JPS60210996A - ヒトのガンマインターフエロンの遺伝子工学的製法 - Google Patents
ヒトのガンマインターフエロンの遺伝子工学的製法Info
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- JPS60210996A JPS60210996A JP60052577A JP5257785A JPS60210996A JP S60210996 A JPS60210996 A JP S60210996A JP 60052577 A JP60052577 A JP 60052577A JP 5257785 A JP5257785 A JP 5257785A JP S60210996 A JPS60210996 A JP S60210996A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトのガンマインターフェロンスナわちこのペ
プチドのためにコード化する（遺伝暗号で示す）化学的
に合成された遺伝子の製法およびこのポリペプチドを表
現するための適当なベクターの組立ておよび宿主微生物
に関する。
プチドのためにコード化する（遺伝暗号で示す）化学的
に合成された遺伝子の製法およびこのポリペプチドを表
現するための適当なベクターの組立ておよび宿主微生物
に関する。
ガンマインターフェロン（以前には免疫インターフェロ
ンまたは■型インターフェロンと呼ばれたが、本明細書
では以下ＩＦＮ−ｒと略す）は１９６５年にＦ、フィー
ルロック氏（ｗｈｅｅｌｌｏｃｋ＊５ｃｉｅｎｃｅ １
４ヱ（１９６５）、３１０を参照されたい）により発見
され、工ＦＮ−７がある棟の細胞をウィルス感染から防
御しうるということが示された。
ンまたは■型インターフェロンと呼ばれたが、本明細書
では以下ＩＦＮ−ｒと略す）は１９６５年にＦ、フィー
ルロック氏（ｗｈｅｅｌｌｏｃｋ＊５ｃｉｅｎｃｅ １
４ヱ（１９６５）、３１０を参照されたい）により発見
され、工ＦＮ−７がある棟の細胞をウィルス感染から防
御しうるということが示された。
ヒトのＩＦＮ−ｒ（基礎的情報に関してはＳｐｒｉｎｇ
ｅｒ社出版（第２版、１９８１年）によるＷ、Ｆｉ、ス
チュワード氏による■、Ｔｈｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍを参照されたい）は１４６個のアミノ酸か
らなるポリはプチド（グレー氏寺によるＮａｔｕｒθ２
９５（１９８２）、５０３を参照されたい）であって、
天然にはグリコジル化されている。このグリコプロティ
ンは約６５，０００〜７！１，０００の分子量を有しく
Ｐｅ５ｔｋａ氏等による。Ｔ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅ
ｍｓ ２５８（１９８３）、９７０６を参照されたい）
、その機能形態はテトラマーであろうと思われる。工Ｆ
Ｎ−ｒのグリコジル化はその機能化のために必須ではな
り、シたがって工ＦＮ−ｒのグリコシダーゼ処理はヒト
の線維芽細胞の細胞培養中においてそのものの抗ウィル
ス活性を減少はさせない（ケラー氏等によるＪ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｏｈｅｍ、 ２５旦（１９８３）、８０１０を
参照されたい）。
ｅｒ社出版（第２版、１９８１年）によるＷ、Ｆｉ、ス
チュワード氏による■、Ｔｈｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
Ｓｙｓｔｅｍを参照されたい）は１４６個のアミノ酸か
らなるポリはプチド（グレー氏寺によるＮａｔｕｒθ２
９５（１９８２）、５０３を参照されたい）であって、
天然にはグリコジル化されている。このグリコプロティ
ンは約６５，０００〜７！１，０００の分子量を有しく
Ｐｅ５ｔｋａ氏等による。Ｔ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅ
ｍｓ ２５８（１９８３）、９７０６を参照されたい）
、その機能形態はテトラマーであろうと思われる。工Ｆ
Ｎ−ｒのグリコジル化はその機能化のために必須ではな
り、シたがって工ＦＮ−ｒのグリコシダーゼ処理はヒト
の線維芽細胞の細胞培養中においてそのものの抗ウィル
ス活性を減少はさせない（ケラー氏等によるＪ、 Ｂｉ
ｏｌ、 Ｏｈｅｍ、 ２５旦（１９８３）、８０１０を
参照されたい）。
さらに、アルファインターフェロンおよびベータインタ
ーフェロンと比べると工ＦＮ−ｒはｐＨ２で不安定であ
り、しかも熱（６０℃）によっても不活性化される。
ーフェロンと比べると工ＦＮ−ｒはｐＨ２で不安定であ
り、しかも熱（６０℃）によっても不活性化される。
人の細胞系統の細胞培養からあるいは白血球（血液銀行
に預けられた血液）からヒトの工ＦＮ−ｒを単離するこ
とは可能だが、収量が少なくしかも生成物の純度も低い
。このために工ＦＮ−ｒに似ているボ１７７−？プチド
類の遺伝子工学的製法が既にたとえばヨーロツ・ξ特許
出願の出願公告第９５．３５０号明細書にも記載されて
おり、そこには工ＦＮ−ｒのためのコード化されている
遺伝子の化学合成、ハイブリッドプラスミド中における
この遺伝子の混入、大腸菌の形質転換および免疫学的活
性を有するポリペプチドの表現が示されている。
に預けられた血液）からヒトの工ＦＮ−ｒを単離するこ
とは可能だが、収量が少なくしかも生成物の純度も低い
。このために工ＦＮ−ｒに似ているボ１７７−？プチド
類の遺伝子工学的製法が既にたとえばヨーロツ・ξ特許
出願の出願公告第９５．３５０号明細書にも記載されて
おり、そこには工ＦＮ−ｒのためのコード化されている
遺伝子の化学合成、ハイブリッドプラスミド中における
この遺伝子の混入、大腸菌の形質転換および免疫学的活
性を有するポリペプチドの表現が示されている。
ヒトの工ＦＮ−ｒは以下のペプチド配列を有する（ Ｄ
ｓｖｏ日氏等によるＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ＋５
ｅａｒｃｈ ＩＱ（１９８２）、２４８７）： Ｏｙｓ １−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓ ｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ ” −Ａｌａ
−−Ｇｌｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅ−ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ ｎ−Ａｌａ ２ ’ −Ｇｌｙ−
Ｈｌｓ−８ｏｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｎ−（）ｌｙ−Ｔｈｒ”−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｙｓ４０−（）ｌｕ−（）ｌｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−（）ｌｎ−８ｅｒ５０−
Ｃ）ｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−８ｏｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ６０−Ｌｙｓ−Ａｅｎ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−
工１ｅ−Ｇ：Ｌｎ７０−Ｌｙｓ−８ｏｒ−Ｖａｌ−（）
ｌｕ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ−（）ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍ
ｅｔ”−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ９０−Ｌｙａ−
Ａｒｇ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｅｎ １００−Ｔｙｒ−８ｅｒ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ’ １ ’−Ｌ７Ｅｌ−Ａ１１Ｌ−工１
１ｉ１−Ｈｌｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｍｅｔ１２’−Ａｌａ−（）ｌｕ−Ｌｅｕ−８ｏ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ａｌａ −Ｌｙｅ −Ｔｈｒ
−［）１ｙ Ｉ Ｉｓ Ｏ−Ｌｙａ−Ａｒｇ−Ｌｙｅ−
Ａｒｇ−８ｅｒ−（）Ｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇｌ ”−（）ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８
ｏｒ−（）ｌｎ １ ”。
ｓｖｏ日氏等によるＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ＋５
ｅａｒｃｈ ＩＱ（１９８２）、２４８７）： Ｏｙｓ １−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓ ｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ ” −Ａｌａ
−−Ｇｌｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅ−ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔ
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Ｈｌｓ−８ｏｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａ
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Ｃ）ｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−８ｏｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ６０−Ｌｙｓ−Ａｅｎ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−
工１ｅ−Ｇ：Ｌｎ７０−Ｌｙｓ−８ｏｒ−Ｖａｌ−（）
ｌｕ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ−（）ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍ
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ｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ９０−Ｌｙａ−
Ａｒｇ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｅｎ １００−Ｔｙｒ−８ｅｒ
−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ’ １ ’−Ｌ７Ｅｌ−Ａ１１Ｌ−工１
１ｉ１−Ｈｌｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｍｅｔ１２’−Ａｌａ−（）ｌｕ−Ｌｅｕ−８ｏ
ｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ａｌａ −Ｌｙｅ −Ｔｈｒ
−［）１ｙ Ｉ Ｉｓ Ｏ−Ｌｙａ−Ａｒｇ−Ｌｙｅ−
Ａｒｇ−８ｅｒ−（）Ｉｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇｌ ”−（）ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８
ｏｒ−（）ｌｎ １ ”。
本発明はＤＮＡ配列Ｉ（後記）からなる化学合成された
遺伝子を使用するヒトの工ＦＮ−ｒの遺伝子工学的製法
に関する。
遺伝子を使用するヒトの工ＦＮ−ｒの遺伝子工学的製法
に関する。
遺伝子コード（暗号）が１退化する” （ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｅンといりこと、１−なわち単に２個のアミノ咳
だけが単一のヌクレオチド配列によりコード化されるが
、残りの１８個の遺伝子学的にコード化可能なアミノ酸
は２〜６ ＩＡＩのトリジレットに指運されうるという
ことは既知である。さらに、異種の宿主細胞は必ずしも
これより生ずるＩＩＪ能なバリエーションを同一に利用
するものでもない。
ｒａｔｅンといりこと、１−なわち単に２個のアミノ咳
だけが単一のヌクレオチド配列によりコード化されるが
、残りの１８個の遺伝子学的にコード化可能なアミノ酸
は２〜６ ＩＡＩのトリジレットに指運されうるという
ことは既知である。さらに、異種の宿主細胞は必ずしも
これより生ずるＩＩＪ能なバリエーションを同一に利用
するものでもない。
したがって遺伝子の合成には非常に多植のコドン可能性
が４仕する。今や本発明により全アミノｊ俊配列１〜１
４６のためにコード化するＤＮＡ配列■（後Ｈｅ ）お
よび配列■の合成のために使用されるＤＮＡ部分配列が
遺伝子工学的方法による工ＦＮ−ｒの合成に時に有利で
あるということが見出された。ＤＮＡ ＋配列Ｉのコー
ド化ストランドの５′末端にはたとえば制限エンドヌク
レアーゼＫｏｏ Ｒ１に相当する１突出している＠ＤＮ
Ａ配列が付着しており、他方コード化ストランドの３′
末端には、５′末端の場せとは異なっているのが有利だ
が、たとえば制限酵素Ｇａｌ ｌに相当する単一ストラ
ンドの芙出している配列が付着している。これらの２棟
の異なる認識配列はＤＮＡが所望の配置でプラスミド中
に組冷込まれていることを保誰している。また同一の突
出している配列を選択することおよび後で適当な選択を
行なうこともげ能である。
が４仕する。今や本発明により全アミノｊ俊配列１〜１
４６のためにコード化するＤＮＡ配列■（後Ｈｅ ）お
よび配列■の合成のために使用されるＤＮＡ部分配列が
遺伝子工学的方法による工ＦＮ−ｒの合成に時に有利で
あるということが見出された。ＤＮＡ ＋配列Ｉのコー
ド化ストランドの５′末端にはたとえば制限エンドヌク
レアーゼＫｏｏ Ｒ１に相当する１突出している＠ＤＮ
Ａ配列が付着しており、他方コード化ストランドの３′
末端には、５′末端の場せとは異なっているのが有利だ
が、たとえば制限酵素Ｇａｌ ｌに相当する単一ストラ
ンドの芙出している配列が付着している。これらの２棟
の異なる認識配列はＤＮＡが所望の配置でプラスミド中
に組冷込まれていることを保誰している。また同一の突
出している配列を選択することおよび後で適当な選択を
行なうこともげ能である。
アミノ酸、メチオニンのためのコドンはこれらの認識配
列とアミノ酸配列のためのコド／との間にあるコード化
ストランドの５′末端に位置している。あるいはまた、
これはたとえば細胞質から所望のポリベゾチドの分泌を
もたらしそしてこの排泄過程中に宿主細胞中に天然に生
ずるシグナル（信号）ペプチダーゼによって除去される
、宿主に本米備わっている細菌蛋白質または他の蛋白質
の前駆配列（ｐｒｅｓｓｑｕｅｎｃｅ） （シグナル配
列またはリーダー配列とも云われる）によって置き侯え
られることもできる（ｌＪＩＩｉ１文二パールマン氏お
よびハルボルソン氏によるＪ。
列とアミノ酸配列のためのコド／との間にあるコード化
ストランドの５′末端に位置している。あるいはまた、
これはたとえば細胞質から所望のポリベゾチドの分泌を
もたらしそしてこの排泄過程中に宿主細胞中に天然に生
ずるシグナル（信号）ペプチダーゼによって除去される
、宿主に本米備わっている細菌蛋白質または他の蛋白質
の前駆配列（ｐｒｅｓｓｑｕｅｎｃｅ） （シグナル配
列またはリーダー配列とも云われる）によって置き侯え
られることもできる（ｌＪＩＩｉ１文二パールマン氏お
よびハルボルソン氏によるＪ。
Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １６７ （１９８３）、 ３９
１を参照されたい）。
１を参照されたい）。
ついでグルタミンのためのトリプレット１４６コード化
に１１固の停止コドンまたは好ましくは２個の停止トリ
プレットが続く。
に１１固の停止コドンまたは好ましくは２個の停止トリ
プレットが続く。
制限酵素のＢａｍ ＨｌおよびＨｌｎａ ｍ （コード
化ストランドのコドン３１および９４におけるあるいは
非コード化ストランドのコドン６２および９５における
）のための２つの内部のユニークな制限部位は３櫨の遺
伝子断片、すなわちエドト１１工ＦＮ−１および工ＦＮ
−Ｉｌｌ （後ｄピのＤＮＡ配列■を参照されたい）を
サブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）することを可能にし
、これらはたとえばｐＢＲ３２２またはｐＵＣＢのよう
な完全に研究されたクローニングベクターに組与込まれ
ることができる。さらに制限酵素のための多数の他のユ
ニークな認識配列が構造遺伝子内に組み込まれ、これら
が一方において工ＦＮ−ｒの部分配列に取りつぎ、多方
において変化の尋人なＷ’ｄするものである。
化ストランドのコドン３１および９４におけるあるいは
非コード化ストランドのコドン６２および９５における
）のための２つの内部のユニークな制限部位は３櫨の遺
伝子断片、すなわちエドト１１工ＦＮ−１および工ＦＮ
−Ｉｌｌ （後ｄピのＤＮＡ配列■を参照されたい）を
サブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）することを可能にし
、これらはたとえばｐＢＲ３２２またはｐＵＣＢのよう
な完全に研究されたクローニングベクターに組与込まれ
ることができる。さらに制限酵素のための多数の他のユ
ニークな認識配列が構造遺伝子内に組み込まれ、これら
が一方において工ＦＮ−ｒの部分配列に取りつぎ、多方
において変化の尋人なＷ’ｄするものである。
Ａｖａ ＩＩａ） １２ ２０
Ａｌｕ Ｉｂ） ５１．９
Ｈ１ｎｆ １” １２６ １３４
Ｄｄ０１°’ １５１ １５９
Ａｈ”” １９１ １９９
Ｔａｑ Ｉ’） ２８６ ２９４
Ａｈａ ｍ” ３１９ ３２７
８９ｔ Ｉａ）３４９ ３５７
ＢＢｔＮＩｄ）３５４ ３６２
Ｐｅｔ ｌａ） ’ ３８Ｑ ３８８
ＢｂｖＩ” ３９０ ３９８
Ｓ”ｔ ｆｆａ）４２２ ４３０
ＤｄｅＩ” ４５６ ４４４
ａ）全ＤＮＡ配夕１月に関してユニークである。
ｂ）部分配列工ＦＮ−１に関してユニークである。
リ 部分配列工ＥＰＮ−１１に関してユニークである。
ｄ）部分配列工ＦＮ−１ｌｌに関してユニークである。
ＤＮＡ配列１１メチオニンのためのコドンおよび突出し
ている末端からなる遺伝子は１８〜６６のヌクレオチド
の長さをゼする３４個のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ配
列■を参照されたい）から、まず最初にそれを化学的に
合成しついでそれらを４〜６個のヌクレオチドの１付層
末端５（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎａｓ）によって＃累的に結
合させることにより構築されつる。
ている末端からなる遺伝子は１８〜６６のヌクレオチド
の長さをゼする３４個のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ配
列■を参照されたい）から、まず最初にそれを化学的に
合成しついでそれらを４〜６個のヌクレオチドの１付層
末端５（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎａｓ）によって＃累的に結
合させることにより構築されつる。
さらにＤＮＡ配列Ｉではアミノ酸に対してコドンが複数
個指定されうるが、このコドンは等価のものではなく、
逆に特定の宿主細胞例えば大腸菌中では異なった選好性
を示すものであってこれらアミノ酸について注意が払わ
れた。さらにパリンドローム配列（ｐａｌｉｒａｒｏｍ
ｉｃ ｓθｑｕｅｎｃｅ） （回文配列）は最少にまで
減少された。
個指定されうるが、このコドンは等価のものではなく、
逆に特定の宿主細胞例えば大腸菌中では異なった選好性
を示すものであってこれらアミノ酸について注意が払わ
れた。さらにパリンドローム配列（ｐａｌｉｒａｒｏｍ
ｉｃ ｓθｑｕｅｎｃｅ） （回文配列）は最少にまで
減少された。
すなわち、ＤＮＡ配列ｌの遺伝子構造は比較的小さな構
造単位からｄ易に生殖でき、それは周知ベクター中にお
ける６種の遺伝子断片のサブクローニング（ｓｕｂｃｌ
ｏｎｉｎｇ）を可能ならしめ、かつそれら断片を一緒に
して全遺伝子を提供しそしてそれを変異させることなも
げ能にする。
造単位からｄ易に生殖でき、それは周知ベクター中にお
ける６種の遺伝子断片のサブクローニング（ｓｕｂｃｌ
ｏｎｉｎｇ）を可能ならしめ、かつそれら断片を一緒に
して全遺伝子を提供しそしてそれを変異させることなも
げ能にする。
合成遺伝子または遺伝子断片をたとえば商業的に入手し
つるプラスミドｐＵｃ ８およびｐＢＲ６２２あるいは
たとえばｐｔａｃ １１およびｐＫＫ１７７．３のよう
な他の一般に人手しうるシラスミドのようなりローニン
グベクター中に組み入れることはそれ自体既知の方法で
実施される。また化学的に合成された遺伝子に可能な蛋
白質の表現を与える適当な化学合成された制御領域を提
供することはあらかじめ可能である。これに関してはマ
ニアナイス氏による教科Ｊ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ。
つるプラスミドｐＵｃ ８およびｐＢＲ６２２あるいは
たとえばｐｔａｃ １１およびｐＫＫ１７７．３のよう
な他の一般に人手しうるシラスミドのようなりローニン
グベクター中に組み入れることはそれ自体既知の方法で
実施される。また化学的に合成された遺伝子に可能な蛋
白質の表現を与える適当な化学合成された制御領域を提
供することはあらかじめ可能である。これに関してはマ
ニアナイス氏による教科Ｊ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ。
Ｍａｎｉａｔｉｓ氏寺による００１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｂｏｒ １９８２）を参照されたい。こうして得ら
れた混成プラスミドの、適当な宿主微生物、有利には大
腸丙申への形１１！′転換は同様にそれ自体既知であり
、前記教科書に詳記されている。表現された蛋白質の単
離およびそれのｆ、ｆ Ｈも同様に記載されている（Ｊ
、 Ａ、σθｏｒｇｉａｄｅｓ氏によるｒｌｅｘａｅ
Ｒｅｐｏｒｔｓｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅＪ ｌ （１９８１ン、 １７９、Ｃａｍｅ
氏およびＧａｒｔｅｒ氏（、編者ンによる「工ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎｅａｎｄ ！ｒｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎａＪ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社出版、１９８４年を参照
されたい）。
Ｈａｂｏｒ １９８２）を参照されたい。こうして得ら
れた混成プラスミドの、適当な宿主微生物、有利には大
腸丙申への形１１！′転換は同様にそれ自体既知であり
、前記教科書に詳記されている。表現された蛋白質の単
離およびそれのｆ、ｆ Ｈも同様に記載されている（Ｊ
、 Ａ、σθｏｒｇｉａｄｅｓ氏によるｒｌｅｘａｅ
Ｒｅｐｏｒｔｓｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅＪ ｌ （１９８１ン、 １７９、Ｃａｍｅ
氏およびＧａｒｔｅｒ氏（、編者ンによる「工ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎｅａｎｄ ！ｒｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎａＪ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社出版、１９８４年を参照
されたい）。
本発明により得られる遺伝子断片の工ＦＮ−１。
工Ｆト…および工ＦＮ−ｉｌｌ 、それらで得られるハ
イブリッドプラスミドおよびその形質転換された宿主微
生物は新規であり、本発明はそれらに関するものである
。同じことはＤＮＡ配列■の変形である新規なりＮＡ配
列にも適用される。本発明の他の態様は時計ｌｌ＋４求
の範囲に記載のとおりである。
イブリッドプラスミドおよびその形質転換された宿主微
生物は新規であり、本発明はそれらに関するものである
。同じことはＤＮＡ配列■の変形である新規なりＮＡ配
列にも適用される。本発明の他の態様は時計ｌｌ＋４求
の範囲に記載のとおりである。
さらに本発明の態様を以下の芙施例で詳しく説明するが
、これより、多数のＩＪＴ能な変法および組み会わせは
当業者には自明である。これらの実施例中、特にことわ
らない限り百分率でのデータは１址によるものである。
、これより、多数のＩＪＴ能な変法および組み会わせは
当業者には自明である。これらの実施例中、特にことわ
らない限り百分率でのデータは１址によるものである。
実施例
１、 ジングルストランドのオリゴヌクレオチドの化学
合成 遺伝子構造単位の合成は遺伝子の構造単位１ａの例を使
用して説明されるが、それはコード化ストランドのヌク
レオチド１〜２６からなる。
合成 遺伝子構造単位の合成は遺伝子の構造単位１ａの例を使
用して説明されるが、それはコード化ストランドのヌク
レオチド１〜２６からなる。
既知方法（Ｍ、Ｊ、ｅａｔｔ氏等による「Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、Ｊ ８ （１９８０ン １０８
１〜１０９６）を使用して６′末端に位置するヌクレオ
シド、（たとえば本発明のノ易合にはシチジン（ヌクレ
オチドｎｏ、 ２３ ）は３′−水ζＩＩＺ基によりシ
リカケ゛ル（メルり社製のフラクトシル（ＰＲＡＣＴＯ
８工Ｌ％登録商標し）に共有結合される。このためにシ
リカゲルは最初に６−（）＋Ｊ工）キシシリル）プロピ
ルアミンと反応せしめられ、エタノールの生成を伴って
５ｉ−０−８１結合が形成される。シチジンはＮ４−ベ
ンツ゛イルー５ｌ−ｏ−スクシノイル−５′−ジメトキ
シトリチルエーテルの形）線で７２ラニトロフエノール
およびＮ、Ｎ’−シフクロヘキシルカルボジイミド応ｕ
しめられてそのスフ／ノイル基の遊陥カルボキシ基がプ
ロピルアミノ基のアミノ基をアシル化する。
ｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、Ｊ ８ （１９８０ン １０８
１〜１０９６）を使用して６′末端に位置するヌクレオ
シド、（たとえば本発明のノ易合にはシチジン（ヌクレ
オチドｎｏ、 ２３ ）は３′−水ζＩＩＺ基によりシ
リカケ゛ル（メルり社製のフラクトシル（ＰＲＡＣＴＯ
８工Ｌ％登録商標し）に共有結合される。このためにシ
リカゲルは最初に６−（）＋Ｊ工）キシシリル）プロピ
ルアミンと反応せしめられ、エタノールの生成を伴って
５ｉ−０−８１結合が形成される。シチジンはＮ４−ベ
ンツ゛イルー５ｌ−ｏ−スクシノイル−５′−ジメトキ
シトリチルエーテルの形）線で７２ラニトロフエノール
およびＮ、Ｎ’−シフクロヘキシルカルボジイミド応ｕ
しめられてそのスフ／ノイル基の遊陥カルボキシ基がプ
ロピルアミノ基のアミノ基をアシル化する。
次に続く・合成の谷工程においてその塩基成分は５′−
〇ージメトキシトリテルヌクレメーシド−３１−亜りん
酸のモノメチルエステルのジアルキルアミドまたはクロ
ライドとして使用されるが、その際アデニンはＮ６−ベ
ンゾイル化合物の形態で、７トシンはＮ４−ハンゾイル
化合物の形態で、グアニンはＮ２−イソブチリル化合物
の形態で、そしてチミンはアミノ基を全く含有していな
いので、保護基なしで存在している。
〇ージメトキシトリテルヌクレメーシド−３１−亜りん
酸のモノメチルエステルのジアルキルアミドまたはクロ
ライドとして使用されるが、その際アデニンはＮ６−ベ
ンゾイル化合物の形態で、７トシンはＮ４−ハンゾイル
化合物の形態で、グアニンはＮ２−イソブチリル化合物
の形態で、そしてチミンはアミノ基を全く含有していな
いので、保護基なしで存在している。
２μモルの結合された／トシンを含有する５０〜の重合
担体を以下の剤、すなわち ａ）ニトロメタン、 ｂ）１％の水を含有しているニトロメタン中における臭
化亜鉛の飽和溶液、 Ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル ｒ）［１．５−の無水アセトニトリル中における４０μ
モルの適当なヌクレオシドホスファイトおよび２００μ
モルのテトラゾール（５分）。
担体を以下の剤、すなわち ａ）ニトロメタン、 ｂ）１％の水を含有しているニトロメタン中における臭
化亜鉛の飽和溶液、 Ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル ｒ）［１．５−の無水アセトニトリル中における４０μ
モルの適当なヌクレオシドホスファイトおよび２００μ
モルのテトラゾール（５分）。
ｇ）４０９６ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリ
ジンを含有するテトラヒドロンジン中における２０俤Ｉ
５ド１伎無水９勿（２分）、ｈ）テトラヒドロフラン、 １）２０％の水および４０チのルチジンを含射するテト
ラヒドロフラン、 ｊ）５：４ 二１’４量比のコリジン／水／テトラヒド
ロフラン中における３チ沃ネ、 ｈ）テトラヒドロフランＴ６よび １）メタノール で連続的に処理する。
ジンを含有するテトラヒドロンジン中における２０俤Ｉ
５ド１伎無水９勿（２分）、ｈ）テトラヒドロフラン、 １）２０％の水および４０チのルチジンを含射するテト
ラヒドロフラン、 ｊ）５：４ 二１’４量比のコリジン／水／テトラヒド
ロフラン中における３チ沃ネ、 ｈ）テトラヒドロフランＴ６よび １）メタノール で連続的に処理する。
前記の「゛ホスファイト」の用語は＠６番目の原子価が
塩素または第３級アミノ基たとえはモルホリノ基により
飽和されているデオキ７リボースー６′ーモノ亜りん酸
のモノメチルエステルであることを理解されたい。合成
における個々の工程の収蔵は４ ９ ０ ｎｍの波長に
おけるジメトキシトリチル陽イオンの吸収を測定する分
光測光により脱トリチル化反応にしたがって各場合に測
定されうる。
塩素または第３級アミノ基たとえはモルホリノ基により
飽和されているデオキ７リボースー６′ーモノ亜りん酸
のモノメチルエステルであることを理解されたい。合成
における個々の工程の収蔵は４ ９ ０ ｎｍの波長に
おけるジメトキシトリチル陽イオンの吸収を測定する分
光測光により脱トリチル化反応にしたがって各場合に測
定されうる。
オリゴヌクレオチドの合成終了ｎｓ オｖー；−ｒーの
メチルホスフェート保護基はｐ−チオクレゾールおよび
トリエチルアミンを使用して除去される。
メチルホスフェート保護基はｐ−チオクレゾールおよび
トリエチルアミンを使用して除去される。
ついでこのオリゴヌクレオチドは３時間アンモニアで処
理することにより固体担体から除去される。オリゴマー
を定量的に２〜６日間日間ファンモニア理すると塩基の
アミノ保護基が除去される。こうして得られた粗生成物
は高圧液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ！ ）によ
りまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製さ
れる。
理することにより固体担体から除去される。オリゴマー
を定量的に２〜６日間日間ファンモニア理すると塩基の
アミノ保護基が除去される。こうして得られた粗生成物
は高圧液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ！ ）によ
りまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製さ
れる。
遺伝子の他の構造単位１ｂ−ｉｌｌｌも全く同様にして
合成され、それらのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列■か
ら誘導される。
合成され、それらのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列■か
ら誘導される。
２．遺伝子断片の工ＦＮ−１、工ＦＮ−■および工ＦＮ
−１１１を得るためのジングルストランドのオリゴヌク
レオチドの鉢累的結仕 ５′末端でのオリゴヌクレオチドのホスホリル化のため
には５ ｎｍｏｆｆｉのアデノシントリホスフェートと
一緒の１ ｎｍｏｆｉのそれぞれのオリゴヌクレオチド
ｌａおよびｌｔ＋を５０分１ｉ３３７℃において２０μ
βの５０ｍＭ）リスＨａｌｌバッファー（ｐＨ７，６）
、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）中における４単位ので４−ポリヌク
レオチドキナーゼで処理した（ Ｃ，Ｃ，Ｒ１ｃｈａｒ
ｄｓｏｎ氏によるｒＰｒｏｇｒｅｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌ
、 ＡＱｉｄ８ Ｒｅｓ、 Ｊ ２（１９７２）、 ８
２５を参照されたい）。この酪素は５分間９５℃での加
熱により不活性化される。ついでこのオリゴヌクレオチ
ドのｌａおよびＩｂはそれらを２分間９５℃で水溶液中
で加熱しりいで徐々に５℃に冷却することによりお互い
に関してハイブリッド化される。
−１１１を得るためのジングルストランドのオリゴヌク
レオチドの鉢累的結仕 ５′末端でのオリゴヌクレオチドのホスホリル化のため
には５ ｎｍｏｆｆｉのアデノシントリホスフェートと
一緒の１ ｎｍｏｆｉのそれぞれのオリゴヌクレオチド
ｌａおよびｌｔ＋を５０分１ｉ３３７℃において２０μ
βの５０ｍＭ）リスＨａｌｌバッファー（ｐＨ７，６）
、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１０ｍＭジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）中における４単位ので４−ポリヌク
レオチドキナーゼで処理した（ Ｃ，Ｃ，Ｒ１ｃｈａｒ
ｄｓｏｎ氏によるｒＰｒｏｇｒｅｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌ
、 ＡＱｉｄ８ Ｒｅｓ、 Ｊ ２（１９７２）、 ８
２５を参照されたい）。この酪素は５分間９５℃での加
熱により不活性化される。ついでこのオリゴヌクレオチ
ドのｌａおよびＩｂはそれらを２分間９５℃で水溶液中
で加熱しりいで徐々に５℃に冷却することによりお互い
に関してハイブリッド化される。
オリゴヌクレオチドのｌｃおよびＨａ％ＩθおよびＩ’
Ｓ Ｉｇおよびｌｈそして１１およびＩｊも類似方法で
ホスホリル化されついで対でハイブリッド化される。オ
リゴヌクレオチドの［ａとＩｂとの対からはじまってｌ
ｌｋとＩｌｌとの対までの谷ホスホリル化および対での
ハイブリッド化は小断片工ＦＮ−１のために実施されそ
してオリゴマーの１ｌｌａと１ｌｌｂとの対からはじま
って１ｌｌｋとｌｌ１ｌとの対までのそれらは小断片工
Ｆｉｌ−１［のために実施される。
Ｓ Ｉｇおよびｌｈそして１１およびＩｊも類似方法で
ホスホリル化されついで対でハイブリッド化される。オ
リゴヌクレオチドの［ａとＩｂとの対からはじまってｌ
ｌｋとＩｌｌとの対までの谷ホスホリル化および対での
ハイブリッド化は小断片工ＦＮ−１のために実施されそ
してオリゴマーの１ｌｌａと１ｌｌｂとの対からはじま
って１ｌｌｋとｌｌ１ｌとの対までのそれらは小断片工
Ｆｉｌ−１［のために実施される。
こうして得られた遺伝子断片工ＦＮ−１のための５対の
オリゴヌクレオチドおよび遺伝子断片の工ＦＮ−［およ
び工ＦＮ−１１１のための６対のオリゴヌクレオチドは
各場合以下のようにつながれる。
オリゴヌクレオチドおよび遺伝子断片の工ＦＮ−［およ
び工ＦＮ−１１１のための６対のオリゴヌクレオチドは
各場合以下のようにつながれる。
これらダブルストランドのヌクレオチドは１６時間かか
つて１５℃で１００単位のＴ４−ＭＡ リガーガを使用
して４０パの５ＱｍＭトリスＨＣＩＡ）９ツ７７−１２
０ｍＭ１ｍ化マグネシウムおよび１ＱｍＭＤＴＴ中にお
いて一緒にされ、それぞれつながれる。
つて１５℃で１００単位のＴ４−ＭＡ リガーガを使用
して４０パの５ＱｍＭトリスＨＣＩＡ）９ツ７７−１２
０ｍＭ１ｍ化マグネシウムおよび１ＱｍＭＤＴＴ中にお
いて一緒にされ、それぞれつながれる。
遺伝子喀片工ＦＮ−１〜ＩＦＮ−１１１の梢製は１０チ
ポリアクリルアミドゲル（尿素の添加なし、２０×４０
ｃｒｎ、１＋ｍ厚さ）上でのゲル電気泳動により実施さ
れ、使用されたメーカー物質はＨｌｎｆｌで切断’さｈ
るφｘ １７４ＤＮＡ（ＢＲＬａ製）であるかまたは
１（ａｅ Ｉｌｌで切断されるｐＢＲ３２２であった。
ポリアクリルアミドゲル（尿素の添加なし、２０×４０
ｃｒｎ、１＋ｍ厚さ）上でのゲル電気泳動により実施さ
れ、使用されたメーカー物質はＨｌｎｆｌで切断’さｈ
るφｘ １７４ＤＮＡ（ＢＲＬａ製）であるかまたは
１（ａｅ Ｉｌｌで切断されるｐＢＲ３２２であった。
五 遺伝子断片の工ＦＮ−１１工ＦＮ−ＩＩおよび工Ｆ
ＩＪ−１１１を含有する混成プラスミドの製法 ａ） ｐＢＲ３２２中への遺伝チェＦＮ−１の組み込み
商業的に人手しうるプラスミドｐＢＲ３２２を製造業者
のデータにしたがって制限エンドヌクレアーゼのＢａａ
Ｒ１およびＢａｍ Ｈｌを使用して既知方法で開裂（
ｏｐｅｎ ）する。消化混付物を既知方法で５チポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分画しそして各断
片は臭化エチジウムでの着色によるかまたは放射性ラベ
リングにより肉眼で見ることができる（前記引用文献、
マニアテイス氏の１ニツク翻訳１法）。ついでプラスミ
ド帯なアクリルアミドゲルから切断し、それを電気泳動
によりポリアクリルアミドから分離させる。また消化混
合物の分画も７２俤低融解アガロースゲル（実施例５ａ
に記載）上で実施されうる。
ＩＪ−１１１を含有する混成プラスミドの製法 ａ） ｐＢＲ３２２中への遺伝チェＦＮ−１の組み込み
商業的に人手しうるプラスミドｐＢＲ３２２を製造業者
のデータにしたがって制限エンドヌクレアーゼのＢａａ
Ｒ１およびＢａｍ Ｈｌを使用して既知方法で開裂（
ｏｐｅｎ ）する。消化混付物を既知方法で５チポリア
クリルアミドゲル上の電気泳動により分画しそして各断
片は臭化エチジウムでの着色によるかまたは放射性ラベ
リングにより肉眼で見ることができる（前記引用文献、
マニアテイス氏の１ニツク翻訳１法）。ついでプラスミ
ド帯なアクリルアミドゲルから切断し、それを電気泳動
によりポリアクリルアミドから分離させる。また消化混
合物の分画も７２俤低融解アガロースゲル（実施例５ａ
に記載）上で実施されうる。
ついで１μＶのシラスミドは一夜、１６℃において１０
ｎｆの遺伝子断片工ＦＮ−１で縛られ（ｌｉｇａｔｅｄ
）る。図１に示されるノ＼イブリッドプラスミドが得ら
れる。
ｎｆの遺伝子断片工ＦＮ−１で縛られ（ｌｉｇａｔｅｄ
）る。図１に示されるノ＼イブリッドプラスミドが得ら
れる。
ｂ）ｐＵＯ８中への遺伝子断片ＩＦＮ−ＩＩの組み込み
ａ）と同様にして商業的に入手しうるプラスミドｐｏＣ
８はＢａｎ １１およびＨｌｎｄ ｍで切断されて開か
れついで遺伝子断片工ＦＮ−…で縛られる。図２に示さ
れるハイブリッドプラスミドが得られる。
ａ）と同様にして商業的に入手しうるプラスミドｐｏＣ
８はＢａｎ １１およびＨｌｎｄ ｍで切断されて開か
れついで遺伝子断片工ＦＮ−…で縛られる。図２に示さ
れるハイブリッドプラスミドが得られる。
リ ｐＵＣ８中への遺伝子断片ＩＦＮ−ｍの組み込みａ
）と同様にしてシラスミドｐ［Ｔｏ ８はＨｌｎｄｌｌ
ｌおよび８ａｌ ｌで切ｖＪ（され開かれついで遺伝子
断片工ＦＮ−ｉｌｌで縛られる。図５に示されるハイブ
リッドプラスミドが得られる。
）と同様にしてシラスミドｐ［Ｔｏ ８はＨｌｎｄｌｌ
ｌおよび８ａｌ ｌで切ｖＪ（され開かれついで遺伝子
断片工ＦＮ−ｉｌｌで縛られる。図５に示されるハイブ
リッドプラスミドが得られる。
４、完全遺伝子の合成およびプラスミド中への組み込み
ａ）形質転換および増幅
こうして得られたハイブリッドプラスミドは大腸菌中に
形質転換される。このためには鉋株大１１ｍＫ１２を７
ＱｍＭ塩化カルシウム溶液での処理により有能なものに
しついでこれに塩化カルシウム中の７０ｍＭであるが、
１０ｍＭトリスａｃＪｌバッファー（１）１７．５）中
のハイブリッドプラスミドの懸濁液を加える。これらの
形質転換される菌株はプラスミドにより役けられた抗生
物質に対する抵抗または感度を使用していつものように
選択され、ハイブリッドベクターは増幅される。細胞を
殺した後にハイブリッドプラスミドは単離され、最初に
使用した制限酵素で切断し、開かれそして遺伝子断片の
より’Ｎ−１，工Ｆ’Ｎ−■および工ＦＮ−１［はゲル
電気泳動により単離される。
形質転換される。このためには鉋株大１１ｍＫ１２を７
ＱｍＭ塩化カルシウム溶液での処理により有能なものに
しついでこれに塩化カルシウム中の７０ｍＭであるが、
１０ｍＭトリスａｃＪｌバッファー（１）１７．５）中
のハイブリッドプラスミドの懸濁液を加える。これらの
形質転換される菌株はプラスミドにより役けられた抗生
物質に対する抵抗または感度を使用していつものように
選択され、ハイブリッドベクターは増幅される。細胞を
殺した後にハイブリッドプラスミドは単離され、最初に
使用した制限酵素で切断し、開かれそして遺伝子断片の
より’Ｎ−１，工Ｆ’Ｎ−■および工ＦＮ−１［はゲル
電気泳動により単離される。
ｂ）各遺伝子断片の結合
増幅により得られる小断片の工ＦＮ−１．工ＦＮ−１１
および工ＦＮ−１１１は実施例２に記載のようにして酵
素的に結合され、こうして得られかつＤＮＡ配列Ｉを有
する合成遺伝子はクローニングベクターｐＵｏ Ｂ中に
導入される。図４に示されるハイブリッドプラスミドが
得られる。
および工ＦＮ−１１１は実施例２に記載のようにして酵
素的に結合され、こうして得られかつＤＮＡ配列Ｉを有
する合成遺伝子はクローニングベクターｐＵｏ Ｂ中に
導入される。図４に示されるハイブリッドプラスミドが
得られる。
５、ＤＩＪＡ配列Ｉの表現のための混成プラスミドの組
み立て ａ） ｐＫＫ １７７．３中への組み込み表現プラスミ
ド（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ） ｐＫＫ
１７７．３ （プラスミドｐｔａｃ １１ ％ Ａｍｍ
ａｎ氏等による（）ｏｎｅ ２５（１９８３）、 １６
７を参照されたい。この中に８ａｌ ｌ制限部位を含有
する配列がＷｏｏ Ｒ１認識部位中で合成的に組み込ま
れた）が制限＃素の１！！ａｏＲ１およびＥｌａｌ ｌ
を使用して開裂される。挿入物■が制限酵素のＥＯＯＲ
Ｉおよび５ａｌｌを使用して図４に示されるプラスミド
から切断される。
み立て ａ） ｐＫＫ １７７．３中への組み込み表現プラスミ
ド（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ） ｐＫＫ
１７７．３ （プラスミドｐｔａｃ １１ ％ Ａｍｍ
ａｎ氏等による（）ｏｎｅ ２５（１９８３）、 １６
７を参照されたい。この中に８ａｌ ｌ制限部位を含有
する配列がＷｏｏ Ｒ１認識部位中で合成的に組み込ま
れた）が制限＃素の１！！ａｏＲ１およびＥｌａｌ ｌ
を使用して開裂される。挿入物■が制限酵素のＥＯＯＲ
Ｉおよび５ａｌｌを使用して図４に示されるプラスミド
から切断される。
挿入物■は２チ低融解アガロースに適用されプラスミド
ＤＮＡから分離されそしてその挿入物はゲルを高められ
た温度でＩＮすることにより回収される（製造業者の記
述による）。挿入物の上流に表現領域または調整領域が
包含されているハイブリッドプラスミドはすでに切断さ
れて開かれているプラスミドｐＫＫ １７７．３を遺伝
子Ｉで縛ることにより得られる。たとえばインプロピル
−！−チオガラクトビ２ノシド（工ＰＴＧンのような適
当なインデューサーを添加後にｍ部Ａが生成されそして
これかＤＮＡ配列配列相当するメチオニル−ポリペプチ
ドの表現につながる。
ＤＮＡから分離されそしてその挿入物はゲルを高められ
た温度でＩＮすることにより回収される（製造業者の記
述による）。挿入物の上流に表現領域または調整領域が
包含されているハイブリッドプラスミドはすでに切断さ
れて開かれているプラスミドｐＫＫ １７７．３を遺伝
子Ｉで縛ることにより得られる。たとえばインプロピル
−！−チオガラクトビ２ノシド（工ＰＴＧンのような適
当なインデューサーを添加後にｍ部Ａが生成されそして
これかＤＮＡ配列配列相当するメチオニル−ポリペプチ
ドの表現につながる。
ｂ）ｐＭＸＺ中への組み込み
表現プラスミドｐＭＸ ２は２１のヌクレオチドにより
短くされたｐＵｏ ８プラスミドからなり、以下の方法
で製造される。
短くされたｐＵｏ ８プラスミドからなり、以下の方法
で製造される。
ｐＵｏ ８を制限エンドヌクレアーゼＦｉｃｏＲ１を使
用して開裂しついでそれをＦｉｃｏ Ｒ１制限部位の両
側上の約２０のヌクレオチドを除去しうる条件下におい
てエキソヌクレアーゼＢａｌ ３１で処理する（前記引
用文献マニアテイス氏による論文を参照されたい）。つ
いでこうして処理されたプラスミドのいずれもの突出し
ている末端がフレナラ（Ｋｌθｎｏｗ ） ＤＮＡポリ
メラーゼを使用して充填されついでそのプラスミドは制
限エンドヌクレアーゼＨ１ｎ４ ｉｌｌを使用して切断
されそして製造業者の主張にしたがって１−低融解アガ
ロースゲル上でイ１１製される。最初にｐＵｏ８中に存
在し、Ｅｃｏ Ｒ１およびＨｌｎｄ ｌ［の制限酵素切
断部位により限定されしかも前記操作により破壊されて
しまったポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋθｒ）は再び
プラスミドに挿入される。このためにはｐＵｏ ８を１
１１す限蝉素ＫｃｏＲ１を使用して開き、その突出して
いる末端をフレナラＤＮＡポリメラーゼおよび５２ｐ−
ラベルされたヌクレオシドトリホスフェートを使用して
充填する。ついでそのポリリンカーを制限酵素Ｈ１ｎｄ
ｉｌｌを使用してシラスミドからり断し、１０％アク
リルアミドゲル上での１気ｖＫ動によりそのプラスミド
から除去する。そのポリリンカー帯をオートラジオグラ
フィーを使用して同定した陵にアクリルアミドの残留物
を電気溶出によりそのポリリンカーから除去しそしてそ
れは短くされたｐＵ（！ Ｂシラスミド中に縛らｒる。
用して開裂しついでそれをＦｉｃｏ Ｒ１制限部位の両
側上の約２０のヌクレオチドを除去しうる条件下におい
てエキソヌクレアーゼＢａｌ ３１で処理する（前記引
用文献マニアテイス氏による論文を参照されたい）。つ
いでこうして処理されたプラスミドのいずれもの突出し
ている末端がフレナラ（Ｋｌθｎｏｗ ） ＤＮＡポリ
メラーゼを使用して充填されついでそのプラスミドは制
限エンドヌクレアーゼＨ１ｎ４ ｉｌｌを使用して切断
されそして製造業者の主張にしたがって１−低融解アガ
ロースゲル上でイ１１製される。最初にｐＵｏ８中に存
在し、Ｅｃｏ Ｒ１およびＨｌｎｄ ｌ［の制限酵素切
断部位により限定されしかも前記操作により破壊されて
しまったポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋθｒ）は再び
プラスミドに挿入される。このためにはｐＵｏ ８を１
１１す限蝉素ＫｃｏＲ１を使用して開き、その突出して
いる末端をフレナラＤＮＡポリメラーゼおよび５２ｐ−
ラベルされたヌクレオシドトリホスフェートを使用して
充填する。ついでそのポリリンカーを制限酵素Ｈ１ｎｄ
ｉｌｌを使用してシラスミドからり断し、１０％アク
リルアミドゲル上での１気ｖＫ動によりそのプラスミド
から除去する。そのポリリンカー帯をオートラジオグラ
フィーを使用して同定した陵にアクリルアミドの残留物
を電気溶出によりそのポリリンカーから除去しそしてそ
れは短くされたｐＵ（！ Ｂシラスミド中に縛らｒる。
ついでこうして組み立てられたプラスミドｐＭＸ２は制
限＃素Ｅｃｏ Ｒ１およびＳａｌ ｌを１史用して開か
れついでｒ−インターフェロンｆｆｉ＆子Ｉで縛られ、
それらの末端はＥａｏＲＩおよび５ＩＬＬ Ｉの認識配
列を有して表現プラスミドｐＭＸ ２ （図５）になる
。ついで高い滴定址のインターフェロンを示すクロー、
ンはその生物活性の測定により同定される。
限＃素Ｅｃｏ Ｒ１およびＳａｌ ｌを１史用して開か
れついでｒ−インターフェロンｆｆｉ＆子Ｉで縛られ、
それらの末端はＥａｏＲＩおよび５ＩＬＬ Ｉの認識配
列を有して表現プラスミドｐＭＸ ２ （図５）になる
。ついで高い滴定址のインターフェロンを示すクロー、
ンはその生物活性の測定により同定される。
６、 混成プラスミドの形質転換
適応する大腸菌細胞に配列■を含有する混成プラスミド
０．１〜１μ２を形質転換し、これをアンピシリン含有
の寒天プレート上に入れる。ついで適当なプラスミド中
に正しく集成されたｒ−インターフェロン遺伝子配列を
含有するクローンをＤＮＡ迅速後処理（前記引用文献マ
ニアナイス氏による論文を参照されたい）により同定す
ることかａＪ能である。
０．１〜１μ２を形質転換し、これをアンピシリン含有
の寒天プレート上に入れる。ついで適当なプラスミド中
に正しく集成されたｒ−インターフェロン遺伝子配列を
含有するクローンをＤＮＡ迅速後処理（前記引用文献マ
ニアナイス氏による論文を参照されたい）により同定す
ることかａＪ能である。
７、ｒ−インターフェロン活性を示すポリペプチドの表
現 前記のハイブリッドプラスミドを大腸菌中に形質転換後
に表現されるポリペプチドはｒ−インターフェロンアミ
ノ酸配列の外にさらに別のメチオニル基をアミノ末端に
含有するものである。
現 前記のハイブリッドプラスミドを大腸菌中に形質転換後
に表現されるポリペプチドはｒ−インターフェロンアミ
ノ酸配列の外にさらに別のメチオニル基をアミノ末端に
含有するものである。
ａ 後処理および精製
所望の光学濃度まで培養された細菌の菌株をたとえば２
時間の十分な時間たとえばＩＰＴＧのような適当なイン
デューサーで培養する。ついで細胞を、０．１％クレゾ
ールおよびＱ、 １ｍＭベンジルスルホニルフルオライ
ドを使用して殺す。遠心分離またはｐ過後にその生物量
をバッファー溶液（５ＱｍＭ）リス、５ ［１ｍＭ Ｆ
ｉＤＴＡ％ｐＨ７，５）に入れそしてたとえばフレンチ
プレスまたはＤＹＮＯ（登録１月ミル（バーゼルにある
Ｖｉｎｙ Ｂａｃｈｏｆｅｒ社製）を使用して機械的に
分裂させついでその不溶性成分を遠心分離により除去す
る。ｒ−インターフェロン活性を有する蛋白質は常套法
で上澄み液から精製される。イオン交換カラム、吸着カ
ラムおよびゲルｐ過カラムの方法または抗体カラム上の
親和クロマトグラフィー法が適当である。生成物の濃縮
および純度はドデシル硫酸ナトリウム／アクリルアミド
ゲルまたはＨＰＬＯを使用する分析によりチェックされ
る。
時間の十分な時間たとえばＩＰＴＧのような適当なイン
デューサーで培養する。ついで細胞を、０．１％クレゾ
ールおよびＱ、 １ｍＭベンジルスルホニルフルオライ
ドを使用して殺す。遠心分離またはｐ過後にその生物量
をバッファー溶液（５ＱｍＭ）リス、５ ［１ｍＭ Ｆ
ｉＤＴＡ％ｐＨ７，５）に入れそしてたとえばフレンチ
プレスまたはＤＹＮＯ（登録１月ミル（バーゼルにある
Ｖｉｎｙ Ｂａｃｈｏｆｅｒ社製）を使用して機械的に
分裂させついでその不溶性成分を遠心分離により除去す
る。ｒ−インターフェロン活性を有する蛋白質は常套法
で上澄み液から精製される。イオン交換カラム、吸着カ
ラムおよびゲルｐ過カラムの方法または抗体カラム上の
親和クロマトグラフィー法が適当である。生成物の濃縮
および純度はドデシル硫酸ナトリウム／アクリルアミド
ゲルまたはＨＰＬＯを使用する分析によりチェックされ
る。
ｒ−インターフェロン活性に関する生成物の生物学的特
性についてはたとえばベロ（ＶｅｒＯ）細胞のようなイ
ンジケーター細胞系統が既知方法で使用され、それらが
インターフェロン含有の細菌抽出物の一連の希釈物と共
に培養される。
性についてはたとえばベロ（ＶｅｒＯ）細胞のようなイ
ンジケーター細胞系統が既知方法で使用され、それらが
インターフェロン含有の細菌抽出物の一連の希釈物と共
に培養される。
ついで検査は、その細菌抽出物によるベロ細胞の前処理
が抗ウイルス状態を達成しうるまでの希釈段階の、たと
えばＶ日Ｖ（小水庖性口内炎ウィルス）のようなウィル
スによる感染により実施される。評価は１１ｊ４倣鏡に
ょる倹食または中性赤の吸収の測定によりなされうる。
が抗ウイルス状態を達成しうるまでの希釈段階の、たと
えばＶ日Ｖ（小水庖性口内炎ウィルス）のようなウィル
スによる感染により実施される。評価は１１ｊ４倣鏡に
ょる倹食または中性赤の吸収の測定によりなされうる。
さらに、ｒ−インターフェロン活性はｒ−インターフェ
ロンに対するモノクロナール抗体に基づく商業的に人手
しうる放射線免疫分析（セルチク社）を使用して測定さ
れうる。
ロンに対するモノクロナール抗体に基づく商業的に人手
しうる放射線免疫分析（セルチク社）を使用して測定さ
れうる。
ＤＮＡ配列 Ｉ
トリプレット随 １２３４５
アミノ酸 Ｃｙｅ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐヌ
クレオチドＮα １０ コード化ストランド ５’ ＴＧＣＴＡＧ ＴＧＣＣＡ
Ｇ ＧＡＣ非コード化ストランド３’ ＡＯＧ ＡＴ（
） ＡＯＧ ＧＴＯ０Ｔ（）６ ７ ８ ９ １０ １
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２４ ２５Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｅｎ Ａｌａ
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ｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓａｒ４６ Ｇｌｎ ６８ ＯＡｏ ６′ ＧＴＣ５’
第１図はプラスミドｐＢＲ３２２の構造を簡単に示す。
第２図はプラスミドｐＵＣ８の構造を簡単に示す。
第３図も同じくプラスミドｐｕｃ ８の構造を簡単に示
す。 第４図も同じくプラスミドｐＵＣ８の構造を簡単に示す
。 第５図はプラスミドｐＭＸ ２の構造を簡単に示す。 ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ＦＩＧ、４
す。 第４図も同じくプラスミドｐＵＣ８の構造を簡単に示す
。 第５図はプラスミドｐＭＸ ２の構造を簡単に示す。 ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ＦＩＧ、４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｊ） ＤＮＡ配列■を含有する合成遺伝子を使用するこ
とからなるヒトのガンマインターフェロンの遺伝子工学
的製法。 ２ン２個の停止コドンが遺伝子の後に続（ものである前
記特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３）使用する宿主微生物が大腸菌である前記特許請求の
範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４） ＤＮＡ配列の■、Ｈａ（工Ｆ’Ｎ−１）、１ｌｂ
（工ＦＭ−１）および１ｌｃ（工ＦＮ−１１１）。 ５） ＤＮＡオリゴヌクレオチドｌａないし同１１１１
０６） ｚｃｏ Ｒ１とＢａｍ ＨＪの制限部位の間に
ＤＮＡ配列Ｉｌ＆（工ｖｕ−１）を、ＢａｍＨｌとＨｌ
ｎｄ ｌｌの制限部位の間にＤＮＡ配列１１ｂ（工ＦＮ
−１１）を、Ｈｌｎｄｌｌ［とＳａｌ ｌの制限部位の
間にＤＮＡ配列Ｎｏ（工ＦＮ−ＩＩＩ）をあるいはｚｃ
ｏ Ｒ１と１３ａｌ ｌの制限部位の間にＤＮＡ配列１
を含有するハイブリッドプラスミド。 ７） Ｅｃｏ Ｒ１制限部位と第１アミノ酸システイン
のためのコドンとの間に正しい読みフレーム中の分泌蛋
白質の前駆配列（＝信号配列）を含有する前記特許請求
の範囲第６項に記載のハイブリッドプラスミド。 ８）前記特許請求の範囲第６項または第７項に記載のハ
イブリッドプラスミドを含有する宿主微生物。 ９）前記特許請求の範囲第６項または第７項に記載のハ
イブリッドシラスミドを含有する大腸菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3409966.2 | 1984-03-19 | ||
| DE19843409966 DE3409966A1 (de) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-gammainterferon und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60210996A true JPS60210996A (ja) | 1985-10-23 |
Family
ID=6230903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60052577A Pending JPS60210996A (ja) | 1984-03-19 | 1985-03-18 | ヒトのガンマインターフエロンの遺伝子工学的製法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS60210996A (ja) |
| KR (1) | KR850006704A (ja) |
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| DE (1) | DE3409966A1 (ja) |
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| FI (1) | FI851037L (ja) |
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| NZ (1) | NZ211478A (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62282595A (ja) * | 1986-03-10 | 1987-12-08 | ベ−リンガ− インゲルハイム インタ−ナシヨナル ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツンク | ハイブリツドインタ−フエロン、それを含有する組成物、およびその製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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- 1985-03-19 MA MA20605A patent/MA20381A1/fr unknown
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|---|---|---|---|---|
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