CN104910274B - 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明“抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11及其杂交瘤细胞株”，涉及免疫学领域。抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.8772的杂交瘤细胞所分泌，所述中和性单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型为：重链IgG1、轻链Kappa。对人神经生长因子具有特异性中和活性，可作为人神经生长因子的拮抗剂。

Description

抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11及其杂交瘤细 胞株

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地涉及抗人神经生长因子的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株。

背景技术

神经生长因子(NGF)是具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。

研究表明，神经生长因子(NGF)是一种在超敏反应的发生和异常性疼痛的产生中具有关键作用的递质。大量临床前研究表明：阻止NGF与其受体的相互作用，即可缓解疼痛。NGF单克隆抗体与NGF中和，阻断NGF与其感觉神经元上的受体的相互作用从而达到缓解疼痛的效果。(抗神经生长因子单克隆抗体Tanezumab.药学进展.2010,34(1):526.)。有报道显示采用神经生长因子抗体拮抗剂来预防或治疗手术后疼痛，包括来自手术或来自切割性或创伤性伤口的疼痛。还有报道显示抗NGF抗体用于治疗各种疾病，包括哮喘、关节炎和银屑病(D.L.谢尔顿.抗NGF抗体用于治疗各种疾病.中国专利申请号：02814992.0)。然而，目前对神经生长因子抗体的报道多是研究多克隆抗体(赵小林，由振东.神经生长因子抗体的制备及其应用.中国神经科学杂志.2004,20(2):171-173.)。而多克隆抗体的特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用推广。单克隆抗体具有特异性强、敏感性高的优点，在临床检测中应用广泛，可以在免疫组化、ELISA等多种方法中使用。国内外对神经生长因子单抗的研究并不常见。现已有报道得到的抗rhNGF单克隆抗体是通过采用酸处理后的沙门氏菌菌体吸附纯化的NGF(抗原：菌体1：5)脾内注射，脾细胞与骨髓瘤细胞经PEG融合后筛选得到杂交瘤细胞，并对得到的抗rhNGF单克隆抗体进行了初步的鉴定分析(苏瑾，张亚莉，尤长宣，等.抗人NGF单克隆抗体的制备及初步鉴定.细胞与分子免疫学杂志.2002,18(2):168)，但没有对抗rhNGF单克隆抗体的中和活性进行鉴定。因此，目前还需要获得一种特异性强、中和活性高的抗人NGF单克隆抗体，用于临床疼痛的缓解和疾病的治疗。

发明内容

根据上述领域的需求，本发明提供一种抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体及其杂交瘤细胞株。

本发明请求保护的技术方案如下：

抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11，由保藏号为CGMCC No.8772的杂交瘤细胞所分泌，所述中和单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型为：重链IgG1、轻链Kappa。

分泌人神经生长因子中和性单克隆抗体12C11的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.8773。

基于本领域对于抗人神经生长因子的中和抗体的研究，还请求保护上述抗体的以下：制药用途：

一种止痛药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。

一种抗过敏药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。

一种抗抗哮喘的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。一种用于治疗银屑病的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。

一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法，步骤如下：

(1)用维持培养基配制抗体样品溶液，在预稀释浓度40μg/ml的基础上，进行2倍系列稀释，共9个稀释度，将待测样品溶液转移至96孔板中，每个浓度3个复孔，每孔50μl，另选择3个孔加入不含抗体的培养基作为阴性对照，每孔100μl；

所述9个稀释度分别为：10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、0.078125μg/ml、0.039063μg/ml；

(2)另用维持培养基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，将其添加至含有抗NGF抗体样品溶液的96孔板中，每孔50μl，阴性对照孔不添加NGF培养基，另选择3个孔加入阳性对照溶液100ng/ml NGF，每孔100μl，然后将96孔板放置于37℃培养箱孵育1h；

(3)取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，PBS洗涤2次，离心收集的细胞用维持培养基重悬，配成每1ml含5×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中含有NGF蛋白及抗NGF抗体的孔、阴性对照孔和阳性对照孔中，每孔100μl；将96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养；72h后，每孔加入MTS溶液20μl，于37℃，5％二氧化碳培养3小时；

(4)从培养箱中取出96孔板，放入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定结果；

(5)通过待测制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗体孔的中和抑制率(％)＝[(阳性孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)-(抗体孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)]/(阳性孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)，计算每孔的中和抑制率， 中和抑制率越高，则抗NGF抗体的中和活性越强。

实验证明，本发明提供的抗人神经生长因子的中和单克隆抗体能够与人神经生长因子特异性结合，具有中和反应活性，因此可以作为hNGF的拮抗剂。与现有的抗人神经生长因子多克隆抗体相比，本发明提供的单抗特异性强，能够避免交叉反应，而且本发明提供的单抗经过了中和活性的鉴定，其效价高、亲和力强、特异性好，能够与人神经生长因子发生明显的中和反应。

本发明还请求保护分泌抗人神经生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号分别为CGMCC No.8773。

另一方面，本发明还提供一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法，所述方法为TF-1细胞增殖法。本发明首次采用TF-1细胞增殖法检测抗NGF抗体的中和活性，该方法可以准确、高效地检测出抗NGF抗体的中和活性，其原理是：NGF依赖的TF-1细胞在NGF蛋白存在的条件下可以促进TF-1细胞增殖，然而在添加了一定浓度的抗NGF抗体后，抗NGF抗体与NGF发生中和作用，从而抑制TF-1细胞的良好生长，然后通过添加MTS混合溶剂细胞显色，在酶标仪上OD490nm处测吸光度，计算每孔的中和抑制率，中和抑制率越高，抗NGF抗体的中和活性也就越强。

生物保藏信息：

生物材料名称：12C11

分类命名：小鼠杂交瘤细胞

保藏日期：2014年1月16日

保藏号:CGMCC No.8772

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

生物材料名称：11F1

分类命名：小鼠杂交瘤细胞

保藏日期：2014年1月16日

保藏号:CGMCC No.8773

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

附图说明

图1.免疫后小鼠血清效价检测结果

图2.抗hNGF单克隆抗体纯化效果的SDS-PAGE鉴定

图3.抗hNGF单克隆抗体蛋白的Western Blot结果

图4.抗hNGF单克隆抗体中和抑制实验结果

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行更详细的描述，需要说明的是，以下实施例仅用于解释和说明，而不是以任何方式限制本发明。

实验材料：

BALB/c小鼠：购自北京大学医学部实验动物中心。

rhNGF：重组人神经生长因子，由申请人单位表达并纯化(乐伟，彭璐佳，史权威，等.重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究.中国药事.2014，28(6)：601-606.)。

NGF依赖的TF-1-A2细胞：由申请人单位本公司驯化后克隆化筛选的TF-1细胞(刘荷中、乐伟、霍立红,等.亚克隆细胞株TF-1-A2及其制备方法与用途.中国发明专利授权号：ZL 201210119401.X.)。

注射用鼠神经生长因子(苏肽生，北京舒泰神药业有限公司，批号：201211148)

AP标记的羊抗鼠IgG：购自SIGMA公司(Cat.No.:A3562)。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可以通过商购或采用本领域常规方法制备而得，规格为实验纯级即可。

实施例1.抗hNGF单克隆抗体的制备

1、BALB/c小鼠免疫

rhNGF制备：由申请人自行表达、纯化并制备(乐伟，彭璐佳，史权威，等.重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究.中国药事.2014，28(6)：601-606.)。

选取5只雌性BALB/c小鼠，将rhNGF抗原与弗氏完全佐剂(sigma公司)混合，乳化完全后皮下注射，每只小鼠的免疫剂量为80μg免疫。首次免疫后，间隔2周及3周，将rhNGF抗原与弗式不完全佐剂(sigma公司)进行乳化后重复免疫两次，小鼠尾部取血，用间接ELISA方法检测血清特异性抗体的效价(结果如图1所示)，其中2#小鼠效价可达1：10⁴，分别对1#、2#、3#、4#和5#小鼠进行融合试验。融合前3天，腹腔加强免疫1次。

2、杂交瘤细胞的制备

超净台内无菌环境下取免疫BALB/c小鼠的脾脏研制成脾细胞悬液，用RPMI1640培养基洗涤2次，收取1×10⁸脾细胞与2×10⁷-5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管中，补加RPMI1640培养基至30ml，充分混匀。1000r/min离心10分钟，将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀。用1ml吸管在1分钟左右加预热至37℃的50％PEG2000(PH 8.0)1ml，边加边轻轻转动，肉眼可见有颗粒出现，缓慢加入RPMI1640培养基至20ml。1000r/min离心6分钟，弃去上清。前10天在HAT选择性培养基中进行培养，之后直至第一次克隆化完成前选用HT培养基培养。2周后用间接酶联免疫吸附法(ELISA法)检测融合细胞的阳性率，选出阳性值较高的孔，经有限稀释对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，连续克隆化3次使阳性克隆孔的阳性率达两次100％后，选出值高的孔转孔并扩大培养并冻存。获得了稳定分泌抗hNGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其编号为11F1和12C11，送保藏，保藏号分别为：CGMCC No.8772和CGMCC No.8773。

3、抗hNGF单克隆抗体腹水的制备、腹水效价测定及抗体纯化

采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。取6-8周龄的健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射石蜡(0.5ml/只)。1周后，杂交瘤细胞离心洗涤，用PBS调整细胞数至1×10⁶个/ml，每只小鼠注射0.5ml。5～7d后，待小鼠腹部膨大后，采集腹水并对腹水效价进行检测。腹水离心后收集上清，用Protein A Sepharose纯化抗体。分装后于-70℃保存。

实施例2.抗hNGF单克隆抗体亚类鉴定

采用Pierce公司的Rapid ELISA Mouse Antibody Isotyping Kit(Cat.No.:37503)鉴定单抗的类及亚类，按照试剂盒说明书操作。

表1抗hNGF单抗亚型的鉴定结果

实施例3.抗hNGF单克隆抗体亲和力常数测定

采用捕获抗体的方法，用GE公司生物分子相互作用分析仪Biacore 3000检测抗hNGF单克隆抗体的亲和力及结合动力学。

表2Biacore检测抗hNGF单克隆抗体与rhNGF抗原的亲和力

实施例4.抗hNGF单克隆抗体的特异性鉴定

采用Western Blot来鉴定单克隆抗体的特异性。抗hNGF单克隆抗体蛋白的纯化效果用SDS-PAGE鉴定(图2)，用Gel-blot-pro分析电泳条带的结果表明，抗体纯度均不低于90％。对rhNGF和mNGF进行SDS-PAGE电泳，电转印后，用制备的单抗(1μg/ml)进行孵育，AP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)作为二抗，按Western Blot的一般步骤操作。抗hNGF单克隆抗体蛋白的Western Blot实验结果如图3所示，由于人的NGF与小鼠NGF之间同源性高达89.1％，并有资料证明人与小鼠NGF之间存在免疫交叉反应，故在Western鉴定过程中也得到了相同的结果。抗hNGF单克隆抗体与mNGF存在微弱交叉反应。

实施例5.抗hNGF单克隆抗体中和活性检测

根据NGF依赖的TF-1细胞可以依赖NGF增殖的原理，本实验用抗hNGF的单克隆抗体中和rhNGF蛋白的生物学活性，从而抑制TF-1细胞增殖。

具体实验步骤如下：

1)用维持培养基配制抗hNGF单克隆抗体样品溶液，在预稀释浓度40μg/ml的基础上，进行2倍系列稀释，共9个稀释度，将待检测样品溶液转移至96孔板中，每个浓度3个复孔，每孔50μl，另选择3个孔加入阴性对照溶液(维持培养基)，每孔100μl。

2)另用维持培养基配制rhNGF蛋白溶液，浓度200ng/ml，将rhNGF蛋白溶液转移至含有抗hNGF单克隆抗体样品溶液的96孔板中，3个复孔每孔50μl。阴性对照孔不添加含有rhNGF蛋白的培养液。另选择3个空白孔加入阳性对照溶液rhNGF蛋白溶液100ng/ml，每孔100μl。以上两步操作完毕后，96孔板放置于37℃培养箱孵育1h。

3)取足量TF-1-A2细胞培养物，离心收集TF-1-A2细胞，PBS重悬2次，离心收集细胞后重悬于维持培养基配成每1ml含5×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中含有抗hNGF单克隆抗体和rhNGF蛋白的孔、阴性对照孔和阳性对照孔，每孔100μl。置于37度，5％二氧化碳培养。72h后，每孔加入MTS溶液20μl，于37度，5％二氧化碳培养3小时。从培养箱中取出96孔板，放入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。按照公式：抗hNGF单克隆抗体孔的中和抑制率(％)＝(50ngNGF OD490nm－阴性孔值)－(该抗体孔OD490nm－阴性孔值)/(50ngNGF OD490nm－阴性孔值)计算中和抑制率。

结果如图4所示，随着抗hNGF单克隆抗体浓度的增加，抗hNGF单克隆抗体的中和抑制率也不断增加，当抗体达到一定浓度时，中和抑制率出现平台期。如表3所示，11F1和12C11的中和抑制率高达100％，表明抗hNGF单克隆抗体与rhNGF蛋白具有明显的中和反应效应。

表3抗hNGF单克隆抗体每孔抑制率(％)

Claims (7)

1.抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11，由保藏号为CGMCC No.8772的杂交瘤细胞所分泌，所述中和性单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型为：重链IgG1、轻链Kappa。

2.分泌人神经生长因子中和性单克隆抗体12C11的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.8772。

3.一种止痛药剂，其特征在于：其药效成分包含权利要求1所述的中和性单克隆抗体12C11。

4.一种抗过敏药剂，其特征在于：其药效成分包含权利要求1所述的中和性单克隆抗体12C11。

5.一种抗哮喘的药剂，其特征在于：其药效成分包含权利要求1所述的中和性单克隆抗体12C11。

6.一种用于治疗银屑病的药剂，其特征在于：其药效成分包含权利要求1所述的中和性单克隆抗体12C11。

7.一种鉴定权利要求1所述的抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11的中和活性的方法，步骤如下：

(1)用维持培养基配制抗体样品溶液，在预稀释浓度40μg/ml的基础上，进行2倍系列稀释，共9个稀释度，将待测样品溶液转移至96孔板中，每个浓度3个复孔，每孔50μl，另选择3个孔加入不含抗体的培养基作为阴性对照，每孔100μl；

所述9个稀释度分别为：10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.15625μg/ml、0.078125μg/ml、0.039063μg/ml；

(2)另用维持培养基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，将其添加至含有抗NGF抗体样品溶液的96孔板中，每孔50μl，阴性对照孔不添加NGF培养基，另选择3个孔加入阳性对照溶液100ng/ml NGF，每孔100μl，然后将96孔板放置于37℃培养箱孵育1h；

(3)取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，PBS洗涤2次，离心收集的细胞用维持培养基重悬，配成每1ml含5×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中含有NGF蛋白及抗NGF抗体的孔、阴性对照孔和阳性对照孔中，每孔100μl；将96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养；72h后，每孔加入MTS溶液20μl，于37℃，5％二氧化碳培养3小时；

(4)从培养箱中取出96孔板，放入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定结果；

(5)通过待测制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗体孔的中和抑制率(％)＝[(阳性孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)-(抗体孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)]/(阳性孔OD490nm平均值-阴性孔OD490nm平均值)，计算每孔的中和抑制率，中和抑制率越高，则抗NGF抗体的中和活性越强。