PT100501A - Composicoes farmaceuticas a base de um membro da familia de moleculas de bdnf/nt-3/ngf, processo para promover a sobrevivencia,crescimentoe/ou diferenciacao de neuronios motores in vitro e de diagnostico, e processo de ensaio de um agente de teste. - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

1. INTRODUÇÃO O presente invento refere-se a métodos de tratamento de desordens nos neurónios motores compreendendo a administração/ a um paciente necessitado de tal tratamento, de um quantidade eficaz de um factor neurotrófico que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF e que suporta a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação dos neurónios motores, preferivelmente BDNF ou NT-3. 0 presente invento refere-se também a processos para a cultura de neurónios motores, a processos para diagnosticar desordens dos neurónios motores, a sistemas de ensaio para a identificação de agentes que podem ser benéficos ou tóxicos para os neurónios motores e a modelos animais para doenças de neurónios motores.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1. NEURÓNIOS MOTORES A interacção entre os neurónios motores e as células de músculos determina o tono muscular e efectua a contracção muscular e, deste modo, está por detrás de todos os movimentos voluntários e involuntários.

Os neurónios motores são classificados, tradicionalmente, como neurónios motores superiores ou neurónios motores inferiores. Os neurónios motores superiores localizam-se no giro pré--central do cérebro e enviam processos longos para sinápse nos neurónios motores inferiores localizados nos cornos ventrais (anteriores) da matéria cinzenta da medula espinal. Dos cornos ventrais da medula espinal, os processos de axónio dos neurónios motores inferiores coalescem para formar as raízes ventrais. Estes axónios terminam, eventualmente, sobre uma ou mais fibras musculares. Através da arborização da parte terminal da sua fibra, cada neurónio motor inferior fica em contacto com, desde algumas até 100-200 ou mais, fibras musculares para formar uma "unidade motora" (Adams e Victor, 1985, em "Principies of Neurology", McGraw-Hill, Inc., New York, p. 37). 73 988 6526-058-118 -3-

As desordens dos neurónios motores resultam em vários graus de fraqueza muscular provocando incapacidade que pode ir, desde uma ligeira dificuldade em realizar tarefas difíceis, até à paralisia total. As desordens dos neurónios motores inferiores estão geralmente associadas a uma paralisia flácida e a uma diminuição no tono muscular. Podem ser afectados grupos contíguos de músculos, inervados por nervos simples ou cujos neurónios motores se localizam muito próximos na medula espinal e a atrofia pode ser bastante profunda, até 70-80 por cento do volume total. Um neurónio motor afectado pode-se tornar irritável e as fibras musculares que ele controla podem descarregar esporadicamente, isoladas de outras unidades, para produzir uma contracção visível, ou fasciculação. Em contraste, quando os neurónios motores são danificados, resulta geralmente uma paralisia espástica, com o aumento no tono muscular e reflexos de tendão hiperactivo. Usualmente, é afectado um membro inteiro ou metade do corpo, em vez de grupos de músculos individuais. A atrofia é ligeira e resulta, tipicamente, da ausência de uso. Estão ausentes as fasci-culações. A identificação de um síndroma clínico como representante de danos nos neurónios motores superiores e inferiores pode facilitar o seu diagnóstico e gestão.

2.2. DESORDENS DOS NEURÓNIOS MOTORES

Os neurónios motores podem ser afectados por um grande número de desordens neurológicas. Os neurónios motores superiores, por exemplo, são afectados, predominantemente, por acidentes ce-rebrovasculares, neoplasmas, infecções e trauma. Os neurónios motores inferiores ou células do corno anterior, são afectados, secundariamente, por estes processos, mas, adicionalmente, estão sujeitos a um certo número de desordens nas quais a perda da célula do corno anterior é a característica principal, incluindo a esclerose lateral amiotrofica, a atrofia muscular espinal infantil e juvenil, a poliomielite e o síndroma post-polio, as neuropatias hereditárias motoras e sensoriais, e as neuropatias motoras tóxicas (p. e., a vincristina).

Predominantemente, de entre estas desordens de células do corno anterior (AHC) a esclerose lateral amiotrofica (ALS ou

73 988 6526-058-118 4- doença de Lou Gehrig) é a mais comum (ver Williams e Windebank, 1991, Mayo Clin. Proc. 66.:54-82 para uma revisão).

Na maior parte dos pacientes com ALS, a queixa inicial é a fraqueza, mais vulgarmente, dos membros superiores (Gubbay et al.. 1985, J. Neurol. 232:295-300); Vejjajiva et al. . 1967, J. Neurol. Sei. 4.:299-314; Li et al. . 1988, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 5JL:778-784). Usualmente, o padrão de fraqueza, de atrofia e de outros sinais neurológicos, é assimétrico e, muitas vezes, focal (Munsat et al. . 1988, Neurol. .38,:409-413). As cãibras musculares, parestesias (sensações de formigueiro) e dor são queixas frequentes (Williams e Windebank, supra). Estão presentes, usualmente, fasciculações generalizadas (id.). A velocidade de progressão da doença varia de paciente para paciente (Gubbay et al.. 1985, J. Neurol. 232:295-300). mas, em virtualmente todos os casos, a doença resulta eventualmente numa incapacidade total, paralesia generalizada (incluindo paralesia respiratória) e morte.

Anatomicamente, as modificações mais proeminentes são, atrofia da medula espinal e das raízes ventrais associadas e rigidez das colunas laterais (daí o nome de esclerose lateral ami-otrófica; Williams e Windebank, supra). Os neurónios motores superiores estão também envolvidos e degeneram em ALS. 0 cérebro pode parecer normal macroscopicamente, se bem que uma atrofia dos cortíces motor e promotor esteja usualmente presente, devido ao envolvimento dos neurónios motores superiores. Verifica-se uma perda generalizada de células de Betz e de outras células piramidais do córtex pré-central, com a gliose reactiva consequente (Hammer et al.. 1979, Exp. Neurol. 63:336-346).

Estudos epidemiológicos têm indicado que os factores genéticos, bem como os factores ambientais desempenham um papel no desenvolvimento da doença (Williams e Windebank, supra). Embora antes se pensasse que era uma doença de adultos de meia idade, verificou-se recentemente que a ALS é mais uma doença das pessoas mais idosas (id.). 73 988 6526-058-118

-5- 0 tratamento corrente consiste de terapia sintomática para diminuir as cãibras musculares, a dor e o cansaço. São usados dispositivos prostéticos para compensar a fraqueza muscular. Contudo, a terapia farmacológica para alterar o progresso da doença tem sido muito mal sucedida. Os benefícios terapêuticos putativos da hormona de libertação da tirotropina têm deparado com resultados conflituosos (Brooks, 1989, Ann. N.Y. Acad. Sei. 553:431-461). A administração de gangliósidos tem sido ineficaz (Lacomblez et al. . 1989, Neurol. 39:1635-1637). A plasmaferese não tem mostrado qualquer vantagem terapêutica tanto sozinha como em combinação com tratamento imunossusprensor (Olarte et al.. 1980, Ann, Neurol. 8.:644-645; Kelemen et al. . 1983, Arch. Neurol. 40.:752-753). 0 agente antiviral guanidina tem sido noticiado como tendo benefícios potenciais a curto prazo, mas os resultados não foram reprodutíveis (Munsat et al. . 1981, Neurol. 31:1054-1055). A administração de aminoácidos de cadeia ramificada para activar a glutamatodesidrogenase foi noticiada como retardadora da velocidade de declínio de pacientes num estudo abreviado (Plaitakis et al. . 1988, Lancet 1.:1015-1018). As tentativas terapêuticas mais recentes, algumas em curso, envolvem a irradiação linfoide total de todo o corpo, o uso dos aminoácidos N-acetilcisteína, N-acetilmetionina, L-treonina e infusão intra-tecal prolongada de hormona de libertação da tirotropina (Williams e Windebank, supra).

Modelos de animais que possuem semelhanças clínicas e patológicas com a ALS incluem o ratinho Mnd, um mutante dominante autossómico, exibindo uma degeneração progressiva, de início tardio, de ambos os neurónios motores superiores e inferiores (Messer and Flaherty, 1986, J. Neurogen. 3.:345-355); o ratinho cambaleante que exibe fraqueza dos membros anteriores e atrofia, nos primeiros tempos de vida, devido a denervação muscular, e a atrofia muscular espinal canina hereditária no Spaniel Brit-tany (Sack et al. f 1984, Ann. Neurol. 15:369-373; Sillevis et al.. 1989, J. Neurol. Sei. 91:231-258; Bird et al.. 1971, Acta Neuropathol. 19:39-50).

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2.3. FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR E SOBREVIVÊNCIA DOS NEURÓNIOS

MOTORES

Na Publicação PCT ns. WO 91/04316, publicada em 4 de Abril de 1991, e que é aqui incorporada como referência, mostrou-se, recentemente, que o factor neurotrófico ciliar (CNTF) é capaz de promover a sobrevivência de neurónios motores in vitro e in vivo. Os implantes de "Gelfoam" (esponja de fibrina) contendo CNTF facilitaram a sobrevivência de neurónios motores em nervos faciais danificados de ratazanas recém-nascidas. 0 CNTF é um factor neurotrófico que exibe actividades biológicas que são muito diferentes das exibidas pelos factores da família da neurotrofina, incluindo BDNF, NT-3 e NGF.

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a processos de tratamento de desordens dos neurónios motores, tais como a esclerose amiotrófica lateral (doença de Lou Gehrig) que compreendem a administração, a um paciente necessitado de tal tratamento, de quantidades eficazes de um factor neurotrófico que seja um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF e que suporte a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação dos neurónios motores. Em parte é baseado na constatação de que o BDNF e o NT-3 são, cada um, capazes de aumentar a actividade da colina-acetiltransferase em culturas de neurónios motores e são retrogradamente transportadas do nervo ciático para a medula espinal. Em concretizações específicas preferidas do invento, pode-se usar uma combinação de BDNF ou de NT-3 e de um segundo agente, tal como o CNTF, no tratamento de doenças dos neurónios motores. 0 presente invento proporciona também processos para a promoção da sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores in vitro. compreendendo a adição, a culturas de neurónios motores, de uma concentração eficaz de um membro da família de genes de BDNF/NT-3/NGF.

Em concretizações adicionais, o presente invento proporciona sistemas de ensaio que podem ser usados para identificar

73 988 6526-058-118 -7- agentes que possuem actividade do tipo BDNF ou NT-3 e que podem ser úteis no tratamento de desordens dos neurónios motores. O presente invento proporciona, adicionalmente, modelos animais de doenças dos neurónios motores produzidas por imunização dos animais contra membros da família de BDNF/NF-3/NGF ou seus derivados, ou por administração a animais de anticorpos a membros da família de anti-BDNF/NT-3/NGF ou de oligonucleótidos anti-sentido em relação a BDNF/NT-3/NGF.

3.1. ABREVIATURAS BDNF factor neurotrófico derivado de cérebro bFGF factor de crescimento de fibroblasto básico CAT colina-acetiltransferase NGF factor de crescimento do nervo NT-3 neurotrofina-3

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Fizeram-se crescer culturas enriquecidas em neurónios motores, em meio quimicamente definido, isento de soro, durante dois dias, e ensaiaram-se para determinar a actividade de colina-acetiltransferase (CPM/h/poço +/-SEM). Na altura do plaqueamento adicionou-se BDNF em concentrações compreendidas entre 10 pg/ml e 100 ng/ml usando solução salina tamponada com fosfato (PBS)/0,5 mg/ml de BSA como diluente. As culturas de controlo receberam apenas PBS/0,5 mg/ml de BSA.

Figura 2. Fizeram-se crescer culturas enriquecidas em neurónios motores, em meio quimicamente definido isento de soro, durante dois dias, e ensaiaram-se para determinar a actividade de colina-acetiltransferase (CPM/h/poço +/- SEM). Na altura do plaqueamento adicionaram-se CNTF, BDNF, bFGF, NGF e CNTF/BDNF em conjunto, (todos em concentrações de 50 ng/ml) diluídas em PBS/0,5 mg/ml de BSA. As culturas de controlo receberam PBS/0,5 mg/ml de BSA.

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Figura 3. Fizeram-se crescer culturas enriquecidas em neurónios motores, em meio quimicamente definido, isento de soro, durante dois dias, e ensaiaram-se para determinar a actividade de colina-acetiltransferase (CPM/h/poço +/- SEM). Na altura do plaqueamento adicionou-se NT-3 em concentrações compreendidas entre 10 pg/ml e 100 ng/ml.

Figura 4. A curva de resposta a dose para BDNF recombinate purificado como se descreve na Secção 8 no bio-en-saio de explante de gângliõ da raiz dorsal.

Figura 5. Morfologia de neurónios motores faciais no pedúnculo cerebral de ratazanas com 7 dias de idade após lesão do nervo facial unilateral na altura do nascimento, a) lado lesionado após tratamento com BDNF; b) lado lesionado após tratamento com NT-3; c) lado lesionado após tratamento com NGF; d) lado lesionado após tratamento com BSA como controlo; e) lado contra--lateral não lesionado do mesmo animal tal como em a) controlo; f) após lesão e tratamento com CNTF como controlo. Ampliação: 400 x.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Com o objectivo de tornar mais clara a descrição, e não como forma de limitação, a descrição detalhada do invento está dividida nas sub-secções seguintes: (i) membros da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF que podem ser usados de acordo com o invento; (ii) aplicações terapêuticas; (iii) aplicações in vitro; (iv) aplicações de diagnóstico; (v) sistemas de ensaio; e (vi) modelos animais.

5.1. MEMBROS DA FAMÍLIA DE MOLÉCULAS DE BDNF/NT-3/NGF QUE PODEM SER USADOS DE ACORDO COM O INVENTO

Verificou-se que o BDNF ou o NT-3 induzem um aumento na ac- -9- 73 988 6526-058-118 tividade da colina-acetiltransferase em culturas de neurónios motores, indicando que certos membros da família da neurotrofina podem ser usados para promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores (ver Exemplos das Secções 6 e 7 infra). A suposição de que estas neurotrofinas actuam directa-mente nos neurónios motores é apoiada pela observação de que o BDNF e a NT-3 são transportados retrogradamente para a medula espinal ventral, o sítio dos neurónios motores (ver Exemplo da Secção 9, infra). 0 presente invento proporciona processos para a promoção da sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores que utilizam membros da família de moléculas de BDNF/NT--3/NGF.

As concretizações preferidas do invento proporcionam o uso de membros da família de BDNF/NT-3/NGF que resultam num aumento da actividade da colina-acetiltransferase em neurónios motores, em relação a neurónios motores não tratados.

Nas concretizações mais preferidas do invento, o BNFN ou a NT-3, tal como se descreve na Publicação PCT na. WO 91/03568 publicada em 21 de Março de 1991, e na Publicação PCT nB. WO 91/03569 publicada em 21 de Março de 1991, aqui incorporadas como referência na sua totalidade, podem ser usados para promover a sobrevivência e/ou diferenciação dos neurónios motores. Como se mostra nos Exemplos das Secções 6 e 7, infra. o BDNF ou a NT-3 podem ser usados para promover a actividade da colina--acetiltransferase em neurónios motores em cultura. Adicionalmente, outros membros da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF, que podem ser identificados de acordo com os processos indicados nas Publicações PCT nas. WO 91/03568 e WO 91/03569, aqui incorporadas como referência na sua totalidade, podem ser usados de acordo com o invento, desde que se determine que são capazes de suportar o crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores. Adicionalmente, podem-se usar moléculas sintéticas que são diferentes, na estrutura primária, de qualquer membro conhecido da família de BDNF/NT-3/NGF e que -10- 73 988 6526-058-118 suportam o crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores. Uma vez que o BDNF e a NT-3 são mais activos do que o NGF no aumento da actividade de colina-acetiltransferase em neurónios motores, estas moléculas sintéticas podem-se parecer, desejavelmente, mais com o BDNF e com a NT-3 do que com o NGF.

Os membros da família de BDNF/NT-3/NGF, para uso de acordo com o invento, podem ser produzidos por qualquer processo conhecido na arte. Podem ser purificados a partir de tecido natural, sintetizados quimicamente ou, preferivelmente, produzidos em sistemas de expressão de ADN recombinante tais como sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos, tal como, por exemplo, o sistema de células COS. Processos para a produção destas moléculas incluem as descritas nas Publicações PCT nBs. WO 91/03568 e WO 91/03569.

Numa concretização específica preferida do invento, o BDNF ou a NT-3 podem ser isolados a partir de meio condicionado por células eucarióticas (p.e., células de ovário de Hamster chinês (CHO) transfectadas com BDNF) exprimindo BDNF, por um procedimento em dois passos consistindo em cromatografia de permuta catiónica e de cromatografia de filtração em gel. Usando o BDNF como exemplo, meio condicionado, recolhido de um bio-reactor Op-ticell (Charles River) semeado com células que expressam BDNF, pode ser diluído com água destilada numa proporção de 1,25:1 e carregado continuamente numa coluna S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Por exemplo, um volume total de 10,6 1 (diluído), pode ser aplicado durante um período de cerca de cinco dias a uma coluna de 15 ml (d.i. 1,6 cm), coluna pode ser lavada com 50 ml de tampão MES 20 mM, pH 5,8, seguidos de 50 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 250 mM seguidos do mesmo tampão MES, sem cloreto de sódio, até a absorvância a 280 nm atingir o nível da linha de base. A coluna pode depois ser lavada com 25 ml de tampão bicina 20 mM, pH 8,5, seguidos de 15 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 100 mM. Subsequentemente, a coluna pode ser eluída com 150 ml de um gradiente de cloreto de sódio de 100 mM a 750 mM em tampão bicina 20 mM, pH 8,5. 0 caudal pode ser de cerca de 2,5 ml/min. A absorvância do eluído pode ser mo-

73 988 6526-058-118 -11-nitorizada a 280 mm com uma sensibilidade de 0,2 unidades de ab-sorvância na escala completa. As fracções contendo BDNF recombi-nante podem ser identificadas pelo bio-ensaio do explante DRG. Pode-se esperar que as fracções com a actividade específica mais elevada correspondam a uma concentração de cloreto de sódio entre 500 e 750 mM. Estas fracções podem ser combinadas e concentradas por ultra-filtração em membrana a alta pressão, usando uma membrana do tipo Omega de 3 kDa, ou uma membrana equivalente que exiba uma ligação de BDNF, não específica, baixa. A amostra concentrada pode depois ser aplicada, por exemplo, a uma coluna de filtração em gel Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) de 120 ml (d.i. 1,6 cm). Esta coluna pode ser empacotada e equilibrada com tampão HEPES 20 mM, pH 7,6, contendo NaCl 400 mM. A coluna pode ser eluída com um caudal de 0,25 ml/min. As fracções podem ser recolhidas e testadas para determinar a actividade de BDNF no bio-ensaio do explante DRG. Pode-se esperar que as fracções eluídas entre 80 e 90 ml contenham o factor de crescimento derivado de cérebro, recombinante, bio—activo. Estas fracções podem ser combinadas e analisadas por eletroforese de redução em SDS-poliacrilamida, sequenciação do terminal N e análise quantitativa dos aminoácidos. Os volumes podem ser ajustados conforme apropriado. A família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF inclui as moléculas codificadas por genes com uma região de homologia substancial partilhada com BDNF, NT-3 e NGF. Membros de família de BDNF/NT-3/NGF, que são úteis de acordo com o invento, podem ser selecci-onados testando a sua actividade biológica na promoção da sobrevivência ou diferenciação de neurónios motores. Por exemplo, e não como limitação, membros da família de BDNF/NT-3/NGF que induzem qualquer dos efeitos seguintes, podem ser úteis de acordo com o invento: (i) aumento do tempo de sobrevivência de neurónios motores em cultura; (ii) aumento da germinação dos neurónios motores em cultura ou in vivo; (iii) aumento da produção de uma molécula associada aos neurónios motores em cultura ou in vivo, p.e., colina-acetil-

73 988 6526-058-118 -12- transferase ou acetilcolinesterase (ver Secções 6 e 7 infra para exemplos de técnicas de medição); ou (iv) diminuição dos sintomas da disfunção dos neurónios motores in vivo.

Estes efeitos podem ser medidos por qualquer método conhecido na arte. Em concretizações preferidas não limitantes, a sobrevivência aumentada dos neurónios motores pode ser medida pelo método descrito em Arakawa et al.. (1990, J. Neurosci. 10;3507--3515); o aumento da germinação de neurónios motores pode ser detectado pelos métodos descritos em Pestronk et al. (1980, Exp. Neurol. 70.:65-82) ou Brown et al. (1981, Ann. Rev. Neurosci. 4.: 17-42); o aumento da produção de moléculas associadas aos neurónios motores pode ser medido por bio-ensaio, ensaio enzimá-tico, ligação de anticorpos, ensaio de transferência Northern, etc., dependendo da molécula a ser medida; e a disfunção dos neurónios motores pode ser medida avaliando a manifestação física da desordem dos neurónios motores, p.e., fraqueza, velocidade de condução dos neurónios motores ou incapacidade funcional.

Em concretizações adicionais do invento, os membros da família de BDNF/NT-3/NGF do invento podem ser combinados com um segundo agente, de modo a suportar a sobrevivência e/ou diferenciação dos neurónios motores. Desejavelmente, o segundo agente é também eficaz na promoção da sobrevivência e/ou diferenciação dos neurónios motores. Por exemplo, numa concretização preferida do invento, um membro da família de BDNF/NT-3/NGF pode ser combinado com CNTF de modo a promover a sobrevivência e/ou diferenciação dos neurónios motores. Tal como se discute na secção 6, infra. observou-se que o BDNF combinado com CNTF exerce pelo menos um efeito aditivo na actividade de CAT dos neurónios motores.

5.2. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS O presente invento proporciona métodos para o tratamento de uma desordem de neurónios motores compreendendo a administração a um paciente que necessite de um tal tratamento, de uma quanti-

73 988 6526-058-118 -13- dade eficaz de um factor neurotrófico que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF que suporta a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores.

Tal como é aqui usado, o termo desordens de neurónios motores refere-se a qualquer condição que perturba a função normal de neurónios motores. Estas desordens podem afectar ou não, es-pecificamente ou mesmo selectivamente, os neurónios motores. Por exemplo, desordens de neurónios motores que podem ser tratadas de acordo com o invento incluem, mas não estão limitadas a, desordens tais como enfarte, infecção, exposição a toxina, trauma, danos cirúrgicos, doença degenerativa ou malignidade que possam afectar os neurónios motores, bem como outros componentes do sistema nervoso. Os métodos do invento podem também ser dirigidos a desordens que afectam selectivamente os neurónios tais como a esclerose amiotrófica lateral e incluem, mas não estão limitadas a, atrofia muscular espinal progressiva, paralisia bulbar progressiva, esclerose lateral primária, atrofia muscular infantil e juvenil, paralisia bulbar progressiva da infância (síndroma de Fazio-Londe) poliomielite e síndroma post-polio e Neuropatia Moto-sensorial Hereditária (Doença de Charcot-Marie-Tooth).

Os membros da família de BDNF/NT-3/NGF que podem ser usados de acordo com o invento são descritos na Secção 5.1, supra. As doses eficazes podem ser determinadas usando métodos conhecidos dos peritos da arte. As doses eficazes e, se presentes, as doses tóxicas (ainda não foi identificado qualquer efeito tóxico para qualquer dos membros da família de BDNF/NT-3/NGF) podem ser determinadas, preferivelmente, in vitro. de modo a identificar a gama de doses óptima (ver secção 5.3, infra).

Em várias concretizações particulares do invento, os facto-res neurotróficos da família de BDNF/NT-3/NGF podem ser administrados conjuntamente com uma quantidade eficaz de pelo menos um outro agente que é, ele próprio, capaz de promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação dos neurónios motores. Por exemplo, os membros da família de BDNF/NT-3/NGF podem ser admi-

73 988 6526-058-118 -14 nistrados em conjunto com o CNTF. Numa concretização específica preferida do invento, o BDNF e o CNTF podem ser co-administra-dos, em conjunto, no tratamento de uma desordem dos neurónios motores.

Em relação aos membros da família de BDNF/NT-3/NGF, o presente invento contempla também o uso de fragmentos, derivados, agonistas ou antagonistas de moléculas neurotróficas da família de BDNF/NT-3/NGF. 0(s) factor(es) neurotróficò(s) do invento podem ser administrados em qualquer transportador farmacologicamente aceitável. A via de administração pode ser qualquer modo de administração conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a, intravenosamente, intratecalmente, subcutaneamente, por injecção no tecido envolvido, intra-arterialmente, intranasalmente, oralmente ou através de um dispositivo implantado. O presente invento proporciona composições farmacêuticas compreendendo um membro da família de BDNF/NT-3/NGF, tal como BDNF ou NT-3, conjuntamente com CNTF, num transportador farmacologicamente aceitável. A administração pode resultar na distribuição do(s) factor(es) neurotrófico(s) do invento através do corpo ou numa área localizada. Por exemplo, em algumas condições que envolvem regiões distantes do sistema nervoso, pode ser desejável a administração intravenosa ou intratecal do factor neurotrófico. Alternativamente, e não como limitação, quando estão envolvidas regiões localizadas do sistema nervoso, tal como em desordens dos neurónios motores provocadas por trauma ou cirurgia, pode ser desejável a administração local. Nestas situações, pode ser colocado um implante, contendo o factor neurotrófico, na área lesionada ou na sua proximidade. Implantes adequados incluem, mas não estão limitados a gelfoam, cera ou implantes à base de micropartículas.

5.3. APLICAÇÕES IN VITRO 0 presente invento proporciona um processo para promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios moto- 73 988 6526-058-118 -15-

res que compreende a exposição dos neurónios motores a uma concentração eficaz de um factor neurotrófico que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF. Este processo pode ser realizado in vivo (ver supra) ou in vitro. Em concretizações preferidas o membro da família de BDNF/NT-3/NGF é o BDNF ou a NT-3.

Em concretizações in vitro. as quantidades eficazes de factor neurotrófico podem ser determinadas, desejavelmente, caso a caso, na medida em que os neurónios motores oriqinários de tecidos diferentes e de diferentes espécies podem exibir sensibilidades diferentes ao factor neurotrófico. Para qualquer cultura particular, pode ser desejável construir uma curva de resposta a dose que correlacione a concentração de factor neurotrófico e a resposta de neurónios motores. Para avaliar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores, pode ser útil comparar neurónios motores expostos a um factor neurotrófico membro da família de BDNF/NT-3/NGF, com neurónios motores não expostos a um tal factor, usando por exemplo corantes vitais para avaliar a sobrevivência, microscopia de contraste de fase e/ou coloração de neurofilamentos para medir a germinação de neurites, ou técnicas que meçam a bioactividade de compostos associados a neurónios motores, tais como a colina--acetiltransferase (CAT). A actividade de CAT pode ser medida, por exemplo, por colheita e lise de neurónios motores, tratados e não tratados, numa solução de Tris-HCl 20 mM (pH 8,6), contendo cerca de 0,1% de Triton X-100, remoção de uma alíquota de vários microlitros e medição da actividade de CAT usando, como substrato, 0,2 ml de [l-TC]acetil-CoA, NaCl 300 mM, brometo de colina 8 mM, EDTA 20 mM e neostigmina 0,1 mM em tampão NaH2 50 mM (pH 7,4), usando o procedimento micro-Fonnum tal como se descreve em Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24; 407-409, aqui incorporada como referência na sua totalidade (ver também secção 7.1.5, infra).

Numa concretização específica não limitante do invento, os neurónios motores podem ser preparados e cultivados in vitro como se segue. Pode-se obter assepticamente pelo menos uma porção

73 988 6526-058-118 de uma medula espinal, preferivelmente obtida a partir de um organismo embrionário tal como de uma ratazana, e separado do bulbo, dos gânglios sensoriais e das meninges aderentes. Os segmentos ventrais da medula podem depois ser isolados, pois os neurónios motores estão localizados nos cornos ventrais (anteriores) da medula espinal. Os segmentos ventrais da medula podem ser cortados em pequenos pedaços e incubados em cerca de 0,1% de tripsina e 0,01% de desoxirribonuclease do tipo 1 em solução salina, tamponada com fosfato (PBS), isenta de cálcio e de magnésio, a 37°C durante cerca de 20 minutos. Depois, pode-se remover a solução de tripsina e podem-se enxaguar as células e colocar num meio fresco tal como um meio de 45% de meio mínimo essencial de Eagle (MEM), 45% de mistura nutriente de Ham F12, 5% de soro fetal de vitelo inactivado por calor, 5% de soro de cavalo inactivado por calor, glutamina (2 mM), penicilina G (0,5 U/ml) e estreptomicina (0,5 /ig/ml). O tecido pode ser dissociado mecanicamente por trituração suave usando uma pipeta de Pasteur e os sobrenadantes são reunidos e filtrados através de um filtro de "nylon" (p.e., Nitex, Tetko; 40 m). A suspensão de células filtrada pode depois ser fraccionada usando uma modificação do método descrito por Schnaar e Schaffner (1981, J. Neurose. .1:204-217). Desejavelmente, todos os passos são realizados a 4eC. Pode-se dissolver metrizamida em meio F12:MEM (1:1) e pode--se estabelecer um gradiente descontínuo que consiste de uma camada de metrizamida a 18% (p.e., 0,5 ml), 3 ml de metrizamida a 17%; 3 ml de metrizamida a 12% e 3 ml de metrizamida a 8%. A suspensão de células filtradas (p.e., 2,5 ml) pode ser acamada sobre o gradiente em degrau e o tubo pode ser centrifugado a 2500xg, durante cerca de 15 minutos, usando um rotor oscilante ("swing-out") (p.e. Sorvall HB4). Pode-se esperar que a centrifugação resulte em três camadas de células: a fraeção I (na interface 0-8%), a fraeção II (na interface 8-12%) e a fraeção III (na interface 12-17%). A fraeção I, enriquecida em neurónios motores, pode ser removida num pequeno volume (p.e., cerca de 1 ml) e enxaguada duas vezes com um meio definido isento de soro tal como meio de 50% de F12 e 50% de MEM, suplementado com glutamina (2 mM), insulina (5 ^g/ml), transferrina (100 /xg/ml), progesterona (20 nM), putrescina (100

73 988 6526-058-118 -17-μΜ) e selenito de sódio (30 nM, ver Bottenstein e Sato, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76.:514-517). Depois, pode-se obter uma contagem das células viáveis por contagem em hemocitómetro na presença de azul de tripano. A suspensão de células enriquecida em neurónios motores pode depois ser plaqueada a uma densidade de cerca de 100 000 células/cm2 em poços de cultura de tecidos (preferivelmente de 6 mm), pré-revestidas com poli-L-ornitina (p.e., 10 jug/ml) e laminina (p.e., 10 jug/ml). Depois, podem-se adicionar os factores neurotróficos. Por exemplo, em concretizações especificas, pode-se adicionar BDNF até se ter uma concentração final compreendida entre cerca de 0,01 e 100 ng/ml e, preferivelmente, de cerca de 50 ng/ml, ou pode-se adicionar NT-3 até se ter uma concentração final compreendida entre cerca de 0,01 e 100 ng/ml e, preferivelmente, de cerca de 50 ng/ml, ou pode-se adicionar BDNF nas concentrações indicadas supra. em conjunto com CNTF, numa concentração de pelo menos cerca de 1 ng/ml e, preferivelmente, de cerca de 10 ng/ml. As culturas de neurónios motores podem depois ser mantidas em meio definido isento de soro, a 37eC, numa atmosfera de 95% de ar/5% de C02 com uma humidade relativa de aproximadamente 100%.

5.4. APLICAÇÕES DE DIAGNÓSTICO O presente invento proporciona também um processo de diagnóstico de uma desordem de neurónios motores num paciente, que compreende a comparação entre o nível de factor neutrófico, que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF, numa amostra retirada do paciente, com uma amostra análoga de um indivíduo normal, detectando-se assim uma aberração no nível do factor neurotrófico no paciente que se correlaciona positivamente com a presença da desordem de neurónios motores. As desordens de neurónios motores que podem ser diagnosticadas deste modo incluem, mas não estão limitadas a, as que se indicam na Secção 5.2., supra. O nível de factor neurotrófico pode ser detectado por qualquer método conhecido na arte incluindo, mas não limitado a ensaio de imuno-adsorvente ligado a enzimas pela técnica de

73 988 6526-058-118 "sanduíche”, ou qualquer outro ensaio que utilize anticorpo anti-factor neurotrófico, incluindo análise de transferência de Western e hibridação in situ, estudos de bioactividade, análise de transferência de Northern, etc..

As amostras de paciente podem ser obtidos a partir de qualquer tecido ou fluído apropriado incluindo, mas não limitado a, tecido de nervo ou de cérebro, ou fluído cérebro-espinal ou sangue.

Uma aberrância no nível de factor neurotrófico pode ser definida como uma diferença estatisticamente significativa no nível de factor neutrófico no paciente, em comparação com um controlo normal. 0 nível aberrante pode estar aumentado ou diminuído em relação aos níveis normais e/ou pode existir em todo o paciente ou apenas numa área localizada. Os pacientes que exibem uma diminuição do factor neurotrófico podem beneficiar particularmente da administração do factor (ver Secção 5.2, supra) . Os pacientes exibindo um aumento no factor neurotrófico podem estar a expressar factor anormal ou podem sofrer de uma insuficiência efectiva de receptores do factor. Os pacientes com menos ou com receptores de factor anormais, podem ser identificados testando células destes pacientes quanto ao receptor de factor neurotrófico normal, por exemplo, comparando a capacidade destas células em se ligarem a factor neurotrófico marcado detectavelmente, com a capacidade de ligação de células normais. Os pacientes com menos receptores ou com receptores anormais podem beneficiar ou não de terapia de factor neurotrófico suplementar e podem beneficiar, particularmente, do tratamento com análogos de agonista de factor neurotrófico.

Adicionalmente, o facto de se ter verificado que o BDNF ou a NT-3 parecem ser transportados retrogradamente pelos neurónios motores, constitui um processo de diagnóstico de uma desordem de neurónios motores relacionada com o BDNF ou com a NT-3, compreendendo a injecção de BDNF ou de NT-3, marcados detectavelmente, de modo a que o BDNF marcado entre num nervo motor, e a determinação se o BDNF ou a NT-3 marcados são ou não transpor- 73 988 6526-058-118

-19- tados retrogradamente, no qual uma falha em serem transportados retrogradamente se correlaciona com uma disfunção dos neurónios motores. Este processo pode ser aplicado no diagnóstico de desordens que incluem, mas que não estão limitadas a esclerose amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal progressiva, atrofia muscular infantil, poliomielite, síndroma post-polio, doença de Charcot-Marie Tooth e traumas ou lesões de nervos.

5.5. SISTEMAS DE ENSAIO O presente invento proporciona sistemas de ensaio que põdem ser usados para identificar compostos que podem ser usados no tratamento de desordens dos neurónios motores. Estes sistemas de ensaio avaliam um agente de teste quanto à sua capacidade para bloquear a ligação de BDNF ou de NT-3 a neurónios motores. Deste modo, o presente invento proporciona um processo para o ensaio de um agente de teste quanto à sua capacidade para promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores, compreendendo a exposição de neurónios motores, em cultura, a BDNF ou NT-3 (ou a qualquer membro adequado da família de BDNF/NT-3(NGF) marcados de um modo detectável, sob condições tais que o BDNF ou a NT-3 são capazes de se ligarem aos neurónios motores e, ao mesmo tempo, a exposição dos neurónios motores a um agente de teste, no qual a inibição da ligação de BDNF ou de NT-3 marcados, pelo agente de teste, indica que o agente de teste pode ser usado no tratamento de desordens dos neurónios motores. Um agente de teste cujo resultado seja positivo num tal sistema de ensaio pode, desejavelmente, ser avaliado adicionalmente, in vitro ou in vivo, quanto à capacidade para promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores em cultura. Um agente de teste com o qual se obtêm resultados negativos pode, em alguns casos, ser um antagonista da actividade do tipo BDNF ou NT-3. O BDNF ou a NT-3 podem ser marcados de um modo detectável por qualquer método incluindo a incorporação de aminoácidos radiomarcados e a adição de um "rótulo" detectável à molécula de factor neutrófico. Este rótulo pode ser fluorescente, pode ter

73 988 6526-058-118 -20- actividade enzimática, pode ser um anticorpo que se liga ao factor neurotrófico, ou pode ser antigénico e capaz de se ligar a um anticorpo (p.e., uma porção do antigénio mvc que é capaz de se ligar a anticorpo anti-myc).

Os agentes de teste que podem ser usados de acordo com o invento incluem, mas não estão limitados a, factores neurotrófi-cos que são membros de família de BDNF/NT-3/NGF, ou seus fragmentos ou derivados, outros compostos peptídicos, derivados de péptidos e compostos não-peptídicos.

Numa concretização específica não limitativa do invento apresentada como exemplo, o BDNF radiomarcado, em conjunto com um agente de teste não marcado, é incubado com neurónios motores em cultura sob condições que permitem a ligação de BDNF. Como controlo, expõe-se uma cultura idêntica de neurónios motores a BDNF radiomarcado, na ausência do agente de teste. Se o agente de teste é capaz de se ligar ao receptor de BDNF, pode inibir competitivamente a ligação de BDNF marcado. Quando se lavam depois as células para remover o BDNF não ligado, será de esperar que a cultura contendo o agente de teste contenha menos radioac-tividade do que a cultura de controlo.

5.6. SISTEMAS DE MODELO ANIMAIS 0 presente invento proporciona adicionalmente sistemas de modelo animal para desordens de neurónios motores, compreendendo animal que possua uma depleção sistémica ou generalizada, de BDNF ou de NT-3. A depleção generalizada de BDNF ou de NT-3 pode ser conseguida produzindo um animal que expressa anticorpo contra o BDNF ou a NT-3; estes animais podem ser produzidos por imunização do animal com BDNF ou com NT-3, de outra espécie ou que foram modificados quimicamente para se tornarem mais imunogénicos. A depleção local pode ser conseguida por introdução de anticorpo anti-BDNF ou anti-NT-3 localmente, p.e., por um implante de hibridoma na vizinhança do giro pré-central. Adicionalmente, podem-se produzir animais transgénicos nos quais o gene endógeno de BDNF ou de NT-3 tenha sido "vencido" por recombinação homóloga.

73 988 6526-058-118 -21-

6. EXEMPLO: 0 BDNF AUMENTOU A ACTIVIDADE DA COLINA-ACETILTRANS-FERASE EM CULTURAS DE NEURÓNIOS MOTORES DE MEDULA ESPINAL VENTRAL

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Para todas as experiências usaram-se embriões (E14) de ratazanas Sprague-Dawley (HSD ou Zivic-Miller). As ratazanas grávidas foram sacrificadas por asfixia com dióxido de carbono e os embriões foram removidos rapidamente e colocados em meio arrefecido com gelo para dissecação posterior.

6.1.2. TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

As medulas espinais foram removidas assepticamente dos embriões de ratazana com 14 dias de gestação. A medula espinal foi cortada na cauda até ao bulbo (ao nível do primeiro gânglio da raiz dorsal), e separada dos gânglios sensoriais e dos meninges aderentes. A medula foi depois subdividida nos segmentos ventral e médio-dorsal para culturas em separado. Os tecidos da medula espinal dorsal foram cortados em pequenos pedaços e incubados em 0,1% de tripsina (GIBCO) e 0,01% de desoxirribonuclease do tipo 1 (Sigma) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), isenta de cálcio-magnésio, a 37°C durante 20 minutos. Depois, removeu--se a solução de tripsina e enxaguaram-se as células, e coloca-ram-se num meio consistindo em 45% de meio essencial mínimo (MEM) de Eagle, 45% de mistura nutriente de Ham F12 (F12), 5% de soro fetal de vitelo inactivado por calor (GIBCO), 5% de soro de cavalo inactivado por calor (GIBCO), glutamina (2 mM), penicilina G (0,5 U/ml) e estreptomicina (0,5 μg/ml). O tecido foi depois dissociado mecanicamente por trituração suave através de uma pipeta de Pasteur e os sobrenadantes foram reunidos e filtrados através de um filtro de "nylon" (Nitex, Tetko; 40 μιη). As suspensões de células filtradas foram depois submetidas a um procedimento de fraccionamento como se descreve na secção 6.1.3, infra.

6.1.3. FRACCIONAMENTO DAS CÉLULAS DE MEDULA ESPINAL VENTRAL POR GRADIENTE DE DENSIDADE DE METRIZAMIDA

Este protocolo de fraccionamento é uma modificação do méto-

73 988 6526-058-118 -22- do descrito por Schnaar e Schaffner (1981, J. Neurosci. l.; 204-217). Todos os passos foram realizados a 4°C. A metrizamida foi dissolvida em meio F12:MEM (1:1) e estabeleceu-se um gradiente descontínuo que consistia em uma camada de metrizamida a 18% (0,5 ml), 3 ml de metrizamida a 17%, 3 ml de metrizamida a 12% e 3 ml de metrizamida a 8%. A suspensão de células de medula espinal ventral filtrada (2,5 ml), obtida como anteriormente se descreveu, foi colocada em camada sobre o gradiente em degrau e o tubo foi centrifugado a 2500xg durante 15 minutos usando um rotor oscilante ("swing-out") (Sorvall HB4). Das centrifugações resultaram três camadas de células: fracção I (nã interface 0-8%), fracção II (na interface 8-12%) e fracção III (na interface 12-17%). A fracção I, enriquecida em neurónios motores, da interface 0-8%, foi removida num pequeno volume (cerca de 1 ml) e enxaguada duas vezes com meio definido isento de soro, consistindo em 50% de F12 e 50% de MEM suplementado com glutamina (2 mM), insulina (5 μg/ml), transferrina (100 μg/ml), progesterona (20 nM), putrescina (100 μΜ) e selenito de sódio (30 nM) (Bottenstein e Sato, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 7.6: 514-517). Uma contagem das células viáveis foi obtida por contagem em hemocitómetro na presença de azul de tripano. A suspensão de células de fracção I (enriquecida com neurónios motores) foi depois plaqueada com uma densidade de 100 000 células/cm2 em poços de 6 mm pré-revestidos com poli-L-ornitina (Sigma; 10 μg/ml) e laminina (GIBCO? 10 μg/ml). No dia do plaqueamento aplicaram-se os tratamentos com factores de crescimento (CNTF e BDNF). As culturas foram mantidas em meio definido isento de soro, a 37°C, em atmosfera de 95% de ar/5% de C02 com uma humidade relativa de aproximadamente 100%. No dia 2 (48 horas), as células foram colhidas para medições de colina-acetiltransferase (CAT; Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409) e ver secção 7.1.5, infra. 6.1.4. FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DE CÉREBRO (BDNF) O BDNF foi produzido em células CHO e purificado a partir de meios condicionados de células CHO até à homogeneidade, tal como foi determinado em geles de poliacrilamida corados com prata e por análise da sequência de aminoácidos (ver Secção 8, in-

73 988 -23- 6526-058-118 fra). 6.1.5. FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR (GNTF) O CNTF usado em todas as experiências foi CNTF recombinante de ratazana expresso em E. coli e purificado como se descreve em Masiakowski et al. W0 91/04316.

6.1.6. OUTROS FACTORES 0 NGF (2,5S) usado nestes estudos foi purificado a partir de glândulas salivares de ratinho de acordo com os protocolos descritos por Mobley et al.. 1976, Biochemistry 15:5543-5551. 0 FGF básico foi obtido junto do Collaborative Research.

6.2. RESULTADOS

6.2.1. EFEITOS DO BDNF SOBRE A ACTIVIDADE DE COLINA-ACETIL-TRANSFERASE O tratamento de culturas enriquecidas em neurónios motores com BDNF resultou num estímulo máximo de 4-5 vezes na actividade de CAT após 48 horas, em comparação com controlos não tratados. O aumento na actividade de CAT pareceu ser dependente da dose de BDNF, conseguindo-se uma resposta máxima para aproximadamente 10 ng/ml, tal como se mostra na Figura l. 6.2.2. EFEITOS DA CO-ADICÃO DE BDNF E DE CNTF SOBRE A ACTIVI- DADE DE COLINA-ACETILTRANSFERASE Uma vez que se tem mostrado que o factor neurotrófico ciliar (CNTF) promove a sobrevivência de neurónios motores de ratazana in vitro (Wong et al.. 1990, Soc. Neurosci. Abst.), pensou-se determinar se o aumento da actividade de CAT por estes dois factores (BDNF e CNTF) era aditivo. 0 co-tratamento com BDNF (50 ng/ml) e com CNTF (50 ng/ml), que representam as concentrações de saturação, resultou num aumento mais do que aditivo na actividade de CAT em neurónios motores cultivados (Fig. 2), sugerindo que estes dois factores actuam sinergisticamente e que possuem vias reguladoras diferentes. 0 efeito acrescentado máximo conseguido pela co-adição de BDNF e de CNTF foi de cerca de 15 vezes mais elevado do que os níveis de controlo. Ve-rificou-se que nem o NGF nem o bFGF têm um efeito significativo 73 988 6526-058-118 -24-

na actividade de CAT em comparação com culturas de controlo (Fig. 2B). A degeneração e a morte dos neurónios motores no corno ven-tral da medula espinal é um aspecto importante do processo pato-fisiológico na esclerose amiotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), em lesões da medula espinal e noutras desordens dos neurónios motores. Estes resultados sugerem que se pode usar BDNF, sozinho ou em combinação com CNTF, no tratamento destas doenças para promover a expressão colinérgica.

7. EXEMPLO: O TRATAMENTO COM NT-3 AUMENTOU A ACTIVIDADE DE COLI-NA-ACETILTRANSFERASE EM CULTURAS DE NEURÓNIOS MOTORES DA MEDULA ESPINAL

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS

7.1.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Para todas as experiências usaram-se embriões (estado E14) de ratazanas Sprague-Dawley (HSD ou Zivic-Miller). As ratazanas grávidas foram sacrificadas por asfixia com dióxido de carbono e os embriões foram removidos rapidamente e colocados em meio arrefecido com gelo para dissecação posterior.

7.1.2. TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

As medulas espinais foram removidas assepticamente dos embriões de ratazana com 14 dias de gestação e preparadas como se descreve na Secção 6.1.2., supra.

7.1.3. FRACCIONAMENTO DE CÉLULAS DA MEDULA ESPINAL VENTRAL POR GRADIENTE DE DENSIDADE DE METRIZÃMIDA 0 protocolo de fraccionamento foi o que se descreveu na secção 6.1.3., supra. com a excepção de se terem tratado as células com NT-3 no dia do plaqueamento. Como se mostra na Figura 3, o tratamento com NT-3 resultou num estimulo máximo de 3-4 vezes na actividade de CAT em neurónios motores, em comparação com controlos não tratados. O aumento da actividade de CAT era dependente de dose, conseguindo-se uma resposta máxima para cerca de 1 ng/ml. 73 988 6526-058-118 -25-

7.1.4. NEUROTROFINA-3 (NT-3) A NT-3 foi produzida em células CHO e purificada a partir de meios condicionados de células CHO até à homogeneidade, tal como se descreve para o BDNF na Secção 8, infra. tal como foi determinado em geles de poliacrilamida corados com prata e por análise da sequência de aminoácidos.

7.1.5. ENSAIO DE COLINA-ACETILTRANSFERASE

As culturas foram colhidas por lise das células numa solução de Tris-HCl 20 mM (pH 8,6) contendo 0,1% de Triton X--100. Removeram-se 2 microlitros do lisado de células e testa-ram-se quanto à actividade de CAT de acordo com o procedimento micro-Fonnum (Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24.:407-409). A composição final de substrato consistia de [1-14C]Acetil-CoA 0,2 mM (NEN, 54,4 mci/mmole), NaCl 300 mM, brometo de colina 8 mM, EDTA 20 mM e neostigmina 0,1 mM, em tampão de NaH2P04 50 mM (pH 7,4). Para estas concentrações de enzima e substrato, a reacção enzi-mática foi linear durante 90-120 minutos. A especificidade da indução de CAT foi testada pela adição de um inibidor específico da actividade de CAT, o N-hidroxietil-4-(l-naftilvinil)pirídio (HNP), durante o ensaio (White e Cavallito, 1970, J. Neurochem. 17:1579-1589).

7.2. RESULTADOS

Tal como se referiu supra. a degeneração e morte dos neurónios motores no corno ventral da medula espinal é um aspecto importante do processo patofisiológico na esclerose amiotró-fica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), em lesões da medula espinal e noutras doenças dos neurónios motores. Os presentes resultados, que mostram um aumento da actividade de CAT em neurónios motores tratados com NT-3, sugerem que a NT-3 pode ser usada no tratamento destas doenças para promover a expressão co-linérgica. 8. EXEMPLO: PROCEDIMENTO PARA A PURIFICAÇÃO DE FACTOR DE CRESCI-MENTO DERIVADO DE CÉREBRO RECOMBINANTE A PARTIR DE MEIO CONDI-

CIONADO DE CÉLULAS DE OVÁRIO DE "HAMSTER” CHINÊS

73 988 6526-058-118 -26-

8.1. MATERIAIS E MÉTODOS O BDNF recombinante foi isolado a partir de meio condicionado de células CHO por um procedimento em dois passos consistindo em cromatografia de permuta catiónica e de filtração em gel. O meio condicionado recolhido do bio-reactor Opticell (Charles River), semeado com células CHO que expressam BDNF, foi diluído com água destilada numa proporção de 1,25:1 e carregado continuamente, a 4°C, numa coluna S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) de 15 ml (1,6 cm de d.i.). Foi aplicado um volume total de 10,6 1 (diluído) num período de cinco dias. A coluna foi lavada com 50 ml de tampão MES 20 mM (uma solução de ácido 4-morfolinoetanossulfónico; pH ajustado até 5,8 com NaOH), pH 5,8, seguindo-se 50 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 250 mM, seguindo-se o mesmo tampão MES sem cloreto de sódio até a absorvância a 280 nm atingir o nível da linha de base. A coluna foi depois lavada com 25 ml de tampão bicina 20 mM, pH 8,5, seguindo-se 15 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 100 mM. Eluiu-se subsequentemente a coluna com 150 ml de um gradiente de cloreto de sódio, de 100 mM até 750 mM, em tampão bicina 20 mM, pH 8,5. 0 caudal foi de 2,5 ml/min.. A absorvância do eluído foi monitorizada a 280 nm com uma sensibilidade de 0,2 unidades de absorvância, escala completa. As fracções contendo BDNF recombinante foram identificadas pelo bio-ensaio de explante de gânglios da raiz dorsal (DRG). As fracções com a actividade específica mais elevada corresponderam á concentração de cloreto de sódio entre 500 e 750 mM. Estas fracções foram combinadas (45 ml) e concentradas até 2 ml por ultra-filtração em membrana a alta pressão, usando uma membrana do tipo Omega de 3 kDa. Esta membrana foi seleccionada com base na sua baixa ligação não específica ao BDNF. A amostra concentrada foi depois aplicada a uma coluna de filtração em gel Sephacryl S-100HR (Pharmacia) de 120 ml (1,6 cm de d.i.). A coluna foi empacotada e equilibrada com tampão HEPES 20 mM, pH 7,6, contendo NaCl 400 mM. A coluna foi eluída a 0,25 ml/min.. Recolheram-se fracções de 2 ml e testaram-se para determinar a actividade de BDNF no bio-ensaio de explante de DRG. Verificou-se que as fracções 73 988

6526-058-118 -27-eluídas entre 80 e 90 ml continham BDNF recombinante bioactivo. Estas fracções foram combinadas e analisadas por electroforese em SDS-poliacrilamida de redução, sequenciação a partir do terminal N e análise quantitativa de aminoácidos. A electroforese em gel (18% de poliacrilamida) revelou a presença de duas bandas muito pouco espaçadas co-migrando com o citrocromo C. A análise do terminal N e a análise quantitativa de aminoácidos foram realizadas usando procedimentos padrão. A sequenciação do terminal N indicou que o material isolado era composto por BDNF de comprimento completo (cerca de 66%) e de BDNF truncado ao qual faltavam os primeiros 6 resíduos de aminoácido. A análise quantitativa de aminoácidos da amostra revelou que a concentração de proteína tinha um valor médio aproximado de 0,043 mg/ml. Com base neste valor, o rendimento final de BDNF bioactivo puro foi de 0,430 mg. 0 bioensaio de explante de DRG requereu aproximadamente 1,2 ng/ml deste material para a semi-saturação.

8.2. RESULTADOS: ANÁLISE QUANTITATIVA DE AMINOÁCIDOS DO BDNF A análise quantitativa de aminoácidos do BDNF purificado foi realizada num analisador de aminoácidos Beckman 6300. Os resultados (Tabela I) indicam que a proteína tinha uma concentração média aproximada de 0,043 mg/ml. A Figura 4 ilustra a curva de resposta a doses para o BDNF usando o bioensaio de explante de gânglio da raiz dorsal padrão. (Segue Tabela I)

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TABELA I

Análise da Sequência de BDNF

Amostra 1: Fracção de Factor Neurotrófico derivado de Cérebro #23, BDNF #2, 100 μΐ, HEPES 20 mH e NaCl 400 mM A amostra foi precipitada com 75% de acetona no congelador (-20eC) de um dia para o outro. 0 precipitado de proteína foi recolhido por centrifugação a 13 000 rpm durante 10 minutos. Foi séqúenciada ‘a proteína dissolvida em ácido trifluoroacético a 70%: cio Sequência I 1 His 17,5 pmol 2 Ser 14,1 3 Asp 26,2 4 Pro 25,0 5 Ala 36,0 6 Arg 54,6 7 Arg 44,1 8 Gly 16,9 9 Glu 13,6 10 Leu 10,7 11 Ser 7,4 12 Vai 15,7 13 - 14 Asp 8,1 15 Ser 4,0 16 Ile 5,0

Sequência II Ref Arg 18,6 pmol His Gly 8,5 Ser Glu 8,8 Asp Leu C0 O H Pro Ser 12,3 Ala Vai 19,0 Arg - Arg Asp 8,2 Gly

Glu

Leu

Ser

Vai

Cys

Asp

Ser

Ile

Quantidades estimadas:

Proteína I: 36,0 x 2,5 = 90,1 pmol (Ala-5) Proteína II: 19,0 x 2,5 = 47,7 pmol (Val-6)

Proporção de Proteína I para II = 2,1

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9. EXEMPLO: TRANSPORTE RETRÓGRADO DE 125I-BDNF E DE 125I-NT-3 PARA A MEDULA ESPINAL DORSAL DE RATAZANA

9.1. MATERIAIS E MÉTODOS

9.1.1. NEUROTROFINAS O BDNF e a NT-3 recombinantes foram preparados a partir de meio condicionado usando o processo descrito na Secção 8, supra. O BDNF e a NT-3 foram radio-iodados (Yip et al.. 1983, J. Neu-rosci. 3.:2172-2182) usando o método da lactoperoxidase para ac-tividades específicas de 3000-7800 cpm/fmol. O 125I livre foi removido antes dos estudos de transporte.

9.1.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Obtiveram-se ratazanas Sprague-Dawley machos (250-300 g) de Zivic Miller e usaram-se em todos os estudos de transporte retrógrado .

9.1.3. ESTUDOS DE TRANSPORTE RETRÓGRADO

As ratazanas foram anestesiadas com uma mistura de hidrato de cloral (4%) e pentobarbital de sódio (0,88%) num volume de 3 ml/kg de peso corporal. O nervo ciático direito foi exposto e esmagado durante 10 segundos num ponto a 0,4 cm distais do tendão do músculo obturador interno. Foi realizada uma lesão de esmagamento com o propósito de expor números máximos de locais de receptor para o acesso do BDNF. Após o esmagamento, injectaram-se, no local de esmagamento, 2 /xl de BDNF ou NT-3, marcados com 125I, contendo quer 10 mg/ml de BSA em PBS, quer BDNF, NT-3 ou NGF não marcados (excesso de 100 vezes) em tampão PBS/BSA. Injectaram-se um total de 16 ng de BDNF e de 14 ng de NT-3 (4x10^ e 2,2x10^ cpm, respectivamente). Suturaram-se as feridas e deixaram-se as ratazanas recuperar durante 18 horas. As ratazanas foram sacrificadas e os segmentos lombares 4 e 5 da medula espinal foram removidos e seccionados nos lados direito (ipsilateral) e esquerdo (contralateral). Colocaram-se amostras em paraformaldeído a 4% tamponado com fosfato (pH 7,4) e contaram-se num contador gama. Os valores estão expressos em attomoles (10“18 moles) de neurotrofina-125I transportada por medula espinal direita ou esquerda ± S.E.M.

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9.2. RESULTADOS

Na Tabela II mostra-se que o BDNF se acumulou na medula espinal de ratazanas, injectadas com 125I-BDNF no nervo ciático esmagado. Observaram-se contagens (300-400 contagens por minuto, correspondentes a cerca de 50 attomoles) no lado injectado enquanto que do lado contralateral se acumularam contagens em número próximo do valor de fundo. 0 baixo nível de contagens que se acumularam no lado contralateral pode resultar de fuga, do local da injecção para o local de interesse, através da circulação sistémica. Este valor de fundo foi normalmente de 15-25% do lado injectado para os estudos de transporte da medula espinal e estas contagens permaneceram relativamente constantes ao longo da experiência. Enquanto um excesso de BDNF de 100 vezes bloqueou significativamente o transporte, o NGF e a NT-3 (>100 vezes) apenas bloquearam parcialmente o transporte. A análise au-to-radiográfica de emulsão do tecido da medula espinal revelou a marcação de grande número de neurónios do corno ventral (no quadrante dorso-lateral do corno ventral) que morfologicamente parecem ser neurónios motores. Na medula espinal dorsal apenas se observou uma marcação de fundo.

TABELA II

Transporte retrógrado de 125I-BDNF para a medula espinal de ratazana

attomoles de BDNF

Inj ecção R L 125i-bdnf + PBS 56 + 15 10 ± 4 125i-bdnf + BDNF 7 + 3* 3 + 1 125i-bdnf + NT-3 35 + 1 6 + 3 125i-bdnf + NGF 48 ± 5 8 + 3

Em todas as experiências o BDNF foi injectado no nervo ciático direito esmagado.

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Os resultados estão expressos como a média ± S.E.M. para 3-4 animais. R, medula espinal direita; L, medula espinal esquerda. *p < 0,05 comparado com -^^I-BDNF + PBS. A Tabela III revela que a NT-3 é também transportada para a medula espinal. De novo, um excesso de 100 vezes do ligando homólogo diminuiu significativamente o transporte, mas o NGF e o BDNF não tiveram efeito significativo no transporte de NT-3. TABELA III '

Transporte retrogrado de 125I-NT-3 para a medula espinal de ratazana attomoles de NT-3

Inj ecção R L 125I-NT-3 + PBS 37 + 3 14 + 9 125I-NT-3 + NT-3 16 + 7* 11 + 6 125I-NT-3 + BDNF 28 ± 5 10 ± 2 125I-NT-3 + NGF 32 ± 6 18 + 4

Os resultados estão expressos como a média ± S.E.M. para 3-4 animais. R, medula espinal direita; L, medula espinal esquerda. *p < 0,05 comparado com 125I-NT-3+PBS 10. EXEMPLO; 0 FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DE CÉREBRO E A NEUROTROFINA-3 SUPORTAM A SOBREVIVÊNCIA DE NEURÓNIOS MOTORES LESIONADOS EM RATAZANAS RECÉM-NASCIDAS Os dados seguintes foram fornecidos em manuscrito por M. Sendtner, B. Holtmann, R. Kolbeck, H. Thoenen e Y.-A. Barde do Departamento de Neuroquímica e Neurobioquímica do Instituto Max-Planck de Psiquiatria.

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10.1. MATERIAIS E MÉTODOS

10.1.1. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS E HISTOLÓGICOS O seccionamento transversal do nervo facial direito em crias de ratazana foi realizado como se descreve em Sendtner et al.. 1990, Nature 345:440-441. Resumidamente, as ratazanas Wis-tar recém-nascidas foram anestesiadas por hipotermia e fez-se um corte, com cerca de 3 mm de comprimento, directamente atrás do ouvido direito. 0 nervo facial foi exposto no forâmen estilomas-toideo e ambas as raízes foram seccionadas transversalmente a cerca de 1 mm distai desta posição. Cortou-se "gelfoam" (Spon-góstan, Paesel, Frankfurt, Alemanha) em pequenos bocados (1x2x3 mm) e embebeu-se em 30 μΐ de PBS contendo quer 5 jug de BSA (Cohn Fraction V, sigma, Deisenhofen, Alemanha) quer factor trófico. A ngelfoam,f foi inserida no local da lesão e fixada sob os ligamentos que cobrem o nervo nesta posição. A pele foi suturada com seda (Ethikon 3-0) e os animais foram devolvidos às mães. No dia sete após o nascimento, os animais foram mortos com doses excessivas de éter e perfusados transcardiamente com 50 ml de formaldeído a 4%. Os pedúnculos cerebrais foram dissecados, fixados pósteriormente durante 1 hora, enxaguados com água; e desidratados com concentrações crescentes de etanol (70-100%). Depois de embebimento com parafina, fizeram-se secções em série (7 jttm) a partir de todo o pedúnculo cerebral com um microtomo para secções em série (supercorte Reichert-Jung 2050). As secções foram coradas com violeta de cresilo (Sigma, Deisenhofen, Alemanha, e contaram-se os nucleólos dos neurónios motores faciais em ambos os lados da lesão e de controlo, usando um microscópio óptico (ampliação de 125 x) em cada quinta secção como se descreve em Sendtner et al.. As contagens não foram corrigidas para dar nucleólos separados. 10.1.2. PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE NGF. BDNF E NT-3 O factor de crescimento de nervo (2.5 S) foi isolado a partir das glândulas submaxilares de ratinhos macho adultos. Tanto o BDNF como a NT-3 recombinantes de ratinho foram produzidos em células de rim de coelho, após transfecção com um vírus vacina recombinante, e purificados a partir dos sobrenadantes. 73 988 6526-058-118 -33-

10.2. RESULTADOS

Se os axónios dos neurónios motores faciais foram seccionados transversalmente ou esmagados, mais do que 80% das células lesionadas degeneraram em poucos dias. Verificou-se que a aplicação de CNTF no local da lesão aumenta as taxas de sobrevivência destas células até aproximadamente 100%. Sob as mesmas condições, a aplicação de 5 /xg de NGF não pareceu melhorar significativamente a sobrevivência dos neurónios motores.

Em contraste com os animais tratados com NGF, puderam-se observar taxas de sobrevivência significativas quando se aplicou BDNF ao nervo facial seccionado transversalmente. Em média, cerca de 50% dos neurónios motores lesionados estavam ainda vivos uma semana após a lesão (Tabela IV). As taxas de sobrevivência foram de 765 a 4580 neurónios no sítio da lesão. No animal onde apenas puderam ser detectados 765 neurónios, a "gelfoam" contendo o factor trófico estava deslocada do local da lesão e isto explica provavelmente o baixo efeito de sobrevivência do BDNF observado nesta única experiência.

Tal como o BDNF, verificou-se também uma sobrevivência melhorada dos neurónios motores após o tratamento com NT-3 (Tabela IV). Contudo, os efeitos foram mais pequenos do que os observados com o BDNF? em média, 27 por cento dos neurónios motores lesionados puderam ser recuperados no lado da lesão. Em comparação com os 18 por cento de neurónios motores recuperados pela BSA, os efeitos de promoção da sobrevivência de NT-3 são estatisticamente significativos (p < 0,05).

Morfologicamente, em animais tratados com BDNF e NT-3, os corpos de células de neurónios motores lesionados foram mais pequenos e mostraram modificações reactivas típicas (Fig. 5). Os núcleos foram deslocados e a cromatolise foi pronunciada em animais tratados com BDNF e com NT-3. Contudo, quando comparados com animais de controlo tratado com BSA-gelfoam, o tamanho dos núcleos pareceu maior (Fig. 5). 73 988 6526-058-118 34-

TABELA IV

SOBREVIVÊNCIA DE NEURÓNIOS MOTORES APÓS LESÃO DO NERVO FACIAL EM RATAZANAS RECÉM-NASCIDAS

O EFEITO DE NEUROTROFINAS

Número de neurónios sobreviventes ± SEM lado com 'lesão lado sem lesão 844 ± 115 4597 ± 222 500 ± 322 4160 ± 409

Animais tratados com BSA-gelfoam (n = 8)

Animais tratados com gelfoam contendo NGF (n = 3)

Animais tratados com gelfoam contendo 2222 ± 446 4534 ± 129 BDNF (n = 9)

Animais tratados com gelfoam contendo 1155 ± 109 4273 ± 415

NT-3 (n = 6) 10.2. DISCUSSÃO

No presente estudo, mostrou-se que o BDNF é capaz de suportar a sobrevivência de um número significativo de neurónios motores faciais após axotomia na ratazana recém-nascida. Adicionalmente, a NT-3 parece ser também activa nestas células, se bem que em menor grau. Por contraste, parece que a NGF não suporta a sobrevivência destas células após axotomia. Estes resultados mostram que membros da família de gene da neurotrofina são capazes de afectar a sobrevivência dos neurónios motores in vivo de um modo similar ao do CNTF. São aqui citadas várias publicações cujas descrições são incorporadas como referência na sua totalidade.

Claims (25)

1. 73 988 6526-058-118 1 - Composição farmacêutica que pode ser usada no tratamento de uma desordem de neurónios motores, caracterizada por compreender um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF, que suportam a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores e CNTF, num portador farmacologicamente aceitável.
2. 2 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1," caracterizada por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser BDNF.
3. 3 - Composição farmacêutica de acordo ctam a reivindicação 1, caracterizada por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser NT-3.
4. 4 - Uso de um factor neurotrófico que (i) é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF e (ii) que suporta a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem dos neurónios motores.
5. 5 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser BDNF.
6. 6 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser NT-3.
7. 7 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a desordem dos neurónios motores ser provocada por esclerose amiotrófica lateral.
8. 8 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a desordem dos neurónios motores ser provocada por trauma.
9. 9 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a desordem dos neurónios motores ser provocada por atrofia

   73 988 6526-058-118 -36 muscular espinal progressiva.
10. 10 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a desordem dos neurónios motores ser provocada por atrofia muscular infantil ou juvenil.
11. 11 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a desordem dos neurónios motores ser provocada por poliomielite ou síndrome pós-polio.
12. 12 - Uso de acordo com a reivindicação 4‘, càracterizàdò por a desordem dos neurónios motores ser provocada por doença de Charcot-Marie-Tooth.
13. 13 - Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o membro da família de BDNF/NT-3/NGF estar associado a pelo menos um outro agente que é capaz de pomover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores.
14. 14 - Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o outro agente ser factor neurotrófico ciliar.
15. 15 - Processo para promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores, caracterizado por se exporem os neurónios motores a uma concentração eficaz de um factor neurotrófico que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF, que são capazes de promoverem a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores.
16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser BDNF.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser NT-3.
18. 18 - Processo para diagnosticar uma desordem de neurónios -37- 73 988 6526-058-118 motores num paciente caracterizado por compreender a comparação entre o nível de um factor neurotrófico que é um membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF numa amostra retirada do paciente com uma amostra análoga de um indivíduo normal, detectando-se assim uma aberração no nível do factor neurotrófico no paciente que se correlaciona positivamente com a presença da desordem de neurónios motores.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser BDNF.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o membro da família de moléculas de BDNF/NT-3/NGF ser NT-3.
21. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a desordem de neurónios motores ser esclerose amiotrófica lateral.
22. 22 - Processo para ensaiar um agente de teste relativamente à capacidade de promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores , caracterizado por compreender (a) expor os neurónios motores a BDNF marcado detectavelmente sob condições tais que o BDNF marcado seja capaz de ligação aos neurónios motores; e (b) expor concorrentemente os neurónios motores a um agente de teste, indicando a inibição da ligação do BDNF marcado, pelo agente de teste, a utilidade do agente de teste para o tratamento de desordens dos neurónios motores.
23. 23 - Processo para ensaiar um agente de teste relativamente à capacidade de promover a sobrevivência, crescimento ou diferenciação de neurónios motores , caracterizado por compreender (a) expor os neurónios motores a NT-3 marcado detectavelmente sob condições tais que o NT-3 marcado seja capaz de ligação aos neurónios motores? e (b) expor concorrentemente os neurónios motores a um agente de teste, indicando a inibição

    73 988 6526-058-118 -38 da ligação do NT-3 marcado, pelo agente de teste, a utilidade do agente de teste para o tratamento de desordens dos neurónios motores.
24. 24 - Processo de preparação de BDNF recombinante substancialmente purificado, caracterizado por compreender (i) expressar BDNF recombinante numa célula eucarióti-ca; (ii) recolher o meio de cultura condicionado pela célula eucariótica do passo (i); (iii) diluir o meio com água destilada; (iv) aplicar o meio diluído a uma coluna de S-Sepharose, eluindo com um gradiente de sal de cerca de 100-750 mM; (v) recolher fracções de eluente; (vi) reunir as fracções com actividade de BDNF; (vii) concentrar as fracções do passo (vi); (viii) aplicar as fracções concentradas do passo (vii) a uma coluna de filtração em gel Sephacryl S-100HR; e (ix) eluir a coluna do passo (viii) com uma solução compreendendo cerca de 400 mM de NaCl a pH 7,6.
25. 25 - Processo de preparação de NT-3 recombinante substancialmente purificado, caracterizado por compreender (i) expressar NT-3 recombinante numa célula eucariótica; (ii) recolher o meio de cultura condicionado pela célula eucariótica do passo (i); (iii) diluir o meio com água destilada; (iv) aplicar o meio diluído a uma coluna de S-Sepharose, eluindo com um gradiente de sal de cerca de 100-750 mM; (v) recolher fracções de eluente; (vi) reunir as fracções com actividade de NT-3; (vii) concentrar as fracções do passo (vi); (viii) aplicar as fracções concentradas do passo (vii) a uma coluna de filtração em gel Sephacryl S-100HR; e (ix) eluir a coluna do passo (viii) com uma solução com- -39- 73 988 6526-058-118 preendendo cerca de 400 mM de NaCl a pH 7,6. Lisboa, Por REGENERÒN PHARMACEUTICALS INC. e MAX PLANCK GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN e V. =0 AGENTE OFICIAL=

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