스 신염은 신염, 단백뇨, 혈뇨 및/또는 신부전의 진단을 갖는 SLE의 경우로서 정의된다. 루푸스 신염 환자에서, 신장 침범은 소변 검체에서의 적혈구 또는 캐스트(cast), 및/또는 단백뇨(>0.5 g/24시간)에 의해 특징지어진다.
임의의 특정 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, SLE는, IFN-α 및 IFN-ω - 그러나 IFN-β는 아님 - 의 과잉생성과 관련된 I형 IFN 반응을 유발하는, 그러한 자가항체 면역 복합체를 촉발하는 것으로 시사된다. 따라서, 본 발명의 IFN-α/ω 항체는, 항바이러스 방어에 있어서 더 중대한 역할을 할 수 있고 분자가 루푸스에서 생물학적 관련성을 갖지 않을 수 있는 IFN-β의 기능에 위해를 가하지 않으면서, IFN-ω 및 다수의 IFN-α 아형을 광범위하게 억제하여, 루푸스 및 다른 면역-매개 염증성 질병에 대해 더 효능 있는 치료를 제공할 수 있다. 예를 들어, 항-IFN-β 항체는, 상승된 IFN-I 활성 및 IFN 시그너처와 또한 관련된 질병인, SLE 및 AGS 환자 둘 모두로부터의 환자 혈청 활성을 중화시키는 데 실패하였다(문헌[Hooks et al., Arthritis and Rheumatism 25:396-400, 1982]; 문헌[Hua et al., Arthritis and Rheumatism 54: 1906 (Jun, 2006)]; 문헌[Rice et al., Lancet Neurology doi:10.1016/S1474-4422(13)70258-8 (2013)]).
SLE 이외의 다른 유형의 루푸스는 피부 홍반성 루푸스(CLE) 및 소아 루푸스를 포함한다.
루푸스와 관련된 증상은 관절 통증 및 경직, 비미란성 관절염, 근육통, 통증, 무력증, 열, 권태, 구강 조직 상의 궤양, 피부 징후(예를 들어, 코 및 빰에 걸친 나비-형상 발진; 일광-유발 피부 발적), 비정상적인 체중 손실 또는 체중 증가, 빈혈, 낮은 림프구 및/또는 혈소판 카운트, 신경학적 또는 신경정신적 징후(예를 들어, 사고판단의 어려움(trouble thinking), 기억 문제, 착란, 우울, 두통, 발작, 뇌졸중), 신장 문제(예를 들어, 신염, 예를 들어 사구체신염), 태양 또는 광 민감성, 모발 손실, 스트레스 또는 추위로 인해 자주색이거나 창백한 손가락, 혈관 병변 또는 다른 혈관 징후, 또는 심폐 증상, 예컨대 심막염 또는 흉막염을 포함한다. 인터류킨 IL-1, IL-6, IL-10, Il-12, IL-17, IL-18, IL-5 및 IL-16; TNF-α 또는 I형 인터페론의 상승된 수준뿐만 아니라, IFN 유도성 유전자의 과발현도 루푸스 환자에 대한 문서에 기재되어 있다. 환자들은 핵 및 세포 성분, 예컨대 이중 가닥 DNA(dsDNA), 리보핵단백질(RNP), SS-a/Ro, SS-b/La, 인지질, 히스톤 또는 카르디올리핀에 대한 상승된 수준의 자가항체를 가질 수 있다. 환자들은 적어도 하나의 조직에서 면역 복합체 침착을 가질 수 있다.
SLE는, 예를 들어, 전신 홍반성 루푸스의 분류에 대한 SLICC(Systemic Lupus International Collaborating Clinics Criteria)에 의한, 또는 ACR(American College of Rheumatology)에 의한 권고를 사용하여 진단 또는 분류될 수 있다. 예를 들어, 2012 SLICC 기준은, 환자가, 적어도 하나의 임상 및 하나의 면역학적 기준과 함께, 11가지 중 적어도 4가지 기준을 보여주거나, 또는 항-DNA 항체(ADA) 또는 항-핵산 항체(ANA)의 존재 하에서의 생검으로 검증된 루푸스 신염을 보여줄 것을 필요로 한다. 임상 기준은 급성 피부 루푸스, 만성 피부 루푸스, 구강 또는 비강 궤양, 비반흔성 탈모증, 관절염, 장막염, 신장 증상, 신경학적 증상, 용혈성 빈혈, 백혈병 또는 혈소판감소증(<100,000/㎣)이다. 면역학적 기준은 ANA, ADA, 항-Sm, 항-인지질 항체, 저보체(low complement)(C3, C4 또는 CH50), 또는 용혈성 빈혈의 존재 하에서 카운팅하지 않는 직접 쿰스 검사(direct Coombs' test)를 포함한다(문헌[Petre et al., Arthritis and Rheumatism Aug 2012]). 활동성 질병은 1개의 BILAG(British Isles Lupus Activity Group)의 "A" 기준 또는 2개의 BILAG "B" 기준; SLE 질병 활성 지수(SLE Disease Activity Index, SLEDAI); 또는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 반응 지수(SLE responder index, SRI) 에 의해 정의될 수 있으며, 이는 문헌[Furie et al., Arthritis Rheum. 61 (9): 1143-51, (2009)]에 기재되어 있다.
SLE 중증도 및 질병 활성은 SLE에 관하여 전문지식을 가진 임상의에 의한 BILAG 점수에 의해 정의될 수 있다. BILAG 2004 지수가 BILAG 점수를 결정하는 데 사용된다(문헌[Yee, et al. Arthritis & Rheumatism 54:3300-3305, 2006]; 문헌[Isenberg et al., Rheumatology 44:902-906; 2005] 참조). BILAG 2004 지수는 하기의 9개의 기관계 영역에 걸쳐 97개의 임상 징후, 증상, 및 실험실 파라미터를 평가한다: 구성적 기관계, 피부점막 기관계, 신경정신 기관계, 근골격 기관계, 심폐 기관계, 위장 기관계, 눈 기관계, 신장 기관계, 및 혈액학적 기관계. 97개의 증상은 이전 개월(4주)에 걸친 중증도에 관하여 그리고 이전 검사로부터의 임의의 변화(신규, 개선, 안정, 악화, 부재)에 관하여 등급이 매겨져 있다. 이어서, 9개의 도메인 각각에 대한 단일 알파벳 점수(A 내지 E)가 각각의 기관 카테고리에서의 검사 결과로부터 도출된다. 표 2는 BILAG 카테고리를 나타낸다.
[표 2]
Figure 112017005865411-pct00005
CLE는 일련의 임상 특징들 및 피부 병변의 지속시간, 검사소견의 이상(laboratory abnormality), 및 피부 생검 조직학적 변화에 따라 급성(ACLE), 아급성(SCLE), 만성(CCLE) 또는 간헐성(ICLE) CLE로 추가로 분류된다. 다양한 CLE 형태의 분류 및 임상 징후가 문헌[Kuhn and Landmann, J Autiommunity 48-49:14-19, 2014]에 검토되어 있다.
I형 IFN 유전자 시그너처는 루푸스의 임상 특징 및 혈청학적 특징과 양의 상관관계가 있는 것으로 보고되어 있다(문헌[Karageorgas et al., J Biomed Biotechnol 273907, 2011], 문헌[Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615, 2003], 문헌[Bennett et al., J Exp Med 197:711-723, 2003], 문헌[Dall'era et al. Ann Rheum Dis 64: 1692-1697, 2005], 문헌[Niewold et al. Genes Immun 8: 492-502,2007]). 손상된 클리어런스와 함께 자가항체의 우세성은 IFN 생성의 피드백 사이클을 초래하는데, 여기서는 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC) 내로의 면역 복합체의 Fc 수용체-의존성 내재화가 증가된 양의 IFN 및 이에 따른 IFN 시그너처의 확립을 초래한다. 임상 시험에서, SLE 환자에서의 항-IFN-α 항체는 IFN 시그너처를 나타내는 환자들 중 대부분에서 I형 IFN 시그너처의 부분 감소 및 외삽 분석에 있어서의 약간의 효능을 보여주었다(문헌[Petri et al., Arthritis and rheumatism 65, 1011 (Apr, 2013)]; 문헌[Merrill J et al., Annals of the rheumatic diseases 70, 314 (2011)]; 문헌[Kennedy et al., The 10th International Congress on SLE, Buenos Aires, Argentina Oral Presentation 5, 022, (April 20th, 2013)]).
루푸스 관리에서의 표준 치료는 현재의 허용된 의료 실무 패턴, 류마티스 협회에 의해 개발된 승인된 지침서(예를 들어, 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology), 유럽 류머티즘 협회(European League Against Rheumatism)) 및 치료 의사의 재량에 기초한다. 루푸스 환자는, 적절한 관리를 행하더라도, 진단이 행해진 후에 오랫동안 질병 활성을 계속 가져서, 종종 신규 기관계를 침범하거나 또는 특정 기관계 손상을 수반한다. 루푸스에서의 질병 활성에는 하기의 3가지 패턴이 있다: 플레어(또는 관해, 재연 질병 활성), 만성 활동성 질병, 및 장기 무활동(long quiescence). 이들 질병 패턴은 전신 임상 평가, 일상적 실험실 검사, 질병 활성의 표준화된 척도, 및 건강 상태 및 삶의 질에 대한 환자 스스로의 지각과 이들 평가의 통합을 사용하여 특징지어진다. 환자의 플레어 징후 및 증상이 지속되거나 악화됨에 따라, 의사는 투약제 및/또는 투여량에 있어서의 변화가 요구됨을 알 수 있다. 루푸스를 제어하기 위해 사용되는 투약제는 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다: (1) 일반의약품(over-the-counter) NSAID를 포함한 NSAID, 예를 들어 나프록센(알레브(Aleve)) 및 이부프로펜(아드빌(Advil), 모트린(Motrin), 기타), 및 처방에 의해 입수가능한 더 강한 NSAID; (2) 항말라리아 약물, 예를 들어 하이드록시클로로퀸(플라퀘닐(Plaquenil)); (3) 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손 및 기타 유형의 코르티코스테로이드, 및 (4) 면역 억제제, 예를 들어 사이클로포스파미드(사이톡산(Cytoxan)), 아자티오프린(이뮤란(Imuran), 아자산(Azasan)), 마이코페놀레이트(셀셉트(Cellcept)), 레플루노마이드(아라바(Arava)) 및 메토트렉세이트(트렉살(Trexall)).
본 발명의 항체는 질병 관련 IFN 조제물을 사용하여 질병 관련 세포에서 시험관내에서 그의 효능에 대해 시험될 수 있다. 그러한 시험관내 시험은, 예를 들어 전혈 중의 SLE 환자 면역 복합체에 의해 유도된 IFN 생성의 억제의 평가, 또는 전혈 중의 IFN 시그너처를 감소시키는 항체의 능력의 평가일 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 루푸스의 동물 모델이 또한 사용될 수 있는데, 예컨대 사구체신염을 포함한 인간 루푸스의 몇몇 특징을 갖는 시간-의존성 및 암컷-편향적 질병을 나타내는 NZB/NZW F1 마우스이다. 그러나, 마우스는 IFN-ω를 생성하지 않기 때문에, 본 발명의 항체의 효능을 평가하기 위한 모델로서의 그의 이용은 더 제한된다.
일부 실시 형태에서, 환자는 I형 인터페론 시그너처를 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "I형 인터페론 시그너처" 또는 "인터페론 시그너처"는 IFN-I에 의해 유도되는 유전자들의 하위세트의 상향조절을 지칭한다. 3 내지 27개의 유전자 범위의 다양한 I형 IFN 시그너처가 알려져 있다. 이들 시그너처는, 예를 들어, SLE를 치료하기 위한 그리고 SLE 환자 계층화의 목적을 위한 I형 IFN 억제제의 표적 관여를 평가하기 위하여 약력학적 마커로서 이용될 수 있다.
예시적인 I형 인터페론 시그너처가 표 3에 나타나 있으며, 이는 문헌[Yao et al., Arthritis and rheumatism 60, 1785 (Jun, 2009)]에 기재된 바와 같은 21개의 상향조절된 유전자로 이루어진다. 다른 예시적인 I형 인터페론 시그너처가 문헌[Tcherepanova, I., et al., Annals of the rheumatic diseases 71(Suppl3) (2012)] 및 문헌[Richardson, B. et al. Development of A Quantitative PCR Method to Determine Interferon Signature Metric Status in SLE Patients: Distribution and Clinical & Serological Associations in Two Lupus Clinical Trials. ACR/ARHP 2012 Annual Meeting Abstract 620 (2012)]에 기재되어 있다.
일부 방법에서, 항-IFN-α/ω 항체는 이중특이성 항체이다.
일부 방법에서, 항-IFN-α/ω 이중특이성 항체는 BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17 또는 CD20을 중화시킨다.
[표 3]
Figure 112017005865411-pct00006
투여/약제학적 조성물
본 발명은 본 명세서에 기재된 본 발명의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 항-IFN-α/ω 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 분자 또는 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 약 1 중량% 이상까지, 많게는 15 또는 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량% 또는 50 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092(특히 pp. 958-989 참조)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체의 투여 방식은 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 또는 당업자에 의해 이해되는 다른 수단과 같은 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(i.v.) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 환자에게 투여될 수 있다. i.v. 주입은, 예를 들어 15, 30, 60, 90, 120, 180, 또는 240분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간에 걸쳐 제공될 수 있다.
면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대 루푸스를 갖는 환자에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하고("치료적 유효량"), 때때로 0.005 mg/㎏ 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 0.05 mg/㎏ 내지 약 20 mg/㎏ 또는 약 0.1 mg/㎏ 내지 약 20 mg/㎏ 또는 약 1 mg 내지 약 20 mg/㎏, 또는 약 4 mg/㎏, 약 8 mg/㎏, 약 16 mg/㎏ 또는 약 24 mg/㎏, 또는, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 높을 수 있으며, 예를 들어 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다.
고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m2일 수 있다. 면역-매개 염증성 질병, 예컨대 루푸스를 치료하기 위해 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 이상 횟수의 용량이 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서의 항-IFN-α/ω 항체는 정맥내 주입에 의해 8주 동안 매주 간격으로 0.1 mg/㎏으로, 1 mg/㎏으로, 5 mg/㎏으로, 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 추가 16주 동안 2주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 4주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여될 수 있다.
항-IFN-α/ω 항체는 본 발명의 방법에서, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서, 유지 요법에 의해, 예컨대 6개월 이상의 기간 동안 주 1회 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체는 일일 투여량으로서, 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나에 대해, 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 하나에 대해, 매 24, 12, 8, 6, 4, 또는 2시간마다의 단회 또는 분할 용량, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여, 1일당 약 0.1 내지 100 mg/㎏, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏의 양으로, 또는 이들의 임의의 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체는 또한, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대 루푸스의 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병의 개시를 지연시키고/시키거나, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대 루푸스가 관해기일 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg/㎏ 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏의 본 발명의 항-IFN-α/ω 항체를 함유하도록 제조될 수 있다.
예를 들어, 정맥내 주입을 위한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 80 ㎏의 환자에 대한 투여의 경우 약 200 ml의 멸균 링거액, 및 약 8 mg 내지 약 2400 mg, 약 400 mg 내지 약 1600 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 800 mg의 항-IFN-α/ω 항체를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 방법이 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더 상세히 기재되어 있다.
면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병의 치료에 효과적인 본 발명의 IFN-α/ω 항체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 시험관내 검정이 사용될 수 있다. 선택적으로, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병, 예컨대 SLE를 포함한 루푸스의 치료에 효과적일 수 있는 본 발명의 IFN-α/ω 항체의 투여량은 당업계에 잘 알려진 관련 동물 모델에게 IFN-α/ω 항체를 투여함으로써 결정될 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 몇몇 인자의 고려에 기초하여, 당업자에 의해 (예를 들어, 임상 시험을 통해) 결정될 수 있다. 그러한 인자는 치료 또는 예방하고자 하는 질병, 관련된 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 모델들 중 임의의 것을 사용하여 그의 효능 및 유효 투여량에 대해 시험될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체는 저장 동안 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에서의, 그리고 하기에 열거된 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나의 일부 실시 형태에서의 항-IFN-α/ω 항체는 제2 치료제와 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 병용하여 투여될 수 있다.
제2 치료제는 코르티코스테로이드, 항말라리아 약물, 면역억제제, 세포독성 약물, 또는 B-세포 조절제일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 제2 치료제는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 데플라즈코르트, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트 모페틸(MMF), 마이코페놀레이트 소듐, 사이클로스포린, 레플루노마이드, 타크롤리무스, 리툭시맙™, 또는 벨리무맙™이다.
본 발명의 추가의 실시 형태
본 명세서의 어딘가 다른 곳에 있는 본 개시내용에 따른 본 발명의 소정의 추가 실시 형태들이 하기에 열거되어 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명과 관련된 것으로서 기재된 상기에 열거된 본 발명의 실시 형태들로부터의 특징은 또한 이들 추가의 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나와 관련된다.
1) 인간 인터페론 오메가(IFN-ω) 및 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 인터페론 알파(IFN-α) 아형에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 중화시키는, 단리된 단일클론 항체.
2) 실시 형태 1에 있어서, 인간 IFN-ω 및 인간 IFN-α 아형의 생물학적 활성은 신호 전달물질 및 전사 활성화인자 2(STAT2), 인터페론 조절 인자 9(IRF9) 및 분비 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서의 인터페론 유도성 ISG54 프로모터 하에서의 SEAP의 인간 IFN-ω 또는 인간 IFN-α 아형-유도 발현인, 항체.
3) 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 적어도 약 1×10-9 M 이하, 약 1×10-10 M 이하, 약 5×10-11 M 이하, 또는 약 1×10-11 M 이하의 IC50으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시키는, 항체.
4) 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 생물학적 활성을 중화시키는, 항체.
5) 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 약 1×10-10 M 내지 약 6×10-12 M의 IC50 값으로 인간 IFN-ω의 활성을 중화시키는, 항체.
6) 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 적어도 약 1×10-10 M 이하의 IC50 값으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 인간 IFN-α 아형의 활성을 중화시키는, 항체.
7) 실시 형태 6에 있어서, IFN-α 아형은 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
8) 실시 형태 7에 있어서, 각각 서열 번호 109, 114 및 121의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1(HCDR1), 2(HCDR2) 및 3(HCDR3) 아미노산 서열, 및 서열 번호 118, 119 및 120의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1(LCDR1), 2(LCDR2) 및 3(LCDR3) 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
9) 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 6개의 인간 IFN-α 아형을 중화시키는, 항체.
10) 실시 형태 9에 있어서, 각각 서열 번호 109, 114, 121, 159, 119 및 160의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
11) 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αI, IFN-αJ1, IFN-αK, IFN-αWA 및 IFN-α4a로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 10개의 인간 IFN-α 아형을 중화시키는, 항체.
12) 실시 형태 11에 있어서, 적어도 아미노산 잔기 F27, L30 및 R33에서 서열 번호 1의 인간 IFN-ω와 결합하는, 항체.
13) 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 각각 서열 번호 109, 114, 121, 161, 119 및 162의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
14) 실시 형태 11 내지 실시 형태 13 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 적어도 인간 IFN-α 아형 IFN-αA, IFN-αB2, IFN-αC, IFN-αF, IFN-αG, IFN-αH2, IFN-αJ1 및 IFN-α4a를 중화시키는, 항체.
15) 실시 형태 14에 있어서, IFN-αI, IFN-αK 또는 IFN-αWA를 추가로 중화시키는, 항체.
16) 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서,
a) 250 U/ml의 인터페론에 의해 유도되는 전혈 중에의 백혈구 인터페론-유도 IP-10 방출을, 10 ㎍/ml의 항체의 존재 하에서 약 50% 이상 억제하거나; 또는
b) 전혈 중에의 전신 홍반성 루푸스(SLE) 면역 복합체-유도 IP-10 방출을, 10 μ/ml의 항체의 존재 하에서 약 50% 이상 억제하는, 항체.
17) 실시 형태 1 내지 실시 형태 16 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 서열 번호 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열 및 서열 번호 150과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
18) 실시 형태 1 내지 실시 형태 17 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서,
a) 서열 번호 109의 HCDR1 아미노산 서열;
b) 서열 번호 111, 112 또는 113의 HCDR2 아미노산 서열;
c) 서열 번호 115 또는 116의 HCDR3 아미노산 서열;
d) 서열 번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 또는 91의 LCDR1 아미노산 서열;
e) 서열 번호 93, 94 또는 95의 LCDR2 아미노산 서열; 및
f) 서열 번호 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
19) 실시 형태 18에 있어서,
a) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 77, 93 및 104;
b) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 85, 93 및 96;
c) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 79, 95 및 107;
d) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 76, 93 및 103;
e) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 85, 93 및 96;
f) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 89, 95 및 100;
g) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 86, 93 및 105;
h) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 76, 93 및 103;
i) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 80, 93 및 97;
j) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 84, 93 및 97;
k) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 90, 93 및 97;
l) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 88, 93 및 102;
m) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 87, 93 및 105;
n) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 91, 93 및 106;
o) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 80, 93 및 97;
p) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 83, 93 및 101;
q) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 98;
r) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 78, 95 및 100;
s) 각각 서열 번호 109, 111, 116, 81, 93 및 106;
t) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 82, 94 및 99;
u) 각각 서열 번호 109, 113, 115, 81, 93 및 106;
v) 각각 서열 번호 109, 112, 116, 81, 93 및 106; 또는
w) 각각 서열 번호 109, 113, 116, 81, 93 및 106의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, 항체.
20) 실시 형태 1 내지 실시 형태 19 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 항체.
21) 실시 형태 20에 있어서, 인간 항체 중쇄 가변 영역 프레임워크는 인간 생식세포계열 유전자 IGHV5-51(서열 번호 155)로부터 유래되는, 항체.
22) 실시 형태 21에 있어서, 인간 항체 경쇄 가변 영역 프레임워크는 인간 생식세포계열 유전자 IGKV1D-39(서열 번호 156)로부터 유래되는, 항체.
23) 실시 형태 1 내지 실시 형태 22 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형을 갖는, 항체.
24) 실시 형태 23에 있어서, Fc 영역 내에 적어도 하나의 치환을 갖는, 항체.
25) 실시 형태 24에 있어서, 치환은 치환 M252Y/S254T/T256E, V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S 또는 P238S/L234A/L235A를 포함하며, 여기서 잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 항체.
26) 실시 형태 1 내지 실시 형태 26 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며,
a) VH는 서열 번호 28, 31, 157 또는 158의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
27) 실시 형태 26에 있어서, VL은 서열 번호 35, 39, 40, 42, 46, 52, 53, 54, 57, 61, 62, 68, 71, 73, 75, 135 또는 150의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
28) 실시 형태 27에 있어서,
a) 각각 서열 번호 28 및 40;
b) 각각 서열 번호 28 및 39;
c) 각각 서열 번호 31 및 62;
d) 각각 서열 번호 28 및 54;
e) 각각 서열 번호 31 및 39;
f) 각각 서열 번호 31 및 68;
g) 각각 서열 번호 28 및 42;
h) 각각 서열 번호 31 및 54;
i) 각각 서열 번호 28 및 53;
j) 각각 서열 번호 28 및 73;
k) 각각 서열 번호 28 및 75;
l) 각각 서열 번호 28 및 52;
m) 각각 서열 번호 28 및 35;
n) 각각 서열 번호 28 및 135;
o) 각각 서열 번호 31 및 53;
p) 각각 서열 번호 28 및 46;
q) 각각 서열 번호 28 및 61;
r) 각각 서열 번호 31 및 57;
s) 각각 서열 번호 157 및 71;
t) 각각 서열 번호 28 및 150;
u) 각각 서열 번호 31 및 71;
v) 각각 서열 번호 158 및 71; 또는
w) 각각 서열 번호 28 및 71의 VH 및 VL을 포함하는, 항체.
29) 실시 형태 1 내지 실시 형태 28 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 이중특이성인, 항체.
30) 실시 형태 29에 있어서, BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL 또는 IFN-γ와 결합하는, 항체.
31) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
32) 실시 형태 1 내지 실시 형태 28 중 어느 하나의 실시 형태의 항체 VH 또는 VL, 또는 항체 VH 및 VL을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
33) 실시 형태 32의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
34) 실시 형태 33의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
35) 실시 형태 19의 항체를 생성하는 방법으로서,
항체가 발현되는 조건에서 실시 형태 33의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 생성되는 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
36) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병의 치료에 사용하기 위한, 항체.
37) 실시 형태 36에 있어서, 하기에 사용하기 위한, 항체:
a) 선택적으로 루푸스, 건선, 면역성 혈소판감소증(ITP), 에이카르디-고우티에레스 증후군(AGS), 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 근염, 공통 가변성 면역 결핍증(CVID), 자가면역 갑상선 질병, I형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 질병(GVHD)인, 면역-매개 염증성 질병 또는 자가면역 질병;
b) 선택적으로 HIV 또는 C형 간염 감염인, 만성 바이러스 감염.
38) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 루푸스의 치료에 사용하기 위한, 항체.
39) 실시 형태 38에 있어서, 루푸스는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스(CLE)인, 루푸스에 사용하기 위한, 항체.
40) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 치료하고자 하는 환자는
a) 루푸스 신염을 갖거나; 또는
b) I형 인터페론 시그너처를 나타내는, 면역-매개 염증성 질병 또는 루푸스의 치료에 사용하기 위한, 항체.
41) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, 제2 치료제와 병용하여 실시 형태 37 내지 실시 형태 40에 따라 사용하기 위한, 항체.
42) 실시 형태 41에 있어서, 제2 치료제는
a) BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2, IL-12, IL-23, IFN-αD, IL-17, CD20, IL-10, CD22, IL-21, ICOS, ICOSL 또는 IFN-γ와 결합하는 항체;
b) 코르티코스테로이드, 항말라리아 약물, 면역억제제, 세포독성 약물, 또는 B-세포 조절제; 또는
c) 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 데플라즈코르트, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트 모페틸 (MMF), 마이코페놀레이트 소듐, 사이클로스포린, 레플루노마이드, 타크롤리무스, 리툭시맙™ 또는 벨리무맙™인, 항체.
43) 실시 형태 1 내지 실시 형태 30 중 어느 하나의 실시 형태에 있어서, IFN-αD, IFN-α1 및/또는 IFN-β를 중화시키지 않는, 항체.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
재료 및 방법
ISRE 리포터 유전자 검정("ISRE 리포터 유전자 검정")
(STAT2 및 IRF9를 안정적으로 발현하는) 완전 활성 I형 IFN 신호전달 경로를 발현하도록 조작되고 IFN-α/β 유도성 ISG54 프로모터의 제어 하에서 SEAP 리포터 유전자로 형질감염된 HEK-블루™ IFN-α/β 세포(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비보젠)를 사용하였다. I형 콜라겐 코팅된 T150 플라스크 내에서 37℃, 5% CO2에서 10% 소태아 혈청, 100 ug/ml의 블라스티시딘 및 30 ug/ml의 제오신을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle media) 중에서 세포를 성장시켰다. 세포를 수거하고, ml당 50,000개 세포로 웰당 50 μl로 384웰 플레이트 내에서 플레이팅하였다. 플레이팅된 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 시험되는 인터페론 샘플을 제조하고, 사용된(spent) HEK ISRE 무혈청 배지 중에 희석시키고, 50 μl의 IFN 샘플을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이팅된 세포를 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션 후에, 여과수 중에 재현탁된 60 μl/웰의 퀀티-블루(QUANTI-Blue)™를 사용하여, 20 μl의 플레이팅된 세포 상층액으로부터 알칼리성 포스파타제를 검출하였다. 광학 밀도를 650 nm에서 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
일부의 ISRE 리포터 유전자 검정을 하기와 같이 96웰 플레이트 내에서 행하였다: HEK-블루™ IFN-α/β 세포(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비보젠)를 100 μl의 무선택 배지(DMEM + 글루타맥스(Glutamax)/10% FBS, 깁코(Gibco)) 중에서 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션되게 하였다. 다음날, I형 IFN 자극제를 별도의 96웰 U-바닥 전달 플레이트(transfer plate)(비디 팔콘(BD Falcon)) 내에서 I형 IFN 억제제와 함께 또는 이것 없이 제조하고(즉, 재조합 인터페론, 백혈구 IFN, IC 유도 IFN 조제물, 혈청 등), 37℃에서 10분 동안 예비가온하였다. 세포들의 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내고, 배지를 제거하고 96웰 U-바닥 전달 플레이트 내에서 제조된 100 μl의 적절한 처리제로 대체하였다. 세포를 다시 37℃에서 24시간 동안 두었다. 다음날, 40 μl의 상층액을 160 μl의 퀀티-블루™ SEAP 기질(인비보젠)이 담긴 96웰 편평 바닥 플레이트(비디 팔콘)에 전달하였다. 플레이트를 약 15분 동안 전개되게 하였으며, 이 시간째에 분광계를 사용하여 650 nm의 흡광도로 그것을 판독하였다.
실시예 1. 가용성 IFN-ω가 SLE 환자의 혈액 중에 존재하고 활성이다
중국 난징으로부터의 2개의 독립적인 SLE 코호트(cohort)로부터의 혈장 및 미국에서의 백인 코호트로부터 수집된 혈청을 제조업체의 사용설명서에 따라 베리플렉스(VeriPlex) 인간 인터페론 멀티플렉스 ELISA 키트(피비엘 어세이 사이언스(PBL Assay Science), 카탈로그 번호 51500-1)를 사용하여 멀티플렉스 ELISA를 사용하여 가용성 IFN-ω 및 IFN-α에 대해 분석하였다. 멀티플렉스 ELISA는 IFN-α 아형을 다수 검출하지만 모두 검출하는 것은 아니며, 총 IFN-α 수준 대 IFN-ω 사이의 정량적인 차이를 정확하게 반영하지 않을 수 있다.
IFN-α에 더하여 IFN-ω는 중국 난징 코호트(도 1a) 및 백인 코호트(도 1b) 둘 모두로부터의 각각의 코호트로부터의 소정의 환자에서 상승된 것으로 확인되었다. 도 1a는 상승된 IFN-α 또는 IFN-ω를 갖는 것으로 확인된 환자들만으로부터의 결과를 나타낸다. 백인 그룹으로부터의 혈청 샘플을 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 IFN-I 활성에 대해 추가로 스크리닝하였다. ELISA에 의해 검출가능한 IFN 단백질을 최대량으로 나타내는 공여자는 또한 리포터 유전자 검정에서 ISRE 유도를 최대 수준으로 보여주었다(도 1c).
실시예 2. IFN-ω와 IFN-α의 조합 차단은 IFN-α 차단 단독으로보다 SLE 면역 복합체-유도 IFN의 더 큰 억제를 가져온다
SLE에 존재하는 I형 IFN 환경을 더 우수하게 나타내는 자극제인 SLE 면역 복합체-유도 IFN을 감소시키는, IFN-α 단독으로의 또는 IFN-ω 및 IFN-α 둘 모두의 억제의 효과를 평가하였다. 인간 PBMC를 2명의 개개의 SLE 공여자로부터 제조된 면역 복합체로 자극함으로써 SLE 면역 복합체-유도 IFN을 제조하였으며, 이러한 컨디셔닝된 배지를 IFN 억제제 및 대조군의 존재 하에서 I형 IFN-유도성 리포터 유전자 검정(ISRE 리포터 유전자 검정)에 이용하였다.
면역 복합체 제조
SLE 공여자 232 및 293 혈장(IFN 활성에 대해 미리 스크리닝됨) 및 건강한 대조군 혈장(아스타트 바이올로직스(Astarte Biologics))을 제조업체의 사용설명서에 따라 단백질 A/G 컬럼(서모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 89958)을 사용하여 IgG 정제에 이용하였다. 풀링된(pooled) 건강한 공여자 조제물(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 카탈로그 번호 34005100)로부터의 혈청을 건강한 대조군 IgG의 정제에 사용하였다. 면역 복합체 형성을 위한 용해물을 생성하기 위하여, HEK293T 세포(ATCC, 카탈로그 번호 CRL-3216)를 1X DPBS(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 14190-250) 중에서 5 × 107개 세포/ml로 농축시켰다. 용해물을 생성하기 위하여, 30분의 초기 냉동을 제외하고는, -80℃에서의 냉동 및 37℃에서의 해동으로 10분의 4회 사이클 동안 냉동-해동을 수행하였다. 네 번째의 냉동-해동 후에, 5분 동안 400xg로 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 이어서, 정제된 IgG 조제물 및 세포 용해물을 제조업체의 사용설명서에 따라 BCA 단백질 검정(피어스(Pierce), 카탈로그 번호 23225)을 사용하여 정량화하였다. 면역 복합체화되고 자극되고 컨디셔닝된 배지 조제물을 생성하기 위하여, 건강한 공여자 소듐 헤파린 첨가 혈액으로부터의 PBMC를 세포 제조(Cell Preparation) 튜브(비디 배큐테이너(BD Vacutainer), 카탈로그 번호 362753)를 사용하여 단리하고, 2×106개 세포/ml로 RPMI 1640(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 11875-085) + 10% FBS(라이프 테크놀로지즈, 카탈로그 번호 16140-063) 배지 중에 재현탁시키고, 6웰 플레이트 내에서 2 ml/웰의 부피로 플레이팅하였다. SLE 및 건강한 혈청으로부터의 정제된 IgG를 각각 500 ug/ml의 등가 농도로 세포 용해물과 예비혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 웰당 2 ml의 부피로 PBMC에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, PBMC 면역 복합체-자극된 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 분취하고, 앞으로의 사용을 위하여 -80℃에서 저장하였다.
활성 검정
HEK-블루 IFNα/β 세포(인비보젠)를 96웰 편평 바닥 플레이트 내에서 200 μl의 DMEM(라이프 테크놀로지즈) + 10% 소태아 혈청(라이프 테크놀로지즈) 중에서 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하고, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하여 세포가 플레이트에 접착되게 하였다. 5시간 후에, HEK-블루 세포를 인큐베이터로부터 제거하고, 하기의 처리와 함께 또는 이것 없이 (희석제로서 HEK-블루 세포 배양 배지를 사용하여) 공여자 232 PBMC 컨디셔닝된 배지의 1:6 희석물 또는 공여자 293 컨디셔닝된 배지의 1:81 희석물로 상층액을 대체하였다: 고정 농도의 20 ㎍/ml 동종형 대조군(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 뮤린 IgG1)과 함께 0.4, 2, 10, 50, 및 100 ㎍/ml의 광범위 항-IFN-α 길항제 mAb(M24, 인간 IgG1), 20 ㎍/ml의 항-IFN-ω 길항제 mAb(이바이오바이언스(eBioscience), 클론 OMG5, 뮤린 IgG1)와 병용된100 ㎍/ml의 항-IFN-α, 또는 20 ㎍/ml의 뮤린 IgG1 동종형 대조군과 병용된 100 ㎍/ml의 인간 IgG1 동종형 대조군(서던 바이오텍(Southern Biotech)). 세포를 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 각각의 웰로부터 40 μl의 세포 상층액을 회수하고 별도의 96웰 편평 바닥 플레이트 내에서 160 μl의 퀀티-블루 알칼리성 포스파타제 기질(인비보젠)에 첨가하였다. 상층액을 10분 동안 기질과 반응되게 하였으며, 이 시간째에 플레이트를 650 nm 파장에서 분광광도계 상에서 판독하였다. 광학 밀도를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에서 도표로 나타내었다.
IFN-α 길항제의 존재 하에서의 IFN-ω의 추가적인 차단은 IFN-α 단독의 차단보다 SLE-관련 IFN-I 활성의 향상된 억제를 가져왔다(도 2). 예상된 바와 같이, 건강한 공여자로부터의 면역 복합체로 자극된 PBMC로부터의 컨디셔닝된 배지(HV IC 컨디셔닝된 배지)는 검출가능한 ISRE 활성을 갖지 않았는데, 이는 SLE 환자 면역 복합체의 인터페론 생성 잠재성(interferogenic potential)을 나타낸다.
실시예 3. IFN-ω의 면역조절 효과는 IFN-α의 면역조절 효과와 유사하다
케모카인 분비, IFN 유전자 시그너처, 수지상 세포 성숙 및 활성화, 및 B-세포 성숙을 유도하는 IFN-ω의 능력을 IFN-α와 대비하여 평가하였다. 이들 연구에서는, 가장 널리 사용되는 치료적 IFN-α 분자들 중 2가지인 IFN-αA 및 IFN-α2를 대표적인 IFN-α 아형 대조군으로서 일차적으로 사용하였다. 일부 검정에서는, IFN-αB2를 사용하였다.
케모카인 분비 및 IFN 유전자 시그너처의 유도
6명의 개개의 건강한 인간 공여자로부터 단리된 PBMC를 IFN-αA(IFN-α2) 또는 IFN-ω로 자극하고, 상층액 및 펠릿을 처리 후 3, 6 및 24시간째에 분석을 위하여 수집하였다.하기의 25개의 사이토카인의 패널을 루미넥스(Luminex) 면역검정을 사용하여 상층액으로부터 측정하였다: IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, TNFα, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, Eotaxin, RANTES, 및 MCP-1. IFN-ω 및 IFN-α2 둘 모두는 검출가능한 IP-10, MCP-1, IL-1RA, IL-6, MIP-1α, 및 MIP-1β의 수준을 향상시켰다. 도 3은 IFN-ω 및 IFN-α2에 의한 IP-10의 유도를 나타낸다. IL-8 분비는 이들 실험에서 두 처리 모두에 의해 감소되었다. IL-2R, IL-12 및 RANTES 수준은 (단지 RANTES만이 증가된 한 명의 공여자를 제외하고는) IFN-α 또는 IFN-ω 처리에 의해 변경되지 않았다. 사이토카인 패널 내의 모든 다른 분석물은 IFN-α 또는 IFN-ω 처리에 대해 변화하지 않거나 검출 한계 미만이었다.
수집된 펠릿을 RNA에 대해 처리하고 마이크로어레이에 의해 21-유전자 IFN 패널 시그너처를 사용하여 평가하여, IFN-ω 및 IFN-α 유도 발현에 있어서의 가능한 유사성 및/또는 차이를 평가하였다. IFN-ω로 처리된 인간 PBMC는 IFN-αA-처리된 세포와 대비하여 거의 구별 불가능한 정성적 및 동태학적 유전자 발현 반응을 나타내었다. 비처리 대조군 대비 IFN-αA 처리에 의해 조절된 유전자의 92.5%를 또한 3시간째에 IFN-ω 처리에 의해 조절하였다. 처리 후 6 및 24시간째의 시점에서, IFN-α 처리에 의해 조절된 유전자의 97.83% 및 99.25%를 또한 각각 IFN-ω에 의해 조절하였다(데이터는 나타나 있지 않음).
요약하면, IFN-α 및 IFN-ω는 6명의 개개의 건강한 인간 공여자로부터 획득된 PBMC 조제물들 사이에 구별 불가능한 정성적 사이토카인 방출 및 유전자 발현 프로파일을 유도하였으며, 이는 이들이 유사한 면역조절 효과를 부여할 수 있음을 시사한다.
IFN-ω는 IFN-ω 차단 항체에 의해 억제된 수지상 세포의 분화를 유도한다
단핵구를 DC 분화 및 그 기능성에 이르도록 유도하는 IFN-ω 및 IFN-α의 능력을 평가하였다.
정제된 단핵구를 표준 방법을 사용하여 3일 동안 50 ㎍/ml의 항-IFN-α 또는 항-IFN-ω의 존재 또는 부재 하에서 GM-CSF 단독으로 존재하거나 또는 IFN-α 또는 IFN-ω와 함께 존재하는 상태에서 DC로 분화시켰다. 세포를 수거하고, 8-컬러 FACS에 의해 표면 마커 발현에 대해 분석하였다. IFN-α 및 IFN-ω 둘 모두는 특징적인 DC 표면 마커 발현 CD83, 및 CD80, CD86, CD40, CD11c를 유도하였고, 단핵구 마커 CD14의 발현은 감소시켰다. 배양의 시작 시에 농도 50 ㎍/ml의 항-IFN-α 또는 항-IFN-ω의 첨가는 DC 분화를 부분적으로 억제하였지만, 한편 동종형 항체는 효과를 갖지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음).
혼합 림프구 반응(MLR)을 사용하여 분화된 DC의 기능성을 입증하였다 분화된 DC를 수거하고, 세척하고, 새로운 배지 중에 재현탁시키고, 정제된 CD4+ T 세포와 1:10, 1:20, 및 1:100의 DC:CD4+ T 세포비로 배양하였다. 일수 6에, 상층액을 수집하고, 26개의 사이토카인/케모카인에 대한 멀티플렉스 비드 검정을 사용하여, 분비된 사이토카인에 대해 분석하였다. IFN-α 또는 IFN-ω의 존재 하에서 분화된 DC는 T 세포 특이적 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17의 분비에 의해 나타난 바와 같이 CD4+ 세포를 활성화하였다. 항-IFN-α 또는 항-IFN-ω 항체의 존재 하에서 분화된 DC는 CD4+ T 세포 활성화를 유도하지 않았다. 도 4a는 항-IFN-α 또는 항-IFN-ω 항체의 존재 하에서 분화된 DC에 의해 활성화된 CD4+ 세포로부터 유도된 IFN-γ 분비의 결여를 나타낸다. 도 4b는 항-IFN-α 또는 항-IFN-ω 항체의 존재 하에서 분화된 DC에 의해 활성화된 CD4+ 세포로부터 유도된 IL-17 분비의 결여를 나타낸다. IFN-α 및 IFN-ω는 또한 IL-4, IL-5, IL-12p40 및 IL-13의 분비를 유도하였다(데이터는 나타나 있지 않음). 모든 배양 조건은 GM-CSF를 포함하였다. 데이터는 2개의 연구를 대표한다. 에러 바는 3회 반복된 루미넥스의 SD를 나타낸다. 이 도면에 나타낸 실험에서는, 1:20의 DC 대 CD4 T 세포 비를 사용한 데이터가 예시되어 있다.
IFN-ω는 T-세포 비의존성 B 세포 활성화를 유도한다
B 세포는 병원성 자가항체 및 사이토카인의 생성을 통해, 그리고 T 세포에 항원을 제시함으로써 루푸스 발병기전에 있어서 결정적으로 중요한 역할을 한다. B 세포 활성화 및 기능적 성숙이 T 세포-의존성(TD) 또는 T 세포-비의존성(TI) 방식으로 일어날 수 있다. TI B 세포 반응에서는, TLR 리간드 또는 수지상 세포-유래 사이토카인이 T 세포 헬프(help) 대신 사용될 수 있기 때문에, T-의존성 내성 제어로부터 B 세포가 방출된다. TLR 리간드(예를 들어, 이중 가닥 DNA) 및 DC-유래 사이토카인(예를 들어, I형 IFN) 둘 모두가 질병 발병기전에 기여하는 것으로 여겨지는 SLE에서, TI B 세포 활성화는 유망한 관련 기전을 나타낸다. 자가항체의 생성 이외에도, 자가반응성 B 세포는, 자가항원을 T 세포에 제시하고 전염증성 사이토카인을 분비함으로써 중요한 병원성 역할을 하는 것으로 여겨진다. IFN-α는 T 세포-유래 인자의 부재 하에서 B 세포 수용체(BCR) 및 CpG(각각 특이적 항원 및 TLR-신호를 모방함)에 대한 항체에 의해 활성화된 인간 B 세포에 의해 전염증성 IL-6의 생성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다. 더욱이, 형질세포양 DC와의 공배양(co-culture)은 가용성 인자에 의존성인 CD86 발현 수준에 의해 결정되는 바와 같이 B 세포 활성화를 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 인간 B 세포에 의해 CD86-발현 및 전염증성 사이토카인 생성을 향상시키는 IFN-ω의 능력은 T 세포-비의존성 배양 시스템을 사용하여 연구되었다. 말초 혈액 B 세포를 CpG(ODN-2006), 항-BCR, 및 CpG 및 항-BCR, 그리고 지시된 바와 같은 다양한 농도의 IFN-α2(알파 2b) 또는 IFN-ω(IFN 농도 단위: U/ml)와 함께 배양하였다. 3일 후에 유세포측정에 의해 CD86-발현(중위 형광 수준)을 결정하고, 상층액을, IL-6을 포함하여 26-플렉스 루미넥스 면역검정에 의해 분석하였다. 결과를 2개의 반복 샘플의 평균값 ± SD로서 표현하였다.
항-BCR 및 항-BCR/CpG 자극 시에 CD86 발현의 용량-의존성 IFN-ω-유도 상향조절이, 시험된 두 공여자 샘플 모두에서 관찰되었으며, 한편 자극 없는 B 림프구의 공배양은 단지 약한 효과를 보여주었다. INF-ω는 IFN-α2B와 유사한 정도로 CD86 발현을 유도하였다. 도 5a는 한 명의 공여자로부터의 B 세포로부터의 IFN-ω-유도 CD86 발현을 나타낸다. IFN-ω는 또한 시험된 두 공여자 샘플 모두에서 CpG 및 항-BCR/CpG 자극 시에 IFN-α2B와 유사한 정도로 IL-6-생성을 용량-의존적으로 유도하였다. 도 5b는 한 명의 공여자로부터의 B 세포로부터의 IFN-ω-유도 IL-6 분비를 나타낸다.
IFN-ω는 BLyS 분비를 유도한다
BLyS(BAFF)는 B 세포 생존 인자이고 인간 SLE에서 임상적으로 검증된 표적이다. IFN-α 처리는, 투여 후 24시간째에 환자로부터 단리된 PBMC의 마이크로어레이 및 qPCR 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 생체내에서 BLyS 유전자 발현을 유도하는 것으로 확인되어 있다. 따라서, BLyS의 분비를 유도하는 IFN-ω의 능력을 평가하였다.
PBMC를 2명의 상이한 정상의 건강한 공여자로부터 단리하였다. 등가 농도의 IFN-ω 및 IFN-α를 사용하여 72시간 동안 세포를 자극하였으며, 이 시간째에 상층액을 수집하고 가용성 BLyS에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 결과를 2개의 반복 샘플의 평균값 ± SD로서 표현하였다.
IFN-ω와 IFN-α는 시험관내에서 인간 PBMC 중에의 BLyS의 분비를 유도하는 데 있어서 유사한 능력이 있었다.한 명의 공여자로부터의 결과가 도 6에 나타나 있다.
실시예 4.
면역화, 파지 패닝, 항체 특성화, 및 결정학 연구에 사용되는 인간 I형 IFN 항원의 생성
표 4에 나타낸 20개의 개별 재조합 인간 I형 IFN 알파를 서열 번호 21-25와 같은 신호 서열을 사용하여 표준 방법을 사용하여 HEK 293 세포 내에서 클로닝하고 발현시켰다. 이들 단백질은 달리 기재되지 않는다면 인간 단백질이다. 발현 수준 및 가용성을 개선하기 위하여, 인간 IFN-ω의 위치 80에서의 단일 아미노산 돌연변이체, IFN-ω T80E를 생성하고 HEK 293 세포에서 발현시켰다. T80E IFN-ω 변이체(서열 번호 2)는 야생형 단백질과 비견되는 활성을 가졌다. IFN-αD와 IFN-α1은 위치 114의 하나의 아미노산에 의해 상이하다(발린 대 알라닌). 알파 A와 알파 2는 위치 23의 하나의 아미노산에 의해 상이하다(알파 A에서의 라이신 대 알파 2에서의 아르기닌). 알파 4는 2개의 아미노산에 의해 상이한 2가지 형태, 4a 및 4b를 갖는데, 이때 2개의 아미노산은 위치 51(알파 4a에서의 알라닌 및 알파 4b에서의 트레오닌) 및 114(알파 4a에서의 글루타메이트 대 알파 4b에서의 발린)에 위치한다. 이들 변형은 수용체 결합 영역 외부에 위치되어 활성에 영향을 주지 않는다. 항체는 이들 변이체 쌍(αD/α1, αA/α2 및 α4a/α4b)을 동일하게 잘 중화시키는 것으로 확인되었으며, 이어서 일부 실험에서는 각각의 쌍의 단지 하나의 항원만을 사용하였다.
[표 4]
Figure 112017005865411-pct00007
실시예 5. IFN-α 및 IFN-ω에 결합하는 항체의 생성
IFN-α 및 IFN-ω-결합 Fab를 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]; 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호; 미국 특허 출원 공개 2010/0021477호에 기재된 바와 같이 드 노보 pIX 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택하였다. 간단히 말하면, 인간 스캐폴드를 다양화함으로써 라이브러리를 생성하였는데, 여기서는 생식세포계열 VH 유전자 IGHV1-69*01, IGHV3-23*01, 및 IGHV5-51*01을 H3 루프를 통해 인간 IGHJ-4 미니유전자와 재조합하고, 인간 생식세포계열 VL카파 유전자 O12(IGKV1-39*01), L6(IGKV3-11*01), A27(IGKV3-20*01), 및 B3(IGKV4-1*01)을 IGKJ-1 미니유전자와 재조합하여 완전한 VH 및 VL 도메인을 조립하였다. 단백질 및 펩티드 항원과 빈번하게 접촉하는 것으로 확인된 위치들에 상응하는 H1, H2, L1, L2 및 L3 루프 주위의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 위치들을 다양화를 위해 선택하였다. 선택된 위치들에서의 서열 다양성을 각각의 IGHV 또는 IGLV 유전자들의 IGHV 또는 IGLV 생식세포계열 유전자 패밀리 내의 각각의 위치에서 발생하는 잔기들로 제한하였다. 길이 7 내지 14개 아미노산의 짧은 크기 내지 중간 크기의 합성 루프를 이용함으로써 H3 루프에서의 다양성을 생성하였다. 인간 항체에서 관찰되는 아미노산의 변형을 모방하도록 H3에서의 아미노산 분포를 설계하였다. 라이브러리 설계는 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010]에 상세히 기재되어 있다. 라이브러리를 생성하는 데 이용된 스캐폴드들은 그들의 인간 VH 및 VL 생식세포계열 유전자 기원에 따라 명명하였다. 3개의 중쇄 라이브러리를 4개의 생식세포계열 경쇄 또는 생식세포계열 경쇄 라이브러리와 조합하여, IFN-α 및 IFN-ω에 대한 패닝 실험을 위한 12개의 특유의 VH:VL 조합을 생성하였다.
라이브러리들을 비오티닐화 인간 IFN-α2 또는 비오티닐화 인간 IFN-αG에 대해 패닝하였다. 3 라운드의 패닝 후에, 항원으로서 인간 IFN-α2, IFN-αG 및 사이노몰거스 IFN-ω를 사용하는 다중클론 파지 ELISA를 수행하여 개별 패닝 실험들의 특이적 농축을 검출하였다. IFN-α2, IFN-αG 및 IFN-ω에 대한 바인더의 농축을 보여준 패닝 실험으로부터 수집된 파지를, 개별 Fab 클론들로부터 발현된 Fab 단백질을 바인더로서 사용한 단일클론 Fab ELISA를 사용하여 추가로 스크리닝하였다. 20 nM 비오티닐화 항원에 대한 결합 신호가 음성 대조군보다 3배 더 높은 Fab 클론들을 2차 Fab 스크리닝을 위해 선택하였다. 선택된 Fab를 IgG1/κ 백그라운드 내로 클로닝하고 프로테온 및 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 추가로 특성화하였다. 이들 검정으로부터, mAb IFWM371을 추가의 조작 및 친화성 성숙을 위해 선택하였다.
표 5는 다양한 I형 IFN뿐만 아니라 IFN-β에 대해서도 프로테온 및 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 측정했을 때의 IFWM371에 대한 친화도(KD) 및 IC50 값을 나타낸다. IFN-α1(IFN-αD)을 제외하고, IFWM371은 179 pM 내지 10 nM 범위로 시험된 모든 인간 IFN-알파 단백질에 결합하였다. 이 항체는 IFN-α1(IFN-αD)과 결합하지 않았다. 이 항체는 또한 인간, 침팬지 및 사이노몰거스 IFN-ω와는 결합하였지만, IFN-β와는 결합하지 않았다. IFWM371은, 이 항체가 중화시키지 않은 IFN-α1(αD)을 제외하고는, 모든 시험된 IFN-α 분자에 대해 활성을 중화시킨다는 것을 보여주었다. IFWM371은 VH IFWH591(서열 번호 28) 및 VL PH9L4(생식세포계열 O12)(서열 번호 29)를 함유한다.
[표 5]
Figure 112017005865411-pct00008
실시예 6. IFN-ω T80E와 복합체를 형성한 IFWM371의 결정 구조
IFN-α 아형 및 IFN-ω에 대한 그의 광범위 결합 특이성에 대한 구조적 기초인 에피토프 및 파라토프를 밝혀내기 위하여, 그리고 친화성 및 특이성을 개선하도록 조작에 대한 지지를 제공하기 위하여, IFWM371의 Fab와 복합체를 형성한 인간 IFN-ω T80E의 결정학 연구를 수행하였다.
His-태깅된(tagged) Fab IFWM371(IgG1/카파 동종형)을 HEK293 세포 내에서 클로닝하고 발현시키고, 친화성, 이온 교환 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. Fab를 20 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 수용하였다. C-말단 6xHis-태그를 갖는 인간 IFN-ω T80E 변이체(이하, 간단히 IFN-ω)를 HEK293 세포에서 발현시켰다. 이 단백질을 20 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl 중에 수용하였다.
IFN-ω를 Fab IFWM371과 1.2:1.0의 몰비(과량의 IFN-ω)로 혼합함으로써 복합체를 제조하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 20 mm HEPES pH 7.5, 0.25 M NaCl로 평형화시킨 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에서 정제하고, 이어서 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 10 kDa 컷오프를 사용하여 9.96 mg/ml로 농축시켰다. MMS 시딩(seeding)을 사용하여 20% PEG 3K, 0.2 M 제2 인산암모늄으로부터 X-회절에 적합한 결정을 얻었다(문헌[Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R. & Gilliland, G. L. (2010). Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 927-33]).
X-선 데이터 수집을 위하여, IFN-ω/Fab IFWM371 복합체의 하나의 결정을, 20% 글리세롤로 보충된 모액(20% PEG 3350, 0.2 M (NH4)2HPO4, pH 7.9) 중에 수초 동안 액침하고, 100 K의 질소의 스트림 중에서 급속 냉동시켰다. 오스믹(Osmic)™ 배리맥스(VariMax)™ 공초점 광학장치, 새턴(Saturn) 944 CCD 검출기, 및 X-스트림(X-stream)™ 2000 저온냉각 시스템(미국 텍사스주 소재의 리가쿠(Rigak))이 구비된 리가쿠 마이크로맥스(Rigaku MicroMax)™-007HF 마이크로포커스 X-선 발생기를 사용하여 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 1/4도 이미지에서 205° 결정 회전에 걸쳐 회절 세기를 검출하였다. X-선 데이터를 프로그램 XDS로 처리하였다. X-선 데이터 통계가 표 6에 제공되어 있다.
IFN-ω/Fab IFM371 복합체의 구조를 페이저(Phaser)를 사용하여 분자 치환법(molecular replacement, MR)에 의해 해석하였다. MR에 대한 검색 모델은 Fab15(PDB ID 3NA9; 문헌[Luo, J., Obmolova, G., Huang, A., Strake, B., Teplyakov, A., Malia, T., Muzammil, S., Zhao, Y., Gilliland, G. L. & Feng, Y. (2010). Coevolution of antibody stability and Vkappa CDR-L3 canonical structure. J Mol Biol 402, 708-19]) 및 IFN-α4A의 결정 구조였다. 그러나, 심각한 분자간 충돌(clash)로 인해 IFN-ω에 대해서는 MR 해석을 얻을 수 없었다. Fab IFWM371 단독으로 페이징된(phased) 전자 밀도 맵의 검사는 IFN-ω 분자의 과반수에 대한 전자 밀도가 누락되고 있음을 보여주었다. 그러나, IFN-ω 분자의 나머지 부분은 밀도에서 용이하게 피팅되었다. 이어서, 페닉스(PHENIX)를 사용하여 구조를 정밀화하고(refine), 쿠트(COOT)를 사용하여 모델 조정을 수행하였다.
[표 6]
Figure 112017005865411-pct00009
IFN-ω/Fab IFWM371 복합체의 전체 분자 구조가 도 7a에 나타나 있다. 비대칭 단위 내에 하나의 복합체가 존재하였다. IFN-ω 분자에 대한 분자 모델은, 나선형 절편(helical segment) AB 및 나선 D 및 E에 상응하는, 잔기 23-39 및 119-153을 포함하였다. 잔기 넘버링은 서열 번호 1에 나타낸 IFN-ω 아미노산 서열에 따른다. 나선 A, B 및 C 및 연결 루프들을 무질서화(disorder)하였다. Fab 분자 모델은 경쇄(서열 번호 29)에 대한 1 내지 212의 잔기 및 중쇄(서열 번호 28)에 대한 1 내지 222의 잔기를 함유하였다. C-말단 6xHis 태그, 쇄간(inter-chain) 이황화물 결합 및 중쇄의 137-141의 잔기를 무질서화하였다. 게다가, 광범위한 H-결합 네트워크를 형성한 항체/항원 계면에는 다수의 물 분자가 존재하였다(도 7b).
IFN-ω 분자의 관찰된 부분은 약 40개의 Cα 원자에 대해 평균 Cα rmsd가 0.42 Å(6개의 IFN-α2 분자, pdb 코드 1rh2)인 IFN-α2와 매우 유사하였고, 공개된 IFN-ω의 전장 모델(PDB id 3se4, 40개의 잔기에 대해 0.54 Å의 Cα rmsd)의 상응하는 부분과 거의 동일하였다. IFN-ω/Fab IFWM371에서의 IFN-ω에 대한 모델은 단지 나선 C 및 D의 부분 및 연결 루프(루프 AB)만을 함유하였다. 나머지 다른 부분들은 전자 밀도가 부재하였다. 결정 패킹(packing) 분석은 누락 나선에 대한 충분한 공간(room)이 없었음을 보여주었다. 회절 데이터에 대한 신중한 분석은 이것이 쌍결정형성(twinning) 또는 잘못된 공간군 배정과 같은 이상으로 인한 인위적인 결함(artifact)이 아니었음을 나타내었다. 따라서, IFN-ω 단백질은 결정화 공정 동안에 절단되었을 가능성이 가장 높았다.
Fab IFWM371은 (S25 내지 D35의) AB 루프의 잔기들 및 나선 E의 잔기 M146, 및 K150으로 구성된 입체구조 에피토프를 인식하였다(도 8a). 파라토프는 LCDR2를 제외한 5개의 CDR로부터의 잔기들로 구성된다. 파라토프 잔기들은 일련의 포켓들을 형성하고, 그 안으로 IFN-ω의 짧은 AB 나선의 잔기 F27, L30, 및 R33의 측쇄들을 도킹한다(dock). 도 8b는 IFWM371의 VL 및 VH에서의 파라토프 잔기들을 나타낸다. 항체 및 항원 상호작용은 대부분 반데르 발스(vdw) 및 소수성 패킹뿐만 아니라 항체와 항원 사이의 H 결합인 것으로 나타난다. 도 8c는 IFN-ω와 IFWM371 상호작용 사이의 2D 상호작용 맵을 나타낸다. 이 도면에서, IFN-ω 에피토프 잔기는 회색으로 강조되어 있고, VL 파라토프 잔기는 박스로 표시되어 있고, VH 파라토프 잔기는 원으로 표시되어 있다. 이 도면은 대부분의 항원/항체 상호작용이 IFN-ω AB 나선의 3개의 에피토프 잔기 F27, L30 및 R33에 의해 형성됨을 보여준다. 따라서, IFN-ω의 이 영역이 에피토프의 주요 부분을 구성한다. 이 복합체의 다른 특징은 물 분자가 항원 인식을 매개하는 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다는 것이다. 3개의 물 클러스터(WC)가 계면에 존재하였다. WC1은 HCDR3과 IFN-ω의 R34, F36 및 E147 사이의 H 결합 상호작용에 기여하였다. WC2는 VH/VL 쌍형성 및 Fv와 주 에피토프 잔기 L30, R33 및 그의 이웃들사이의 H 결합을 매개하였다. WC3 물 분자는 계면의 주변에 존재하였는데, 이는 아마도 이들 상호작용에 있어서 덜 중요할 것이다.
IFWM371은 IFN-αD 또는 IFN-α1을 제외하고는 다수의 IFN-α 아형 및 IFN-ω와 강하게 결합한다. IFWM371은 IFN-β와 결합하지 않는다. IFN의 서열 정렬이 도 9에 나타나 있다. IFWM371 에피토프 잔기는 이들 아형 사이에서 대체로 보존되는데, 이는 IFNM371의 광범위 특이성이 에피토프 보존의 결과임을 시사한다. 그러나, IFWM371이 결합하지 않는 IFN-αD 또는 IFN-α1은 F27 대신 S27을 함유하는데, 이는 F27 측쇄의 소수성 접촉부의 대부분의 손실을 초래한다. F27은 HCDR2, HCDR3 및 LCDR3의 잔기들에 의해 형성된 깊은 포켓 내에 도킹되기 때문에, 측쇄 접촉부의 손실은 IFN-αD 및 IFN-α1 단백질에 의한 결합이 매우 적거나 전혀 없는 것에 대한 가장 유망한 설명이 될 것이다. 이는 또한 F27이 결합 "핫 스폿" 잔기들 중 하나임을 시사한다. P26은 덜 잘 보존되는 잔기이다. His 또는 Leu 잔기가 몇몇 IFN-α 아형에서 이 위치를 차지한다. 크기 및 형상 차이로 인해, 이 잔기는 이들 돌연변이를 갖는 IFN-α와 IFWM371 사이의 국소 상호작용에 상당한 영향을 줄 수 있다.
실시예 7. IFWM371의 알라닌 스캔
IFWM371 중쇄 및 경쇄 CDR 잔기의 알라닌 스캔을 수행하여 후속의 친화성-성숙 작업을 이끌었다. 용매에 낮게 노출되거나 용매에 노출되지 않은 일부 잔기를 제외하고는, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 CDR 내의 모든 잔기를 알라닌으로 대체하였다. CDR에서의 음성 잔기들이 알라닌이었을 경우에는, 이들을 티로신 및/또는 세린 및/또는 아스파르트산으로 대체하였다. 가능한 개발가능성 부담(developability liabiliy)을 갖는 하나의 위치(IFWH591, 서열 번호 28 내의 W104)를 알라닌, 티로신, 세린, 및 아스파르트산으로 대체하였다. 돌연변이된 mAb를 HEK 293 세포에서 일시적으로 발현시켰으며, ELISA에 의해 IFN들의 패널에 대한 결합 활성에 대해 세포 상층액을 시험하였다. 2개의 VH 돌연변이체, IFWH591 R59A(서열 번호 30) 및 IFWH591 N103A(서열 번호 31)는 모 mAb와 대비하여 상당히 개선된 결합을 가졌다.
실시예 8. IFWM371의 친화성-성숙
라이브러리 설계
2개의 별개의 VL 라이브러리(PH9L4L2 및 PH9L4L3)를 설계하고 IFWM371 경쇄 PH9L4(O12)(서열 번호 29)의 친화성-성숙을 위해 사용하였다. 라이브러리 PH9L4L2의 다양화를 위해 선택된 위치들은 항-단백질 및 항-펩티드 복합체에서 빈번하게 확인되는 잔기 위치들에 기초하였다. 각각의 위치를 다양화하기 위해 사용된 잔기들을 IGKV 유전자들의 생식세포계열 유전자 패밀리 내에 인코딩하였다(문헌[Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96]). 라이브러리 복잡성(library complexity)을 107개의 라이브러리 구성원을 초과하지 않도록 제한하여, 친화성 성숙 동안 다양성을 완전히 평가할 수 있도록 하였다(실제의 라이브러리 복잡성: 3.57). 표 7은 이 라이브러리에서의 VL PH9L4(O12)의 LCDR1 위치 30, 31 및 32, LCDR2 위치 50 및 LCDR3 위치 91, 92, 93, 94 및 96에 대한 라이브러리 설계 다양화 스킴(scheme)을 나타낸다. 잔기 넘버링은 카밧에 따른다.
[표 7]
Figure 112017005865411-pct00010
제2 경쇄 친화성-성숙 라이브러리, PH9L4L3에서 다양화시키고자 하는 잔기 위치들을 항체-단백질 복합체들 사이의 구조의 분석에 기초하여 선택하였으며, 각각의 위치에서의 다양성을, 항체 단백질 구조뿐만 아니라 각각의 위치에 대한 생식세포계열 유전자에서의 아미노산 사용의 분석에 기초하여 설계하였다(문헌[G. Raghunathan et al, Antigen-binding site anatomy and somatic mutations in antibodies that recognize different types of antigens. J. Mol Recognit. 25:103-113 (2012)]). LCDR3의 경우, 각각의 위치가, 상이한 생화학적 특성들(즉, 극성/비극성, 양으로/음으로 하전됨)의 아미노산들을 가짐을 보장하도록 천연 레퍼토리를 넘어서 다양성을 확장시켰다. 추가적으로, 위치당 각각의 아미노산의 상대 빈도를 변동시켰는데, 이는 슬로닝(Sloning) 라이브러리 합성 기술을 사용하여 가능하게 하였다. 표 8은 PH9L4L3의 라이브러리 조성을 나타낸다. 잔기 넘버링은 카밧에 따른다.
[표 8]
Figure 112017005865411-pct00011
패닝 및 특성화
경쇄 라이브러리 PH9L4L2 또는 PH9L4L3을 모 중쇄 IFWH591(서열 번호 28)과 조합함으로써 친화성 성숙 라이브러리들을 생성하였다. 이어서, 라이브러리들을 고친화성 항체들을 선택하기 위하여 패닝에 사용하였다. 일부 친화성-성숙 패닝 실험들은, 결합에 있어서, 단지 IFN-ω에만 결합하거나 또는 단지 몇몇 IFN-α 아형에만 결합하였을 뿐, 그러나 둘 모두에 결합하지는 않은 편향된 개선을 보여주었다. 대부분의 IFN-α 아형 및 IFN-ω에 대하여 개선된 IC50으로 광범위하게 중화시키는 항체를 생성하기 위하여, 서로 더 다양화된 IFN-α 아형들(IFN-α2, IFN-α4a, IFN-αF 및 IFN-αG)의 하위세트를 각각의 패닝 라운드 사이에 사이노몰거스 원숭이 또는 인간 IFN-ω로 대안적으로 패닝하였다. 각각의 패닝 실험에 대해 총 3 라운드의 패닝을 수행하였다.
개별 클론들의 Fab 단백질을 TG-1 E. 콜라이(E.coli)에서 발현시켰으며, 세균 세포 용해물을 Fab ELISA에 사용하여, IFWM371과 대비하여 인간 IFN-α4a, IFN-αF 및 IFN-ω에 대한 그의 친화성을 결정하였다. IFWM371 Fab는 이들 항원과 약하게 결합하였기 때문에, 항원들에 대해 더 높은 친화성을 갖는 Fab IFWF477을 비교를 위한 대리(surrogate) Fab로서 사용하였다. ELISA에서 대리 Fab보다 수배 더 높은 결합 활성을 나타낸 42개의 클론을 확인하였다. 일부 변이체는 LCDR1 상에 하나의 아미노산 삽입을 함유하였는데, 이는 원래의 라이브러리 설계의 일부가 아니었고 라이브러리 합성 동안에 도입시킨 것이었다. 전체적으로, VL 의 친화성 성숙은 대리 Fab와 대비하여 결합에 있어서 상당한 개선을 가져왔다. 이들 2개의 라이브러리로부터의 최상의 클론들은 각각 대리 Fab IFWF477보다 인간 IFN-ω에 대해 23배 초과로 더 높은 결합 활성을 나타내었다.
추가의 기능적 및 생물물리학적 특성화를 위하여, 이들 라이브러리로부터 유래된 총 42개의 경쇄를 모 중쇄 IFWH591(서열 번호 28)뿐만 아니라, 실시예 7에 기재된 알라닌 스캐닝 실험으로부터 확인된, 개선된 결합 활성을 갖는 2개의 VH 변이체, IFWH624(IFWH591 R59A, 서열 번호 30) 및 IFWH629(IFWH591 N103A, 서열 번호 31)와 쌍형성시켰다. 이어서, 총 126개의 전환된 mAb(3개의 중쇄와 쌍형성된 42개의 경쇄)를 발현시키고 추가로 특성화하였다. 표 9는 모 항체 및 선택된 친화성-성숙된 항체 및 그들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 나타낸다.
[표 9]
Figure 112017005865411-pct00012
Figure 112017005865411-pct00013
Figure 112017005865411-pct00014
인간 IFN-ω 및 인간 IFN-α 아형의 패널에 대한 126개의 생성된 mAb의 친화도를 프로테온에 의해 측정하였다. 이들 mAb를 48웰 플레이트 내에서 HEK 293E 세포에서 대조군과 함께 3회 반복하여 일시적으로 형질감염시키고, 세포 상층액을 이 실험에 사용하였다. 검정 처리율(assay throughput)을 증가시키기 위하여, 개별 항원의 단지 하나의 농도를 사용하였다. 표 10은 모 IFWM371 및 선택된 친화성-성숙된 항체에 대한 KD 값을 나타낸다.이들 mAb의 대부분은 시험된 모든 항원에 대한 결합 친화성의 상당한 개선을 나타내었다. 이들 중 일부는 모 mAb에 비하여 100배 초과의 개선을 나타내었다.
[표 10]
Figure 112017005865411-pct00015
Figure 112017005865411-pct00016
Figure 112017005865411-pct00017
126개로 된 패널로부터의 선택된 항체들을 IFN-α 아형 및 IFN-ω의 스펙트럼을 억제하는 그들의 능력에 대하여 ISRE 검정에서 특성화하였으며, 그들의 가용성 및 생물물리학적 특성을 평가하였다. ISRE 검정으로부터의 IC50 값이 선택된 항체들에 대해 표 11 및 표 12에 나타나 있다. IC50 값은 11개의 재조합 IFN-α 아형에 대하여 그리고 IFN-ω에 대하여 몇몇 항체에 있어서 두 자릿수 pM 이하였다. 이는 모 mAb, IFWM371에 비하여 100배 초과의 개선을 나타내는데, 이때 모 mAb, IFWM371은, 그의 항원들에 대한 그의 IC50이 한 자릿수 내지 두 자릿수 nM의 범위였다. 모 항체로서, 친화성-성숙된 항체들은 IFN-αD 또는 IFN-β를 중화시키지 않았다. 가장 강력한 친화성-성숙된 항체 mAb IFWM3423은 그것이 결합한 모든 인터페론 아형들에 대해 거의 한 자릿수 피코몰 IC50을 가졌다.
[표 11]
Figure 112017005865411-pct00018
[표 12]
Figure 112017005865411-pct00019
실시예 9. 번역 후 변형 위험을 최소화하기 위한 항체의 조작
중화 활성, 가용성 및 생물물리학적 특성에 기초하여, IFWM371, IFWM3331(IFWB3066), IFWM3399(IFWB3134), IFWM3421(IFWB3156) 및 IFWM3423(IFWB3158)의 친화성 성숙으로부터 유도된 4개의 mAb를 추가로 분석하였다. 이들 mAb의 중쇄는 IFWH591(서열 번호 28) 또는 IFWH629(서열 번호 31)로 이루어지고, 이들의 경쇄는 IFWL984(서열 번호 71) 또는 IFWL1048(서열 번호 53) 또는 IFWL1073(서열 번호 61)으로 이루어진다.
두 VH 쇄 모두는 그들의 CDR 내에 몇몇 잠재적인 번역 후 변형(PTM) 모티프를 함유하며, 이에는 산-촉매 가수분해 서열 모티프(D52-P53), HCDR2 상의 이성질화 모티프(D55-S56), 및 HCDR1 및 CDR-H3 상의 잠재적인 산화 부위 - HCDR1(W33) 및 CDR-H3(W104) - 가 포함된다.
IFWL984(서열 번호 71) 및 IFWL1048(서열 번호 53)의 VL은 LCDR1 상에 하나의 이성질화 모티프(D30-G31)를 함유하며, 한편 IFW1073(서열 번호 61)의 VL은 LCDR3 상에 잠재적인 산화 부위(W92 및 W94)를 그리고 LCDR1 상에 잠재적인 탈아미드화 부위(N31-S32)를 함유한다.
중쇄 CDR에 대한 PTM 위험을 감소시키기 위하여, HCDR2 내의 D52를 생식세포계열 잔기 티로신으로 복귀-돌연변이시켰다(D52Y). P53을 알라닌으로 돌연변이시켰다. HCDR3 내의 W104(VH_W104)를 알라닌, 티로신, 세린 또는 아스파르트산으로 대체하였다. 돌연변이된 중쇄들을 3개의 상이한 경쇄와 공발현시키고, ISRE 검정에서 시험하였다. 이들 실험으로부터, 중쇄 IFWH615(서열 번호 157) 및 IFWH617(서열 번호 158)을 갖는 항체를 추가로 특성화하였다.
VL IFWL984(서열 번호 71) 및 IFWL1048(서열 번호 53)에 대한 PTM 위험을 감소시키기 위하여, 잠재적인 PTM 모티프를 제거하기 위한 일련의 돌연변이들을 실시예 6에 기재된 IFWM371/IFN-ω 복합체 구조로부터 획득된 구조 정보의 지침에 따라 설계하였다. 게다가, 공통 경쇄 IFWL984를 갖는 IFWM3421(IFWB3156) 및 IFWM3423(IFWB3158)의 가용성을 개선하기 위하여, 그들의 CDR 내의 몇몇 소수성 잔기 상에서 일련의 돌연변이들을 행하여 항체 경쇄의 전체 표면 소수성을 감소시켰다. IFWL984 변이체를 모 중쇄 IFWH591과 함께 HEK293E 세포에서 발현시키고, 세포 상층액 중에 있는 발현된 항체를 실시예 11에 기재된 방법을 사용하여 IFN-ω 및 백혈구 IFN의 억제를 위한 ISRE 리포터 유전자 검정에서 스크리닝하였다. 생성된 항체 IFWB3196(D30E, F32Y), IFWB3201(D30S, G31S), 및 IFWB3202(D30S, G31S, F32Y)는 우수한 중화 활성을 유지하였다. 표 13은 모 IFWH591 중쇄 가변 영역(서열 번호 28) 및 변이 IFWL984 경쇄를 갖는 생성된 항체들의 VL 서열을 나타낸다. 모 IFWM3421은 IFWH591 VH를 갖고, 모 IFWM3423은 IFWH629 VH를 갖는다. 표 14는 선택된 생성된 항체의 IFN-ω 및 백혈구 IFN의 중화에 대한 IC50 값을 나타낸다.
[표 13]
Figure 112017005865411-pct00020
[표 14]
Figure 112017005865411-pct00021
유사하게, PTM 위험을 감소시키기 위해 26개의 IFWL1048 변이체를 작제하였다. 생성된 경쇄들을 HEK293E 세포에서 중쇄 IFWH591과 함께 공발현시키고, 항체를 함유하는 상층액을 ISRE 검정으로 스크리닝하였다. 표 15는 생성된 항체들의 VH 및 VL 서열을 나타내고, 표 16은 IFN-ω 및 백혈구 IFN에 대한 항체들의 IC50 값을 나타낸다. LCDR1 내의 DG 모티프(D30-G31)를 제거한 변이 IFWL1048 쇄를 갖는, IFWB3210(D30S), IFWB3211(D30E) 및 IFWB3223(D30S, G31S)을 포함한, 생성된 항체들은 모 mAb, IFWB3056(VL: IFWL1048, VH: IFWH591) 및 IFWB3134(VL: IFWL1048; VH: IFWH629)와 유사한 중화 활성을 나타내었다. 그러나, DG 모티프가 제거되고 치환을 행하여 소수성을 감소시킨 변이 IFWL1048 쇄를 갖는, IFWB3219(D30E, A32Y), IFWB3227(D30S, G31S, F94L) 및 IFWB3230(D30S, G31S, A32Y, F94L)을 포함한, 생성된 항체들은 모 mAb보다 더 낮은 활성을 보여주었다.
[표 15]
Figure 112017005865411-pct00022
[표 16]
Figure 112017005865411-pct00023
IFWB3066의 VL IFWL1073 상의 잠재적인 PTM 모티프는 LCDR3 상의 잠재적인 산화 부위(W92 및 W94)를 포함하였다. IFWL1073의 LCDR3(QQGWDWPLT; 서열 번호 98)을 다수의 친화성-성숙된 항체들의 LCDR3 내에 존재하는 것으로 확인된 공통 LCDR3 서열(QQSYDFPLT; 서열 번호 154)로 대체하였다. 게다가, LCDR1 상의 잠재적인 탈아미드화 부위(N31-S32)에 대처하기 위하여 몇몇 돌연변이체를 설계하였다. IFWL1073의 14개의 생성된 변이체를 IFWH591과 쌍형성시키고, 48웰 HEK293E 일시적 형질감염으로 발현시켰다. 세포 상층액들을 재조합 인간 IFN-ω 및 바이러스-유도 백혈구 발현된 IFN에 대한 그들의 중화 활성에 대한 ISRE 검정에서 직접 시험하였다. 돌연변이 W93Y 및/또는 W95F를 갖는 mAb는 중화 활성에 있어서 약간의 개선을 나타내었다. 치환에 의해 또는 CDR-L1을 짧게 함으로써 NS 모티프를 제거하기 위한 돌연변이체는 중화 활성의 감소 또는 손실을 나타내었다. 표 17은 생성된 항체들의 VH 및 VL 서열을 나타내고, 표 18은 IFN-ω 및 백혈구 IFN에 대한 IC50 값을 나타낸다.
[표 17]
Figure 112017005865411-pct00024
[표 18]
Figure 112017005865411-pct00025
PTM 위험을 최소화하기 위한 조작 작업으로부터 유도된 선택된 VL 변이체들을 IFWH591 또는 IFWH629와 쌍형성시키고, 발현 및 정제를 위해 규모를 확대하였다. 표 19는 항체들의 VL/VH 쌍형을 나타낸다. 표 20은 다양한 재조합 IFN-α 아형 및 IFN-ω에 대한 선택된 생성된 항체들의 IC50 값을 나타낸다.
[표 19]
Figure 112017005865411-pct00026
[표 20]
Figure 112017005865411-pct00027
실시예 10. 항-IFN-α/ω 항체의 광범위 중화 능력
생성된 항체들 중 몇몇은, 전술된 ISRE 검정을 사용하여 측정된, 100 pM 이하의 IC50으로 IFN-ω 및 다수의 IFN-α 아형을 중화시켰다. 이들 항체의 가변 영역 서열이 표 21에 나타나 있다.표 22는 이들 항체의 LCDR1 서열을, 표 23은 LCDR2를, 표 24는 LCDR3을, 표 25는 HCDR1을, 표 26은 HCDR2를, 그리고 표 27은 HCDR3을 나타낸다. 도 10은 ISRE 검정에서 각각의 I형 IFN에 대한 IC50 값을 나타낸다.
[표 21]
Figure 112017005865411-pct00028
[표 22]
Figure 112017005865411-pct00029
[표 23]
Figure 112017005865411-pct00030
[표 24]
Figure 112017005865411-pct00031
[표 25]
Figure 112017005865411-pct00032
[표 26]
Figure 112017005865411-pct00033
[표 27]
Figure 112017005865411-pct00034
실시예 11. 항-IFN-α/ω 항체는 백혈구 IFN을 중화시킨다
백혈구 IFN을 중화시키는 항체의 능력을 전혈로부터의 IFN-유도 IP-10 방출을 억제하는 항체의 능력에 의해 평가하였다.
친화성-성숙 캠페인으로부터의 또는 PTM 위험을 최소화한 후의 선택된 항체들을 내인성 I형 IFN을 억제하는 그들의 능력에 대해 추가로 특성화하였다. 모든 특성화된 항체들은 IgG1/κ 유형을 가졌다. 항체 IFWM3522, IFWM3525, IFWM3399 및 IFWM3423을 이 검정에서 사용하였다.
IP-10 방출 검정:
240 μl의 전혈(바이올로지컬 스페셜티 코포레이션(Biological Specialty Corporation))을, 세포 배양 배지(10% HI FBS 및 1% penn strep을 갖는 RPMI1640) 중에 희석된 IFN 또는 IFN-함유 컨디셔닝된 배지와 함께 또는 이것 없이, 30μl의 항체(항 IFN-α/ω 또는 동종형 대조군)를 함유하는 96웰 U-바닥 플레이트 내의 개별 웰들에 첨가하였다. 자극을 위하여, 인간 백혈구 IFN(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 250 U/ml(최종 부피)로 이용하고, SLE 면역 복합체-처리된 컨디셔닝된 배지를 웰당 10 μl로 이용하였다. IFN 및 항체 혼합물을, 전혈을 첨가하기 전에 실온에서 20 내지 30분 동안 사전 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃에서 20 내지 22시간 동안 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 플레이트를 실온에서 5분 동안 400xg로 원심분리하고, 혈장을 제거하고 -20℃에서 냉동시켰다. 각각의 처리로부터의 2개의 반복 샘플을 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 CXCL10/IP-10 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 해동 시에, 수집된 혈장을 샘플 희석 완충액을 사용하여 2.5배 희석시켜 이 검정에서 사용하였다. 제조업체의 프로토콜을 따르되, 하기와 같이 표준물의 희석에 약간의 변형을 가하였다. 4000 pg/ml의 농도에서 시작하여 31.25 pg/ml로 종료되는, 항원 표준물의 2배 연속 희석물을 제조하였다. 플레이트를 반응을 중지한 지 30분 이내에 450 nm에서의 흡광도로 판독하였다. 소프트맥스 프로(Softmax Pro)를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과
선택된 항체들을 관련 세포 유형에서 내인성 IFN-I 조제물을 중화시키는 그들의 능력에 대해 특성화하였다. 전혈의 IFN-I 자극은 시험관내 및 생체내에서의 IP-10(CXCL10) 방출을 유도한다(문헌[Arico, E. et al. Concomitant detection of IFNalpha signature and activated monocyte/dendritic cell precursors in the peripheral blood of IFNalpha-treated subjects at early times after repeated local cytokine treatments. J Transl Med 9, 67, doi:10.1186/1479-5876-9-67 (2011)]; 문헌[Mohty, A. M. et al. Induction of IP-10/CXCL10 secretion as an immunomodulatory effect of low-dose adjuvant interferon-alpha during treatment of melanoma. Immunobiology 215, 113-123, doi:10.1016/j.imbio.2009.03.008 (2010)]). IP-10이 SLE에서 상승되고, 몇몇 연구에서는 질병 활성 및 질병의 임상 징후와 상관관계를 갖는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Bauer, J. W. et al. Interferon-regulated chemokines as biomarkers of systemic lupus erythematosus disease activity: a validation study. Arthritis and rheumatism 60, 3098-3107, doi:10.1002/art.24803 (2009)]; 문헌[Kong, K. O. et al. Enhanced expression of interferon-inducible protein-10 correlates with disease activity and clinical manifestations in systemic lupus erythematosus. Clinical and experimental immunology 156, 134-140, doi:10.1111/j.1365-2249.2009.03880.x (2009)]; 문헌[Rose, T. et al. IFNalpha and its response proteins, IP-10 and SIGLEC-1, are biomarkers of disease activity in systemic lupus erythematosus. Annals of the rheumatic diseases 72, 1639-1645, doi:10.1136/annrheumdis-2012-201586 (2013)]).
백혈구 IFN에 의해 유도된 전혈 중에의 IP-10 방출을 억제하는 항 IFN-α/ω mAb의 능력을 시험관내에서 조사하였다. IFN-I은 감염성 인자, 예컨대 바이러스에 따라 급속히 생성되어, 감염의 제어를 돕는다. 인간 백혈구 IFN은 바이러스 감염 후에 백혈구에 의해 생성되는 IFN들의 천연 혼합물이고, 대체로 IFN-α 아형 및 IFN-ω로 구성된다. IFN-ω는 이들 조제물에서의 총 IFN-I 활성의 대략 15%를 구성하는 것으로 여겨진다. 중요한 것은, 감염은 SLE의 유도 및 증악(exacerbation) 둘 모두에 잠재적으로 기여하는 것으로 여겨진다는 것이다. 이 연구에서는, 인간 백혈구 IFN을 억제제 또는 대조군의 존재 하에서 2명의 건강한 인간 공여자로부터의 전혈 샘플에 첨가하고, IFN 노출 후 24시간째에 IP-10 방출에 대해 혈장을 평가하였다. 항 IFN-α/ω mAb: IFWM3522 및 IFWM3525(도 11a), 및 IFWM3399(도 11b) 모두는 시험된 2명의 공여자 모두에서 백혈구 IFN-유도 IP-10 방출을 용량-의존적으로 중화시켰다.
실시예 12. 항-IFN-α/ω 항체는 SLE 면역 복합체를 중화시킨다
SLE의 특징은, 전형적으로 임상적으로 정의된 질병의 발달에 앞서 나타나는 자가항체, 예컨대 항-이중 가닥 DNA(항-dsDNA)의 존재이다. 핵산 리간드에 결합된 자가항체는 SLE 환자에서 I형 IFN의 내인성 유도인자인 것으로 여겨진다. 자가항원의 손상된 클리어런스와 함께 자가항체의 우세성은 IFN 생성의 피드백 사이클을 초래하는데, 여기서는 형질세포양 수지상 세포(pDC) 내로의 면역 복합체의 Fc 수용체-의존성 내재화가 증가된 양의 순환 IFN 및 IFN 유전자 시그너처의 확립을 초래한다.
본 발명자들은 질병과 더 관련된 내인성 IFN 조제물을 중화시키는 항-IFN-α/ω 항체의 능력을 추가로 시험하였다.
본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 면역 복합체를 제조하였다. 이어서, 이들 SLE 환자-유래 면역 복합체를, 세포 배양물(IC92 및 IC163)로부터 수집된, 건강한 공여자 PBMC 및 IFN-함유 컨디셔닝된 배지에 첨가하였다. 다음으로, 컨디셔닝된 배지를 억제제 또는 대조군의 존재 하에서 4명의 건강한 공여자로부터의 건강한 공여자 전혈에 첨가하여 IFN-유도 IP-10 방출에 대한 IFN-α/ω 중화의 영향을 결정하였다. IFWM3522, IFWM3525, 및 IFWM3399 모두는 시험된 모든 전혈 공여자에서 SLE 면역 복합체-유도 IFN 조제물 둘 모두를 사용하여 IP-10 방출을 용량-의존적으로 중화시켰다. 도 12a는 한 명의 공여자(SLE 공여자 92)로부터의 항체 IFWM3522 및 IFWM2525에 의한 인간 전혈에서의 SLE 면역 복합체-유도 IFN-자극된 IP-10 방출의 중화를 나타낸다. 도 12b는 항체 IFWM3399 및 동종형 대조군에 대한 결과를 나타낸다.
실시예 13. 항-IFN-α/ω 항체는 SLE 혈장을 중화시킨다
항 IFN-α/ω mAb는 무균성 리간드(면역 복합체; 실시예 12) 및 미생물 리간드(백혈구 IFN; 실시예 11) 둘 모두에 대한 노출 후에 인간 1차 세포로부터 생성된 내인성 IFN-I 조제물의 강력한 용량-의존성 중화를 보여주었다. 생리학적 I형 IFN을 중화시키는 IFN-α/ω mAb의 효력을 SLE 환자 혈청 및 혈장으로부터의 IFN-I 활성을 중화시키는 항체의 능력에 의해 추가로 평가하였다. 따라서, 이러한 접근은 시험관내에서의 반복이 어려울 수 있는 IFN 스펙트럼을 함유할 수 있는 환자로부터의 실제의 순환 IFN-I 환경을 중화시키는 항체의 능력을 평가한다.
SLE 혈청을 사용한 ISRE 검정:
HEK 블루(α/β) 세포(인비보젠)를 200 μl의 DMEM + 10% FBS의 총 부피로 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 이 검정에서 30분의 인큐베이션 후에 1.0 이상의 OD를 달성하는 것에 기초하여 미리 선택된 풀링된 혈장(3명의 공여자) 또는 혈청(13명의 공여자)을 해동시키고 DMEM + 10% FBS와 1:1 (v/v) 비로 혼합하였다. 상층액을 미리 플레이팅된 HEK 블루 세포로부터 제거하고, 100 μl의 SLE 혈장 또는 혈청/배지 혼합물로 대체하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션되게 하였다. 다음날, 40 μl의 컨디셔닝된 배지를 제거하고, 새로운 플레이트 내에서 160 μl의 퀀티-블루 기질(인비보젠)에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션되게 하였다. 650 나노미터 파장에서 분광광도계를 사용하여 플레이트를 판독하고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
결과
환자들의 중국인 코호트(SLE 코호트 1)로부터의 SLE 혈청 및 주로 아프리카계 미국인으로 된 코호트(SLE 코호트 2)로부터의 SLE 혈장을 ISRE 검정을 사용하여 IFN-I 활성에 대해 사전 스크리닝하였다. OD가 약 1.0 이상인 SLE 공여자 혈청 또는 혈장 샘플은, 길항제 항체에 의한 억제가 용이하게 측정될 수 있도록 IFN-I 활성의 충분한 범위(window)를 갖는 것으로 결정되었다. 이어서, 이들 공여자 샘플을 풀링하여 혈청 또는 혈장 스톡을 생성하여, 반복 실험 및 항체 적정을 가능하게 하기에 충분한 샘플 부피를 생성하였다. SLE 환자에서의 정성적 및 정량적 IFN-I 반응에서의 잠재적인 다양성을 더 우수하게 포착하기 위하여, 다양한 인종/민족 코호트로부터의 SLE 환자 샘플을 이용하였다. 아프리카계 미국인 및 아시아인 공여자는 백인 공여자보다 더 높은 IFN-I 활성을 갖는 것으로 여겨진다. 시험된 항-IFN-α/ω mAb는 풀링된 SLE 환자 혈청 및 혈장 샘플에서 IFN-I 활성을 용량-의존적으로 중화시켰다. 두 SLE 코호트 모두로부터의 풀링된 샘플을 사용한 2개의 독립적인 실험으로부터의 IC50 값이 표 28에 나타나 있다.
[표 28]
Figure 112017005865411-pct00035
실시예 14. 항-IFN-α/ω 항체는 IFN 유전자 시그너처를 중화시킨다
I형 IFN은, 건강한 대조군과 대비하여 일부 SLE 환자에서 또한 과발현되는 유전자들의 스펙트럼을 유도한다. 이 IFN 유전자 시그너처를 나타내는 SLE 환자로부터의 혈장 샘플은, 건강한 공여자 PBMC 또는 세포주에 첨가될 때, 유사한 유전자 세트의 과발현을 유도할 수 있고, 이러한 활성은 IFN-α를 표적화하는 항체에 의해 우세하게 중화된다(문헌[Hua et al.,Arthritis and rheumatism 54, 1906-1916, doi:10.1002/art.21890 (2006)]).
SLE 환자의 헤파린 첨가된 전혈 내에 존재하는 IFN-I 시그너처의 정상화에 대한 항체의 영향을 결정하기 위해 검정을 개발하였다. IFN-I 유도성 유전자 MX1(믹소바이러스 내성 1) 발현을 IFN-I 활성에 대한 마커로서 사용하였다.
재료
소듐 헤파린 튜브 내로 SLE 또는 건강한 혈액을 수집한 후 2 내지 4시간째에, 항-IFN-α/ω 항체 또는 인간 IgG1 동종형 대조군이 담긴 96웰 U-바닥 플레이트 내로 240 μl를 플레이팅하였다. PBS 중에 희석된 항체를 240 μl의 혈액에 웰당 30 μl로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 인큐베이션 후에, 745 μl의 팍스진(PAXgene) 안정화 시약(퀴아젠)을 96 깊은 웰 플레이트에 첨가하고, 혈액 샘플을 전달하고 피펫팅(pipetting)에 의해 완전히 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고, 추가의 처리 시까지 -80℃에서 냉동시켰다. 해동 후에, 샘플을 2 ml 안전-잠금(Safe-Lock) 튜브(에펜도르프(Eppendorf))에 전달하고, 10분 동안 5000xg로 회전시켰다. 상층액을 흡인하고, 샘플 펠릿을 와동에 의해 432 μl의 DNase/RNase 무함유 물 중에 재현탁시켰다. 샘플을 5000xg로 추가로 원심분리하고, 펠릿을 350 μl의 BR1 완충액 중에 재현탁시켰다. 다음으로, 300 μl의 BR2 완충액을 첨가한 후, 40 μl의 프로테이나제 K 및 샘플을 첨가하고, 55℃에서 인큐베이션하고 800 rpm으로 10분 동안 진탕하였다. 남은 정제에 대해서는 제조업체의 프로토콜을 따랐다(퀴아젠, 카탈로그 번호 762164). 각각의 샘플로부터의 120 ng의 총 RNA를 아이스크립트(iScript) cDNA 합성 키트(바이오-라드(BIO-RAD))를 사용하여 cDNA로 전환시키고, 인간 MX1 및 베타 액틴(ACTB)(각각 카탈로그 번호 Hs00895608_m1 및 Hs01060665_g1)에 대한 프라이머/프로브 쌍을 qPCR에 이용하였다. Viia7 실시간 PCR 시스템에서 데이터를 수집하고, 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였는데, 이는 ACTB에 대해 MX1의 발현에 있어서의 변화(dCT)를 나타낸다.
결과
환자 혈액에서 IFN-I 시그너처를 감소시키는 IFN-α/ω 항체의 능력을 IFN-I 활성에 대한 마커로서 MX1 유전자 발현을 사용하여 평가하였다.
MX1 유전자 발현은 건강한 대조군과 대비하여 SLE 환자의 혈액에서 대략 7배 증가하였다. 시험된 항-IFN-α/ω 항체는 24시간의 인큐베이션 후에 SLE 환자의 혈액에서의 MX1 발현을 용량-의존적으로 감소시켰으며, 최고 항체 농도에서, 건강한 대조군에서 관찰된 수준에 근접하게 MX1 발현을 정상화하였다. 도 13은, 베타 액틴 발현에 대해 정규화된, 한 명의 SLE 공여자에서의 MX1 발현에 대한 항체 처리의 영향을 나타내고, 건강한 대조군과 대비하여 상승된 베이스라인 MX1 발현을 갖는 다수의 공여자들을 대표한다.
실시예 15. 항-IFN-α/ω 항체는 사이노 I형 IFN을 중화시킨다
다양한 사이노 I형 IFN을 중화시키는 선택된 항-IFN-α/ω 항체의 능력을 ISRE 리포터 유전자 검정을 사용하여 평가하였다.
사이노몰거스 IFN-α2(피비엘 어세이 사이언시즈), IFN-α4(시노 바이올로지컬(Sino Biological)), IFN-α8(시노 바이올로지컬), 및 IFN-α13(시노 바이올로지컬)을 이 검정에서 사용하였다. 각각의 IFN에 대해 미리 결정된 EC75 값을 사용하여 IC50 값을 결정하였다. (IFN-α2에 대해서는 0.078 ng/ml, IFN-α4에 대해서는 2.68 ng/ml, IFN-α8에 대해서는 0.66 ng/ml, 그리고 IFN-α13에 대해서는 18.4). 선택된 항-IFN-α/ω mAb의 IC50은 표 29에 나타나 있다. 표 20에서의 데이터는 2개의 독립적인 실험의 평균이다. IFN-α/ω mAb IFWM3525 및 IFWM3522는 시험에 이용가능한 인간 항원과 이종상동성(orthologous) 사이노몰거스 항원 사이에 유사한 교차-중화 특성을 나타내었다. 사이노몰거스 IFN-α13의 중화의 결여가 예상되었는데, 이 분자는, 인간 IFN-αD와 마찬가지로, 위치 27에 세린(S27)을 갖기 때문이다.
[표 29]
Figure 112017005865411-pct00036
실시예 16. IFN-ω T80E와 복합체를 형성한 IFWM3421의 결정 구조
하기의 변경을 제외하고는, 본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이, 결정화, X-선 데이터 수집 및 구조 결정을 행하였다:
IFN-ω:Fab를 1.05:1.00 비(과량의 IFN-ω)로 혼합함으로써 이 복합체를 제조하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 이어서 정제 없이 20 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl 중 8.37 mg/mL로 농축시켰다. X-선 데이터 수집을 위한 결정을 MMS 시딩으로 HEPES pH 7.5, 0.2 M Li2SO4, 18% PEG 3350으로부터 얻었다.
IFNω/Fab3186 복합체에 대한 X-선 데이터 수집의 경우에는, 합성 모액(0.1 M HEPES, pH 7.5, 20% PEG 3350, 0.2 M LiSO4, 및 20% 글리세롤) 중에 결정을 액침하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. X-선 데이터를 APS(아르곤 내셔널 랩(Argonne National Lab))에서 수집하였다. ELN ATeplyak-2013-0014. 회절 데이터를 XDS로 처리하였다. 구조 정밀화 통계가 표 30에 제공되어 있다.
[표 30]
Figure 112017005865411-pct00037
IFNω/Fab3421의 결정 구조는 1.9 Å인 것으로 결정되었다(표 30). IFN-ω 모델은 잔기 23-39 및 118-153을 함유하였다. IFN-ω 분자의 대부분은 어떠한 전자 밀도도 갖지 않았고 결정에서 그들에 대한 공간이 없었는데, 이는 IFN-ω의 절단이 또한 일어났음을 시사한다.
IFN-ω/Fab3421 복합체의 전체 구조는 IFNω/FabM371과 매우 유사하였다. 개별 성분들(VH, VL 및 IFNω)의 골격 구조는 모두 거의 동일하다(각각 Cα rmsd 0.17, 0.23 및 0.36 Å).
그러나, 다수의 상당한 구조적 차이가 존재하였다. 첫째, 2개의 구조를 VL 상에서 중첩시켰을 때, VH를 4도 회전시키고 항원을 11도 회전시켰는데, 이는 VL에 대해 IFN-ω 분자의 큰 시프트를 초래하였다. 둘째, H 결합 및 물 구조(특히, WC2)가 2개의 구조 사이에서 상이하였다(도 14a 및 도 14b). IFN-ω의 R33은, 모 M371 복합체 내의 HCDR3의 D107과의 염교(salt-bridge)를 포함한 6개의 H 결합을 형성한다(도 14a). 성숙된 형태에서, IFN-ω의 R33 및 VH의 D107 둘 모두에 대한 측쇄 전자 밀도는 덜 명확하고(도시되지 않음), 이들은 더 멀리 떨어져 있는 것으로 나타나는데, 이에 따라 전하-전하 상호작용의 수 및 강도를 감소시킨다(도 14b). M371 내의 VH의 H99를 포함하는 물 분자는 이제 부재한다(도 14a, 도 14b). 셋째, HCDR3의 F108이 항원 결합에 관여되어 있지 않고, VL/VH 계면의 일부이다. 이는 모 구조에서 2개의 대안적인 입체구조를 채택한다(도 14c). VL에서의 L96I 돌연변이와 함께 VL/VH 도메인의 상대 회전은 그것을 단일 회전이성질체로 축소시켰다. 따라서, 성숙 돌연변이의 일부는 Fv의 더 우수한 쌍형성으로 이어진 것으로 보인다. 넷째, 성숙 동안 2개의 위치를 F로 돌연변이시켰다(A50F 및 Y32F). Y32는 IFN-ω의 골격과 2개의 H 결합을 형성한다. 그러나, 이들은 또한 F로의 돌연변이의 결과로서 손실되었다(도 14d). A50F 돌연변이는 항원과 어떠한 새로운 접촉도 생성하지 않는다. 오히려, 그의 페닐 고리는 VH W104와 스택되고, 이는 다시 항원으로 패킹된다(도 14d). LCDR3에서는, 2개의 추가의 소수성 돌연변이(T94L 및 L96I)가 항원의 L30 및 F27에 대한 더 우수한 소수성 포켓을 형성하는 것으로 나타난다. 2개의 추가의 음전하 돌연변이(S39D 및 S93D)는, 용매와의 상호작용을 제외하고는, 어떠한 상호작용도 형성하지 않는다. 전체적으로, 친화성 개선은 극성 상호작용은 감소시키지만 항원으로의 소수성 패킹뿐만 아니라 더 우수한 VL/VH 쌍형성도 유리하게/강하게 하는 성숙 과정의 결과이다.
에피토프 및 파라토프 잔기. 도 15는 IFN-ω와 IFWM3421 사이의 2D 상호작용 mAb를 나타낸다. 에피토프 잔기들은 M371 구조 내의 것들과 동일하다. 파라토프 잔기들 또한 거의 동일하다(도 15). 그러나, 전술된 바와 같이, 성숙 과정은 다수의 구조적 및 상호작용의 차이를 가져왔으며, 이는 결합 친화성에 있어서의 개선에 대한 유망한 설명이 될 것이다.
실시예 17. IFN-ω T80E와 복합체를 형성한 IFWM3525 1의 결정 구조
본질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이, 결정화, X-선 데이터 수집 및 구조 결정을 행하였다.
IFN-ω를 IFWM3525의 Fab와 1.05:1.0의 몰비(과량의 IFN-ω, 1.92 : 1.12 mg)로 혼합함으로써 복합체를 제조하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 20 mm HEPES pH 7.5, 0.25 M NaCl, 10% 글리세롤로 평형화시킨 수퍼덱스 200 컬럼 상에서 정제하고, 이어서 9.79 mg/ml로 농축시켰다. IFN-ω/Fab3186 결정으로부터 시드를 사용하여 MMS 시딩에 의해 18% PEG 3K, 0.2 M 소듐 시트레이트로부터, X-회절에 적합한 결정을 얻었다.
X-선 데이터 수집을 위하여, IFN-ω/Fab IFWM3525 복합체의 하나의 결정을 합성 모액(20% PEG 3350, 0.2 M 소듐 시트레이트, 25% 글리세롤) 중에 수초 동안 액침하고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰다. X-선 데이터를 APS(아르곤 내셔널 랩)에서 수집하였다. 회절 데이터를 XDS10으로 처리하였다.
IFN-ω/IFWM3525 복합체의 구조를 페이저를 사용하여 분자 치환법(MR)에 의해 해석하였다. MR에 대한 검색 모델은 IFN-ω/FabM371의 결정 구조였다. 이어서, 페닉스를 사용하여 구조를 정밀화하고, 쿠트를 사용하여 모델 조정을 수행하였다. 모든 다른 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 스위트(suite)를 사용하여 수행하였다. 모든 분자 그래픽은 파이몰(PyMol)을 사용하여 생성하였다. 구조 정밀화 통계가 표 31에 제공되어 있다.
[표 31]
Figure 112017005865411-pct00038
IFN-ω/IFWM35258 복합체의 전체 구조는 IFN-ω/FabM371과 매우 유사하였다. IFN-ω 분자에 대한 분자 모델은, 나선형 절편 AB 및 나선 D 및 E에 상응하는, 잔기 23-39 및 119-153을 포함한다. 나선 A, B 및 C 및 연결 루프들을 무질서화한다. IFN-ω의 이들 누락 부분은 M371 및 M3421 복합체 구조에 있어서 확인되는 바와 같이 제한된 단백질 가수분해에 기인할 가능성이 높다. Fab 분자 모델은 경쇄에 대한 1 내지 213의 잔기 및 중쇄에 대한 1 내지 222의 잔기를 함유한다. C-말단 6xHis 태그, 쇄간 이황화물 결합 및 중쇄의 137-141의 잔기를 무질서화한다. 낮은 회절 분해능으로 인해 용매 물 분자가 포함되지 않았다.
도 16은 IFN-ω와 IFWM3525의 Fab 사이의 2-차원 상호작용 맵을 나타낸다. AB 나선의 에피토프 잔기 F27, L30, 및 R33은 Ab/Ag 상호작용의 대부분을 설명한다. 따라서, IFN-ω의 이 영역은 에피토프의 주요 부분을 구성하는 것으로 보인다. 모 M371과 비교하여, 에피토프는 IFN-ω의 나선 E로부터의 2개 초과의 잔기를 함유하는데, 이들 잔기는 IFWM3525의 HCDR3과의 상호작용을 형성한다.
IFWM3525는 IFNω 및 대부분의 IFNα 아형에 대한 광범위 결합 특이성을 갖는다. 이는 IFNβ 및 IFNα―D/1과 결합하지 않는다. IFN들의 서열 정렬(도 9)은 IFWM3525 에피토프 잔기가 IFN-ω와 IFN-α 아형 사이에서 대체로 보존됨을 나타낸다. 게다가, IFN-α(pdb 코드 2RH2, 단지 Cα 트레이스만이 PDB에서 이용가능하였기 때문에, 누적된 데이터를 사용하여 이를 재구축하고 정밀화함) 및 IFN-ω 내의 에피토프 잔기들의 구조 비교는 에피토프 잔기들이 매우 유사한 골격 및 측쇄 구조를 가짐을 나타낸다. 따라서, 서열 및 구조 보존(또는 에피토프 보존)은 IFWM3525에 의한 IFNα/ω의 광범위 결합을 담당할 가능성이 높다.
서열 목록
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SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. CHI, ELLEN CONNOR, JUDITH HUANG, CHICHI JORDAN, JARRAT LIN-SCHMIDT, XIEFAN LUO, JINQUAN LU, LU MARTINEZ, CHRISTIAN OBMOLOVA, GALINA SWANSON, RONALD <120> INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTIBODY ANTAGONISTS <130> JBI5048WOPCT <140> To Be Assigned <141> 2015-06-22 <150> 62/015,765 <151> 2014-06-23 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Met Val Lys Gly Ser Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln His Leu 85 90 95 Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala 100 105 110 Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg 115 120 125 Val Tyr Leu Lys Glu 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Lys Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Thr Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Glu Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Asp Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 72 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcca gagcattgat gggttcctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatttc gcgagcagcc tgcagagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Gln Ser Ile Asp Asn Ser Tyr 1 5 <210> 83 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Gln Ser Ile Asp Arg Ala 1 5 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Gln Ser Ile Glu Gly Ala 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Gln Ser Ile Gly Asp Phe 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Gln Ser Ile Gly Lys Ser 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Gln Ser Ile Gly Ser Ala 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Gln Ser Ile 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324 <210> 93 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Phe Ala Ser 1 <210> 94 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Gly Ala Ser 1 <210> 95 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Trp Ala Ser 1 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Gln Gln Ala Leu Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gln Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Gln Gln Gly Trp Asp Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gln Gln Gly Tyr Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Gln Gln Gly Tyr Asp Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gln Gln Ser Phe Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gln Gln Ser His Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gln Gln Ser His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Gln Gln Ser Ile Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Gln Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Gln Gln Trp Tyr Asp Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 108 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 108 gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60 attacctgcc gcgcgagcca gagcatcgat ggcgccctga actggtatca gcagaaaccg 120 ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatttc gcgagcagcc tgcagagcgg cgtgccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcag gcctacgact ttccgttgac atttggccag 300 ggcaccaaag tggaaattaa a 321 <210> 109 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 110 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 110 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tcggctgggt gcggcagatg 120 cccggcaagg gcctggagtg gatgggcatc atcgacccca gcgacagcga cacccggtac 180 agccccagct tccagggcca ggtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgcgc ccggcacccc 300 ggcctgaact gggcccccga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 111 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Ile Ala Pro Ser Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Ile Asp Ala Ser Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or Ala <400> 114 Ile Xaa Xaa Ser Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 115 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Ala Arg His Pro Gly Leu Ala Trp Ala Pro Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Ala Arg His Pro Gly Leu Asn Trp Ala Pro Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 117 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 117 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tcggctgggt gcggcagatg 120 cccggcaagg gcctggagtg gatgggcatc atcgacgcca gcgacagcga cacccggtac 180 agccccagct tccagggcca ggtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgcgc ccggcacccc 300 ggcctgaact gggcccccga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly, Asp, Ala, Arg, Glu, Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp, Gly, Asn, Ser, Arg, Glu or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Ala, Asn, Thr, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Tyr, Asn or not present <400> 118 Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 119 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Phe, Trp or Gly <400> 119 Xaa Ala Ser 1 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ala, Gly, Ser or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu, Tyr, His, Trp, Phe or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Thr, Leu, Asn or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Leu, Phe or Ile <400> 120 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 121 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ala or Asn <400> 121 Ala Arg His Pro Gly Leu Xaa Trp Ala Pro Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 122 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tcggctgggt gcggcagatg 120 cccggcaagg gcctggagtg gatgggcatc atcgacccca gcgacagcga cacccggtac 180 agccccagct tccagggcca ggtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgcgc ccggcacccc 300 ggcctggcct gggcccccga cttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360 agc 363 <210> 123 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 127 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ile Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 128 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 135 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 136 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 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Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Leu Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 141 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 142 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 142 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 143 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 143 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gly Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 144 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 144 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 145 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 145 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 146 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 147 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 147 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Asp Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 148 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 148 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 149 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 149 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Asp Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 150 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 151 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 151 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Gln Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 152 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 152 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 153 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 153 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Phe Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Gln Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Leu 1 5 <210> 155 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 156 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 157 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Ala Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Gly Leu Asn Trp Ala Pro Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 158 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 158 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Ala Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Gly Leu Asn Trp Ala Pro Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 159 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly, Asp, Ala, Glu, Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp, Gly, Asn, Ser or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Ala, Asn, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Tyr, Asn or not present <400> 159 Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ala, Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Tyr, His, Trp or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Thr, Leu or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Leu, Phe or Ile <400> 160 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ala or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asn or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Tyr, Asn or not present <400> 161 Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Phe, Thr or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Leu, Phe or Ile <400> 162 Gln Gln Xaa Tyr Asp Xaa Pro Xaa Thr 1 5

Claims (51)

  1. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-IFN 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 경쇄 가변 영역은
    서열 번호 82의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1) 아미노산 서열;
    서열 번호 94의 CDRL2 아미노산 서열; 및
    서열 번호 99의 CDRL3 아미노산 서열;을 포함하고,
    상기 중쇄 가변 영역은
    서열 번호 109의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1) 아미노산 서열;
    서열 번호 113의 CDRH2 아미노산 서열; 및
    서열 번호 116의 CDRH3 아미노산 서열;을 포함하는 것인,
    단리된 항-IFN 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 28을 포함하고 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 150을 포함하는 것인, 단리된 항-IFN 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 분자.
  5. 제4항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 단리된 핵산 벡터 또는 벡터들.
  6. 제5항의 단리된 핵산 벡터 또는 벡터들을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 및 SP2/0에서 선택되는 하나 이상이거나, 그의 불멸화되거나 (immortalized) 형질전환된 세포인 것인, 숙주 세포.
  8. 항-IFN 항체를 생성하는 방법으로, 제4항의 핵산 분자를 벡터 내로 도입하는 단계, 항체를 발현하도록 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및 상기 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  9. 삭제
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