JPH0632625B2 - ウナギカルシトニン誘導体遺伝子 - Google Patents

ウナギカルシトニン誘導体遺伝子

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JPH0632625B2
JPH0632625B2 JP60113254A JP11325485A JPH0632625B2 JP H0632625 B2 JPH0632625 B2 JP H0632625B2 JP 60113254 A JP60113254 A JP 60113254A JP 11325485 A JP11325485 A JP 11325485A JP H0632625 B2 JPH0632625 B2 JP H0632625B2
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eel calcitonin
dna
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Central Glass Co Ltd
Hodogaya Chemical Co Ltd
Sagami Chemical Research Institute
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ウナギカルシトニン誘導体を製造するため
の遺伝子系に関し、さらに詳しくは、ウナギカルシトニ
ン誘導体をコードする遺伝子及びその製造方法、ウナギ
カルシトニン誘導体と他の蛋白質との融合蛋白質をコー
ドする遺伝子、ウナギカルシトニン誘導体をコードする
遺伝子を含有するプラスミド、並びにこのプラスミドに
より形質転換された大腸菌に関する。
〔従来の技術〕
カルシトニンは、Ｃ末端がアミド化された３２個のアミ
ノ酸からなるペプチドであり、高カルシウム血症、Page
t（ページェット）病について治療効果が認められてい
る。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨新生促
進作用も確認されており老人性の骨粗鬆症に対しても有
望視されている。現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウ
シ、ヒト、ラット、サケ、ウナギから分離され、それぞ
れ構造が明らかにされている。
由来する生物種間におけるカルシトニンの血中での生理
活性を比較すると魚類の鰓後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約３０倍の比活性を
示し、効力の持続時間も長い。ウナギカルシトニンは特
に、活性が高いのみならず、イン−ビトロにおける血清
中又は肝、腎等の臓器の抽出液中での安定性が極めて高
い。このため、ウナギカルシトニンは、医薬として使用
する場合に特に有利であると考えられる。
現在治療用のカルシトニンとして市販されているもの
は、ブタ、サケ、ウナギのカルシトニンであるが、これ
らは生体から抽出したりまたは化学的に合成することに
よって得られている。しかしその生産量はわずかであり
また高価である。従ってウナギカルシトニンを経済的、
且つ大量に製造することができる新規な方法の開発が強
く望まれている。
このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用
いる方法が最も好ましい。特開昭５８−203953にはヒト
カルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌におけるその発
現が記載されている。特表昭58−501121にはヒトカルシ
トニンの前駆体遺伝子が記載されている。特表昭59−50
1095にはヒトカルシトニンの化学合成遺伝子とその発現
について記載されている。また、特表昭59−501243には
天然由来ヒトカルシトニン遺伝子及びその発現について
記載されている。
しかしながら、ウナギカルシトニン及びその誘導体の遺
伝子の合成及び大腸菌における発現についてはまだ記載
されていない。
〔発明が解決しようとする問題点〕
この発明は、前記のごとく最も有望視されているウナギ
カルシトニンを経済的、且つ大量に製造するための新規
な方法を開発する事を最終目的とし、その前駆体として
も使用できる、Ｃ末端にグリシンを有するウナギカルシ
トニン（ウナギカルシトニン誘導体と称する）の遺伝子
系を提供する事を目的とする。
〔問題点を解決するための手段〕 前記の目的は、次のアミノ酸配列： Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｃ
ｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈ
ｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ で表わされるウナギカルシトニン誘導体をコードする遺
伝子及びその製造方法；ウナギカルシトニン誘導体と他
の蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子；ウナギカ
ルシトニン誘導体をコードする遺伝子を含有するプラス
ミド；及びこのプラスミドにより形質転換されている大
腸菌を提供することにより解決される。
〔具体的な説明〕
(1)カルシトニン誘導体構造遺伝子とその合成 この発明に係るウナギカルシトニン誘導体は次のアミノ
酸配列： を有し、天然ウナギカルシトニンの３２個のアミノ酸の
Ｃ末端に追加のアミノ酸であるグリシンを有する。前記
配列中２６位、２７位及び２９位でカッコ内に示したア
ミノ酸はサケカルシトニン誘導体中のアミノ酸である。
すなわち、ウナギカルシトニン誘導体においてはサケカ
ルシトニン誘導体中の２６位のアミノ酸であるアスパラ
ギンがアスパラギン酸に、２７位のアミノ酸であるスレ
オニンがバリンに、そして２９位のアミノ酸であるセリ
ンがアラニンに置き換えられている。
上記のアミノ酸配列中には５個の反復するアミノ酸が存
在し、このようなペプチドをコードする構造遺伝子を化
学合成することは一般に困難である。（例えば、Ｊ．ウ
ィンダス等、ニュクレイック・アシズ・リサーチ(Nucle
ic Acids Research)，10,6639(1982)参照〕。しかしな
がら本発明者等はすでに特願昭59−170492号（特開昭61
-52288号公報）明細書に詳細に記載されている方法によ
りサケカルシトニン前駆体（誘導体）遺伝子を合成して
いる。従って、上記のごとく、サケカルシトニン誘導体
のアミノ酸配列と比べて３個のアミノ酸が異なるに過ぎ
ないウナギカルシトニン誘導体の遺伝子の合成は、すで
に合成されているサケカルシトニン誘導体遺伝子を、公
知の変異誘発法、例えばオリゴヌクレオチドプライマー
を用いる特異的塩基置換変異(Directed muta-tion)法に
より処理することにより行うのが有利である。
なお、前記特願昭59−170492号（特開昭61-52288号公
報）明細書に記載されている方法により合成された遺伝
子は次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＧＡ− ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ を有し、ＣＴ２と称される。この遺伝子ＣＴ２を含有す
るプラスミドをpSCT2と称し、このプラスミドを含有す
る大腸菌エシェリシャ・コリ(Escherichia coli)RR1/pS
CT2は微工研菌寄第7775号(FERM P-7775)として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。このプラス
ミドの作製方法は参考例１に詳細に記載する。
本発明においては、上記サケカルシトニン誘導体遺伝子
に特異的塩基置換変異をかけることにより、サケカルシ
トニン誘導体の第２６位、第２７位及び第２９位のアミ
ノ酸であるアスパラギン、スレオニン及びセリンのコド
ン、すなわちＡＡＧ、ＡＣＴ及びＴＣＴをそれぞれアス
パラギン酸、バリン及びアラニンのコドン、例えばＧＡ
Ｃ、ＧＴＴ、ＧＣＴに変え、ウナギカルシトニン誘導体
の遺伝子を得る。これらのコドンは塩基配列中で相互に
近接しているため、１つのプライマーオリゴヌクレオチ
ド、例えば次の配列： ５′TGGTCGTGGTTGCAGCCATGCGC３′ Ala VarAsp を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて前記の変異を
行うことができる。
この変異処理は例えば次の様にして行われる。すなわ
ち、前記プラスミドpSCT2を制限酵素HpaＩ及びSalＩで
切断して0.6kbpの断片を得る。他方、ファージＭ13mp９
の２本鎖ＤＮＡをSmaＩ及びSa1Ｉで切断することにより
2.7kbpの断片を得る。これらをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
って連結し、これを用いて大腸菌ＪＭ103を形質転換
し、この形質転換体を培養することにより１本鎖組換体
ファージＤＮＡを得る。こうして得られた、サケカルシ
トニン誘導体遺伝子のアンチコーディング鎖（負鎖）を
含有する１本鎖ＤＮＡを得る。この組換体ファージをCT
M31と称する。このファージ１本鎖ＤＮＡを鋳形として
前記プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを形成した後これ
を精製し、これを用いて大腸菌ＪＭ103を形質転換す
る。次に、ファージプラークを、例えば32Ｐで標識され
た次の合成オリゴヌクレオチドプローブ： ５′TCGTGGTTGCAGCCA３′ を用いてスクリーニングし、変異体ファージを得る。こ
の塩基配列を決定し、目的とする変異が導入された遺伝
子（ウナギカルシトニン誘導体遺伝子）を含有するファ
ージを選択し、これをCTM41と称する。
こうして得られた、ウナギカルシトニン誘導体をコード
する遺伝子は次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ を有する。
なお、サケカルシトニン誘導体遺伝子（ファージCTM31
の部分）、ウナギカルシトニン誘導体遺伝子（ファージ
CTM41の部分）、プライマーオリゴヌクレオチド、及び
プローブオリゴヌクレオチドのそれぞれの塩基配列を、
サケカルシトニン誘導体及びウナギカルシトニン誘導体
のアミノ酸配列と共に第１図に示す。
(2)融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片 一般にカルシトニンのような低分子量ペプチドを大腸菌
で生産するには、まず他の蛋白質と融合した安定な高分
子量蛋白質として採取し、これをイン−ビトロで切断し
て所望の低分子量ペプチドを得ることが得策であると言
われている。このような融合蛋白質を構成する蛋白質と
して、本発明のウナギカルシトニン誘導体の生産におい
ては精製の便利等の観点からメタピロカテカーゼ又はそ
の部分を用いるのが好ましい。また、融合蛋白質を採取
した後にこれを切断して目的とするカルシトニン誘導体
を得るために切断部位、すなわちカルシトニン誘導体の
第１アミノ酸とメタピロカテカーゼ蛋白質のＣ末端アミ
ノ酸の間にメチオニンを介在せしめるのが好ましい。
従って、本発明においては、この部分のＤＮＡ断片とし
て、例えばウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝
子及びメチオニンのコドンＡＴＧを介してその上流に位
置するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分からなる
ＤＮＡ断片を用いることができる。このメタピロカテカ
ーゼ遺伝子又はその部分は、高い翻訳効率を得るため、
メタピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列と、メタピロカテ
カーゼ構造遺伝子又はその部分とから成ることが好まし
い。
メタピロカテカーゼ構造遺伝子部分の大きさは広範囲に
変えることができる。
(3)発現プラスミド 本発明の発現プラスミドは、大腸菌プロモーター系、及
び前記融合蛋白質遺伝子をこの順序で含む大腸菌プラス
ミドである。プロモーター系として、例えば1acUV5系、
ＰＬ系、tac系等を使用することができる。
具体的な発現プラスミドの例として、例えば発現用プラ
スミドpTCCM1に前記ファージCTM41のウナギカルシトニ
ン誘導体遺伝子を挿入することにより得られる発現プラ
スミドpCTM4を挙げることができる。
プラスミドpTCCM1はtacプロモーター及びその下流にメ
タピロカテカーゼ遺伝子(C230)を含有するプラスミドで
あり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ(Esche
richia coli)RB791/pTCCM1がFERM P-7780として、そし
てJM103/pTCCM1がFERMP-7781として、それぞれ工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。
プラスミドpCTM4の作製に当っては、第２図（Ａ）に示
すように、ウナギカルシトニン誘導体遺伝子（図中ＣＴ
で示す）を含有するファージCTM41の２本鎖型をEcoRIで
消化することによりウナギカルシトニン遺伝子の０位の
メチオニンコドンより上流であってその近傍に位置する
EcoRI部位を切断し、フィル−インによって平滑化し、
さらにウナギカルシトニン誘導体遺伝子の下流に存在す
るSalＩ部位をSalＩにより切断する。次にウナギカルシ
トニン誘導体遺伝子を含む590bpの小断片を単離する。
他方、プラスミドpTCCM1をAvaＩで消化することにより
該プラスミド中のメタピロカテカーゼ遺伝子（図中C230
で示す）の中間に位置するAvaＩ部位を切断し、フィル
−インにより平滑化する。次に、メタピロカテカーゼ遺
伝子の下流に位置するSalＩ部位をSalＩにより切断し、
メタピロカテカーゼ遺伝子の下流部分が除去された2940
bpの大断片を単離する。
次に、これらの両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
し、これを用いて大腸菌ＪＭ103株を形質転換し、ウナ
ギカルシトニン誘導体遺伝子が適切に挿入されたプラス
ミドを含有するクローンをコロニーハイブリダイゼーシ
ョン、塩基配列の決定等により選択する。このようなプ
ラスミドの１つをpCTM４と称する。このプラスミド中の
ウナギカルシトニン誘導体遺伝子（CTM41由来）の上流
部とメタピロカテカーゼ遺伝子（pTCCM１由来）の下流
部との連結領域の塩基配列を第２図（Ｂ）に示す。
このプラスミドpCTM４はtacプロモーターの支配下にメ
タピロカテカーゼのアミノ酸及びその下流のウナギカル
シトニン誘導体の３３アミノ酸からなる融合蛋白質（合
計174アミノ酸）をコードする遺伝子を含有する。この
プラスミドを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ(Ecsch
erichia coli)JM103/pCTM4は、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第8239号(FERM P-8239)として寄
託されている。
(4)融合蛋白質の生産、単離及びウナギカルシトニン誘
導体の精製 前記の発現プラスミドを大腸菌に導入することにより融
合蛋白質生産性の大腸菌株を得ることができる。このた
めの宿主として、例えばRB791株、JM103株、W3110株、R
R1株、SM32株等を使用することができる。
培養は常法に従って、例えばＬＢ培地中で好気的条件下
で行う。目的プラスミドを含有する宿主を維持するた
め、培地中にはアンピシリンを例えば５０μｇ／ｍ程
度添加するのが好ましい。菌体濃度が所望濃度、例えば
500ｎｍにおける光学濃度0.3〜0.6に達したとき誘導剤
として、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド〔isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside；Ｉ
ＰＴＧと略す〕を、例えば最終濃度が１ｍＭとなるよう
に添加し、さらに数時間、例えば２〜８時間培養する。
培養終了後、遠心分離、濾過等の常法に従って菌体を分
離し、所望によりこの菌体を適当な緩衝液、例えばpH7.
5のリン酸カリウム緩衝液により洗浄する。次にこの菌
体を、リゾチーム処理、超音波処理等の常法に従って破
砕し、遠心分離により沈澱画分を回収する。所望により
この沈澱を例えばリン酸カリウム緩衝液に再懸濁し再度
遠心分離して沈澱を回収することにより洗浄する。
このような処理により大部分の目的融合蛋白質が沈澱画
分中に回収され夾雑蛋白質が上清画分中に溶存し、除去
される。このような簡単な操作によって目的とする融合
蛋白質を夾雑蛋白質から分離することができることが、
ウナギカルシトニン誘導体をメタピロカテカーゼとの融
合蛋白質として発現させるこの発明の大きな特徴の１つ
である。
次に、こうして得られた不溶性画分をさらに精製するた
め、塩酸グアニジン水溶液に溶解し、この溶液を透析し
て塩酸グアニジンを除去することにより融合蛋白質を沈
澱せしめ、遠心分離等の方法により回収する。所望によ
り、この沈澱を塩酸グアニジン溶液に再溶解し、クロマ
トグラフィーによりさらに精製することができる。
次に、このようにして回収した融合蛋白質を、そのメチ
オニン部分において常法に従ってCNBrにより切断し、目
的とするウナギカルシトニン誘導体を遊離せしめる。
最後に、このウナギカルシトニン誘導体を、常法に従っ
て精製する。この精製においては、例えばＣ１８カラム
クロマトグラフィー、TSK G2000SWカラムクロマトグラ
フィー等が適当である。
(5)精製されたウナギカルシトニン誘導体の分析 アミノ酸分析の結果を次の表に示す。
表中Glyの理論値はＣ末端にGlyを有するものとした場合
の値である。本発明により得られたペプチドのアミノ酸
組成は文献記載のウナギカルシトニンに残基のグリシン
が付加したもののそれとよく一致した。
またアミノ酸シーケンサーによりアミノ酸配列の決定を
行ったところ、そのアミノ酸配列が予想されたウナギカ
ルシトニン誘導体のそれと同一であることが確認され
た。
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例1.Ｍ１３ファージを用いる特異的塩基置換変異の
導入（ウナギカルシトニン誘導体遺伝子の作製）（第１
図） １）１本鎖鋳型ＤＮＡの調製 サケカルシトニン誘導体の遺伝子を有するプラスミドpS
CT２からのサケカルシトニン誘導体の遺伝子を含むHpa
Ｉ−SalＩ0.6kbpのＤＮＡ断片0.5pmolと、Ｍ13ファージ
ｍｐ９の２本鎖ＤＮＡからのSmaＩ−SalＩ2.7kbpＤＮＡ
断片0.5pmolを混合し、６６ｍＭTris-Hcl(pH7.5)、５ｍ
ＭMgcl2、５ｍＭＤＴＴ及び１ｍＭＡＴＰ含有する溶液
２０μ中で100ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て１２℃にて１６時間連結反応を行った。反応後、反応
液を用いてメッシング等の方法〔メッシング等、メソズ
・イン・エンチモロジー(Methods in Enzymology)101,2
0-78,1983〕に従って大腸菌ＪＭ103を形質転換し、0.02
%X-gal及び１ｍＭIPTGを含有する軟寒天と共にプレート
し、３７℃にて一晩培養した。組換体によって形成され
た白いプラークより一本鎖鋳型ＤＮＡを調製した。すな
わち、白いプラークをつまようじの先端で釣り、大腸菌
ＪＭ103が生育している1.5ｍの２×YT培養液（1.6％
バクトトリプトン、１％酵母エキストラクト及び0.5％N
acl）中に懸濁して３７℃にて５時間培養し、そして培
養液上清から、ポリエチレングリコール沈澱、フェノー
ル処理及びエタノール沈澱によって１本鎖組換体ファー
ジＤＮＡを回収した。
得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型としてメッシングらの方法
（前掲）に従ってジデオキシ法により塩基配列を決定
し、クローニングされた１本鎖ＤＮＡの配列を確認し
た。こうしてサケカルシトニン誘導体の遺伝子のアンチ
コーディング鎖を含む１本鎖ＤＮＡが得られた。この組
換体ファージをCTM31と命名した。
２）オリゴヌクレオチドをプライマーとする二本鎖ＤＮ
Ａの合成 上記のようにしてえられたCTM31の１本鎖ＤＮＡを鋳型
として用い、合成オリゴヌクレオチド： ５′TGGTCGTGGTTGCAGCCATGCGC３′ をプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼKlenow断片に
よる修復反応を行った。すなわち、鋳型１本鎖ＤＮＡ0.
5pmoleに５′末端を燐酸化したプライマー２pmoleを加
え、そして７ｍＭTris-Hcl(pH7.5)、0.1ｍＭEDTA、２０
ｍＭNacl及び７ｍＭMgCl2を含有する溶液１０μ中で
６０℃にて２０分間保持し、続いて２３℃にて２０分間
保持した。さらに、この反応混合物に、dATP、dGTP、dT
TP、及びdCTPをそれぞれ0.5ｍＭになるように加え、全
体を２０μとしてＤＮＡポリメラーゼKlenow断片２ユ
ニットを加え、そして２３℃にて２０分間インキュベー
トした。続いて、１０ｍＭＡＴＰを１μ及びＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ１ユニットを加え、１２℃にて一晩インキュ
ベートした。
３）アガロースゲル電気泳動による２本鎖ＤＮＡの分離 上記のようにして得られた２本鎖ＤＮＡからバックグラ
ウンドとなる未反応の１本鎖ＤＮＡを除去するために反
応溶液全量を２μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含
む0.8％のアガロースゲル電気泳動により分離した。目
的とする２本鎖ＤＮＡを確認したのち、その部分のゲル
片を切り出して透析チューブに入れ、８９ｍＭトリスホ
ウ酸、２ｍＭEDTA緩衝液を満たしシールした後、同緩衝
液中で５０Ｖの定電圧で１２時間電気泳動する事により
ゲル中のＤＮＡを溶出させた。次にＤＮＡを透析チュー
ブより取り出し凍結乾燥し、乾固物を100μの蒸留水
に溶解して、イオン交換ディスポーザブルカラムElutip
-d(Schleicher & Schuell)を用いて精製した。
４）大腸菌ＪＭ103の形質転換 上記２本鎖ＤＮＡ0.1pmoleを用いてメッシングの方法に
従い大腸菌ＪＭ103を形質転換した。
５）変異体の検索 上記のようにして得られたファージプラークについて、
合成オリゴヌクレオチド： ５′TCGTGGTTGCAGCCA３′ （32Ｐで標識したもの）をプローブとして用いて、プラ
ークハイブリダイゼーションによる変異体ファージのス
クリーニングを行った。すなわち、ベントン・デイビス
等の方法〔W.D.ベントン及びR.W.デイビス、サイエンス
(Science)196,180,1977〕に従って軟寒天培地からニト
ロセルロースフィルターにプラークを移し、真空中８０
℃にて２時間ベーキングした。このニトロセルロースフ
ィルターを６×ＳＳＣ、10×Denhardt溶液中で、32Ｐで
標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプローブとし
て２３℃にて１晩ハイブリダイゼーションを行った。次
に、このフィルターを６×ＳＳＣ中で４６℃にて洗浄
し、そしてオートラジオグラフィーを行い陽性シグナル
を示す変異体ファージプラークを単離した。
６）変異体ＤＮＡの塩基配列の決定 変異体ファージＤＮＡを鋳型としてジデオキシ法により
塩基配列を決定し、塩基置換変異が生じ、ウナギカルシ
トニン誘導体の遺伝子を有するファージを得た事を確認
した。この変異体ファージプラーク株をJM103/CTM41と
命名した。
実施例2. ファージCTM41の２本鎖ＤＮＡ１０pmoleを、１０ｍＭの
Tris-Cl(pH7.5)、0.7ｍＭのMgCl2、５ｍＭのNaCl及び0.
7ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む100μの緩衝
液中２０ユニットのEcoRIにより３７℃にて４時間消化
し、反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
し、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、沈澱を乾燥し
た。このＤＮＡを、５０ｍＭのTris-Cl(pH8.0)、７５ｍ
ＭのNaCl、１０ｍＭのMgCl2、５ｍＭのβ−メルカプト
エタノール、並びに0.25ｍＭずつのdATP、dGTP、dCTP、
dTTP及びＡＴＰを含有する100μの緩衝液中２０ユニ
ットのＤＮＡポリメラーゼKlenow断片により３７℃にて
２時間フィル−イン反応を行った。この反応抽出物をフ
ェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱せしめ、そして乾燥した。このＤＮＡを、１ｍ
ＭのTris-Cl(pH7.5)、0.7ｍＭのMgCl2、１５ｍＭのNaC
l、0.7ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び0.02ｍＭの
EDTAを含有する緩衝液100μ中８ユニットのSalＩによ
り３７℃にて２時間消化した。この反応液を、エチジウ
ムブロマイドを含有する1.2％のアガロースゲル上で電
気泳動分離し、ＤＮＡの小断片を含有するゲル部分を切
り取り、透析膜を用いる電気溶出法で目的とするＤＮＡ
断片を溶出した。溶出液からＤＮＡ断片をエタノールに
より沈澱せしめ、この沈澱を乾燥し、４０μの水に溶
解した。
プラスミドpTCCM1のＤＮＡ１０pmoleを、１ｍＭのTris-
Cl(pH7.4)、１ｍＭのMgCl2、５ｍＭのNaCl及び0.1ｍＭ
のEDTAを含有する緩衝液100μ中２０ユニットのAvaＩ
により３７℃にて４時間消化した。この反応混合物をフ
ェノール及びクロロホルムにより抽出し、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱せしめ、沈澱を乾燥した。この後CTM41Ｄ
ＮＡの処理と同様にしてフィル−イン反応、SalＩによ
る消化、及びＤＮＡ断片のゲル分離を行い、目的とする
断片を含む溶液４０μを得た。
前記のＤＮＡ断片を含有する溶液それぞれ５μずつ
を、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
Ｎ′−２−エタンスルホン酸(HEPES)(pH7.8)、７ｍＭの
MgCl2、１２ｍＭのジチオスレイトール及び0.4ｍＭのＡ
ＴＰを含有する緩衝液合計100μ中で、３０ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃にて２４時間連結処
理した。
この反応混合物１０μを用いて大腸菌ＪＭ103（凍結
保存してあったコンピテント細胞）を形質転換した。こ
うして処理された大腸菌コロニーについて、カルシトニ
ン誘導体構造遺伝子Ｕ３１フラグメント(GGGAAGTTGAGTC
AG)（参考例１を参照のこと）を用いてコロニーハイブ
リダイゼーションを行ったところ約６０％の頻度で陽性
コロニーが得られた。これらの陽性株について、発現試
験を行い、約19100ダルトンの蛋白質を発現する株を選
択した。これらの株からプラスミドＤＮＡを調製し、カ
ルシトニン誘導体構造遺伝子Ｌ−４１フラグメント(GTA
ATTCCTGACTCA)（参考例１を参照のこと）をプローブと
して用いてジデオキシシーケンシング法により塩基配列
を決定し、ウナギカルシトニン誘導体遺伝子が適切に挿
入されていることを確認した。このプラスミドをpCTM４
と称する。
このプラスミドは、tacプロモーターの支配下に、メタ
ピロカテカーゼとウナギカルシトニン誘導体との融合蛋
白質をコードする遺伝子を含む。
実施例3.ウナギカルシトニン誘導体の製造 (1)培養 プラスミドpCTM４を含有する大腸菌ＪＭ103株を５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍｌ中で、
３７℃にて１晩振とう培養した。次にこの培養液１０ｍ
ｌを１の同じ培地に接種し、６時間３７℃にて培養し
ＯＤ550が約0.5に達した時IPTGを最終濃度が１ｍＭにな
るように添加し、さらに６時間培養した。
(2)融合蛋白質の単離 前記のようにして得た培養液を6000rpmにて15分間遠心
分離することにより菌体を回収した。これに５０ｍｇの
リゾチームを添加して５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（pH7.5、10ｍＭのEDTAを含有）に懸濁して５０ｍｌと
し、０℃にて３０分間置き、さらに１５分間ずつ２回超
音波処理することにより破砕した。これを10,000rpmに
て30分間、４℃で遠心分離することにより上清（第３図
中Ｓ−１）と不溶性画分（第３図中Ｐ−１）とに分け
た。第３図に示すごとく、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において、大部分の蛋白質が不溶性画分に
存在した。この不溶性画分を５０ｍｌの上記と同じリン
酸緩衝液に再懸濁し、これを10,000rpmにて３０分間４
℃で遠心分離することにより上清（第３図中Ｓ−２）と
不溶性画分（第３図中Ｐ−２）とに分けた。第３図に示
すように約19100ダルトンの目的とする融合蛋白質を含
む蛋白質の多くが不溶性画分に存在した。この不溶性画
分を５０ｍｌの７Ｍ塩酸グアニジン水溶液に懸濁し、０
℃にて３０分間静置して融合蛋白質を可溶化した。この
可溶化画分には主として目的融合蛋白質が含まれていた
（第３図中ＳＰ−３）。これを8,000rpmにて１５分間遠
心分離して融合蛋白質を含む上清液を得た。この液を蒸
留水に対して透析して塩酸グアニジンを除去することに
より融合蛋白質を析出せしめた。この沈澱に約５０ｍｌ
の蒸留水を加えた後凍結乾燥し、約280ｍｇの淡黄色粉
末を得た。
(3)ウナギカルシトニン誘導体の単離 これに２０ｍｌの７０％蟻酸を加えさらに500ｍｇのCNB
rを加えて室温、暗所に一晩置くことにより融合蛋白質
を切断し、ウナギカルシトニン誘導体ペプチドをメタピ
ロカテカーゼ蛋白質から遊離せしめた。次にこの混合物
を水で希釈した後凍結乾燥し、約260ｍｇの白色粉末を
得た。
次にこの凍結乾燥粉末に２０ｍｌ0.1％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を加え、Ｃ１８カラムによりクロマトグラ
フ処理した。0.1％ＴＦＡ中10％〜50％CH3CNによる直線
グラジエント溶出を行って画分を分取した。この様子を
第４図に示す。採取した画分をRP-304カラムを用いる逆
相高速液体クロマトグラフィー（逆相HPLC）を用いて分
析し、サケカルシトニンＩ標品とほぼ同じリテンション
タイムを有する画分（第４図中矢印で示す）を分取し
た。次にこの画分をTSK-G2000SWを用いるゲル濾過HPLC
により0.05％ＴＦＡ中で精製した。この様子を第５図に
示す。サケカルシトニンＩ標品とほぼ同じ分子量を有す
る画分を分取し、半調製用RP-304カラムを用いる逆相HP
LCによりさらに２回精製し、サケカルシトニンＩ標品と
ほぼ同じ分子量を有する画分を分取した。この２回目の
逆相HPLCの様子を第６図に示す。このウナギカルシトニ
ン誘導体含有画分をRP304逆相HPLC及びTSK-G2000 SWゲ
ル濾過HPLCにより分析したところ、それぞれ第７図
（Ａ）及び（Ｂ）に示す通り、サケカルシトニンＩ標品
とほぼ同一の分子量を示す単一ピークが得られ、均一な
ウナギカルシトニン誘導体が得られたことが確認され
た。この均一な画分を凍結乾燥することにより200μｇ
のウナギカルシトニン誘導体の白色粉末が得られた。
参考例1.サケカルシトニン誘導体遺伝子の化学合成 第８図に本発明のサケカルシトニン誘導体遺伝子の配列
を示す。これらのオリゴヌクレオチドの化学合成は、ホ
スホトリエステル固相法を用いて行った。例えば、オリ
ゴヌクレオチドＬ−３１の完全に保護されたオリゴヌク
レオチドを合成するためには、４０ｍｇ（2.2μmol）の
シトシンヌクレオシドに１５ｍｇずつのＣＧ、ＡＡと、
１０ｍｇずつのＡＧ、ＣＣ、ＣＣ、ＴＴ、ＡＴのダイマ
ーユニットを順次反応させた。
一回の縮合操作を示せば、縮合には２０ｍｇの２，４，
16−トリメチルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド(MSNT)を用い350μの無水ピリジン中で室温１
時間反応した。反応後、固型物をピリジンで洗浄し、ジ
メチルアミノピリジンを触媒として用いて１０％の無水
酢酸ピリジン溶液中で室温３分間キャッピング反応を行
った。ピリジン、ジクロルメタン溶液でそれぞれ洗浄
後、３％ＴＣＡのジクロルメタン溶液１０ｍｌで固型物
を洗う事により５′末端の保護基であるジメトキシトリ
チル(DMTr)基を除去した。このあと、ジクロルメタン、
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で洗浄し、ピリジンと共
沸脱水を行う事によって反応容器中の水分を完全に除
き、次の回の縮合反応へと続ける。DMTr基の除去率によ
って算出した平均の縮合収率は９１％であった。
次に４０ｍｇのヌクレオシドレジンにより連続縮合反応
によって合成したＬ−３１の保護基を含むオリゴヌクオ
チドに対して、0.5Ｍのピリジンアルドキシムとテトラ
メチルグアニジン（ＴＭＧ）の５０％ジオキサン水溶液
を1.5ｍｌ加え、３０℃で２日間反応した。濃縮して溶
媒を回収した後、封管中で２２％アンモニアを含むピリ
ジン水溶液２ｍｌと５５℃で５時間反応した。
これらの反応により、ヌクレオシドとレジンとの結合が
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。
レジンを濾別により取り除き、減圧濃縮によってアンモ
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをＣ−１８ディスポーザブルカラムSe
ppak(Waters)にかけた。１５％の濃度のアセトニトリル
水溶液２０ｍｌをカラムに流した後、３０％のアセトニ
トリル水溶液２ｍｌをカラムに加えると目的物が溶離、
流出する。
溶離した画分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
DMTr基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によって酢
酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、3,000回転
で１０分間遠心する事によりオリゴヌクレオチドを沈下
させた。上清を除去した後、減圧によってエタノールを
除き、蒸留水100μに溶解した。
HPLCによる精製はμBondpakＣ−１８(Waters)カラムを
用いて0.1Ｍトリエチルアミンアセテート水溶液と、ア
セトニトリルの溶媒系で行った。アセトニトリル濃度を
１０％より開始し、１分毎に0.6％の勾配で６０分間上
昇させた。溶出は１分間あたり１ｍｌの流速で行い目的
とするピークのものをフラクションコレクター(Gilson)
で集めて凍結乾燥した。
３回にけて分取操作を行う事により、精製されたＬ−３
１のオリゴヌクレオチドを２１ＯＤ（260ｍμで測定）
得た。
同様にして、他のオリゴヌクレオチドも合成した。合成
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。オリゴヌクレオチドの
物理的性状として１次元ホモクロマトグラフィーにおけ
るＲｆ値を示す。
また半数のフラグメントに対しては２次元ホモクロマト
グラフィー法（たとえば、R.Bambara等、NAR1 331(197
4)参照）又はマクサム、ギルバート法（たとえば、A.Ma
xam等、メソズ・イン・エンチモロジー(Methods in Enz
ymology)65 499(1980)参照）によって純度と塩基配列を
確認した。
第９図に酵素反応によって作製したサブブロックを示
す。例えばサブブロック３−５を作製するためには、サ
ブブロックを構成する１０個のフラグメントそれぞれ10
0pｍｌを蒸留水で希釈して９μとし、１０μciのγ
〔３２ｐ〕ATP(3100ci/mmol)を加え、溶液を５０ｍＭTr
is塩酸、pH9.6、１０ｍＭMgCl2、２ｍＭスペルミン、10
0ｍＭKCl、１０ｍＭＤＴＴになる様に調整し、４単位の
ポリヌクレオチドキナーゼを加え全容積を１５μとし
た。３７℃で３０分間反応する事により５′末端を３２
ｐでラベルした。次にすべての５′末端をリン酸化する
ために１ｎmolのＡＴＰと１単位のポリヌクレオチドキ
ナーゼを加え３７℃で６０分間反応させた。
反応後１０個のフラグメントを混合し、Ｃ−18ディスポ
ーザブルカラムSeppak(Wsters)を用いて前述した方法で
精製した。溶離したＤＮＡ溶液を濃縮しエタノール沈澱
処理を行ってＤＮＡを沈下させた。上清を除去した後減
圧によってエタノールを除き乾固物を４０μのリガー
ゼ緩衝液（25ｍＭ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ンＮ′−２−エタンスルホン酸(HEPES)pH7.8、7.5ｍＭM
gCl2）に溶解した。この溶液を1.5ｍｌ容エッペンドル
フチューブに入れ、６５℃で１０分間、４２℃で３０分
間加熱した後、０℃において１０個のフラグメントを接
着させた。このＤＮＡ溶液を0.2ｍＭのＡＴＰ、６ｍＭ
のＤＴＴを含むリガーゼ緩衝溶液とし、Ｔ４リガーゼ８
単位を加え、全容量を５０μとし、１２℃で１６時間
反応させた。
反応溶液を一部取り出し１２％のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で検討した。ゲルは７Ｍ尿素を含んだものと
含まないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジ
オオートグラフィーを行い、デンシトメーター(Helena
Laboratories)を用いて反応物の組成を検討した。その
結果７８塩基と９３塩基に相当するＤＮＡが１５％と２
７％の割合で生成していた。同様にして他のサブブロッ
クを合成した。
合成収率は次の通りであった。
サブブロックを集合、連結してヌクレオチド配列の全体
を製造した。すなわち、サブブロック３−５と３−７の
リガーゼ反応終了後の反応液各４５μを1.5ｍｌ容エ
ッペンドルフチューブ内で混合し、６５℃で１０分間、
４２℃で３０分間加熱した後、０℃においてサブブロッ
クＤＮＡ相互を接着させた。このＤＮＡ溶液に新たに３
０ｎmolのＡＴＰと500ｎmolのＤＴＴを加えＴ４リガー
ゼ１２単位を加えて全量を100μとし１２℃で１６時
間反応させた。
反応物の組成を検討すると113塩基と115塩基の対合に相
当するＤＮＡが全体の２３％の割合で生成していた（第
１０図参照）。
次に上記の反応溶液全量を７Ｍ尿素を含む１２％のポリ
アクリルアミド電気泳動により分離した。ラジオオート
グラフィーにより目的のＤＮＡを確認したのち、その部
分のゲル片を切り出して透析チューブに入れ、８９ｍＭ
トリスホウ酸、２ｍＭEDTA緩衝液を満たしシールした
後、同緩衝液中で５０Ｖの定電圧で１２時間電気泳動す
る事によりゲル中のＤＮＡを溶出させた。次にＤＮＡを
透析チューブより取り出し凍結乾燥し、乾固物を100μ
の蒸留水に溶解して、イオン交換ディスポーザブルカ
ラムElutip-d(Schleicher & Schuell)を用いて精製し
た。
製造した全遺伝子はすべてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼとＡＴＰを用いて５′末端をリン酸化した。
プラスミドpHT2のHpaＩ−ClaI断片にHpaＩ、ClaIの制限
酵素認識配列が再生するようにサケカルシトニン遺伝子
を組み込んだ組み替えプラスミドを造成した（第１１図
参照）。
すなわち、pHT2の２０μｇを100μのClaI反応液（６
ｍＭTris塩酸、pH7.9、６ｍＭMgCl2、５０ｍＭNaCl）中
で制限酵素ClaIを１０単位加え３７℃６０分間反応を行
いエタノール沈澱処理によってＤＮＡを沈下させた。
このＤＮＡ沈澱を100μのHpaＩ反応液（10ｍＭTris塩
酸、pH7.5、７ｍＭMgCl2、100ｍＭKCl、７ｍＭ βメル
カプトエタノール）に溶解し制限酵素HpaＩを１５単位
加えて３７℃９０分間反応を行った。さらに反応液に、
大腸菌アルカリフォスファターゼ(BAP)0.08単位を加え
６５℃３０分間反応させて５′末端を脱リン酸化した。
反応液を100μのフェノールで洗浄したあと0.7％アガ
ロースゲル電気泳動(AGE)を行い、大きなＤＮＡ断片を
電気泳動法によって回収した。
このようにして得たpHT2のClaI−HpaＩ断片ＤＮＡ0.5ｐ
molと、５′末端にリン酸基を含むサケカルシトニン誘
導体遺伝子0.5ｐmolを、Ｔ４ＤＮＡライゲーション反応
液２０μ（２５ｍＭH EPES、pH7.8、7.5ｍＭMgCl2、
0.2ｍＭＡＴＰ、６ｍＭＤＴＴ）に溶解して、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ３単位と２０℃１６時間反応し、そのうちの
１０μを用いて大腸菌株ＲＲＩに形質転換させ100μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンに耐性の形質転換を選んだ。第
８図のサブブロック３−５と３−７を凍結した遺伝子の
形質転換株をRRI/pSCT2と命名した。
上記形質転換株のプラスミド中のサケカルシトニン誘導
体遺伝子の塩基配列は次のようにして分析した。
すなわち、pSCT2のプラスミドＤＮＡ１５μｇを１５単
位の制限酵素HpaＩを用いて切断し、大腸菌アルカリフ
ォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化した後γ−
〔32Ｐ〕ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて
５′末端を32Ｐラベルした。次に１５単位の制限酵素Ba
mHIを用いて分解後目的とするＤＮＡ断片を精製し、マ
クサム、ギルバート法により塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドは設計通りの塩基配列を有していた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、サケカルシトニン誘導体遺伝子の塩基配列及
びサケカルシトニン誘導体のアミノ酸配列、ウナギカル
シトニン誘導体遺伝子の塩基配列及びウナギカルシトニ
ン誘導体のアミノ酸配列、プライマーオリゴヌクレオチ
ド、並びにプロープオリゴヌクレオチドの関係を示す。 第２図（Ａ）はファージCTM41とプラスミドpTCCM1とか
らのプラスミドpCTM４の作製を示し、（Ｂ）はpTCCM1由
来ＤＮＡ断片とCTM41由来ＤＮＡ断片との連結部の塩基
配列を示す。 第３図は、プラスミドpCTM４を含有する大腸菌により生
産された融合蛋白質の精製過程を示す。 第４図はウナギカルシトニン誘導体のＣ１８カラムクロ
マトグラフィーによる精製の様子を示す。 第５図はＣ１８カラムからの溶出画分のTSK-ゲルG2000
SWカラムを用いるゲル濾過による精製の様子を示す。 第６図は、RP-304カラムを用いる逆相HPLCによる精製の
様子を示す。 第７図は、最終画分のRP304逆相HPLCによる分析の結果
（Ａ）及びKSK-G2000 SWゲルによる分析の結果（Ｂ）を
示す。 第８図は、サケカルシトニン誘導体遺伝子（構造遺伝子
及びその周辺部分を含む）の全体図である。 第９図はサケカルシトニン誘導体遺伝子の合成に使用す
るサブブロックの構成図であり、●印は酵素によるリン
酸基の付加を示す。 第１０図は、サブブロック３−５と３−７とからサケカ
ルシトニン誘導体遺伝子が生成することを示すオートラ
ジオグラム図である。 第１１図は、プラスミドpSCT２の作製を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/36 7306−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:46 (71)出願人 999999999 日産化学工業株式会社 東京都千代田区神田錦町３丁目７番地１ (71)出願人 999999999 東ソー株式会社 山口県新南陽市大字富田4560番地 (72)発明者 三木 鉄蔵 千葉県我孫子市新々田２―１―Ａ―908 (72)発明者 松本 礼子 神奈川県相模原市麻溝台2621 (72)発明者 成島 裕之 神奈川県相模原市西大沼４−４―１ (72)発明者 大森 宗樹 東京都豊島区雑司が谷２−５―９ (56)参考文献 特公 昭53−1806（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ から成るウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝
    子。
  2. 【請求項２】次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ から成るウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
    と他の蛋白質をコードする遺伝子とから成る融合蛋白質
    遺伝子。
  3. 【請求項３】前記ウナギカルシトニン誘導体をコードす
    る遺伝子、及びメチオニンのコドンATGを介してその上
    流に位置するメタピロカテカーゼ遺伝子又はその部分か
    ら成る特許請求の範囲第２項記載の遺伝子。
  4. 【請求項４】次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ から成るウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
    を含有するプラスミド。
  5. 【請求項５】大腸菌プロモーター系、メタピロカテカー
    ゼ遺伝子又はその部分、及び前記ウナギカルシトニン誘
    導体をコードする遺伝子をこの順序で含んで成る特許請
    求の範囲第４項記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】前記プロモーター系がtac系である特許請
    求の範囲第５項記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】プラスミドpCTM4である特許請求の範囲第
    ６項記載のプラスミド。
  8. 【請求項８】次の塩基配列： 正鎖：ＴＧＣＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＡＣＴ− 負鎖：ＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧＡ− ＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴ− ＡＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡ− ＣＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＡＣＧＴＴ− ＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴＴ− ＴＧＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ− ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴ ＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡ から成るウナギカルシトニン誘導体をコードする遺伝子
    を含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌。
  9. 【請求項９】大腸菌プロモーター系、メタピロカテカー
    ゼ遺伝子又はその部分、及び前記ウナギカルシトニン誘
    導体をコードする遺伝子をこの順序で含んで成るプラス
    ミドにより形質転換された特許請求の範囲第８項記載の
    大腸菌。
  10. 【請求項１０】前記大腸菌がRB791、HB101株、JM103
    株、C600株、RR1株、SM32株、又はW3110株を宿主とする
    特許請求の範囲第９項記載の大腸菌。
  11. 【請求項１１】エシェリシャ・コリ(Escherichia coli)
    JM103／pCTM4（微工研菌寄第8239号）である特許請求の
    範囲第８項〜第10項のいずれか１項に記載の大腸菌。
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