CN103764677A - 抗神经生长因子抗体及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备适用于马的抗体的方法。还提供了与马神经生长因子(NGF)特异性结合且中和马NGF结合p75或TrkA马NGF受体的能力的马源化抗体。本发明延及编码所述抗体的核酸和使用所述抗体和/或核酸治疗马的疼痛和关节炎的方法。
Description
技术领域
本发明涉及充当马神经生长因子的拮抗剂抗体及其片段。本发明还延及制备这些抗体和片段的方法以及这些抗体和片段在治疗马的与神经生长因子相关的病症中的治疗用途，例如疼痛、疼痛相关病症以及与导致疼痛发作的病症。
背景技术
神经生长因子（NGF）是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽链、β多肽链和γ多肽链构成。NGF是神经营养因子家族的成员，其参与许多不同的作用。NGF促进感觉神经元和交感神经元的生存和分化，并且通过两类膜结合受体即低亲和性NGF受体p75和高亲和性NGF受体跨膜酪氨酸激酶TrkA来传导信号。NGF与TrkA或p75的结合导致感觉神经元中神经肽的上调。
已经描述了使用NGF拮抗剂治疗人类的疼痛和疼痛敏感(CattaneoA.、Curr.Op.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，国际专利申请WO2006/131951描述了人源化形式的大鼠αD11(aD11)单克隆抗体。αD11抗体对小鼠NGF具有结合特异性，但已知也与人类和大鼠形式的NGF结合。在施用至人之前，需要对αD11大鼠衍生单克隆抗体进行人源化，从而使产生的中和抗体最少，该中和抗体是由人类对啮齿类衍生抗体的抗大鼠抗体(HAMA)反应产生的。而且，用人恒定结构域取代小鼠恒定结构域允许选择下游效应子功能。
目前，通过施用数种镇痛剂包括局部和全身麻醉剂、麻醉性镇痛剂、α2拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAID)和类固醇来进行马的疼痛管理。这些药物中的每一种都需要频繁地施用并且在功效和安全性也有局限性。因此，对于患有慢性疼痛例如患有癌痛或关节炎的马，需要不频繁施用且持久有效的疼痛缓解。
虽然已知NGF在马组织中表达，但既没有描述马NGF的拮抗剂，也没有在马中使用阻塞NGF介导的信号传导以防止或缓解疼痛。由于不利的中和抗体的产生，因此在马中使用在其他物种中充当抗NGF拮抗剂的已知抗体并不可行。而且，包含马衍生恒定结构域和衍生自已知的抗NGF抗体例如αD11的可变结构域的嵌合抗体的产生，并不能保证与马NGF结合。此外，这样的抗体可以显示出与马中可能存在但最初衍生该抗体的物种中不存在的其他靶表位的交叉反应。另外，不利的中和抗体的产生将限制该抗体的长期施用，当治疗与慢性疼痛相关的病症或癌性病症时，这是特别重要的条件。同样，使用CDR移植或相关的技术产生马源化形式的抗NGF抗体可能导致中和抗体的产生，并且可能进一步显示抗原结合亲和性与亲合力的降低。因此，迫切需要用于马疼痛管理的结合成员，所述结合成员充当马NGF的拮抗剂，并且保持高水平的结合亲和性与亲合力，同时避免针对其的中和抗体的产生。
发明概述
经过大量的努力，本发明人意外制备了特异性结合马NGF的马源化抗体及其来源的结合片段。出乎意料地，本文表明，本发明的抗体及其结合片段与马NGF的结合，通过抑制马NGF与高亲和性TrkA受体或与p75受体的结合，隔离了马NGF的生物活性。这反过来阻止了感知神经元中神经肽的上调，结果减轻或消除了痛觉。已经使用重组DNA方法产生了抗体，使得该抗体基本上是非免疫原性的，也就是说，在施用至马个体时，并未产生针对该抗体的中和抗体。由于使用标准方法例如CDR移植等并未产生抗体，因此这样的发现是令人惊讶且完全出乎意料的。
根据本发明的第一方面，提供了制备适合用于马中的抗体的方法，其包括或基本上由以下步骤组成：
从马之外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对马中存在的靶抗原有结合特异性；
将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个马抗体的框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个马抗体的框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及
用存在于一个或多个马抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基来取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
本发明人已经发现了修饰马中使用的供体抗体的方法，这样的方法使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有在马中的该位置将是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保持了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，在马中，修饰的抗体不被看做外来的，并且尤其是在长期施用后，也没有在马中引起可能导致抗体功效的中和的免疫反应。
在某些实施方案中，取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括，用存在于对应位置的与所述一个或多个取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基来取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
在某些实施方案中，该方法还包括用衍生自马抗体的重链和/或轻链的恒定结构域置换所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的步骤。通常，该重链的恒定结构域被HC2马恒定结构域取代。
在某些实施方案中，靶抗原是神经生长因子(NGF)。
本发明第一方面的方法并不包括CDR移植。根据本发明第一方面的方法制备的抗体包含供体抗体的CDR、根据本发明的第一方面的方法制备的马源化框架区，以及马恒定结构域。
本发明延及根据本发明的第一方面例如以下的描述制备的抗体。
因此，根据本发明的另一方面，提供了特异性结合马神经生长因子(NGF)的马源化抗体或其结合片段。通常，当与NGF结合时，马源化抗体或其结合片段中和NGF生物功能。也就是说，马源化抗体或结合片段与NGF的结合隔离了NGF与TrkA受体或与p75受体结合的能力。在某些实施方案中，马源化抗体或其结合片段与NGF结合的结合亲和力KD为1x10-8或更小。通常，该马源化抗体在马中不是免疫原性的。
在某些实施方案中，根据本发明第一方面的制备抗体的方法来制备该马源化抗体。
在本发明的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够与马神经生长因子(NGF)特异性结合，该抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在一些实施方案中，中和抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是马源化抗体，即具有已经去免疫的氨基酸序列的抗体，从而，当施用至马个体后，并不产生针对其的中和抗体。在某些实施方案中，根据本发明第一方面的制备抗体的方法来制备马源化抗体。通常通过氨基酸取代或缺失的方式来选择或修饰抗体的重链恒定结构域，从而使得恒定结构域并不介导下游的效应子功能。典型地是，所述重链是马HC2或HC6重链。已经显示这些同种型缺乏效应子功能(Lewis et al，Mol Immunol.2008Feb;45(3):818-827)。更典型地是，所述重链是马HC2重链。本发明人已经证明，通过与蛋白A结合可纯化这种同种型。
在一些实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或与其具有至少85、90、95或99%序列同源性的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在本发明的另一或相关方面，提供了中和抗体或其抗原结合片段，其能够与马神经生长因子(NGF)特异性结合，该抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度。
通常，重链(VH)的可变区与包含至少一个免疫球蛋白恒定结构域的另一氨基酸序列结合。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域衍生自子类IgG(免疫球蛋白G)抗体，以形成本发明的马源化抗体的完整重链。已知七种不同的马免疫球蛋白γ(IgG)重链恒定结构域。通常，所述恒定结构域包含CH1、CH2和CH3以及位于所述CH1和CH2结构域之间的合适的连接体（或铰链“hinge”）。通常，本发明的抗马NGF抗体包含与恒定结构域结合的重链可变结构域，其中该恒定结构域并不介导下游的效应子功能例如补体结合、ADCC、Fc受体结合等。
这样的重链可以包含具有HC2或HC6同种型的重链，并且可以具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、6或7。更典型地是，所述重链是马HC2重链。
在某些实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含涉及马恒定结构域IgG2(HC2)的SEQ ID NO:6或涉及马恒定结构域IgG6(HC6)的SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%氨基酸同一性的序列的重链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些另外的实施方案中，抗体或结合片段可以包含其中恒定结构域中的至少一个残基被取代或缺失以阻止该残基糖基化的重链。该恒定结构域的残基的去糖基化可以通过阻止恒定结构域(Fc域)与细胞上的Fc受体(FcR)结合来限制下游的效应子功能。因此，在某些另外的实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：包含SEQ ID NO:8（IgG2(HC2)的非糖基化形式）和SEQ ID NO:9（IgG6(HC6)的非糖基化形式）的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的重链。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在另一个或相关的方面，本发明延及中和抗体或其抗原结合片段，其能够与马神经生长因子(NGF)特异性结合，所述抗体或抗体结合片段包含或由以下组成或基本上由以下组成：轻链和重链，其中轻链(VL)的可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中重链(VH)的可变区包含、组成为或基本组成为：与氨基酸序列SEQ ID NO:2相同或基本上同源的氨基酸序列或与其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些实施方案中，抗体或结合成员(binding member)包含轻链，所述轻链包含、组成为或基本组成为：氨基酸序列SEQ ID NO:4或与其具有至少85%、优选为95%、更优选为至少98%氨基酸同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些实施方案中，抗体或结合成员包含重链，所述重链包含、组成为或基本组成为：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选95%、更优选至少98%同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
通常，通过氨基酸取代或缺失的方式来选择或修饰所述抗体的重链恒定结构域，使得恒定结构域不介导下游的效应子功能。通常，所述重链是马HC2或HC6重链。所述重链更典型地是马HC2重链。在某些实施方案中，抗体或结合成员包含重链，所述重链包含、组成为或基本组成为：SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选90%、更优选至少98%同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6包含HC2重链，已经显示其缺乏效应子功能，但是其可以使用蛋白A柱纯化。这允许在制造中大规模纯化具有HC2重链的抗体，因而是有益的。
在某些实施方案中，抗体可以与至少受体分子缀合。
在某些另外的实施方案中，可以取代或缺失恒定结构域中的至少一个残基，以防止该残基的糖基化。因此，在某些另外的实施方案中，抗体或抗体结合片段包含、组成为或基本组成为：重链，其中该重链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选90%、更优选至少98%同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
本发明人进一步限定了一系列可以与互补性决定区(CDRs)结合以形成马源化重链可变结构域和马化轻链可变结构域的框架区(FR)。每一个重链结构域和轻链结构域都具有4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。
抗体分子可以包含重链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。重链可变结构域(VH)CDR称为HCDRs，根据Kabat编号系统在下列位置可以找到这些CDRs:HCDR1–Kabat残基31-35、HCDR2–Kabat残基50-65、HCDR3–Kabat残基95-102(KabatEA et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest(具有免疫学重要性的蛋白质序列)，5th edition.Bethesda:US Department of Health andHuman Services，)。
而且，抗体进一步包含轻链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。轻链可变结构域(VL)CDR称为LCDRs，根据Kabat编号系统在下列位置可以找到这些CDRs:LCDR1–Kabat残基24-34、LCDR2–Kabat残基50-56、LCDR3–Kabat残基89-97。
轻链可变结构域或重链可变结构域包含四个框架区，FR1、FR2、FR3和FR4，以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列插入CDR。
在另一方面或相关方面，本发明延及抗NGF抗体或其NGF抗原结合片段，所述抗体或抗体结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含以下中的至少一个：
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成的FR1框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的FR2框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的FR3框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的FR4框架区；
所述重链可变区，包含以下中的至少一个：
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成的FR1框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:15组成的FR2框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:16组成的FR3框架区；
包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:17组成的FR4框架区。
通常，轻链CDR和重链CDR衍生自对NGF、优选马NGF具有结合特异性的抗体。
通常，本发明马源化抗马NGF抗体的产生不需要待引入轻链可变结构域或重链可变结构域的框架区内的回复突变。
在某些实施方案中，包含以上描述的所述至少一个框架区的轻链可变结构域与马来源的轻链恒定结构域结合，马衍生轻链恒定结构域通常为轻链κ恒定结构域，但任选地为λ轻链。在某些实施方案中，所述轻链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的FR1区，具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的FR2区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的FR3区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的FR4区，或与前述氨基酸序列具有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少于5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
在某些另外的实施方案中，包含以上描述的至少一个框架区的重链可变区与马衍生重链恒定结构域结合。在某些实施方案中，恒定结构域的氨基酸序列没有任何翻译后修饰，或者可以被修饰以除去可能经历N-连接或O-连接糖基化的任何残基或全部残基，这样使得恒定结构域未被糖基化。在某些实施方案中，重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的FR1区，具有氨基酸序列SEQ ID NO:15的FR2区，具有氨基酸序列SEQID NO:16的FR3区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:17的FR4区，或具有与前述氨基酸序列有至少85、90、95或98%序列同一性的氨基酸序列的框架区。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约5个氨基酸，优选约10个氨基酸的长度上。
在某些另外的实施方案中，可以对本文描述的框架区进行修饰。也就是说，发明者确认，对于每一框架区中的一些残基来说，可以为指定位置选择的氨基酸。重要的是，这些框架区修饰不会导致互补性决定区的构象改变，这是由于这可以改变所得抗体的结合特异性和/或亲和性。在某些实施方案中，本发明延及将2个或以上氨基酸取代引入到轻链可变区和/或重链可变区的框架区的氨基酸残基。
因此，在某些另外的实施方案中，本发明延及多肽，例如包含具有FR1区的轻链可变结构域的抗体或其抗原结合片段，所述FR1区包含被以下氨基酸取代（其中氨基酸用其单字母代码表示）中的一个或多个修饰的氨基酸序列SEQ ID NO:10，即位置2的氨基酸残基I(I2)被氨基酸残基V取代，S7是T，A9是E，L11是V，S12是T或A，A13是V，S14是T，E17是Q，T18是R，T20是E，I21是I、L、M或V，以及E22是K。此外，还可以提供一个或多个以下取代：D1是G、K或V，I2是F、N、S或T，V3是A、G、I或M，M4是L、Q或V，T5是A或I，S7是F，A9是D、P或S，S10是F、L或T，L11是S，S12是E或V，A13是L、Q或T，S14是A或P，L15是P或R，G16是R，T18是S、G或K，V19是A，T20是D或V，I21是T，以及E22是L、N、Q、R、S或T。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链FR2区可以被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：K5是R，Q8是E，S9是A，K11是R或E，L12是R。此外，还可以提供一个或多个以下取代：Y2是F或H，Q3是R或S，Q4是H、K、R或V，K5是V，P6是I、L或S，S9是P、R、V或T，P10是L，K11是I或L，L12是A、E、G、H、Q或W，L13是F、I、M或V，I14是F、T、M或V，以及Y15是A、C、D、E、F、G、H、Q、R、S、T或V。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的轻链FR3区可以被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：S4是D，F6是Y，D14是E，Y15是F，S16是T，N20是S，S24是A，S29是I、S或T，以及F31是Y。此外，还可以提供一个或多个以下取代：G1是D或F，V2是A或F，P3是L或S，S4是A、E、G或L，F6是L，S7是C、F、G、N、R或T，G8是A，S9是D、E、G、K、R、T或W，G10是A、R或V，S11是A、F、T或Y，G12是E或T，T13是A、S或W，S16是A或V，L17是F或P，T18是A、I、S或V，I19是V，N20是D、G或T，S21是D、E、P、R或T，Q23是E或R，S24是E或T，E25是A、D、G或T，D26是N，V27是A、L、E、G或S，A28是G，S29是D、E、F、L、M、N或V，Y30是C，以及F31是H、S、T、V或W。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的轻链FR4区可以被以下氨基酸取代进行修饰：L9是I。此外，还可以提供一个或多个以下取代：F1是I或L，Q3是L，T5是S，K6是M、N或R，L7是M或V，E8是A、D或K，L9是F、M或V，以及K10是A、E、G、I、Q、R、T或V。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的重链FR1区可以被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：N13可以是K。此外，还可以提供一个或多个以下取代：K5可以是Q，G10可以是D，L11可以是Q，V12可以是M，N13可以是M或R，P14可以是I或S，S15可以是A或G，Q16可以是E，T17可以是A，S19可以是T，T21可以是S或V，T23可以是A、F或S，V24可以是I，S25可以是T，G26可以是A，F27可以是A、G、I、M、N、Q或S，S28可以是D、H、I、L、N或P，L29可以是D、S、T或V，以及T30可以是E、I、N或R。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:15的重链FR2区可以被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：W12是F。此外，还可以提供一个或多个以下取代：V2可以是L，A5可以是P、S或V，K8可以是W，G9可以是R，L10可以是P或W，W12可以是E、H、R、V或Y，以及G14可以是A、D或S。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:16的重链FR3区可以被一个或多个以下氨基酸取代进行修饰：T3是S，R6是K，F14是Y，Q16是T，M17是L，R32是G。此外，A2可以是C、G、I、T或V，T3可以是D、I、M、N或R，I4是V，T5是I、L或S，R6是E或S，D7是E或N，T8是A、E、I、P、S或Y，S9是E、G、K或T，K10是E、L、N、Q或R，S11是G、K、N或R，Q12是E、H或R，V13是A、I、L、F或S，F14是L、R、S、T或V，L15是V，Q16是I，M17是V，N18是D、K、R、S或T，S19是D、E、G、K、M或T，L20是M或V，T21是S，S22是D、E、G或R，E23是D或G，T25是A，A26是S，V27是D，Y29是A、F、I或W，A31是E、G、I、S、T或V，以及R32是A、E、G、H、I、K或S。
在某些另外的实施方案中，具有氨基酸序列SEQ ID NO:17的重链FR4区可以被以下氨基酸取代进行修饰：Q3是P。
在本发明以上方面的某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。通常，所述抗体是马源化抗体。
在本发明以上方面的某些实施方案中，本发明的马源化NGF中和抗体或由其衍生的结合片段与马NGF（神经生长因子）特异性结合且其结合亲和性的平衡解离常数(KD)为1x10-8或更小。而且，优选该马源化抗体不与马内存在的任何其他表位交叉反应，并且进一步，当将本发明的抗体施用于马时，不产生针对本发明的抗体的中和抗体。此外，优选抗体的恒定结构域不介导任何下游的效应子功能，包括但不限于补体结合和激活、ADCC以及Fc受体结合和激活。在某些另外的实施方案中，可以对本发明的抗体进行重链的恒定结构域的氨基酸序列修饰。所述修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的添加、取代或缺失。通常为了改变抗体的功能特性而进行所述氨基酸改变。例如，可以进行氨基酸修饰以防止被抗体恒定结构域介导的下游效应子功能，例如通过防止抗体结合Fc受体、激活补体或诱导ADCC的能力。此外，为了改变当施用于马时抗体的循环半衰期，可以对重链恒定结构域铰链区(hinge region)进行修饰。
通常，通过氨基酸取代或缺失来选择或修饰抗体的重链恒定结构域，使得该恒定结构域不介导下游的效应子功能。通常，所述重链是马HC2或HC6重链。更典型地是，所述重链为马HC2重链。
在另一或相关方面，本发明延及特异性结合一种或多种马可溶性蛋白的抗体或其结合片段，其中所述抗体不介导下游的效应子功能，并且所述抗体可通过结合蛋白A纯化。
在某些实施方案中，所述一种或多种可溶性蛋白选自：CSF、白细胞介素、生长因子和神经营养因子。在某些实施方案中，所述一种或多种可溶性蛋白是神经营养因子。在某些实施方案中，所述一种或多种可溶性蛋白是NGF。
在某些实施方案中，所述抗体包含通过氨基酸取代或缺失的方式选择或修饰的重链，使得所述抗体不介导下游的效应子功能。
在某些实施方案中，所述抗体包含具有HC2同种型的重链。已经证明，含有HC2同种型的抗体缺乏效应子功能，并且可使用蛋白A柱层析或蛋白A亲和色谱将其纯化。
在某些实施方案中，该抗体包含轻链和重链，其中轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85，90,95或99%序列同一性的氨基酸序列，其中重链可变结构域(VH)包含、组成为或基本组成为：与氨基酸序列SEQ ID NO:2相同或基本上同源的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同源性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些实施方案中，所述抗体包括轻链，该轻链包含、组成为或基本组成为：氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选95%、更优选至少98%氨基酸同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸、更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些实施方案中，所述抗体包括重链，该重链包含、组成为或基本组成为：氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，或与所述氨基酸序列具有至少85%、优选90%、更优选至少98%同一性的序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸、更优选约25个氨基酸的长度上。
在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。通常，所述抗体是马源化抗体。
在某些另外的实施方案中，本发明的抗体或由其衍生的结合片段与马NGF（神经生长因子）特异性结合且其结合亲和性的平衡解离常数(KD)为1x10-8或更小。而且，优选该马源化抗体不与马内存在的任何其他表位交叉反应，并且进一步，当将本发明的抗体施用于马时，不产生针对本发明的抗体的中和抗体。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不介导下游的效应子功能。通常，所述抗体或结合片段具有马重链亚型HC2。
在某些实施方案中，根据本发明的第一方面的制备抗体的方法来制备马源化抗体。
本发明延及结合马NGF且隔离其结合马p75受体和马TrkA受体能力的抗体片段。
在某些实施方案中，本发明的任一抗体的抗体结合片段可以包含通过柔性连接体连接以形成单链抗体的本发明的重链和轻链序列。
单链Fv(scFv)包含VH结构域和VL结构域。VH结构域和VL结构域结合形成靶结合位点。这两个结构域通过肽连接体共价连接。scFv分子在N末端需要轻链可变结构域的情况下可以具有VL-连接体-VH的形式，或在N末端需要VH结构域的情况下为VH-连接体-VL。因此，在某些另外的实施方案中，抗原结合片段是单链Fv(scFv)抗体片段。在某些另外的实施方案中，抗体结合片段选自Fab抗体片段、Fab’抗体片段、F(ab’)2抗体片段、Fv抗体片段、sFV抗体片段等，但并不限于此。
在某些另外的实施方案中，本发明提供了用于联合疗法的多特异性或多价抗体，其包含以不同的结合特异性与其他抗体偶联或结合的本发明的抗NGF抗体或结合片段。多特异性抗体包含对第一NGF表位有特异性的至少一个抗体或结合片段，和对马NGF上存在的另一表位或对不同的抗原有特异性的至少一个结合位点。多价抗体包含对同一马NGF表位有结合特异性的抗体或抗体结合片段。因此，在某些实施方案中，本发明延及包含本发明的马源化抗体的四个或更多Fv区Fab区的抗体融合蛋白。另外的实施方案还延及抗体融合蛋白，其包含衍生自本文描述的抗体的一个或多个Fab区与来自对马NGF有特异性的抗体的一个或多个Fab区或Fv区。在某些另外的实施方案中，本发明延及双特异性抗体，其中本发明的抗体或其结合片段与对第二靶标有结合特异性的第二抗体或其结合片段连接，所述第二靶标不是马NGF。优选地，所述第二靶标通过p75或TrkA受体有助于阻止NGF介导的信号传导。可以通过本领域技术人员熟知的多种方法或重组方法来制得这样的多价抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
本发明的另一方面提供了抗神经营养因子中和抗体，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的轻链可变结构域，和/或具有氨基酸序列SEQ IDNO:2的重链可变结构域。在某些实施方案中，神经营养因子是马神经生长因子(NGF)。
本发明的又一方面提供了治疗、抑制或减轻马的疼痛的方法，该方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的抗马NGF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是马源化抗体；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
在某些实施方案中，该马源化抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少95%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与所述氨基酸序列具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该马源化抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少95%序列同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和与前述氨基酸序列具有至少95%、更优选至少98氨基酸同一性的序列。
在某些实施方案中，该马源化抗体或其抗原结合片段是本发明的前述方面提供的任何抗马NGF抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，疼痛是指神经病理性疼痛(neuropathic pain)。特别是，疼痛可以是手术后或外科手术后疼痛。手术后疼痛(post-operativepain)可能在马的以下任何手术程序后发生，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛（肿瘤疼痛）。在某些另外的实施方案中，疼痛与炎性疼痛、瘙痒疼痛、风湿性关节炎或骨关节炎相关或由它们导致。在某些另外的实施方案中，疼痛是与脚掌疼痛、太阳下瘀伤(subsolar bruising)、蹄叶炎、蹄脓肿、后显示外伤(post showingtrauma)、比赛后创伤(post race trauma)、舟骨综合症和近端悬韧带炎(proximal suspensory desmitis)相关或由它们导致。
根据本发明的另一方面，提供了治疗马个体的关节炎的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的本发明的抗马NGF抗体或其抗原结合片段；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
在某些实施方案中，该抗体是马源化抗体。在某些实施方案中，该马源化抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQID NO:2或SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，关节炎或关节炎病症包括选自免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎和相关病症的病症。
通常，关节炎或关节炎病症的治疗包括减轻、抑制、降低、压制或延迟与关节炎病症相关的或由其引起的疼痛的发作。
本发明的又一方面提供了治疗马个体中对NGF敏感性增加引起的或与其相关的或导致其的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的本发明的抗马NGF抗体或其抗原结合片段；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
根据本发明的又一方面，提供了治疗马中被NGF诱发增殖的肿瘤和与其相关的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的本发明的抗马NGF抗体或其抗原结合片段；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
在某些实施方案中，肿瘤是骨肉瘤。在某些实施方案中，自分泌或旁分泌NGF诱导肿瘤增殖。
在某些实施方案中，本发明的前述方法进一步包括共同施用至少一种另外的药剂的步骤，该药剂可以提高和/或补足本发明的抗NGF抗体的功效。例如，该抗体或其抗原结合片段可以与至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇、透明质酸(hyaluronan)或透明质酸(hyaluronic acid)共同施用。
合适的镇痛剂的实例包括但不限于布托啡喏、丁丙诺啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替啶、吗啡、纳布啡及其衍生物。合适的NSAIDS包括但不限于对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非罗考昔、罗贝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
在某些另外的实施方案中，所述至少一种另外的药剂可以是活性治疗剂，其可以是选自抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂或类似药剂中的一组或多组。而且，所述至少一种另外的药剂可以是炎症介质(mediator)的抑制剂，例如PGE受体拮抗剂，免疫抑制剂例如环孢霉素，抗炎糖皮质激素。在某些另外的方面，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗认知紊乱或损伤的药剂，例如老龄马中日益普遍的失忆或相关病症。而且，所述至少一种另外的药剂可以是用于治疗心血管疾病的抗高血压药物或者其他化合物，例如以治疗高血压、心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一种另外的药剂可以是利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂或HMG-CoA还原酶抑制剂、苯基丁氮酮、透明质酸、多硫酸化粘多糖(polysulphated glycosaminoglycan)、白细胞介素-1受体拮抗剂、IRAP、双氯芬酸和骨关节炎疾病改善药物。
在某些实施方案中，作为前述方法的一部分，将抗体或抗原结合片段以从约0.01mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量，特别是从约0.03mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量施用至马。
在其它方面，本发明延及包含本发明任何前述方面的抗体或其结合片段的组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一方面提供了用于治疗导致马慢性疼痛或由马的慢性疼痛引起的疼痛或病症的药物组合物，其包含药学有效量的本发明的抗马NGF马源化抗体，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在某些实施方案中，所述组合物可以进一步包括至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇或类固醇。
在其它方面，本发明延及编码本发明的抗体或抗体结合片段的分离核酸。
因此，本发明的另一方面提供了编码根据本发明任意前述方面的抗体或抗原结合片段的分离核酸。
在某些实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗马NGF马源化抗体或抗体片段的轻链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链。
在某些另外的实施方案中，多核苷酸编码具有氨基酸序列SEQ IDNO:2的抗马NGF马源化抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9的重链。
在某些实施方案中，所述分离核酸进一步包含编码与其可操作地连接的一个或多个调控序列的核酸。
在另一方面，本方面提供了包含多核苷酸的表达载体，该多核苷酸包含编码本发明的重链可变结构域和/或轻链可变结构域，或重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域的多核苷酸。在某些实施方案中，所述表达载体进一步包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。
本发明的另一方面提供了并入本发明的前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的又一方面提供了产生本发明的任意前述方面的抗体的宿主细胞。
本发明的又一方面提供了产生马源化抗马NGF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达马源化抗马NGF中和抗体。
本发明的又一方面提供了产生本发明的抗马NGF马源化抗体的方法，包括以下步骤：在合适的宿主细胞内表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明抗体的轻链和/或重链；回收表达的多肽，其可以在一个宿主细胞内一起表达或者在不同的宿主细胞内单独表达；以及分离抗体。
本发明的又一方面提供了治疗、减轻或抑制马的疼痛的方法，所述方法包括：将有效量的本发明的任意前述方面的多核苷酸施用至马。
本发明的又一方面提供了本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者本发明前述方面的核酸，或者本发明任意前述方面的载体，用于治疗、预防或减轻马疼痛。
在某些实施方案中，疼痛是急性疼痛。在另外的实施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手术后疼痛或者由马的任何手术程序造成的疼痛，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛与炎性痛、瘙痒痛、风湿性关节炎相关或由其引起。疼痛可以与脚掌疼痛、太阳下瘀伤、蹄叶炎、蹄脓肿、后显示外伤、比赛后创伤、舟骨综合症和近端悬韧带炎相关或由其引起。
本发明的另一方面提供了本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者本发明前述方面的核酸，或者包含本发明的任一前述方面的载体，用于治疗骨关节炎和/或风湿性关节炎。
本发明的另一方面提供了本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明的任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，用于治疗马个体中通过NGF诱导增殖的肿瘤及其相关病症、尤其是骨肉瘤。在某些实施方案中，通过自分泌或旁分泌NGF诱导肿瘤增殖。
本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段或者本发明前述方面的药物组合物或者本发明前述方面的核酸、或者包含本发明的任意前述方面的载体在制备用于治疗或预防马疼痛的药物中的用途。
疼痛可以是急性疼痛或慢性疼痛。在某些实施方案中，疼痛是慢性疼痛。而且，疼痛可以是手术后疼痛或者由马的任何手术程序造成的疼痛，其包括但不限于矫形外科手术、软组织外科手术等。在某些另外的实施方案中，疼痛是与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛。在某些另外的实施方案中，疼痛与炎性疼痛、瘙痒痛、风湿性关节炎相关或由其引起，或者其还可以与脚掌疼痛、太阳下瘀伤、蹄叶炎、蹄脓肿、后显示外伤、比赛后创伤、舟骨综合症和近端悬韧带炎相关或由其引起。
本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段，或者本发明前述方面的药物组合物，或者本发明前述方面的核酸，或者包含根据本发明的任意前述方面的载体，在制备用于治疗、抑制、减轻或预防马风湿性关节炎或骨关节炎的药物中的用途。
本发明的另一方面提供了本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段、，或者本发明前述方面的药物组合物，或者包含本发明任意前述方面的抗体或抗体结合片段的核酸或载体，在制备用于治疗马中通过NGF诱导增殖的肿瘤及其相关病症尤其是骨肉瘤的药物中的用途。在某些实施方案中，通过自分泌或旁分泌NGF来诱导肿瘤增殖。
本发明的另一方面提供了产生本发明的抗马NGF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或其后代细胞。
本发明的又一方面提供了用于治疗马的疼痛或者用于治疗与疼痛相关病症、或者用于治疗、减轻或抑制与骨关节炎、风湿性关节炎、炎性疼痛、瘙痒痛、脚掌疼痛、太阳下瘀伤、蹄叶炎、蹄脓肿、后显示外伤、比赛后创伤、舟骨综合症和近端悬韧带炎相关的疼痛的试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明的任一前述方面的抗马NGF抗体或结合片段以及其使用说明。
本发明的又一方面提供了体外、离体和体内检测流体中抗马NGF单克隆抗体的诊断试剂盒，用于确定所述抗体的浓度。该试剂盒可以包含本发明任意抗体或其结合片段。该试剂盒可以包含使用说明。
附图说明
图1示出根据本发明产生的马源化抗体与鼠NGF和马NGF结合的图表。
图2A-示出显示本发明的马源化抗体蛋白A纯化的凝胶，如同使用对重链具有特异性的抗马多克隆抗体通过蛋白免疫印迹所显示的；图2B示出使用SDS-Page(B)纯化马源化抗体的结果的凝胶。
图3示出显示通过马源化抗体抑制TF-1细胞的NGF诱导增殖的曲线图。
图4示出显示缺少通过抗原捕获的马源化抗体诱导的补体沉积(complement deposition)的图表。
图5示出马源化抗NGF的轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。下划线标注根据Kabat编号识别的三个CDR区。特定残基上方的星号表明大鼠αD11抗鼠NGF单克隆抗体之间序列上的区别。
图6示出马源化抗NGF的重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)。下划线标注根据Kabat编号识别的三个CDR区。特定残基上方的星号表明马源化序列与大鼠αD11抗鼠NGF单克隆抗体之间的序列上的区别。
图7示出马κ轻链(eqN-kLC)抗体的马源化抗NGF轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。用黑体表示可变结构域。
图8示出的马源化抗NGF重链可变结构域马IgG-2重链(eqN-HC2(IgG2))的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。用黑体表示可变结构域。
图9示出具有HC6重链恒定结构域的马源化抗NGF重链可变结构域IgG-6重链(eqN-HC6(IgG2))的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。用黑体表示可变结构域残基。
图10示出马源化抗NGF MAbs的HC2和HC6同种型变体的蛋白A亲和层析的比较。图10A和10C示出加载型2（HC2，图10A）和型6（HC6，图10C）抗体的CHO转染上清液后的UV吸收率（黑线）和导电率（灰线）的分布图。图10B和图10D示出从柱回收抗体（通过定量ELISA测量），并且显示几乎所有的HC2抗体与柱结合并且其通过特定的洗提被回收（图10B）,而没有HC6抗体通过柱结合（图10D）。图11示出通过对应于本发明的方法制备的抗马NGF多克隆抗体降低马炎性疼痛。
发明详述
通过大量的试验，发明人获得了大鼠抗-小鼠NGF单克隆抗体(MAb)αD11氨基酸序列，并且用其产生了非免疫原性抗-NGF抗体。所得到的抗体可以是嵌合抗体或马源化抗体，其并不是使用标准CDR移植技术生产而得，其出乎意料地显示了结合马NGF的高亲和性。更令人惊奇的是，显示该抗体可中和马NGF生物功能，特别是通过抑制NGF基于细胞的受体TrkA和p75的结合。而且，还意外地发现，当施用至马时，并不在马中产生针对它的中和抗体。因此，本发明的非免疫原性抗体适合于长期缓解马的慢性疼痛。
发明人利用的产生本发明抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的方法，导致轻链可变结构域和重链可变结构域的框架区内存在的特定大鼠（供体）氨基酸残基被这样的残基取代，基于发明人的分析，所述残基会保留CDR区的构象，并因此保持结合特异性和亲合力，同时如果将抗体以不变的方式施用至马，降低可能导致针对该抗体产生的中和抗体的免疫原性表位的存在。具体而言，制备本发明(被称为PETisation)抗体的方法包括：通过将供体抗体框架区的序列与衍生自马的一个抗体或抗体库的序列进行比较，评价供体（例如大鼠）抗体框架区的序列施用至马的适宜性。尽管该比较是在供体序列与靶序列的单个成员之间进行，但是显而易见的是，与靶序列库进行比较是优选的，因为这将扩展靶标种类中每一Kabat位置的自然选择的数目。这不但将增加供体与靶标之间匹配的可能性，而且还将扩展不存在匹配的取代的选择。因此，将能够选择与供体尽可能紧密的特征的取代。当供体序列与马序列在任何Kabat数目或对应的位置不同时，修饰供体序列以用马中该位置的自然的氨基酸残基来取代正在讨论的氨基酸残基。
如果需要取代供体免疫球蛋白中存在的氨基酸残基，通常采用保守取代的原则，其中该氨基酸残基天然位于马Kabat位置，并且在大小、电荷、疏水性方面与供体序列中被取代的氨基酸尽可能密切相关的氨基酸残基取代。目的是选择不引起供体抗体的三维结构扰动或破坏或引起最低程度的扰动或破坏。在某些情况下，将没有清楚的选择，并且每一选择都有利弊。最终的决定可能要求各种可选序列的三维建模甚至表达。然而，通常利用明显的偏好。作为该步骤的结果，当残基在靶中是外来的并且该取代氨基酸与被取代的氨基酸尽可能密切相关时，仅对供体序列作出改变。因而，避免了外来表位的产生，但是由于维持了整个三位结构，因此，还维持了亲和性和特异性。
轻链恒定结构域和重链恒定结构域通常衍生自马（靶）衍生的抗体。选择或锈蚀重链恒定结构域，从而使得它们不介导下游的效应子功能。非常意外的是，由于发现并没有产生针对本发明生产的抗体的中和抗体或者产生了最少的所述抗体，因此惊人地发现该抗体具有长循环半衰期和重复剂量给药的相关益处。而且，由于以不影响CDR区的三位构造的方式进行框架残基取代，使其结合特异性没有变化。
尽管杂合的鼠-马嵌合抗体是已知的，但是目前在文献中并没有描述完全马源化的多克隆抗体的例子。因此，非常意料不到的是，可以产生这样的抗体，并且经证明其具有治疗功效。
在人类和小鼠中存在四种主要的IgG同种型，虽然术语是类似的，但它们在行为和功能上是不同的，其包括对细菌产物例如蛋白A和蛋白G的亲和性，激活补体依赖性细胞溶解(CDC)的能力以及通过抗体依赖性细胞毒性应(ADCC)诱导杀死靶细胞的能力。当将抗体设计用于为清除具有它们的同源抗原的靶细胞时，用CDC和ADCC活性或“防护的”恒定结构域选择IgG同种型在临床上被认为是有益的，例如在肿瘤控制或感染控制方面（例如，为了上述目的，在人类医学应用中优选人IgG1同种型）。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小CDC和ADCC活性的人IgG同种型（例如，在这样的人类医学应用中，常常优选IgG4同种型）。已经描述了马免疫系统中的七个不同的免疫球蛋白γ(IgG)重链恒定结构域同种型以及单独的κ和λ恒定结构域序列。并没有按照由其介导的功能活性来表征七个马重链恒定结构域IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6和IgG7。当将抗体设计用于为例如在肿瘤控制或感染控制中清除具有同源抗原的靶细胞时，用CDC和ADCC活性恒定结构域选择IgG同种型是有利的，例如在人类医学应用中优选人IgG1同种型。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小或“非防卫”的CDC和ADCC活性的人IgG同种型。马MAb同种型具有更广的活性谱，因此推测防卫的(armed)重链和非防卫的(disarmed)重链的选择具有相似的价值。
本发明的抗体包含马来源的重链恒定结构域和马来源的轻链恒定结构域。而且，互补性决定区衍生自大鼠αD11抗-小鼠NGF抗体。αD11抗体首先描述于Cattaneo et al.(Cattaneo A,Rapposelli B,Calissano P.(1988)“Three distinct types of monoclonal antibodies after long-termimmunization of rats with mouse nerve growth factor”.J Neurochem50(4):1003-1010)。随后Ruberti et al.(Ruberti,F.et al.(1993)“Cloning andExpression of an Anti-Nerve Growth Factor(NGF)Antibody for StudiesUsing the Neuroantibody Approach”.Cellular and Molecular Neurobiology.13(5):559-568)克隆了αD11抗体。
将衍生自αD11抗体的CDR区域与本发明人确定的框架区序列组合来维持CDR的三级结构，因此维持了结合特异性，同时当将抗体施用至马时，阻止针对所述抗体产生中和抗体。
每一轻链可变结构域和重链可变结构域都包含四个框架区，称为FR1-FR4。对于这些框架区中的每一个，本发明人已经确定了每一特定位置的优选氨基残基（所谓的优选残基），和还可能在该位置提供的可选的氨基酸残基。以下表1至表8示出每一重链和轻链的四个框架区。这些表相对特定框架区，并且进一步用于沿完整的重链可变结构域或轻链可变结构域的长度识别特定残基的位置的编号系统，提供了氨基酸位置。组1示出的一个残基或多个残基是优选的残基，而组2的残基是可选的残基。然而，对于涉及该特定位置的组1所示的残基来说，这些残基通常不是优选的。使用单字母命名系统确定氨基酸残基。
表1轻链可变结构域FR1残基
表2轻链可变结构域FR2残基
表3 轻链可变结构域FR3残基
表4 轻链可变结构域FR4残基
表5 重链可变结构域FR1残基
表6 重链可变结构域FR2残基
表7 重链可变结构域FR3残基
表8 重链可变结构域FR4残基
因此，本发明的马源化抗体不同于例如由衍生自第一物种的完整的可变结构域和衍生自第二物种的可变结构域组成的嵌合单克隆抗体或者不同于CDR-移植的马源化抗体，其中重链可变结构域和轻链可变结构域的互补性决定区(CDRs)包含衍生自供体抗体并被引入衍生自靶抗体或马生殖系序列的框架区(FR)和恒定区(CR)的氨基酸残基。
优选，马源化抗体基本上保留了衍生CDR的母体（供体）抗体的结合特异性。这意味着该马源化抗体将显示与衍生CDR的供体抗体相同或基本上相同的抗原结合亲和性和亲合力。理想的是，该马源化抗体对靶表位的亲和性将不小于供体抗体对供体抗体对靶表位亲和性的10%，更优选不小于约30%，最优选是不小于该母（供体）抗体的亲和性的50%。测定抗原结合亲和性的方法是本领域已知的，并且包括半-最大结合测定(half-maximal binding assays)、竞争测定和斯卡查德分析(Scatchardanalysis)。
如前文所限定的，本发明延及衍生自本发明的马源化抗体的结合成员或抗原结合片段。这样的抗原结合片段指保留与马NGF特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已经证明，可以通过全长抗体来执行抗体的抗原结合功能。在某些实施方案中，结合成员或抗原结合片段可以是分离的结合成员。本发明的结合成员或抗原结合片段可以包含本发明的抗体的片段，例如完整的马源化抗体分子的片段，诸如重链或轻链，例如重链和/或轻链的可变结构域。在某些实施方案中，结合成员通常包含、组成为或基本组成为：抗体VH和/或VL域。还提供了结合成员的VH域，也作为本发明的一部分。3个互补性决定区("CDRs")以及4个相关的框架区("FRs")位于每一VH和/或VL域内。VH结构域通常包含3个HCDR（重链互补性决定区），并且VL域通常包含3个LCDR（轻链互补性决定区）。因此，结合成员可以包含VH域，其依次包含VH CDR1(或HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)以及多个相关的框架区。结合成员可以额外地或可选地包含VL结构域，其依次包含VL CDR1、CDR2和CDR3以及相关的框架区。VH或VL结构域通常包含四个框架区，FR1、FR2、FR3和FR4，以下述排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4穿插3个互补决定区。
图5示出根据本发明抗NGF抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列。用下划线标注CDR1、CDR2和CDR3区。而且，图6示出本发明抗NGF抗体重链可变结构域的氨基酸序列。用下划线标注CDR1、CDR2和CDR3区。
在图5和图6中，根据Kabat等设计的编号系统(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242,Kabat etal.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391)可以对轻链可变结构域（图5）和重链可变结构域（图6）的残基进行常规编号。Kabat编号系统指对比抗体或其抗原结合片段的重链可变结构域和轻链可变结构域中的其他氨基酸残基更易变的氨基酸残基编号的系统。当提及可变结构域中的残基（大概是轻链的残基1-104和重链的残基1-113）时，通常使用Kabat编号系统。在本发明特定阐述的情况下，该编号系统仅用于本发明中。这是因为Kabat残基名称并不总是与本文列举的相关序列中给出的本发明重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸残基的线性编号直接对应。特别是，与缩短或被插入的结构组成对应的严格Kabat编号的氨基酸相比，不论是重链或轻链的基本可变结构域结构的框架区还是互补性决定区(CDR)，实际的线性氨基酸序列可能含有较少的或额外的氨基酸。用使用Kabat编号的标准序列校准抗体序列的残基，来确定任何给定抗体的残基的正确Kabat编号。
图6示出重链可变结构域氨基序列。其同样在SEQ ID NO:2中示出。然而，在图6中，编号考虑到氨基酸残基80、80A、80B和80C，其属于Kabat编号方式；而在SEQ ID NO:2中进行线性连续编号，残基80、80A、80B和80C依次列为80、81、82和83。对图7中的Kabat残基100、100A、100B、100C、100D、100E和100F，也同样如此。
如上文所述，抗体结合片段可以选自不限于Fab片段、Fab’片段和scFv(单链可变片段)或者选自拟肽物、双特异性抗体或相关的多价衍生物。
在某些实施方案中，抗体结合片段是Fab或F(ab’)2片段，其由异四聚体(heterotetrameric)抗体的VL、VH、CL和CH1结构域组成。在某些实施方案中，VL结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，并且VH结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，CL和CH1结构域基于马免疫球蛋白CL和CH1结构域的氨基酸序列，特别是IgG2(HC2)或IgG6(HC6)马衍生的恒定结构域。
用于重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的方法是本领域技术人员熟知的，并且其包括国际PCT专利公开WO92/22324所公开的方法和Sawaiet al.(“Direct Production of the Fab Fragment Derived From the SpermImmobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNAExpression Vectors”,1995,AJRI34:26-34)中公开的方法。Huston et al.（“Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”,Methods in Enzymology,vol.203:46-88(1991)）中公开了可以用于产生scFv（单链Fv片段）的技术的实例。
在某些实施方案中，根据Morimoto(Morimoto et al.,"Single-steppurification of F(ab')2fragments of mouse monoclonal antibodies(immunoglobulins G1)by hydrophobic interaction high performance liquidchromatography using TSKgel Phenyl-5PW"Journal of Biochemical andBiophysical Methods24:107-117(1992))的方法，通过蛋白水解消化，可以从全长抗体衍生抗体片段。还可以通过宿主细胞直接产生抗体片段（Carter et al.,"High level Escherichia coli expression and production of abivalent humanized antibody fragment"Bio/Technology10:163-167(1992)）。
除了提供对马NGF具有结合特异性且抵消马NGF功能的马源化单克隆抗体之外，本发明进一步延及除了包含基于SEQ ID NO:1限定的VL（轻链可变）区的氨基酸序列和SEQ ID NO:2限定的VH（重链可变）区的氨基酸序列的一对结合域之外的结合成员。特别是，本发明延及基于本发明的抗体的马源化抗体的VL或VH区的单个结合结构域。
因此，在本发明的某些另外的实施方案中，提供了结合成员，其包括或由以下组成或基本上由以下组成：衍生自本发明的人源化抗体的单个结合结构域。在某些实施方案中，单个结合结构域衍生自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4限定的VH（重链可变结构域）的氨基酸序列。这样的结合结构域可以用作马NGF的寻靶剂。
在某些实施方案中，可以用另外的工程技术修饰本发明的抗体，例如通过包括可以改变血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性的修饰。而且，在某些实施方案中，可以产生改变糖基化模式改变的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，改变本发明的抗体以增加或降低该抗体糖基化的程度。多肽的糖基化通常是N连接或O连接。N连接指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于碳水化合物部分与天冬酰胺酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。因此，多肽中的这两个三肽序列任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的任一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。本发明人提供了非糖基化的马恒定结构域，其在本文中限定为SEQ IDNO:8或9。
在某些另外的实施方案中，通过将本发明的抗马NGF抗体与聚乙二醇(PEG)反应使其聚乙二醇化(PEGylated)。
在某些实施方案中，可以通过选择影响(a)取代区域中多肽主链的结构例如，片层或螺旋构象；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链的大部分来完成抗体生物学特性的修饰。根据侧链性质的相似性可以将氨基酸分组(A.L.Lehninger,in Biochemistry,2nd Ed.,73-75,WorthPublishers,New York(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)无电荷极性的：GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、GIu(E)；(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可选地，基于共同的侧链的性质，可以将天然存在的残基分组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、VaI、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、GIn;(3)酸性的：Asp、GIu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：GIy、Pro；(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将使得这些类之一的一种取代为另一种。还可以将这类取代的残基引入到保守取代位点或者引入到剩余的（例如，非保守的）位点。
在各种另外的方面，本发明延及包含连接至分子伴侣的本发明的抗马NGF抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物。在某些实施方案中，这样的抗体-伴侣分子缀合物是通过化学连接的方式缀合，例如肽连接体、肼连接体或二硫化物体连接。在某些实施方案中，偶联伴侣是效应分子、标记、药物或载体分子。将本发明的抗体与肽基和非肽基偶联伴侣偶联的合适的技术是本领域技术人员已知的。合适的标记的实例包括可检测标记例如放射性标记，或酶标记例如辣根过氧化物酶，或化学部分例如生物素。可选地，标记可以是功能标记，例如蓖麻毒素或能够在抗体结合位点将前药(prodrugs)转化为活性药物的前药(pro-drugs)。
在各种另外的方面，本发明延及编码本发明的马源化抗体、抗体片段和结合成员的多核苷酸，特别是分离的多核苷酸。如本文所限定的，“多核苷酸”包括任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA，包括但不限于单链和双链RNA以及单链和双链区的混合物的RNA。本发明的多核苷酸，例如编码本发明的多肽的多核甘酸，包括其等位基因变体和/或它们的补体，其包括在中等或严格条件下与这类核苷酸序列杂交的多核苷酸。
本发明进一步延及基于本发明的马NGF抗体的抗体模拟物，例如域抗体、纳米抗体、单抗体、(unibody)、万能抗体(versabody)以及duocalin。很多抗体模拟技术是本领域技术人员已知的。例如，所谓的域抗体(Domantis,UK)是抗体的小的功能结合单元，其对应于人抗体轻链或重链的可变区。用于产生这样的域抗体的说明可以在美国专利第6291158号、美国专利第6582915和美国专利第6593081号中找到。纳米抗体是抗体来源的治疗蛋白，其含有骆驼中发现的天然存在的重链抗体的结构特性和功能特性。单抗体是进一步的抗体片段技术，以除去IgG4抗体的铰链区为基础。铰链区的缺失导致大小大约为传统IgG4抗体的一半且具有单价结合区的分子。单抗体保留了IgG4抗体的惰性特性，因此不引起免疫反应。
而且，结合分子包括亲和体分子(US专利5,831,012)、DARPins(设计的锚定重复蛋白)(国际PCT专利申请公开WO02/20565)和anticalins(US专利7,250,297和WO99/16873)。万能抗体是另一种抗体模拟技术。万能抗体(Amunix,US专利2007/0191272)是3-5kDa的称为微蛋白的小蛋白，其半胱氨酸残基大于15%，这些残基形成取代蛋白质通常显示的疏水核心的高密度二硫键支架。
Avimer是另一种抗体模拟物。Avimers起源于人血清蛋白家族的重组。它们是由调控结合结构域组成的单一蛋白链，每一结合结构域经设计结合特定的靶位点。Avimer能同时结合单蛋白靶标上的位点和/或多蛋白靶标上的位点。被称为多点连接或亲和力，这种结合机制模拟体内细胞和分子相互作用的方式，支持拮抗剂和激动剂的产生，并且导致具有多重功能和强活性的药物。根据通过引用并入本文的WO2004/044011和且例如US2005/0053973可以生产Avimers文3-5kDa的称为微蛋白的小蛋白库。Avimers3-5kDa的称为微蛋白的小蛋白库也可以从Avidia Inc(Mountain View,California,USA)商业获得。
抗体的产生
可以通过化学合成来完全或部分地产生本发明的抗体和结合成员。例如，可以通过本领域技术人员已知的方法来制备本发明的抗体和结合成员，例如标准液肽合成或固相肽合成方法。可选地，使用液相肽合成方法或者进一步通过液相、固相和溶液化学的组合可以在溶液中制备抗体和结合成员。
本发明进一步延及通过在合适的表达系统中表达编码含有本发明抗体的至少一个氨基酸的核酸来产生本发明的抗体或结合成员，使得可以编码期望的肽或多肽。例如，可以表达编码氨基酸轻链的核酸和编码氨基酸重链的第二核酸以提供本发明的抗体。
因此，在本发明的某些另外的方面，提供了编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。
通常，可以以分离的或纯化的形式提供编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸，或者以基本上没有可以与其天然联系的材料的形式，除了一个或多个调控序列之外，提供编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。表达本发明的抗体或结合成员的核酸可以是完全或部分合成的，并且其可以包括但不限于DNA、cDNA和RNA。
熟练技术人员可以利用本领域技术人员熟知的方法容易地制备编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列，例如Sambrook et al.（MolecularCloning”,A laboratory manual(分子克隆:实验室手册),cold Spring HarborLaboratory Press,Volumes1-3,2001(ISBN-0879695773)）和Ausubel et al.（Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的小方法).JohnWiley and Sons,4th Edition,1999(ISBN–0471250929)，分子生物学中的短期协议）中描述的方法。所述技术包括(i)使用聚合酶链反应(PCR)扩增核酸样品，(ii)化学合成；或(iii)制备cDNA序列。可以以本领域技术人员已知的任何合适的方式合成和使用编码本发明的抗体或结合成员的DNA，包括对编码DNA取样、确定待表达的部分的任一侧的合适的限制酶识别位点和从DNA切离该部分。然后将切离的部分可操作地连接至合适的启动子并在合适的表达系统中表达，例如可商购获得的表达系统。可选地，可以通过使用合适的PCR引物来扩增DNA的相关部分。可以通过定点突变对DNA序列进行修饰。
以含有如上所述的至少一个核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体，提供编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列。构建体可以包含在包含一个或多个如上的构建体的重组细胞内。可以通过在合适的条件下培养含有合适的核酸序列的重组宿主细胞来便利地实现表达。表达后，可以使用任何合适的方法将抗体或抗体片段分离和/或纯化，然后视情况使用。
用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫和杆状病毒系统。本领域用于表达异源的多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、海拉细胞(HeLa cells)、仓鼠崽肾细胞和NSO小鼠骨髓瘤细胞。普通的优选细菌宿主是E.coli.。在原核细胞例如E.coli.中表达抗体和抗体片段，在本领域中被良好地建立。作为产生结合成员的选项，在培养的真核细胞中表达对本领域技术人员而言也是可用的。
用于生产抗体的常用方法是本领域人员熟知的，这样的方法讨论于例如Kohler and Milstein(1975，Nature256:495-497)、美国专利第4,376,110号、Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，1988，Cold Spring Harbor中。用于制备重组抗体分子的方法在上述文献中也有描述，并且在例如欧洲专利0,368,684中也有描述。
在本发明的某些实施方案中，使用包含编码抗体或结合成员的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入物的重组核酸。按照定义，这样的核酸包含编码单链核酸、由所述编码核酸和由其互补核酸组成的双链核酸或者这些互补（单链）核酸本身。
而且，编码抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸可以是酶促或化学合成的具有编码用于天然存在的重链可变结构域和/或用于轻链可变结构域或其突变体的真实序列的核酸。
本发明的抗体不但通过重组直接产生而且可以通过作为与异源多肽的融合多肽重组的方法产生，异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选为可被宿主细胞识别和加工的（即被信号肽酶切割）序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列通过被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp(复合天然氨基酸)或热稳定肠毒素II前导序列(heat-stable enterotoxin II leaders)的原核信号序列取代。
当用于提及本发明的马源化抗体或由其衍生的结合成员或编码其的多肽时，术语“分离的”指所述抗体、结合成员或核酸（多核苷酸）以分离的和/或纯化的形式提供的状态，也就是说将它们从其天生环境中隔离、分离或纯化，并且它们以基本纯或均质的形式提供，或者在有核酸或没有或基本上没有除了编码具有所需功能的多肽的序列外的起源的核酸或基因的情况下提供。因此，这类分离的抗体、结合成员和分离的核酸将没有或基本上没有与其天然联系的材料，例如当这些制备是在体外或体内通过重组DNA技术进行时，在它们的天生环境或制备环境（例如细胞培养物）中找到的其他多肽或核酸。
抗体、结合成员和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配置并且实际上其仍可以视为以分离的形式提供。例如，如果用于在免疫测定中覆盖微量滴定板，可以将抗体和结合成员与明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时将抗体和结合成员与药学上可接受的载体或稀释剂混合。可以自然地或通过异源真核细胞（例如，CHO或NSO细胞）使抗体或结合成员糖基化，或者抗体或结合成员（例如，如果通过在原核细胞中表达来生产）也可以不被糖基化（非糖基化）。
包含抗马NGF马源化抗体分子的异源制剂也构成本发明的一部分。例如，这样的制剂可以是具有全长重链的抗体和具有缺少C端赖氨酸的重链的抗体和具有不同糖基化程度的抗体和/或具有衍生氨基酸（例如N端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基）的抗体的混合物。
药物组合物
通常可以将本发明的药物组合物制备成液体制剂、冻干制剂，可以作为液体或气雾制剂重构的冻干制剂。在某些实施方案中，制剂中抗体的浓度为约0.5mg/ml至约250mg/ml，约0.5mg/ml至约45mg/ml，约0.5mg/ml至约100mg/ml，约100mg/ml至约200mg/ml，或者约50mg/ml至约250mg/ml。
在某些实施方案中，制剂还包含缓冲剂。通常，制剂的pH为约pH5.5至约pH6.5。在某些实施方案中，缓冲剂可以包含约4mM至约60mM的组氨酸缓冲剂，约5mM至约25mM的琥珀酸盐缓冲剂，或者约5mM至25mM的醋酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂包含浓度为约10mM至300mM、通常为约125mM的氯化钠，和浓度为约5mM至50mM、典型地为约25mM的柠檬酸钠。在某些实施方案中，制剂还可以包含浓度为大于0%至约0.2%的表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组，但不限于：聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85以及其组合。在优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯-20并且可以进一步包含浓度为125mM的氯化钠和浓度为25mM的柠檬酸钠。
施用
本发明的抗体或结合成员可以单独施用，但是优选作为药物组合物施用，药物组合物通常将包含根据既定的给药途径选择的合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药学载体包括水、甘油、乙醇等。
可以将本发明的单克隆抗体或结合成员通过任何合适的途径施用至需要治疗的患病马中。通常，可以将组合物通过注射或输液肠道外给药。用于肠道外给药的优选的实例包括但不限于：静脉内、心脏内、动脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下、跨粘膜、吸入或经皮肤给药。给药途径还可以包括局部给药和肠内给药，例如粘膜（包括肺粘膜）给药、口服给药、鼻部给药、直肠给药。
在组合物作为可注射组合物递送的实施方案中，例如静脉内、皮肤内或皮下的应用中，活性成分可以是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受的水溶液形式。本领域技术相关人员完全能使用例如等渗媒介例如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer’s injection)或乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer’s injection)制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
还可以通过微球、脂质体、其他微粒物递送系统或置于某些组织包括血液中的持续释放剂来施用组合物。以上所述的方法和方案(protocols)以及根据本发明可以使用的其他方法和流程的实例可以在Remington’sPharmaceutical Sciences（霍明顿药物学，第18版,Gennaro,A.R.,Lippincott Williams&Wilkins）、Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems（药物剂型和药物递送系统，第20版ISBN0-912734-04-3）和Ansel,H.C.et al.（第7版ISBN0-683305-72-7）中找到，其全部内容通过引用并入本文。
通常将治疗有效量的本发明的抗体和组合物施用至个体，该治疗有效量是对施用了该组合物的个体足以显示益处的量。施用的实际剂量、给药频率(rate)和时长将根据被治疗的病症的性质和严重性、被治疗的病患的诸如年龄、性别和体重的因素以及使用的途径来确定。应当进一步考虑组合物的性质，例如结合活性和/或体内血浆寿命、制剂中抗体或结合成员的浓度，以及递送的途径、位置和频率。
剂量给药方案可以包括抗体或组合物的单一给药，或者抗体或组合物的多剂量给药。抗体或含有抗体的组合物可以进一步顺序地或单独地与其他治疗剂和药物施用，所述其他治疗剂和药物用于治疗施用本发明的抗体或结合成员以治疗的病症。
可以施用至个体的剂量给药方案的实例选自但不限于：1μg/kg/天至20mg/kg/天、1μg/kg/天至10mg/kg/天、10μg/kg/天至1mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量是这样的，其使得获得血浆浓度为1μg/ml至100μg/ml的抗体。然而，所施用的组合物的实际剂量、频率和时间安排将取决于被治疗的病症的性质和严重性。治疗的药方例如剂量决定等最终属于兽医从业人员和其他兽医的责任并听凭他们处理，通常考虑是待治疗的病症、个别患者的病症、递送的位置、给药方法和从业人员已知的其他因素。
定义
除非另有限定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清楚，然而，在发生歧义的情况下，本文给出的定义优先于任何字典或外在的定义。
在全文中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或其他变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包括(includes)”或“包括(including)”应理解为表示包含所述整数或整数组，但并不排除任何其他的整数或整数组。
如本文所使用的，除非文中明确要求，诸如“a(一个/种)”、“an(一个/种)”以及“the(该/所述)”的术语包括单数个或复数个参照物。因此，例如，提到“一种活性剂(an active agent)”或“一种药学活性剂”包括一种单一的活性剂和两种或以上不同的活性剂组合，而提到“载体”，其包括两种或以上载体以及单一载体的混合物等。而且，除非文中另有要求，单数的术语包括复数并且复数的术语也包括单数。
如本文所限定的，术语“疼痛”指与实际的或潜在的组织损伤相关的或按照这样的损伤描述的不愉快的感觉和情感体验。
关于手术或手术后疼痛，US动物福利法(Animal Welfare Act2002.AWA regulations,CFR,Title9(Animals and Animal Products),Chapter1(Animal and Plant Health Inspection Service,Department of Agriculture).Subchapter A(Animal Welfare),Parts1–4)将疼痛的过程规定为合理地预期将引起应用该过程的人类超过轻微或短暂疼痛或悲痛的任何过程，也就是说，超过通过注射或其他小的手术引起的疼痛。因此，如果马经历疼痛的外科手术，则该动物应该施用术后镇痛剂。
在另外的情况下，由于诸如关节炎的有关医疗状况，例如多发性关节炎、风湿性关节炎、炎症、瘙痒、骨关节炎、或癌或恶性病症，马可能经历严重的疼痛或慢性疼痛。
术语“伤害性感受”指伤害刺激的感觉。本文限定的“神经病理性疼痛”（也被称为神经痛）指来自有神经信号问题的疼痛。其可能由于影响躯体感觉系统的损害或疾病而发生。存在数种神经疼痛的原因并且其可能与自发发生的、被称为感觉迟钝的感觉异常有关。可选地，其可能与触摸痛有关，当正常不发生疼痛的接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起触摸痛。例如，如果个体患有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛，或者如果有糖尿病性神经病，则床上用品的压迫可能引发疼痛。神经病理性疼痛也可以由触摸痛造成，其中当正常不发生疼痛的接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起疼痛。例如，如果有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛。与痛觉有关的神经病理性疼痛指正常只引起轻微的不适的刺激或接触所产生的严重的疼痛，而感觉异常，指即使当没有任何东西与引起疼痛的区域接触时发生的不舒服的或痛苦的感觉，例如四肢发麻。神经病理性疼痛的其他形式包括瘙痒或发痒，其可以与皮肤中的过敏反应或炎症反应以及由组织损伤和修复过程产生的炎性痛有关。
如本文所限定的，术语“NGF中和抗体”或类似的术语描述了能够中和NGF的生物活化和信号传到的抗体。中和抗体也可以被称为拮抗性抗体或阻断抗体，其特异性优选选择性地结合NGF并抑制NGF的一种或多种生物活性。例如，中和抗体可以抑制NGF与其靶配体的结合，例如细胞膜结合TrkA或p75受体。
如本文所使用的，术语“生物活性”指分子的任何一种或多种内在的生物学特性（不管是体内发现天然存在的还是通过重组方法给予或激活的）。生物学特性包括但不限于受体结合和/或激活、诱导细胞信号传导或细胞增殖、抑制细胞生长、诱导细胞因子产生、诱导细胞凋亡和酶活性。
如本文使用的，术语“互补性决定区(CDR)”指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列，如同Kabat et al.(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,免疫学研究的蛋白质的序列，Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242，)中所述的。如本文所使用的，术语“框架区(FR)”指插入在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在合适的方向（允许CDR结合抗原）。
如本文所使用的，术语“恒定区(CR)”指抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，恒定区通常指马的恒定区，也就是说，主题马源化抗体的恒定区来源于各自马免疫球蛋白。重链恒定区可以选自任何马重链同种型。
本文所用的术语“嵌合抗体”指含有衍生自两种不同抗体的序列的抗体，所述不同抗体通常为不同物种的。最典型的是，嵌合抗体包含衍生自供体物种且特异性结合靶表位的可变结构域和从施用该抗体的靶物种获得的抗体衍生的恒定结构域。
如本文所用的术语“免疫原性”指当施用至接受者时引起免疫反应（体液的或细胞的）的寻靶蛋白或治疗部分的能力的估量。本发明涉及主题马源化抗体的免疫原性。优选本发明的抗体不具有免疫原性，也就是说，当施用至马时，将不会产生针对它们的中和抗体，并且进一步，没有通过抗体的Fc区介导的效应子功能。
如本文所用的术语“同一性”或“序列同一性”指在比对的序列中任何特定的氨基酸残基位置处，氨基酸残基在比对的序列中间是相同的。本文所用的术语“相似性”或“序列相似性”表示，在比对的序列的任何特定的位置，氨基酸残基在这些序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以被异亮氨酸或缬氨酸取代。这可以被称为保守取代。优选地，当本发明的氨基酸序列通过其中包含的任一氨基酸的保守取代来修饰时，与未修饰的抗体相比，这些变化对所产生的抗体的结合特异性或功能活性没有影响。
本发明的（原住）多肽及其功能衍生物的序列同一性涉及，在比对序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与对应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。不管是N端或C端的延长还是插入都不应该解释为降低序列同一性或同源性。用于实施两个或以上氨基酸序列的比对和用于确定它们的序列同一性或同源性的方法和计算机程序，是本领域技术人员熟知的。例如，使用算法例如BLAST(Altschul et al.1990)、FASTA(Pearson&Lipman1988)或Smith-Waterman algorithm(史密斯-沃特曼算法，Smith&Waterman1981)可以容易地计算2个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。
如本文所用的，提到与第二氨基酸残基具有最高同源性的氨基酸残基，指与第二氨基酸残基共有最多的特征和特性的氨基酸残基。在确定氨基酸残基与第二氨基酸残基是否具有最高同源性时，评定通常可以由各种因素组成，例如但不限于电荷、极性、疏水性、侧臂质量和侧臂尺寸。
术语“对应的位置”在本文中用来表示存在于第二序列的与第一序列中的特定氨基酸对应的某位置的氨基酸残基，且该术语用于表示，当比对两条序列以允许两条序列之间的最大序列同一性时，与第一序列的位置相同的第二序列中的位置。对应位置处氨基酸残基具有相同的Kabat编号。
本文所用的术语“基本上由...组成”或“基本上由...组成”表示，肽可以含有除所描述的以外的其他要素或元素，条件是这样的要素或元素并不会实质地影响抗体或抗体片段特异性结合马NGF的能力。也就是说，包含多肽的抗体或抗体片段可以具有不干扰抗体或抗体片段结合马NGF的能力和不抵消马NGF功能活性的能力的其他要素或元素。可以将这样的修饰引入氨基酸序列中，低抗体的免疫原性。例如，基本上由特定序列组成的多肽在该序列的一端或两端可以含有一个、两个、三个、四个、五个或以上额外缺失或取代的氨基酸，条件是这些氨基酸并不干扰、抑制、阻断或干扰抗体或片段结合马NGF和隔离其生物功能的作用。同样，有助于抵消本发明的抗体的马NGF的多肽分子可以被一个或多个官能团化学修饰，条件是这类官能团不干扰抗体或抗体片段结合马NGF和抵消其功能的能力。
如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指抑制马NGF结合p75和/或TrkA受体所需的本发明的药物、结合化合物、小分子、融合蛋白或药物筛选化合物(peptidomimetic)的量。
本文中术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可交换地用来表示通过相邻残基的α氨基和羰基之间的肽键连接的线性氨基酸残基。氨基酸残基通常是天然的“L”同分异构形式。然而，只要通过多肽保留期望的功能特性，“D”同分异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基。
如本文所限定的，“抗体”包含特异性结合目的靶抗原的抗原-结合蛋白，所述靶抗原具有可以被重组制备或通过免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽，在本文中该靶抗原是马神经生长因子。术语“抗体”包含单克隆抗体和嵌合抗体，特别是马源化抗体，并且进一步包含多克隆抗体或任何类或子类的抗体。“抗体”进一步延及杂合抗体、双特异性抗体、异种抗体以及其保留抗原结合的功能片段。
短语“特异性结合”指抗体与存在于异源蛋白群中的特定蛋白或靶的结合。因此，当存在于免疫测定条件时，抗体结合特定蛋白而并不大量地结合样品中存在的其他蛋白，在本文中该特定蛋白指马NGF。
如本文所限定的，“马(equine)”还可以指“马科动物(horse)”。马属于亚种，其学名为家马(Equus ferus caballus)，它们属于臌胀类（有蹄的）哺乳动物(hooved(ungulate)mammals)。马是马科(Equidae)的亚种并且包括归入其中的任何种类，并且延及已知的300种以上的马品种。
现将参考以下实施例描述本发明，所提供的实施例用于说明的目的并非意图用于限制本发明。
实施例
实施例1-抗体的生产
通过将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的马源化轻链可变结构域序列和重链可变结构域分别与C末端马恒定重链或恒定轻链组合来产生完整的抗体序列。将马源化αD11VH结构域与两种不同的马重链恒定结构域HC2(IgG2)和HC6(IgG6)结合；且将马源化αD11VL结构域与马κ轻链恒定结构域结合。全长成熟抗体链的序列显示于SEQ ID No:4(具有κ恒定结构域的轻链)和SEQ ID No:6(具有HC2恒定结构域的重链)。
通过密码子的优选和完整化学基因合成并克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+中，将组合的氨基酸序列转化为哺乳动物细胞中可表达的形式。如实施例2-5详细描述的，将得到的cDNA转染到CHO细胞，并且分析上清液。
实施例2-确定抗体与鼠NGF和马NGF的结合
将马源化重链cDNA和轻链cDNA转染到CHO细胞中，收集上清液并以ELISA模式使其与马NGF或鼠NGF反应。在孵育和洗涤步骤后，通过连接于辣根过氧化物酶(HRP)的山羊-抗马IgG特异性多克隆抗体的反应性来检测结合的马抗体，并使用TMB使其显影。在450nm下测量所得的产物的光密度，并将其与来自模拟空白载体转染的上清液（图1中表示为“模拟(Mock)”）的光密度进行比较。
图1的图表示出该结果。示出HC2(HC2恒定结构域)马源化抗体（称为eqN-HC2+eqN-kLC-1）与小鼠NGF的结合。在图表的第二部分中，示出包含eqN-KlC-1轻链和eqN-HC2(IgG2)恒定结构域的eqN-HC2+eqN-kLC-1抗体与马NGF的结合。
实施例3-马源化抗体的纯化
使用蛋白A柱纯化从实施例2获得的上清液，通过SDS-PAGE使其分开，并且测试其与抗马IgG多克隆抗体HRP的反应活性。还使用考马斯蓝对SDS-PAGE凝胶进行染色以检测重链和轻链。抗马IgG多克隆抗体制剂主要识别马重链。结果显示于图2A和B中。
结果显示通过蛋白A对具有2型重链的马抗NGF纯化，如通过抗马多克隆抗体HRP形成的蛋白质印迹所示的。通过考马斯染色的SDS-PAGE分析峰级分。使用SDS-PAGE时重链和轻链的降解是明显的。考马斯蓝染色的凝胶（图2B）示出存在重链和轻链以及完整的抗体(MW为70)。
实施例4-马源化抗体抑制NGF诱导的TF-1细胞增殖
在存在1.0ng/mL NGF的情况下，孵育来自实施例2的连续稀释的CHO转染上清液（“拮抗剂”）。通过掺入胸苷来测定增殖结果。
图3示出该结果。在计算的3-8ng/mL的单克隆抗体(MAb)（该抗体包含eqN-kLC-1轻链和eqN-HC2(IgG2)恒定链）时，观察到50%的抑制。
实施例5-抗原捕获马源化抗体诱导的补体沉积
用涂有0.1ng/mL NGF的板孵育来自实施例2的经蛋白A纯化的转染上清液，以捕获抗体。洗涤这些板并且涂覆0.1ng/mL NGF以捕获抗体。洗涤这些板然后用人血清孵育，并且通过抗人C1q多克隆抗体HRP的结合测量结合的补体C1q，并如上述进行显影。将C1q对抗原捕获的“eqN-HC2+eqN-kLC-1”的结合与C1q对人抗NGF MAb的结合比较，并且将人IgG1Fc域作为阳性对照，将IgG4变体作为阴性对照。
补体结合方法
用100μl/孔的5μg/ml小鼠NGF涂覆板，并用5%BSA/PBS封阻该板。于室温下用细胞培养物上清液将涂覆的孔孵育1小时，并且将其在PBS/1%BSA(100μl/孔)中稀释，其中该细胞培养物上清液含有重组的马源化抗NGF IgG。洗涤该板，并在室温下用在含有0.5mM MgCl2、2mMCaCl2、0.05%吐温-20、0.1%明胶和0.5%BSA的弗罗那缓冲盐水中1/100稀释的100μl/孔的人血清孵育该板1小时。洗涤后，用100μl的在PBS/1%BSA中1/800稀释的绵羊抗-C1q-HRP(抗体)孵育该板。洗涤后，通过加入100l TMB底物(Thermo Scientifi)使该板显影。通过加入100μl的2NH2SO4停止显影并在450nm处读出吸光度。
图4的图表示出该结果。这些结果出人意料地显示没有C1q与马源化HC2抗体（该抗体包含eqN-kLC-1轻链和eqN-HC2重链(IgG2恒定结构域重链)）结合。因而，该结果表明，由于NGF是可溶的介质，具有重链恒定结构域型HC2（马IgG2衍生恒定结构域）的马源化抗体将适合用于抵消马NGF。
因此，本文已证明，非常意外的是，当本发明的抗体具有马HC2衍生重链（IgG2马重链恒定结构域亚型），抗体与马NGF的结合并不导致补体激活或者其他下游的效应子功能，例如ADCC。因而，所述抗体通过阻止马NGF与膜结合TrkA或p75受体的结合抵消马NGF的生物功能活性，抑制相关的下游的细胞内信号级联。而且，由于NGF频繁地发生在神经等附近，抵消或中和本发明的抗体的NGF具有马HC2(IgG2)亚型衍生重链，其能在不引起更广的免疫反应的情况下隔离马NGF生物活性。这样的功能活性是意料之外的，而且也是非常期望的。
实施例6-使用蛋白A亲和色谱对马IgG同种型HC2而不是HC6的
优先纯化
将马源化的HC2和HC6变体转染得到的CHO细胞上清液加载到蛋白A亲和色谱（如图2），并且通过与NGF的结合用ELISA定量含有抗体的洗脱级分。如图10所示，使用蛋白A层析回收HC2同种型而不是HC6同种型。这些数据表明蛋白A层析是纯化马抗NGF免疫球蛋白的同种型HC2而不是HC6的有益工具。
实施例7-抗马NGF单克隆抗体-安全性和发热(pyrexia)
在CHO细胞中表达抗马NGF单克隆抗体，并且其通过蛋白A层析和/或尺寸排阻层析的组合被纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。将抗体以每千克体重0.01-10mg的量静脉注射到马体内，并且由兽医通过外观检测来评估毒性病症，体重变化、体温和血浆生化性质。期望在这些或任何血浆生化分析物中没有观察到变化。
实施例8-体内抗马NGF单克隆抗体的血浆动力学-血清半衰期和免
疫原性
在CHO细胞中表达抗马NGF单克隆抗体，并且其通过蛋白A层析和/或尺寸排阻层析的组合纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。将抗体以每千克体重0.01-10mg的量静脉注射到马体内，并且在之后2周以上的任何时间取出血浆样品。使用NGF作为，靶标抗马多克隆抗体-辣根过氧化物酶作为第二反应试剂，通过ELISA评估稀释的血浆样品用于抗马NGF抗体浓度。测得的血浆浓度与二相动力学一致，即组织分(α)相和七天的消除相(β)相。
期望在100-300小时之间不存在血浆浓度中抗马NGF抗体浓度的急剧下降。这证明，在马血液中既没有已存在的中和抗体来重组抗NGF单克隆抗体，也没有这样的中和抗体在注入后生成。
实施例9-抗NGF单克隆抗体降低体内由于骨关节炎导致的炎性疼痛
在0天时，将抗马NGF单克隆抗体以每千克体重0.01-10mg的量或者将作为媒介对照的磷酸盐缓冲液静脉注射或关节内注射数组患关节炎的马中，其中将磷酸盐缓冲液作为媒介对照。在4-14天后，通过目测评分方法评价马的跛足程度：0分，没有跛足（全负重）；1分，轻微跛足（非全负重但行走正常）；2分，中等跛足（轻微负重且行走不正常）；3分，严重跛足（无负重）。观察者不了解哪匹马接受了注射。
随着注入后时间的进行，期望接受抗马NGF单克隆抗体的马比媒介对照组的跛足评分降低，这表明相比于仅用媒介，抗马NGF单克隆抗体有降低马的疼痛的效果。
实施例10-示出抗犬NGF单克隆抗体降低体内炎性痛的效果的对照
实施例
抗体疗法
应用制备本发明的抗体的方法以产生适合于犬中使用的犬源化抗体。将犬源化αD11VL结构域与犬κ轻链恒定结构域结合，并且将犬源化αD11VH结构域与犬重链同种型结合。在CHO细胞中表达衍生自表达重链和轻链的表达载体的抗犬NGF单克隆该抗体，并且其通过阴离子层析法、疏水作用层析法和尺寸排阻层析法的组合被纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。
有炎症的犬模型：
在机构伦理委员会（Institutional Ethics Committee，CRL,爱尔兰）的预先批准下进行所有的实验。将高岭土(kaolin)注入（-1天时）比格犬的一条后腿的垫脚中，从而在约24小时后开始自身化解炎症，这导致狗暂时性跛足。在该模型中，一旦对高岭土的起初始炎性反应减弱，在约1-2周内该犬的跛足程度将稳定地减小，然后全部恢复。
通过静脉注射将抗犬NGF单克隆抗体以每千克体重200μg或作为媒介对照的磷酸盐缓冲液注入（0天时）到3匹狗的组中。7天后，通过目测评分方法评价狗的跛足程度：0分，没有跛足（全负重）；1分，轻微跛足（非全负重但行走正常）；2分，中等跛足（轻微负重且行走不正常）；3分，严重跛足（无负重）。观察者不了解哪匹狗接受了注射。
图11示出了该结果。与对照组相比，注射3天后，接受抗NGF单克隆个抗体的狗的跛足评分减小，这表明与仅用媒介相比，抗NGF单克隆抗体具有降低狗的疼痛的效果。延迟的活性与抗犬NGF单克隆个抗体的血浆药物动力学一致，这表明约30小时的慢组织分布相和垫脚区相对差的血管形成。图11示出的结果表明，通过相当于本发明方法的方法制备的抗犬NGF抗体在降低跛足的同时降低了狗的炎性疼痛。
通过引用将本发明提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明的范围的情况下，对本发明的实施方案进行各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然就具体优选的实施方案进行了描述本发明，但是应该理解，请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的实施本发明的方式的各种修改。
Claims (97)
1.一种制备适用于马的抗体的方法，包括以下步骤：
从除马以外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对所述马中存在的靶抗原具有结合特异性；
将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个马抗体框架区氨基酸序列中对应位置存在的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体抗体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个马抗体框架区氨基酸序列内对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及
用所述一个或多个马抗体中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的方法，其中取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括：用对应位置存在的与一个或多个被取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括：用衍生自马抗体的重链和/或轻链的恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域。
4.如权利要求3所述的方法，其中用HC2型马恒定结构域取代所述重链的恒定结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是神经生长因子(NGF)。
6.能够特异性结合马神经生长因子(NGF)的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗体结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，所述重链可变结构区包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体或马源化抗体。
8.如权利要求6或7所述的抗体或其抗原结合片段，其中通过氨基酸取代或缺失的方式来选择或修饰所述重链恒定结构域，使得所述恒定结构域并不介导下游的效应子功能。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链是马同种型HC2或HC6重链。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链是马同种型HC2重链。
11.如权利要求6-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或者与其具有至少85%同一性的氨基酸序列。
12.如权利要求6-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
14.抗马NGF抗体或其马NGF结合片段，所述抗体或抗体结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区包含以下的至少一个：
由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成或包含其的FR1框架区；
由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成或包含其的FR2框架区；
由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成或包含其的FR3框架区；以及
由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成或包含其的FR4框架区；
所述重链可变区包含以下的至少一个：
由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成或包含其的FR1框架区；
由氨基酸序列SEQ ID NO:15组成或包含其的FR2框架区；
由氨基酸序列SEQ ID NO:16组成或包含其的FR3框架区；以及
由氨基酸序列SEQ ID NO:17组成或包含其的FR4框架区。
15.如权利要求14所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:10的FR1区的轻链可变结构域，所述SEQ ID NO:10通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：即V，S7是T，A9是E，L11是V，S12是T或A、A13是V，S14是T，E17是Q，T18是R，T20是E，I21是I、L、M或V以及E22是K。
16.如权利要求14所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:10的FR1区的轻链可变结构域，所述SEQ ID NO:10通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：即D1是G、K或V，I2是F、N、S或T，V3是A、G、I或M，M4是L、Q或V，T5是A或I，S7是F，A9是D、P或S，S10是F、L或T，L11是S，S12是E或V，A13是L、Q或T，S14是A或P，L15是P或R，G16是R，T18是S、G或K，V19是A，T20是D或V，I21是T，以及E22是L、N、Q、R、S或T。
17.如权利要求14-16中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:11的FR2区的轻链可变结构域，所述SEQID NO:11通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：K5是R，Q8是E，S9是A，K11是R或E，以及L12是R。
18.如权利要求14-16中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:11的FR2区的轻链可变结构域，其中SEQID NO:11通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：Y2是F或H，Q3是R或S，Q4是H、K、R或V，K5是V，P6是I，L或S，S9是P、R、V或T，P10是L，K11是I或L，L12是A、E、G、H、Q或W，L13是F、I、M或V，I14是F、T、M或V，以及Y15是A、C、D、E、F、G、H、Q、R、S、T或V。
19.如权利要求14-18中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:12的FR3区的轻链可变结构域，所述SEQID NO:12通过被选自以下的一个或多个氨基酸进行取代修饰：S4是D，F6是Y，D14是E，Y15是F，S16是T，N20是S，S24是A，S29是I、S或T，以及F31是Y。
20.如权利要求14-18中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:12的FR3区的轻链可变结构域，其中SEQID NO:12通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：G1是D或F，V2是A或F，P3是L或S，S4是A、E、G或L，F6是L，S7是C、F、G、N、R或T，G8是A，S9是D、E、G、K、R、T或W，G10是A、R或V，S11是A、F、T或Y，G12是E或T，T13是A、S或W，S16是A或V，L17是F或P，T18是A、I、S或V，I19是V，N20是D、G或T，S21是D、E、P、R或T，Q23是E或R，S24是E或T，E25是A、D、G或T，D26是N，V27是A、L、E、G或S，A28是G，S29是D、E、F、L、M、N或V，Y30是C，以及F31是H、S、T、V或W。
21.如权利要求14-20中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:13的FR4区的轻链可变结构域，所述SEQID NO:13通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：L9是I。
22.如权利要求14-20中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:13的FR4区的轻链可变结构域，所述SEQID NO:13通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：F1是I或L，Q3是L，T5是S，K6是M、N或R，L7是M或V，E8是A、D或K，L9是F、M或V，以及K10是A、E、G、I、Q、R、T或V。
23.如权利要求14-22中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:14的FR1区的重链可变结构域，所述SEQID NO:14通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：N13是K。
24.如权利要求14-22中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其包含具有SEQ ID NO:14的FR1区的重链可变结构域，所述SEQID NO:14通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：K5是Q，G10是D，L11是Q，V12是M，N13是M或R，P14是I或S，S15是A或G，Q16是E，T17是A，S19是T，T21是S或V，T23是A、F或S，V24是I，S25是T，G26是A，F27是A、G、I、M、N、Q或S，S28是D、H、I、L、N或P，L29是D、S、T或V，以及T30是E、I、N或R。
25.如权利要求14-24中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，包含具有SEQ ID NO:15的FR2区的重链可变结构域，所述SEQ IDNO:15被W12是F的氨基酸取代进行修饰。
26.如权利要求14-24中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，包含具有SEQ ID NO:15的FR2区的重链可变结构域，所述SEQ IDNO:15通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰：V2是L，A5是P、S或V，K8是W，G9是R，L10是P或W，W12是E、H、R、V或Y，以及G14是A、D或S。
27.如权利要求14-26中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，包含具有SEQ ID NO:16的FR3区的重链可变结构域，所述SEQ IDNO:16通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰，即T3是S，R6是K，F14是Y，Q16是T，M17是L，以及R32是G。
28.如权利要求14-26中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，包含具有SEQ ID NO:16的FR3区的重链可变结构域，所述SEQ IDNO:16通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰，即A2可以是C、G、I、T或V，T3可以是D、I、M、N或R，I4是V，T5是I、L或S，R6是E或S，D7是E或N，T8是A、E、I、P、S或Y，S9是E、G、K或T，K10是E、L，N、Q或R，S11是G、K、N或R，Q12是E、H或R，V13是A、I、L、F或S，F14是L、R、S、T或V，L15是V，Q16是I，M17是V，N18是D、K、R、S或T，S19是D、E、G、K、M或T，L20是M或V，T21是S，S22是D、E、G或R，E23是D或G，T25是A，A26是S，V27是D，Y29是A、F、I或W，A31是E、G、I、S、T或V，以及R32是A、E、G、H、I、K或S。
29.如权利要求14-28中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，包含具有SEQ ID NO:17的FR4区的重链可变结构域，所述SEQ IDNO:17通过被选自以下的一个或多个氨基酸取代进行修饰，即Q3是P。
30.如权利要求14-29中任一项所述的抗马NGF抗体或马NGF结合片段，其中所述重链是马同种型HC2的重链。
31.通过权利要求1-5中任一项所述的方法制备的抗体或其结合片段。
32.特异性结合一种或多种马可溶性蛋白的抗体或其结合片段，其中所述抗体并不介导下游的效应子功能，并且所述抗体通过与蛋白A结合是可纯化的。
33.如权利要求32所述的抗体或结合片段，其中所述抗体包含具有马HC2同种型的重链。
34.如权利要求32或33所述的抗体或结合片段，其中所述一种或多种可溶性蛋白选自CSF、白细胞介素、生长因子和神经营养因子。
35.如权利要求34所述的抗体或结合片段，其中所述一种或多种可溶性蛋白是NGF。
36.如权利要求6-35中任一项所述的抗体或结合片段，其以具有1x10-8或更小的平衡解离常数的亲和性与马NGF特异性结合。
37.如权利要求6-36中任一项所述的抗体或结合片段，其中所述抗体或片段与马NGF的结合抑制马NGF结合p75或TrkA马NGF受体的能力。
38.如权利要求6-37中任一项所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段在马中不是免疫原性的。
39.如权利要求6-38中任一项所述的抗体或结合片段，其中所述抗原结合片段选自单链Fv(scFv)抗体片段、Fab抗体片段、Fab’抗体片段和F(ab’)2抗体片段。
40.如权利要求6-39中任一项所述的抗体或结合片段，其中所述抗体是多特异性抗体或多价抗体。
41.如权利要求6-40中任一项所述的抗体或结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体或马源化抗体。
42.一种治疗、抑制或减轻马疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的抗马NGF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是马源化抗体；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述抗马NGF抗体是权利要求6-41中任一项所述的抗体。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与其具有至少85%序列同一性的序列，所述重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列和与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述疼痛选自神经病理性疼痛、炎性疼痛、瘙痒疼痛、围术期疼痛、手术后疼痛和外科手术后疼痛。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述手术后疼痛选自矫形外科手术和软组织手术导致的疼痛。
48.治疗马个体关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的抗马NGF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是马源化抗体；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述抗马NGF抗体是权利要求6-41中任一项所述的抗体。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重链可变结构域包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列和与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
52.如权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述关节炎或关节炎病症包括选自免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎和骨关节炎。
53.如权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述关节炎或关节炎病症的治疗包括减轻、抑制、降低、压制或延迟与所述关节炎或关节炎病症相关或由其引起的疼痛的发作。
54.治疗马个体由马NGF表达增强或对NGF敏感性增强引起的或与其相关的或导致其的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的抗马NGF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是马源化抗体；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述抗马NGF抗体是权利要求6-41中任一项所述的抗体。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列和与所述氨基酸序列具有至少85%氨基酸同一性的序列。
58.治疗马由NGF诱发增殖的肿瘤和与其相关的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
提供治疗有效量的抗马NGF抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是马源化抗体；以及
将所述抗马NGF抗体或其抗原结合片段施用至有需要的马。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述抗马NGF抗体是权利要求6-41中任一项所述的抗体。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与所述氨基酸序列具有至少85%同一性的序列，所述重链可变结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同源性的氨基酸序列。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述抗马NGF抗体包含轻链和/或重链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的序列，所述重链包含、组成为或基本组成为：选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列和与所述氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求58-61中任一项所述的方法，其中所述肿瘤由自分泌或旁分泌NGF诱导增殖。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤是骨肉瘤。
64.如权利要求42-63中任一项所述的方法，进一步包括共施用至少一种另外的治疗剂的步骤。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述至少一种治疗剂选自镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇和类固醇。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述至少一种治疗剂选自抗生素、抗真菌治疗剂、抗原生动物治疗剂和抗病毒治疗剂。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述至少一种治疗剂选自炎症介质的抑制剂、PGE受体拮抗剂、免疫抑制剂、环孢霉素、抗炎糖皮质激素、用于治疗认知功能障碍或认知损伤的药剂、抗高血压药剂、用于治疗心血管功能障碍的化合物、利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、苯基丁氮酮、透明质酸(hyaluronic acid)、多硫酸化粘多糖、白细胞介素-1受体拮抗剂、IRAP、双氯芬酸和骨关节炎疾病改善药物。
68.如权利要求42-67中任一项所述的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段以约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的剂量施用至马。
69.如权利要求42-67中任一项所述的方法，其中将所述抗体或抗原结合片段以约0.03mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量施用至马。
70.用于治疗导致马疼痛或由疼痛引起的或导致疼痛的病症的药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求6-41中任一项所述的抗马NGF马源化抗体或其结合片段，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
71.如权利要求70所述的药物组合物，进一步包含至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇或类固醇。
72.如权利要求70或71所述的药物组合物，其中所述导致疼痛的病症选自风湿性关节炎、炎症、瘙痒、骨关节炎、急性疼痛、慢性疼痛、外科手术疼痛、外科手术后疼痛。
73.分离的核酸，其编码权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
74.分离的核酸，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的抗马NGF抗体或抗体片段的轻链可变结构域或具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的轻链。
75.分离的核酸，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的抗马NGF马源化抗体或抗体片段的重链可变结构域或具有选自SEQ ID NO:5-9的氨基酸序列的重链。
76.如权利要求73-75中任一项所述的分离的核酸，其可操作地连接于一个或多个调控序列。
77.表达载体，包含权利要求73-75中任一项所述的核酸。
78.如权利要求77所述的表达载体，进一步包含一个或多个调控序列。
79.如权利要求77或78所述的表达载体，其中所述载体是质粒或逆转录病毒载体。
80.宿主细胞，其整合了权利要求77-79中任一项所述的表达载体。
81.产生马源化抗马NGF中和抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养权利要求80所述的宿主细胞，以使所述细胞表达马源化抗马NGF中和抗体。
82.治疗、减轻或抑制马疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：将治疗有效量的权利要求73-75中任一项所述的核酸施用至所述马。
83.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，用于治疗或预防马疼痛。
84.如权利要求83所述的抗体或抗体结合片段，其中所述疼痛选自：急性疼痛、慢性疼痛、围术期疼痛、手术后疼痛、炎性疼痛、瘙痒疼痛、矫形外科手术引起的疼痛、与软组织外科手术相关的疼痛、与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛以及与风湿性关节炎、免疫介导多发性关节炎或骨关节炎相关的或由其引起的疼痛。
85.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，用于治疗关节炎。
86.如权利要求85所述的抗体或抗体结合片段，其中所述关节炎是骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎或风湿性关节炎。
87.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，用于治疗或预防马由NGF诱导增殖的肿瘤及其相关病症。
88.如权利要求87所述的抗体或抗体结合片段，其中所述肿瘤是骨肉瘤。
89.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，在制备用于治疗或预防马疼痛的药物中的用途。
90.如权利要求89所述的用途，其中所述疼痛选自急性疼痛、慢性疼痛、围术期疼痛、手术后疼痛、炎性疼痛、瘙痒疼痛、矫形外科手术引起的疼痛、与软组织外科手术相关的疼痛、由卵巢子宫切除术引起的疼痛、与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛以及与风湿性关节炎、免疫介导的多发性关节炎或骨关节炎相关的或由其引起的疼痛。
91.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，在制备用于治疗、抑制、减轻或预防马的关节炎的药物中的用途。
92.如权利要求91所述的用途，其中所述关节炎是骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎或风湿性关节炎。
93.权利要求6-41中任一项所述的抗体或抗体结合片段，权利要求70-72中任一项所述的药物组合物，权利要求73-76中任一项所述的核酸或者权利要求77-79所述的表达载体，在制备用于治疗马由NGF诱导增殖的肿瘤和其相关病症的药物中的用途。
94.如权利要求93所述的用途，其中所述肿瘤是骨肉瘤。
95.细胞系或其衍生细胞或后代细胞，其产生权利要求6-41中任一项所述的抗马NGF中和单克隆抗体或其片段。
96.用于治疗马疼痛，或者用于治疗与疼痛相关的病症，或者用于治疗、减轻或抑制与骨关节炎、炎症、瘙痒、免疫介导的多发性关节炎或风湿性关节炎相关的疼痛的试剂盒，其包含权利要求6-41中任一项所述的抗马NGF抗体或结合片段及其使用说明。
97.用于检测抗马NGF单克隆抗体或结合片段的诊断试剂盒，其包含权利要求6-41中任一项所述的抗马NGF抗体或结合片段。
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