NO851065L - Genteknologisk fremgangsmaate til fremstilling av human-gammainterferon og middel til gjennomfoering av denne fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for fremstilling

av human-gamma interferon, kjemisk syntetiserte gener,

som koder dette peptidet, såvel som egnede vektorkonstruk-sjoner og vertsorganismer for fremstilling av dette polypeptidet.

Gamma-interferonet (tidligere immuninterferon eller type II-interferon; her kort betegnet som IFN-y) ble oppdaget

i året 1965 av; F. Wheelock (Wheelock; Science 149 (1965), 310), som viste at IFN-y kan beskytte bestemte celler mot en virusinfeksjon. Menneskelig IFN-y (grunnkunnskap se W.E.Stewart, II, The INterferon System, Springer Verlag

(2. utg. 1981)), er et polypeptid av 146 aminosyrer (Gray

et al., Nature 295 (1982), 503), som fra naturens side er glykosylert. Glykoproteinet har en molekylvekt på ca. 63 000 - 73 000 (Pestka et al., J. Biol. Chem 258 (1983), 9706) og foreligger i sin funksjonelle form sannsynligvis som tetramer. Glykosyleringen av IFN-y er ikke nødvendig for dens funksjonalitet. Således reduserer glykosidase-behandlingen av IFN- ikke dets anti-virale aktivitet i humane firbroblast-cellekulturer (Keller et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 8010).

Videre er IFN-y i motsetning til alfa-interferoner og beta-interferon ustabil ved pH 2 og inaktiveres også ved varme (60°C) .

Utviklingen av human-IFN-y fra cellekulturer av menneskelige cellelinjer eller fra leukocyter (blodkonserver) er bare mulig med dårlig utbytte og lav produktrenhet. Det er derfor allerede foreslått genteknologiske fremgangsmåter for fremstilling av IFN-y-lignende polypeptider, eksempelvis i europeisk patentsøknad med offentliggjørelsesnr. 95 350 den kjemiske syntesen av et gen som koder for IFN- y, hvis innbygning i et hybrid plasmid, omdannelsen av E.coli og fremstillingen av et immunologisk aktivt polypeptid.

Human-IFN-Y har følgende peptidsekvens (Devos et al., Nucl. Acids Research 10 (1972) 2487):

Foreliggende oppfinnelse gjelder den genteknologiske fremstillingen av human-IFN-Y ved hjelp av et kjemisk synteti-sert gen, som er kjennetegnet vec. DNA-sekvensen I (bilag). • Den genetiske koden er som bekjent "utartet", dvs. at bare for to aminosyrer kodes en enkelt nukleotid-sekvens, mens de gjenværende 18 genetisk koderbare aminosyrene er å til-forordne 2 til 6 tripletter. Av de herved gitte variasjons-mulighetene, gjør dessuten vertscellene fra forskjellige arter ikke alltid den samme bruk. For syntesen av genene består således et uoversiktlig mangfold av kodemuligheter. Det ble nu funnet, at DNA-sekvensen I (bilag), koder for

den totale aminosyresekvens 1-14 6, såvel scrn at de DNA-delsekvenser som benyttes for syntesen av sekvensen I,

er sårlig fordelaktig for den genteknologiske syntesen av IFN-Y- Ved 5'-enden av den koderende strengen av DNA-sekvens I ansluttes en "overhengende" DNA-sekvens, eksempelvis tilsvarende restriksjons endonuklease Eco RI, ved 3<1->enden av den koderende strengen derimot en enkeltstrengig,

overhengende sekvens som fordelaktig er forskjellig fra den med 5'-enden, eksempelvis tilsvarende restriksjonsenzymet Sal I. Disse to forskjellige erkjennelsessekvenser garanterer innføringen av DNA i plasmider i den ønskede orientering. Det kan også velges like overhengende sekvenser og senere foretas en tilsvarende seleksjon.

Mellom disse erkjennelsessekvenser og kodene for aminosyre-rekkefølgen, befinner aminosyren metionin seg ved 5<1->enden av den koderende strengen i koden. Alternativt til dette kan det stå en presekvens (også kalt singla- eller "leder"-sekvens) av et bakterielt elelr forøvrig vertsegent protein (oversiktsartikkel:Perlman og Halvorsen; J. Mol. Biol. 167 (1983), 391), som eksempelvis bevirker sekresjon av det ønskede polypeptid fra cytoplasmaet og ved denne eks-kresjonsprosess avspaltes fra en naturlig forekommende signal-peptidase i vertscellen. I tilslutning til triplet 146, som koder for glutamin, følger så et stopp-kodon, eller fortrinnsvis to stopp-tripletter.

To interne, singulære snittsteder for restriksjonsenzymene Barn HI henholdsvis Hind III (i kodon 31 henholdsvis 94

i den koderende strengen eller i kodon 32 henholdsvis 95

i den ikke-koderende strengen), muliggjør subkloning av tre genefragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III (se DNA-sekvens II), som kan innbygges i godt undersøkte klonevektorer, som f.eks. pBR 322 eller pUC 8. I tillegg ble det innenfor strukturgenet innebygget en rekke andre, signulære erkjennelsessekvenser som restriksjonsenzymer, som på den ene siden skaffer en tilgang til delsekvenser av IFN- og på den annen side tillater gjennomføring av variasjoner:

Genet, som består av DNA-sekvens I, kodonet for metionin

og de ovenstående ender kan oppbygges av 34 oligonukleotider med en lengde på 18 til 33 nukleotider (se DNA-sekvens II), idet disse først syntetiseres kjemisk og deretter sammenknyttes enzymatisk over "klebrige ender" av 4-6 nukleotider .

Ved DNA-sekvens I ble det videre tatt hensyn til, at ved

de aminosyrer, som kan tilforordnes flere kodoner, er disse ikke likeverdige, men viser snarere forskjellige preferan-ser i den aktuelle vertscellen, som E.coli. Videre ble palindomiske sekvenser redusert til et minstemål.

Genestrukturen til DNA-sekvens I er således lett tilgjenge-lig fra relativt små byggstener, muliggjør subkloning av 3 genfragmenter i godt kjente vektorer og muliggjør deres kombinasjon til totalgen såvel som eventuelle forandringer av dette.

Innbygningen av de syntetiske genene henholdsvis genfragmentene i kloningsvektorer, eksempelvis i de handelsvanlige plasmider pUC 8 og pBR 322, henholdsvis andre ålment til-gjengelige plasmider som ptac 11 og pKK 177,3, foregår på i og for seg kjent måte. De kjemisk syntetiserte genene kan på forhånd også utstyres med egnede kjemisk syntetiserte kontrollregioner, som muliggjør en fremstilling av protein-ene. Det skal i denne henseende vises til læreboken til Maniatis (Molecular CLoning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, 1982). Omdannelsen av de således oppnådde hybridplasmidene i egnede vertsorganismer, fordelaktig E. coli, er likeledes i og for seg kjent, og inngående beskrevet i den foran nevnte lærebok. Utvinningen av det fremstilte proteinet og dets rensing, er likeledes beskrevet, (J.A. Georgiades, Texas Reports in Biology and Medicine el (1981) 179; Came og Carter (utgivere), "Interferons and Their Applications", Springer-Verlag 1984).

Genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III, som kan oppnås ifølge oppfinnelsen, de dermed oppnådde hybrid plasmidene og de omdannede vertsorganismene er nye og gjenstand for oppfinnelsen. Det samme gjelder for de nye DNA-sekvenser som er omdannet fra DNA-sekvens I. Andre utførelsesformer av oppfinnelsen er angitt i patentkravene.

I de følgende eksemplene forklares ennå noen utførelsesfor-mer av oppfinnelsen, hvorav det for fagmannen fremgår en rekke mulige omdannelser og kombinasjoner. Prosentangiv-elser beregnes hermed på vekten, om ikke annet er angitt.

Eksempler.

1. Kjemisk syntese av et enkeltstrenget oligonukleotid.

Med eksempel i genebyggsten Ia, som omfatter nukleotidene 1-23 i den koderende strengen, forklares syntesen av gen-byggstenene. Ifølge kjente metoder (M.J.Gait et al., Nucleic Acids Res. 8 )1980) 1081-1096)), bindes det nukleocid som står ved 3'-enden, i foreliggende tilfellet altså cytidin (nukleotid nr. 23), kovalent over 3'-hydroksyfunksjonen på silicagel ( (R)Fractosil, firma Merck). For å oppnå dette, omsettes først silicagelen under avspaltning av etanol med 3-(trietoksysilyl)-propylamin, hvorved det oppstår en Si-O-Si-binding. Cytidinet omsettes som N-4benzoyl-31 - 0-succinoyl-5<1->dimetoksytrietyleter i nærvær av paranitro-fenol og N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid med den modifiserte bærer, hvorved den frie karboksygruppen i succinoylgruppen acylerer aminoresten i propylaminogruppen.

I de følgende syntesetrinnene innsettes basebestanddelene som 5<1->O-dimetoksytrityl-nuklosid-3<1->fosforsyrling monometyl-ester, dialkylamid eller -klorid, hvorved adeninet foreligger som N 6 -forbindelser, cytosinet som N 4-forbindelse, guaninet som N 2-forbindelse og tyminet som ikke inneholder noen aminogruppe, uten beskyttelsesgruppe.

50 mg av den polymere bæreren, som bundet inneholder 2

(imol cytosin, behandles i rekkefølge med følgende reagenser:

a) Nitrometan,

b) mettet sinkbromidløsning i nitrometan med 1% vann,

c) metanol,

d) tetrahydrofuran,

e) acetonitril,

f) 40 |imol av det tilsvarende nukleosidf osf it og 200 (imol tetrazol i 0,5 mlVannfri acetonitril (5 min.), g) 20% acetanhydrid i tetrahydrofuran med 40% lutidin 10% dimetylaminopyridin (2 min.),

h) tetrahydrofuran,

i) tetrahydrofuran med 20% vann og 40% lutidin,

j) 3% jod i kollidin/vann/tetrahydrofuran i volumforholdet 5:4:1,

k) tetrahydrofuran og

1) metanol.

Under "fosfit" forstås herved desoksyribose-3<1->monofosforsyr-ling-monometylester, hvorved den tredje valensen er mettet med klor eller en tertiær aminogruppe, eksempelvis en morfo-linorest. Utbyttene av de enkelte syntesetrinnene kan eventuelt bestemmes etter detrityleringsreaksjon b) spek-trofotometrisk ved måling av absorbsjonen av dlmetoksytrityl-kationet ved en bølgelengde på 496 nm.

Etter'avsluttet syntese av oligonukleotidet, avspaltes metylfosfat beskyttelsesgruppene i oligomeren ved hjelp av p-tiokresol og trietylamin.

Deretter fraskilles oligonukleotidet fra den faste bæreren ved 3-timers behandling med ammoniakk. En 2- til 3-dagers behandling av oligomerene med konsentrert ammoniakk avspal-ter kvantitativt amino beskyttelsesgruppene fra basene.

Det således oppnådde råproduktet renses ved høytrykks væske-kromatografi (eller ved polyakrylamid-gel elektroforese. Helt tilsvarende syntetiseres også de øvrige gel-byggstenene Ib-IIIl, hvis nukleotidrekkefølge fremgår fra DNA-sekvens

II.

2. Enzymatisk sammenknytning av de enkeltstrengede oligonukleotidene til genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III.

For fosforylering av oligonukleotidet ved 5'-enden, ble

1 nmol av hver av oligonukleotidene Ia og Ib behandlet med 5 nmol adenosintrifosfat med fire enheter T4-polynukleo-tid-kinase i 20^1 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,6), 10 mM magnesiumklorid og 10 mM ditiotreitol (DTT) i 30 minutter ved 37°C (C.C.Richardson, Progress i Nucl. Acids Res. 2

(1972) 825). Enzymet inaktiveres ved 5 minutters oppvarming til 95°C. Deretter hybridiseres oligonukleotidene Ia og Ib mot hver-andre, idet de oppvarmes i vandig løsning i 2 minutter til 95°C og deretter avkjøles langsomt til 5°C.

Analogt fosforyleres oligonukleotidene Ic og id, le og

If, lg og Ih såvel som li og Ij, og hybridiseres parvis. For subfragmentet IFN-II fosforyleres oligonukleotidene

Ila med Ilb osv., til Ilk med III og for subfragment IFN-III oligomerene Illa med Illb osv. til Ulk med IIIl og hybridiseres parvis.

De således oppnådde fem oligonukleotidparene for genfragmentet IFN-I henholdsvis de seks oligonukleotiddparene for genfragmentene IFN-II og IFN-III ligeres alle som følger: De dobbeltstrengede nukleotidene forenes og ligeres i hver 40 (il 50 mM Tris-HCl-buf f er, 20 mM magnesiumklorid, og

10 mM DTT med hjelp av 100 enheter T4-DNA-lgase ved 15°C

i løpet av 16 timer. Rensingen av genfragmentene IFN-

I til IFN-III foregår ved gelelektroforese på en 10%-ig polyakrylamid-gel (uten urinstofftilsetning, 20.40 cm, 1 mm tykkelse), hvorved som markeringssubstans tjente ØX 174 DNA (Fa. BRL), snittet med Hinf I, eller pBR 322, snittet med Hae III. 3. Fremstilling av hybridplasmider, som inneholder genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III.

a) Innbygning av genfragmentet IFN-I i pBR 322.

Det handelsvanlige plasmid pBR 322 åpnes på kjent måte

med resetriksjonsehdonukleasene Eco RI og Ban HI etter angivelse av produsenten. Fordøyelsessatsen oppdeles på en 5%-ig polyakrylamidgel ved elektroforese på kjent måte og bruddstykkene gjøres siktbare ved farging med etidiumbromid eller ved radioaktiv markering ("Nick-Translation" etter Maniatis, se ovenfor). Plasmidbåndene uttas deretter fra akrylamidgelen og fraskilles elektro-foretisk fra polyakrylamid. Oppdelingen av fordøyelses-

satsen kan også foregå på 2%-ig lavtsmeltende agarosegeler (som beskrevet i eksempel 5a).

i ug plasmid ligeres så med 10 ng genfragment (IFN-I over natten ved 16°C. Hybrid plasmidet ifølge fig.

1 oppnås.

b) Innbygning av genfragmentet IFN-II i pUC 8 analogt med a) oppdeles det handelsvanlige plasmid pUC 8 med

Barn HI og Hind III og ligeres med benfragmentet IFN-II. Hybrid plasmidet ifølge fig. 2 oppnås.

c) Innbygning av genfragmentet IFN-II i pUC 8 analogt med a) oppdeles plasmid pUC 8 med Hind III og Sal

I, og ligeres med genfragment IFN-III. Hybridplasmidet ifølge fig. 3 oppnås. 4. Syntese av det komplette gen og innbygning i et plasmid.

a) Omdannelse og forstørrelse.

De således oppnådde hybrid plasmider omdannes i E.coli.

For å oppnå dette, gjøres stammen E. coli K 12 kompe-tent ved behandling med en 70 mM kalsiumkloridløsning og tilsettes suspensjonen av hybrid plasmidet i 10

mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), som er 70 mM av kalsiumklo-rid. De omdannede stammene seleksjoneres som vanlig under utnyttelse av de antibiotika-resistenser, hhv. -følsomheter som er formidlet ved plasmidet og hybrid-vektorene forstørres. Etter avlivning av cellene isoleres hybridplasmidene, oppdeles med de opprinnelig an-vendte restriksjonsenzymene og genfragmentene IFN-I, IFN-II og IFN-III isoleres ved gel-elektroforese.

b) Sammenknytning av genfragmentene.

De subfragmenter IFN-I, IFN-II og IFN-III som er oppnådd

ved forstørrelsen, sammenknyttes enzymatisk som beskrevet i eksempel 2, og det således oppnådde syntetiske

gen med DNA-sekvens I innføres i kloningsvektoren pUC 8. Det oppnås et hybrid plasmid iflg. fig. 4. 5. Konstruksjon av hybrid plasmider for uttrykk av DNA-sekvens I.

a) Innbygning i pKK 177,3.

Uttrykksplasmidet pKK 177,3 (plasmid ptac 11, Amman

et al., Gene 25 (1983) 167), ved hvilken det i Eco RI-erkjennelsesstedet syntetisk innebygges en sekvens, som inneholder et Sal-I-snittsted), åpnes med restriksjonsenzymene Eco RI og Sal I. Fra plasmidet ifølge fig. 4 utsnittes innføring I med restriksjonsenzymene Eco RI og Sal I.

Innføring I tilsettes til 2%-ig, lavt-smeltende agarose, skilles fra plasmid-DNA og innføringen gjenvinnes ved oppløsning av gelen ved forhøyet temperatur (etter angivelse av produsenten). Ved ligasjon av det oppsnit-tede plasmidet pKK 177,3 med Gel I oppnås et hybrid plasmid, ved hvilket innføringen er innsjaltet foran et uttrykks- hhv. reguleringsområde.

Etter tilsetning av en egnet induktor som Isopropyl-B-tiogalaktopyranosid (IPTG) dannes et mRNA, som fører til fremstilling av metionyl-polypeptidet tilsvarende DNA-sekvens I.

b) Innbygning i pMX 2.

Uttrykksplasmidet pMX2 består av et pUC-8-plasmid

som er forkortet med 21 nukleotider og fremstilles på følgende måte: pUC 8 åpnes med restriksjons endonuklease Eco RI og behandles deretter med eksonuklease Bal 31 under beting-elser, som tillater avspaltning av ca. 20 nukleotider på begge sider av Eco RI-snittstedet (Maniatis, se

ovenfor). Deretter oppfylles eventuelt overstående ender av det således behandlede plasmidet med Klenow-DNA-polymerase, plasmidet ettersnittes med restriksjons-endonuklease Hind III og plasmidet renses over 1%-ig lavt-smeltende agarosegeler etter oppgaver av produsenten. I plasmidet gjeninnføres den polyforbinder som opprinnelig var tilstede i pUC 8 og som var begrenset ved restriksjonsenzymsnittende Eco RI og Hind III,

og som ble ødelagt under de foran beskrevne manipula-sjonene. For å oppnå dette, åpnes pUC 8 med restriksjonsenzymet Eco RI og de overstående endene oppfylles med Klenow-DNA-polymerase under anvendelse av 32p-markerte nukleocidtrifosfater. Polyforbinderen utsnittes deretter fra plasmidet med restriksjonsenzymet Hind III og fraskilles fra plasmidet ved elektroforese på 10% akrylamid-geler. Etter identifikasjon av polyfor-binderbåndet ved hjelp av en autoradiografi, befries polyforbinderen fra akrylamid-rester ved elektroeluering og ligeres i det forkortede pUC 8-plasmid. Det således konstruerte plasmid pMX 2 åpnes deretter med restriksjonsenzymene Eco RI og Sal I og ligeres i uttrykksplasmidet pMX 2 med Y-interferon-gel I, som i endene oppviser Eco RI- og Sal I-erkjennelsessekvenser (fig. 5). Kloner som oppviser en høy interferontiter, identifiseres så på grunnlag av den biologiske aktivitets-bestemmelsen.

6. Omdannelse av hybrid plasmider.

Kompetente E.coli-celler omdannes med 0,1 til 1 ug

av hybridplasmider, som inneholder sekvens I, og plate-res på agarplater som inneholder ampicillin. Deretter kan kloner, som inneholder den korrekt intergrerte y-interferongen-sekvens i de tilsvarende plasmider, identifiseres ved DNA-hurtigopparbeidelse (Maniatis,

se ovenfor).

7. Fremstilling av polypeptider som oppviser -interferon-aktivitet.

Etter omdannelse av de nevnte hybrid plasmider til E.coli fremkommer et polypeptid, som foruten y-interferon-aminosyresekvensen i tillegg bærer en ytterligere metionylgruppe på aminoenden.

8. Opparbeidelse og rensing.

De bakteriestammer som er dyrket til ønsket optisk tetthet, inkuberes med en egnet induktor, eksempelvis IPTG, tilstrekkelig lenge, eksempelvis i 2timer. Deretter avlives cellene med 0,1% kresol og 0,1 mM benzylsul-fonylfluorid. Etter sentrifugering eller filtrering opptas cellemassen i en bufferløsning (50 mM tris,

50 mM EDTA, pH 7,5) og oppsluttes mekanisk, eksempelvis

(R)

med en French-presse, hhv. ( R ) Dyno-Muhle (Fa. Willy Bachofor, Basel), hvorpå de uløselige bestanddelene avsentrifugeres. Fra den ovenstående væske renses det protein som inneholder y-interferon-aktiviteten ved hjelp av vanlige metoder. Egnet er ioneveksler-, adsorbsjons-, gelfiltrerings-søyler eller affinitets-kromatografi på anti-legemesøyler. Ved natriumdodecyl-sulfat-akrylamidgel- eller HPLC-analyse, kontrolleres anrikningen og renheten av produktet.

For biologisk karakterisering av produktet på -inter-feronaktivitet, benyttes på vanlig måte indikatorcelle-linjer, som f.eks. Vero-celler, og inkuberes med for-tynnelsesrekker av interferon-holdige bakterieekstrakter. Deretter overprøves med infeksjon med en virus som

VSV (Vesicular Stomatitis Virus), til hvilket fortynnel-sestrinn ved Vero-cellene det kan oppnås en anti-viral status med bakterieekstraktet. Utøvelsen kan foregå mikroskopisk eller ved bestemmelse av nøytral-rød opptak.

y y-interferon-aktiviteten kan også måles med et handels-vanlig radioimmunoforsøk (Celltech Ltd.), som er opp-bygget på et monoklonalt antilegeme mot y-interferon.

Claims (3)

1. Genteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av human-gammainterferon, karakterisert ved at det anvendes et syntetisk gen, som inneholder DNA-sekvens I.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det i tilslutning til genet følger to stopp-kodoner.

3. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 eller 2, karakterisert ved at E.coli tjener som vertsorganisme.