JPS62282595A - ハイブリツドインタ−フエロン、それを含有する組成物、およびその製造方法 - Google Patents

ハイブリツドインタ−フエロン、それを含有する組成物、およびその製造方法

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JPS62282595A
JPS62282595A JP62053911A JP5391187A JPS62282595A JP S62282595 A JPS62282595 A JP S62282595A JP 62053911 A JP62053911 A JP 62053911A JP 5391187 A JP5391187 A JP 5391187A JP S62282595 A JPS62282595 A JP S62282595A
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plasmid
hybrid
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ペーター　スウェットリー
ペーター　マインドル
ギュンター　アドルフ
エドガー　ファルクナー
ゲルハルト　ボド
イングリット　マウレル−フォギー
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Boehringer Ingelheim International GmbH
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　　１３　：　４７
３９〜４７４９゜１９８５　（ＥＰ−Ａ−０，１７０，
２０４も参照）にはω−インターフエロンと呼ばれる１
型の新規なインターフェロン、それらをコードするＤＮ
Ａ配列、これらのＤＮＡ配列を含有するプラスミド、お
よびこの新規インターフェロンを産生する生物体につい
て記載されている。
上記報告に記載されている発現プラスミドにより、たと
えばＥ、ｃｏｉｉ　　Ｈ８１０１中に形質転換されたｐ
ＲＨＷｌ　１またはＤＲＨＷｌ　２で、かなり大量、試
験量の新規ω−インターフエロンを製造した場合、しか
しながら、新規ω−インターフエロンの発現を増大させ
ることが好ましく、また同時に新規の発現インターフェ
ロンの以後の精製に改良を要することが明らかにされた
。
驚くべきことに、これらの欠点は、α−インターフエロ
ンの部分とω−インターフエロンの部分からなる新しい
ハイブリッドインターフェロンによって解消できること
、また、それを含有する新しいプラスミドの構築によっ
てω−インターフエロンの発現を改善できることが発見
され、本発明は完成された。
この新規なハイブリッドインターフェロン、そのＮ末Ｉ
ＭｅｔもしくはＮ−ホルミルＭｅｔ誘導体、および、そ
のハイブリッドインターフェロンのペプチド配列にグル
コシル化部位が存在する場合はそのＮ−グリコシル化誘
導体は優れた薬理学的性質を有し、またとくに、α−お
よびω−インターフエロンの精製に適した新規モノクロ
ナール抗体の製造に使用できる。
すなわち、本発明は、式 ％式％ （式中、ＢｇｌＩＩはα１．α２およびω−インターフ
エロンに共通のＢｇＪ　Ｉｆ制限部位であり、Ｒ１はα
１もしくはα２インターフエロンのＢＱｊ！ＩＩ切断部
より上流にあるＤＮＡ配列によってコードされるα１も
しくはα２インターフエロンのペプチド配列であってＲ
２はω−インターフエロンのＥ１１’に切断部位の下流
にあるＤＮＡ配列によってコードされるω−インターフ
エロンのペプチド配列であるか、またはＲ１はω−イン
ターフエロンの８Ｃｌｊ！　Ｉ［切断部位の上流にある
ＤＮＡ配列によってコードされるω−インターフエロン
のペプチド配列であってＲ２はα１もしくはα２インタ
ーフエロンのＢＱｊ！　Ｉｆ切断部位の下流にあるＤＮ
Ａ配列によってコードされるα１もしくはα２インター
フエロンのペプチド配列である）で示される新規なりＱ
ｊ！　ＩＩハイブリッドインターフェロン、そのＮ末端
ＭｅｔもしくはＮ−ホルミルＭｅｔ誘導体、および、そ
のハイブリッドインターフェロンのペプチド配列にグリ
コシル化部位が存在する場合はそのＮ−グリコシル化誘
導体、医薬組成物および実験動物の免疫処置用中間生成
物としてのその使用、これらのハイブリッドインターフ
ェロンをコードするＤＮＡ配列、それらの製造方法、α
−およびω−インターフエロンを精製するための新規モ
ノクロナール抗体およびその使用、それらを分泌するハ
イブリッド細胞系およびその製造方法、上記の新規モノ
クロナール抗体を含有する新規抗体アフィニティーカラ
ムを用いるαおよびω−インターフエロンの新規精製方
法およびその製造方法、ω−インターフエロンの発現を
改善するための新規プラスミドおよびその新規プラスミ
ドを製造するための新規な中間プラスミドならびにそれ
らの製造方法に関する。
本発明においては、上に特定した対象物を製造するため
に、以下の操作を使用する。
本発明の第一の目的はω−インターフエロンの精製法を
改良することにあるが、とくにこれは誰もまだ成功して
いない相当する抗ω−インターフエロン抗体アフィニテ
ィーカラムを公知方法で製造することによって行われる
。この場合の一方法は、α−インターフエロンの一部好
ましくはα１もしくはα２−インターフエロンたとえば
ＩＦＮ−ａ２　（ＡｒＣ＋）（ＥＰ−Ａ−０，０９５，
７０２参照）の一部と、ω−インターフエロンの一部好
ましくはω１　（Ｇｊ！ｕ）らしくはω１　（Ｇｊ！Ｖ
）インターフェロン（ＥＰ−Ａ−０，１７０，２０４参
照）の一部から作られた本発明の新規ハイブリッドイン
ターフェロンによって提供される。
ＩＦＮ−α２　（Ａｒｇ）とＩＦＮ−（Ｚ）１の場合、
相当する部分をコードするＤＮＡ配列を、たとえば両遺
伝子における１９１〜１９６番目のＢＱＩＭ切断部位を
介してリゲートできる。α−インターフエロンのアミノ
１１１−６６のペプチド中にあるギャップ、たとえばＩ
ＦＮ−α２（Ａｒ’Ｑ）中の４５番目のアミノ酸のギャ
ップは包含させれば、両遺伝子のこの配列は以下の塩基
配列図（細菌蛋白質合成後に通常再び分離されるＮ末端
Ｍｅｔ基を含む）から明らかなようにたがいに合致する
。
、　　、　　　　　家　　宝　　　　六　　彎　　　　
ｇｇ−一一一 ＝８降り　呂村朴　１１’ｌ　：　：　、＠ｌヨ　非３
を雪８υ８　　　＝甚ｏむ　　　ヨ淀只淀　　　フと；
と−べψべ　　−ｕ＞ｕ　　　ｅｏｕａ　　　＞ａ＞ａ
＞←り← ｕｕｂ：ｒｕ　　　茨Ｅ３ｇ　　　ｉ；５ｉ；ｅｉ　　
　ｅｃ：ｔ”−Ｌｊ４ＩＩ−１ ｏｔｕ＋／Ｉｈ ΔむΔ七　１＝碇＝シ　ゞと８と８４にミ芸知１ａ（Ｊ
＞Ｌｌ ６＜。。　　ｆｆｆｆａ’ｉ　　　２Ｅ２ｕ　　　Ｃ０
しｌ０−Ｉｊ −υ−ト ：ａｕ＋ａｕ　　ｉＪ３＜　　　Ｇ３５＜　　　５３’
＃５＋＋１＜−べ 、、　　　ｍＥｆｆ５　　　ａＥａ、ｉ；　　　５ｇ５
Ｂべａ＜＋、＋ Ｊヨ５　ｇ　　　；　ｇ　５　ｇ　　　、ＱＩ　Ｗ　、
ＱＩ　Ｗ　　　、、　、　、、乏”ｇｉ、；ｐ　　ｇ、
；Ｈｉｊ　　彎ｙｉｙｉ　　非ａ自ｇ５ｅ”ｔＪ　　Ａ
ｔ■　　ビ５６．Ｉ べべく＜　　禿！：Δ七 へ←Ｑｌ）− ４゜イ。　　１月Ｌ　　漏ご；−５星５ミ１１　＜　ｖ
＋　＜ ＋ｊＯＩｊｕ ＞リ　）−＋Ｌ５　　　　：ｌＥフ８ −←−← ｕｈｕ←　　エベ＞、ｊ　　ご１ご〉　　；乏二淀：　
￥ｈ　：　￥　　　３　’ｅ　’、　Ｅ　　　５　Ｉｇ
　ｊ　ｆ、　　、−ｓ　ｇ　！’　３工＜エベ　　　　
　　　　　　　　　　り＋ｊ１５１ｊｉ　５ａＨａｔ、
ｑ’　　　−：’ｇｇ　　　ＱＩＣＪＩＪ（ＪべＬ＋Ｌ
Ｌ／Ｉべ ２０番　弓１１　邑ふ証綽　症３０ 、Ｈｌ：、Ｈ七　　含藁訃呆　　１Ｉ足　　３Ｉ陥ベロ
ベυ ヨ乏只淀　　　ｚ８二δ ΔじΔし　　ΔＬ■　　リａｔｔｏ　　　Σベペ。
；乏：Ａ淀　　Ｈ電６　　　”ｇｇ　　　藁ご８−〇−
Ｑ −べ一＜　　テ８汗８　　　ａ呂５　ａ　　　　賽々ｉ
””　　　ｉ−＋？ｈ？　　　　　　　　　　ｔ＜ａｔ
ｙ−←Φ←　　ｊじ、！８　　　　　　　　１８！１”
”’　　　＜ｏ＜ａ　　　、３；；５　　　＞Ｕｏｃ・
・・・　　・・・。　　≧ｆｉ’５ｉｊ　　　”８８ａ
ｌｌ−ν←　　　二むｊむ Ｌ５０　り　Ｑ 上記配列中、各二重列の第一の列はＩＦＮ−Ｃ２（Ａｒ
ｇ）の相当する配列、第二の列はω１−インターフエロ
ンの配列である。両遺伝子に共通のＢｇｊ！　ＩＦ切断
部位はヌクレオチド１９１〜１９６番目に存在し、ＩＦ
Ｎ−Ｃ２（Ａｒｉは第二のＢにＪ１Ｍ部位をヌクレオチ
ド４５１〜４５６番目にもっている。
さらに各プラスミドの以下の表示は、大きさには関係な
く、その必須の配列と制限酵素認識配列のみを含有する
。以下の略号が使用された。
制限酵素認識配列： Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｂｇ：ＢＱ、ｌ！ＩＩ、Ｂｇｌ：ＩＦ
Ｎ−Ｃ２（Ａｒｑ）遺伝子にＪ３ける第一のＦ３ＱＩ　
ＩＩ部位、ＢＱ２　：　ＩＦＮ−７２２（ＡｒＧＩ）遺
伝子における第二のＢＱｆＩＩ部位、Ｅ：ＥＣ０ＲＩ、
Ｈ：Ｈｉｎｄｌ［［、Ｎ：ＮＣ０Ｉ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｓ
：５ｐｈＩ Ｐ１０ニトリブトファンプロモーター／オペレーター（
Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）と以下の
シャインダルガルノ配列（リポソーム結合部位）ｐａｒ
ニブラスミドｐＰＭ３１からの分配遺伝子座 ｏｒｉ：複製オリジン ｒ　　＋ Ａｐ　、アンピシリン抵抗性遺伝子 Ｔｃ　　、ｙトラサイクリン抵抗性遺伝子Ｓ　　、　− ＴＣ、Ｔトラサイクリン感受性遺伝子 ｋｂ：１０００塩基対 新規なりＱＩＴ１ハイブリッドインターフェロンおよび
そのＮ−グリコシル化誘導体は、α１もしくはα２イン
ターフエロンのアミノ酸１〜６６好ましくはＩＦＮ−α
２（Ａｒ９）のアミノ酸１〜６５とω１インターフェロ
ンのアミノ酸６７〜１７３から、またはω１インターフ
ェロンのアミノ酸１〜６６とα１もしくはα２−インタ
ーフエロンのアミノ酸６７〜１６７好ましくは［ＦＮ−
（２２（Ａｒｇ）のアミノ酸６６〜１６６からなり、Ｎ
末端Ｍｅｔ基は通常、細菌蛋白質合成後に再び除去され
る。
驚くべきことに、この新規ハイブリッドインターフェロ
ンは抗ＩＦＮ−α抗体によって認識される。したがって
、文献公知の抗ＩＦＮ−α−抗体くたとえばＥＰ−Ａ−
０，１１９，４７６参照）を用いて新規ハイブリッドイ
ンターフェロンを精製することができる。このようにし
て得られた精製ハイブリッドインターフェロンにより、
試験動物たとえばＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫処置すれば
、相当する抗体の生成を誘導することができる。これら
の新規な抗体は、新規なハイブリッドインターフェロン
を認識するのみでなく、驚くべきことにハイブリッドイ
ンターフェロンの各成分たとえばω−インターフエロン
をも認識する。
相当するハイブリッドインターフェロンプラスミド構築
に対する最初の基板は上述のようにα１−１α２−およ
びω１−インターフエロン遺伝子の１９１〜１９６番目
の共通のＦ３ＱＩ　ＩＩ制限部位である。この場合、Ｉ
ＦＮ−α２（Ａｒｔ；ｌ）遺伝子の４５番目のコドンの
ギャップも数えられていて、必要な相当する遺伝子の単
離の基盤はα１もしくはα２インターフエロンまたはω
１インターフェロンをコードするプラスミドである。
この目的で、本発明によれば、まず、ω１インターフェ
ロンの発現を改善する新しいプラスミドを製造する。使
用される原料プラスミドは、文献公知で市販されている
プラスミドｐＡＴ１５３（Ａｍｅｒｓｈａｓ製、またＡ
、　Ｊ、　Ｔｗｉｎほか：　Ｎａｔｕｒｅ２８３　；　
２１６〜２１８．１９８０）　、たとえばｒｏｒ　　Ｉ
　ＦＮ−α２　（Ａｒｃ）をコードするプラスミドｐａ
ｒｐＥＲ３３（ＥＰ−Ａ−０，１１５，６１３参照）、
および式 Ｃｙｍ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｈ
ｉｓ２゜ Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｍ＠ｔ　Ａ
ｒｇコ５ Ｌｙｓ　　入ｓｐ　　Ａｒｇ　　入ｒ９　人ｓｐ　　Ｐ
ｈａ　　入ｚ９５゜ Ｓ＠ｔ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈ
ｉｓＬ＠ｕ　　Ｇｉｎ　　Ｇｉｎ　　！ｌａ　　Ｐｈａ
　　Ｓａｒ　　ＬａｕＧｉｎ　　Ｇｉｎ　　Ｌ＠ｕ　　
Ｇｉｎ　　ＨＬｓ　　Ｌ＠ｕ　　ＧｌｕＧｌｕ　　ＧＬ
ｙ　　Ｇｌｕ　　５ｅｒ　　Ａｌａ　　−Ｘ−ＡｌａＡ
ｒｇ　Ａｒｇτｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　工１ｅ
Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ　ｋｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇ
ｌｕＳ＠ｔ　　Ｌａｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓ＠ｒ
　　Ｔｈｒ　　Ａｇｎｋｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ
　Ｇａｙ　Ｓａｔ　Ｓ＠ｔＧｌｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓ
＠ｔ　入ｒｇ　入ａｎ　Ｔｈｒ　Ｌ噛ｕ２５　　　　　
　　　　　　　　３Ｑ 入ｒｇ　　Ｘ１ｅ　Ｓａｒ　　Ｐｒｏ　　Ｆｈｅ　Ｌａ
ｕ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ’！’ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍａｌ　にｌｙＡｒｇ　Ｖａｌ　
Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ１４
５　　　　　　　　　　　　　　１．５０Ｖａｌ　Ｖａ
ｌ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ＧＬｕ工１ｅ　Ｍｅｔ　ＬｙｅＭ
ｅ仁Ｇｉｎ　Ｇｌｕλｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｌｙｍ（式中、１１１番目のＸはＧｊｌｕまたはＧｌ’
ｊである）で示されるω１−インターフエロンをコード
するプラスミドｐＲＨＷ１１もしくは１２（ＥＰ−Ａ−
０，１７０，２０４）のようなプラスミドである。
式 （式中、ＺはヌクレオチドＧまたはＣであり、Ｗはヌク
レオチドＧであるかまたはヌクレオチドがないことを意
味する）で示される配列を有するｐａｒ座、ならびに発
現に必要なプラスミドｏＥＲ１０３のレプリコンおよび
制御配列（特許請求の範囲第１７項参照）を含有するプ
ラスミドｐａｒｐＥＲ３３をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
で切断する。生成した２個のフラグメントをたとえば１
％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によって分離し
、ＩＦＮ−α２　（ＡｒＱ）遺伝子を含む小フラグメン
トを電気溶出によって単離する。
得られたＤＮＡをついでエタノール添加で沈殿させ、遠
心分離で分離し、たとえば１０ｍＭトリ（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ＝８．０および
１　ｉＭエチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウムＦ（Ｅ
ＤＴＡ）中、ＴＥ！笥液のような適当な緩衝液にとる。
プラスミドＰＡＴ１５３も３ａｍＨｒとＰｓｔＩで切断
する。生成した２個のフラグメントをたとえば１％アガ
ロースゲルを用いたゲル電気で分離し、複製オリジンを
含有する大フラグメントを単離する。このようにして得
られた大フラグメントをついで、プラスミドｐａｒｐＥ
Ｒ３３から得られた小フラグメントと、リガーゼたとえ
ばＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にリゲートさせる。
生成したプラスミドの複製のためには、細菌、好ましく
はＥ、ｃｏｌｉのＨ８１０１株〔遺伝子型Ｆ−、ｈｓｄ
ｓ２０　（ｒ−、ｍ−）　、ｒｅｃＡ１３、ａｒａ−１
４，１）ｒＯＡ２、ＪａＣＹｌ、ＱＥｌｌに２、ｒｐｓ
Ｌ２０　（Ｓｍ　　’）　、）ｌ／ｊ！−５、ｍｔｊ！
−１，５ｕｌ）Ｈ４４，１ａｍｂｄａ−）をＣａＣｌ２
溶液で洗浄し、得られたコンビ−テントＥ、ｃｏ１ｉ　
　Ｈ８１０１をリガーゼ反応混合物と混合し、０℃でイ
ンキュベーション後、４２℃で２分間の熱ショックによ
りプラスミドＤＮＡは細菌によって取り込まれる。次に
、形質転換した細菌をアンピシリン含有ＬＢアガール（
ＬＢメジウム＋アガール１５９／１）上で平板培養する
。組換えベクター分子を取り込んだＥ。
ｃｏｆｉ　　ＨＢ１０１細菌のみがこのアガール上で生
育できる。上述の操作により３７℃でインキュベーショ
ン後、得られた１２個のコロニーが選択され、それらか
らＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法（ＮｔｌＣＩ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　７　、１５１３．１９７９参
照）を用いてプラスミドが単離された。選択されたプラ
スミドのＰｓｔＩ−Ｂａｍ）−ＩＩ、ＰｓｔＩ−ｐｖｕ
ｍまたはＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩでの制限酵素二重消化
、ついで生成したフラグメントのゲル電気泳動によって
、これらのプラスミドの正しい構造が確認された。この
ようにして得られたプラスミドが選択され、ｐａｒｐＡ
ＴＥＲ３３と命名された（第１図の構築概要図参照）。
このプラスミドは、Ｅ、ｃｏＩｌｉ　　ＨＢｌｏｌを形
質転換した場合、表現型Ａｐ　（アンピシリン抵抗性）
、Ｔｃ’　　（テトラサイクリン抵抗性）を示す。
このようにして得られ、次の制限酵素地図で示されるプ
ラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３を、ω１−インターフエ
ロンの発現を改善するプラスミドの製造のために）ｌｉ
ｎｄｌｌ［および３ａｍＨＩで切断する（構築計画につ
いては第２図参照）。
このようにして生成した３個のフラグメントを、たとえ
ば１％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動で分離し、
長さ約３７５０塩基対（ｂｐ）で、トリプトファンプロ
モーター／オペレーター（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ　）　、複製オリジンおよびＡｐｒ遺伝了
を有する最大のフラグメント（フラグメントａ）を単離
し、ω１−インターフエロンをコードするＤＮＡとリゲ
ートさせる。このＤＮＡは、ω１−インターフエロンを
コードするプラスミドの切断、好ましくはプラスミドｐ
Ｒ）（Ｗｌ　１またはｐＲＨＷｌ２を３ａｍＨＩおよび
Ｈｉｎｄｌｌ［で切断し、ついで得られた２個のフラグ
メントをゲル電気泳動で分離することによって得られる
。所望の遺伝子は長さ約８００ｂｐの小フラグメントに
含まれている。生成したプラスミドを複製するためには
、細菌好ましくは旦ＩＣｏＪ！ｉ　　ＨＢＩＯＩをＣａ
Ｃ＊２ｍ液で洗浄し、得られたコンピテントＥ、Ｃｏ、
！　ｔ　　ト１８１０１をリガーゼ反応混合物と混合し
、０℃でインキュベーション後、４２℃で２分間の熱シ
ョックによりプラスミドＤＮＡを細菌に取り込ませる。
ついで形質転換された細菌をアンピシリン含有ＬＢアガ
ール上で平板培養する。組換えベクター分子を吸収した
Ｅ、ｃｏｆｉ　　Ｈ８１０１細菌のみがこのアガール上
で生育できる。この操作を用い、３７℃でインキュベー
ション後、得られた６個のコロニーを選択し、これらか
らＢｉｒｎｂＯｉｌらの方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　　７　、１５１３．１９７９）を用いてプ
ラスミドを￥１ｍした。選ばれたプラスミドをＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩ［［、ＮｃｏＩおよびＰｓｔ工により制
限酵素消化したのち、これらのプラスミドの構造の正し
さが確認された。このようにして得られた次の制限酵素
地図 〔式中、ＩＦＮω１はＩＦＮ−ω１　（ＧｉＶ）または
ＩＦＮ−ωｌ　（Ｇｊ！ｕ）をコードするＤＮＡ配列を
示す）を有するプラスミドが選択され、ω１（Ｇｌｙ）
インターフェロンをコードするプラスミドｐＲＨＷ１２
を出発プラスミドとして用いた場合、ｐＲＨＷｌ　４と
命名されたく第２図参照）、Ｅ、ｃｏ、ｉ！ｉ　　Ｈ８
１０１を形質転換した場合、このプラスミドは表現型Ａ
ｐ　およびＴＣＳを示す。
出発プラスミドとしてｐＲＨＷｌｌを用いた場合には、
ω１　（Ｇｊ！ｕ）インターフェロンをコードするプラ
スミドｐＲＨＷ１３が同様にして得られる。
このようして得られたプラスミドｐＲＨＷ１４は、従来
公知のプラスミドｐＲＨＷ１２　（ＥＰ−Ａ−０，１７
０，２０４）に比較して、ω１（Ｇｊ！Ｖ）インターフ
ェロンの２倍の発現率を有することが、マキシ細胞系（
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３７．６９２〜６９３
．１９７９）によって明らかにされた。すなわち、ＵＶ
誘発損傷に対する修復系を欠いているＥ、ｃｏｊ！ｉ　
　Ｃ３Ｒ６０３（遺伝子型１”−、ｔｈｒ−１、Ｊｅｕ
Ｂ６、ＤｒＯ△２、ｐｈｒ−１、ｒｅｃＡｌ、ａｒＱＥ
３、ｔｈｉ−１，ｕｖｒＡ６、ａｒａ−１４、］ａｃＹ
１、ＱａＩＫ２、ＸＶｆ−５、ｍｔ！−１，ｇＶｒＡ９
８　（ｎａＩＡ９８）、ｒｐｓＬ３１、ｔｓｘ−３３，
１ａｍｄａ−１ｓｕｐＥ４４）をプラスミドｐＲＨＷ１
２およびｐＲＨＷｌ４で形質転換する。照射量を、細菌
の染色体は損傷されることは多いがプラスミドはほとん
ど損傷されないように選択すれば、プラスミドのコード
する遺伝子の転写、したがって翻訳のみが優位に起こる
。メジウム中に３５８−メチオニンを加えておくと、主
たるプラスミド遺伝子産物は標識され、これはアクリル
アミドゲル上で分離したのち、Ｘ線フィルムで直接、増
感フィルムを用いることにより記録できる（第３図参照
）。いずれの場合もアンピシリン抵抗性遺伝子産物（β
−ラクタマーゼ、ｂｌ　ａ）同等に強く標識される。
しかしながら、ｐＲ）−ＩＷｌ　４の場合は、ω１（Ｇ
ｊ！ｙ）−インターフエロンはＤＲＨＷ１２の場合に比
し２倍強く標識される。
式１のハイブリッドインターフェロンをコードし、共通
のＢ（Ｊｊ！ＩＩ切断部位の上流にα１−またはα２−
インターフエロンをコードするＤＮＡ配列を有するプラ
スミドを製造するためには（構築計画については第４図
参照）、たとえばプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３と、
ω１−インターフエロンをコードするプラスミドたとえ
ばプラスミドｐＲＨＷ１４をそれぞれＢＣＩ　ＩＦおよ
び５ｐｈＩで切断する。このようにして生成されたフラ
グメントをたとえば１％アガＯ−スゲルを用いてゲル電
気泳動により分離し、溶出し、エタノール沈殿によって
精製する。ｐａｒｐＡＴＥＲ３３およびｐＲＨＷｌ　４
に出発した場合、得られたフラグメントを適当な緩衝液
たとえばＴＥ緩衝液に溶解したのち、プラスミドｐａｒ
ｐＡＴＥＲ３３から得られた大フラグメントをプラスミ
ドｐＲＨＷＩ　４から得られた小フラグメントと、リガ
ーゼたとえばＴ４ＤＮＡ−リガーゼの存在下にリゲート
させた。得られたプラスミドを複製するためには、細菌
好ましくはＥ、ｃｏｔｔ　ｒのＨ８１０１株〔遺伝子型
Ｆ−、ｈｓｄｓ２０　（ｒ−、ｍ−）、ｒｅｃＡ１３、
ａｒａ−１４、ｐｒｏＡ２．１ａＣＹ１、ＱａＩＫ２、
ｒｐｓＬ２０（Ｓｍ’　）　、ｘ　ｙｌ−５、ｍｔＪ−
１，５ｕｐＥ４４、ｊａｍｂｄａ−）をＣａＣｌ２溶液
で洗浄し、このようにして得られたコンピテントＥ。
ｃｏｔ　１Ｈ８１０１をリガーゼ反応混合物と混合し、
０℃でインキュベーション後、４２℃で２時間の熱ショ
ックによりプラスミド［）ＮＡを細菌に取り込ませた。
次に、形質転換された細菌をアンピシリン含有ＬＢアガ
ール（Ｌ８メジウム＋アガール１５５Ｆ／Ｊ）上に置い
た。組換えベクター分子を取り込んだＥ、ｃｏｊ！ｉ　
　）１８１０１細菌のみがこのアガール上で生育できる
。３７℃でインキュベーション後、生成した数個のコロ
ニーを選択し、これらからＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法（
１４ｔｌｃｌ。
＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　　７．１５１３．１９７９）を
用いてプラスミドを単離した。選ばれたプラスミドをＢ
ＱＪ！　Ｉｔおよびｓｐｈ■でＩＩＩ限醇素二重消化し
て、これらのプラスミドの構築の正しさが確認された。
得られたプラスミドが選ばれ、１）ＲＨ７２と命名され
た。以下の制限酵素地図 を有するこのプラスミドは、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ　　Ｈａｌ
ｏｌを形質転換させた場合、表現型Ａｐ　およびＴＣＳ
を示し、式 Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎτｈｒ２゜ Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｌａｕ入１ａ　Ｇｉｎ　ＭｓｔＬｙｓ
　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　Ｐ′ｈａＧｉｎ
　ｈ＠Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＧｌｕＧｉｎ　Ｇｉｎ
　　工ｍ＠　Ｐｈａ　　Ｓａｔ　Ｌ＠ｕ８゜ Ｔｒｐ　入ｓｎ　Ｍｅセ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕＧｉ
ｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　１（ｉｓ　Ｌ＠ｕ　ＧｌｕＧ
ｌｙ　Ｇｌｕ　　Ｓａｒ　入１ａ　（ｄｙ　入１ａＡｒ
ｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｚｌ＠Ｓａｒ　
Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ＧｌｕＬ＠ｕ　’Ｐ
ｈ＊　　Ｌ＠ｕ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ１〕０ ｋＸｑ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　ＳｅｒＡｒ
ｇ　Ａｒｇ　　！ｌ＊　Ｓａｒ　Ｌ＠ｕ　　ｈａ　Ｓａ
ｒ　Ｃｙ＋ａ　Ｌｅｕτｈｒ　Ｘ１＠　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ｌ＠ｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　工ｌ＠Ｔｈｒ　Ｃ
ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｕ１１ａ　　Ｓａｒ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　入
１ａ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　ＡｒｇＡｒｇ　Ｖａ工
τｙｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｙｒＭｅｔ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｔａｕ　Ａｒｇ
　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐで示されるＩＦＮ−α２／ω
１　（Ｇｊ！ｙ）−（ＢｑＪＩＩ）、そのＭｅｔおよび
Ｎ−ホルミルＭｅｔｉ導体、ならびにそのＮ−グリコシ
ル化に導体をコードし、このポリペプチドをコードす（
式 で示される配列を含有する。ＤＲＨ７２のＩＦＮ−α２
／ω１　（Ｇｌｙ）コード配列がその退行変異体に置換
されていてもよいことを理解すべきである。
式■のハイブリッドインターフェロンをコードし、共通
のＢＯｊ！ＩＩ切断部位の上流にω１−インターフエロ
ンをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを製造す
るためには（構築計画については第５図参照）、ＩＦＮ
−α２　（Ａｒｇ）のＤＮＡ配列の場合のように、α−
インターフエロンのＤＮＡ１ｉ！デ１に２個のＢＱｊｌ
Ｉ切断部位がある場合には、２工程操作に従わなければ
ならない。
第一工程では、プラスミドｐＲＨＷ１４のＢｇＪ！ｎお
よび５ｐｈＩによる切断で得られた大フラグメントを、
プラスミドＤａｒｐＡＴＥＲ３３のＦ３Ｑ１■および５
ｐｈＩによる消化で得られＩＦＮ−α２　（Ａｒａ）の
Ｃ末端をコードするフラグメントと、リガーゼたとえば
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下にリゲートさせる。生成し
たプラスミドを複製するためには、細菌好ましくは旦Ｉ
ＣｏＪｉ　　Ｈ８１０１を形質転換し、培養する。
選択されたプラスミドの構造は、プラスミドＤＲＨ７２
の製造に関して前述したと同様にしてチェックされる。
このようにして得られたプラスミドは選択され、ＤＲＨ
７７と命名された。次の制限酵素地図を有する。
第二工程においては、ハイブリッドインターフェロン、
たとえばＩＦＮ−ω１／α２　（Ｂ（１！ＩＩ）の遺伝
子を完成するために、ｐａｒｐＡＴＥＲ３３の切断時に
除去された位置１９２〜４５５のフラグメントをプラス
ミドｐＲＨ７７に再挿入する必要がある。そのためには
、プラスミドｐＲ）−１７７をＢＱｊ！Ｉ［で切断し、
５′末端のホスフェートをウシ小腸ホスファターゼ（Ｃ
ＩＰ）を用いて除去する。このようにして得られた線状
化プラスミドｐＲＨＷ７７をたとえば１％アガロースゲ
ルを用いてゲル電気泳動により分離し、単離し、エタノ
ール沈殿によって精製した。得られた線状化フラグメン
トを適当な緩衝液たとえばＴＥ緩衝液に溶解したのち、
このフラグメントを、ｐａｒｐＡＴＥＲ３３のＢＱｊ！
ＩＩおよび５ｐｈＩによる最初の消化で得られた２６３
Ｍ）フラグメントとリガーゼたとえばＴ４ＤＮＡ−リガ
ーゼの存在下にリゲートさせる。得られたプラスミドを
複製するためには、細菌好ましくはｌ：、ｃｏｊ！ｉ　
　Ｈｅ１０１を、プラスミドりＲＨ７２の１１造に関し
て前述したと同様にして形質転換し、培養する。選択さ
れたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｌ１ｕＩま
たはＨａｅｍで切断し、その構造の正しさをチェックす
る。末端が同一であるために、２６３ｂｐのフラグメン
トは２つの方向に挿入される。
２６３ｂｐ　　ＢｏｊｌＩフラグメントが発現のために
正しい位置に挿入されたプラスミドはｐＲＨ７８ｒ１一
方、発現のための方向性が正しくないプラスミドはｐＲ
Ｈ７８ｆと命名されている。
Ｅ、ＣＯＪ！ｉ　　ＨＢｌｏｌを形質転換すると、両プ
ラスミドは表現型Ａｐ　およびＴＯを示す。
プラスミドｐＲ）１７８ｒは以下の制限酵素地図を有し
、次のＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱＪ！ＩＩ）ポリペプチ
ド配列をコードし、その下段に示したこのポリペプチド
をコードするヌクレオチド配ダ１を含有する。
Ｅ　　目　　委　　８８　六　　； 寸　　　　　　豐　　　　　　　噴 ｏ　５　ｇ　Ｅフ目ｏ：；ｖ：Ｂｇｉ擬揖ＩＪａ　ぎ葺
　！底　■　占滅　！這 と引　５３　　、ｉ転　３！　　５’　　、ｑ’風足　
二１　　冨８　：？　二６　謔ちＺＦ　ｉ目　タ３　昌
　Ｉ郊　Ｊ目 ：Ｂ３Ｍ３Ｈ’ＯＦ＋２’、５’ｉｉ５’Ｍ’ｉＥ！４
ａＳ慕　コ目　３墓　昌　ロ　訂 ｊｅ　Ｊヨ　】庭　占滅　Ｊ３１瑚 ５　ｊ　　Ｕ底　長　！遥　Ｓ澹　ン１？リ　芝３　　
ｆｆｆｌ　　ａ３　　；ｕ　　１舶２　ａｇ５ｒｉ　ｏ
、ａｌ、ｙ；４ａＦ、、ｇＦ、Ｉ’ｊ、ｔｆ、。
？３　ｊｕ　Ｊ３　お％　　ｆｆＨｊ記＃Ｈ４ｔ、　　
ａ５　　Ｂ３　　Ｍｕ、、　　ａｐ　　　３５ち　五°
　１°　°０　“０　“目　５　ａぺ。　　。５　　〉
し　　−足　ごモ　よコ騒　ｋＦ　ぎ嚢　ロ　３却　Ｉ
囃１３瑚プラスミドｐＲＨ７８ｆは次の制限酵素地図を
有し、次のポリペプチド配列をコードし、その下段を示
したこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
有する。
η１８δＨｌ：　Ｂ　５　：５　ｉｆ　　　ｇ　ｉ：　
３拓８８＜＆４ａｔｓａ←べ 謂２　５Ｌ：　　ｇち　苗ご　　目妊ご口ｌ遜ｔｎ３　
　３ＣＪ　　　”　　　ゝ０ 々（２！：　エ＜　３む　　Ｈｇ目ｌ〔謔８　２む　：
淀　１？　　　１定む８拓６七ＵａＵ＜　　←　ト　ペ ｇ肛　　冨８　！０　−む　　　ご巳じυ肛８≦ｔａｕ
　　ｔｎｈ　　Ｃ５０ｗｈ　　　ｈ＜ｕ６＜ｈａ−５じ
Ｎ＝ミ！よ８哨是舞　　とミ＄６ごと臣ｕａ＜ｈ＜　　
Ｅ−１ｕ ご８　々ミ　Ｃ七　５拓　　？６８ｉちむ８Ｑ←ｈｏｈ
す← 仁ト２七定七〇 国Ｕ　＜ペ　ペ（苗ご　　−じ□ｕｕべ〉、Ｈ２、Ｈ２
ｆ、；　　冒ｕ　　　１ｅｌｉ：ｇ５５５　５ｇ　　；
５　３２　　（：８５ｍ”ｎｏ、、ｕ彎、ｔｙ＋３ｏａ
８２Ａｒ、、：１；、ＢＮ２Ｅ５　ｇ　　３ｇ　　、ｃ
ｒｔｉ　　３Ｅ　　５ｇＨｊ’９！”；５　　ｄ　　；
５　　；ｇ　　’５５ＭＥｇＨＵＥｆｆｌご　５じ　ニ
　ｉ　ＡＩ髄ＩＨＩ Ｍｅ、、Ｈ３ｇ　　ξ目　］弓ｕｇ”ｐｉｇ複製および
発現のためには、本発明の新規プラスミドは細菌宿主に
導入することができる。原核生物、たとえばＥ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ１２、株２９４（ＡＴＣＣ順３１．４４６）、
Ｅ、ｃｏ１ｉＸ１７７６（ＡＴＣＣＮα３１．５３７）
、Ｅ。
ｃｏＪｉ　　Ｗ３１１０（Ｆ−１ｊ！ａｍｂｄａ−１原
栄養株、ＡＴＣＣＮα２７．３２５）、Ｅ。
ｃｏｉｉ　　）−ＩＢｌｏｌ［Ｆ−１ｈｓｄｓ２０（ｒ
”　、ｍ−）、ｒｅＣＡ１３、ａｒａ−１４、ｐｒｏＡ
２．１ａｃＹ１、ＱａＩＫ２、ｒｐｓｌ−２０（Ｓｍｒ
）、ｘｙｌ−５、ｍｔＪ−１，５ｕｌ）Ｅ４４．１　ａ
ｍｂｄ　ａ−）　、ＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉＳ
のようなりａｃｉｌｌｉ　ｉｌおよび他の腸内細菌たと
えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔＶＩ）ｈｉｌｌｌＪｒｉ
ｌｌまたはＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなら
びに各種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓが適していることが
明らかにされている。
新規ハイブリッドインターフェロン、プラスミドＤＲＨ
７２，ｐＲＨ７８ｆおよびｏＲＨ７８ｒを発現させるた
めには、たとえばＥ、ｃｏＪｉを形質転換させ、培養す
る。発現したポリペプチドの抗ウィルス活性を、細胞を
破壊し細菌屑を除去したのち、ＣＰＥ減少試験を用いて
測定した。
ｐＲＨ７２で形質転換したＥ、ＣＯＪ！　ｉおよび１）
Ｒ８７８ｆで形質転換したＥ、ｃｏｌｉから得られた細
胞残留物は抗ウイルス性を示さないことが明らかにされ
た。しかしながら、驚くべきことに、ＩＦＮ−ω１／α
２（ＢＱｊ！ＩＩ）を含むプラスミドｐＲＨ７８ｒから
得られた細胞残留物は、Ａ３４９１［１胞に対して特異
的抗ウィルス活性を有し、これはＩＦＮ−＋２２　（Ａ
ｒａ）の約４倍強力であった。
本発明によって製造され、新規ハイブリッドインターフ
ェロンをコードする新規プラスミドのＤＮＡ配列はまた
、適当にｉ飾後、他の任意の生物体中に導入することも
できる。
この種類の配列の発現および翻訳は、その非形質転換型
生物体にとって「同等」とみなせる他の調節システムの
制御下にも実施できる。たとえば、ラクトース依存性Ｅ
、ＣＯＪ！　＋からの染色体ＤＮＡはラクトースまたは
１ａＣ−オペロンを含有し、これは酵素β−ガラクトシ
ダーゼの発現を指示することによりラクトース分解を可
能にする。
１ａｃｌｌｌＩＯ要素は、Ｅ、ｃｏｉ　ｒに感染するバ
クテリオファージｊ！ａｍｂｄａ−ｐｊ！ａｃ５から得
ることができる。このファージの１ａＣ−オペロンは同
一の細菌種から形質導入によって得ることができる。本
発明の方法において使用できる調節システムはまたその
生物体に固有のプラスミドＤＮＡに由来するものであっ
てもよい。１ａＣ−プロモーター／オペレーターシステ
ムはＩ　ＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）によ
って誘導することができる。
他のプロモーター／オペレーターシステムまたはその部
分、たとえばアラビ１−スプロモーター／オペレーター
、コルヒチンＥ１プロモーター／オペレーター、ガラク
トースプロモーター／オペレーター、アルカリホスファ
ターゼプロモーター／オペレーター、ｔｒｐブＯモータ
ー／オペレーター、キシロース−Ａプロモーター／オペ
レーター、ｔａｃプロモーター等も、同様に有効に使用
できる。
原核生物のほかに、酵母のような真核生物を用いること
も可能である。真核生物の微生物中ではＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがもつとも一般的
に使用されるが、他の多くの種も一般的には利用可能で
ある。ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中での発現には、プ
ラスミドＹＲｐ７、たとえば（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂほ
か、Ｎａｔｕｒｅ、２８２．３９．１９７９：にｉｎｇ
ｓｍａｎホか、ａｅｎｅ、ヱ、　１４１　、１９７９　
：　Ｔｓｃｈｕｕｅｒ　ホか、Ｇｅｎｅ、　１０．１５
７．１９８０）およびプラスミドＹ　Ｅ　Ｄ　１３　（
Ｂｗａｃｈほか、Ｇｅｎｅ、　８．１２１〜１３３．１
９７９）が通常使用される。プラスミドＹＲＤ７はＴＲ
Ｐ１遺伝子を含有し、これはトリプトファンを含まない
メジウム中で生育できない酵母変異株に選択マーカーを
与える。たとえばＡＴＣＣＮｋ１４４０７６゜ 酵母宿主ゲノムの特性としてＴＲＰ１変異が存在すれば
、形質転換を示す有力な道具になる。培養をトリプトフ
ァンなしで実施すればよい。酵母遺伝子しＥＵ２を含有
するプラスミドＹＥｐ１３の場合も事情は全く同じで、
これをＬＥＵ−２マイナス変異株を補うために使用でき
る。酵母ベクターに適当なプロモーター配列は、ＡＤＨ
Ｉ（Ａｍｍｅｒｅｒ、　Ｇ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、上旦ユ。
１９２〜２０１．１９８３）、３−ホスホグリセレート
−キナーゼ（Ｈｉ　ｔｚｅａ＋ａｎほか、Ｊ、　Ｂ１１
１゜Ｃｈｅｗ、、２５５．２（５７３，１９８０）また
は他（Ｆ）ＩＩＮ糖酵素（Ｋａｗａｓｋｉ　＆　Ｆｒａ
ｅｎｋｅｌ、ＢＢＲＣ，ｌ立８．１１０７〜１１１２．
１９８２）たとえばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−
３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ
、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナ
ーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼの遺
伝子の５′接続領域を含有する。適当な発現プラスミド
を構築する場合には、これらの遺伝子に伴う終結配列も
発現ベクター中の発現させる配列の３′末端に、ｍＲＮ
Ａのポリアデニル化と終結を与えるために挿入できる。
転写が生育条件によって制御される利点をも有する他の
プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ−２、
イソシトクロームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関
連する分解酵素、上述のグリセロアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガ
ラクトースの処理にかかわる酵素の遺伝子のプロモータ
ー領域が包含される。酵母接合型遺伝子座によって調節
されるプロモーター、たとえば遺伝子ＢＡＲＩ。
ＭＦα１．５ＴＥ２．５ＴＥ３および５ＴＥ５のプロモ
ーターは、温度依存性ｓｉｒ変異を用いて温度調節シス
テム中に挿入することもできる（Ｒｈｉｎｅ　Ｐｈ、　
Ｄ、　　学位論文、オレゴン大学、Ｅｕｇｅｎｅ、　０
ｒｅ（Ｉｏｎ、　　１９７９　：　ＨｅｒＳｋＯＷｉｔ
Ｚ　＆Ｏｓｈｉｍａ、　　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＹｅａｓｔＳａＣＣ
ｈａｒｏｌｙＣｅＳ、第１部、１８１〜２０９．１９８
１　、　Ｃｏ１ｄ　５ｔ）ｒｉｎｉｌｌ　Ｈａｒｂｏｒ
　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、これらの変異は、酵母の
静止接合型カセットの発現に影響するので、間接的には
接合型依存性プロモーターに影響する。しかしながら一
般には、酵母に適合性のプロモーターおよび酵母に特異
的な複製、終結配列を含有する任意のベクターが適して
いる。
微生物に加えて、培養多細胞生物体も宿主生物として適
している。理論的には、を椎動物または非育４を動物い
ずれのｉｔ＋Ｐｉｉ培養から得られる培養細胞も使用で
きる。しかしながら、を椎動物細胞の培養による増殖（
組織培養）は、最近、常套手段になっているので（Ｔｉ
ｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｋｒ１Ｊｓｅ　＆Ｐａｔｔ
ｅｒｓｏｎ　＠、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　
１９７３　）　、とくにを椎動物の細胞にとくに興味が
もたれている。
この種類の有用な宿主細胞系には、ＶＥＲＯおよびＨｅ
Ｌａ１胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｉｔ
胞、ならびにＷ２Ｂ５、Ｂｌ−ＩＫ、Ｃ０８−７および
ＭＤＣＫ［ｌ胞系が包含される。
これらの細胞の発現ベクターは、一般に、複製オリジン
、発現させる遺伝子の上流に位置するプロモーター、な
らびに必要なＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化
部位および転写終結配列を含有する。
哺乳動物の細胞を使用する場合は、発現ベクター上の制
＠機能はウィルス材料から取ることが多い。たとえば慣
用されるプロモーターはポリオーマ−アデノウィルス２
から得られ、またシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）
はとくにしばしば用いられる。ＳＶ４０の初期および後
ｍ遺伝子のプロモーターは、いずれも、ＳＶ４０のウィ
ルス複製オリジンを含有するフラグメントとしてウィル
スから容易に得られるのでとくに有用である（Ｆｉｅｒ
Ｓほか、Ｎａｔｕｒｅ、　ｉＬユ、　１１３　、１９７
８〉。ＳＶ４０の小フラグメントも大フラグメントも、
それがウィルス複製部位におけるＨｉｎｄｌ［［切断部
位から８にｌＩＩ切断部位に及ぶ長さ約２５０ｂｏの配
列を含有する限り、使用できる。さらに、所望の遺伝子
配列と正常には接続しているプロモーターまたは制御配
列は、これらの制御配列が宿主細胞システムと適合性を
示す限り、使用可能であるし、使用が推賞できる場合が
多い。
複製部位は、外因性部位を導入するための適当なベクタ
ー構築により、たとえばＳＶ４０または他のウィルス源
（たとえば、ポリオーマ、アデノ、■Ｓ■、ＰＢＶ等）
から供与することもできるし、また宿主細胞の染色体複
製礪構を用いることもできる。ベクターを宿主細胞染色
体に統合する場合には、一般に後者の方法で十分である
。
その生物学的活性のスペクトルに基づき、本発明の新規
ハイブリッドとくにＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱＪＩＩ）
インターフェロンは、公知のインターフェロンが使用さ
れている任意の種類の治療に使用できる。これらには、
たとえば、ヘルペスウィルス、ライノウィルス、ＡＩＤ
Ｓにおけるウィルス感染およびその他のウィルス疾患、
各種癌等が包含される。新規インターフェロンはそれ自
体で、または他の公知インターフェロンもしくは生物学
的活性物質たとえばｔＦＮ−γ、ＩＬ−２、他の免疫調
節剤等とともに使用できる。
ＩＦＮ−ω／ａ２　（ＢＱｊｌＩＩ）のようなＩＦＮ−
ω／αハイブリッドは、抗腫瘍または抗ウイルス治療が
必要な場合、または免疫系が抑制された患者における抗
ウイルス予防処置に際して、非経口的経路で投与できる
。投与量および投与回数は、現在臨床試験においてＩＦ
Ｎ−α物質について用いられているのと同様でよい。た
とえば、約（１〜１０）Ｘ１０６単位／日、１％以上純
粋な製剤の場合、約５×１０７ｗ１位／日までが投与さ
れる。
実質的に均一な細菌産生ＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱｊＩ
Ｉ＞の簡便な剤型を製造するに際しては、たとえば非経
口投与用剤型の場合、ＩＦＮ−ω１／α２　（ＢｑＪＩ
［）３Ｈｇを５％ヒト血清アルブミン２５ｄに溶解して
もよい。ついでこの溶液を細菌フィルターに通し、濾液
を無菌条件下に１００個のバイアルに分包する。各バイ
アルは非経口投与に適当な＠ＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱ
ｊｌＩＩ）６Ｘ１０６単位を含有する。ガラスバイアル
は使用時まで冷所（−２０℃）に保存することが好まし
い。本発明の物質は、医薬として使用できる組成物を得
るためには公知方法で処方することができる。本発明の
ポリペプチドは医薬として許容される担体物質と混合さ
れる。慣用の担体およびその処方については、Ｅ、　Ｎ
、　ＨａｒｔｉｎのＲｅａ＋ｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓの記載が参
考になる。
患者に効果的に投与できる適当な医薬製剤の製造には、
ＩＦＮ−ω１／α２（ＢｑｆＩＩ）を適当量の担体と混
合する。非経口投与が好ましい。
さらに、新規ハイブリッドインターフェロンは、これら
のインターフェロンとくにＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱＪ
Ｉ［＞に対する抗体であって、同時に母体のインターフ
ェロンｒＦＮ−α２およびＩＦＮ−ω１をも認識する抗
体の製造に適している。このようにして製造された抗体
は、したがって、ω−インターフエロンの免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーに適している。
したがって、本発明はさらに、新規モノクロナール抗体
産生ハイブリッド細胞系、その製造方法、およびＩＦＮ
−αおよびω−インターフエロンとくにω１インターフ
ェロンに特異的なモノクロナール抗体のマウスからの製
造方法を包含する。
この新規モノクロナール抗体は、ω１　（Ｇｊ！ｕ）ま
たはω１　（Ｇｊ！ｙ）インターフェロンの高度精製お
よび検出にとくに適している。
このために必要な抗体産生ハイブリッド細胞系は、ハイ
ブリッドインターフェロンたとえば１ＦＮ−ω１／α２
（ＢＱｊ！Ｉ）で免疫処置したマウスの牌細胞と、骨髄
腫細胞たとえばＰ３−Ｘ−６３Ａｇ８−６５３系の骨髄
腫細胞（ＮａｔｌＪｒｅ。
２６６．５５０〜５５２．１９７７参照）との細胞融合
によって得られる。このようにして得られた細胞系は、
免疫処置に使用したハイブリッドインターフェロンおよ
び２種の母体インターフェロンたとえばＩＦＮ−ω１／
α２（ＢＱｊｌＩＩ）の場合はω１インターフェロンと
ＩＦＮ−α２（Ａｒｃ）の抗ウイルス活性両者を中和す
ることができ、ω１インターフェロンのアフィニティー
クロマトグラフィーに適している。
生物学的に不活性な担体に結合させると、上述のように
して製造された抗体はω１インターフェロンまたはＩＦ
Ｎ−αの超精製に使用できる。
抗体は適当に活性化された担体、好ましくはデキストラ
ンに基づく担体、たとえばＰｈａｒｍａｃｉａ社（Ｉｌ
ｐｐｓａｌａ　）　製のＣＮＢｒ−活性化セファロース
またはＣ）−１−活性化セファロースに共有結合させる
。超精製には、ＥＰ−Ａ−０，１７０，２０４に記載の
方法によっであるいは本発明により上述の新規プラスミ
ドを用いて得られた、精製すべきω１インターフェロン
の溶液を、上述のようにして製造した抗体親和性担体上
に、弱塩基性（ｉｌｌたとえばｐＨ７〜８、好ましくは
ｐＨ７，５で送り、溶出液に蛋白質が認められなくなる
までｐＨ１７，５で洗浄し、ついで結合したインターフ
ェロンを、酸性範囲で、たとえば２５％エチレングリコ
ール中０．１Ｍクエン酸を用いて溶出する。ａられた蛋
白質含有フラクションを強酸性陽イオン交換樹脂たとえ
ばＰｈａｒｍａＣｉａ製の陽イオン交換樹脂Ｈｏｎｏ−
８上クロマトグラフイーに付す。上記溶出液中のヒトイ
ンターフェロンは直ちに陽イオン交換カラムに吸着され
る。これをＮａＣ１勾配を用いてついで溶出する。
本発明に関連して必要な基本的プラスミドは、ＥＰ−Ａ
−０，１１５，６１３およびＥＰ−Ａ−０，１７０，２
０４の関係でそれぞれ、（ｌｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌ
ｕｎｇ　　ｆｊｒ　Ｈｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｉｃｎに
寄託された。
たとえば、ｐＥＲ１０３はＤＭＳ懇２７７３として１９
８３年１２月２０日、Ｅ７６Ｅ９およびＰ９Ａ２はそれ
ぞれＤＭＳ順３００３および３００４として１９８４年
７月４日に寄託され、これらのクローンの公開に必要な
宣言もすでに行なわれている。これらのプラスミドを用
い、ＥＰ−Ａ−０，１１５，６１３およびＥＰ−Ａ−０
，１７０，２０４の記載によれば（Ｈｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ。
■、４７３９〜４７４９．１９８５も参照）、本技術分
野の熟練者には本発明の再現は容易であろう。
次に本発明を以下の実施例によりさらに例示するが、こ
れは本発明をいかなる意味においても限定するものでは
ない。
実施例中のすべての酵素反応はその製造業者が特定した
条件下に実施されている。
例１ ｐａｒｐＡＴＥＲ３３の製造 ｐａｒｐＡＴＥＲ３３（１０μｙ＞を２００μｍの反応
溶液中、各２０ｍ位の［３ａｍＨＩおよびＰＳｔＩで切
断する。生成した２個のフラグメントを、ついで１％ア
ガロースゲル中［１×ＴＢＥ緩衝液ニドリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン＜Ｔｒ　Ｉ　５）１０．８ＳＦ
／Ｊ！、ホウ酸）　　　　５．５’Ｊ／１、エチレンジ
ニトリロ四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）０．９３９
／１およびエチジウムプロミド（ＥｔＢｒ）０．５ｙ／
ｊ！中１％アガロース：溶出緩衝液は１ＸＴＢＥ：電気
泳動５Ｖ／Ｃｍ：ＤＮＡフラグメントはアガロースゲル
を紫外線（２５４ｎｍ）で照射して可視化する］で分離
する。インターフェロンα２−Ａｒｑ［ＩＦＮ−ａ２　
（Ａｒｏ）］を含有する小フラグメントヲ単Ｉｄｌ　［
ＤＮＡ帯（７）ＤＥ−８１ｉ１紙（＠ｈａｔｍａｎ　）
上電気泳動；濾紙は２００１１１８Ｎａ（、！、２５＋
１１８　　Ｔ　ｒ　ｉ　Ｓ、　Ｉ）Ｈ＝７．５．１ｍＨ
Ｅ［）ＴＡで洗浄：　［）ＮＡの溶出はＩＭ　　ＮａＣ
ｊ！、２５ｅＨＴｒ　ｉ　ｓｐＨ＝７．５．１ｍＭ　　
ＥＤＴＡで実施１、ＤＮＡを２６５容のエタノールを加
えて沈殿させる。遠心分離後、ＤＮＡを乾燥し、適当容
量のＴＥＩＩ衝液（１０ｍ）Ｉ　　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，
ｏ。
１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）にとる。
１０μ９のｐＡＴｌ　５３も反応溶液２００μｌ鴫 中、２０ｍ位のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し、得
られたフラグメントを分離する。ｍ製オリジンを含む大
フラグメントをｐＡＴｌ　５３から単離する。
精製ＤＮＡフラグメント０．５μ３を反応溶液［６６ｍ
ＨＴｒ　ｉ　ｓ、　ｐＨ＝７．５．１００ｍＨＮａＣ１
，５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｉ　ＩＮ　　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　１　ａ＋Ｈアデノシントリホスフ
ェート＜ＡＴＰ）１２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５
単位の存在下にリゲートする。ついで、１５０μｍのコ
ンビ−テントＥ、ｃｏｊ！ｉ　　ＨＢｌｏｌ［Ｆ−、ｈ
ｓｄｓ２０　（ｒ−、ｍ−）　、ｒｅｃＡ１３、ａｒａ
−１４，ｐｒｏＡ、ｊ！ａｃＹ１゜ＱａｌＫ２．ｒｐＳ
Ｌ２０　（Ｓｍｒ）、ｘｙｉ−５、ｍｔトづ、５ｕｐＥ
４４．１ａｍｂｄａ−］をリガーゼ反応混合物１μｌと
混合し、０℃で３０分間インキニーベートし、ＤＮＡと
４２℃で２分間インキュベーションして形質転換する［
コンピーテントＥ、Ｃｏｊｔ　ｉ　：Ｅ、ＣＯｊ！　ｉ
をＬＢメジウム（トリプトン１０９／１．ＦｎＥ１エキ
ス５ｇ／ｌ、ＮａＣｊ！５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７゜５）中０
Ｄ６ｏｏｏｌｌｌ＝０．３まで生育させ、遠心分離する
。
この細菌を０．５容の氷冷５０ａ＋ＨＣａＣｊ！２溶液
中に再懸濁し、３０分間インキニーベートする。
再び遠心分離したのち、細菌を最初の容量の１／１５の
５０ｉＨＣａＣｌ２に再懸濁する］、、細菌懸濁液をＬ
ＢＢアガールＬＢメジウム＋アガール１５ｇ／ｊり上、
アンピシリン５０μ！Ｊ／ａｉ！とともに平板培養する
。１６時間３７℃でインキュベートしたのち、生成した
１２個のコロニーを選択し、これらの中から、顕微鏡ス
ケールでプラスミドを単離した（Ｂ１「口ｂｏｉｍ、　
Ｈ，Ｃ，＆口ｏｌｙ、　Ｊ、。
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．１５１３．１９
７９）　、構築の正しさは、Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ
、Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＰｖｕＩ［およびＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩによる制限肝素二重消化、ついでゲル電気泳動によ
り、期待したフラグメントが生成することにより確認し
た。１個のプラスミドを選択し、ｐａｒｐＡＴＥＲ３３
と命名した。１）ａｒｐＡＴＥＲ３３で形質転換された
Ｅ、ＣＯｊ！　ｉは表現型Ａｐｒ（アンピシリン抵抗性
）、ＴＣ（テトラサイクリン抵抗性）を示す。
例２ ｐＲＨＷｌ　４の製造 １０ｕｇのｐａｒｐＡＴＥＲ３３を、反応溶液１５０μ
ｌ中、）−１ｉｎｄｌｌ［および３ａｒｙｉＨＩにより
二重消化する。生成した３個のＤＮＡフラグメントを１
％アガロース上で分離し、長さ約３７５０塩基対＜ｂＯ
）の最大フラグメントを単離する〈フラグメントａ）。
このフラグメントはトリプトファンプロモーター／オペ
レーター（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　
、複製オリジンおよびＡｐ　３！伝子をもっている。１
０μ９のｐＲｌ−ＩＷｌ　２も１５０μｌの反応溶液中
、３ａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ［［で二重消化する。生
成した２個のフラグメントをゲル電気泳動で分離し、Ｉ
ＦＮ−ω１　（ＧＪｙ）遺伝子を含有する、長さ約８０
０　ｂｐの小フラグメントを単離する（フラグメントｂ
）。フラグメント（ａ）４０ｎ９を、反応溶液１０μｌ
中、約５Ｏμ９のフラグメント（ｂ）と、５単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼによりリゲートさせる。コンビ−テント
Ｅ、ｃｏｉｉ　　ＨＢ１０１懸濁液２００μｍをリガー
ゼ反応溶液と混合し、細菌を４２℃における熱ショック
で形質転換し、ＬＢアガール上ファンピシリン５０μ９
／ｒｒｄｌともに平板培養する。
３７℃で１６時間インキニーベートしたのち、得られた
６個のコロニーを選択し、細菌から顕微鏡スケールでプ
ラスミドＤＮＡを単離した。ＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼ、ＥＣ０ＲＩ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＮＣ０Ｉおよび
ＰｓｔＩで消化し、ついでフラグメントをゲル電気泳動
で解析したところ、１個のプラスミドが所望の構造を有
することが明らかになった。このプラスミドをｐＲｌ−
Ｉ　Ｗ１４と命名した。ｐＲＨＷｌ４で形質転換された
Ｅ、ＣＯｊ！　＋は、表現型Ａｐ　およびＴＣＳを示す
。
例３ プラスミドがコードする蛋白質の検知 プラスミドがコードする蛋白質は、マキシ細胞システム
を用いて検知することができる（Ｓａｎｃａｒ、　Ａ、
、　Ｈａｃｋ、　Ａ、　Ｈ，およびＲｕｐｐ、　Ｗ、　
Ｄ、。
Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３７．６９２〜６９３
．１９７９）。この目的では、Ｅ、ｃｏｊ！　１ｃｓＲ
６０３［Ｆ−、ｔｈｒ−１，１ｅｕＢ６．ｏｒｏＡ２゜
ｐｈｒ−１，ｒｅｃＡｌ、ａｒｑＥ３．ｔｈｉ　−１、
ｕｖｒＡ６．ａｒａ−１４，ＪａｃＹｌ。
ＱａｆＫ２．ＸＶＩ−５，ｍｔｌ−１，Ｃ］ＶｒＡ９８
　（ｎａＪＡ９８）、ｒｐｓＬ３１．ｔｓｘ−３３、ｊ
！ａｍｂｄａ’″、５ｕｐＥ４４］をプラスミドｐＲＨ
Ｗ１２およびＤＲＨＷＩ　４で形質転換し、発現メジウ
ム［１（１／Ｊ！ （ＮＨ４）２Ｓ０４．３．５９／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝　７．３．０．５９／ＩＮａＣ！
、２１ｇ／ｊ！カゼイン加水分解物（Ｎ分解、ビタミン
を含まない）、１１ｇ／Ｊ！グルコース、１ａ＋ＨＭＱ
ＳＯ，０，１１１ＨＣａＣｊ！２、１ｑ／１チアミン塩
酸塩、２Ｏｒ１１ｇ／Ｉ　　Ｌ−システィン、１００η
／ＩＩアンピシリン】中３７℃で、濃度ＯＤ６゜ｏｎ＋
ｍ””、６まで生育させる。培養液１０ｄを開放ペトリ
皿中、紫外線殺菌ランプ（１５Ｗ）で５０ｃｊＩの距離
から５秒間照射し、さらに１時間培養する。依然として
増殖可能な細菌を殺滅するために、培養液にＤ−シクロ
セリン１００μ９を加える。１６時間３７℃でインキュ
ベーション侵、細菌を遠心分離し、ｕｅｒｓｈｅｙ塩溶
液（５，４９／ｊ！　　ＮａＣ１，３，０ｇ／ｌＫＣｌ
、１．１　ｇ／Ｉ　　ＮＨ４Ｃ，１，１５ｊ１９／ｊＩ
ＣａＣｊ！２　ｘ２Ｈ２０，０，２９／ＩＭｇＣｊ！２
×６Ｈ２０１０，２η／１ＦｅＣｊ！３ｘ６Ｈ，Ｃ１８
７ｔｔｒｙ／ＩｔＫＨＰＯ，１２，１９／Ｉ　　Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ＝７．４）５−で２回洗浄し、Ｈｅｒｓｈｅｙ
メジウム＜　ｎｅｒｓｈｅｙ塩１００ｍにつき、２０％
グルコース２．０ｄ、２％スレオニン０．５ｄ、１％ロ
イシン１．Ｏｔｅ、２％プロリン１．０ｍ、２％アルギ
ニン、０．１％チアミン塩酸塩０．１ｄ！含有）５−中
、２０μｇ／−のインドールアクリル酸（ＩＡＡ）とと
もにインキュベートする。３５Ｓ−メチオニン５μＣｉ
／ｄを加えて３７℃でさらに１時間インキニーベートす
ると、新たに合成された蛋白質は放射能で標識される。
細菌を遠心分離し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
サンプル緩衝液（６，６ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ＝６
．８．２ｍＨＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、３％グリセロール
、０．０２％ブロムフェノールブルーおよび０．６６％
２−メルカプトエタノール）２００μｌ中１００℃で分
解する。ついでサンプルを１５％ポリアクリルアミドゲ
ル中で分離する（分離ゲル：１５％アクリルアミド、０
．４％ごサリチルアミド、３７５ｍＨＴｒ　ｉ　ｓ　　
ＤＨ＝８．８．２ｍＨＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ　：捕
集ゲル＝６％アクリルアミド、０．１６％ビサリチルア
ミド、３７５ｍＨＴｒ　ｉ　Ｓ　　１）Ｈ＝６．８．２
ｍＨＥＤＴＡ１０．１％ＳＯＳ、電穫緩衝液：３．０９
／Ｉ　　Ｔｒｉｓ、１４．２９／１グリシン、０．３３
５ｇ／Ｉ　ＥＤＴＡ、０．！ＩＭ／Ｊ！ＳＤＳ　：電気
泳動時間ニ一定の２ＱｍＡで１６時間）。ゲルを２０％
メタノール、７．５％酢酸中で１時間固定し、５％メタ
ノール、１％グリセロール中で３０分間インキニーベー
トし、ゲル乾燥国中で乾燥する。ゲルを、増感フィール
ド（にｏｄａｋ　）を用い一８０℃でにｏｄａｋ　Ｘ　
Ｏｎ＋ａｔ　Ｓ　　Ｘ線フィルムに曝露させる。いずれ
の場合も、アンピシリン抵抗性遺伝子生成物（β−ラク
タマーゼ）は同等に強く標識される。しかしながら、ｐ
ＲＨＷｌ　４を用いた場合は、ＩＦＮ−ω１はｐＲＨＷ
ｌ２を用いた場合より２倍強く標識される（第３図参照
）。
例４ 細菌からのＩＦＮ−ω１（Ｇ乏ｙ）の１出ＤＲＨＷ１２
またはｐＲＨＷｌ　４で形質転換されたＥ、ｃｏｊ！　
１ＨＢ１０１を発現メジウム中で２０μｇ／＃＋１！の
ＩＡＡとともに０Ｄ６ｏｏｏｌ＝２０ト まで生育させる。Ｈ２ＳＯ４をｐｔｌが２になるまで加
えて細菌を殺滅し、２０℃で６０分間インキュベートす
る。細菌を遠心分離して除き、培養物は使用時まで一２
０℃に凍結する。細菌は１０容の１％酢酸に再懸濁する
、溶液のｐｔｌを２ＮＮａＯ）−１を加えて１０に調整
し、懸濁液を０℃で２時間攪拌する。ついで２Ｎ　　Ｈ
Ｃｊ！で再びｐＨ７，５に戻し、細胞層を遠心分離して
除去する［Ｊ２−２１遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　）
　、Ｊ　Ａ　１０ローター、４℃、１０．ＯＯＯｒｐｍ
　、３０分〕。
上澄液（粗抽出液）中のインターフェロン活性は、脳心
筋症（ＥＭＣ）ウィルスで感染したヒトＡ３４９１１１
胞（ヒト肺癌細胞系）上、［ＦＮ−Ｃ２（Ａ　ｒ　ｏ　
）を標準とし て用い、細胞変性効果（ＣＰＥ）減少試験によって測定
する。ｐＲＨＷＩ　２で形質転換したＥ。
Ｇｏｌ＋の培養物からは１００．０００単位／９（３回
の別個の培養の平均）が得られたがクローンｐＲＨＷ１
４からは２００．０００単位／ｇ培養物（１５回の培養
）を生じる。
例５ １０μ３のｏａｒＤＡＴＥＲ３３およびｐＲＨＷｌ　４
をそれぞれ、溶液１００μｌ中、Ｂｇｊ！Ｉおよび５ｐ
ｈＩで消化する。得られたフラグメントを０．８％アガ
ロースゲル上で分離し、ＤＮＡを溶出し、沈殿により精
製する。フラグメントをＴＥ２０μｌに溶解する。ＩＦ
Ｎ−α２／ω１　（ＢＱｊ！ＩＩ）に対する発現プラス
ミドは、Ｄａ　ｒ　ｐＡＴＥＲ３３の大フラグメント１
μｌとｐＲＨＷｌ　４の小フラグメント５μｌを、計２
０μｌ中、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いリガーゼ
反応を行うことにより製造する。１ｃｏ１ｉ　　ＨＢｌ
ｏｌの形質転換後、生成したアンピシリン抵抗性クロー
ンの一部のプラスミドを顕微鏡スケールで単離し、構築
の正しさをＢａｌ　Ｉｆ／Ｓｐｈ　Ｉを用いた二重制限
酵素消化でチェックする。このようにして選ばれた１つ
のプラスミドをｐＲＨ７２と命名した。このプラスミド
で形質転換されたＥ、ＣＯｊ！　ｉは表現型ＡＤ’。
ＴＣＳを有する。
λｌ プラスミドｐＲＨ７８ｒおよびｐＲＨ７８ｆ（７）構築 ｐＲＨＷｌ４の大フラグメント１μｌを、ＩＦＮ−（２
２（Ａｒｌ）のＣ末端をコードするｐａｒｐＡＴＥＲ３
３からのＢｇｌＩＩ（２）−８ｐｈＩフラグメント５μ
ｌと、反応溶液２０μｍ中、５単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いてリゲートする。得られたプラスミドで例５に
記載したと同様にしてＥ、ＣＯｊ！　１ＨＢ１０１を形
質転換し、所望の構造を有するプラスミドを選択する。
ハイブリッドインターフェロンω１／α２（ＢｇｌＩＩ
）の遺伝子を完成するためには、ＤａｒｐＡＴＥＲ３３
をＢＱｊ！Ｉｌで切断したとき除去されたフラグメント
をＩ）ＲＨ７７中に導入しなければならない。それには
１０μ９のｐＲＨ７７を溶液５０μｍ中ＢｑｆｌＩで切
断し、この溶液を２ＸＣＩＰ緩衝液（ＣＩＰ：ウシ小腸
ホスファターゼ、２ＸＣ（Ｐ！ｌ衝液：１００＋ｎＨＴ
ｒｉｓｐＨ−９，０，２ｅＨＭｇＣＪ！　　、０．２ｍ
ＨＺｎＣ１２）で２倍に希釈し、１単位のＣＩＰ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎａｅｒ　　Ｈａｎｈｅｉｍ　）を加えて５′
末端ホスフエートを除去する（３７℃、６０分）。ｐＲ
Ｈ７７の線状化型をアガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの
溶出ついで沈殿により精製する。ＤＮＡをＴＥ緩衝液２
０μｌに取り、その１μｌをｐａｒｐＡＴＥＲ３３をＢ
Ｑｊ！ＩＩ／５ＤｈＩｒ消化したときに得られた２　６
３　ｂｐフラグメント（Ｂｏｌｌｌ　（１）−（ＢａＩ
Ｉ［（２）フラグメント）５μｌと、反応溶液針１０μ
ｌ中、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてリゲートす
る。Ｅ。
ｃｏｊ！ｉ　　ＨＢｌｏｌを形質転換する。生成した６
個のコロニーからのＤＮＡを解析した。２６３ｂｐフラ
グメントの挿入は同じ末端をもっているために２つの方
向に起こるので、プラスミドは制限エンドヌクレアーゼ
ＡＪ！ｕｌおよびＩ−１ａ　ｅ　ｍを用いて正しい構造
かどうか調べた。ＢＱｊ！ＩＩフラグメントが発現のた
めに正しい位置に挿入されたプラスミドをｐＲＨＷ７８
ｒと命名し、発現のために正しくない方向に挿入されて
いるプラスミドを１）ＲＨ７８ｆと命名した。１）ＲＨ
７８ｒまたはＤＲＨ７８ｆｒ形質転換されたＥ、ｃｏｌ
ｒは表「 現型Ａｐ　、Ｔｃ’を示す。
例フ インターフェロン（抗ウィルス）活性を測定す各種プラ
スミドで形質転換されたＥ、　Ｃ０ｊｊ　ｉを３５Ｉｄ
の発現メジウム中、２０μ９／μｌのＩＡＡとともに３
７℃で０Ｄ６００　ｎｍ””、６に達するまで生育され
る。細菌を遠心分離する。細菌ベレットを５０ｍＨＴｒ
　ｉ　ｓ　　Ｉ）ｌＩ＝７．６／３０ｍＨＭ　にＪ　Ｃ
１２溶液３．５−中に取り、超音波破壊装置（Ｍ　Ｓ　
Ｅ　、　５ｏｎｉｐｒｅｐ１５０　）を用い、水冷下、
最大力の衝撃を与える。懸濁液を１０分間遠心分離しく
Ｊ２−２１遠心分子ｆｌ磯、１０．００Ｏｒｐｍ　、　
４℃、ＪＡ２０ローター）、上澄液を無菌条件下に濾過
する。この溶液の抗ウィルス活性をＣＰＥ低下試験（Ａ
５４９１［１胞、ＥＭＣウィルス）で測定する。ｐＲ）
−１７２［ＩＦＮ−α２／ω１（ＢｏｉＩＩ）］で形質
転換されたＥ、Ｃ０Ｊｉは抗ウィルス活性を示さず、ま
た成熟ＩＦＮ−ω１のセリン以下の最初の６４個のアミ
ノ酸をコードするｐＲＨ７８ｆで形質転換されたＥ、Ｃ
Ｏｊ！ｉも抗ウィルス活性を示さない。これに対し、ク
ロ−ンＤＲＨ７８ｒ内（７）ＩＦ、Ｎ−ω１／ａ２（ｔ
ｌＪＩＩ）コード配列は、インターフェロン［ＩＦＮ−
Ｃ２（ＡｒＱ）を標準として比較］約３Ｘ１０６単位／
培養液１１、細菌濃度１０Ｄ６００ｎｍ”抗ウィルス活
性を示す。このＡ３４９細胞に対する抗ウイルス活性比
はＩ’ＦＮ−Ｃ２（Ａｒｇ）に比べて約４倍である。
次表には、ＩＦＮ−Ｃ２（Ａｒｌ）と比較して、ハイブ
リッドインターフェロン−ω１／α２（［３０ＪＩＩ）
のアミノ酸の変化を掲げる。
位置　ＩＦＮ−Ｃ２（Ａｒｇ）　Ｉ　ＦＮ−ω１／α２
　　遷移電荷の変化（位置） １）１陽電荷の消失：（１４） ２）４陽電荷のＷＩ得：　（２０，３８，４５，５３）
３）２陰電荷の消失：　（４３，５３）ハイブリッド体
は、ｒ　ＦＮ−Ｃ２（Ａｒｇ＞よりも陽電荷を５個多く
もっている。
例９ ＩＦＮ−ω１／α２　　Ｂ　　ＩＩＩ）の−２０℃に凍
結したクローン）−１８１０１／Ｃ）ＲＨ７８ｒの酸処
理Ｅ、ｃｏ１　ｉ　１４５９を水冷しながら１％酢酸１
４５０ｄ中で、均一に分布するまで（約３０分））！痒
し、ついで旧ｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ　　Ｔ　４５　／　
′Ｂ（Ｊａｎｋｅ　ａｎｄ　Ｋｕｎｋｅｌ）を用い、１
０、ＯＯＯｒｐｍで２×１分間ホモジナイズする。
次に、Ｐｏｌｙｍｉｎ　ｐ　（Ｓｅｒｖａ　、カタログ
番号３３１４１）を１度０．２５％マチ加え、５ＮＮａ
ＯＨを用いてｐＨを１０．０に調整する。水冷下に２時
間攪拌したのち、ｐＨを５Ｎ　　ＨＣｊ！で７．５に調
整し、粗抽出液を遠心分離によって澄明化する（Ｃｈｒ
ｉｓｔ　Ｃｒｙｏｆｕｇｅ　６−６　Ｓ　１３　、　Ｏ
ＯＯｒ＋）１，１時間、約４℃） インターフェロンを沈殿させるために、粗抽出を４３０
’Ｊ／１の硫酸アンモニウムと混合し、４〜８℃で１６
時間、沈殿が完結するまで放置する。
次に沈殿を遠心分離によって回収する＜　Ｂｅｃｋｍａ
ｎ遠心分ｍ機Ｊ２−２１、ローターＪＡ１０．１０゜Ｑ
ＱＱｒＨ，６０分、４〜８℃）。硫酸アンモニウムベレ
ットを０．０１Ｍ　　ＮａＣ１１４５−に取り、懸濁液
のｌ）Ｈを５　Ｎ　　Ｎ　ａ　Ｏｌ−１で７．５に調整
する。３時間攪拌したのち（氷冷下）、溶液を澄明にな
るまで遠心分離しく　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ　２−２１、
ローターＪＡ１０．１０．ＯＯＯｒｐｍ　、４℃、６０
分）　、Ｎｅｐｈｒｏｓｓ−Ａｌｌｅｇｒｏ透析カート
リッジ（Ｏｒｇａｎｏｎ社）を用い、０．ＯＩＭ　　Ｎ
ａＣ１に対して、インターフェロン溶液の浸透圧が３７
０１０３ｍｏＩ／　ｆになるまで透析する。
タンデムク口マトグラフイー：りロマトグラフイー精製
用には、ＤＥ−５２セルロース（１４ｈａｔｍａｎ　）
　７５　’ｊのカラムを０．０２５ＭＴｒ　ｉ　ｓ／Ｈ
Ｃ１＋０．２Ｍ　　ＮａＣｊ！、ＩＩＩ、５で平衡化し
、モノクロナール抗体ＥＢ［−１（ＥＰ−Ａ−０，１１
９，４７６参照）をセファロース４Ｂ　（ＢｒＣＮ活性
化セファロース４Ｂ、Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａを用いて調
製）とカップリングさせて含有するアフィニティーカラ
ムの前に挿入する。
アフィニティーカラムはモノクロナール抗体ＥＢＩ−１
（４８０■）を含有し、上述のように同じ＜Ｔｒ　：　
Ｓ／トＩＣｊ！＋ＮａＣｊ！、ｐＨ７，５で平衡化する
。インターフェロン溶液を両力ラムに通し、０．０２５
Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！＋０．２Ｍ　　ＮａＣ１で、
溶出液中の吸光度測定値０Ｄ２８ｏｎＩｎが０．１以下
になるまで洗浄する。次に、予備カラム（ＤＥ−５２セ
ルロース）をはずし、ＥＢ［−１カラムを溶出液が蛋白
質を含まなくなるまで（溶出液の０Ｄ２Ｂ□　ｎｍＯ，
０１ＩＸ下）洗浄する。ついで吸着されたインターフェ
ロンを２５％エチレングリコール中０．１Ｍクエン酸を
用いて溶出する。蛋白質のピークを集める。抗体カラム
からの酸溶出液のｐＨを２Ｎアンモニアを用いて４．５
に調整し、生成した沈殿を遠心分離して除く。
最終精製工程は、担体Ｍ　ＯＮ　Ｏ−Ｓ　（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）上イオン交換クロマトグラフィーである。床
容１ｄ（ＨＲ５１５）のカラムをＦＰＬＣ装置（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　）に接続し、０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ４，２で平衡化する。ＩＦＮ溶液を適用し、吸
着されたインターフェロンをｐｔｌ勾配（緩衝液Ａ：Ｏ
，ＩＭクエン酸ナトリウムＤＨ４，２および緩衝液Ｂ：
０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８、Ｏ）によって溶出す
る。インターフェロン−ω１はｐＨ７，０で溶出し、こ
のＩＦＮピークを集める（第６図参照）。
精製の評価 精製ハイブリッドインターフェロン−ω１／α２（ＢＱ
ｊ！Ｉ＞は均一である（第７図−ゲル゛透過ＨＰＬＣ参
照）。比活性約８００×１０６単位／蛋白質りは、ＩＦ
Ｎ−Ｃ２（ＡｒＱ）（約３００×１０６単位／蛋白質Ｒ
ｇ）よりも高い。
例１０ １−１ｕ　Ｉ　ＦＮ−ω１に・するモノクロナール１の
製造 ａ）免疫処置 約８週齢の雌性ＢａＪｂ／ｃマウス２匹を高純度のＩＦ
Ｎ−ω１／α２　（ＢＱｊ！ＩＩ）　　（純度〉９５％
、０．１％リン酸ナトリウム／クエン酸ナトリウムｐ１
４７に溶解）で次のように免疫処置する。
第１回の免疫処置：ＩＦＮ−ω１／α２（ＢｑｆＩＩ）
１００μ９、完全フロインドアジュバントとの乳化液、
腹腔内注射 第２回の免疫処置：ＩＦＮ−ω１／α２（Ｂｑｊ！Ｉ［
）１００μ９、不完全フロインドアジュバントとの乳化
液、第１回の免疫処置１カ月後に腹腔内性）１゜ 第２回の免疫処置から１０日後に血液サンプルを採取す
る。血清が、ＨｕｌＦＮ−ω１、Ｈｕ−ＩＦＮ−ａ２　
（Ａｒｃ）およびＩＦＮ−ω１／ａ２（ＢＱｊ！ＩＩ）
の抗ウィルス活性を中和する能力を次のようにして試験
する。すなわち、ｌｌ１ｇ１培養メジウム中血清サンプ
ル希釈液１００μｌをＩＦＮ（１００抗ウイルス単位／
ｄ）の細胞培養メジウム中溶液１００μｌと混合し、３
７℃で９０分間インキュベートする。次に、丈ンブルの
抗ウィルス活性を生物学的試ｗＡ（Ａ５４９肺Ｗ１ｍ胞
、脳心筋炎ウィルス）で測定する。
第２回目の免疫′処置４週後、マウス１にはさらにＩＦ
Ｎ−ω１／α２　（ＢＣ１ｊ！ＩＩ）　１００μ９を静
脈内注射する。６日後に牌臓を取り出し、ハイブリドー
マの製造に用いる。第２回目の免疫処置３週後にマウス
２を再び免疫処置する。すなわち、ＩＦＮ−ω１／α２
　（ＢｑＩＩＩ）１００μ９を腹腔内投与し、ω１／α
２　（ＢｑｉｌＩ）１００μびを皮下投与する。２週後
にさらに血清サンプルを採取する。これは上述の試験に
おいて希釈度１：１００でＨｕｌＦＮ−ω１に対して部
分中和効果を示す。第３回目′の免疫処置４週後に、Ｉ
　ＦＮ−ω１／α２　（Ｂｃｌ！ＩＩ）１００μ９を静
脈内注射し、４日後に牌臓を取り出し、ハイブリドーマ
の調製に使用する。
ｂ）ハイブリドーマの［１およびスクリーニングにｊｈ
ｌｅｒ　＆　Ｈｉｌｓｔｅｉｎ　　（Ｎａｔｕｒｅ　　
２５６．　４９５　。
１９７５）によって初めて開発された方法により、非ス
クリーニング細胞系Ｐ３Ｘ６３ＡＱ８．６５３　（Ｋｅ
ａｒｎｅｙほか：Ｊ、　１ｍ１ｕｎｏ１．　１２３．１
５４８．１９７９）を用いてハイブリドーマを調製する
。融合には、５０％ポリエチレングリコール４０００と
５％ジメチルスルホキシドを使用する。
ＨＡＴメジウム中のハイブリッド細胞の選択は公知の方
法により実施する（　Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ
−ｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍ
ａｉｎｔｅｎａｎｃｅ、　Ｌｏｖｂｏｒｇ。
Ｕ、　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ　　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ。
１　９　８　２　　；　　Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　八
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　　ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａｓ　　
：＾　Ｈｅｗ　　Ｄｉａ＋ｅｎｓｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　八ｎａｌｙｓｉｓ。
にｅｎｎｅｔ、　Ｒ，Ｈ，、ＨＣＫｅａｒｎ、　Ｔ、　
Ｊ、　　＆　ＢＯＣｈｔＯｌ、に。
Ｂ、［、ＰＩｅｎｕａ＋　Ｐｒｅｓｓ刊、　Ｎｅｗ　’
１０ｒｋ、　　Ｌｏｎｄｏｎ、　　１９８０）。
計７３０ハイブリドーマ培養体が２回の融合から得られ
た。スクリーニングは次のように実施した。
少なくとも１０〜２０％の融合性ハイブリドーマ培養体
の培養上澄液を等容のＨｕｆＦＮ−ω１（２０抗ウィル
ス単位／ｄ）の溶液と混合し、３７℃で９０分間インキ
ュベートし、ついでその抗ウィルス活性を試験した。す
べての培養液について少なくとも２回、１″ｉｊ４間の
間隔を置いて試験した。７３０のハイブリドーマ培養体
中わずか１個が全試験において一定の抗ウィルス活性の
低下を示した。この培養体（以下ＯＭＧ−２と称す）を
限定希釈によりサブクローニングし、サブクローンにつ
いて上述の試験法を用いて再び活性を試験した。数個の
溶性サブクローンをブリスタンで前処置したマウスに接
種した。このサブクローンのひとつは、全マウスに抗体
含有腹水の生成を生じた。５０％飽和硫酸アンモニウム
溶液で沈殿させて、得られた抗体を部分精製した。得ら
れたプレバレージョンは純度的７５％の抗体を含有して
いたくゲル透過高圧液体りＯマドグラフィーで測定）。
腹水１ｄから抗体的１０■を得ることができる。陰イオ
ン交換クロマトグラフィーにより、純度９５％以上まで
さらに精製される。
Ｃ）抗体ＯＭＧ−２の特性 非還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動において、抗体ＯＭＧ−２は分子量
約１５０，０００を示す。ゲル透過高圧液体クロマトグ
ラフィーにおいて、この抗体はＩａＧマーカー蛋白質と
同一の保持能を有する。したがって、この抗体は多分Ｉ
ｇＧ型であると思われる。
中和試験（例１０ｂ参照）において、硫酸アンモニウム
沈殿により部分精製した抗体は、以下の結果を示した。
抗体濃度　　　　ＩＦＮプレバレージョン／ｄ　　ω１
　　　α２　　　ω１／α２５０００　　　　　＋／　
−＋／　− １０００＋ １００　　　　　−　　　　−　　　　　　＋１０　　
　　　　　　　　　　　　　　＋　７−したがって、こ
の抗体はマウスの免疫処置に用いたハイブリッドＩＦＮ
−ω１／α２（ＢｑＪＩＩ）に対し、強力な中和作用を
有するが、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−７２２（ＡｒＱ）およびＨ
ｕＩＦＮ−ωｌに対するその作用は約５００倍弱い。Ｈ
ｕ　Ｉ　ＦＮ−ω１に対する親和性は比較的に明らかに
低いにもかかわず、抗体ＯＭＧ−２はこのインターフェ
ロンの免疫アフィニティークロマトグラフィーに効果的
に使用できる（例１１参照）。
例１１ １ＦＮ−ω１の精製 ａ））ｄｌ出およびＣＰＧクロマトグラフィーニー２０
℃で低温凍結したクローンｐＲトＩＷ１４の酸沈段Ｅ、
ｃｏ１ｉ　７９４９を、水冷下に、１％酢酸７７００ｄ
！中で、完全に分配されるまで（約３０分）攪拌し、２
Ｎ　　ＮａＯＨを用いてｐｌ＋を１０に調整する。氷冷
しながら２時間攪拌したのら、懸濁液のｐＨを７．５に
調整しく２Ｎ　　ＨＣＪり、澄明になるまで遠心分離す
る（１時間、１０．０００ｒｌ）ｌｉｔ、４℃、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ遠心分離１１Ｊ２−２１、ＪＡ−１００−ター
）。澄明な上澄液を５０ｍ／時の速度でＣＰＧカラム（
制御多孔ガラス、ＣＰＧｌｏ−３５０，１２０〜２００
メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ　−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ　
Ｉｎｃ、、ｌｌ５Ａ　）　５００に適用し、ついでカラ
ムを０．０２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１＋１Ｍ　　Ｎａ
ＣＪ　（ｐＨ７，５）で完全に洗浄する。カラムに吸着
されたインターフェロンを次に５０％エチレングリコー
ル中０．０２５ＭＴｒ　ｉ　ｓ／ＨＣｊ！＋１Ｍ　　Ｋ
ＳＣＮ　（ｐＨ７，５）で溶出する（５０ｄ／時）。Ｉ
ＦＮプールを次に、０．０２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１
＋０．１ＭＨＣｌに対して透析し、この間、外液に１０
％ポリエチレングリコール４０．０００を加えて同時に
ＩＦＮブールを濃縮する。透析濃縮液を遠心分離して澄
明化する（１時間、４℃、１５，０００ｒｐｍ　１Ｂｅ
ｃｌｖａｎ遠心分１１１１１Ｊ２−２０、ＪＡ−２００
−ター）。
ｂ）ＯＭ　Ｇ　２−セファロース上アフィニティークロ
マトグラフィー 精製モノクロナール抗体ＯＭＧ−２をＢｒＣＮ−活性化
４Ｂを製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の指示に従っ
て用い、担体セファロース４Ｂにカップリングする。活
性化セファロース４８１ｇに対してモノクロナール抗体
１６１１１９を使用する。容ｆｆ１８ｄの７フイニテイ
ーカラムを上述の分離に使用する。
例１１ａによるＣＰＧカラムからの濃縮液をアフィニテ
ィーカラムに４ａｉ！／分の速度で通じ、ついで０．０
２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ／ＨＣｊ！＋０．１ＭＮａＣＪ！、
Ｉ）Ｈ７，５で、溶出液に蛋白質が含ま机なくなるまで
洗浄する（溶出液のＯＤ　　　　が洗８０　ｎｍ 浄緩衝液の値と同じになるまで）。結合したインターフ
ェロンを次に、２５％エチレングリコール中０．１Ｍク
エン酸を用い、２ｒｄ／分の速度で溶出し、蛋白質ピー
ク（ＯＤ　　　　）を集める。
８０　ｎｍ Ｃ）担体ＭＯＮＯ−８上イオン交換りＯマドグラフィー ＥＰＬＣ装置（ＰｈａｒｌｌｌａＣｉａ　）　１．：結
合サセタ担体材料ＭＯＮＯ−８の１威カラム（ＨＲ５１
５）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ製）を使用する。イ
オン交換カラムは２５％ポリエチレングリコール中０．
１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６，０で平衡化し、例１１ｂ
に従って得られるアフィニティーカラムからの溶出液を
０．５−／分の速度で通す。吸着されたインターフェロ
ンを次にＮａＣ１勾配（緩衝液８２２５％ポリエチレン
グリコール中０．１Ｍリン酸カリウム＋１Ｍ　　ＮａＣ
ＩＩ）１１６．０）を用いて溶出する。各分画（ｌａｅ
＞についてインターフェロン活性を試験する。！ｌｌｉ
液８４６％に。
おける第１のピーク（ＯＤ　　　）がインターフ８０　
ｎｍ エロンーωを含有する（第８図参照）。
ｄ）逆相ＨＰＬＣ Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｗ　Ｐ　−ＲＰ　１８カラム、４
Ｘ２５０履、粒子径５μ、孔径３００人を固定相として
使用する。移動相は、０．１％トリフルオロ酢酸中アセ
トニル勾配とする。
！１！ｔｉ液へ一水中０．１％トリフルオロ酢酸緩衝液
Ｂニアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸 勾配：２８分間に２０〜６０％Ｂ 流速：１ｒＩｔｉ／分 検出：ＯＤ２１４０ｍ 例１１Ｃに従って得られる蛋白質（ＭＯＮＯ−８による
ＩＦＮ−プール）６３０μ９を適用する。
溶出液は４８〜６５％Ｂの範囲を試験する。インターフ
ェロンω１は保持時間２４．５分、緩ｖｊＪ液８６３％
で溶出する（第９図参照）。収量は５〜１０μ９、比活
性は１０８単位／ｍ９蛋白質以上である。
ｅ）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 例１１ｄによって得られた［ＦＮ−ω１ビーク（ＲＰ−
）−ＩＰＬｃ）を５ｐｅｅｃｔｖａｃ遠心分離礪内で乾
燥し、４７０Ａ型シクエンサ−（ＡＤｐｌ　１ｅｄａｉ
ｏｓｙｓｔｅｎ＋ｓ）によって解析する。以下のアミノ
酸配列が得られる。
Ｘｘｘ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−０１ｎ−Ａｓｎ−Ｘ
ｘｘ−Ｇｌｙ−’Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−この配列は
ＣＤＮＡから誘導されるアミノ酸の順序を確認する（第
１＠目のシスティンは蛋白質の還元お゛よびアルキル化
なしでは検出できない。
第７番目のヒスチジンは明瞭には検出できない）。
【図面の簡単な説明】
第１図はＤａｒｐＡＴＥＲ３３（７）構築［［１−ある
。第２図はｐＲＨＷ１４の構築概略図である。 第３図は、マキシ細胞（Ｅ、ｃｏｊ！　１ｃｓＲ６０３
）からの３５ｓ標識蛋白質のオートラジオグラフである
。第４図はｐＲＨ７２の構築概略図である。 第５図はＤＲＨ７８ｒおよびｐＲＨ７８ｆの構築概略図
である。第６図はＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱＩＩ［＞の
ＭＯＮＯ−Ｓクロマトグラフである（ＡＵＦＳ＝吸収単
位フルスケール）。第７図はＩＦＮ−ω１／α２（ＢＱ
ｊ！ＩＩ）のゲル透過ＨＰＬＣを示すグラフである。第
８図はＩ　ＦＮ−ω１のＭＯＮＯ−Ｓクロマトグラフで
ある。第９図はＩＦＮ−ω１の連相ＨＰＬＣを示すグラ
フである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）α−インターフエロンの部分およびω−インター
    フエロンの部分からなるハイブリツドインターフエロン
    、そのＮ末端ＭｅｔまたはＮ−ホルミルＭｅｔ誘導体、
    ならびにそのハイブリツドインターフエロンのペプチド
    配列がグリコシル化部位を含有する場合はそのＮ−グリ
    コシル化誘導体（２）式 【遺伝子配列があります】（ I ） （式中、ＢｇｌｔIIはα１−、α２−およびω−インタ
    ーフエロンに共通のＢｇｌII制限部位であり、Ｒ＿１は
    α１もしくはα２インターフエロンのＢｇｌII切断部位
    の上流にあるそのＤＮＡ配列によりコードされるα１も
    しくはα２インターフエロンのペプチド配列であつてＲ
    ＿２はω−インターフエロンのＢｇｌII切断部位の下流
    にあるそのＤＮＡ配列によりコードされるω−インター
    フエロンのペプチド配列であるか、またはＲ＿１はω−
    インターフエロンのＢｇｌII切断部位の上流にあるその
    ＤＮＡ配列によりコードされるω−インターフエロンの
    ペプチド配列であつてＲ＿２はα１もしくはα２インタ
    ーフエロンのＢｇｌII切断部位の下流にあるそのＤＮＡ
    配列によりコードされるα１もしくはα２インターフエ
    ロンのペプチド配列である）を有する特許請求の範囲第
    １項に記載のＢｇｌIIハイブリツドインターフエロン、
    そのＮ末端ＭｅｔまたはＮ−ホルミルＭｅｔ誘導体、な
    らびにそのハイブリツドインターフエロンのペプチド配
    列がグリコシル化部位を含有する場合はそのＮ−グリコ
    シル化誘導体 （３）α−インターフエロンとしてＩＦＮ−α２（Ａｒ
    ｇ）を用い、ω−インターフエロンとしてω１（Ｇｌｕ
    ）またはω１（Ｇｌｙ）インターフエロンを用いること
    を特徴とする特許請求の範囲第２項に記載のＢｇｌIIハ
    イブリツドインターフエロン、そのＮ末端Ｍｅｔまたは
    Ｎ−ホルミルＭｅｔ誘導体、ならびにそのＮ−グリコシ
    ル化誘導体 （４）式 【アミノ酸配列があります】 （式中、ＸはＧｌｙまたはＧｌｕである）で示される特
    許請求の範囲第３項に記載のＩＦＮ−α２／ω１（Ｂｇ
    ｌII）ハイブリツドインターフエロンそのＮ末端Ｍｅｔ
    またはＮ−ホルミルＭｅｔ誘導体、ならびにそのＮ−グ
    リコシル化誘導体（５）式 【アミノ酸配列があります】 で示される特許請求の範囲第３項に記載のＩＦＮ−ω１
    ／α２（ＢｇｌII）、およびそのＮ末端ＭｅｔまたはＮ
    −ホルミルＭｅｔ誘導体 （６）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
    ５項のいずれかに記載のハイブリツドインターフエロン
    を含有する医薬組成物 （７）特許請求の範囲第３項または第５項のいずれかに
    記載のハイブリツドインターフエロンを含有する医薬組
    成物 （８）ウィルス疾患治療用の医薬組成物を製造するため
    の特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第５項
    のいずれかに記載のハイブリツドインターフエロンの使
    用 （９）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
    ４項のいずれかに記載のハイブリツドインターフエロン
    を慣用の担体中に配合することを特徴とするウィルス疾
    患の治療に適した医薬組成物の製造方法。 （１０）試験動物を免疫処置し、特許請求の範囲第１項
    から第５項までのいずれかに記載のハイブリツドインタ
    ーフエロンに対する、またα−およびω−インターフエ
    ロンに対するモノクロナール抗体を製造するための、特
    許請求の範囲第１項から第５項までのいずれかに記載の
    ハイブリツドインターフエロンの使用 （１１）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
    かに記載の新規ハイブリツドインターフエロンの暗号配
    列を含有する組換えＤＮＡ分子 （１２）式 【遺伝子配列があります】 （式中、ＹはヌクレオチドＧまたはＡである）で示され
    る特許請求の範囲第４項に記載のＩＦＮ−α２／ω１（
    ＢｇｌII）ハイブリツドインターフエロンをコードする
    ＤＮＡ分子およびその退行変異体 （１３）式 【遺伝子配列があります】 で示される特許請求の範囲第３項または第５項のいずれ
    かに記載のＩＦＮ−ω１／α２（ＢｇｌII）ハイブリツ
    ドインターフエロンをコードするＤＮＡ分子およびその
    退行変異体 （１４）特許請求の範囲第１１項、第１２項または第１
    ３項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を含有するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれかに記載のハイブリツドインターフエロンをコー
    ドするベクター （１５）特許請求の範囲第１２項または第１３項のいず
    れかに記載の組換えＤＮＡ分子を含有することを特徴と
    する特許請求の範囲第１４項に記載のベクター （１６）さらに発現に必要なレプリコンおよび制御配列
    、ならびに任意にｐａｒ座を含有することを特徴とする
    特許請求の範囲第１４項および第１５項に記載の発現プ
    ラスミド （１７）発現に必要なレプリコンおよび制御配列はプラ
    スミドｐＥＲ１０３に由来し、式 【遺伝子配列があります】 で示される特許請求の範囲第１６項に記載の発現プラス
    ミドまたはその￥ｔｒｐ￥プロモーターを維持した修飾
    体 （１８）ｐａｒ座はプラスミドｐＰＭ３１に由来し、式 【遺伝子配列があります】 はヌクレオチドＧを表すかまたはヌクレオチドはないこ
    とを示す）を有する特許請求の範囲第１６項に記載の発
    現プラスミドまたはその機能性修飾体 （１９）プラスミドＰＡＴ１５３において ＢａｍＨ I −Ｐｓｔ I フラグメントがプラスミドｐａ
    ｒｐＥＲ３３のＢａｍＨ I −Ｐｓｔ I フラグメントで
    置換され、以下の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１４項から第１８項までの
    いずれかに記載の発現プラスミドｐＲＨ７２ （２０）ＢｇｌIIで線状化したプラスミドｐＲＨ７７に
    プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３の塩基長２６３ｂｐＳ
    Ｐｈ I −ＢｇｌIIフラグメントを用い、以下の制限酵
    素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１４項から第１８項までの
    いずれかに記載の発現プラスミド ｐＲＨ７８ｒ （２１）特許請求の範囲第１１項から第１３項までのい
    ずれかに記載の遺伝子情報を含有する形質転換宿主生物 （２２）原核生物または真核生物である特許請求の範囲
    第２１項に記載の宿主生物 （２３）遺伝子情報は、複製に必要なレプリコンおよび
    制御配列を含有するベクター中に含まれている特許請求
    の範囲第２１項に記載の宿主生物（２４）遺伝子情報は
    適当な宿主中で複製可能な特許請求の範囲第１４項から
    第２０項までのいずれかに記載のベクター中に含まれて
    いる特許請求の範囲第２１項に記載の宿主生物 （２５）宿主は￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥　ＨＢ１０１である特
    許請求の範囲第２４項に記載の宿主生物 （２６）特許請求の範囲第２５項に記載の宿主生物を処
    理することによつて得ることを特徴とする特許請求の範
    囲第１１項、第１２項または第１３項のいずれかに記載
    のＤＮＡ配列の製造方法 （２７）特許請求の範囲第５９項に記載のプラスミドｐ
    ａｒｐＡＴＥＲ３３をＢｇｌIIおよび Ｓｐｈ I で消化して得られる大フラグメントを、特許
    請求の範囲第４１項に記載のプラスミドＰＲＨＷ１４を
    ＢｇｌIIおよびＳｐｈ I で消化して得られる小フラグ
    メントとリゲートし、このようにして得られたプラスミ
    ドによつて複製のために￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥　ＨＢ１０１
    を形質転換することを特徴とする特許請求の範囲第１９
    項に記載の発現プラスミドｐＲＨ７２の製造方法 （２８）特許請求の範囲第６１項に記載のプラスミドｐ
    ＲＨ７７をＢＱｌIIで切断し、ついで特許請求の範囲第
    ５９項に記載のプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３を消化
    して得られる塩基長２６３ｂｐのフラグメントとリゲー
    トし、このようにして得られたプラスミドによつて複製
    のために￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥　ＨＢ１０１を形質転換する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２０項に記載の発現
    プラスミドｐＲＨ７８ｒの製造方法 （２９）細菌宿主を特許請求の範囲第１４項から第２０
    項までのいずれかに記載のプラスミドで形質転換するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第２２項から第２５項ま
    でのいずれかに記載の形質転換宿主生物の製造方法 （３０）特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
    かに記載のハイブリツドインターフエロンを製造するに
    あたり、これらのハイブリツドインターフエロンをコー
    ドする遺伝子情報で適当な細菌宿主生物を形質転換し、
    この情報を発現させ、得られたハイブリツドインターフ
    エロンを宿主生物から単離することを特徴とする方法 （３１）特許請求の範囲第１４項から第２０項までに記
    載の発現プラスミドの１種で宿主￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥　Ｈ
    Ｂ１０１を形質転換することを特徴とする特許請求の範
    囲第３０項に記載の方法（３２）式 【遺伝子配列があります】 （式中、位置１１１のＸはＧｌｕまたはＧｌｙである）
    で示される純粋なω１−インターフエロンを製造するに
    あたり、組換え法で製造したω−インターフエロンを、
    α−インターフエロンの一部とω−インターフエロンの
    一部からなる特許請求の範囲第１項から第５項までに記
    載のハイブリツドインターフエロンに対するモノクロナ
    ール抗体を含む抗体アフイニテイーカラムを用いて精製
    することを特徴とする方法 （３３）組換え法で製造したω−インターフエロンは、
    特許請求の範囲第３９項から第４１項までに記載のプラ
    スミドまたはその退行変異体で形質転換した細菌宿主を
    用いて製造することを特徴とする特許請求の範囲第３２
    項に記載の純粋なω−インターフエロンの製造方法 （３４）使用する宿主は、￥Ｅ．Ｃｏ１ｉ￥細菌、￥Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ￥または種￥Ｓｅｒ
    ｒａｔｉａ￥もしくは￥Ｐｓｅｕｄｏｍａｓ￥の細菌の
    ような腸内細菌である特許請求の範囲第３３項に記載の
    方法 （３５）細菌宿主として￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥　ＨＢ１０１
    を使用する特許請求の範囲第３３項に記載の方法（３６
    ）特許請求の範囲第５３項に記載の抗体を、担体に共有
    結合する抗体として用いる特許請求の範囲第３３項に記
    載の方法 （３７）活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを担体として使用す
    る特許請求の範囲第３２項に記載の方法 （３８）Ｍｏｎｏ−Ｓクロマトグラフィーカラムを使用
    する特許請求の範囲第３２項に記載の方法 （３９）プラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３中、Ｈｉｎｄ
    III−ＢａｍＨ I フラグメントをプラスミドｐＲＨＷ１
    １またはｐＲＨＷ１２のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨ I フラ
    グメントで置換し、次の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＩＦＮω１はＩＦＮ−ω１（Ｇｌｙ）またはＩ
    ＦＮ−ω１（Ｇｌｕ）をコードするＤＮＡ配列である〕
    で示されるω１−インターフエロンの発現プラスミド （４０）ω１−インターフエロン遺伝子は式【遺伝子配
    列があります】 （式中、ＹはヌクレオチドＡまたはＧである）で示され
    るＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第３９項に記載の
    発現プラスミドｐＲＨＷ１３またはｐＲＨＷ１４および
    その退行変異体 （４１）ＹはヌクレオチドＧである特許請求の範囲第３
    ９項または第４０項に記載の発現プラスミドｐＲＨＷ１
    ４ （４２）ｐａｒｐＡＴＥＲ３３の約３７５０ｂｐ塩基長
    のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨ I フラグメントを、ω１−イ
    ンターフエロンをコードするプラスミドのＨｉｎｄIII
    とＢａｍＨ I 消化で得られた約８００ｂｐ塩基長にリ
    ゲートすることを特徴とする特許請求の範囲第３９項、
    第４０項または第４１項に記載の発現プラスミドの製造
    方法 （４３）遺伝子としてプラスミドｐＲＨＷ１１から単離
    されたω１（Ｇｌｕ）インターフエロン遺伝子を使用す
    ることを特徴とする発現プラスミドｐＲＨＷ１３の製造
    方法 （４４）遺伝子としてプラスミドＰＲＨＷ１２から単離
    されたω１（Ｇｌｙ）インターフエロン遺伝子を使用す
    ることを特徴とする発現プラスミドｐＲＨＷ１４の製造
    方法 （４５）特許請求の範囲第３９項、第４０項、第４１項
    、第５９項または第６１項に記載の発現プラスミドで形
    質転換された細菌宿主 （４６）特許請求の範囲第３９項、第４０項、第４１項
    、第５９項または第６１項に記載の発現プラスミドで形
    質転換された￥Ｅ．Ｃｏｌｉ￥細菌（４７）特許請求の
    範囲第３９項、第４０項、第４１項、第５９項または第
    ６１項に記載の発現プラスミドで形質転換された￥Ｅ．
    ｃｏｌｉ￥　ＨＢ１０１ （４８）相当する細菌宿主を特許請求の範囲第３９項、
    第４０項、第４１項、第５９項または第６１項に記載の
    発現プラスミドで形質転換することを特徴とする特許請
    求の範囲第４５項、第４６項または第４７項に記載の細
    菌宿主の製造方法 （４９）特許請求の範囲第１項から第５項までに記載の
    ハイブリツドインターフエロンで免疫処置したマウスの
    脾臓細胞と骨髄腫細胞の細胞融合によつて得られ、これ
    らのハイブリツドインターフエロンに対する抗体を産生
    することを特徴とする￥ｉｎ　ｖｉｔｒｏ￥および￥ｉ
    ｎ　ｖｉｖｏ￥で培養可能なハイブリッド細胞系 （５０）使用する脾臓細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスから採
    取し、使用する骨髄腫細胞は系ｐ３−Ｘ−６３Ａｇ８−
    ６５３の細胞である特許請求の範囲第４９項記載のハイ
    ブリッド細胞系 （５１）免疫処置には特許請求の範囲第２項、第３項、
    第４項または第５項に記載のハイブリツドインターフエ
    ロンを使用する特許請求の範囲第４９項および第５０項
    に記載のハイブリッド細胞系（５２）免疫処置には特許
    請求の範囲第５項に記載のハイブリツドインターフエロ
    ンを使用し、構成的にＯＭＧ−２抗体を合成することを
    特徴とする特許請求の範囲第４９項、第５０項および第
    ５１項に記載のハイブリッド細胞系ＯＭＧ−２ （５３）α２およびω１型ヒトインターフエロンならび
    に特許請求の範囲第５項に記載のハイブリツドインター
    フエロンの活性を完全にまたは部分的に中和することを
    特徴とするモノクロナール抗体（５４）細胞融合によつ
    てＩｇＧ抗体を産生するハイブリッド細胞系を製造し、
    これをサブクローニングし、細胞を生育させたのち抗イ
    ンターフエロン特異性をもつＩｇＧ抗体を単離すること
    を特徴とする特許請求の範囲第５３項に記載の抗ヒトイ
    ンターフエロン−α２および−ω１ならびに抗ハイブリ
    ツドインターフエロン特異性を有する新規なＩｇＧ−抗
    体をマウスから製造する方法 （５５）特許請求の範囲第５項に記載のハイブリツドイ
    ンターフエロンに対して免疫処置したマウスからの骨髄
    腫細胞および脾細胞を細胞融合に使用する特許請求の範
    囲第５４項に記載の方法 （５６）骨髄腫細胞として細胞系Ｐ３−Ｘ−６３Ａｇ８
    −６５３を使用する特許請求の範囲第５５項に記載の方
    法 （５７）特許請求の範囲第５項に記載のハイブリツドイ
    ンターフエロンに対して免疫処置した ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞を使用する特許請求の
    範囲第５５項に記載の方法 （５８）特許請求の範囲第５３項に記載のモノクロナー
    ル抗体を活性化担体に共有結合させることを特徴とする
    抗体アフイニテイー担体の製造方法（５９）プラスミド
    ｐＡＴ１５３のＢａｍＨ I −Ｐｓｔ I フラグメントが
    プラスミドｐａｒｐＥＲ３３のＢａｍＨ I −Ｐｓｔ I
    フラグメントによつて置換され、次の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３（６０）プ
    ラスミドｐａｒｐＥＲ３３をＢａｍＨ I およびＰｓｔ
    I で消化して得られる小フラグメントを、プラスミド
    ｐＡＴ１５３をＢａｍＨ I およびＰｓｔ I で消化して
    得られる大フラグメントとリゲートすることを特徴とす
    る特許請求の範囲第５９項に記載のプラスミドｐａｒｐ
    ＡＴＥＲ３３の製造方法 （６１）プラスミドＰＲＨＷ１４中のＳｐｈ I −Ｂｇ
    ｌII大フラグメントがプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３
    のＳｐｈ I −ＢｇｌII小フラグメントで置換され、次
    の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される発現プラスミドｐＲＨ７７ （６２）特許請求の範囲第４１項に記載のプラスミドｐ
    ＲＷＨ１４をＢｇｌIIおよびＳｐｈ I で消化して得ら
    れる大フラグメントを、特許請求の範囲第５９項に記載
    のプラスミドｐａｒｐＡＴＥＲ３３をＢｇｌIIおよびＳ
    ｐｈ I で消化して得られＩＦＮ−α２（Ａｒｇ）のＣ
    末端をコードする小フラグメントにリゲートし、ついで
    得られたプラスミドで細菌宿主を形質転換することを特
    徴とする特許請求の範囲第６１項に記載の発現プラスミ
    ドｐＲＨ７７の製造方法 （６３）特許請求の範囲第１項から第５項までに記載の
    ハイブリツドインターフエロン、ＩＦＮ−α２またはＩ
    ＦＮ−ω１の精製のための特許請求の範囲第５３項に記
    載のモノクロナール抗体の使用
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