JP2017528118A - インターフェロンアルファ及びオメガ抗体アンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒトインターフェロンオメガ(IFN−ω)及び複数のヒトインターフェロンアルファ(IFN−α)のサブタイプ(抗IFN−α/ω抗体)に結合し、その活性を中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、IFN−α単独の場合と比較して同様の免疫調節効果を有する狼瘡病原におけるINF−ωの役割の理解に基づく。IFN−ωが、狼瘡患者の血清中に存在し、かつそこで活性であることが判明しており、IFN−ωが、IFN−αと比較して同様のサイトカイン放出プロファイル及び遺伝子発現プロファイル、樹状細胞分化、並びにT細胞に依存しないB細胞の活性化を誘導することが判明しており、これは、IFN−α及びIFN−ωを中和して治療効果を最大化する理論的根拠の基礎を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、本発明のIFN−α/ω抗体が結合するIFN−ωと複数のIFN−αサブタイプとによって共有される中和性が最小のエピトープを特定することにも基づく。本発明のIFN−α/ω抗体は、IFN−ω及び複数のIFN−αサブタイプを中和し得るため、これらは、複数のIFN−αサブタイプを中和するがIFN−ωは中和しない抗体と比較して、I型IFN及びIFNシグネチャのSLE関連調製物を中和する上でより効力があり得る。したがって、本発明の抗体は、狼瘡を含む免疫媒介炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療により効果的であり得る。本発明のIFN−α/ω抗体はIFN−βを中和しないため、全てのI型IFNを遮断することが予測される抗IFNAR療法と比較して、より好ましい安全性及びPKプロファイルを有し得る。
QSIX1X2X3X4、[式中、
X1はG、D、A、R、E、S、又はNであり、
X2はD、G、N、S、R、E、又はKであり、
X3はF、A、N、T、S、又はVであり、
X4はY、Nであるか、又は欠失している]。
X5AS、[式中、
X5はF、W、又はGである]。
QQX6X7X8X9PX10T、[式中、
X6はA、G、S、又はWであり、
X7はL、Y、H、W、F、又はIであり、
X8はD、又はSであり、
X9は、F、T、L、N、又はWであり、
X10はL、F、又はIである]。
IX11X12SDSDT、[式中、
X11はD、又はAであり、
X12はP、又はAである]。
ARHPGLX13WAPDFDY、[式中、
X13はA、又はNである]。
GYSFTSYW
QSIX14X15X16X17、[式中、
X14はG、D、A、E、S、又はNであり、
X15はD、G、N、S、R、又はRであり、
X16はF、A、N、S、又はVであり、
X17はY、Nであるか、又は欠失している]。
QQX18X19X20X21PX22T、[式中、
X18はA、G、又はSであり、
X19は、Y、H、W、又はFであり、
X20はD、又はSであり、
X21は、F、T、L、又はWであり、
X22はL、F、又はIである]。
QSIX23X24X25X26、[式中、
X23はA、又はDであり、
X24はN、又はGであり、
X25はF、N、又はSであり、
X26はY、Nであるか、又は欠失している]。
QQX27X28X29X30PX31T、[式中、
X27はG、又はSであり、
X28は、Yであり、
X29はDであり、
X30はF、T、又はLであり、
X31はL、F、又はIである]。
配列番号109のHCDR1アミノ酸配列、
配列番号111、112、又は113のHCDR2アミノ酸配列、
配列番号115、又は116のHCDR3アミノ酸配列、
配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、又は91のLCDR1アミノ酸配列、
配列番号93、94、又は95のLCDR2アミノ酸配列、及び
配列番号96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、又は107のLCDR3アミノ酸配列を含む。
a)それぞれ109、113、116、77、93、及び104、
b)それぞれ109、113、116、85、93、及び96、
c)それぞれ109、113、115、79、95、及び107、
d)それぞれ109、113、116、76、93、及び103、
e)それぞれ109、113、115、85、93、及び96、
f)それぞれ109、113、115、89、95、及び100、
g)それぞれ109、113、116、86、93、及び105、
h)それぞれ109、113、115、76、93、及び103、
i)それぞれ109、113、116、80、93、及び97、
j)それぞれ109、113、116、84、93、及び97、
k)それぞれ109、113、116、90、93、及び97、
l)それぞれ109、113、116、88、93、及び102、
m)それぞれ109、113、116、87、93、及び105、
n)それぞれ109、113、116、91、93、及び106、
o)それぞれ109、113、115、80、93、及び97、
p)それぞれ109、113、116、83、93、及び101、
q)それぞれ109、113、116、82、94、及び98、
r)それぞれ109、113、115、78、95、及び100、
s)それぞれ109、111、116、81、93、及び106、
t)それぞれ109、113、116、82、94、及び99、
u)それぞれ109、113、115、81、93、及び106、
v)それぞれ109、112、116、81、93、及び106、又は
w)それぞれ109、113、116、81、93、及び106のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列を含む。
抗体のVHをコードする第1のポリヌクレオチド及び抗体のVLをコードする第2のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
発現ベクターを用いて宿主細胞を転換することと、
VL及びVHが発現して抗体を形成する条件下の培地内で宿主細胞を培養することと、
宿主細胞又は培地から抗体を回収することと、を含む。
本発明のIFN−α/ω抗体は、全身性紅斑性狼瘡(SLE)若しくは皮膚紅斑性狼瘡(CLE)を含む狼瘡などの免疫媒介炎症性疾患若しくは自己免疫疾患、又は乾癬、免疫性血小板減少症(ITP)、エカルディ−グチエール症候群(AGS)、全身性硬化症、シェーグレン症候群、筋炎、分類不能型免疫不全症(CVID)、自己免疫性甲状腺疾患、I型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶反応、若しくは移植片対宿主病(GVHD)などの免疫媒介炎症性疾患の治療に利用され得る。これらの疾患は、IFN−α及び/若しくはIFN−ω、又はI型IFNシグネチャの生成の増加に関連し得る。
本発明は、本明細書で説明する本発明の抗IFN−α/ω抗体を含む医薬組成物を提供し、以下に列記される番号付けされた実施形態の各々のいくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体を提供する。治療上の使用では、本発明の抗IFN−α/ω抗体は、医薬的に許容される担体内の活性成分として、有効量の抗IFN−α/ω抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、水、及び落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成物起源のものを含む油等の液体であってもよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術(例えば、濾過)によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的状態に近づける場合に必要な、pH調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、平滑剤並びに着色剤等の医薬的に許容される補助物質を含有することができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子又は抗体の濃度は幅広く変化してもよく、即ち約0.5重量%未満、通常は少なくとも約1重量%から最大で15若しくは20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%、又は50重量%までであってもよく、また、選択される特定の投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092に記載され、特にpp.958〜989を参照されたい。
以下に、本明細書の他の箇所に記載した開示に従った本発明の更なる特定の実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして説明される上記の本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態の各々及び全てにも関する。
2)前記ヒトIFN−ω及び前記ヒトIFN−αサブタイプの前記生物活性が、シグナル伝達性転写因子2(STAT2)、インターフェロン調節因子9(IRF9)、及びSEAPを安定に発現するHEK293細胞におけるインターフェロン誘導性ISG54プロモーター下でのヒトIFN−ω又はヒトIFN−αサブタイプに誘導された分泌胚アルカリホスファターゼ(SEAP)の発現である、実施形態1に記載の抗体。
3)前記抗体が、少なくとも約1×10-9M以下、約1×10-10以下、約5×10-11以下、又は約1×10-11M以下のIC50でヒトIFN−ωの生物活性を中和する、実施形態1又は2に記載の抗体。
4)前記抗体が、少なくとも約1×10-10M以下のIC50値で前記ヒトIFN−ωの前記生物活性を中和する、実施形態1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
5)前記抗体が、約1×10-10M〜約6×10-12MのIC50値で前記ヒトIFN−ωの前記活性を中和する、実施形態1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
6)前記抗体が、少なくとも約1×10-10M以下のIC50値で少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、又は11のヒトIFN−αサブタイプの前記活性を中和する、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
7)前記IFN−αサブタイプが、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される、実施形態6に記載の抗体。
8)前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、及び121の重鎖相補性決定領域(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)、及び3(HCDR3)のアミノ酸配列、並びに配列番号118、119、及び120の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)、及び3(LCDR3)のアミノ酸配列を含む、実施形態7に記載の抗体。
9)前記抗体が、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される少なくとも6つのヒトIFN−αサブタイプを中和する、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
10)前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、121、159、119、及び160のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を含む、実施形態9に記載の抗体。
11)前記抗体が、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される少なくとも10のヒトIFN−αサブタイプを中和する、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
12)前記抗体が、少なくともアミノ酸残基F27、L30、及びR33において配列番号1のヒトIFN−ωと結合する、実施形態11に記載の抗体。
13)前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、121、161、119、及び162のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を含む、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
14)前記抗体が、少なくとも前記ヒトIFN−αサブタイプのIFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αJ1、及びIFN−α4aを中和する、実施形態11〜13のいずれか一項に記載の抗体。
15)前記抗体が、IFN−αI、IFN−αK、又はIFN−αWAを更に中和する、実施形態14に記載の抗体。
16)前記抗体が、
a)250U/mLのインターフェロンによって誘導された全血中での白血球インターフェロン誘導性IP−10放出を、10μg/mlの抗体の存在下で約50%以上阻害するか、又は
b)全血中の全身性紅斑性狼瘡(SLE)免疫複合体によって誘導されたIP−10の放出を、10μg/mlの抗体の存在下で約50%以上阻害する、実施形態1〜15のいずれか一項に記載の抗体。
17)前記抗体が、配列番号28と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列、及び配列番号150と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を含む、実施形態1〜16のいずれか一項に記載の抗体。
18)
a)配列番号109のHCDR1のアミノ酸配列、
b)配列番号111、112、又は113のHCDR2のアミノ酸配列、
c)配列番号115又は116のHCDR3のアミノ酸配列、
d)配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、又は91のLCDR1のアミノ酸配列、
e)配列番号93、94、又は95のLCDR2のアミノ酸配列、及び
f)配列番号96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、又は107のLCDR3のアミノ酸配列を含む、実施形態1〜17のいずれか一項に記載の抗体。
19)配列番号、
a)それぞれ109、113、116、77、93、及び104、
b)それぞれ109、113、116、85、93、及び96、
c)それぞれ109、113、115、79、95、及び107、
d)それぞれ109、113、116、76、93、及び103、
e)それぞれ109、113、115、85、93、及び96、
f)それぞれ109、113、115、89、95、及び100、
g)それぞれ109、113、116、86、93、及び105、
h)それぞれ109、113、115、76、93、及び103、
i)それぞれ109、113、116、80、93、及び97、
j)それぞれ109、113、116、84、93、及び97、
k)それぞれ109、113、116、90、93、及び97、
l)それぞれ109、113、116、88、93、及び102、
m)それぞれ109、113、116、87、93、及び105、
n)それぞれ109、113、116、91、93、及び106、
o)それぞれ109、113、115、80、93、及び97、
p)それぞれ109、113、116、83、93、及び101、
q)それぞれ109、113、116、82、94、及び98、
r)それぞれ109、113、115、78、95、及び100、
s)それぞれ109、111、116、81、93、及び106、
t)それぞれ109、113、116、82、94、及び99、
u)それぞれ109、113、115、81、93、及び106、
v)それぞれ109、112、116、81、93、及び106、又は
w)それぞれ109、113、116、81、93、及び106のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3の配列を含む、実施形態18に記載の抗体。
20)前記抗体が、ヒト化されている又はヒトである、実施形態1〜19のいずれか一項に記載の抗体。
21)前記ヒト抗体重鎖可変領域フレームワークがヒト生殖系列遺伝子IGHV5−51(配列番号155)由来である、実施形態20に記載の抗体。
22)前記ヒト抗体軽鎖可変領域フレームワークがヒト生殖系列遺伝子IGKV1D−39(配列番号156)由来である、実施形態21に記載の抗体。
23)前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプのものである、実施形態1〜22のいずれか一項に記載の抗体。
24)前記抗体がFc領域内に少なくとも1つの置換を有する、実施形態23に記載の抗体。
25)前記置換が、置換M252Y/S254T/T256E、V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S又はP238S/L234A/L235Aを含み、残基の番号付けがEU番号付けに準ずる、実施形態24に記載の抗体。
26)重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、
a)VHが配列番号28、31、157、又は158のアミノ酸配列を含む、実施形態1〜26のいずれか一項に記載の抗体。
27)前記VLが配列番号35、39、40、42、46、52、53、54、57、61、62、68、71、73、75、135、又は150のアミノ酸配列を含む、実施形態26に記載の抗体。
28)配列番号、
a)それぞれ28及び40、
b)それぞれ28及び39、
c)それぞれ31及び62、
d)それぞれ28及び54、
e)それぞれ31及び39、
f)それぞれ31及び68、
g)それぞれ28及び42、
h)それぞれ31及び54、
i)それぞれ28及び53、
j)それぞれ28及び73、
k)それぞれ28及び75、
l)それぞれ28及び52、
m)それぞれ28及び35、
n)それぞれ28及び135、
o)それぞれ31及び53、
p)それぞれ28及び46、
q)それぞれ28及び61、
r)それぞれ31及び57、
s)それぞれ157及び71、
t)それぞれ28及び150、
u)それぞれ31及び71、
v)それぞれ158及び71、又は
w)それぞれ28及び71、の前記VH及び前記VLを含む、実施形態27に記載の抗体。
29)前記抗体が二重特異性である、実施形態1〜28のいずれか一項に記載の抗体。
30)前記抗体が、BLyS、CD40L、IL−6、CD27、BDCA2、IL−12、IL−23、IFN−αD、IL−17、CD20、IL−10、CD22、IL−21、ICOS、ICOSL、又はIFN−γと結合する、実施形態29に記載の抗体。
31)実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
32)前記抗体VH若しくはVL、又は実施形態1〜28のいずれか一項に記載の抗体VH及びVLをコードするポリヌクレオチド。
33)実施形態32に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
34)実施形態33に記載のベクターを含む宿主細胞。
35)実施形態19に記載の抗体の生成方法であって、前記抗体が発現する条件下で実施形態33に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された抗体を回収することとを含む、方法。
36)免疫媒介炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に使用するための、実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体。
37)
a)前記免疫媒介炎症性疾患又は前記自己免疫疾患であって、任意選択的に狼瘡、乾癬、免疫性血小板減少症(ITP)、エカルディ−グチエール症候群(AGS)、全身性硬化症、シェーグレン症候群、筋炎、分類不能型免疫不全症(CVID)、自己免疫性甲状腺疾患、I型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶反応、又は移植片対宿主病(GVHD)である、前記免疫媒介炎症性疾患又は前記自己免疫疾患、
b)慢性ウイルス感染症であって、任意にHIV又はC型肝炎感染症である、慢性ウイルス感染症に使用するための、実施形態36に記載の抗体。
38)狼瘡の治療に使用するための、実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体。
39)狼瘡が全身性紅斑性狼瘡(SLE)又は皮膚紅斑性狼瘡(CLE)である、狼瘡に使用するための、実施形態38に記載の抗体。
40)治療される患者が、
a)狼瘡腎炎を有するか、又は
b)I型インターフェロンシグネチャを示す、免疫媒介炎症性疾患又は狼瘡の治療に使用するための、実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体。
41)第2の治療薬と組み合わせて実施形態37〜40に従って使用するための、実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体。
42)前記第2の治療薬が、
a)BLyS、CD40L、IL−6、CD27、BDCA2、IL−12、IL−23、IFN−αD、IL−17、CD20、IL−10、CD22、IL−21、ICOS、ICOSL、若しくはIFN−γと結合する抗体、
b)コルチコステロイド、抗マラリア剤、免疫抑制剤、細胞毒性剤、若しくはB細胞調節剤、又は
c)プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート(deflazcort)、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、ミコフェノール酸ナトリウム、シクロスポリン、レフルノミド、タクロリムス、リツキシマブ(商標)、又はベリムマブ(商標)である、実施形態41に記載の抗体。
43)前記抗体がIFN−αD、IFN−α1、及び/又はIFN−βを中和しない、実施形態1〜30のいずれか一項に記載の抗体。
ISREレポーター遺伝子アッセイ(「ISREレポーター遺伝子アッセイ」)
完全に活性なI型IFNシグナル伝達経路を発現する(STAT2及びIRF9を安定に発現する)ように操作され、IFN−α/β誘導性ISG54プロモーターの制御下で、SEAPレポーター遺伝子でトランスフェクトされたHEK−Blue(商標)IFN−α/β細胞(InvivoGen(San Diego,CA)を使用した。これらの細胞を、10%ウシ胎児血清、100ug/mLのブラストサイジン、及び30ug/mLのゼオシンでDulbeccoの改変イーグル培地中のコラーゲンI型コーティングされたT150フラスコにて、37℃、5%CO2で増殖させた。細胞を採取し、50,000細胞/mLの384ウェルプレートに、50μL/ウェルでプレーティングした。プレーティングした細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。試験したインターフェロン試料を調製し、使用済みのHEK ISRE無血清培地中で希釈し、IFN試料50μLを各ウェルに添加した。プレーティングした細胞を37℃、5%CO2で20時間インキュベートした。室温で20分間インキュベートした後、60μL/ウェルのQUANTI−Blue(登録商標)を濾過水中に再縣濁した20μLのプレーティングした細胞上清から、アルカリホスファターゼが検出された。光密度をBiotek Synergyプレートリーダー上で、650nmで読み取った。
VeriPlexヒトインターフェロン多重ELISAキット(PBL Assay Science、カタログ番号51500−1)を用いた多重ELISAを用いて、製造業者の指示に従い、中国南京市出身の2つの独立したSLEコーホートの血漿、及び米国の白人コーホートから収集した血清を可溶性IFN−ω及びIFN−αに関して分析した。多重ELISAは多くのIFN−αサブタイプを検出するが、全てを検出せず、全IFN−α濃度対IFN−ωの量的な違いは正確に反映しない場合がある。
SLE免疫複合体によって誘導されたIFN(SLEに存在するI型IFN環境をより良好に表わす刺激である)を減少させるためのIFN−αのみの阻害、又はIFN−ω及びIFN−αの両方の阻害の効果を評価した。ヒトPBMCを2名の個別のSLEドナーから調製した免疫複合体で刺激することにより、SLE免疫複合体によって誘導されたIFNを調製し、この馴化培地をIFN阻害剤及び対照の存在下のI型IFN誘導性レポーター遺伝子アッセイ(ISREレポーター遺伝子アッセイ)で利用した。
タンパク質A/Gカラム(Thermo Scientific、カタログ番号89958)を使用し、製造業者の指示に従い、SLEドナー232及び293の血漿(IFN活性に関して予備スクリーニングした)、並びに健常対照の血漿(Astarte Biologics)をIgG精製に利用した。プールされた健常ドナーの調製物からの血清(Life Technologies、カタログ番号34005100)を、健常対照のIgGの精製に用いた。免疫複合体形成のための溶解物を生成するために、HEK293T細胞(ATCC、カタログ番号CRL−3216)を1×DPBS(Life Technologies、カタログ番号14190−250)中で5×107細胞/mlに濃縮した。溶解物を生成するために、10分間の凍結解凍を4サイクル実施し、30分間の初期凍結を除いては、−80℃で凍結し、37℃で解凍した。4回目の凍結解凍後、細胞残屑を400×gで5分間の遠心分離によって除去した。精製IgG調製物及び細胞溶解物を、続いてBCAタンパク質アッセイ(Pierce、カタログ番号23225)を用いて、製造業者の指示に従い定量した。免疫複合体で刺激した馴化培地調製物を生成するため、Cell Preparation管(BD Vacutainer、カタログ番号362753)を用いて健常ドナーのヘパリンナトリウム化血液からのPBMCを単離し、RPMI 1640(Life Technologies、カタログ番号11875−085)+10% FBS(Life Technologies、カタログ番号16140−063)培地で2×106細胞/mlに再懸濁して、2ml/ウェルの6ウェルプレートにプレーティングした。SLEからの精製IgG及び健常血清を細胞溶解物と各500ug/mlの同等の濃度でプレミックスし、RTで30分間インキュベートし、続いて2ml/ウェルでPBMCに添加し、37℃で24時間インキュベートした。プレートを1000rpmで5分間遠心分離にかけ、PBMC免疫複合体刺激馴化培地を回収し、アリコートし、将来の使用のために−80℃で保存した。
HEK−Blue IFN−α/β細胞(Invivogen)を96ウェル平底プレート中の200μl DMEM(Life Technologies)+10%ウシ胎児血清(Life Technologies)に50,000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で5時間インキュベートして、細胞をプレートに付着させた。5時間後、HEK Blue細胞をインキュベータから取り出し、上清を、ドナー232 PBMC馴化培地の1:6希釈物、又はドナー293馴化培地1:81希釈物と交換し(希釈剤としてHEK Blue細胞培養培地を用いて)、0.4、2、10、50、及び100μg/mlの広域の抗IFN−αアンタゴニストmAb(M24、ヒトIgG1)に加えて固定濃度20μg/mlのアイソタイプ対照(R&D Systems、ネズミIgG1)、100μg/mlの抗IFN−αと組み合わせて20μg/mlの抗IFN−ωアンタゴニストmAb(eBioscience、クローンOMG5、ネズミIgG1)、又は100μg/mlのヒトIgG1アイソタイプ対照(Southern Biotech)と組み合わせた20μg/mlのネズミIgG1アイソタイプ対照、の処置を加えたか、又は加えなかった。細胞を37℃で終夜インキュベートした。翌日、各ウェルから40μlの細胞上清を取り除き、別個の96ウェル平底プレート中の160μlのQuanti−Blueアルカリホスファターゼ基質(Invivogen)に添加した。上清を基質と10分間反応させ、プレートを650nm波長の分光光度計で読み取った。GraphPad Prismで光学濃度をプロットした。
ケモカイン分泌、IFN遺伝子シグネチャ、樹状細胞の成熟及び活性化、並びにB細胞の成熟を誘導するIFN−ωの能力を、IFN−αと比較して評価した。これらの研究では、最も広く用いられる治療的IFN−α分子であるIFN−αA及びIFN−α2を、代表的なIFN−αサブタイプ対照として主に用いた。いくつかのアッセイでは、IFN−αB2を用いた。
6名の健常ヒトドナーから単離したPBMCをIFN−αA(IFN−α2)又はIFN−ωで刺激し、上清及びペレット剤を回収して分析した。処置後3、6、及び24時間。25のサイトカインのパネル(L−1β、IL−1RA、IL−2、IL−2R、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−12、IL−13、IL−15、IL−17、TNF−α、IFN−α、IFN−γ、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、IP−10、MIG、Eotaxin、RANTES、及びMCP−1)を、Luminexイムノアッセイを用いて上清から測定した。IFN−ω及びIFN−α2はいずれも検出可能なIP−10、MCP−1、IL−1RA、IL−6、MIP−1α、及びMIP−1βのレベルを高めた。図3は、IFN−ω及びIFN−α2によるIP−10の誘導を示す。IL−8の分泌は、これらの試験における両方の処置によって減少された。IFN−α又はIFN−ω処置によってIL−2R、IL−12、及びRANTESのレベルは変更されなかった(RANTESのみが上昇した1ドナーの例外を除く)。サイトカインパネルの他の全ての検体は、IFN−α又はIFN−ω処置に関連して変化することはなかった、又は検出限界を下回っていた。
B細胞は、病原性自己抗体及びサイトカインの生成を介して、またT細胞に抗原を提示することにより、狼瘡病原に決定的に重要な役割を果たす。B細胞の活性化及び機能的成熟は、T細胞依存性(TD)又はT細胞非依存性(TI)の方法で生じ得る。TIのB細胞の応答においては、TLRリガンド又は樹状細胞誘導サイトカインがT細胞のヘルプの代替となることができるために、B細胞はT依存性耐性対照(T-dependent tolerance control)から放出される。TLRリガンド(例えば二本鎖DNA)及びDC誘導サイトカイン(例えばI型IFN)が疾患病因に寄与すると考えられるSLEにおいては、TIのB細胞はおそらく適切な機構を示す。自己抗体の生成の他にも、自己反応性B細胞は、自己抗原をT細胞に提示して炎症促進性サイトカインを分泌することにより重要な病原性役割を果たすと考えられる。IFN−αは、T細胞誘導因子の不在下で、B細胞受容体(BCR)及びCpG(それぞれ特異的な抗原及びTLRシグナルを模倣する)に対する抗体によって活性化されたヒトB細胞によって炎症促進性IL−6の生成を増進することが報告されている。更に、形質球様DCとの同時培養も、可溶性因子に依存するCD86発現レベルによって決定されるB細胞の活性化を増進することが示されている。ヒトB細胞によるCD86発現及び炎症促進性サイトカインの生成を増進するIFN−ωの能力を、T細胞非依存性培養系を用いて調査した。示されるようにCpG(ODN−2006)、抗BCR、並びにCpG及び抗BCR、並びに様々な濃度のIFN−α2(α2b)又はIFN−ωを用いて、末梢血B細胞を培養した(IFN濃度の単位はU/ml)。3日後、フローサイトメトリーによってCD86発現(平均蛍光レベル)を決定し、上清を、IL−6を含む26−plexのLuminexイムノアッセイによって分析した。結果を複製試料±SDの平均値として表した。
BLyS(BAFF)はB細胞生存因子であり、臨床的に有効なヒトSLE中の標的である。IFN−α処置は、投薬から24時間後に患者から単離したPBMCをマイクロアレイ及びqPCR分析することによって決定されるように、インビボでBLyS遺伝子発現を誘導することが判明している。よって、BLySの分泌を誘導するIFN−ωの能力を評価した。
表4に示す20の個別の組み換えヒトI型IFN−αをクローニングし、配列番号21〜25のようなシグナル配列を用い、標準的な方法を用いて、HEK 293細胞において発現させた。タンパク質は特に指示しない限りはヒトである。発現レベル及び可溶性を改善するために、ヒトIFN−ωの位置80の単一のアミノ酸突然変異体であるIFN−ωT80Eを生成し、HEK 293細胞において発現させた。T80E IFN−ω変異体(配列番号2)は、野生型タンパク質と同等の活性を有した。IFN−αD及びIFN−α1は、位置114の1つのアミノ酸が異なる(バリン対アラニン)。αA及びα2は、位置23の1つのアミノ酸が異なる(αAのリシン対α2のアルギニン)。α4は2つの形態4a及び4bを有し、これらは位置51(α4aのアラニン対α4bのスレオニン)及び114(α4aのグルタミン酸対α4bのバリン)の2つのアミノ酸が異なる。これらの変異は受容体結合領域外に位置し、活性に影響を及ぼさない。抗体は、これらの変異体の対(αD/α1、αA/α2、及びα4a/α4b)を等しく良好に中和しすることが判明し、その後のいくつかの実験では、各対1つの抗原のみを使用した。
IFN−α及びIFN−ωに結合するFabsを、ShiらのJ Mol Biol 397:385−96,2010、国際公開公報第WO2009/085462号;米国特許出願公開第US2010/0021477号で説明されるように新たなpIXファージディスプレイライブラリから選択した。要約すると、ライブラリは、ヒト足場を多様化することによって作製されたものであり、生殖系列VH遺伝子であるIGHV1−69*01、IGHV3−23*01及びIGHV5−51*01を、H3ループを介してヒトIGHJ−4ミニ遺伝子で組み換え、そしてヒト生殖系列VLκ遺伝子であるO12(IGKV1−39*01)、L6(IGKV3−11*01)、A27(IGKV3−20*01)及びB3(IGKV4−1*01)をIGKJ−1ミニ遺伝子で組み換えることで、完全なVH及びVLドメインを構築した。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると確認された位置に相当するH1、H2、L1、L2及びL3ループ周辺の位置を選択した。選択した位置での配列多様性は、それぞれのIGHV又はIGLV遺伝子のIGHV又はIGLV生殖系列遺伝子ファミリーそれぞれの位置で生じる残基に制限した。7〜14アミノ酸長の単鎖〜中鎖型の合成ループを利用することにより、H3ループにおいて多様性が発生した。H3でのアミノ酸分布を、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計した。ライブラリ設計の詳細は、ShiらのJ.Mol.Biol.397、385−96、2010年に記載されている。ライブラリを生成するために利用した足場は、これらのヒトVH及びVL生殖系列遺伝子起源に準じて命名した。IFN−及びIFN−に対するパニング実験では、3つの重鎖ライブラリを、4個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせることで12個の固有VH:VLの組み合わせを生成した。
エピトープ及びパラトープ、IFN−αサブタイプ及びIFN−ωに対する広範な結合特異性の構造的基礎を明らかにし、親和性及び特異性を改善するための改変を支持するためするため、IFWM371のFabと複合したヒトIFN−ω T80Eの結晶学的研究を実施した。
IFWM371重鎖及び軽鎖CDR残基のアラニンスキャンを実施し、続く親和性成熟への取り組みに導いた。いくつかの溶媒曝露の低い又は溶剤に曝露されていない残基を除く、重鎖及び軽鎖両方のCDR中の全ての残基をアラニンと置換した。CDRの天然残基がアラニンである場合、チロシン及び/又はセリン及び/又はアスパラギン酸と置換した。可能性のある発生傾向を有する1つの位置(IFWH591中W104、配列番号28)をアラニン、チロシン、セリン、及びアスパラギン酸で置換した。突然変異させたmAbをHEK293細胞内で一時的に発現させ、細胞上清のIFNのパネルに対する結合活性をELISAによって試験した。2つのVH突然変異体、IFWH591 R59A(配列番号30)及びIFWH591 N103A(配列番号31)は、親mAbと比較して著しく改善された結合を有した。
ライブラリ設計
2つの別個のVLライブラリ(PH9L4L2及びPH9L4L3)を設計して、親和性成熟IFWM371軽鎖PH9L4(O12)(配列番号29)に対して使用した。ライブラリPH9L4L2の多様化のために選択された位置は、抗タンパク質及び抗ペプチド複合体で頻繁に見られる残基位置に基づいた。各位置を多様化するために用いられた残基をIGKV遺伝子の生殖系列遺伝子ファミリー内でコードした(Shiら(2010)J.Mol.Biol.397:385−96)。ライブラリの複雑性は、親和性成熟の間に多様性が十分に評価されるように107ライブラリメンバーを超えないように制限された(実際のライブラリ複雑性は3.57)。表7は、ライブラリ中のVLLPH9L4(O12)のLCDR1位置30、31、及び32、LCDR2位置50、並びにLCDR3位置91、92、93、94、及び96のライブラリ設計多様化スキームを示す。残基番号付けはKabatに準ずる。
軽鎖ライブラリPH9L4L2又はPH9L4L3と親重鎖IFWH591(配列番号28)とを組み合わせることにより、親和性成熟ライブラリを生成した。続いてライブラリを用いて高親和性抗体を選択するためにパニングした。いくつかの親和性成熟パニング実験は、IFN−ωのみ又はいくつかのIFN−αサブタイプのみのいずれかに対する結合に偏って改善したが、両方は改善しなかった。大半のIFN−αサブタイプ及びIFN−ωに関して改善されたIC50を用いて広範な中和抗体を生成するために、互いに対してより多様化されたIFN−αサブタイプのサブセット(IFN−α2、IFN−α4a、IFN−αF、及びIFN−αG)を各パニングラウンド間でマカクザル又はヒトIFN−ωで交互にパニングした。各パニング実験に対して合計3ラウンドのパニングを実施した。
中和活性、溶解度特性、及び生物物理学的特性に基づき、IFWM371、IFWM3331(IFWB3066)、IFWM3399(IFWB3134)、IFWM3421(IFWB3156)、及びIFWM3423(IFWB3158)の親和性成熟由来の4つのmAbを更に分析した。これらのmAbの重鎖はIFWH591(配列番号28)又はIFWH629(配列番号31)のいずれかからなり、これらの軽鎖はIFWL984(配列番号71)、又はIFWL1048(配列番号53)、又はIFWL1073(配列番号61)のいずれかからなる。
生成された抗体のうちのいくつかは、上記のISREアッセイを用いて測定された、100pM以下のIC50でIFN−ω及び複数のIFN−αサブタイプを中和した。これらの抗体の可変領域配列を表21に示す。表22は抗体のLCDR1配列を示し、表23はLCDR2を示し、表24はLCDR3を示し、表25はHCDR1を示し、表26はHCDR2を示し、表27はHCDR3を示す。図10はISREアッセイでの各I型IFNのIC50値を示す。
全血からのIFNによって誘導されたIP−10の放出を阻害する抗体の能力によって、白血球IFNを中和する抗体の能力を評価した。
240μlの全血(Biological Specialty Corporation)を、細胞培養培地(10%のHI FBS及び1%のペンストレップ(penn strep)を有するRPMI1640)中に希釈したIFN又はIFN含有馴化培地あり又はなしの30μIの抗体(抗IFN−α/ω又はアイソタイプ対照)を含む96ウェルのU底プレートの各ウェルに添加した。刺激のために、250U/ml(最終容量)のヒト白血球IFN(Sigma−Aldrich)、及び10μl/ウェルのSLE免疫複合体で処理した馴化培地を利用した。IFNと抗体との混合物を室温で20〜30分間プレインキュベートした後に、全血に添加した。プレートを37℃で20〜22時間かけて終夜インキュベートした。翌日、室温でプレートを400×gで5分間遠心分離にかけて血漿を除去し、−20℃で凍結させた。各処置からの複製試料をCXCL10/IP−10 ELISAキット(Qiagen)を用いて分析した。解凍時に、回収した血漿を、試料希釈緩衝液を用いて2.5倍に希釈して、アッセイで使用した。標準の希釈に関して以下のわずかな改変を加えた他は製造業者のプロトコルに従った。抗原標準の2倍希釈液を濃度4000pg/mlから開始して31.25pg/mlで完了して作製した。反応停止後30分以内に450nmの吸光度でプレートを読み取った。Softmax Proを用いて分析を実施した。
関連する細胞型中の内因性IFN−I調製物を中和する能力に関して選択抗体を特徴付けした。全血のIFN刺激はインビトロ及びインビボのIP−10(CXCL10)放出を誘導する(Arico,E.らのConcomitant detection of IFNalpha signature and activated monocyte/dendritic cell precursors in the peripheral blood of IFNalpha−treated subjects at early times after repeated local cytokine treatments.J Transl Med 9,67,doi:10.1186/1479〜5876〜9〜67(2011).、Mohty,A.M.らのInduction of IP−10/CXCL10 secretion as an immunomodulatory effect of low−dose adjuvant interferon−alpha during treatment of melanoma.Immunobiology 215,113〜123,doi:10.1016/j.imbio.2009.03.008(2010))。IP−10はSLE中で上昇し、いくつかの研究では疾患活性及び疾患の臨床症状と相関することが示されている(Bauer,J.W.らのInterferon−regulated chemokines as biomarkers of systemic lupus erythematosus disease activity:a validation study.Arthritis and rheumatism 60,3098〜3107,doi:10.1002/art.24803(2009)、Kong,K.O.らのEnhanced expression of interferon−inducible protein−10 correlates with disease activity and clinical manifestations in systemic lupus erythematosus.Clinical and experimental immunology 156,134〜140,doi:10.1111/j.1365〜2249.2009.03880.x(2009)、Rose,T.らのIFNalpha and its response proteins,IP−10 and SIGLEC−1,are biomarkers of disease activity in systemic lupus erythematosus.Annals of the rheumatic diseases 72,1639〜1645,doi:10.1136/annrheumdis−2012〜201586(2013))。
SLEの顕著な特徴は、典型的には臨床的に定義された疾患の発生に先立つ、抗二本鎖DNA(抗dsDNA)などの自己抗体の存在である。核酸リガンドに結合した自己抗体は、SLE患者におけるI型IFNの内因性誘導因子であると考えられている。自己抗原のクリアランス障害と関連した圧倒的多数の自己抗体は、IFN生成のフィードバックサイクルに至り、形質細胞様樹状細胞(pDC)への免疫複合体のFc受容体依存性の内在化が、循環するIFNの増量及びIFN遺伝子シグネチャの確立につながる。
抗IFN−α/ωmAbは、両方の滅菌リガンド(免疫複合体、実施例12)、及び微生物リガンド(白血球IFN、実施例11)への曝露後にヒト初代細胞から生成された内因性IFN−I調製物の強力な用量依存的中和を実証した。生理学的I型IFNを中和するIFN−α/ωmAbの効力を、SLE患者の血清及び血漿からのIFN−I活性を中和する抗体の能力によって更に評価した。この方法は、インビトロでは再現(recapitulate)が困難であり得るIFNスペクトルを含み得る患者からの実際に循環するIFN−I環境を中和する抗体の能力を評価する。
HEK Blue(α/β)細胞(InvivoGen)を50,000細胞/ウェル(合計容量200μlのDMEM+10% FBS)でプレーティングし、37℃で終夜インキュベートした。翌日、本アッセイにおける30分のインキュベーション後に1.0以上のOD達成を基準に予め選択されたプール血漿(3ドナー)又は血清(13ドナー)を解凍して、DMEM+10% FBSと1:1(v/v)の比率で混合した。予めプレーティングしたHEK Blue細胞から上清を除去して、100μlのSLE血漿又は血清/培地混合物と置き換え、37℃で終夜インキュベートさせた。翌日、40μlの馴化培地を除去し、新しいプレートに160μlのQuanti−Blue基質(InvivoGen)を添加して、30分間インキュベートさせた。分光光度計を用いて650ナノメートル波長でプレートを読み取り、GraphPad Prismを用いてIC50値を計算した。
ISREアッセイを用いて、中国人患者のコーホート(SLEコーホート1)のSLE血清、及び主にアフリカ系アメリカ人コーホート(SLEコーホート2)のSLE血漿をIFN−I活性に関して予備スクリーニングした。1.0以上のODを有するSLEドナーの血清又は血漿試料は、アンタゴニスト抗体による阻害が容易に測定され得るように十分なIFN−I活性の窓を有していると決定された。続いてこれらのドナー試料をプールして、反復実験及び抗体の滴定を実現するのに十分な試料堆積を生成する血清又は血漿ストックを生成した。SLE患者における定性的かつ定量的IFN−I応答の潜在的な多様性をより良好に捕捉するために、様々な人種/民族コーホートからのSLE患者試料を利用した。アフリカ系アメリカ人及びアジア人ドナーは、白人ドナーと比較してより高いIFN−I活性を有すると考えられる。試験された抗IFN−α/ωmAbは、プールされたSLE患者の血清及び血漿試料中のIFN−I活性を用量依存的に中和した。両方のSLEコーホートからのプール試料を用いた2つの独立した実験からのIC50値を表28に示す。
I型IFNは、健常対照と比較して一部のSLE患者でも過剰発現する遺伝子のスペクトルを誘導する。このIFN遺伝子シグネチャを示すSLE患者の血漿試料は、健常ドナーPBMC又は細胞株に添加されたときに同様の遺伝子のセットの過剰発現を誘導することができ、この活性は、IFN−αを標的とする抗体によって主に中和される(Huaら、Arthritis and rheumatism 54,1906〜1916,doi:10.1002/art.21890(2006))。
SLE又は健常血液をナトリウムヘパリン管に回収してから2〜4時間後に、240μlを抗IFN−α/ω抗体又はヒトIgG1アイソタイプ対照を含む96ウェルのU底プレートにプレーティングした。PBSに希釈した抗体を、240μlの血液に30μl/ウェルで添加した。37℃で24時間インキュベートした後、PAXgene安定試薬(QIAGEN)を96ディープウェルプレートに添加し、血液試料を移して、ピぺッティングにより十分に混合した。プレートを封止して、更なる処理のために−80℃で凍結した。解凍後、試料を2mlのSafe−Lock管(Eppendorf)に移して、5000×gで10分間回転させた。上清を吸引して、試料ペレットを渦動によって432μlのDNase/RNaseフリー水に再懸濁させた。試料を5000×gで更に遠心分離して、ペレットを350μlのBR1緩衝液に再懸濁させた。次に300μlのBR2緩衝液を添加し、続いて40μlのプロテイナーゼKを添加し、試料を55℃でインキュベートし、800rpmで10分間振盪した。精製の残部に関しては製造業者のプロトコルに従った(QIAGEN、カタログ番号762164)。各試料の全RNAのうち120ngをiScript cDNA Synthesisキット(BIO−RAD)を用いてcDNAに変換し、ヒトMX1及びβ−アクチニン(ACTB)用のプライマー/プローブ対(それぞれカタログ番号Hs00895608_m1及びHs01060665_g1)をqPCRに対して利用した。データをViia7 Real Time PCRシステム上に収集して、GraphPad Prismで分析し、ACTB(dCT)に対するMX1の発現の変化を示した。
患者の血中のIFN−Iシグネチャを低減させるIFN−α/ω抗体の能力を、MX1遺伝子発現をIFN−I活性のマーカーとして用いて評価した。
様々なカニクイザルI型IFNを中和する選択抗IFN−α/ω抗体の能力を、ISREレポーター遺伝子アッセイを用いて評価した。
結晶化、X線データ収集、及び構造決定を、以下の変更を除いて本質的に実施例6で説明したように実施した。
結晶化、X線データ収集、及び構造決定を、本質的に実施例6で説明したように実施した。
Claims (51)
- ヒトインターフェロンオメガ(IFN−ω)及び少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、又は11のヒトインターフェロンアルファ(IFN−α)サブタイプと結合し、それらの生物活性を中和する、単離されたモノクローナル抗体。
- 前記ヒトIFN−ω及び前記ヒトIFN−αサブタイプの前記生物活性が、シグナル伝達性転写因子2(STAT2)、インターフェロン調節因子9(IRF9)、及びSEAPを安定に発現するHEK293細胞におけるインターフェロン誘導性ISG54プロモーター下での前記ヒトIFN−ω又は前記ヒトIFN−αサブタイプによって誘導された分泌胚アルカリホスファターゼ(SEAP)の発現である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくとも約1×10-9M以下、約1×10-10M以下、約5×10-11M以下、又は約1×10-11M以下のIC50で前記ヒトIFN−ωの前記生物活性を中和する、請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくとも約1×10-10M以下のIC50値で前記ヒトIFN−ωの前記生物活性を中和する、請求項3に記載の抗体。
- 前記抗体が、約1×10-10M〜約6×10-12MのIC50値で前記ヒトIFN−ωの前記活性を中和する、請求項4に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくとも約2×10-10M以下、約1.5×10-10M以下、又は約1×10-10M以下のIC50値で少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、又は11のヒトIFN−αサブタイプを中和する、請求項5に記載の抗体。
- 前記IFN−αサブタイプが、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される、請求項6に記載の抗体。
- a)配列番号109のHCDR1アミノ酸配列、
b)配列番号111、112、又は113のHCDR2アミノ酸配列、
c)配列番号115又は116のHCDR3アミノ酸配列、
d)配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、又は91のLCDR1アミノ酸配列、
e)配列番号93、94、又は95のLCDR2アミノ酸配列、及び
f)配列番号96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、又は107のLCDR3アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の抗体。 - 前記抗体が、それぞれ配列番号109、113、及び116の重鎖相補性決定領域(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)、及び3(HCDR3)のアミノ酸配列、並びにそれぞれ配列番号82、94、及び99の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)、及び3(LCDR3)のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、及び121の重鎖相補性決定領域(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)、及び3(HCDR3)のアミノ酸配列、並びにそれぞれ配列番号118、119、及び120の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)、及び3(LCDR3)のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体が、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される少なくとも6つのヒトIFN−αサブタイプを中和する、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、121、159、119、及び160のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の抗体。
- 前記抗体が、IFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αI、IFN−αJ1、IFN−αK、IFN−αWA、及びIFN−α4aからなる群から選択される少なくとも10のヒトIFN−αサブタイプを中和する、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくともアミノ酸残基F27、L30、及びR33において配列番号1のヒトIFN−ωと結合する、請求項13に記載の抗体。
- 前記抗体が、それぞれ配列番号109、114、121、161、119、及び162のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の抗体。
- 前記抗体が、少なくとも前記ヒトIFN−αサブタイプのIFN−αA、IFN−αB2、IFN−αC、IFN−αF、IFN−αG、IFN−αH2、IFN−αJ1、及びIFN−α4aを中和する、請求項15に記載の抗体。
- 前記抗体が、IFN−αI、IFN−αK、又はIFN−αWAを更に中和する、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、
a)250U/mLのインターフェロンによって誘導された全血中での白血球インターフェロンによって誘導されたIP−10の放出を、10μg/mlの抗体の存在下で前記抗体の不在下と比較して約50%以上阻害する、あるいは
b)全血中の全身性紅斑性狼瘡(SLE)免疫複合体によって誘導されたIP−10の放出を、10μg/mlの抗体の存在下で前記抗体の不在下と比較して約50%以上阻害する、請求項14に記載の抗体。 - 前記抗体が、配列番号28と少なくとも90%、95%、又は97%同一の重鎖可変領域(VH)アミノ酸配列、及び配列番号150と少なくとも90%、95%、又は97%同一の軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を含む、請求項5に記載の抗体。
- 配列番号、
a)それぞれ109、113、116、77、93、及び104、
b)それぞれ109、113、116、85、93、及び96、
c)それぞれ109、113、115、79、95、及び107、
d)それぞれ109、113、116、76、93、及び103、
e)それぞれ109、113、115、85、93、及び96、
f)それぞれ109、113、115、89、95、及び100、
g)それぞれ109、113、116、86、93、及び105、
h)それぞれ109、113、115、76、93、及び103、
i)それぞれ109、113、116、80、93、及び97、
j)それぞれ109、113、116、84、93、及び97、
k)それぞれ109、113、116、90、93、及び97、
l)それぞれ109、113、116、88、93、及び102、
m)それぞれ109、113、116、87、93、及び105、
n)それぞれ109、113、116、91、93、及び106、
o)それぞれ109、113、115、80、93、及び97、
p)それぞれ109、113、116、83、93、及び101、
q)それぞれ109、113、116、82、94、及び98、
r)それぞれ109、113、115、78、95、及び100、
s)それぞれ109、111、116、81、93、及び106、
t)それぞれ109、113、116、82、94、及び99、
u)それぞれ109、113、115、81、93、及び106、
v)それぞれ109、112、116、81、93、及び106、あるいは
w)それぞれ109、113、116、81、93、及び106のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3の配列を含む、請求項19に記載の抗体。 - 前記抗体が、ヒト化されている又はヒトである、請求項20に記載の抗体。
- 前記ヒト抗体重鎖可変領域フレームワークがヒト生殖系列遺伝子IGHV5−51(配列番号155)由来である、請求項21に記載の抗体。
- 前記ヒト抗体軽鎖可変領域フレームワークがヒト生殖系列遺伝子IGKV1D−39(配列番号156)由来である、請求項22に記載の抗体。
- 前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプのものである、請求項21に記載の抗体。
- 前記抗体がFc領域内に少なくとも1つの置換を有する、請求項24に記載の抗体。
- 前記置換が、置換M252Y/S254T/T256E、V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S、又はP238S/L234A/L235Aを含み、残基の番号付けがEU番号付けに準ずる、請求項25に記載の抗体。
- 重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含み、
a)前記VHが配列番号28、31、157、又は158のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の抗体。 - 前記VLが配列番号35、39、40、42、46、52、53、54、57、61、62、68、71、73、75、135、又は150のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の抗体。
- 配列番号、
a)それぞれ28及び40、
b)それぞれ28及び39、
c)それぞれ31及び62、
d)それぞれ28及び54、
e)それぞれ31及び39、
f)それぞれ31及び68、
g)それぞれ28及び42、
h)それぞれ31及び54、
i)それぞれ28及び53、
j)それぞれ28及び73、
k)それぞれ28及び75、
l)それぞれ28及び52、
m)それぞれ28及び35、
n)それぞれ28及び135、
o)それぞれ31及び53、
p)それぞれ28及び46、
q)それぞれ28及び61、
r)それぞれ31及び57、
s)それぞれ157及び71、
t)それぞれ28及び150、
u)それぞれ31及び71、
v)それぞれ158及び71、あるいは
w)それぞれ28及び71、の前記VH及び前記VLを含む、請求項28に記載の抗体。 - 配列番号28のVHアミノ酸配列及び配列番号150のVLアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の抗体。
- 前記抗体が二重特異性である、請求項1、20、又は29に記載の抗体。
- 前記抗体が、BLyS、CD40L、IL−6、CD27、BDCA2、IL−12、IL−23、IFN−αD、IL−17、CD20、IL−10、CD22、IL−21、ICOS、ICOSL、又はIFN−γと結合する、請求項31に記載の抗体。
- 請求項1、20、又は29に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- (i)請求項20若しくは29に記載の抗体VH若しくはVL、又は(ii)請求項20若しくは29に記載の抗体VH及びVLをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項35のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項35のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項20に記載の抗体の生成方法であって、前記抗体が発現する条件下で請求項36に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記抗体を回収することと、を含む、方法。
- 免疫媒介炎症性疾患、自己免疫疾患、又は慢性ウイルス感染症の治療方法であって、請求項1、20、又は29に記載の単離された抗体の治療有効量を、それを必要とする患者に、前記疾患又は前記感染症を治療するのに十分な時間投与することを含む、方法。
- 前記免疫媒介炎症性疾患又は前記自己免疫疾患とは、狼瘡、乾癬、免疫性血小板減少症(ITP)、エカルディ−グチエール症候群(AGS)、全身性硬化症、シェーグレン症候群、筋炎、分類不能型免疫不全症(CVID)、自己免疫性甲状腺疾患、I型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶反応、又は移植片対宿主病(GVHD)である、請求項38に記載の方法。
- 狼瘡が、全身性紅斑性狼瘡(SLE)又は皮膚紅斑性狼瘡(CLE)である、請求項39に記載の方法。
- 前記患者が狼瘡腎炎を有する、請求項40に記載の方法。
- 前記患者がI型インターフェロンシグネチャを示す、請求項38に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症がHIV又はC型肝炎感染症である、請求項38に記載の方法。
- 前記抗体が請求項20又は29に記載の抗体を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項38に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、BLyS、CD40L、IL−6、CD27、BDCA2、IL−12、IL−23、IFN−αD、IL−17、CD20、IL−10、CD22、IL−21、ICOS、ICOSL、又はIFN−γを中和する、請求項45に記載の方法。
- 第2の治療薬を更に投与する、請求項38に記載の方法。
- 前記第2の治療薬が、BLyS、CD40L、IL−6、CD27、BDCA2、IL−12、IL−23、IFN−αD、IL−17、CD20、IL−10、CD22、IL−21、ICOS、ICOSL、又はIFN−γと結合する抗体である、請求項47に記載の方法。
- 前記第2の治療薬がコルチコステロイド、抗マラリア剤、免疫抑制剤、細胞毒性剤、又はB細胞調節剤である、請求項47に記載の方法。
- 前記第2の治療薬がプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、ミコフェノール酸ナトリウム、シクロスポリン、レフルノミド、タクロリムス、リツキシマブ(商標)、又はベリムマブ(商標)である、請求項49に記載の方法。
- 前記抗体がIFN−αD、IFN−α1、及び/又はIFN−βを中和しない、請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体。
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