CN116003590A - 抗ngf抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗NGF抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用；本发明还提供了编码所述抗NGF抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，以及包含所述分离的多核苷酸的载体。本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗NGF介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗NGF抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及能特异性结合人神经生长因子的抗NGF抗体及其抗原结合片段，本发明还涉及所述抗体及其抗原结合片段的制备方法和用途。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)是最先确定的神经营养因子，其在外周及中枢神经元的发育及存活中的作用已被表征。NGF已被证明在周围交感和胚胎感觉神经元和基底前脑胆碱能神经元的发育中是一种关键的存活和维持因子(Smeyne et al.(1994)Nature,368:246-249；Crowley et al.(1994)Cell,76:1001-1011)，其能上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay et al.(1989)Nature,337:362-364)。NGF包含α、β、γ三个亚单位，β亚单位是NGF的活性亚单位。目前已知NGF通过两种不同的膜表面受体，TrkA酪氨酸激酶受体(Tropomyosin receptor kinase A,TrkA,也称为“高亲和性”NGF受体)和p75共同神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR,也称为“低亲和性”NGF受体)调节其活性(Chao et al.(1986)Science,232:518-521)。
NGF/TrkA信号通路与疼痛密切相关，可介导疼痛的发生。在受伤和炎症组织中，NGF高表达，并且TrkA对伤害性感受神经元的激活通过多种机制引发，并产生疼痛信号。大鼠注射NGF后，热刺激引起的缩足潜伏期明显缩短(Lewin et al.(1994)Eur J Neurosci,6:1903-1912)。动物模型中，通过给予NGF抗体、TrkA-IgG等方式中和NGF活性，可显著减少炎症相关的疼痛(Woolf CJ et al.(1994)Neuroscience,62:327-331；McMahon SB et al.(1995)Net.Med.1:774-780；Koltzenburg M et al.(1999)Eur.J.Neurosci.11:1698-1704),提示NGF水平的增加是产生全身痛觉过敏反应所必需的。患有类风湿关节炎患者滑液中NGF含量明显升高，非炎症患者滑液中未检测到NGF(Aloe et al.(1992)Arthritisand Rheumatism,35:351-355)。健康人注射NGF后，可产生痛觉敏感及局部性疼痛(Pettyet al.(1994)Ann Neurol,36:244-246)。NGFβ基因发生纯合子错义突变会使人体出现HSAN5症状，这类患者对疼痛、冷、热不敏感(Larsson et al.(2009)Neurobiol Dis,33:221-228)。NTRK1基因编码TrkA蛋白，其多态性与痛觉改变密切相关。NTRK1的17号外显子常染色体隐性突变会引起先天性痛觉不敏感合并无汗症(Indo et al.(1996)Naturegenetics,13:485-488)。
在全球范围内，有数以千万计的患者在遭受着慢性疼痛带来的痛苦，而这个数字随着人口增加还在不断增加。当前临床上使用的用于慢性疼痛治疗的药物包括非甾体类抗炎药、抗惊厥药、阿片类药物等，然而这些药物有很多的不足，其中，非甾体抗炎药的疗效有限，并且具有包括消化道出血和肾脏毒性等副作用；而阿片类药物具有成瘾等副作用。该领域亟需能缓解疼痛、无毒性、防滥用的非阿片类止痛药，因此通过抑制NGF治疗慢性疼痛的方法价值非常明确。到目前为止，有许多抗人NGF抗体处于研发或临床开发阶段，其中进展最快的包括Pfizer/Lilly公司的抗NGF单克隆抗体Tanezumab和Regeneron/Sanofi公司的Fasinumab。Tanezumab是最先开发的抗NGF抗体药物，据报道它对退行性关节病相伴的关节痛、慢性腰痛、与间质性膀胱炎相伴的膀胱痛等疼痛显示出了强大且范围广的镇痛效果(Lane NE et al.(2010)N Engl J Med,363:1521-1531)，目前该药物正在进行骨关节炎、背部疼痛、癌症疼痛等适应症的III期临床实验。Fasinumab治疗骨关节炎痛的II/III期临床研究数据显示，4种剂量Fasinumab治疗组的患者在疼痛缓解方面取得了具有统计学意义的显著改善。另一方面,多个NGF抑制剂的临床实验也表明，NGF抗体可能面临被限制用于重病人群、不能长期使用和剂量限制等问题，使得NGF抗体的临床应用需要进一步的安全验证。
NGF是神经元发育极为重要的因子，在开发抑制NGF功能的药物时，也需要考虑NGF剂量对神经元的影响。一方面，抗体药物的有效剂量取决于对抗原的中和活性和存在于体内的抗原量，中和活性的提高与给药量降低相关。抗NGF抗体研究需要获得针对不同抗原表位或相同抗原表位而亲和力不同的CDR区。不同CDR的免疫原性不同，造成的抗体耐受速度和毒性也不同，直接影响药效。另一方面，受试者对抗体本身产生的免疫反应会形成免疫复合物，使得药物动力学改变，产生变应性反应等，消除了它的治疗性用途。相对于鼠源抗体和嵌合抗体，人免疫系统针对人源化抗体的抗体反应最小，同时人源化抗体与天然人抗体具有相似的半衰期，这样就保证了更少的给药频率和更低的给药剂量。
因此，研发亲和力更高，特异性更强的抗NGF抗体，并进行人源化改造对于与NGF相关的各种疾病的治疗或预防而言是极其重要的。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种高亲和力，强特异性及疗效显著的抗NGF抗体。本发明还提供了所述抗体的制备方法和用途。
一方面，本发明提供了能够特异性结合NGF的抗NGF抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:13所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:14所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:15所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:22所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:23所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合NGF的抗NGF抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:26所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:27所示的VL CDR3。
一方面，本发明提供了能够特异性结合NGF的抗NGF抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:29，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:30，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:19所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:20所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:21所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:28所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:29所示的VL CDR2、如SEQ ID NO:30所示的VL CDR3。
根据本发明所述的能够特异性结合NGF的抗NGF抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、5和9中任一项所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3、7和11中任一项所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:3所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:3所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:3所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:5所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:7所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:5所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:7所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:9所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:11所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:11所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:11所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:11所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；
优选地，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61和63的任一项所示的序列的重链和/或如SEQ ID NO:31和41的任一项所示的序列的轻链。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记；优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
本发明还提供了分离的核酸分子，其编码所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62和64中任一项所示的核苷酸编码序列。
本发明还提供了载体，其包含所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
本发明还提供了宿主细胞，其包含所述的分离的核酸分子或所述的载体。
本发明还提拱了制备所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
本发明还提供了双特异性或多特异性分子，其包含所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合NGF，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。
本发明还提供了免疫缀合物，其包含所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
本发明还提供了药物组合物，其含有所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或者免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
本发明还提供了试剂盒，其含有所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
本发明还提供了嵌合抗原受体，其包含所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述抗原结合受体包含所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述抗原结合受体由免疫效应细胞(例如T细胞)所表达。
本发明还提供了所述抗体或其抗原结合片段，或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原受体，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗NGF介导的疾病或病症；
优选地，所述的疾病或病症包括骨关节炎疼痛、手术后疼痛、类风湿关节炎疼痛、低背痛、癌症相关性疼痛、神经病理性疼痛及内脏痛；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
本发明还提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的双特异性或多特异性分子，或所述的免疫缀合物，或所述的药物组合物，或所述的嵌合抗原受体，或所述的宿主细胞；
所述疾病为NGF介导的疾病或病症；
优选地，所述的疾病或病症包括骨关节炎疼痛、手术后疼痛、类风湿关节炎疼痛、低背痛、癌症相关性疼痛、神经病理性疼痛及内脏痛；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
本发明还提供了一种检测NGF(例如人NGF)在样品中的存在或其量的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品与所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段与NGF之间复合物的形成或检测所述复合物的量；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记；
优选地，所述NGF是人NGF。
本发明人发现，本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下优点：
1.本发明提供的抗体具有高的亲和力，亲和力常数KD值小于或者接近10-12M，能够有效阻断NGF和其受体之间的结合，阻断疼痛的响应；
2.本发明提供的抗体与抗原结合的特异性极强，与NGF同家族蛋白无交叉结合，可以预期其临床安全性风险也将降低；
3.本发明提供的抗体具有显著的动物镇痛效果，预期临床疗效显著；
4.本发明提供的抗体采用CHO细胞表达，具有产量高、活性高、纯化工艺简单以及生产成本低的优势。
附图说明
图1表示本发明的抗NGF抗体与人NGF蛋白结合的ELISA实验结果。
图2表示本发明的抗NGF抗体对人NGF与受体TrkA、p75结合的影响。
图3表示本发明的抗NGF抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖。
图4表示本发明的抗NGF抗体抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖。
图5表示本发明的抗NGF抗体抑制TrkA/NFAT-bla/CHO细胞中的报告基因表达。
图6表示本发明的抗NGF抗体特异性结合NGF并抑制NGF诱导的信号通路。
图7表示本发明的抗NGF抗体43E5与138E12的竞争结合曲线。
图8表示本发明的抗NGF抗体43E5与138E12对CFA致小鼠炎症性疼痛的作用，其中**P<0.01vs生理盐水；***P<0.001vs生理盐水。
图9表示本发明的人源化抗NGF抗体与人NGF结合。
图10表示本发明的人源化抗NGF抗体与NGF同家族蛋白结合。
图11表示本发明的人源化抗NGF抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖。
具体实施方式
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段能够以小于或者接近10- 12M的结合亲和性(KD)与NGF特异性结合，其通过生物膜层光学干涉技术测量。结合亲和性值可以用KD值表示，其通过当抗原和抗体结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(koff/kon)计算得到。所述抗原结合亲和性(例如KD)可以通过本领域己知的适宜方法适宜地确定，例如包括使用仪器如Fortebio的生物膜层光学干涉技术。
在某些实施方式中，本申请所述抗体或抗原结合片段与NGF以0.1nM的EC50(即半数结合浓度)结合。抗体或抗原结合片段与NGF的结合可以通过本领域己知的方法如夹心法如ELISA，Western印迹，FACS或其他结合试验测定。
所述抗体是NGF特异性的。在某些实施方式中，所述抗体任选地不与NGF同家族蛋白脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)、神经营养因子-4(neurotrophin-4,NT-4)结合。
实施例1:鼠源抗NGF抗体的制备
将重组人NGF蛋白(北京义翘神州科技有限公司，11050-HNAC)作为免疫原与等量弗氏完全佐剂(Sigma-Alderich，F5881)混合乳化，用于初始免疫。准备6周龄BALB/c和C57小鼠(江苏华阜康)各五只，每只动物皮下注射50μg免疫原(不包括佐剂质量，下同)。将免疫原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Alderich，F5506)混合乳化，用于后续加强免疫。初始免疫2周后每只动物腹腔注射25μg免疫原进行第一次加免；2周后每只动物皮下注射25μg免疫原进行第二次加免。4-5周后最后一次免疫冲击，腹腔注射25μg免疫原。
最后一次免疫后分离小鼠B细胞，与SP2/0细胞(中国科学院细胞库，TCM18)混合，参照BTX公司电转仪操作手册进行融合。融合细胞经过培养后采用酶联免疫法(ELISA)筛选出与NGF结合并能抑制人NGF和受体TrkA结合的杂交瘤细胞。再通过有限稀释法进行亚克隆，以同样ELISA方式筛选获得3个阳性杂交瘤单克隆细胞株，分别命名为43E5、137H8、138E12。
将杂交瘤单克隆细胞株进行扩增并用无血清培养基培养，收集培养基并用蛋白G柱从中纯化，以获得鼠源抗人NGF单克隆抗体43E5、137H8、138E12。
实施例2：鼠源抗NGF抗体与人NGF结合的ELISA检测
使用人NGF(北京义翘神州科技有限公司，11050-HNAC)作为抗原研究抗NGF抗体的结合能力。96孔酶标板每孔包被50ng人NGF，洗涤及封闭后加入梯度稀释的抗体，室温孵育1小时。洗涤三次后加入HRP偶联山羊抗小鼠抗体(Biolegend,405306)，室温孵育1小时，三次洗涤后加入四甲基联苯胺(TMB，Biolegend，421101)显色，1M HCl终止显色，酶标仪读取450nm处吸光值。
三个杂交瘤分泌的抗NGF抗体均以剂量依赖的方式结合至人NGF(图1)，三个抗体与人NGF结合的EC50分别为0.082nM，0.112nM，0.1nM(表1)。
表1抗NGF抗体与人NGF结合的EC50
抗体 43E5 137H8 138E12
EC50(nM) 0.082 0.112 0.100
实施例3：鼠源抗NGF抗体与人NGF结合亲和力检测
应用生物分子相互作用检测平台ForteBio Octet Red96(PALL)测定抗体亲和力。利用SA(Streptavidin)Biosensor(Fortebio，18-5021)固定生物素标记的人NGF，然后结合梯度浓度的抗NGF抗体。再加缓冲液(1X Kinetics Buffer:PBS+0.1％BSA+0.05％Tween20)进行解离，最后通过仪器算法计算出抗原抗体结合的亲和动力学常数(表2)。
表2抗NGF抗体与人NGF结合亲和力
Figure BDA0003877138220000131
实施例4:鼠源抗NGF抗体对人NGF与受体TrkA或p75结合的阻断作用检测
A.抗NGF抗体对人NGF与受体TrkA结合的阻断作用
如果采用包被受体TrkA方法检测，96孔酶标板每孔包被50ng NGF受体TrkA蛋白(融合人Fc)，洗涤三次后3％BSA封闭1小时。10000ng/mL(66.67nM)抗NGF抗体依次3倍稀释10个浓度至0.17ng/mL(0.0011nM)，取100μl与等体积1μg/mL的生物素标记人NGF混匀，二者室温孵育0.5小时后加入封闭洗涤完成的酶标板中。室温孵育1小时，洗涤三次。加入链霉亲和素标记HRP(Streptavidin-HRP，Biolegend，405210)孵育0.5小时后洗涤三次。酶标板中加TMB，显色终止后读数。
如果采用包被配体NGF方法检测，96孔酶标板每孔包被50ng人NGF，洗涤三次。3％BSA封闭1小时后洗涤三次，将10000ng/mL(66.67nM)抗人NGF抗体梯度稀释3倍至0.17ng/mL(0.0011nM)，每孔加入100μL，室温孵育1小时后洗涤三次。每孔加入100μL 1μg/mL融合人Fc的TrkA，室温孵育1小时后洗涤三次。加入HRP偶联驴抗人IgG抗体(Biolegend，410902)，室温反应1小时。洗涤后加入TMB显色，终止后读数。
结果如图2A和图2B所示，抗NGF抗体可以阻断人NGF与受体TrkA的结合，阻断效果随抗体浓度的升高而明显升高。三个抗体阻断人NGF与受体TrkA结合的IC50如表3和表4；
表3阻断TrkA-NGF结合IC50
抗体 43E5 137H8 138E12
IC50(nM) 0.767 0.738 0.677
表4阻断NGF-TrkA结合IC50
抗体 43E5 137H8 138E12
IC50(nM) 0.967 0.791 0.865
B.抗NGF抗体对人NGF与受体p75结合的阻断作用
96孔酶标板每孔包被50ng人NGF，3％BSA封闭1h后洗涤3次，加入10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，0μg/mL(66.67nM，6.67nM，0.67nM，0.067nM，0nM)的抗NGF抗体40μL，室温孵育15分钟，每孔加入40μL 2μg/mL的融合人Fc的p75(北京义翘神州科技有限公司，13184-H02H)孵育1小时后洗涤3次，加入100uL HRP偶联驴抗人Fc二抗，(Biolegend，410902)，室温反应1小时。洗涤后加入TMB显色，终止后读数。如图2C所示，所选三株抗NGF抗体中,43E5不能阻断人NGF与受体p75的结合,137H8及138E12可以阻断人NGF与受体p75的结合。
需要说明的是，Pfizer/Lilly的NGF抗体Tanezumab临床试验过程中出现骨关节炎进展加速(Rapidly Progressive Osteoarthritis,RPOA)的不良反应，Tanezumab可同时阻断NGF与TrkA及p75的结合。有研究显示，p75受体功能与神经元发育，成骨细胞分化、增殖，成肌细胞分化、肌肉修复等有关(Akiyama Y et al.(2014)Differentiation,87:111-118；Deponti et al.(2009)Molecular Biology of the Cell,20:3620-3627；Mikami et al.(2012)Differentiation,84:392-399)。此外，Sanofi公司开发的TrkA小分子抑制剂GZ389988A临床试验过程中未出现RPOA不良反应，研究人员认为与GZ389988A选择性作用于TrkA，保留了NGF-p75通路的完整功能相关(Krupka et al.(2019)Osteoarthritis andCartilage,27:1599-1607)。本发明专利中，43E5不能阻断人NGF与p75的结合，预期临床出现RPOA的可能性降低，安全性优于其它具备p75阻断作用的抗体。
实施例5：鼠源抗NGF抗体的体外中和活性检测
A.NGF诱导的TF-1细胞增殖实验
TF-1细胞(人血液白血病细胞，ATCC,CRL-2003)的生长高度依赖GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，但NGF与TF-1细胞表面的TrkA结合后也能诱导TF-1的生长，从而不需要依赖GM-CSF。
将TF-1细胞培养于含10％FBS(Gibco，10091148)，2μg/mL GM-CSF(R&D，215-GM-010)的RPMI1640培养基(HyClone，SH30027)，在对数生长期收集细胞，彻底洗涤清除原生长培养基中的GM-CSF,用不含GM-CSF的培养基重悬，每孔5000细胞稀释在80μl培养基中铺到白色透底96孔细胞培养板(corning，3610)。抗NGF抗体由400μg/mL(2666.67nM)进行4倍梯度稀释制备10个浓度，与等体积50ng/mL的人NGF混合，孵育0.5小时，取20μL加入96孔板内的细胞中，在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞72小时后加入100μL
Figure BDA0003877138220000151
细胞活力检测试剂(Promega，G7573)，震荡破碎细胞，使用多功能酶标仪(SpectraMax)读取光学luminescence信号。
如图3所示，三个抗NGF抗体能够抑制人NGF诱导的TF-1细胞的增殖，IC50如表5所示。
表5抗NGF抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖IC50
抗体 43E5 137H8 138E12
IC50(nM) 0.083 0.123 0.077
B.NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖实验
Ba/F3细胞的生长有依赖IL3及不依赖IL3两种途径，不依赖IL3的生长需要Ba/F3细胞稳定表达活性激酶。构建表达全长人TrkA的Ba/F3(TrkA/Ba/F3)细胞，该细胞增殖需要添加NGF诱导。
将TrkA/Ba/F3细胞培养于含10％FBS,100ng/mL NGF的RPMI1640培养基，收集细胞并彻底洗涤清除原生长培养基中的NGF，按照每孔3000细胞重悬于80μL不含NGF的培养基中，铺到白色透底96孔细胞培养板(corning，3610)。混合人NGF和梯度稀释的抗体，加入96孔板内的细胞中，NGF终浓度为5ng/mL，梯度稀释的抗NGF抗体终浓度最高为40μg/mL(266.67nM)。在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞48小时后加入
Figure BDA0003877138220000152
细胞活力检测试剂(Promega，G7573)，震荡破碎细胞，使用多功能酶标仪(SpectraMax)读取光学luminescence信号。
在观测TrkA/Ba/F3细胞生长的过程中，添加了人NGF的细胞可以正常增殖；三个抗NFG抗体能够抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖，抑制作用随浓度的升高而增强(图4)，IC50如表6所示。
表6抗NGF抗体抑制NGF诱导的TrkA/Ba/F3细胞增殖IC50
抗体 43E5 137H8 138E12
IC50(nM) 0.096 0.083 0.098
C.NGF诱导的TrkA/NFAT-bla/CHO细胞中报告基因的表达检测
NGF结合跨膜受体TrkA可激活下游磷脂酶C(PLC)，通过一系列信号转导引起胞内钙浓度升高和蛋白激酶C(PKC)活化，最终促进细胞核因子(nuclear factor)及活化T细胞核因子(NFAT)由胞质转运至细胞核，开启依赖NFAT的基因的表达。TrkA/NFAT-bla/CHO细胞(ThermoFisher，K1516)基因组中整合了编码人TrkA的基因，且报告基因β-内酰胺酶(β-bla)基因上游插入了NFAT响应元件，当NGF-TrkA通路激活，在NFAT控制下细胞将表达β-内酰胺酶，β-内酰胺酶的活性可以反应NGF-TrkA通路的激活程度。
按照产品说明准备TrkA-NFAT-bla/CHO细胞，每孔10,000细胞铺到384孔板，过夜培养。混合人NGF和梯度稀释的抗体，室温孵育0.5小时后加入到细胞中，使NGF最终作用浓度为80ng/mL，梯度稀释的NGF抗体终浓度最高为40μg/mL(266.67nM)。在37℃，5％CO2培养箱中培养5小时后向细胞中加入按照操作手册配制的LiveBLAzerTM FRET-B/Gβ-内酰胺酶底物CCF4(ThermoFisher，K1095)，室温避光静置2小时。多功能酶标仪(SpectraMax)读取信号。
结果显示三个抗NGF抗体可以抑制人NGF引发的信号通路的激活(图5)，IC50如表7所示。
表7抗NGF抗体抑制TrkA/NFAT-bla/CHO细胞中报告基因表达IC50
抗体 43E5 137H8 138E12
EC50(nM) 0.0532 0.0859 0.0442
实施例6：抗NGF抗体特异性检测
A.鼠源抗NGF抗体与NGF同家族蛋白结合的ELISA检测
96孔酶标板每孔包被50ng人NGF(北京义翘神州科技有限公司，11050-HNAC)，人BDNF(北京义翘神州科技有限公司，50240-MNAS),人NT-3(北京义翘神州科技有限公司，10286-HNAE)，或人NT-4(Alomone,N-270)，按照实施例2中方法检测鼠源抗NGF抗体与人NGF及三个同家族蛋白的结合情况。
如图6所示，三个鼠源抗NGF抗体与NGF(图6A)有高亲和力，抗体43E5、138E12与BDNF(图6B)，NT-3(图6C)，NT-4(图6D)基本无结合，抗体137H8与三个NGF同家族蛋白有微弱结合(图6B-6D)。
B.鼠源抗NGF抗体特异性抑制TrkA-NFAT-bla/CHO细胞中报告基因表达检测
如实施例5C中，按照产品说明准备TrkA-NFAT-bla/CHO细胞，TrkB-NFAT-bla/CHO细胞(ThermoFisher，K1491)和TrkC-NFAT-bla/CHO细胞(ThermoFisher，K1515)。
稀释本发明的抗体至40μg/mL(266.67nM)，与人NGF或者人BDNF(用于TrkB-NFAT-bla/CHO细胞)，或者人NT-3(用于TrkC-NFAT-bla/CHO细胞)混合,室温孵育0.5小时后加入到细胞中。培养5小时后向细胞中加入按照操作手册配制的LiveBLAzerTM FRET-B/Gβ-内酰胺酶底物CCF4，室温避光静置2小时。多功能酶标仪读取信号。
三个抗NGF抗体可抑制NGF与TrkA结合引起的后续信号传导，但并不影响BDNF与TrkB以及NT-3与TrkC的信号传导(图6E)；
需要说明的是，与Pfizer/Lilly的NGF抗体Tanezumab相比，本申请的三个抗NGF抗体，尤其是抗体43E5、138E12与NGF同家族抗体BDNF、NT-3、NT-4不结合，而Tanezumab与NT-3、NT-4交叉结合作用明显，也就是说，本申请的43E5、138E12特异性优于Tanezumab，预期临床不良反应表现优于Tanezumab。
实施例7：抗NGF抗体43E5与138E12的的抗原表位分级
应用生物分子相互作用检测平台Fortebio Ocete RED96检测两个抗NGF抗体43E5与138E12结合NGF是否有竞争。利用SA(Streptavidin)Biosensor固定生物素标记的人NGF，第一步上样监测抗体138E12的结合情况，第二步上样继续监测138E12或者43E5的结合情况，最后加缓冲液(1X Kinetics Buffer:PBS+0.1％BSA+0.05％Tween20)进行解离.
如图7所示，43E5与138E12可同时结合人NGF，且以非竞争方式结合。
实施例8：鼠源抗NGF抗体可变区测序及序列分析
使用TRIzol试剂盒(Ambion,15596-026)提取杂交瘤细胞总RNA，以之为模板合成第一链cDNA(Takara)。快速扩增cDNA末端(RACE)得到抗体轻链和重链片段，将扩增片段分别克隆至标准载体。测序得到抗NGF抗体43E5,137H8,138E12的重链和轻链可变区序列为：
抗NGF抗体43E5:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVRQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCRRGANLNHYGNDEGSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1)
重链可变区核酸序列：
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAGGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTAGAAGAGGGGCAAATCTTAATCACTATGGTAACGACGAGGGTTCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQID NO:2)
轻链可变区氨基酸序列：
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSVGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCWQGTHLPQTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:3)
轻链可变区核酸序列：
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGTAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGTTGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTTTGCTGGCAAGGTACACATCTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:4)
抗NGF抗体137H8:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYAVNWVRQPPGKGLEWLGMIWFDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDYYGSSWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:5)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGCTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGTTTGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGACTACTACGGTAGTAGCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:6)
轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISYYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPRTFGGGTKLDIK(SEQ ID NO:7)
轻链可变区核酸序列：
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCTATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGACATCAAA(SEQ ID NO:8)
抗NGF抗体138E12:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWFDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:9)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGTTTGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAGGGTTATTACTACGGTACTACCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ IDNO:10)
轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:11)
轻链可变区核酸序列：
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:12)
序列分析得到Kabat及IMGT系统界定的CDR，下表(表8)基于Kabat及IMGT系统的定义列出三个抗NGF抗体的CDR。
表8：抗体CDR界定
Figure BDA0003877138220000211
实施例9：抗NGF抗体对CFA致小鼠炎症性疼痛的作用
C57BL/6小鼠(浙江维通利华实验动物技术有限公司)，雄性，SPF级，6-8周龄，适应性饲养5天。适应期结束后将动物分成3组，分别为生理盐水组、抗NGF抗体43E5组、抗NGF抗体138E12组，每组10只动物。小鼠足底注射造模剂CFA之前，采用VonFrey测定3次痛阈(间隔不少于10分钟)，取3次平均值为其基础痛阈(图8A)。
次日于小鼠左后足足底注射25μl CFA致炎(CFA和液体石蜡比例为1：1)。待足趾肿胀明显后(造模后24小时左右)，同样方法3次检测小鼠左后足痛阈，取平均值为给药前的痛阈值(图8B)。
随后每组分别皮下注射生理盐水、抗NGF抗体43E5、抗NGF抗体138E12，剂量10mg/kg，并测定给药后24小时、48小时、72小时的痛阈(图8C-8E)，测定一次，评价受试物对痛阈的影响。
结果如图8所示，给药后24、48、72小时，抗NGF抗体43E5和138E12均能明显改善CFA引起的痛阈下降，与生理盐水组相比，具有统计学差异。
实施例10：鼠源抗NGF抗体人源化改造及表征
A.抗体的人源化改造
根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)序列进行人源化改造。将鼠源抗体的VL、VH的氨基酸序列在人胚胎系抗体氨基酸序列数据库进行对比和检索，找出同源性高的人类IGHV和IGKV序列作为人源化模板。通过计算机模拟技术，分析可变区与框架区氨基酸存在的可能空间位阻及相互影响，确定对维持人源化抗体活性比较关键的框架区氨基酸，在人源化过程中对这些氨基酸予以保留。通过CDR移植技术完成对轻链和重链可变区的人源化改造。之后通过选定的抗体恒定区模板，得到以下多个人源化抗体。其中抗NGF抗体43E5以人IGHV1-2为重链可变区和人IGKV2-30为轻链可变区模板，获得抗体43E5-01和43E5-02。以人IGHV1-69为重链可变区和人IGKV2-30为轻链可变区模板，获得抗体43E5-05和43E5-06。43E5-01、43E5-02、43E5-05和43E5-06四个抗体的轻链可变区序列是相同的。抗NGF抗体138E12以人IGHV4-59为重链可变区和人IGKV1-39为轻链可变区获得抗体138E12-01和138E12-02。138E12-01和138E12-02抗体轻链可变区氨基酸序列相同，重链可变区氨基酸有区别。此外，由于138E12-01和138E12-02抗体重链互补决定区序列中含有异构化位点DG以及脱酰胺位点NS，为去除以上位点对抗体的潜在影响，对138E12-01和138E12-02抗体的重链可变区进行了进一步改造。以138E12-01为模板，将VH中的DG54-55突变为EG54-55、NS60-61突变为QS60-61、同时将DG54-55、NS60-61突变为EG54-55和QS60-61，分别获得抗体138E12-08、138E12-09、138E12-10。以138E12-02为模板，将VH中的DG54-55突变为EG54-55、DG54-55突变为DA54-55、NS60-61突变为QS60-61、NS60-61突变为NT60-61、DG54-55和NS60-61同时突变为EG54-55和QS60-61获得抗体138E12-03、138E12-04、138E12-05、138E12-06和138E12-11。138E12-07以人IGHV4-59为重链可变区和人IGKV1-39为轻链可变区获得，其重链可变区的框架区序列为全人源，未保留鼠源氨基酸，但将其重链互补决定区的DG54-55和NS60-61同时突变为EG54-55和QS60-61。
对人源化抗体重链和轻链分别进行基因合成，并经酶切后连入相应质粒中。将构建好的质粒瞬时转染至CHO细胞中进行表达，经过7-10天表达，细胞培养上清用相应缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)进行纯化，之后用柠檬酸钠或其它缓冲液进行洗脱，经此步骤获得的抗体，可通过SDS-PAGE或SEC-HPLC进行纯度等鉴定，并用于后续其它表征研究。
上述抗体的可变区氨基酸序列如表9所示:
表9抗NGF抗体43E5,138E12人源化抗体可变区序列:
Figure BDA0003877138220000241
抗NGF抗体43E5人源化抗体可变区序列:
抗NGF抗体43E5人源化抗体43E5-01、43E5-02、43E5-05、43E5-06含有相同的轻链。
轻链可变区氨基酸序列：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLHSVGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCWQGTHLPQTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:31)
轻链可变区核酸序列：
GACGTGGTCATGACACAGAGCCCACTGTCTCTGCCTGTGACCCTGGGACAGCCAGCCTCTATCTCCTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTGCACAGCGTGGGCAAGACATACCTGAACTGGCTGCAGCAGAGGCCAGGACAGAGCCCAAGGCGGCTGATCTATCTGGTGTCTAAGCTGGACTCCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTTACACTGAAGATCTCTCGCGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTTCTGTTGGCAGGGCACCCATCTGCCACAGACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:32)
43E5-01：
重链可变区氨基酸序列:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTMTADKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCRRGANLNHYGNDEGSYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGCTATCGATCCTGAGACCGGAGGAACAGCTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAGAGTGACCATGACAGCCGACAAGTCTATCTCCACCGCTTATATGGAGCTGAGCAGACTGCGCTCTGACGATACAGCCGTGTACTATTGTAGGCGGGGCGCTAACCTGAATCATTACGGCAATGATGAGGGCTCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC(SEQID NO:34)
43E5-02:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCRRGANLNHYGNDEGSYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:35)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCTATCGATCCTGAGACCGGAGGAACAGCTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAGAGCCACCCTGACAGCTGACAAGTCTATCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCAGACTGCGCTCTGACGATACAGCCGTGTACTATTGTAGGCGGGGCGCTAACCTGAATCATTACGGCAATGATGAGGGCTCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC(SEQID NO:36)
43E5-05:
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGAIDPETGGTAYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCRRGANLNHYGNDEGSYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGCTATCGATCCTGAGACCGGAGGAACAGCTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAGAGTGACCATCACAGCCGACAAGTCCACCAGCACAGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGCGCAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTAGGCGGGGCGCTAACCTGAATCATTACGGCAATGACGAGGGCTCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCT(SEQID NO:38)
43E5-06：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCRRGANLNHYGNDEGSYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACAGACTATGAGATGCACTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCTATCGATCCTGAGACCGGAGGAACAGCTTACAACCAGAAGTTTAAGGGCAGAGCCACCCTGACAGCTGACAAGTCCACCAGCACAGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGCGCAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTAGGCGGGGCGCTAACCTGAATCATTACGGCAATGACGAGGGCTCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCT(SEQID NO:40)
抗NGF抗体138E12人源化抗体可变区序列：
抗NGF抗体138E12人源化抗体138E12-01,138E12-02,138E12-03,138E12-04,138E12-05,138E12-06，138E12-07，138E12-08，138E12-09，138E12-10，138E12-11含有相同的轻链。
轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:41)
轻链可变区核酸序列：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCAGAACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:42)
138E12-01：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWFDGSTDYNSALKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:43)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCTGGTTCGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:44)
138E12-02：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFDGSTDYNSALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:45)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:46)
138E12-03：
重链可变区氨基酸序列:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFEGSTDYNSALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:47)
重链可变区核酸序列:
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGAGGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:48)
138E12-04：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFDASTDYNSALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:49)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGACGCCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:50)
138E12-05：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFDGSTDYQSALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:51)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGACGGCAGCACCGACTACCAGAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:52)
138E12-06：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFDGSTDYNTALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:53)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGACGGCAGCACCGACTACAACACCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:54)
138E12-07：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWFEGSTDYQSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:55)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCTGGTTCGAGGGCAGCACCGACTACCAGAGCGCCCTGAAGAGCAGAGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:56)
138E12-08：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWFEGSTDYNSALKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCTGGTTCGAGGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:58)
138E12-09：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWFDGSTDYQSALKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:59)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCTGGTTCGACGGCAGCACCGACTACCAGAGCGCCCTGAAGAGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:60)
138E12-10：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWFEGSTDYQSALKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:61)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCTGGTTCGAGGGCAGCACCGACTACCAGAGCGCCCTGAAGAGCAGAGTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:62)
138E12-11：
重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTGYGVNWIRQPPGKGLEWLGMIWFEGSTDYQSALKSRLTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREGYYYGTTYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:63)
重链可变区核酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCAGCCTGACCGGCTACGGCGTGAACTGGATCAGACAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCATGATCTGGTTCGAGGGCAGCACCGACTACCAGAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGGGCTACTACTACGGCACCACCTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC(SEQ IDNO:64)
B.人源化抗NGF抗体表征
1)人源化抗体与人NGF结合
使用人NGF(北京义翘神州科技有限公司，11050-HNAC)作为抗原研究人源化后抗体的亲和力及特异性。包被液(PBS)稀释NGF，96孔酶标板每孔包被50ng，洗涤及封闭后加入梯度稀释的抗体，室温孵育1小时。洗涤三次后加入HRP偶联驴抗人IgG抗体(Biolegend)，室温反应1小时，三次洗涤后加入四甲基联苯胺(TMB，Biolegend)显色，1M HCl终止显色，酶标仪读取450nm处吸光值。
结合情况如表10和图9所示，不同序列的人源化抗体均与人NGF有相似的结合，结合程度与人鼠嵌合抗体(含鼠源抗NGF抗体可变区和人抗体恒定区)相当。
表10人源化抗NGF抗体与人NGF结合EC50
抗体 43E5-01 43E5-02 43E5-05 43E5-06 43E5-chi -
EC50(nM) 0.229 0.222 0.214 0.192 0.104 -
抗体 138E12-01 138E12-02 138E12-03 138E12-04 138E12-05 138E12-06
EC50(nM) 0.0403 0.0420 0.0392 0.0570 0.0634 0.0500
抗体 138E12-07 138E12-08 138E12-09 138E12-10 138E12-11 138E12-Chi
EC50(nM) 0.0340 0.0253 0.0270 0.0184 0.0324 0.0454
2)人源化抗体与其他NGF家族蛋白结合
按照实施例6A中所述的ELISA方法检测人源化抗NGF抗体与人NGF及三个同家族蛋白的结合情况。结果如图10A-H所示，人源化后抗体与NGF(图10A和10B)有高亲和力，与BDNF(图10C和D)，NT-3(图10E和F)，NT-4(图10G和H)基本无结合。
3)NGF诱导的TF-1细胞增殖实验
如实施例5A中所述，通过TF-1细胞的增殖来检测人源化抗NGF抗体的中和活性。结果如图11所示，人源化抗体均可抑制NGF诱导的TF-1细胞的增殖，且多数人源化抗体的抑制能力与人鼠嵌合抗体相当，IC50如表11所示。
表11人源化抗NGF抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖IC50
抗体 43E5-01 43E5-02 43E5-05 43E5-06 43E5-chi -
IC50(nM) 0.582 0.534 0.701 0.568 0.255 -
抗体 138E12-01 138E12-02 138E12-03 138E12-04 138E12-05 138E12-06
IC50(nM) 0.030 0.064 0.130 0.112 0.136 0.125
抗体 138E12-07 138E12-08 138E12-09 138E12-10 138E12-11 138E 12-Chi
IC50(nM) 0.214 0.067 0.035 0.031 0.062 0.074
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述，但应当认识到，本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明主旨和范围的情况下，可以对本发明做出各种改进、修饰和变化，而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。

Claims (16)

1.能够特异性结合NGF的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:16所示的VH CDR1、如SEQID NO:17所示的VH CDR2、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:25所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:26所示的VLCDR2、如SEQ IDNO:27所示的VL CDR3。
2.能够特异性结合NGF的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:5所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:7所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:5所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:7所示的序列的VL。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段带有标记；优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:6和/或8所示的核苷酸编码序列。
8.载体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
11.双特异性或多特异性分子，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合NGF，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。
12.免疫缀合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
13.药物组合物，其含有权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的双特异性或多特异性分子或者权利要求12所述的免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
14.试剂盒，其含有权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
15.嵌合抗原受体，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述抗原结合受体包含权利要求1-6任一项所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述抗原结合受体由免疫效应细胞(例如T细胞)所表达。
16.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求11所述的双特异性或多特异性分子，或权利要求12所述的免疫缀合物，或权利要求13所述的药物组合物，或权利要求15所述的嵌合抗原受体，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗NGF介导的疾病或病症；
优选地，所述的疾病或病症包括骨关节炎疼痛、手术后疼痛、类风湿关节炎疼痛、低背痛、癌症相关性疼痛、神经病理性疼痛及内脏痛；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
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