JPH01206994A - 組換えベクター - Google Patents
組換えベクターInfo
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- JPH01206994A JPH01206994A JP2890888A JP2890888A JPH01206994A JP H01206994 A JPH01206994 A JP H01206994A JP 2890888 A JP2890888 A JP 2890888A JP 2890888 A JP2890888 A JP 2890888A JP H01206994 A JPH01206994 A JP H01206994A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
この発明は、主にlll1i瘍細胞より分泌されるポリ
ペプチドで、l1ti瘍の増殖に重要な役割を果たしテ
ィるI+瘍増殖因子(Transforsing Gr
owtl+Factor) a (TGF−a )の誘
導体をコードするDNA配列を含む組換えベクターに関
する。
ペプチドで、l1ti瘍の増殖に重要な役割を果たしテ
ィるI+瘍増殖因子(Transforsing Gr
owtl+Factor) a (TGF−a )の誘
導体をコードするDNA配列を含む組換えベクターに関
する。
[従来技術及びその欠点]
RNA腫瘍ウィルスにより腫瘍化したマウス線維芽細胞
の無血清培養上清から分離された物質が正常線維芽細胞
を可逆的に腫瘍化することが見出され、このようなIl
’ii瘍化活性を有する[1か腫瘍増殖因子(Tran
sforming Growth Factor (T
GF))と命名された(Todaro、 G、 J、ら
、Proc、 ’NaLl。
の無血清培養上清から分離された物質が正常線維芽細胞
を可逆的に腫瘍化することが見出され、このようなIl
’ii瘍化活性を有する[1か腫瘍増殖因子(Tran
sforming Growth Factor (T
GF))と命名された(Todaro、 G、 J、ら
、Proc、 ’NaLl。
Acad、 Sci、 USA、 75.4001 (
1978))、その後、TGFは物理化学的及び生物学
的性質を異にする複数の増殖因子の総称であることかわ
かり(Sporn。
1978))、その後、TGFは物理化学的及び生物学
的性質を異にする複数の増殖因子の総称であることかわ
かり(Sporn。
M、 Il、: Federation Pro
c、、 42. 2621 (198:l))。
c、、 42. 2621 (198:l))。
現在、TGFはα、β及びγ2の存在か確認されている
( Delarco、 J、E、 :Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci。
( Delarco、 J、E、 :Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci。
USA、鮭、 6264 (+981))。
種17の腫瘍細胞からTGFは産生されていることか知
られているか(Tadaro、 G、J、:J、 1l
iol。
られているか(Tadaro、 G、J、:J、 1l
iol。
Chew、、 256.6859 (+981); f
lozengurL、 E、:Exp。
lozengurL、 E、:Exp。
Ce1l 1les、 jユ5. 221 (1
981); AnLoniacles、 11.N
、:Cancer Rcs、、 43.83 (+98
3); l#1llia+ss、 L、T、:Proc
、 Natl、 Acad、 Sci、 USA、 R
I、 7466(1984))、TGFは腫瘍細胞に特
有の増殖という現象にオートタリン的に関tトすると考
えられている(Todaro、 G、J、: Ne
w Engl、 J、 Mad、、 303.
52](198+1)。すなわち、産生細胞自身にも
レセプターがあり、ガン化の機構の解明に興味がもたれ
ている。
981); AnLoniacles、 11.N
、:Cancer Rcs、、 43.83 (+98
3); l#1llia+ss、 L、T、:Proc
、 Natl、 Acad、 Sci、 USA、 R
I、 7466(1984))、TGFは腫瘍細胞に特
有の増殖という現象にオートタリン的に関tトすると考
えられている(Todaro、 G、J、: Ne
w Engl、 J、 Mad、、 303.
52](198+1)。すなわち、産生細胞自身にも
レセプターがあり、ガン化の機構の解明に興味がもたれ
ている。
、TGFα、β、γ2はいずれも細胞腫瘍化に伴い細胞
外へ分泌されることか知られているが’rodaro、
G、 J、: 、1. Ce11. Pl+1sio
1.、102. ’1001(1980); 5po
rn、M、B、: Mo1.Ce11.Biol、
互。
外へ分泌されることか知られているが’rodaro、
G、 J、: 、1. Ce11. Pl+1sio
1.、102. ’1001(1980); 5po
rn、M、B、: Mo1.Ce11.Biol、
互。
242 (1985)) 、 正常細胞に存在すること
も知られている。特にTGF−βは血小板中に不活性型
で大騒に蓄積されている( 5porn、 M、11.
: J、 Riot。
も知られている。特にTGF−βは血小板中に不活性型
で大騒に蓄積されている( 5porn、 M、11.
: J、 Riot。
Chem、、 258.7155 (1983))。
しかし、TGF−αは正常細胞から分泌されているとい
う報告は少なく腫瘍が特異的に産生ずると考えられ、そ
のモノクローナル抗体はガンの診断薬及び治療薬として
有効である。また、 TGF−〇は組織培養系で骨吸収
を惹起することがわかっており、骨疾患の治療及び損傷
の治療薬ともなり得る。
う報告は少なく腫瘍が特異的に産生ずると考えられ、そ
のモノクローナル抗体はガンの診断薬及び治療薬として
有効である。また、 TGF−〇は組織培養系で骨吸収
を惹起することがわかっており、骨疾患の治療及び損傷
の治療薬ともなり得る。
50個のアミノ酸から成るヒト成熟TGF−αを含むヒ
ト前駆体TGF−αの塩基配列及びアミノ酸配列は既に
Derynkらによって決定されているDerynck
、 R,: Ce1l、 38.287 (1984)
) (第2図)、プリンクらは腎細胞腫から11)られ
たcDNA配列より、第2図中の て囲まれた
第40−第89アミノ酸から成る成熟TGF−α遺伝子
?切り出し、発現、精製及び活性の確認を行っている。
ト前駆体TGF−αの塩基配列及びアミノ酸配列は既に
Derynkらによって決定されているDerynck
、 R,: Ce1l、 38.287 (1984)
) (第2図)、プリンクらは腎細胞腫から11)られ
たcDNA配列より、第2図中の て囲まれた
第40−第89アミノ酸から成る成熟TGF−α遺伝子
?切り出し、発現、精製及び活性の確認を行っている。
しかしながら、 TGF−αは分子橡が5500と小さ
いため、菌体内では分解され易く不安定である。
いため、菌体内では分解され易く不安定である。
従って、これまで、TGF−αを菌体内で発現するには
、大腸菌のTrpE蛋白質との融合蛋白質として発現し
ているが、発現量は不十分であり、蛋白質か疎水性であ
るため精製が困難であるという問題かある。
、大腸菌のTrpE蛋白質との融合蛋白質として発現し
ているが、発現量は不十分であり、蛋白質か疎水性であ
るため精製が困難であるという問題かある。
[発明が解決しようとする問題点]
従って、この発明の目的は、精製が容易なTGF−α誘
導体を遺伝子T学的手法により大九tに生産する技術を
提供することである。
導体を遺伝子T学的手法により大九tに生産する技術を
提供することである。
[問題点を解決するための手段]
本願発明者らは、 TGF−αのC末端側に、TGF−
αに親水性を付午するアミノ酸配列を付加することによ
り、従来の方法に比較し、菌体内の発現量が8倍以上に
多くなり、しかもTGF−αの精製が容易になることを
見出し、この発明を完成した。
αに親水性を付午するアミノ酸配列を付加することによ
り、従来の方法に比較し、菌体内の発現量が8倍以上に
多くなり、しかもTGF−αの精製が容易になることを
見出し、この発明を完成した。
すなわち、この発明は、TGF−αのC末端に。
TGF−αに親水性を付与するアミノ酸配列か付加され
たTGF−α誘導体をコードするDNA配列を含む組換
えベクターを提供する。
たTGF−α誘導体をコードするDNA配列を含む組換
えベクターを提供する。
[発明の効果]
この発明により、精製が容易な親水性のTGF−α誘導
体の遺伝子工学的手法による大量生産を可能にする組換
えベクターが提供された。この発明の組換えベクターで
宿主を形質転換し、宿主を培養すると宿主によってTG
F−α誘導体が生産される。このTGF−α誘導体は菌
体内で安定であると考えられ、従来の方法に比較し、8
倍以上発現量が多い0発現量が多いことはその精製が容
易になり純度も高いものが得られることを意味する。ま
た、このTGF−α誘導体はTGF−αに比較し、親水
性であるため、精製か容易である。このTGF−α誘導
体は、天然のTGF−α前駆体のアミノ酸配列を参考に
しており、そのため生物学的活性を維持してJ、zるた
め、そのまま用いることができる。
体の遺伝子工学的手法による大量生産を可能にする組換
えベクターが提供された。この発明の組換えベクターで
宿主を形質転換し、宿主を培養すると宿主によってTG
F−α誘導体が生産される。このTGF−α誘導体は菌
体内で安定であると考えられ、従来の方法に比較し、8
倍以上発現量が多い0発現量が多いことはその精製が容
易になり純度も高いものが得られることを意味する。ま
た、このTGF−α誘導体はTGF−αに比較し、親水
性であるため、精製か容易である。このTGF−α誘導
体は、天然のTGF−α前駆体のアミノ酸配列を参考に
しており、そのため生物学的活性を維持してJ、zるた
め、そのまま用いることができる。
[発明の詳細な説明]
上述のように、この発明の組換えベクターは、TGF−
αのC末端にTGF−αに親水性を付与するアミノ酸が
付加されたTGF−α誘導体をコードするDNA配列を
含む。TGF−αに親水性を付グーするアミノ酸配列は
、配列中にLys、 Gly、 Arg、 Asp、G
lu、Scr、 Asn、Gln及びProのような比
較的親水性のアミノ酸を多数含む、すなわち、好ましく
は30%以−し、さらに好ましくは50%以上含むもの
である。この親水性付榮アミノ酸配列中のアミノ酸の数
は特に限定されないが、好ましくは2個ないし3個、さ
らに好ましくは7個ないし8個である。後述の実施例に
おいては、前駆体TGF−α中のアミノ酸配列であって
成熟TGF−αのC末端に結合された8個のアミノ酸を
そのまま親水性付与アミノ酸配列として用いている。す
なわち、第2図に示されるように、Val−Val−A
la−八Ia−Ser−Gln−Lys−Lysを親水
性付与アミノ酸配列として用いている。
αのC末端にTGF−αに親水性を付与するアミノ酸が
付加されたTGF−α誘導体をコードするDNA配列を
含む。TGF−αに親水性を付グーするアミノ酸配列は
、配列中にLys、 Gly、 Arg、 Asp、G
lu、Scr、 Asn、Gln及びProのような比
較的親水性のアミノ酸を多数含む、すなわち、好ましく
は30%以−し、さらに好ましくは50%以上含むもの
である。この親水性付榮アミノ酸配列中のアミノ酸の数
は特に限定されないが、好ましくは2個ないし3個、さ
らに好ましくは7個ないし8個である。後述の実施例に
おいては、前駆体TGF−α中のアミノ酸配列であって
成熟TGF−αのC末端に結合された8個のアミノ酸を
そのまま親水性付与アミノ酸配列として用いている。す
なわち、第2図に示されるように、Val−Val−A
la−八Ia−Ser−Gln−Lys−Lysを親水
性付与アミノ酸配列として用いている。
この発明の組換えベクターを構成するベクタ一部分は、
宿主細胞中で自律的に増殖することができ、発現のため
のプロモーターを有し、適名な選択マーカーを有するい
ずれのものでもよく、後述する2つの実施例では大腸菌
用のいくつかのベクターから誘導されたものを用いてい
る。
宿主細胞中で自律的に増殖することができ、発現のため
のプロモーターを有し、適名な選択マーカーを有するい
ずれのものでもよく、後述する2つの実施例では大腸菌
用のいくつかのベクターから誘導されたものを用いてい
る。
この発IJJの組換えベクターを用いて大腸菌を形質転
換して大11g菌に親水性TGF−α誘導体を生産させ
る場合、以下の2つの方法が考えられる。
換して大11g菌に親水性TGF−α誘導体を生産させ
る場合、以下の2つの方法が考えられる。
1つは宿主蛋白質との融合蛋白質としての生産であり、
もう1つは、シグナルペプチドを結合することによる菌
体外への分泌生産である。
もう1つは、シグナルペプチドを結合することによる菌
体外への分泌生産である。
〈融合蛋白質〉
TGF−αのような低分子量の外来タンパク賀は菌体内
て発現後、プロテアーゼによる分解を受けやすく、また
転写の効率も低いとされている。そこで、一般に菌体の
ある蛋白質との融合蛋白質として生産し、後に特異的に
菌体蛋白質を除去し。
て発現後、プロテアーゼによる分解を受けやすく、また
転写の効率も低いとされている。そこで、一般に菌体の
ある蛋白質との融合蛋白質として生産し、後に特異的に
菌体蛋白質を除去し。
目的物を得るという方法が用いられる。後述の実施例で
はTrpE蛋白質がTGF−α誘導体のN末端に融合さ
れている。また、このTGF−α誘導体は前述した通り
、従来のTGF−αと異なり、C末端は数個のアミノ酸
が付加したものである。こうすることにより、N末端及
びC末端が、プロテアーゼによる分解を受けにくくなり
、その発現!直も従来のTGF−α融合タンパク質より
8倍多く、飛躍的に生産性が向上した。
はTrpE蛋白質がTGF−α誘導体のN末端に融合さ
れている。また、このTGF−α誘導体は前述した通り
、従来のTGF−αと異なり、C末端は数個のアミノ酸
が付加したものである。こうすることにより、N末端及
びC末端が、プロテアーゼによる分解を受けにくくなり
、その発現!直も従来のTGF−α融合タンパク質より
8倍多く、飛躍的に生産性が向上した。
〈分泌生産〉
大11g菌にある外来蛋白質を発現させようとする場合
、上述の方法の他に精製及び経済性の観点から菌体外へ
分泌することが好ましい。
、上述の方法の他に精製及び経済性の観点から菌体外へ
分泌することが好ましい。
一般に、大腸菌によっ゛C遺伝子工学的に産生されるペ
プチドはそのままでは分泌されず、これを分泌させるた
めにはペプチドのN末端側にシグナルペプチドが付加さ
れていることが必要である。従って、この発明の好まし
い具体例においては、親水性TGF−α誘導体のN末端
側にシグナルペプチドが付加されている。後述の実施例
では、大111菌アルカリホスフアターゼのシグナルペ
プチドphoAが付加されている。もっとも、シグナル
ペプチドはphoAに限定されるものではなく、他のい
ずれのシグナルペプチドをも採用することができる。シ
グナルペプチドは細胞膜を通過する際に切断される。
プチドはそのままでは分泌されず、これを分泌させるた
めにはペプチドのN末端側にシグナルペプチドが付加さ
れていることが必要である。従って、この発明の好まし
い具体例においては、親水性TGF−α誘導体のN末端
側にシグナルペプチドが付加されている。後述の実施例
では、大111菌アルカリホスフアターゼのシグナルペ
プチドphoAが付加されている。もっとも、シグナル
ペプチドはphoAに限定されるものではなく、他のい
ずれのシグナルペプチドをも採用することができる。シ
グナルペプチドは細胞膜を通過する際に切断される。
この発11の組換えベクターは、l:記TGF−α誘導
体及び所望によりそのN末端にシグナルペプチドか付加
されたものをコードするDNAを調製し、これを、制限
酵素による開裂、アニーリング及びライゲーションから
なる常法によって適当な発現ベクター中に組込み、これ
を用いてそのベクターの宿主を形質転換し、宿主を培養
し、ベクター中の選択マーカーによって該組換えベクタ
ーを含む宿主を選択し、該宿主から組換えベクターを抽
出することによって製造することができる。
体及び所望によりそのN末端にシグナルペプチドか付加
されたものをコードするDNAを調製し、これを、制限
酵素による開裂、アニーリング及びライゲーションから
なる常法によって適当な発現ベクター中に組込み、これ
を用いてそのベクターの宿主を形質転換し、宿主を培養
し、ベクター中の選択マーカーによって該組換えベクタ
ーを含む宿主を選択し、該宿主から組換えベクターを抽
出することによって製造することができる。
TGF−α誘導体及び所望によりそのN末端にシグナル
ペプチドか付加されたものをコードするDNAは、 T
GF−αの塩基配列か決定されているので、ホスホアミ
ダイト法等の常法により化学合成することかできるのて
便利である。また、後述の実施例において示されるよう
に、先ず成熟TGF−αをコードするDNA配列をクロ
ーニングし1次いでこれにN末端側にシグナルペプチド
を付加するためのオリゴヌクレオチドを付加したものを
クローニングすることもてきる。このように、成熟TG
F−α、シグナルペプチドと順次付加していく方法を採
用すると、後に種々の構造遺伝子、シグナルペプチドの
組合せか可能であるという利点がある。
ペプチドか付加されたものをコードするDNAは、 T
GF−αの塩基配列か決定されているので、ホスホアミ
ダイト法等の常法により化学合成することかできるのて
便利である。また、後述の実施例において示されるよう
に、先ず成熟TGF−αをコードするDNA配列をクロ
ーニングし1次いでこれにN末端側にシグナルペプチド
を付加するためのオリゴヌクレオチドを付加したものを
クローニングすることもてきる。このように、成熟TG
F−α、シグナルペプチドと順次付加していく方法を採
用すると、後に種々の構造遺伝子、シグナルペプチドの
組合せか可能であるという利点がある。
[発明の実施例]
以下、この発明を実施例に基づいて説明するが、この発
明は下記実施例に限定されるものてはない。
明は下記実施例に限定されるものてはない。
実施例1(融合蛋白質を用いた方法)
大腸菌トリプトファンオペロンのTrpEタンパク質の
N末端を含む、第3図に示す塩ノ^配列を有するTGF
−α誘導体遺伝子を化学合成した。すなわち、第3図に
示す全24(Nil基対を同図に示すように14個のフ
ラグメントに分割し、ホスホアミタイト法(文献: C
arutbers、 M、Il、: J、 Am。
N末端を含む、第3図に示す塩ノ^配列を有するTGF
−α誘導体遺伝子を化学合成した。すなわち、第3図に
示す全24(Nil基対を同図に示すように14個のフ
ラグメントに分割し、ホスホアミタイト法(文献: C
arutbers、 M、Il、: J、 Am。
CIues、 Soc、 103,3185 (191
11)により合成した。
11)により合成した。
精製したフラグメントをライゲーション反応により結合
しく文献: Itakura、に、: 5cience
198゜1056 (1977) ) 、 240塩
基対のTrpE融合TGF−a遺伝子誘導体を得た。得
られた遺伝子は第317Iに示すように末端にC1al
、5alll、IJ断部位をそれぞれ有し、図示の部分
にEco81部位を有する。
しく文献: Itakura、に、: 5cience
198゜1056 (1977) ) 、 240塩
基対のTrpE融合TGF−a遺伝子誘導体を得た。得
られた遺伝子は第317Iに示すように末端にC1al
、5alll、IJ断部位をそれぞれ有し、図示の部分
にEco81部位を有する。
ベクターpAT−Ptrp (文献: 1kehara
、 M、:Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i、 USA 81.5956 (1984))をC1
al及び5allて消化し、上記合成遺伝子を直接、該
ベクターのトリプトファンプロモーターの下流のC1a
1.5a11部位に組込み、TGF−α誘導体遺伝子を
有する組換えベクター1)AT−TrpE−TGF−α
■を得た(第1図A)。この組換えベクターを用い、大
1[111R+旧株を形質転換し、40 ILg/ml
のアンピシリン存在下、L培地にて一晩培養し、候補株
を得た。この候補株を培養し、集菌した後、アルカリ法
(T、 Maniatis: Mo1ecular C
loning。
、 M、:Proc、 Natl、 Acad、 Sc
i、 USA 81.5956 (1984))をC1
al及び5allて消化し、上記合成遺伝子を直接、該
ベクターのトリプトファンプロモーターの下流のC1a
1.5a11部位に組込み、TGF−α誘導体遺伝子を
有する組換えベクター1)AT−TrpE−TGF−α
■を得た(第1図A)。この組換えベクターを用い、大
1[111R+旧株を形質転換し、40 ILg/ml
のアンピシリン存在下、L培地にて一晩培養し、候補株
を得た。この候補株を培養し、集菌した後、アルカリ法
(T、 Maniatis: Mo1ecular C
loning。
p36:l、 Co1d Spring 1larbo
r Laboratory)により、プラスミドを大量
調製した。得られたプラスミドを制限酵素及び塩基配列
の決定により、目的遺伝子の挿入を確認し、このプラス
ミドを持つ菌をTrpE−TGF−a U /IIBI
OI株と命名した。
r Laboratory)により、プラスミドを大量
調製した。得られたプラスミドを制限酵素及び塩基配列
の決定により、目的遺伝子の挿入を確認し、このプラス
ミドを持つ菌をTrpE−TGF−a U /IIBI
OI株と命名した。
このTrpE−TGF−α■/IIBIOI株を40u
g/mlのアンピシリンを含む100 mlのし培地中
で一夜培養し、5文の0.5zカザミノ酸を含むM9培
地(組成: 0.7$ Na211P04”1211
20.0.3$ KI12PO,,0,05XNaC
l、0.1 % NIl、CI、1 mM CaC1z
、0.5%グルコース)に接種し、37°Cで培養し、
5110 nmにおける吸光度が0.5になるまて培養
したところでインドールアクリル酸を最終濃度20#L
g/mlになるように加え、さらに20時間培養を粛続
した後、遠心分離により5.6gの菌体を集めた。
g/mlのアンピシリンを含む100 mlのし培地中
で一夜培養し、5文の0.5zカザミノ酸を含むM9培
地(組成: 0.7$ Na211P04”1211
20.0.3$ KI12PO,,0,05XNaC
l、0.1 % NIl、CI、1 mM CaC1z
、0.5%グルコース)に接種し、37°Cで培養し、
5110 nmにおける吸光度が0.5になるまて培養
したところでインドールアクリル酸を最終濃度20#L
g/mlになるように加え、さらに20時間培養を粛続
した後、遠心分離により5.6gの菌体を集めた。
集めた菌体な2 Bl■lのリゾチーム、211ME
DTA及び100園屓トリス−塩酸緩衝液(pH8,0
)を含む溶液中に懸渇し、0℃、30分間放置した。ざ
らにβ−メルカプトエタノールを351L+加え。
DTA及び100園屓トリス−塩酸緩衝液(pH8,0
)を含む溶液中に懸渇し、0℃、30分間放置した。ざ
らにβ−メルカプトエタノールを351L+加え。
超音波処理を行ない、菌体を粉砕した。−晩攪拌した後
、遠心分離により、可溶性画分であるE清と、不溶性画
分である沈殿に分離し、それぞれS w a n kと
Muresの方法(文献: 5Wank、 Il、T:
Anal、 Bioches、 39 (1971))
に従い、8M尿素存在下Is! SO3−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なったところ、不溶性画分に目
的とするTrpE−TGF−α誘導体の発現が確認され
た。さらに具体的に述べると、TrpE−TGF−α誘
導体の発現はベクター、pATphoA−TGF−αI
Iを含まない118101株を培養したもの及びpAT
−phoA−TGF−(X Hを含むか、インドールア
クリル酸を加えず蛋白質の発現を誘導しなかったものと
比較し、明らかに新しい蛋白質か目的とする分子量的7
000の位置に出現したことにより確認された。
、遠心分離により、可溶性画分であるE清と、不溶性画
分である沈殿に分離し、それぞれS w a n kと
Muresの方法(文献: 5Wank、 Il、T:
Anal、 Bioches、 39 (1971))
に従い、8M尿素存在下Is! SO3−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なったところ、不溶性画分に目
的とするTrpE−TGF−α誘導体の発現が確認され
た。さらに具体的に述べると、TrpE−TGF−α誘
導体の発現はベクター、pATphoA−TGF−αI
Iを含まない118101株を培養したもの及びpAT
−phoA−TGF−(X Hを含むか、インドールア
クリル酸を加えず蛋白質の発現を誘導しなかったものと
比較し、明らかに新しい蛋白質か目的とする分子量的7
000の位置に出現したことにより確認された。
得られた不溶性画分を、8Mグアニジン及び10mMメ
ルカプトエタノールを含む溶液に溶解した後、セファデ
ックスG−75(ファルマシア社製)を用いてゲルろ過
を行なった。ゲルろ過の具体的な条件は、溶出液: 2
0 +*M Tris−HCI (pH8,0)、4M
グアニジン、10mMメルカプトエタノール、カラム:
φ2.6 x 100 cm、流速: 2.4 ml/
15分てあった。第4図に示す98−112画分を集め
、TrpE−TGF−α誘導体タンパク質37 gを得
た。これを臭化シアンによりTrpE部分を切断し、さ
らにセファデックスG−50(ファルマシア社製)を用
いゲルろ過を行なった。このゲルろ過の具体的条件は、
溶出液: lIc0OHパII 3 COOtl /
If□O−25/88/888、カラム:φ2.5 x
100 cm、 1&速2.2 ml/15分であつ
た。第5r?lに示す溶離曲線か得られ■の両分を集め
TGF−α誘導体タンパク賀4.Omgを得た。
ルカプトエタノールを含む溶液に溶解した後、セファデ
ックスG−75(ファルマシア社製)を用いてゲルろ過
を行なった。ゲルろ過の具体的な条件は、溶出液: 2
0 +*M Tris−HCI (pH8,0)、4M
グアニジン、10mMメルカプトエタノール、カラム:
φ2.6 x 100 cm、流速: 2.4 ml/
15分てあった。第4図に示す98−112画分を集め
、TrpE−TGF−α誘導体タンパク質37 gを得
た。これを臭化シアンによりTrpE部分を切断し、さ
らにセファデックスG−50(ファルマシア社製)を用
いゲルろ過を行なった。このゲルろ過の具体的条件は、
溶出液: lIc0OHパII 3 COOtl /
If□O−25/88/888、カラム:φ2.5 x
100 cm、 1&速2.2 ml/15分であつ
た。第5r?lに示す溶離曲線か得られ■の両分を集め
TGF−α誘導体タンパク賀4.Omgを得た。
実施例2(シグナルベプチトを用いた方法)h記Trp
E及びTGF−α誘導体の遺伝子を含むベクター、pA
T−TrpE−TGF−αHをEcoRl及び5all
て処理してEco旧−3allltli片を切り出した
。一方、大1賜菌アルカリホスフアターゼのシグナルベ
プチトを含むMeL−Lys−Glu−Ser−Thr
−lle−八I a −1,c o −L e u −
Pro−Leu−Leu−Phe−Thr−P ro−
Va l −Thr−L ys−A 1a−A rg−
Glu−Pheのアミノ酸配列をコードし、かつその5
゛末端及び3°末端かそれぞれC1al及びEcoR1
部位を有する、 CGAT ATG AAA CAA AGCACT A
TT GCA CTG GCA CTCTT八 CCG
TTA CTG TTT ACCCCT
GTG ACA AAA GCCACCTCT
GACGTA TへCTTT C7丁 TCG
TGA TAA CGTGACCGT GAG
AAT GGCAAT GACAAA TGG GGA
CACTGT TTT CGG TTG へ
Gへ CTG CTT AAて示される塩基配列を
有するphoAオリコヌクレオチトを化学合成し、これ
を上記EcoR1−9at IFfi片とT、DNAリ
ガーゼにより結合した。この結合断片を先に得られた組
換えベクター、pAT−TrpE−TGF−aHのC1
al、 5al1部位に組込み(第1図B)、シグナル
ペプチドphoA、成熟TGF−α及び親水性付与アミ
ノ酸配列をコードするDNAを含む組換えベクターを用
い、大腸菌118101株を形質転換し。
E及びTGF−α誘導体の遺伝子を含むベクター、pA
T−TrpE−TGF−αHをEcoRl及び5all
て処理してEco旧−3allltli片を切り出した
。一方、大1賜菌アルカリホスフアターゼのシグナルベ
プチトを含むMeL−Lys−Glu−Ser−Thr
−lle−八I a −1,c o −L e u −
Pro−Leu−Leu−Phe−Thr−P ro−
Va l −Thr−L ys−A 1a−A rg−
Glu−Pheのアミノ酸配列をコードし、かつその5
゛末端及び3°末端かそれぞれC1al及びEcoR1
部位を有する、 CGAT ATG AAA CAA AGCACT A
TT GCA CTG GCA CTCTT八 CCG
TTA CTG TTT ACCCCT
GTG ACA AAA GCCACCTCT
GACGTA TへCTTT C7丁 TCG
TGA TAA CGTGACCGT GAG
AAT GGCAAT GACAAA TGG GGA
CACTGT TTT CGG TTG へ
Gへ CTG CTT AAて示される塩基配列を
有するphoAオリコヌクレオチトを化学合成し、これ
を上記EcoR1−9at IFfi片とT、DNAリ
ガーゼにより結合した。この結合断片を先に得られた組
換えベクター、pAT−TrpE−TGF−aHのC1
al、 5al1部位に組込み(第1図B)、シグナル
ペプチドphoA、成熟TGF−α及び親水性付与アミ
ノ酸配列をコードするDNAを含む組換えベクターを用
い、大腸菌118101株を形質転換し。
40μg/mlのアンピシリン存在下、L培地にて一晩
培養し、候補株を得た。この候補株を培養し、集菌した
後、アルカリ法により、プラスミドを大量調製し、制限
酵素による分析を行ない、目的遺伝子の挿入を確認し、
このプラスミドを持つ菌を1)IIOATGF−Q I
I /IIBIOI株と命名した。
培養し、候補株を得た。この候補株を培養し、集菌した
後、アルカリ法により、プラスミドを大量調製し、制限
酵素による分析を行ない、目的遺伝子の挿入を確認し、
このプラスミドを持つ菌を1)IIOATGF−Q I
I /IIBIOI株と命名した。
得られたPhoA−TGF−(X II /llB10
’1株を40pg/mlアンピシリンを含むし培地中で
一晩培養し、この培養液1mlを401のM9CA培地
に加え、37℃でOD+%oo−0,9まで培養した。
’1株を40pg/mlアンピシリンを含むし培地中で
一晩培養し、この培養液1mlを401のM9CA培地
に加え、37℃でOD+%oo−0,9まで培養した。
この培養液を集菌し、40%シュクロース及び2 mM
EDTAを含む溶液に懸渇し、24℃、10分間放置
した。遠心分離により、上積を除いた菌体に水(0”C
)を加え、浸透圧ショックにより外膜を破壊し、ペリプ
ラズム画分を水溶液中に得た。遠心分離により菌体を除
き、ペリプラズム画分を8M尿素存在下tsx SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、目的とする
TGF−α誘導体タンパク質の分泌発現を確認した。
EDTAを含む溶液に懸渇し、24℃、10分間放置
した。遠心分離により、上積を除いた菌体に水(0”C
)を加え、浸透圧ショックにより外膜を破壊し、ペリプ
ラズム画分を水溶液中に得た。遠心分離により菌体を除
き、ペリプラズム画分を8M尿素存在下tsx SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、目的とする
TGF−α誘導体タンパク質の分泌発現を確認した。
第1図は、この発明の組換えベクターの製造工程の実施
例を説明するための図、 第2図は成熟TGF−αを含むTGF−α萌駆体のアミ
ノ酸配列その遺伝子のkJ1基配列配列す図。 第3図は第1図に示す製造工程において化学合成された
TrpE融合TGF−αのアミノ酸配列及びその遺伝子
の塩基配列を示す図。 第4図は実施例において得られたこの発明の組換えベク
ターを発現させて得られたTrpE−TGF−α誘導体
をゲルろ過によって精製した際に得られた溶離曲線、及
び 第5図は第4図に示すゲルろ過により精製されたTrp
E−TGF−α誘導体のTrpEを切断除去して得られ
るTGF−α誘導体をゲルろ過により精製した際に得ら
れた溶離曲線を示す。 第5図
例を説明するための図、 第2図は成熟TGF−αを含むTGF−α萌駆体のアミ
ノ酸配列その遺伝子のkJ1基配列配列す図。 第3図は第1図に示す製造工程において化学合成された
TrpE融合TGF−αのアミノ酸配列及びその遺伝子
の塩基配列を示す図。 第4図は実施例において得られたこの発明の組換えベク
ターを発現させて得られたTrpE−TGF−α誘導体
をゲルろ過によって精製した際に得られた溶離曲線、及
び 第5図は第4図に示すゲルろ過により精製されたTrp
E−TGF−α誘導体のTrpEを切断除去して得られ
るTGF−α誘導体をゲルろ過により精製した際に得ら
れた溶離曲線を示す。 第5図
Claims (6)
- (1)TGF−αのC末端に、TGF−αに親水性を付
与するアミノ酸配列が付加されたTGF−α誘導体をコ
ードするDNA配列を含む組換えベクター。 - (2)親水性を付与するアミノ酸配列はVal−Val
−Ala−Ala−Ser−Gln−Lys−Lysで
ある特許請求の範囲第1項記載の組換えベクター。 - (3)前記DNA配列は、TGF−αのN末端に大腸菌
の蛋白質の全部又は一部を含むアミノ酸配列をコードす
る領域を含む特許請求の範囲第1項又は第2項記載の組
換えベクター。 - (4)前記大腸菌の蛋白質の全部又は一部は、トリプト
ファンオペレーターのTrpE蛋白質又はアルカリフォ
スファターゼのシグナルペプチドである特許請求の範囲
第3項記載の組換えベクター。 - (5)前記TrpEのアミノ酸配列はMet−Lys−
Ala−lle−Phe−Val−Leu−Lys−G
ly−Ser−Leu−Asp−Arg−Asp−Pr
o−Glu−Pheであり、前記シグナルペプチドのア
ミノ酸配列はMet−Lys−Glu−Ser−Thr
−lle−Ala−Leu−Ala−Leu−Leu−
Pro−Leu−Leu−Phe−Thr−Pro−V
al−Thr−Lys−Ala−Arg−Gln−Ph
eである特許請求の範囲第4項記載の組換えベクター。 - (6)前記DNA配列は 【遺伝子配列があります】 で示されるDNA配列又は 【遺伝子配列があります】 で示されるDNA配列を含む特許請求の範囲第5項記載
の組換えベクター。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2890888A JPH01206994A (ja) | 1988-02-12 | 1988-02-12 | 組換えベクター |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2890888A JPH01206994A (ja) | 1988-02-12 | 1988-02-12 | 組換えベクター |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01206994A true JPH01206994A (ja) | 1989-08-21 |
Family
ID=12261503
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2890888A Pending JPH01206994A (ja) | 1988-02-12 | 1988-02-12 | 組換えベクター |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01206994A (ja) |
-
1988
- 1988-02-12 JP JP2890888A patent/JPH01206994A/ja active Pending
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