PT85753B - Processo para a preparacao por engenharia genetica de calcitonina de salmao bem como de agentes para a realizacao do referido processo - Google Patents

Processo para a preparacao por engenharia genetica de calcitonina de salmao bem como de agentes para a realizacao do referido processo Download PDF

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Description

A calcitonina é uma hormona peptidica que participa na regulação do nível de cálcio no soro em virtude da sua acçao de hipocalcemia e de hipofosfatemia. As características gerais da calcitonina de diferentes espécies são um comprimento de 32 ácidos aminados, uma ponte de dissulfureto entre as cisternas 1 e 7 e uma função prolinamida C-terminal. Da entre as calcitoninas que se podem obter comercialmente (humana, suina, de enguia e de salmão) a mais activa é a de salmão. A calcitonina é utilizada para o tratamento de perturbações do metabolismo do cálcio. Estas perturbações incluem hipercalcemia, doença óssea de Paget, diferentes formas de osteoporose bem como sindrome de Sudeck. A actividade analgésica da calcitonina constitui um outro aspecto actual desta hormona. Para além do exposto, a calcitonina é activa terapeuticamente na pancreatite aguda, js que inibe a secreção das enzimas pancreáticas e deste modo apressa a normalização de numerosos parâmetros da doença.
Já é conhecida a preparação por engenharia genética de polipeptideos com uma amida de ácido carboxílico carboxi-terminal como a calcitonina passando por um intermediário com um glicilo C-terminal bem como a respectiva transfbrmaçao enzimática (pedido de Patente Europeia com o número de publicação - seguidamente representado por ”EP-A” - 0 133 282).
No EP-A 191 869 descreve-se um processo para a preparação de calcitonina de salmão I com uma metionina N-terminal adicional e uma glicina C-terminal (calcitonina de salmão
I-Gly ) e de carboxamida de calcitonina de salmao I, no qual se integra um gene num plasmídeo de expressão, se provoca a expressão respectiva e eventualmente se transforma por via enzimática o peptídeo com glicina na carboxamida.
A presente invenção encontra-se definida nas respectivas reivindicações, referindo-se em particular à utilizaçac dum gene especial para a preparação de calcitonina dê salmão I-Gly33,
A primeira fase do processo de engenharia genética consiste na síntese química do gene especial. Nesta fase é sintetizada tanto a cadeia de codificação como a cadeia não codi ficante, ambas por síntese química, prescindindo-se deste modo da habitual reacção de ligação enzimática que á utilizada de acordo com EP-A 0 191 869 e também era anteriormente usada normalmente para a construção dum gene a partir de fragmentos sobrepostos (ver EP-A 0 133 282, 0 136 472, 0 155- 590, 0 161 504, 0 163 249, 0 171 024, 0 173 149 ou 0 177 827).
código genético é degenerado”, como se sabe, isto é, apenas dois ácidos aminados são codificados por sequências de nucleótidos únicas, enquanto que os restantes 1B ácidos aminados codificáveis geneticamente podem ser coordenados por dois a seis tripletos. Em consequência existe uma grande variedade de combinações de codões seleccionáveis para a síntese dum gene. Descobriu-se agora que a sequência de ADN I (Anexo, repre· sentada com o codão de início ATG, dois codões de paragem de tradução e extremidades salientes para diferentes enzimas de restrição) é especialmente vantajosa.
Na extremidade 5’ da cadeia de codificação encontra-se uma sequência de ADN saliente correspondente ã endonuclease de restrição Sphl e na extremidade 3’ da cadeia de codificação, por seu lado, a sequência simples saliente corresponde à enzima de restrição EcoRI. Ambas estas sequências de reconhecimento distintas garantem a inserção do ADN no plasmídeo com a orientação pretendida.
Entre estas sequências de reconhecimento e o codão para a série de ácidos aminados encontra-se, junto da extremidade 5’ da cadeia de codificação, o codão para o ácido aminado metionina (que se encontra marcado na sequência de ADN I com o número 0). Na extremidade desta cadeia, ao tripleto que codifica para a prolina segue-se o codão 33 para a glicina, seguido de dois tripletos de paragem da tradução (codões de Stop).
No interior do gene estrutural foi incorporada u na série de sequências de reconhecimento específicas para endonucleases de restrição, que permitem o acesso a sequências parciais da calcitoniria de salmão I e possibilitam a realização de mutações:
i
Enzima de restrição
Corte após o nucleótido No.
(cadeia de codificação)
Sall20
HindIII39
PstI67
Hpall (MspII)88
Kpnl100
ScrFI103
Na sequência de ADN I foi tomado ainda em consideração que, para cada ácido aminado que corresponde a vários codões, estes não são equivalentes: pelo contrário em cada célula hospedeira, como E. coli, apresentam preferências distintas. Além disso, as sequências palindrómicas foram reduzidas ao mínimo. A sequência de ADN I pode ser preparada a partir de dois oligonucleótidos sintetizados por via química com comprimentos de 109 e 117 nucleótidos.
gene sintético é clonado em E. coli depois de inserção no plasmídeo comercial pUC19 (Figura 1). A sequencia de ADN I pode ser retomada por digestão com Sphl e EcoRI a partir do plasmídeo novamente isolado.
Após transclonagem do gene num vector de expressão como o plasmídeo pWHl (EP-A 0 133 282) obtém-se a expressão *» 33 da calcitonina de salmao I-Gly sob a forma de uma proteína de fusão com uma proteína bacteriana como a y^-galactosidase ou com sequências parciais desta. Estas proteínas de fusão podem então ser hidrolisadas quimicamente de acordo com os métodos tradicionais.
A meticnina na extremidade de amina pode ser eliminada por cisão com brometo de cianogénio de modo a eliminai conjuntamente a fracção não desejada da proteína bacteriana na
proteína de fusão.
A transformação do resíduo de glicina 33 no grupo amina da função prolinãmida na calcitonina de salmão I é conhecida em si (EP-A 0 191 869 e 0 133 282; A.F, Bradbury et al., Nature 298 (1982) 686-688).
A integração do gene sintético no plasmídeo b levada a cabo de modo conhecido em si. Para este fim pode-se fazer referência ao manual de Maniatis (Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). A transformação do plasmídeo hibrido deste modo obtido num organismo hospedeiro apropriado, de modo vantajoso em E. coli, é igualmente conhecida em si e encontra-se igualmente descrita no referido manual). A obtenção da proteína que se pretende expressar e a respectiva purificação podem ser efectuadas de acordo com os processos referidos em EP-A 0 191 869 e EP-A 0 133 282.
Os processos para a preparação da sequência de ADN I e dos plasmídeos híbridos obtidos com essa sequência estaj igualmente incluídos no âmbito da presente invenção.
Nos exemplos que se, seguem elucidam-se em pormenor alguns modos de concretização da presente invenção. Os dados em percentagem são referidos a peso sempre que não houver indicação em contrário.
Exemplos
1. Síntese química dum oligonucleótido de cadeia simples
Como exemplo da cadeia de codificação da sequência de ADN I, descreve-se a síntese das duas fracções constituintes do gene. Para a realização da sintese em fase solida, utiliza-se o nucleósido situado na extremidade 3’, no caso presente
portanto uma guanosina (nucleótido na. 113) ligado através da função 3’-hidroxilo por uma ligaçao covalente a um suporte. 0 material de suporte é um vidro de poro controlado (Controlled Pore Glass) = CPG) funcionalizado com resíduos de aminoalquilo de cadeia longa.
Nas fases de síntese que se seguem empregam-se os componentes de base sob a forma dialquilamida de 5’-0-dimetoxitritil-nuclet$sido-3’-fosfato de J-f-cianoetilo, utilizando-se a 6 adenina sob a forma do composto N -benzoilo, a citosina sob a forma do composto N -benzoilo, a guanina sob a forma do composto N -isobutirilo e a timina sem grupo protector.
Tratam-se 25 mg do polímero de suporte, contendo ligados 0,2 jumol de N -isobutirilo-guanosma, sucessivamente com os seguintes agentes:
A) acetonitrilo
B) ácido tricloroacético a 3% em diclorometano
C) acetonitrilo
D) 5yjmol do fosfito do nucleósido correspondente e 25yjmol de tetrazólio em 0,15 ml de acetonitrilo anidro
E) acetonitrilo
F) anidrido acético a 20% em tetrahidrofurano com 40% de lutidina e 10% de dimetilaminopiridina
G) acetonitrilo
H) iodo a 3% em lutidina/água/tatraidrofurano nas proporçoes 5:4:1.
Por fosfito” compreende-se o desoxirribose-3’-monofosfato de mono-j$-cianoetilo, no quál a terceira valência se encontra saturada por um resíduo de diisopropilamina. Os rendimentos de cada fase de sintese podem em cada caso ser determinados depois da reacção de eliminação do tritilo B) por meios
espectrofotométricos através da medida da absorçao do catião dimetoxitritilo a um comprinento de onda de 496 nm.
Após concluida a síntese, segue-se a hidrólise do grupo dimetoxitritilo como descrito em A) a C). Por tratamento com amoníaco separa-se o oligonucleótido do suporte e eliminam-se ainda os grupos ^y^-cianoetilo. Um tratamento com uma duração de dois a três dias do oligómero com amónia concentrada elimina de forma quantitativa os grupos protectares de amina das bases. 0 produto bruto obtido deste modo é purificado por electroforese em gel de poliacrilamida.
2. Preparação dum plasmídeo hibrido contendo a sequência de
AD.M I
Dissolvem-se 100 pmol de cada um dos oligonucleótidos de 109 bases (cadeia de codificação) e de 117 bases (cadeia não codificante) em conjunta em 50yul de tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 10 mM e ditiotrietol 10 mM, aquece-se esta solução durante 5 minutos a 952Q e arrefece-se até à temperatura ambiente num periodo de duas horas. A cadeia dupla de ADN hibridado correspondente à sequência de ADN I é purificada por cromatografia em gel.
plasmídeo comercial pUC19 é aberto de modo conhecido com as endonucleases de restrição Sphl e EcoRI de acordo com os dados do fornecedor. Separa-'se a mistura resultante da digestão de modo conhecido por electroforese num gel de agarose a 1% e tornam-se os framentos visiveis por coloração com brometo de etidio. As bandas plasmidicas são finalmente cortadas do gel de agarose e separadas da agaíose por electroeluição.
Em seguida liga-se 1 jug de plasmídeo com 10 ng do corres
- 7 pondente fragmento de ADN da sequencia de ADN I durante a noite a 16^0. Obtem-se o plasmídeo híbrido de acordo com a Figura 1.
3. Construção dum plasmídeo de expressão contendo a sequência de ADN I plasmídeo de expressão pWHl é constituído por uma fracção proveniente dum plasmídeo pBR322 e por um gene para a J?-galactosidade com a respectiva região de regulação. A preparação do plasmídeo pWHl foi descrita em pormenor em EP-A 0 133 282. Este plasmídeo contém no ácido aminado 1005 da y^-galactosidade um sítio de corte singular EcoRI, o qual pode ser utilizado como sítio de clonagem para genes eucarióticos. A partir do plasmídeo de acordo com a Figura ’ pode ser obtida a sequência de ADN I por digestão com as enzimas de restrição Sphl e EcoRI. Na sequência de ADN I liga-se um ligante obtido por síntese química, o qual contém an sequências de reconhecimento para as enzimas de restrição Sphl e EcoRI:
5’ AA TTC GGC GCA TG 3’
3· G CCG C 5 ' (EcoRI) (Sphl)
Depois de uma digestão com a enzima de restrição EcoRI obtém-se um fragmentei de ADN, flanqueado por sequências de reconhecimento de EcoRI. Este fragmento pode por fim ser integrado no plasmídeo pWHl aberto com EcoRI, obtendo-se deste modo o plasmídeo representado na Figura 2»
Para este fim abre-se 0,1 a 1 yjg de pWHl com EcoRI e desfosforila-se na extremidade 5* do sítio de corte EcoRI ccm fosfatase alcalina de origem bacteriana. Deste modo evita-se
uma ligação do plasmideo com ele mesmo. Só se podem fechar em forma de anel aqueles plasmideos que possuem integrado um fragmento de gene com sequências de reconhecimento de EcoRI. Para este fim adicionam-se 10jug do gene da calcitonina e realiza-se a ligação.
4. Transformação do plasmideo hibrido
Transformam-se células competentes de E. coli com 0,1 a 1 jã do plasmideo de acordo com a Figura 2 e cultivam—se em placas de agar com ampicilina. Em seguida pode verificar-se a integração do gene da calcitonina e o respectivo sentido de integração no plasmideo por meio de análise de ADN (Maniatis, op. cit.)..
5. Expressão
Após transformação deste plasmideo híbrido em E. coli, consegue-se a expressão duma proteína de fusão que contém na extremidade de amirla da sequência de Met-(calcitonina de salmão-Gly) três ácidas aminados do ligante bem como a sequência dos 1005 ácidos aminados da ^-aalactosidase. Após hidrólise por cianeto de cianogÓnio obtém-se a calcitonina de salmão-Gly3\
6. Processamento final e purificação
Induzem-se as estirpes bacterianas a cultivar até a densidade óptica pretendida com um indutor apropriado, por exemplo com IPTG, durante o tempo suficiente, por exemplo 2 horas.
Em seguida matam-se as células com cresol a 0,1 % e fluoreto de fenil-metil-sulfonilo (fluoreto de benzilsulfonilo) 0,1 mM. Após centrifugação ou filtração, provoca-se a ruptura das células suspendendo a massa celular numa solução aquosa
ácida a pH 3,0 num dispositivo adequado (prensa francesa ou moinho Dyno e em seguida separam-se os resíduos celulares insolúveis por centrifugação· As proteínas são isoladas a partir do sobrenadante por métodos normais (Grau, Mullner, Speipke, Angew, Chem. 98 (1986) 530). A concentração e a pureza dos produtos são verificados por análise de HPLC.
Em seguida separa-se a metionina da fracçao da proteína ^/-galactosidade bacteriana ligada a metionina por hidrólise com brometo de cianogénio e extrai-se e purifica-se o derivado de calcitonina.
As proteínas de fusão com uma fracção de _/£-galactosidase podem ser detectadas logo no extracto bruto do lisado das bactérias em virtude do comportamento diferente da J^-galactosidase autentica em electroforese em gel. Após a hidrólise por brometo de cianogénio é possível determinar o grau de pureza e a concentração da calcitonina de salmão-Gly por HPLC.
A caracterização do produto no que diz respeito à actividade de calcitonina pode ser levada a efeito por via imunológica ou por via biológica:
A calcitonina I de salmão preparada por via bacteriana e a sua variante calcitonina de salmão I-Gly reagem numa análise radioimunológica (RIA) com um anticorpo contra a calcitonina I de salmão sintética. A análise radioimunológica pode ser terminada de modo conveniente como análise de imunoprecipitação com anticorpos anti-calcitonina e anticorpos anti-IgG-anti-calcitonina. A sensibilidade da RIA é de 10 ng de calcitonina de salmão I.
Ir
ou λ 1¾ 3 3
A actividade biológica da calcitonina de salmao I-Gly da calcitonina de salmao I pode ser medida da concentração de cálcio possível recorrer a determinada através no assay kits” de soro. Para este fim cálcio comerciais.
da z
e
Sequência de ADN I
Tripleto n2. 0 1 2 3
Ácido aminado Met Cys Ser Asn
Nucleótido n®. 1 5 10 15
Cadeia de codificação 5* C ATG TGC TCT AAC
Cadeia não codificante 3» GT A CG TAC A CG AG A TTG
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Leu Ser Thr Cys Vai Leu Gly Lys Leu Ser
20 25 30 35 40 45
CTG TCG ACT TGC GTT CTT GGT AAG CTT TCT
GAC AGC TGA A CG CAA GAA CCA TTC GAA AGA
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Gin Glu Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pr.o
50 55 60 65 70 75
CAG GAA CTT CAT AAA CTG CAG ACC TAT CCG
GTC CTT GAA GTA TTT GAC GTC TGG ATA GGC
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly
80 85 90 95 100 105
CGC ACT AAT ACC GGC TCT GGT ACC CCT GGT
GCG TGA TTA TGG CCG AGA CCA TGG GGA CCA
34 35
Stp Stp
110 115
TAA TAG 3*
ATT ATC TTA A 5»

Claims (1)

  1. Processo pera a preparaçao de calcitonina I de salmão com uma glicina adicional C-terminal e de caltitonina I-carboxamida de salmão que compreende inserir um gene que codifica para o peptideo-glicina num plasmideo de expressão, promover a respectiva expressão e eventualmente transformar o peptideo-glicina na respectiva carboxamida por via enzimática caracterizado por a estrutura do gene para o peptideo-glicina apresentar a sequência de ADN II
    TGC TCT AAC CTG TCG ACT TGC GTT CTT GGT A AG CTT TCT CAG GAA CTT A CG AGA TTG GAC AGC TGA A CG CAA GAA CCA TTC GAA AGA GTC CTT GAA CAT AAA CTG CAG ACC TAT CCG CGC ACT AAT ACC GGC TCT GbT ACC CCT GTA TTT GAC GTC TGG ATA GGC GCG TGA TTA TGG CCG AGA CCA TGG GG A GGT CCA
    - Processo para a preparação dum gene estrutural de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a cadeia de codificação e a cadeia não codificante serem obtidas por síntese quimicá, eventualmenté com secções de ADN flanqueantes.
    - 3§ Processo de acordo com a reivindicação 2 caracte12 rizado por a síntese ser realizada pelo método do fosfito
    A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 20 de Setembro de 1986, sob o No. P 36 32 037.4. ’ ’
    Lisboa, 18 de 5etembro de 1987.
    RESUMO wPR0CE550 PARA A PREPARAÇÃO POR ENGENHARIA GENÍTICA DE CALCITONINA DE SALMÃO'BEM COMO DE AGENTES PARA A REALIZAÇÃO DO REFERIDO PROCESSO»
    A invenção refere-se a um processo para a preparação de calcitonina I de salmão com uma glicina adicional C-terminal e de calcitonina I-carboxamida de salmão que compreende inserir um gene que codifica para o peptideo-glicina num plasmídeo de expressão, promover a respectiva expressão e eventualmente transformar o peptideo-glicina na respectiva carboxamida por via enzimática apresentando a estrutura do gene para o peptideo-glicina a sequência de ADN II
    TGC TCT AAC CTG TCG ACT TGC GTT CTT GGT AAG CTT TCT CAG GAA CTT A CG AG A TTG GAC AGC TGA A CG CAA GAA CCA TTC GAA AG A GTC CTT GAA CAT AAA CTG CAG ACC TAT CCG CGC ACT AAT ACC GGC TCT GGT ACC CCT GTA TTT GAC GTC TGG ATA GGC GCG TGA TTA TGG CCG AG A CCA TGG GGA GGT
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