HUT70275A

HUT70275A - Methods of treatment of motor neuron diseases using members of the bdnf/nt-3/ngf family of molecules

Info

Publication number: HUT70275A
Application number: HU9400063A
Authority: HU
Inventors: Vivien Wong; Czeslaw Radziejewski; Peter Distefano
Original assignee: Regeneron Pharma; Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1991-07-10
Filing date: 1992-05-19
Publication date: 1995-09-28
Also published as: CA2113083A1; GR3036776T3; DE69231930T2; FI940098A0; WO1993001300A1; NO940084L; EP0593516A1; EP0755682A1; FI940098A; CN1065768C; IE921602A1; DK0593516T3; SK2694A3; PT100501A; ZA923639B; HU9400063D0; AU2009592A; ES2157903T3; JPH06509094A; CN1071585A

Description

A találmány motoros neuron-betegségek kezelésére alkalmas eljárásokra vonatkozik, melyek szerint a kezelésre szoruló betegnek a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagjai közé tartozó és a motoros neuronok túlélését, növekedését és/vagy differenciálódását elősegítő neurotrofikus /idegszövetet tápláló/ faktor, előnyösen BDNF vagy NT-3 hatásos mennyiségét adjuk be. A találmány szerint eljárást is kifejlesztettünk a motoros neuronok tenyésztésére és a motoros neuronok rendellenességeinek diagnosztizálására, továbbá elemző rendszereket a motoros neuronokra nézve hasznos vagy mérgező anyagok azonosítására, valamint állati modelleket a motoros neuronbetegségek vizsgálatához.

1. MOTOROS NEURONOK

A mozgató neuronok és izomsejtek egymásrahatása meghatározza az izomtónust, befolyásolja az izomösszehuzódást és ezáltal alapját képezi az Összes akaratlagos és akarattól független mozgásnak.

A motoros neuronokat hagyományosan az elsődleges mozgató neuronok és másodlagos mozgató neuronok csoportjába sorolják. Az elsődleges motoros neuronok az agy precentrális tekervényében helyezkednek el és hosszú nyúlványokat bocsátanak le a másodlagos motoros neuronok zinapszisaihoz a gerincvelő szürkeállományának ventrális /elülső/ szarvaiban. A gerincvelő ventrális szarvaiból kiindulva a másodlagos • · ·

- 3 mozgató neuronok axon nyúlványai egyesülnek és motoros ideggyököket alkotnak. Ezek az axonok végül egy vagy több izomroston végződnek. Rostjaik terminális részének elágazódása utján minden motoros neuron változó számú, például 100-200 vagy ennél több izomrosttal kerül érintkezésbe és motoros egységet alkot /Adams és Victor, in Principles of Neurology, McGraw-Hill, Inc., 1985, New York, 37. oldal/.

A motoros neuronok betegségei különböző mértékű izomgyengeséget eredményezve tehetetlenséghez vezetnek, amely nehéz feladatok végrehajtásakor fellépő kisebb nehézség és a teljes paralizis között változhat. A másodlagos motoros neuronok zavarai általában petyhüdt bénulással és izomtónus csökkenéssel járnak. Egyedi idegek, vagy a gerincvelőben egymáshoz közelfekvő neuronok által beidegzett szomszédus izomcsoportok károsodhatnak és sorvadásuk mértéke olyan nagy lehet, hogy a teljes izomtömeg 70-80%-ára is kiterjedhet. A beteg motoneuronok ingerelhetővé válhatnak és az általuk szabályozott izomrostok elszórtan, más egységektől izoláltan depolarizálódhatnak látható rángást vagy izomköteg-rángást okozva. Ha viszont az elsődleges motoros neuronok károsodnak, általában izomtónus fokozódással és hiperaktiv in-reflexekkel járó görcsös bénulás alakul ki. Általában nem egyedi izomcsoportok, hanem inkább egy egész tag, vagy a testfél van megtámadva. A sorvadás kisfoku és jellemzően a használat hiányára vezethető vissza. Izomköteg-rángás nem figyelhető meg. Az • ·

- 4 ο elsődleges vagy másodlagos mozgató neuronok károsodását jellemző klinikai tünetegyüttes azonosítása megkönnyítheti a diagnózist és a kezelést.

2. MOTOROS NEURON-BETEGSÉGEK

Neurológiai betegségek széle köre befolyásolhat motoros neuronokat. Az elsődleges mozgató neuronok zavarát pl. túlnyomórészt agy-érrendszeri balesetek, daganatok, fertőzések és trauma okozzák. E folyamatok a másodlagos motoros neuronokat, vagy az elülső szarv sejtjeit másodlagos károsíthatják, de emellett számos betegség támadhatja meg őket, ahol az elülső gerincvelőszarv sejtjek pusztulása a legfőbb jellegzetesség; e betegségek közé tartozik az izomsorvadásos lateralsclerosis, csecsemőköri és ifjúkori gerincizom-sorvadás, poliomyelitis és post-polio szindróma, örökletes érzőmozgató neuropátiák és toxikus motoros neuropátiák /például vincristin hatására/.

Ezek közül főként az elülső gerincveslőszarv sejtek /AHC/ rendellenességei, izomsorvadásos lateralsclerosis /ALS vagy Lou Gehrig-betegség/ a leggyakoribb /lásd. Williams és Windebank, Mayo Clin. Proc. 66, 54-82 /1991//.

Miatrófiás lateralsclerosisban /ALS/ szenvedő betegeknél a kezdeti panasz gyengeség, leginkább a felső tagokban /Gubbay és munkatársai, J. Neurol. 232, 295-300 /1985/; Vejjajiva és munkatársai, J. Neurol Sci. 4, 299-314 /1967/;

Li és munkatársai, <J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51. 778-784 /1988//. A gyengeség, sorvadás és más neurológiai jelek aszimmetrikusan alakulnak ki és gyakran gócos jellegűek /Munsat és munkatársai, Neurol. 38, 409-413 /1988//. Gyakori panasz az izomgörcs, paresztézia /zsibbadság érzet/ és fájdalom /William és Windebank, fenti közlemény/. Általános izomkötegrángás gyakran megfigyelhető' /lásd ugyanott/. A betegség előrehaladásának mértéke betegről betegre változik /Gubbay és munkatársai, J. Neurol. 232. 295-300 /1985//, de a betegség jóformán minden esetben végül teljes tehetetlenséghez, általános paralizishez /beleértve légzésbénulást/ és halálhoz vezet.

Anatómiailag a legfeltűnőbb változás a gerincvelő és a hozzátartozó mozgató ideggyökök sorvadása és a laterális kötegek merevsége /innen a név: izomsorvadásos lateralsclerosis; Williams és Windebank fent idézett közleménye/. ALS-ben az elsődleges mozgató neuronok is károsodnak és elfajulnak. Az agy makroszkóposán normálisnak tűnhet, noha az elsődleges motoneuronok érintettsége következtében általában a motoros és promotoros kortexek sorvadása is bekövetkezik. A precenirális cortexből a Betz-sejtek és más piramissejtek általánosan károsodnak, amit reaktív gliosis követ /Hammer és munkatársai, Exp. Neurol. 63, 336-346 /1979//.

Epidemológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a betegség kialakulásában genetikai és környezeti tényezők

játszanak szerepet /Williams és Windebank, fent idézett közlemény/. Valaha középkorú felnőttek betegségének tartották, újabban azonban kimutatták, hogy inkább idős személyeknél fordul elő /lásd ugyanott/.

A szokásos kezelés tüneti kezelésből, az izomgörcsök, fájdalom és fáradékonyság csökkentéséből áll. Profetikus eszközöket alkalmaznak az izomgyengeség ellensúlyozása céljából. A betegség folyamatát megváltoztató farmakológiai terápia azonban hatástalannak bizonyult. A tirotropin releasing hormon vélt terápiás hasznát ellentétes eredmények kétségessé tették /Brooks, Ann. N.Y. Acad. Sci. 553. 431-461 /1989//. Gangliozidok alkalmazása hatástalan volt /Lacombez és munkatársai, Neurol. 39. 1635-1637 /1989//. Plazmaferezis magában, vagy immunszuppressziv kezeléssel kombinálva sem mutatkozott előnyösnek /Olarte és munkatársai, Ann. Neurol. 8, 644-645 /1980/; Kelemen és munkatársai, Arch. Neurol. 40. 752-753 /1983//. Leírták a vírusellenes guanidin potenciális, rövid időtartamú előnyeit, de az eredményeket nem tudták reprodukálni /Munsat és munkatársai, Neurol. 31. 1054-1055 /1981//. Egy rövid kísérlet alapján leírták, hogy a glutamát-dehidrogenázt aktiváló, elágazó láncú aminosavak lassítják a betegek gyengülésének ütemét /Plaitakis és munkatársai, Láncét 1, 1015-1018 /1988//. Egyes, részben folyamatban levő újabb terápiás vizsgálatoknál a teljes nyirokrendszerre kiterjedő egésztest-besugárzást és aminosavakat, mint N-acetil-ciszteint, ·· « » «· ······ ··

- 7 N-acetil-metinonint, L-treonint alkalmaztak tireotropin releasing hormon hosszú távra tervezett intratekális infúziójával együtt /Williams és Windebank, fent idézett közlemény/'.

Az ALS-sel klinikai és patológiai hasonlóságot mutató állati modell az Mnd egér, amely az elsődleges és másodlagos mozgató neuronok későn meginduló progresszív elfajulását mutató autoszomális domináns mutáns /Messer és Flaherty, J. Neurogen. ,3, 345-355 /1986//; a wobbler egér, amelynél izom-denerváció következtében a korai életszakaszban alsó végtag gyengeség és sorvadás jön létre; és a Brittany spániel, melynél örökletes gerincizom-sorvadás alakul ki /Sack és munkatársai, Ann. Neurol. 15, 369-373 /1984^5 Sillevis és munkatársai, J. Neurol. Sci. 91, 231-258 /1989/; Bírd és munkatársai, Acta Neuropathol. 19, 39-50 /1971//·

3. CILIÁRIS NEUROTROFIKUS FAKTOR ÉS MOTOROS

NEURON TÚLÉLÉS

Az 1991. április 4-én közzétett, WO 91/04316 számú FCT bejelentés szerint a ciliáris neurotrofikus faktor /CNTF/ in vitro és in vivő előmozdítja a mozgató neuronok túlélését. CNTF-et tartalmazó, gélhabból álló beültetett anyagok újszülött patkányok elvágott arcidegeiben elősegítették a motoros neuronok túlélését. A CNTF olyan neurotrofikus faktor, amely a neurotrofin faktorok családjától - a BDNF-től, NT-3tól és NGF-től - jelentősen eltérő biológiai aktivitásokkal • · · ·« · · · · ♦ · · ♦ · · ·· ♦ » ·· · • ······ ·· · ·· · ·« *·

- 8 rendelkezik.

A találmány motoros neuron-betegségek, mint izomsorvadásos lateralsclerosis /Lou Gehrig-betegség/ kezelési eljárására vonatkozik, mely szerint a rászoruló betegnek a BDNF/NT-3/NGF molekulacsaládba tartozó és a motoros neuronok túlélését, növését és/vagy differenciálódását eló'mozditó neurotrofikus faktor hatásos mennyiségét adjuk be. Találmányunk alapját részben az a felfedezés képezi, hogy a BDNF és NT-3 motoros neuron-tenyészetekben fokozni képes a kolin-acetiltranszferáz aktivitást és retrográd transzporttal az ülőidegtől a gerincvelőhöz jut le. A találmány eló'nyben részesített, specifikus kivitelezésénél a mozgató neuron-betegség kezelésére a BDNF vagy NT-3 és egy második hatóanyag, mint CNTF kombinációját alkalmazzuk.

A találmány szerint eljárásokat is kidolgoztunk a motoros neuronok in vitro túlélésének, növekedésének és/vagy differenciálódásának elősegítésére, melyek során a motoros neuronok tenyészeteihez a BDNF/NT-3/NGF géncsalád egy tagjának hatásos koncentrációját adjuk.

További vonatkozásában a találmány szerint elemző rendszereket fejlesztettünk ki, amelyek BDNF vagy ΝΤ-3-szerü aktivitással rendelkező hatóanyagok azonosítására használhatók és alkalmasak lehetnek motoros neuron-betegségek kezelésére.

A találmány szerint továbbá motoros neuron-beteg« ·« >»··· • · · · · · ·♦ ♦ « ·4 « • «····· ·· ·

- 9 ségek állati modelljét hoztuk létre olymódon, hogy állatokat a BDNF/NT-3/NGF család tagjai vagy származékai ellen immunizáltunk, vagy állatoknak BDNF/NT-3/NGF ellenható anti-BDNF/NT-3/NGF antitesteket vagy antisense oligonukleotidokat adtunk be.

3· Rövidítések

BDNF - agyi neurotrofikus faktor bFGF - bázikus fibroblaszt növekedési faktor

GAT - kolin-acetiltranszferáz

NGF - idegi növekedési faktor

NT-3 - neurotrofin-3

4. ÁBRÁK RÖVID BEÍRÁSA

1. ábra. Motoros neuronokbán dús kultúrákat 2 napon át te- nyésztettünk szérummentes, kémiailag definiált tápoldatban és vizsgáltuk a kultúrák kolin-acetiltranszferáz aktivitását /cpm/h/vályat + S.E.M.7· A tenyésztés elkezdésekor 10 pg/ml - 100 ng/ml koncentrációjú BDNF-et adtunk a vályatokhoz, higitóként BSA-tartalmu /BSA = borjuszérum albumin/ sóoldatot /PBS/ használva /0,5 mg BSA/ml PBS puffer7· A kontroll tenyészetekhez csak PBS-t /0,5 mg BSA/ml puffer7 adtunk.

2, ábra. Motoros neuronokbán dús kultúrákat szérummentes, kémi- ailag definiált tápoldatban 2 napon át tenyésztettünk

• · · ·

3. ábra.

4. ábra.

5. ábra.

és meghatároztuk a tenyészet kolin-acetiltranszferáz aktivitását /cpm/h/vályat + S.E. M.7. A tenyésztés kezdetén PBS-sel /0,5 mg BSA/ml PBS puffer7 hígított CNTF-et, bFGF-et, NGF-et és GNTF/BDNF kombinációt /minden anyag koncentrációja 50 ng/ml7 adtunk a kultúrákhoz. A kontroll tenyészetek csak PBS-t kaptak /0,5 mg BSA/ml BPS puffer7·

Motoros neuronokbán dús kultúrákat szérummentes, kémiailag definiált tápfolyadékban 2 napon át tenyésztettünk és meghatároztuk a kolin-acetiltranszferáz aktivitást /cpm/h/vályat + S.E.IvI.7· A tenyésztés kezdetén 10 pg/ml - 100 ng/ml koncentrációjú ΝΤ-3-at adutunk a kultúrákhoz.

A 8. fejezetben leírtak szerint megtisztított rekombináns BDNF dczis/hatás gó’rbéje a hátsógyöki ganglion /DRG/ tenyészet biológiai próbájában.

Faciális motoneuronok morfológiája 7 napos patkányok agytörzsében, a születés után végzett egyoldali arcideg-irtás után, a/ sérült oldal BDNF kezelés után; b/ sérült oldal NT-3 kezelés után; c/ sérült oldal NGF kezelés után; d/ sérült oldal BSA kezelés után /kontroll/; az a/ pont szerint kezelt ugyanazon állat nem károsított ellentétes oldala / az a/ kontrollja_7; f/ károsítás és GNTF kezelés után /kontroll/. Nagyítás: x400 • 4 • 4 · * «· •444 44· • 444444 444

4· · 4444

5. A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

A találmány világossá tétele céljából - hatókörének korlátozása nélkül - a találmány részletes leírását a következő alfejezetekre tagoljuk:

/i/ a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád találmány szerint alkalmazható tagjai;

/ii/ gyógyászati alkalmazások;

/iii/ in vitro alkalmazások;

/iv/ diagnosztikai alkalmazások;

/v/ kimutatási rendszerek; és /vi/ állati modellek.

5.1. A BDNF/NT-3/NGF MOLEKULACSALÁD TALÁLMÁNY SZERINT

HASZNÁLHATÓ TAGJAI

Kitűnt, hogy mozgató neuron-tenyészetekben a

BDNF vagy NT-3 fokozza a kolin-acetiltranszferáz aktivitást, ami arra enged következtetni, hogy a neurotrofin-család egyes tagjai a motoros neuronok túlélésének, növekedésének és/vagy differenciálódásának serkentésére használhatók /lásd az alábbi

6. és 7. fejezetet/. E neurotrofinoknak a mozgató neuronokra gyakorolt közvetlen hatását az a megfigyelés támasztja alá, hogy a BDNl·' és NT-3 retrográd transzport által jut el a ventrális gerincvelőhöz, a motoros neuronok helyéhez /lásd az alábbi 9. fejezetet/.

A találmány szerint módszereket dolgoztunk ki a • · · · · · ·· · · ·« · • ···«·« ·· · •· · ·· ·· motoros neuronok túlélésének, növekedésének és/vagy differenciálódásának előmozdítására, melyeknél a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagjait alkalmazzuk.

A találmány előnyös kivitelezésénél a BDNF/NT-3/NGF család azon tagjait használjuk, amelyek a mozgató neuronokbán fokozzák a kolin-acetiltranszferáz aktivitást, kezeletlen neuronokkal összehasonlítva.

A találmány legelőnyösebb kivitelezésénél - az

1991. március 21-én WO 91/03568 számon közzétett PCT nemzetközi bejelentés és az 1991. március 21-én WO 91/03569 számon közzétett PCT bejelentés leírása szerint - a BDNF vagy NT-3 mozgató neuronok túlélésének és/vagy differenciálódásának elősegítésére alkalmazható. Amint az alábbi 6. és 7. fejezetből kitűnik, a BDNF vagy NT-3 motoros neuron-tenyészetben a kolin-acetiltranszferáz aktivitás serkentésére használható. Ezenfelül a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád más tagjai - amelyek a WO 91/03568 és WO 91/03569 számú PCT bejelentések alapján azonosíthatók a találmány szerint szintén használhatók, amennyiben képesek a motoros neuronok növekedésének és/vagy differenciálódásának előmozdítására. Használhatók továbbá szintetikus molekulák is, amelyek primer szerkezetükben eltérnek a BDNF/NT-3/NGF család bármely ismert tagjától és elősegítik a mozgató neuronok növekedését és/vagy differenciálódását. Minthogy a BDNF és NT-3 hatásosabban fokozza motoros neuronokbán a kolin-acetiltranszferáz aktivitást, mint az NGF, kívánatos lehet, hogy a fenti ···· • · · ♦ · · ·· · · ·· · • ······ · · · • · · · · · ·

- 13 szintetikus molekulák jobban hasonlítsanak a NDNF-hez és ΝΤ-3-hoz, mint az NGF-hez.

A BDNF/NT-3/NGF család találmány szerint használható tagjai a szakirodalomból ismert eljárásokkal állíthatók elő. Természetes szövetekből tisztítással kinyerhetők, kémiailag szintetizálhatok, vagy rekombináns DNS-t kifejező rendszerekben, mint prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerekben, például a COS sejtrendszerben hozhatók létre. E molekulák előállítására alkalmas módszerek közé tartoznak a WO 91/03568 és WO 91/03569 közzétételi számú PCT bejelentésekben leírtak.

A találmány egy előnyös kivitelezésénél a BDNF-et vagy ΝΤ-3-at eukarióta sejtek-kondicionálta médiumból /például BDNF-fel transzfektált kinaihörcsög ováriumsejtekből /CHO// izoláljuk kationcseréből és gélszüréses kromatográfiából álló kétlépcsős eljárás segítségével. Példaként BDNF-nél maradva, a BDNF-et kifejező CHO sejtekkel beoltott, Opticell bioreaktorról /Charles River/ összegyűjtött kondicionált médiumot desztillált vízzel 1,25 : 1 arányban hígítjuk és folyamatosan S-Sepharose Fást Flow /Pharmacia/ oszlopra visszük fel. Például 10,6 liter /hígított/ össztérfogatot mintegy 5 napos időszak alatt viszünk fel egy 15 ml-es /1,6 cm belső átmérő/ oszlopra. Az oszlopot 50 ml 20 mM MES pufferrel /pH 5,8/, majd 250 mM NaCl-ot tartalmazó azonos pufferrel, végül NaCl nélküli MES pufferrel addig mossuk, amíg a 280 nm-en ** ♦ mért abszorbancia eléri az alapszintet. Ezután az oszlopot 25 ml bicin-pufferrel /N,N-bisz/5-hidroxi-etil/-glicin, pH 8,5/, majd 10 mM NaCl-ot tartalmazó azonos pufferei mossuk. Az oszlopot ezután 20 mM bicin-pufferrel /pH 8,5/ készült 10 mM - 750 mM NaCl-gradienssel /150 ml/ eluáljuk. Az átfolyási sebesség mintegy 2,6 ml/min. Az eluátum abszor’oanciája 280 nm-en követhető 0,2 abszorbanciaegység érzékenységgel. A rekombináns BDNF-et tartalmazó frakciókat a hátsógyöki ganglion /DRG/ tenyészet biológiai próbájában azonosítjuk. A legmagasabb fajlagos aktivitást mutató frakciók várhatóan az 500 - 750 mM NaCl koncentrációnak felelnek meg. E frakciókat egyesitjük és nagynyomású membrán ultraszüréssel töményitjük 3 kDa Omega tipusu membránt vagy olyan egyenértékű membránt használva, melyen a BDNF aspecifikus megkötó'dése csak kis mértékű. A besűrített mintákat ezután például egy 120 ml-es /1,6 cm belső átmérő/ Sephacryl S-100HR gélszürő oszlopra /Pharmacia/ tápláljuk. Az oszlopot 400 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM HEPES pufferrel /pH 7,6/ hozzuk egyensúlyba, majd 0,25 ml/min sebességgel eluáljuk. A frakciókat összegyűjtjük és a DRG biológiai próba segítségével meghatározzuk BDNF aktivitásukat. Várhatóan a 80 és 90 ml közötti frakciók tartalmaznak bioaktiv rekombináns, agyból származó növekedési faktort. E frakciókat egyesitjük és redukciós nátrium-dodecil-szulfát /SDS/ - poliakrilamid gél-elektroforézissel, N-terminális szekvencia-elemzéssel és mennyiségi aminosav-analizissel vizs*»♦ · • · · »4 • · * · ♦ · •· · · » β « * «····· » · · • · · · · · ·

- 15 géljük. Ha szükséges, a térfogatokat módosítjuk.

A BDNF/NT-3/NGF molekulacsaládba azok a molekulák tartoznak, amelyekben a gének egy a BDNF-ben, ΝΤ-3-ban és NGFben közös, homológ szakaszt kódolnak. A BDNF/NT-3/NGF család találmány szerint használható tagjait biológiai aktivitásuk, azaz a mozgató neuronok túlélését vagy differenciálódását serkentő képességük tesztelése alapján választjuk ki. A találmány szerint például a BDNF/NT-3/NGF család azon tagjai használhatók, amelyek a következő hatások valamelyikét fejtik ki:

/i/ motoros neuronok túlélési idejének meghosszabbodása tenyészetekben;

/ii/ motoros neuronok fokozott elágazódása tenyészetben vagy in vivő;

/iii/ motoros neuronokkal társuló molekulák, például kolin-acetiltranszferáz vagy acetilkolin-észteráz fokozott képződése tenyészetben vagy in vivő /lásd az alábbi 6. és 7. fejezet példáit a mérési technikákra/; vagy /iv/ motoros neuronok zavart működésére utaló tünetek in vivő csökkenése.

Az ilyen hatások az irodalomból ismert módszerekkel mutathatók ki. Előnyös kivitelezéseknél a mozgató neuronok fokozott túlélése mérhető Arakawa és munkatársai /J. Neurosci. 10, 3507-3515 /1990// módszerével; a motoros neuronok fokozott képződése mutatható ki Pestronk és munkatársai /Exp. Neurol. 70, 65-82 /1980// vagy Brown és munkatársai /Ann. Rév. Neurosci.

Λ · 4 *·♦· *« • · * · · · ·· * Ó ♦< · * * · · ·· · «· ··

- 16 £, 17-42 /1981// eljárásával; a motoros neuronokkal társuló molekulák fokozott képződése mérhető biológiai próbával, enzimes vizsgálattal, ellenanyag-kötéssel, Northern-hibridizációval, stb., függően a meghatározandó molekulától; és a motoros neuronok diszfunkciója, mint például gyengeség, a mozgató neuron ingervezetési sebessége vagy müködésbeli képtelenség a motoros neuron-betegség fizikai megnyilvánulásának megállapítása utján mérhető.

A találmány szerinti kivitelezésen kívül a találmány szerinti BDNF/NT-3/NGF család tagjai egy második hatóanyaggal kombinálhatok a mozgató neuron túlélésének és/vagy differenciálódásának elősegítése céljából. Kívánatosán a második hatóanyag is hatásosan serkenti a motoros neuronok túlélését és/vagy differenciálódását. A találmány előnyös kivitelezésénél például a BDNF/NT-3/NGF család tagjai CNTF-fel kombinálhatok a motoros neuron túlélése és/vagy differenciálódása előmozdítása céljából. Az alábbi 6. fejezetben megbeszéltek szerint megfigyeltük, hogy a CNTF-fel kombinált BDNF legalább is additív hatást gyakorol a mozgató neuron CAT aktivitására .

5.2. TERÁPIÁS ALKALMAZÁSOK

A találmány szerint eljárást dolgoztunk ki motoros neuron-betegségek kezelésére, melynek során a kezelésre szoruló betegnek a BDNF/NT-3/ÜGF molekulacsalád tagját képező és a

- 17 mozgató neuronok túlélését, növekedését vagy differenciálódását elősegítő neurotrofikus faktor hatásos mennyiségét adjuk be.

A leírásban használt motoros neuron-betegség” megjelölés olyan állapotokra vonatkozik, amelyek zavarják a mozgató neuronok normális működését. Az ilyen betegségek specifikusan vagy aspecifikusan, vagy éppen szelektíven támadják meg a mozgató neuronokat. A találmány szerint kezelhető motoros neuron-betegségek közé tartozik például az infarktus, fertőzés, toxinhatás, trauma, sebészeti beavatkozás, degenerativ betegség vagy daganatos betegség, amelyek befolyásolhatja t ják a mozgató neuronok'és az idegrendszer más komponenseit. A találmány szerinti módszerekkel a neuronokat szelektíven megtámadó betegségek, mint miatrófiás lateralsclerosis, és például előrehaladó gerincizom-sorvadás, előrehaladó nyultvelőgyulladás, primer lateralsclerosis, csecsemőkori és ifjúkori izomsorvadás, gyermekkori progresszív nyultvelőgyulladás /Fazio-Londe szindróma/, poliomyelitis és post-polio szindróma, és örökletes szenzomotoros neuropátia /Charcot-MarieTooth-betegség/ kezelhetők.

A BDNF/NT-3/NGF család találmány szerint használható tagjait az alábbi 5.1. fejezetben ismertetjük. A hatásos dózisokat ismert eljárások segítségével határozzuk meg. A hatásos dózisokat és az esetleges toxikus dózisokat /á BDNF/NT3/NGF család ismert tagjainak toxikus hatását eddig nem mutatták ki/ előnyösen in vitro határozzuk meg az optimális dózis.··.:

·· 4 <

* · 4··· • · <

tartomány megállapítása céljából /lásd az alábbi 5.3. fejezetet/.

A találmány különböző sajátos kivitelezéseinél a BDNF/NT-3/NGF család neurotrofikus faktorai legalább egy másik hatóanyag hatásos, mennyiségével együtt alkalmazhatók, mely utóbbi anyag maga is képes a mozgató neuronok túlélésének, növekedésének vagy differenciálódásának elősegítésére. Például a BDNF/NT-3/NGF család tagjai CNTF-fel együtt alkalmazhatók. A találmány egy előnyös, sajátos kivitelezésénél a BDNF-et és a CNTF-et együtt alkalmazzuk motoros neuronbetegségek kezelésére.

Ami a BDNF/NT-3/NGF család tagjait illeti, a találmány magában foglalja a BDNF/NT-3/NGF családba tartozó neurotrofikus molekulák töredékeinek, származékainak, agonistáinak vagy antagonistáinak használatát is.

A találmány szerinti neurotrofikus faktor/ok/ bármely farmakológiailag elfogadható hordozóanyagban alkalmazhatók. Bármilyen ismert adagolási mód alkalmazható, beleértve például az intravénás, intratekális, szubkután utat, az érintett szövetbe történő befecskendezést, intraarteriális, intranazális, orális alkalmazást, vagy beültetett eszköz használatát. A találmány szerint gyógyszer-készítményeket állítunk elő, amelyek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagban a BDNF/NT-3/NGF család tagját, mint BDNF-et vagy ΝΤ-3-at tartalmaznak CNTF-fel együtt.

·· 1 ·· ···· ♦· 4 4 44 • ·«·· · ·· ·

Alkalmazás után a találmány szerinti neurotrofikus faktor/ok/ a testben, vagy egy adott területen oszlanak szét. Például az idegrendszer távoli részeit érintő egyes betegségeknél kívánatos lehet a neurotrofikus faktort intravénásán vagy intratekálisan alkalmazni. Ha viszont az idegrendszer lokalizált régiói érintettek, mint trauma vagy eebészeti beavatkozás okozta mozgató neuron-betegségeknél, a helyi alkalmazás előnyös. Ilyen esetekben neurotrofikus faktort tartalmazó implantátumot helyezünk a károsodott területbe vagy annak közelébe. Alkalmas beültethető anyag például a gélhab, viasz, vagy mikrorészecske-alapu implantátumok.

5.3. IN VITRO ALKALMAZÁSOK

A találmány szerint eljárást dolgoztunk ki mozgató neuronok túlélésének, növekedésének és/vagy differenciálódásának előmozdítására, mely szerint a mozgató neuronokhoz a BDNF/NT-3/NGF molekulacsaládhoz tartozó neurotrofikus faktor hatásos koncentrációját adjuk hozzá. Ez az eljárás in vivő /lásd fent/ vagy in vitro hajtható végre. Előnyös kivitelezésnél a BDNF/NT-3/NGF család tagjai közül a BDNF-et vagy ΝΤ-3-iat alkalmazzuk.

In vitro körülmények között a neurotrofikus faktor hatásos mennyiségét célszerűen esetről esetre határozzuk meg, minthogy a különböző szöveti forrásokból vagy különböző fajokból származó motoneuronok érzékenysége a neurotrofikus faktor • · · **· ···· * 9 t · t « ·· · · 99 9

9 9999 · 9 · 9

9 99 99 iránt eltérő lehet. Egy adott tenyészetnél kívánatos megszerkeszteni a dózis/hatás görbét, amely a neurotrofikus faktor koncentrációjának és a motoros neuron reagálásának összefüggését mutatja. A motoros neuron túlélésének, növekedésének és/vagy differenciálódásának értékeléséhez hasznos lehet a BDNF/NT-3/NGF család tagját képező neurotrofikus faktornak kitett mozgató neuronokat az ilyen faktoroknak ki nem tett motoros neuronokkal összehasonlítani, például vitális festéket használva és élő sejtek kimutatására, fázis-kontraszt mikroszkópot és/vagy idegszál-festést a neurit-elágazódás mérésére, vagy eljárásokat a motoneuronokkal társuló vegyületek, mint kolin-acetiltranszferáz /CAT/ bioaktivitásának meghatározására. A CAT aktivitás mérése céljából például a kezelt és kezeletlen neuronokat összegyűjtjük és 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó 20 mM Tris-HCl oldatban /pH 8,6/ lizáljuk, a feloldott anyagból néhány mikroliter alikvotot kiveszünk és a mikro-Fonnum eljárás segítségével /J. Neurochem. 24. 407-409 /1975// /lásd az alábbi 7.1.5. fejezetet is/ meghatározzuk a minta CAT aktivitását, szubsztrátként 0,2 ml /I-¹^C7acetil-CoA-t, 300 mM NaCl-ot, 8 mlvl kolin-bromidot, 20 mM EDTA-t és 0,1 mM neosztigmint használva 50 mM NaHg pufferben /pH 7,4/.

A találmány egy sajátos kiviteli formájánál motoros neuronokat preparálunk és in vitro tenyésztünk, az alábbiak szerint. A gerincvelő legalább egy részét - melyet előnyösen patkány-embrióból nyerünk - aszeptikus körülmények között • · · ·« ···· w · · · » · ·· · <9 ··« • » ···« · ·« · ·· · ···4

- 21 eltávolítjuk és elválasztjuk a nyultagytól, a szenzoros ganglionoktól és a megtapadó meninxektől. Ezután a gerincvelő ventrális szegmensei izolálhatok, minthogy a mozgató neuronok a gerincvelő ventrális /elülső/ szarvában lokalizálódnak. A ventrális gerincvelő-szegmenseket ezután kis darabokra aprítjuk fel és mintegy 1% tripszint és 0,01% 1 tipusu dezoxiribonukleázt tartalmazó, kalcium- és magnéziummentes foszfátpufferes sóoldatban /PBS/ 37°C-on 20 percen át inkubáljuk. A tripszines oldatot ezután eltávolítjuk, a sejteket mossuk és 45% Eagle»s Minimum Essential Médiumból /MÉM/, 45% Ham»s Nutrient Mixture Ρ-12-ből, hővel inaktivált 5% fötális borjúsavóból, hővel inaktivált 5% lósavóból, glutaminból /2 mM/, penicillin G-ből /0,5 E per ml/ és streptomicinből /0,5 ug per ml/ álló friss tápközegbe helyezzük. A szövetet ezután mechanikusan disszociáljuk Pasteur-pipettával történő óvatos triturálás utján, a felüluszókat egyesitjük és nylon-szűrőn /például Nitex, Tetko; 40 um/ átszűrjük. A szűrt sejtszuszpenziót ezután frakciónáljuk Schnaar és Schaffner /<J. Neurosci.

1, 204-217 /1981// módosított eljárása szerint. Minden műveletet 4°C-on hajtunk végre. Metrizamidot F12:MEM médiumban /1:1/ oldunk és 18% metrizamid-rétegből /pl. 0,5 ml/; 3 ml 17% metrizamidból; 3 ml 12% metrizamidból és 3 ml 8% metrizamidból álló lépcsős gradienst állítunk elő. Az átszűrt sejtszuszpenziót /pl. 2,5 ml/ a szakaszos gradiensre rétegezzük és a csövet 2500 g-vel mintegy 15 percen át centrifugáljuk kilendülő fejes • · • · ·

- 22 /swing-out/ rotort használva /például Sorvall HB4/. Centrifugálás után három sejtréteget kapunk: az I. frakciót /a 0-8% határfelületen/, a II. frakciót /a 8-12% határfelületen/ és a III. frakciót /a 12-17% határfelületen/. A 0-8% határfelületen elhelyezkedő, mot.oros neuronokbán dús I. frakcióból kis térfogatot /kb. 1 ml/ kiveszünk és kétszer szérummentes, definiált médiummal, mint glutaminnal /2 mM/, inzulinnal /5 ug per ml/, transzferrinnel /100 ug per ml/, progeszteronnal /20 nM/, putreszcinnel /100 uM/ és nátrium-szlelenittel /30 nM/ kiegészített 50% F12-ből és 50% MEM-ből álló médiummal mossuk /lásd Bottenstein és Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76. 514-517 /1979//. Az élő sejtek számát hemocitométerben határozzuk meg tripánkék festés után. A motoros neuronokbán feldúsult sejtszuszpenziót ezután szövettenyésztő mikrotitráló lemezekben /előnyösen 6 mm/ növesztjük /kb. 100 000 sejt per cm /, melyeket előzőleg poli-L-ornitinnel /pl. 10 ug per ml/ és lamininnal /pl. 10 ug per ml/ vontunk be,. Ezután hozzáadjuk a neurotrofikus faktorokat. Egy sajátos kiviteli formánál például annyi BDNF-et alkalmazunk, hogy mintegy 0,01 - 100 mg/ml, előnyösen körülbelül 50 ng/ml végkoncentrációt érjünk el, vagy a fentebb megadott BDNF koncentrációkat 1 ng/ml, előnyösen 10 ng/ml koncentrációjú CNTF-fel együtt adjuk a lemezekhez. A mozgató neurontenyészeteket ezután szérummentes, definiált tápközegben tartjuk 37°C-on, 95% levegő/5% szén-dioxid atmoszférában, közel 100% relatív páratartalomnál.

• · ·

5.4. DIAGNOSZTKIA ALKALMAZÁSOK

A találmány szerint eljárást is kidolgoztunk betegek mozgató neuron-betegségeinek diagnosztizálására, mely szerint a betegből és egy egészséges egyénből származó mintában összehasonlítjuk a BDNF/NT-3/NGF családba tartozó neurotrofikus faktor szintjét és ezáltal megállapítjuk a beteg neurotrofikus faktor szintjének rendellenességét, amely pozitív korrelációt mutat a motoros neuron-betegség fennállásával. Az igy diagnosztizálható mozgató neuron-betegségek közé tartoznak például a fenti 5.2. fejezetben felsoroltak.

A neurotrofikus faktor-szint bármely ismert módszerrel meghatározható, igy például enzimhez kötött immunoadszorbens szendvics” próbával vagy anti-neurotrofikus faktor ellenanyagot alkalmazó bármely más eljárással, beleértve a Western-hibridizációt és in situ hibridizációt, biaktiv vizsgálatokat, Northern-hibridizációt és másokat.

A betegből vett minta bármely alkalmas szövetből vagy folyadékból származhat, igy például ideg- vagy agyszövetből, agy-gerincvelői folyadékból vagy vérből.

A neurotrofikus faktor szintjének rendellenessége a normális kontroll és a beteg neurotrofikus faktor-szintje közötti, statisztikusan szignifikáns különbségként határozható meg. A rendellenes szint a normál szinthez képest növekedhet vagy csökkenhet, és/vagy a rendellenesség a beteg egész szervezetére, vagy csak egy lokalizált területre terjed ki. A » ·

- 24 csökkent neurotrofikus szintet mutató betegek számára különösen előnyös a faktor alkalmazása /lásd a fenti 5.2. fejezetet/.

A neurotrofikus faktor csökkenését mutató betegnél esetleg abnormális faktor fejeződik ki, vagy a faktor receptorainak tényleges száma kicsi. A kisebb számú vagy abnormális faktorreceptorokkal rendelkező betegeket olymódon azonosítjuk, hogy e betegek sejtjeiben teszteljük a normális neurotrofikus faktor-receptorokat. Ebből a célból például összehasolitjuk az ilyen sejtek jelölt neurotrofikus faktort megkötő képességét a normális sejtek kötőképességével. Kevesebb, vagy abnormális receptorral rendelkező betegek számára a kiegészítő neurotrofikus faktor terápia előnyös lehet vagy nem; számukra különös előnyt jelenthet a neurotrofikus faktor-agonista analógokkal történő kezelés.

Ezenfelül a felfedezés, hogy a BDNF-et vagy ΝΤ-3-at retrográd utón transzportálják a mozgató neuronok, alapját képezi a BDNF- vagy ΝΤ-3-függő motoros neuron-betegségek diagnosztikai eljárásának. Eszerint kimutatható, jelölt BDNF-et vagy ΝΤ-3-at fecskendezünk be, hogy a jelölt BDNF bejusson a mozgató idegbe, és meghatározzuk, hogy a jelölt BDNF vagy NT-3 retrográd módon transzportálódik-e, minthogy a retrográd transzport elégtelensége korrelációban van a motoros neuronok rendellenes működésével. E módszer például izomsorvadásos lateralsclerosis, előrehaladó gerincizom-sorvadás, poliomyelitis, post-polio szindróma, Charcot-Marie-Tooth-szindróma, ideg- 25 sérülés vagy károsodás kórisméjére használható.

5.5. VIZSGÁLATI RENDSZEREK

A találmány szerint kimutatási rendszereket fejlesztettünk ki, amelyek motoros neuron-betegségek azonosítására használhatók. E meghatározási rendszerek segítségével megállapítható, hogy a tesztanyag blokkolni tudja-e a BDNF vagy NT-3 kötődését a mozgató neuronokhoz. így a találmány szerint eljárást dolgoztunk ki tesztanyagoknak a motoros neuronok túlélését, növekedését vagy differenciálódását elősegítő képességének meghatározására, mely szerint a tenyésztett mozgató neuronokat kimutatható, jelölt BDNF vagy NT-3 /vagy a BDNF/NT-3/NGF család más alkalmas tagja7 hatásának tesszük ki olyan körülmények között, amikor a jelzett BDNF vagy NT-3 a motoros neuronokhoz tudkötődni. Ezzel egyidőben a motoros neuronokat egy tesztanyag hatásának tesszük ki; ha a fenti körülmények között a tesztvegyület gátolja a jelzett BDNF vagy NT-3 kötődését, úgy a tesztanyag motoros neuron-betegségek kezelésére használható. Az ilyen kísérleti rendszerben pozitívan értékelt tesztanyagnak a mozgató neuron-kultura túlélését, növekedését vagy differenciálódását elősegítő képességét azután in vitro vagy in vivő célszerűen tovább vizsgáljuk. A negatívan értékelt tesztanyag egyes esetekben a BDNF vagy ΝΤ-3-szerü aktivitás antagonistája lehet.

A BDNF vagy NT-3 kimutathatóan jelölhető ismert módszerekkel, beleértve a radioaktív izotóppal jelölt aminosavak beépülését, továbbá a neurotrofikus faktor molekulához kimutatható toldalék hozzáadását. Az ilyen toldalék fluoreszcens lehet, enzimaktivitással rendelkezhet, neurotrofikus faktorhoz kötődő ellenanyag lehet, vagy antitesthe kötődő antigén lehet /például a myc-antigén része, amely kötődni tud az anti-myc ellenanyaghoz/.

A találmány szerint használható tesztanyagok közé tartoznak többek között a BDNF/NT-3/NGF család neurotrofikus faktorai, vagy ezek fragmentumai vagy származékai, egyéb peptidvegyületek, peptidszármazékok és nem peptidvegyületek.

A találmány egy specifikus, nem korlátozó, példaként megadott kivitelezésénél radioaktív izotóppal jelölt BDNF-et a nem jelölt tesztanyaggal együtt tenyészetben inkubálunk a motoros neuronokkal, BDNF-kötődéshez alkalmas körülmények között. Kontrollként hasonló motoros neuron-tenyészetet izotóppal jelölt BDNF-fel inkubálunk tesztanyag távoDétében. Ha a tesztanyag a BDNF-receptorokhoz képes kötődni, kompetitiven gátolja a jelölt BDNF megkötődését. Ha a sejteket ezután a meg nem kötött BDNF eltávolítása céljából mossuk, a tesztanyagot tartalmazó tenyészet radioaktivitása várhatóan kisebb lesz a kontroll tenyézeténél.

5.6. ÁLLATI MODELLRENDSZER

A találmány szerint a motoros neuron-betegségek modellezésére olyan állatrendszert találtunk, ahol a BDNF vagy NT-3 szisztémásán vagy generalizáltan kiürült. A BDNF vagy NT-3 generalizált kiürülése olyan állatokkal érhető el, melyekben ellenanyag fejeződik ki a BDNF vagy NT-3 ellen; ilyen állatok nyerése céljából az állatot más fajból származó, vagy kémiai módosítás utján immunogénebbé vált BDNF-fel vagy ΝΤ-3-mal immunizáljuk. Helyi kiürülés érhető el anti-BDNF vagy anti-NT-3 ellenanyag lokális bevitelével, például a gyrus precentralis közelébe beültetett hibridoma segítségével. Ezenfelül transzgén állatok nyerhetők, melyekben az endogén BDNF vagy NT-3 gént homológ rekombinációval kiütöttük”.

6. PÉLDA: BDNF ÁLTAL FOKOZOTT KOLINACETILTRANSZFERÁZ AKTIVITÁS A VENTRÁLIS GERINCVELŐ MOTOROS NEURON-TENYÉSZETEIBEN

6.1. ANYAG ÉS MÓDSZER

6.1.1. KÍSÉRLETI ÁLLATOK

Sprague-Dawley patkányok /HSD vagy Zivic Miller/ embrióit /E14/ használjuk a kísérletekben. Terhes patkányokat szén-dioxid fulladás utján megölünk, az embriókat gyorsan eltávolítjuk és a további boncolásig jéghideg közegbe helyezzük.

·· * ·· »··« • · « 4 · · • ······ ·· · • · · «« · ·

6.1.2. SZÖVETTENYÉSZTŐ TECHNIKÁK

A gerincvelőket fertőzmentesen eltávolítjuk az embriókból a terhesség 14. napján. A gerincvelőt a nyultagyhoz képest kaudálisan elvágjuk /az első háti gyök gangionjának szintjén/, megszabadítjuk a szenzoros gangionoktól és a hozzátapadó meninxektől. A gerincvelő ventrális és hátközépi szegmenseit egymástól elválasztjuk külön kultúrák előállítása céljából. A ventrális gerincvelő-szöveteket kis darabkákra vágjuk szét és kalcium-magnézium-mentes foszfátpufferes sóoldattal /PBS/ készült, 1,1% tripszint /Gibco/ és 0,01% 1 típusú dezoriribonukleázt tartalmazó oldatban 37°C-on 20 percen át inkubáljuk. A tripszines oldatot leszívjuk, a sejteket mossuk és 45% Eagles’s Minimum Essential Médiumból /MÉM/ és 45% Ham’s Nutrient Mixture F-12-ből, hővel inaktivált 5% fötális borjusavóból, hővel inaktivált 5% lósavóból, glutaminból /2 mM/, penicillin G-ből /0,5 E per ml/ és streptomicinből /0,5 ug per ml/ álló friss tápoldatba helyezzük. A szövetet ezután mechanikusan disszociáljuk Pasteur-pipettával történő óvatos triturálás utján, a felüluszókat egyesitjük és nylonszűrőn /pl. Nitex, Tetko; 40 um/ átszűrjük. A szűrt sejtszuszpenziót ezután a fenti 6.1.3. fejezetben leírtak szerint frakciónáljuk.

• · « · · · ·· · · «· · • ····*· ·· · • · · ·« ·«

6.1.3. VENTRÁLIS GERINCVELŐ-SEJTEK FRAKCIONÁLÁSA METRIZAMID SŰRŰSÉG-GRADIENSSEL

E frakcionálási rendszer Schnaar és Schaffner /J. Neurosci. 1, 204-217 /1981// eljárásának módosítása.

Minden műveletet 4°C-on hajtunk végre. Metrizamidot F12:MEM /1:1/ közegben oldunk és 18% metrizamid-rétégből, 3 ml 17% metrizamidból, 3 ml 12% metrizamidból és 3 ml 8% metrizamidból álló szakaszos gradienst állítunk elő. A gerincagy-sejtek átszűrt szuszpenzióját /2,5 ml/ a fenti lépcsős gradiensre rété gézzük és a csövet 2500 g-vel mintegy 15 percen át centrifugáljuk kilendülő fejes rotort használva /pl. Sorvall HB4/. Centrifugálás után 3 sejtréteget kapunk: az I. frakciót /a 0-8% határfelületen/, a II. frakciót /a 8-12% határfelületen/ és a III. frakciót /a 12-17% határfelületen/. A 0-8% határfelületen elhelyezkedő, motoros neuronokbán dús frakcióból kis térfogatot /mintegy 1 ml/ kiveszünk, kétszer szérummentes, definiált médiumban, mint glutaminnal /2 mM/, inzulinnal /5 ug per ml/, transzferrinnel /100 ug per ml/, progeszteronnal /20 nM/ putreszcinnel /100 uM/ és nátrium-szelenittel /30 nM/ kiegészített 50% F12-ből és 50% MEM-ből álló tápközeggel mossuk /lásd Bottenstein és Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 514-517 /1979//. Az élő sejtek számát hemocitométerben határozzuk meg tripánkékfestés után. Az I. frakció motoros neuronokbán dús sejtszuszpenzióját ezután poli-L-ornitinnel /Sigma; 10 ug per ml/ és lamininnal /Gibco; 10 ug per ml/ bevont 6 mm mélyedé-

- 30 2 sekben 100 000 sejt/cm sűrűséggel tenyésztjük. A növekedési faktorokkal /CNTF és BDNF/ történő kezelést a tenyésztés napján hajtjuk végre. A kultúrákat szérummentes, definiált médiumban tartjuk 37°C-on, 95% levegő/5% C0£ atmoszférában, közel 100% relatív páratartalomnál. A 2. napon /40 h/ a sejteket összegyűjtjük a kolin-acetiltranszferáz aktivitás /CAT; Fonnum, J. Neurochem. 24, 407-409 /1975// meghatározása céljából /lásd az alábbi 7.1.5. fejezetet/.

6.1.4. AGY-EREDETŰ NEUROTROFIKUS FAKTOR /BDNF/

BDNF-et CHO-sejtekben hozunk létre és CHO-sejtkondicionálta médiumból homogenitásig tisztítjuk, ezüsttel megfestett poliakrilamid gélek és az aminosav-sorrend elemzése alapján meghatározva /lásd az alábbi 8. fejezetet/.

6.1.5. CILIÁRIS NEUROTROFIKUS FAKTOR /CNTF/

A kísérletekben használt CNTF Escherichia coliban kifejeződő rekombináns patkány CNTF, melyet Masiakowski és munkatársai szerint tisztítunk meg /WO 91/04316 nemzetközi közzétételi szám/.

6.1.6. EGYÉB FAKTOROK

A kísérletekben használt NGF-et /2.5S/ egér nyálmirigyekből izoláljuk és tisztítjuk Ivíobley és munkatársai eljárása szerint /Biochemistry 15, 5543-5551 /1976//. A bázikus • · « · 4· • 4 4 · 444 • ****** *4·

- 31 FGF-et a Collaborative Research-től kaptuk.

6.2. EREDMÉNYEK

6.2.1. BDNF HATÁSA A KOLIN-ACETILTRANSZ-

FERÁZ AKTIVITÁSÁRA

A motoros neuronokbán dús tenyészetek BDNF kezelése a CAT aktivitást 48 h múlva 4-5-szörösére növelte, összehasonlítva a kezeletlen kontrollokkal. A CAT aktivitás fokozódása a BDNF dózisától függ, maximális hatást mintegy 10 mg/ml dózis fejt ki, amint ezt az 1. ábra mutatja.

6.2.2. BDNF ÉS CNTF EGYÜTTES ADÁSÁNAK HATÁSA

A KÖLIN-ACETILTRANSZFERÁZ AKTIVITÁSRA

Minthogy kitűnt, hogy a ciliáris neurotrofikus faktor /CNTF/ in vitro előmozdítja a patkány motoros neuronjai túlélését /Wong és munkatársai, Soc. Neurosci. Abst. 1990/, meg akartuk állapítani, hogy e két faktor /BDNF és CNTF/ CAT aktivitást fokozó hatása additiv-e. BDNF-fel /50 ng per ml/ és CNTF-fel /50 ng per ml/ /telítési koncentrációk/ való együttes kezelés tenyésztett mozgató neuronok CAT aktivitását az additív növekedésnél nagyobb mértékben fokozta /2. ábra/, ami arra enged következtetni, hogy e két faktor hatása szinergisztikus és szabályozásai útjaik különböznek. A BDNF és CNTF együttes alkalmazásakor elért megnagyobb hozzáadódó hatás mintegy 15-ször magasabb a kontroll szinteknél. NGF és bFGF «· · ·· ···« • · · * · · ·· ♦ · ·· · • ····«· ·· · ·· · ·« ·· nem befolyásolta jelentősen a CAT aktivitást, összehasonlítva a kontroll kultúrákkal /2B. ábra/.

A gerincvelő ventrális szarvában a motoros neuronok elfajulása és pusztulása a miatrófiás lateralsclerosis /ALS; Lou Gehrig-betegseg/, gerincagy károsodás és más mozgató neuron-betegségek patofiziológiai folyamatának fő vonása. Eredményeink arra utalnak, hogy a BDNF magában vagy CNTF-fel kombinálva e betegségek kezelésére használható a kolinerg kifejeződés fokozása utján.

7. PÉLDA: NT-3 KEZELÉS FOKOZTA A KOLINACETILTRANSZFERÁZ AKTIVITÁST A GERINCAGY MOZGATÓ NEURONJAI KULTÚRÁIBAN

7.1. ANYAG ÉS MÓDSZER

7.1.1. KÍSÉRLETI ÁLLATOK

Sprague-Dawley patkányok /HSD vagy Zivic-Miller/ embrióit /E14 stádium/ használjuk minden misérletben. A terhes patkányokat szén-dioxid fulladás utján megöljük, az embriókat gyorsan eltávolítjuk és további boncolásig jéghideg közegbe helyezzük.

7.1.2. SZÖVETTENYÉSZTÉSI TECHNIKÁK

A terhesség 14. napján a patkányembriók gerincagyát fertőzésmentes körülmények között eltávolítjuk és a fenti 6.1.2. fejezet szerint preparáljuk.

• · • · · · · * ·· ♦ · ·♦ · « ······ ·· · ·· · ·· ··

7.1.3. VENTRÁLIS GERINCAGY-SEJTEK FRAKCIO-

NÁLÁSA METRIZAMID SŰRŰSÉG-GRADIENSSEL

A frakcionálási sémát a fenti 6.1.3. fejezetben ismertettük, azzal az eltéréssel, hogy ezúttal a sejteket a tenyésztés napján NT-3-mal kezeljük. Amint a 3. ábra mutatja, az NT-3 kezelés a motoros neuronokbán a CAT aktivitást 3-4szeresére növeli a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva. A CAT aktivitás növekedése dózisfüggő, maximális válasz mintegy 1 ng/ml dózissal érhető el.

7.1.4. NEUR0TR0FIN-3 /NT-3/

ΝΤ-3-at CHO sejtekben hozunk létre és a CHO sejtek-kondicionálta médiumból homogenitásig tisztítjuk az alábbi 8. fejezetben a BDNF tisztítására leírtak szerint; a tisztaságot ezüsttel megfestett poliakrilamid gélek és arainosav-sorrend analízis utján állapítjuk meg.

7.1.5. KOLIN-ACETILTRANSZFERÁZ KIMUTATÁS

A tenyészeteket összegyűjtjük és a sejteket 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó 20 mM Tris-HCl pufferrel /pH 8,6/ lizáljuk. A sejtkivonatból kiveszünk 2 ul-t és a mikro-Fonnum eljárással /Fonnum, J. Neurochem. 24, 407-409 /1975// meghatározzuk CAT aktivitását. A végső szubsztrátkeverék 0,2 mM /I-^CZ-acetil-CoA-ból /NEN, 54,4 mCi per mmol/, 300 mM NaClból, 8 mM kolin-bromidból, 20 mM EDTA-ból és 50 mM NaHgPO^- 34 oldatban /pH 7,4/ oldott 0,1 mM neosztigminből áll. Ennél az enzim- és szubsztrát-koncentrációnál az enzimreakció 90-120 percen át kineáris. A CAT aktivitás fajlagosságát az aktivitást specifikusan gátló N-hidroxi-etil-4-/1-naftil-vinil/-piridinium /HNP/ hozzáadása utján ellenőrizzük /V/hite és Cavallito, J. Neurochem. 17, 1679-1589 /1970//.

7.2. EREDMÉNYEK

Mint fentebb megtárgyaltuk, a gerinagy ventrális szarvában a mozgató neuronok elfajulása és pusztulása az izomsorvadásos lateralsclerosis /ALS; Lou Gehrig-betegség/, gerincvelő károsodás és más mozgató neuron-betegségek jellegzetessége. Az ΝΤ-3-mal kezelt motoros neuronok fokozott CAT aktivitását mutató eredmények arra utalnak, hogy az NT-3 e betegségek kezelésére használható a kolinerg expresszió fokozása által.

8. PÉLDA: ELJÁRÁS REKOMBINÁNS AGY-EREDETÜ NÖVEKEDÉSI FAKTOR /BNDF/ TISZTÍTÁSÁRA kínai hörcsög ováriumsejtek-kondiconálta MÉDIUMBÓL

8.1. anyag és módszer

Rekombináns BDNF-et CHO-sejt kondicionálta médiumból izolálunk katiocseréből és gélszüréses kromatográfiából álló kétlépcsős eljárással.

BDNF-et kifejező CHO-sejtekkel beoltott, Opticell

«

- 35 bioreaktorról /Charles River/ összegyűjtött kondicionált médiumot desztillált vízzel 1,25 : 1 arányban hígítunk és folyamatosan, 4°C-on 15 ml /1,6 cm belső' átmérő/ S-Sepharose Fást Flow /Pharmacia/ oszlopra visszük fel 5 nap alatt. Az oszlopot 50 ml 20 mM MES pufferrel /4-morfolin-etánszulfonsav-oldat; pH 5,8 beállítása NaOH-dal/, majd 250 mM NaCl-ot tartalmazó azonos pufferrel, mégül NaCl nélküli MES pufferrel addig mossuk, amíg a 280 nm-en mért abszorbancia eléri az alapszintet. Ezután az oszlopot 25 ml 20 mM bicin-pufferrel /pH 8,5/, majd 100 mM NaCl-ot tartalmazó azonos pufferrel mossuk. Az oszlopot ezután 20 mM bicin-pufferrel /pH 8,5/ készült 100 mM - 750 mii NaCl-gradienssel /150 ml/ eluáljuk. Az átfolyási sebesség 2,5 ml/min. Az eluátum abszorbanciáját 280 nmen követjük /érzékenység: 0,2 AE max./. A rekombináns BDNF-et tartalmazó frakciókat a hátsógyöki ganglionok /DRG/ tenyészetének biológiai próbájában azonosítjuk. A legmagasabb fajlagos aktivitást mutató frakciók az 500 és 750 mM közötti NaCl-koncentrációnak felelnek meg. E frakciókat egyesitjük és nagynyomású membrán ultraszüréssel töményitjük 3 kDa Omega tipusu membránt használva. E membránt azon az alapon választottuk ki, hogy a BDNF-et nem-specifikusan csak kis mértékben köti meg.

A besűrített mintát ezután 120 ml /1,6 cm belső átmérő/ Sephacryl S-100HR gélszürő oszlopra /Pharmacia/ visszük fel. Az oszlopot 400 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mM HEPES-pufferrel /pH 7,6/ hozzuk egyensúlyba. Az oszlopot 0,25 ml/min sebesség• · * «· «·*« • · · · Λ · ·« * · »« * • ·····» ·· · • · · e · * ·

- 36 gél eluáljuk. 2 ml frakciókat szedünk és BDNF aktivitásukat a DRG biológiai próbában határozzuk meg. A 80 és 90 ml között eluált frakciók bioaktiv rekombináns BDNF-et tartalmaznak. E frakciókat egyesitjük és redukciós SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel, N-terminális szekvencia-elemzéssel és mennyiségi aminosav-analizissel vizsgáljuk. A gél elektroforézissel /18% poliakrilamid/ két, egymáshoz közel elhelyezkedő sáv mutatható ki, amelyek citokróm C-vel együtt futnak. Az N-terminális analízist és a mennyiségi aminosav-elemzést standard eljárásokkal hajtjuk végre.

Az N-terminális szekvencia-analízis azt mutatta, hogy az izolált anyag teljes hosszúságú BDNF-ből /mintegy 66%/ és csonka BDNF-ből áll, melyben hiányzik az első hat aminosavcsoport. A minta kvantitatív aminosav elemzése szerint az átlagos fehérjekoncentráció 0,043 mg/ml. Ennek az értéknek az alapján a tiszta bioaktiv BDNF végső hozama 0,430 mg. A DRG szövettenyésztenyésztő biológiai próbához féltelitésig mintegy 1,2 ng/ml anyag szükséges.

8.2. EREDMÉNYEK: BDNF MENNYISÉGI

AMINO SAV-ELEMZÉSE

A tisztított BDNF aminosav-elemzését Beckman 6300 aminosav analizátor segitéségével végezzük el. Az eredmények /1. táblázat/ azt mutatják, hogy a fehérje átlagos koncentrációja mintegy 0,043 mg/ml. A 4. ábra a BDNF-fel kapott • · · ·· « · ♦ · · • · ···* · * ·· · «· dózis/hatás görbét mutatja a hátsógyöki gangliontenyészet standard, biológiai próbájában.

I. táblázat

BDNF SZEKVENCIA-ELEMZÉSE

1. minta: Agy eredetű neurotrofikus faktor, frakció #= 23, BDNF /= 2, 100 ul, 20 mM HEPES és 400 mM Na Cl

A mintákat 75% acetonnal hütó'szekrényben /-20°C/ éjszakán át kicsapjuk. A fehérjecsapadékot percenkénti 13000 fordulattal 10 percig centrifugáljuk. A 70% trifluor-ecetsavban oldott protein aminosav-sorrendje az alábbi:

Ciklus	I. í	szekvencia	II.	szekvencia	Ref
1	His	17,5 pmol	Arg	18,6 pmol	His
2	Ser	14,1	Gly	8,5	Ser
3	Asp	26,2	Glu	8,8	Asp
4	Pro	25,0	Leu	10,8	Pro
5	Alá	36,0	Ser	12,3	Alá
6	Arg	54,6	Val	19,0	Arg
7	Arg	44,1			Arg
8	Oly	16,9	Asp	8,2	Gly
9	Glu	13,6			Glu
10	Leu	10,7			Leu
11	Ser	7,4			Ser
12	Val	15,7			Val
13					Cys
14	Asp	8,1			Asp
15	Ser	4,0			Ser
16	Ile	5,0			Ile

·♦ · ·· «··· • · · · · * ·· 9 · ·* · • ·&·«·· ♦ · · • · ♦ * · · f

I. táblázat /folytatás/

Becsült mennyiségek:

I. protein: 36,0 x 2,5 = 90,1 pmol /Ala-5/

II. protein: 19,0 x 2,5 = 47,7 pmol /Val-6/

I. preotein és II. protein aránya = 2,1

9. PÉLDA: ¹²⁵J-BDNF és ¹²⁵J-NT-3 RETROGRÁD

TRANSZPORTJA PATKÁNY VENTRÁLIS GERINCAGYÁHOZ

9.1. ANYAG ÉS MÓDSZER

9.1.1. NEUROTROFINOK

Kondicionált médiumból rekombináns BDNF-et és ΝΤ-3-at preparálunk a fenti 8. fejezetben leirt eljárást használva, a BDNF-et és ΝΤ-3-at radioaktív jóddal jelöljük /Yip és munkatársai, J. Neurosci. 2» 2172-2182 /1983//. A A laktoperoxidáz eljárással meghatározott fajlagos aktivitás 3000 - 7800 cpm/fmol. A szabad /nem kötött/ ^²^j-ot a transzportvizsgálatok előtt eltávolitottuk.

9.1.2. KÍSÉRLETI ÁLLATOK

Him Sprague-Dawley patkányokat /250-300 g/ ZivicMillertől kaptunk és ezeket használtuk a retrográd transzport vizsgálatokhoz.

·♦ · ··< ··♦:

- 39 9.1.3. RETROGRÁD TRANSZPORT VIZSGÁLATOK

A patkányokat klorál-hidrát /4%/ és nátrium-pentobarbitál /0,88%/ keverékével /3 ml per tskg/ elaltatjuk. A jobb ülőideget szabaddá tesszük és 10 másodpercen át összenyomjuk egy a musculus .obturator internus inához képest 0,4 cm-re disztálisan fekvő ponton. A roncsoló károsítás célja, hogy a BDNF számára maximális számú receptorhelyet tegyünk hozzáférhetővé. Az összenyomást követően 10 mg BSA/ml PBS pufferben levő ^^5j_BPNP-et vagy $J-NT-3-at /2 ul/, vagy

PBS/BSA pufferben levő jelöletlen BDNF-et, ΝΤ-3-at vagy NGF-et /100-szoros felesleg/ fecskendezünk be a károsított helyre. Összesen 16 mg BDNF-et és 14 ng ΝΤ-3-at fecskendezünk be x 10 ill. 2,2 x 10 cpm/. A sebeket összevarrjuk és a patkányokat 18 órán át regenerálódni hagyjuk. Ezután az állatokat megöljük és a gerincagy 4. és 5. lumbális szegmensét eltávolítjuk és szétvágjuk egy jobb /ugyanazon oldali/ és egy bal /ellenoldali/ ágra. A mintákat foszfát pufferes /pH 7,4/ 4% paraformaldehid-oldatba helyezzük és gamma-számlálóban meghatározzuk a percenkéni beütésszámot /cpm/. Az adatokat a jobb vagy baloldali gerincagy által transzportált J-neurotrofin fi attomóljaiban /10 mól/ fejezzük ki /+ S.S.M./.

9.2. EREDMÉNYEK

A II. táblázat azt mutatja, hogy BDIIF halmozódik fel a patkányok gerincagyában, miután a sérült ülőidegbe • V « • · · · · · • 9 9 9 ··· • · «··· · · ♦4 ·· 9 ····

- 40 *25j-BDNF-et fecskendeztünk be. Beütésszámot /300-400 cpm, ami mintegy 50 attomólnak felel meg/ regisztráltunk az injektált oldalon, mig az ellentétes oldalon csak a háttérhez közeli beütésszámot kaptunk. Az ellenoldalon felhalmozódó alacsony beütésszám eredete a szisztémás keringés okozta átszivárgás az injekció helyéről a kérdéses helyre. A gerincagyi transzport vizsgálatokban e háttér általában az injektált oldal beütésszámának 15-25%-a és ez a beütésszám viszonylag állandó marad a kísérlet folyamán. Mig a BDNF 100-szoros feleslege jelentősen blokkolja a transzportot, az NGF és NT-3 />10-szeres/ csak részlegesen blokkol. A gerincagy szövet emulziós autoradiográfiája jelölődést mutat a nagy ventrális szarv neuronjaiban /a ventrális szarv hátsó-oldalsó kvadránsában/, amelyek morfológiailag mozgató neuronoknak tűnnek. A hátulsó gerincagyban csak háttér-jelölődés mutatható ki.

4« 44«· * 4 · ·· • •4 4«· • · 44·· 4· «4 4··

- 41 II. táblázat

J’^j-bdní¹ retrográd transzportja patkány gerincagyához attömői BDNF

Injekció JB ¹²⁵J-BDNF + PBS 56 + 1510+4 ¹²⁵J-BDNP + BDNP 7 + 3^X3 + 1 ¹²⁵J-BDNF + NT-3 35+16+3 ¹²⁵J-BDNP + NGP 48+58+3

Minden kísérletben BDNP-et injektáltunk az összenyomott jobb ülőidegbe.

Az eredményeket 3-4 állat átlagaként fejezzük ki + S.E.M. J, jobb gerincagy; B, bal gerincagy.

xp<0,05 a kontroll ^²^J-BDNP + PBS-sel összehasonlítva.

A III. táblázat azt mutatja, hogy a gerincagyhoz NT-3 is transzportálódik. A homológ ligand 100-szoros feleslege ebben az esetben is jelentősen csökkenti a transzportot, de NGP és BDNF nem befolyásolja jelentősen az NT-3 transzportját.

*999

• · ···«

III. táblázat

125

J-NT-3 retrográd transzportja patkány gerincagyához

	attoméi	NT-3
Injekció	J		B
¹²⁵J-NT-3 + PBS	37 + 3	14	+ θ
¹²⁵J-NT-3 + NT-3	16 + 7*	11	+ ⁶
¹²⁵J-NT-3 + BDNF	28+5	10	+ 2
¹²⁵J-NT-3 + NGF	32 + 6	18	+ 4
Az eredményeket 3-4	állat átlagaként	fejezzük ki + S.E
J, jobb gerincagy;	B, bal gerincagy.
xp a kontroll ^²^J	-NT-3 + PBS-sel összehasonlítva.

10. PÉLDA: AGY-EREDETŰ NEUROTROFIKUS FAKTOR ÉS

NEUR0TR0FIN-3 ÚJSZÜLÖTT PATKÁNYOKNÁL ELŐSEGÍTI A KÁROSÍTOTT MOZGATÓ NEURONOK TÚLÉLÉSÉT

A következő adatok Sendtner M., Holtmann B., Kolbeck R.,Thoenen H. és Barde Y.A. kéziratából származnak /Max Planck-Institute fór Psychiatry, Dept. of Neurochemistry and Neurobiochemistry/.

• · ·

- 43 »

10.1. ANYAG ÉS MÓDSZER

10.1.1. SEBÉSZETI ÉS SZÖVETTANI ELJÁRÁSOK

Újszülött patkányoknál a jobb arcideget Sendtner és munkatársai /Natúré 345, 440-441 /1990// szerint vágjuk át. Röviden, újszülött Wistar patkányokat hipot-ermia utján elaltatunk és közvetlenül a jobb fül mögött mintegy 3 mm hosszú vágást ejtünk. Az arcideget a foramen stylomastoideumnál szabaddá tesszük és e helytől kb. 1 mm-re disztálisan mindkét gyököt átvágjuk. Gélhabot /Spongostan, Paesel, Frankfurt/ kis darabokra /1x2x3 mm/ vágunk és átitatjuk 5 ug BSA-t /Cohn Fraction V, Sigma, Deisenhofen, Németország/ vagy trofikus faktort tartalmazó 30 ul PBS-pufferrel. A gélhabot behelyezzük a károsított helyre és az ideget az őt fedő szalagok alatt rögzítjük. A bőrt selyemmel /Ethikon 3-0/ összevarrjuk és az állatokat visszavisszük az anyjukhoz. A születés utáni

7. napon az állatokat éter túladagolással, vagy a szíven átáramoltatott 50 ml 4% formaldehidoldat segítségével megöljük. Az agytörzseket szétvágjuk, 1 órán át rögzítjük, vízzel mossuk és növekvő koncentrációjú etanollal /70 - 100%/ víztelenítjük. Paraffin-beágyazás után az egész agytörzsből sorozatmetszeteket /7 um/ készítünk sorozatvágó mikrotóm /Reichert-Jung 2050 supercut/ segítségével. A metszeteket krezilibolyával megfestjük /Sigma, Deisenhofen, Németország/, és úgy a kontroll, mint a károsított oldalon az arci mozgató neuronok magvacskáit fénymikroszkóp alatt /125x nagyítás/ minden 5. metszetben leszámol- juk, Sendtner és munkatársai leírása szerint. A számot a felhasadt magvacskák számával nem korrigáljuk.

10.1.2. NGF, BDNF ÉS NT-3 ELŐÁLLÍTÁSA ÉS

JELLEMZÉSE

Agyi növekedési faktort /2,5 S/ érett hím egerek felső állcsont alatti mirigyeiből izolálunk. Rekombináns BDNFet és ΝΤ-3-at egyaránt nyúl vesesejtekből nyerünk rekombináns vakcinia vírussal történő transzfekeié, majd a felüluszóból történő tisztítás után.

10.2. EREDMÉNYEK

Ha az arci motoros neuronok axonjait átvágjuk vagy összenyomjuk, a károsodott sejtek több mint 80%-a néhány nap alatt degenerálódik. A sérült helyen CNTF-et alkalmazva mintegy 100%-ig növekszik e sejtek túlélése. Azonos körülmények között 5 ug NGF alkalmazása nem fokozza jelentősen a motoneuronok túlélését.

Az NGF-fel kezelt állatokkal ellentétben jelentős túlélési ráta figyelhető meg, ha az átvágott arcidegen BDNF-et alkalmazunk. A károsodott mozgató neuronoknak mintegy 50%-a a károsítás után 1 hét múlva még él /IV. táblázat/. A károsodás helyén a túlélési ráta 765 és 4580 neuron között változik. Abban az állatban, ahol csak 765 neuront tudtunk kimutatni, a trófikus faktort tartalmazó gélhabot eltávolitottuk a káro- 45 sodott helyről és ez valószínűleg megmagyarázza a BDNF csekély hatását a túlélésre ebben az egy kísérletben.

A BDNF-hez hasonlóan a mozgató neuronok fokozott túlélését figyeltük meg NT-3 kezelés után /IV. táblázat/. A hatás mégis kisebb a BDNF-fel kapottnál; átlagosan a sérült mozgató neuronok 27%-a marad életben a károsított oldalon. A BSA-val kapott 18% túléléssel összehasonlítva az NT-3 túlélést fokozó hatása statisztikailag szignifikáns /p* 0,05/.

Úgy a BDNF-fel, mint az ΝΤ-3-mal kezelt állatoknál a sérült motoros neuron sejttestek morfológiailag kisebbek és jellemző reaktiv változásokat mutatnak /5. ábra/. A magok helyükről elmozdultak és a kromatin kifejezett lizise figyelhető meg a BDNF-fel vagy ΝΤ-3-mal kezelt állatoknál. A BSAgélhabbal kezelt kontroll állatokkal összehasonlítva azonban a magok mérete nagyobbnak tűnik /5. ábra/.

• · · • ·· •· ·« ·· • · · * ·

IV. táblázat

MOTOMEURONOK TÚLÉLÉSE ÚJSZÜLÖTT PATKÁNYOKNÁL

AZ ARCIDEG KÁROSÍTÁSA UTÁN

NEUROTROFINOK HATÁSA

Túlélő neuronok száma + S.E.M.

BSA gélhabbal kezelt állatok /n = 8/

NGF-et tartalmazó gélhabbal kezelt állatok /n = 3/

BDNF-et tartalmazó gélhabbal kezelt állatok /n = 9/

ΝΤ-3-at tartalmazó gélhabbal kezelt állatok /n = 6/

Sérült oldal	Ép oldal
844 + 115	4597 + 222
500 + 322	4160 + 409
2222 + 446	4534 + 129
1155 + 109	4273 ± 415

10.3. MEGBESZÉLÉS

Vizsgálatainkban kimutattuk, hogy újszülött patkánynál axon-bemetszés után a BDNF jelentős számú motoneuron túlélését képes elősegíteni. Ezenfelül az NT-3 is hat e sejtekre, bár kisebb mértékben, de az NGF hatástalannak bizonyult. Adataink azt mutatják, hogy a neurotrofin géncsalád tagjai a CNTF-hez hasonló módon tudják befolyásolni a mozgató neuronok túlélését.

Az idézett különböző közlemények megállapításait tájékoztatás céljából ismertettük.

Claims

1. Eljárás mozgató neuron-betegségek kezelésére, azzal jellemez V. e, hogy a kezelésre szoruló betegnek hatásos mennyiségű neurotrofikus faktort adunk be, amely /i/ a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagja és /ii/ elősegíti a motoros neuronok túlélését, növekedését vagy differenciálódását.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagja BDNF.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagja NT-3·

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a motoros neuron-zavart izomsorvadásos lateralsclerosis okozza.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve , hogy a motoros neuron-zavart trauma okozza.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve , hogy a motoros neuron-zavart előrehaladó gerincizom-sorvadás okozza.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve , hogy a motoros neuron-zavart csecsemőkori vagy ifjúkori izomsorvadás okozza.

• · ·« • · » · · · «· · · · · · « ······ ·· ♦ ·· · ·· ··

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a motoros neuron-zavart poliomyelitis vagy post-polio szindróma okozza.

9· Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a..motoros neuron-zavart Charcot-MarieTooth-szindróma okozza.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a BDNF/NT-3/NGF család tagját legalább egy másik olyan vegyülettel együtt alkalmazzuk, amely elő tudja mozdítani a motoros neuron túlélését, növekedését vagy differenciálódását.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a másik reagens ciliáris neurotrofikus faktor.

12. Mozgató neuron-betegség kezelésére használható gyógyszer-készítmény, azzal j ellemezve, hogy a motoros neuron túlélését, növekedését vagy differenciálódását elősegítő BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád egy tagját CNTF-fel és gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt tartalmazza .

13. A 12. igénypont szerinti gyógyszer-készítmény, azzal jellemezve, hogy a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád tagja BDNF.

14. A 12. igénypont szerinti gyógyszer-készítmény, azzal jellemezve, hogy BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád «· ···· tagja NT-3.

15. Eljárás mozgató neuronok túlélésének, növekedésének vagy differenciálódásának elősegítésére, azzal j ellemezve, hogy a motoros neuronokat a BDNF/NT-3/NGF molekulacsaládhoz tartozó és a mozgató neuronok túlélését, növekedését vagy differenciálódását előmozdító neurotrofikus faktor hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy in vitro hajtjuk végre.

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy in vivő hajtjuk végre.

18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy a BDNF/NT-3/NGF család tagja BDNF.

19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a BDNF/NT-3/NGF család tagja NT-3.

20. Eljárás betegek motoros neuron-rendellenességeinek diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a betegből származó mintában a BDNF/NT-3/NGF molekulacsalád egy tagjának szintjét összehasonlítjuk egy egészséges egyén hasonló mintájával és ilymódon a betegnél megállapítjuk a neurotrofikus faktor-rendellenesség szintjét, amely pozitív korrelációban van a motoros neuron-zavar mértékével.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a BDNF/NT-3/NGF család tagja BDNF.

22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel1 e m e z v e , hogy a BDNF/NT-3/NGF család tagja NT-3.

23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 11 e m e z v e , hogy a mozgató neuron-betegség izomsorvadásos lateralsclerosis.

24. Eljárás egy tesztanyag motoros neuronok túlélését, növekedését vagy differenciálódását serkentő képességének kimutatására, azzal jellemezve, hogy /a/ motoros neuronokat kimutatható, jelölt BDNF-fel hozunk érintkezésbe olyan körülmények között, amikor a jelölt BDNF kötődni képes a motoros neuronokhoz; és /b/ egyidejűleg motoros neuronokat egy tesztanyag hatásának teszünk ki, melynek során a tesztanyag jelölt BDNF-kötődést gátló hatása azt jelenti, hogy a tesztanyag motoros neuron-betegségek kezelésére használható.

25. Eljárás egy tesztanyag motoros neuronok tűi- élését, növekedését vagy differenciálódását gének kimutatására, azzal j ellemezv ros neuronokat kimutatható, jelölt ΝΤ-3-mal elősegítő képessée , hogy /a/ motohozunk érintkezésbe olyan körülmények között, amikor a jelölt NT-3 kötődni képes a motoros neuronokhoz; és /b/ egyidejűleg motoros neuro nokat egy tesztanyag hatásának teszünk ki, melynek során a tesztanyag jelölt ΝΤ-3-kötődést gátló hatása azt jelenti, hogy a tesztanyag motoros neuron-betegségek kezelésére haszínálható.

26. Eljárás gondosan megtisztított rekombináns « ·

- 52 BDNF preparálására, azzal j ellenezve, hogy /i/ a rekombináns BDNF-et egy eukarióta sejtben kifejeződni hagyjuk;

/ii/ az /i/ pont eukarióta sejtjei által kondicionált tenyésztő közeget összegyűjtjük;

/iii/ a közeget desztillált vizzel hígítjuk;

/iv/ a hígított közeget S-Sepharose oszlopra viszszük fel és mintegy 100-750 mM sóoldat-gradienssel eluáljuk;

/v/ az eluált frakciókat összegyűjtjük;

/vi/ a BDNF aktivitással rendelkező frakciókat egyesítjük;

/vii/ a /vi/ pont szerinti frakciókat töményitjük; /viii/ a /vii/ pont szerinti koncentrált frakciókat Sephacryl S-100HR gélszürő oszlopra visszük fel; és /ix/ a /viii/ pont szerinti oszlopot mintegy 400 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldattal pH 7,6-on eluáljuk.

27. Eljárás gondosan megtisztított rekombináns NT-3 preparálására, azzal j ellemezve, hogy /i/ a rekombináns ΝΤ-3-at egy eukarióta sejtben kifejeződni hagyjuk;

/ii/ az /i/ pont szerinti eukarióta sejtek-kondicionálta tenyésztő közeget összegyűjtjük;

W > · *

- 53 /iii/ a közeget desztillált vízzel hígítjuk;

/iv/ a hígított közeget S-Sepharose oszlopra visszük fel és mintegy 100-750 mM sóoldatgradienssel eluáljuk;

/v/ az eluált frakciókat összegyűjtjük;

/vi/ az NT-3 aktivitással rendelkező frakciókat egyesitjük;

/vii/ a /vi/ pont szerinti frakciókat töményítjük;

/viii/ a /vii/ pont szerinti koncentrált frakciókat Sephacryl S-100HR gélszürő oszlopra visszük fel; és /ix/ a /viii/ pont szerinti oszlopot mintegy

400 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldattal pH 7,6-on eluáljuk.

28. Eljárás BDNF-függő motoros neuron-rendellenesség diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy kimutatható, jelölt BDNF injektálása utján a jelölt BDNF behatol a mozgató idegbe, és meghatározzuk, hogy a jelölt BDNF retrográd módon transzportálódik-e, minthogy a retrográd transzport hibája korrelációban van a motoneuronok diszfúnkciójával.

29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a rendellenesség izomsorvadásos lateralsclerosis, előrehaladó gerincizom-sorvadás, ifjúkori izomsorvadás, poliomyelitis, ”post-polio szindróma, Charcot-

- 54 Marie-Tooth szindróma, idegi trauma vagy idegsérülés.

30. Eljárás NT-3 függő motoros neuron-rendellenesség diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy kimutatható, jelölt NT-3 injektálása utján a jelölt NT-3 behatol a mozgató idegbe,, és meghatározzuk, hogy a jelölt NT-3 retrográd módon transzportálódik-e, minthogy a retrográd transzport hibája korrelációban van a motoneuronok diszfunkciójával.

31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a rendellenesség izomsorvadásos lateralsclerosis, előrehaladó gerincizom-sorvadás, ifjúkori izomsorvadás, poliomyelitis, post-polio szindróma, CharcotMarie-Tooth szindróma, idegi trauma vagy idegsérülés.