PT85498B - Processo para a preparacao de um novo factor neuronotrofico e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Memória Descritiva

I. OBJECTO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo factor neuronotrófico macro molecular (SDNF) derivado do cérebro de mamíferos, em particular do núcleo caudato de bovinos e a um processo para a preparação do mesmo. Do ponto de vista químico, o factor neuronotrófico purificado é uma proteí na básica com um ponto isoeléctrico aproximado de 10, cujo peso molecular, determinado por electroforese com gel contendo SDS (dodecilsulfato de sódio), é semelhante ao da lisozima, isto é, igual a cerca de 14 400 dalton. Do ponto de vista biológico, a molécula é capaz de incrementar in vitro a sobrevivência de neurónios do sistema nervoso em cultura, especialmente os do sistema nervoso central.

— A fonte acima mencionada e as caracterís ticas químicas e biológicas dos factores neuronotróficos distinguem-se das de outros factores neuronotróficos macromoleculares identificados, já descritos. Além disso, as aplicações farmacêuticas da molécula de SDNF foram identificadas e essas aplicações também fazem parte do objecto da presente invenção.

II. INTRODUÇÃO

a. Definição e Papel dos Factores Neuronotróficos

Verificou-se que a sobrevivência e o crescimento de células de mamíferos in vivo e in vitro são regulados por uma série de sinais extracelulares específicos semelhantes a hormonas, conhecidos como de crescimento, a maior parte dos quais são proteínas ou péptidos. Biologicamente, cada factor de crescimento actua sobre um grupo particular de células específicas a que se destina e que lhes respondem.

A investigação sobre os factores de crescimento proteicos macromoleculares, que controlam a sobrevivência e, o desenvolvimento de células de neurónios de mamíferos tanto durante o seu crescimento como quando são adultos, está agora a ter um considerável interesse no campo da investigação neurobiológica. Foi sugerido que, durante o desenvolvimento do sistema nervoso, factores neuronotróficos que ocorrem extrinsecamente e são derivados directamente dos micro-ambientes humorais e celulares, regulam a sobrevivência e a morte das células dos neurónios (Oowan, W. M. e col., Science 225:1258, 1984). Na realidade, foi sugerido que a competição entre axões e de inervamento do crescimento para factores neuronotróficos derivados de células de uma cerca finalidade determina quais são os neurónios que vivem ou que morrem durante a ambriogénese. No adulto, de maneira seme• lhante, se for da mesma maneira, factores neuronotróficos

~ foram propostos como indispensáveis para manter a sobrevivência das células dos neurónios e corrigir ligações funcionais intracerebrais (S. Varon, Discussions in Neuroscience, Vol. II, N2 5, 1985). Portanto, o enfraquecimento progressivo e a morte de células dos neurónios (que ocorrem depois de uma lesão traumática, de processos patológicos tais como choque ou doenças neurodegenerativas e envelhecimento) podem envolver a diminuição da quantidade ou a inibição de factores neuronotróficos in vivo (S. Varon, ibid; S. H. Appel. Ann. Neurol., 10:499· 1981): S. Varon e col., Dev. Neurosci., 6:73, 1984).

Também foi sugerido por estes investigadores que os factores neuronotróficos dos mamíferos adultos são a base dos processos de reparação e regenerativos a seguir a uma lesão não só do sistema nervoso periférico mas também do sistema nervoso central, Na realidade, a aplicação de modernas técnicas neurobiológicas nas experiências de transplantação e de lesões dos sistemas nervoso centrais de animais fortaleceu a ideia de que a reparação dos neurónios é possível no sistema nervoso central de mamíferos adultos, desde que estejam disponíveis sinais tróficos apropriados (Ρ. H. Gage e col., Nature 308;637, 1984).

Até recàntemente, o único factor neuronotrófico proteico macromolecular bem caracterizado era o faotor de crescimento dos nervos (NGP) (R. Levi-Montalcini e col., Physiol. Rev. 48:534. 1968; R. Levi-Montalcini. Ann. Rev. Neurosci., 5:341, 1982). A descoberta de que o NGP era capaz de estimular a sobrevivência apenas num limitado número de tipos de neurónios de mamíferos in vitro e in vivo levou à deia de que o NGP é apenas um de uma família de factores neuronotróficos macromoleculares, cada um dos quais é capaz de regular a sobrevivência de tipos definidos de neurónios. Presentemente, só dois outros factores neuronotróficos macromoleculares foram purificados e caracterizados - factor neuronotrófico ciliar (CNTP) (S. Varon, Discussions in Neu

- 3 roscience, Vol. II, Numero 3, 1985? S. Varon e col., Dev. Neurosci., 6:73, 1984) e factor neuronotrófico derivado do cérebro (BDNF) (S. Varon, Discussions in Neuroscience, Vol. II, Número 3, 1985; Y. Barde e col., Embo J. 1:549, 1982). As fontes, características químicas e actividades biológica referidas nestas literaturas destes factores são esboçadas em seguida.

b. Ensaio Biológico de Factores Neuronotróficos

Os sistemas de cultura de neurónios in vitro provaram ser ferramentas fundamentais e indispensáveis para o estudo da actividade neuronotrófica em extractoscb tecido e para o controlo de processos complexos apropriados para o fraccionamento e a purificação de factores neuronotróficos. Verificou-se que as culturas de neurónios dissociadas postmitóticas em monocamadas conservadas in vitro em condições de cultura adequadas restritivas necessitam e respondem a um suporte trófico adicionHdo extrinsecamente ao sistema da cultura. Portanto, a actividade neuronotrófica em preparação brutas semipurificadas ou purificadas pode ser operativamente determinada controlando a sua capacidade para promover a sobrevivência de células de neurónios in vitro.

Além disso, radioisótopos marcadores específicos dos neurónios (por exemplo, a análise do teor de neurofilamentos ou marcadores de absorção específicos) são usados para suportar ou confirmar os critérios morfológicos.

c. Características de Factores Neuronotróficos Identificados

Como se chamou a atenção anteriormente, os factores neuronotróficos macromoleculares identificados até esta data são o factor do crescimento dos nervos (NGF), o factor neuronotrófico ciliar (CNTF) e o factor neuronotrófico derivado do cerebro (BONF). As fontes biológicas, as caracterís ticas químicas e a actividade biológica de cada um d stes factores são esboçadas seguidamente, segundo foi indicado nas referências bibliográficas acima mencionadas.

1. Factor de Crescimento dos Nervos (NGF),

Fonte; 0 NGF foi originalmente descoberto em tumores de sarcomas de ratos x(R. Levi-Montalcini e col., J. Exp. £ool., 116 : 321, 1951) e foi depois purificado até à homogeneidade a partir de glândulas salivares submandibulares de ratos do sexo masculino (S. Varon e col., Biochemistrv 6:2202, 1967) e de veneno de cobra (R. H. Angeletti, P_roc. N_atl. Acad. Sei., USA 65:668, 1970).

M_uitas outras fontes relativamente ricas de NGF foram também referidas, incluindo a próstata da cobaia (G. P. Harper e col., Natura 279:160, 1979) e a placenta humana (L. D. G_oldstein e col., Neurochem. Res., 3:175, 1979). Pequenas quantidades de NGF foram também encontradas presentes em outros tecidos, incluindo o sistema nervoso central dos mamíferos (S. Varon, Díscussions in Neuroscience, Vol. II, Ne 3, 1985? F. Hefti e col., Neuroscience 14:55, 1985).

A relação fisiológica entre estas fontes potenciais de NGF e os sítios de acção aparente não é muito clara, mas supõe-se geralmente que o NGF é segregado a partir de vários tecidos periféricos que necessitam a inervação pelas células que respondem a NGF. A sequên ia. e a clonação de NGF obtida das glândulas submandibulares de ratos do sexo masculino foram também realizadas (J. Scott e col., N_ature 302:538, 1983; A. Ulrich e col., N_ature 303:821, 1983). 0 gene humano é de β-NGF foi também isolado e clonado com êxito (A. Ulrich e col., Nature 303:821, 1983; Patente Europeia Numero 0121388).

- 5 Caracteristicas Químicas

NGF obtido a partir de glândulas submandibulares de rato foi o tipo mais completamente caracterizado. 0 NGF de glândulas de rato actua como um complexo proteico 7S (peso molecular igual a cerca de 140 000 dalton)

A actividade de NGF é exclusivamente associada com a sub-unida de β (conhecida como 2, 5S NGF), uma proteína dimérica básica com o peso molecular igual a cerca de 25 300 dalton (apresentado um peso molecular igual a cerca de 12 650 dalton por electroforese com gel/SDS), cujo ponto isoelectrico é aproximadamente igual a 9, 3. F_oram já referidas as sequências de β-NGF proveniente de glândulas submandibulares de ratos do sexo masculino e de proveniência humana ou de outras fontes (J. Scott e col., N_ature 302:538, 1983; A. Ulrich e col., N_ature 303:821, 1983).

Actividade Biológica:

O NGF proveniente da glândula eubmandibular do rato foi usado para a maior parte dos estudos sobre a actividade de NGF in vitro e in vivo.

Dgterminou-se a gama de actividade bioló· gica in vitro de NGF quer em células de neurónios primários quer em células clonais em cultura. As células de neurónios primárias indicadas como respondendo a NGF in vitro incluem neurónios sensoriais de fetos (dia embriónico 8-12) em gânglioc de raiz dorsal, neurónios nor-adrenérgicos autonômicos nos gânglios simpáticos de fetos, neurónios colinérgicos de fetos em células do septo e cromafínicas adrenais em desenvolvimento.

Enquanto os neurónios sensoriais e simpáticos dependem de NGF para a sobrevivência e desenvolvimento, os neurónios colinérgicos não parecem necessitar a

presença de NGF para a sobrevivência, mas apenas para a sua diferenciação, isto é, para a expressão de traços fenotípicos característicos ligados ao neuro-transmissor. A adição de NGF às células de cromafina adrenais (células derivadas das extremidades neurais) na fase inicial do seu desenvolvimento provoca a expressão de fenotipos neuronais. As células clonais referidas como respondendo a NGF in vitro incluem células adrenais de cromafina derivadas de tumores da extremidade neural, conhecido como células de feocromacitoma (PC12) e células de neuroblastomas humanos. Após o tratamento com NGF, estas células passam de uma forma intensamente prolífera de comportamento para um estado neurónico postmitótico.

Os neurónios gue se preferem como respondendo a NGF in vivo incluem neurónios sensoriais dos glânglios da raiz dorsal, neurónios simpáticos e neurónios colinérgicos do sistema nervoso central tanto durante o desenvolvimento como também no estado adulto a seguir a uma lesão.

Neste último caso, a administração intracerebral de NGF provocou a sobrevivência de células de neurónios e a expressão de traços fenotípicos característicos.

Estes efeitos estão assoei ados com um aperfeiçoamento nas variações de comportamento provocadas por lesões,

2. Factor Neuronotrófico Ciliar (CNTF)

Fontex 0 CNTF foi detectado pela primeira vez e purificado a partir do, tecido embriónico (Εθ) de olhos de pinto, incluindc o corpo coroide e ciliar da íris juntamente com apitélio pigmentário. Subsequentemente, identificou-se a presença de actividade de CNTF numa variedade de extractos de diferentes tecidos, incluindo o nervo ciático da ratazana adulta e o fluído de feridas do sistema nervoso central da ratazana.

Características Químicas

CNTF proveniente de tecido intra-ocular de fetos de pintos contendo aproximadamente 2 x 10 em

termos de proteína, 9 % em termos de actividade trófica e purificado por electroforese com gel contendo SDS apresenta um peso molecular igual a 20 400 dalton e tem um ponto isoelectrico igual a cerca de 5. Este peso molecular e semeiaantemente a sua carga negativa líquida diferenciam claramentê o CNTF da proteína β-NGF submandibular do rato. Não foi indicada a sequência do CNTF purificado proveniente dos olhos dos pintos nem a sua purificação à escala preparativa a partir de CNTF derivado de mamíferos.

Actividade., Biológica :

Realizaram-se estudos biológicos usando principalmente extractos de olhos de pintos, preparações de CNTF semi-purificadas ou purificadas e apenas in vitro. Os neurónios que respondem in vitro incluem gânglios ciliares (Εθ) dê fetos de pintos, neurónios (Ε^θ) derivados de ganglios da raiz dorsal de fetos de pintos, neurónios neonatais de gânglios da raiz dorsal de ratos e neurónios simpáticos E-q de gânglios de pintos de gânglios neonatais de ratazana. Verificou-se que nenhum dessas actividades é bloqueada ou inibida por anticorpos de β-NGF submandibular de rato. Não se fez qualquer menção aos efeitos in vivo do CNFT

3. Factor Neuronótrófico Derivado do Cerebro (BDNF)

Fontes Estudou-se a actividade de BDNF quer em meios condicionados da linha de células clonais de ratazanas C6 quer em extractos de cérebro de várias espécies. 0 factor foi purificado a partir de cérebro de porco adulto.

Características Químicas

BDNF purificado a partir do cérebro —8 de porcos adultos (com um rendimento de 3,8 x 10 em termos de proteína, menos do que 5% em termos de actividade trófica) é um polipeptído fortemente básicr (pi 10,1) com um peso molecular igual a cerca de 12 300 dalton por electroforese

com gel contendo SDS. N_a literatura, não foi indicada qualquer sequência. A molécula de BDNF e o seu processo de extracção são descritos na P_atente Alemã Ocidental DE 3213963 Al.

Actividade Biológica:

Realizaram-se estudos sobre actividade biológica usando extracto bruto derivado de cérebro de porco, preparação de BDNF semipurificadas e purificadas e exclusivamente in vitro. Verificou-se que promove a sobrevivência quer de neurónios sensoriais derivados do placodo quer de neurónios sensoriais derivados da extremidade neural e que promove o desenvolvimento de neurites e a sobrevivência de células de explantos de retina in vitro (J. E. Turner, D_evelop. Brain Res., 18:251, 1985; J. E. Turner, Develop, 3rain Res., 18:265, 1985). M_uito embora as suas propriedades químicas sejam muito semelhantes às de β-NGF, não se detectaram quaisquer reacções cruzadas imunologicas. Além disso, o BDNF não actua sobre os neurónios simpáticos. Não foram indicados q uaisquer efeitos in vivo de 9DNF.

III. NOVO FACTOR NEURONOTRÓFICO DERIVADO DE CÉREBRO DE MAMÍFEROS

A presente invenção refere-se a um novo factor neuronotrófico (SDNF) com um peso molecular igual a 14 400 dalton que é activo sobre os neurónios do sistema nervoso e, em particular, do sistema nervoso central, e a um processo para a sua preparação.

a. Fonte e Procedimento de Purificação novo factor neuronotrófico de acordo com a presente invenção pode obter-se de acordo com a seguinte maneira de proceder que é também parte do objecto da presente invenção.

A maneira de proceder utilizada caracteriza-se por se homogeneizar cérebro de mamíferos, preferivelmente de animais bovinos, e, preferivelmente, de núcleos caudatos, sob condiçõ s neutras, seguida de por uma precipitação com ácido a pH 4-5 e fraccionamento cromatografico num peneiro molecular com eluente. tamponizado diluído, a uma concentração compreendida õbntro do intervalo de 10 mM a 30 mH; as fracções activas são ainda melhor purificadas por cromatografia com permuta de catiões com um gradiente compreendido entre 0,1 M e 1 M de tampão de acetato de amónio, e se reunirem e liofilizarem as fracções activas.

Poâem usar-se cérebros de mamíferos tanto frescos como congelados (por exemplo, a -70° C). Todas as operações de purificação acima mencionadas realizam-se preferivelmente a uma temperatura compreendida entre 0 e 6°G.

Para a preparação de cada carga, os cérebros completos ou partes de cérebros são homogeneizados em 2 ou 4 volumes de solução tamponizada diluída a um pH variável entre 6 e 7,4 e, em seguida, acidula-se, preferivelmente com CE1, a um pH compreendido entre 4 e 5, preferivelmente igual a 4,5 e agita-se durante várias horas. Separa-se o material que precipitou mediante centrifugação (por exemplo, 40 000 rotações por minuto, durante quarenta minutos), neutraliza-se o sobrenadante e dialisa-se em contra corrente com uma solução tamponizada diluída e liofiliza-se. A_s membranas de diálise tem um corte de peso molecular compreendida entre 5 e 10 quilodalton. 0 fraccionamento por meio de filtro molecular realiza-se usando uma fase estacionaria com uma gama de fraccionamento compreendida entre 5 000 e 150 000 dalton. A amostra é eluída com uma solução tamponizada diluída até uma concentração que varia entre 10 mM e 30 mM e a um pH que varia entre 6 e 7,4. Reunem-se as fracções biologicamente activas, liofilizam-se, aplicam-se a uma coluna cromatográfica com permuta de catiões e elui-se com um gradiente de tampão de acetato de amónio desde 0,1 molar até 1 molar com um pH com- 10 -

preendido entre 6 e 7. A actividade neuronotrófica é eluída e, aproximadamente, concentração 1 molar e as fracções activas são mais uma vez reunidas e liofilizadas.

A maneira de proceder acima descrita pode ser interrompida em qualquer fase de purificação se o material biologicamente activo já for suficientemente puro ou se se utilizarem outras fracções menos purificadas.

seguinte exemplo descreve a invenção, embora não limite o seu âmbito:

Exemplo

Num matadouro, ootiveram-se cérebros frescos de animais da. espécie bovina e dissecaram-se os núcleos caudatos em gelo. Para a preparação de cada carga, homogeneizaram-se aproximadamente 150 gramas de tecido caudato (25 - 30 cérebros) (homogeneizador Polytron, ponto 6, 60 segundos) em três volumes de solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato (PBS), diluída na proporção de 1 : 10 (pH 7,4), contendo fluoreto de fenil-metil-sulfonilo (PASF) (0,3 mg/ml) e EGTA (ácido etilenoglicol-bis-õ-aminoetil-éter,N,N,Ν’,Ν’-tetracético) (1 ml·'), acidulou-se com HC1 a pH 4,5- manteve-se dentro de gelo durante duas horas e, subsequentemente, centrifugou-se (40 000 rotações por minuto, durante quarenta minutos). Reuniu-se o sobrenadante, neutralizou-se (pH 7,4), dialisou-se durante a noite (corte a 8 kDa) com P3S diluído na proporção de 1 : 10 (pH 7,4), liofilizou-se e conservou-se a -20°C, subdividido em várias porções. Imediatamente antes da utilização, as partes aliquotas são novamente suspensas em 1/10 do seu volume inicial usando água destilada e avalia-se o teor de proteína de acordo com o método de G. L. Peterson (A_nal. Biochem., 83:346. 1977). Diluiu-se então as amostras com meio de cultura, filtrou-se através de filtros Millex de 0,45 mícron, previamente saturados com albumina de soro bovino (1 mg/ml) e adicionaram-se quantidades apropriadas da fracção sobrenadante

filtrada às culturas de células mesencefálicas isentas de soro, para ensaiar a actividade neuronotrófáca.

Utilizou-se uma coluna de Sephadex

G-150 (fino) (que mede 8 cm x 120 cm), para separar os componentes do sobrenadante de acordo com o seu peso molecular. Os sobrenadantes liofilizados foram ressuspensos em água destilada e aplicados à coluna (aproximadamente 750 mg de proteína em 6 ml de tampão de eluição). 0 tampão de eluição tinha a seguinte composição milimolar (9H 7,30) : NaCl = 13,68; KC1 s 0,27; Na₂HP0₄.H₂0 = 0,8; KH₂?0₄ = 1,5.

A coluna foi eluida com um caudal de 90 ml por hora, usando uma bomba peristáltica. A densidade 6ptica do eluido foi continuamente controlada a 230 nm com um contrelador de ultravioletas. Obtiveram-se fracções de 15 ml automaticamente e, depois de se liofilizar, ensaiaram-se reijtivamente à sua actividade neuronotrópica. A croraatografia por filtração através de gel e a colheita das fracções realizaram-se numa divisão arrefecida a 4°C.

Reunirama-se as fracções biologicamente activas eluídas da coluna contendo Sephadex G-150 e liofilizar am- se. Ressuspenderam-se partes alíquotas de material liofilizado em 110 μΐ de CH₃COO(NH)₄ 0,1 M de pH 6,45. Determinou-se as proteínas em 10 ul. Apdiicaram-se os restantes 100 μΐ (1,9 mg de proteína) numa coluna TSK-CM-35?J (uma coluna de permuta de iões para cromatografia em fase líquida sob alta pressão). Eiuiram-se as fracções com um gradiente de (NH₄) COOCH₃ (0,1 Μ - 1 M), pH 6,45 a um caudal de 0,5 ml por minuto. T_ampão A : (NH^OOOCH-j 0,1 M, pH 6.45. T_ampão Β í (NH₄) OOOCH₃ 1 M, pH 6,45. Perfil do gradiente : 0 - 20 minutos, 100% de A/0% de B (isocrático) ; 20 - 40 minutos, 0% de 1/100% de B (linear) s 40 - 70 minutos, 0% de xA/100% de B (isocrático); 70 - 75 minutos, 100% de A/0% de B (linear). Ag fracções foram liofilizadas e ressuspensas em 0, 6 ml de tampão de fosfato (10 mM, pH 5,7).

A_s proteínas foram medidas era amostras de 100 jil e o material restante foi utilizado para o ensaio biológico e para a análise de SDS-PAGS.

A Tgbela 1 resume as principais fases da maneira de proceder de purificação e refere-se a um exemplo do grau de purificação (em termos de proteína) e o rendimento em percentagem de actividade neuronotrófica que se pode conseguir durante a maneira de proceder de purificação. Os rendimentos em proteína e em actividade trófica distinguem esta maneira de proceder das outras maneiras de proceder usadas para a purificação cb CNTF e de BDNF.

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b

Caracterização Química

A actividade biológica da fracção sobrenadante bruta obtida a partir do homogeneizado total depois da precipitação com ácido, neutralização e diálise é sensível à tripsina, o que indica que a molécula activa é de natureza proteica ou peptídica. A molécula biologicamente activa presen te no extracto sobrenadante bruto acima referido é eluída da coluna de Sephadex G-150 em fracçoes que correspondem a um peso molecular que varia entre 10 000 e 30 000 dalton (Figura

A Figura 1 representa um perfil típico da eluição de Sephadex 0-150 de sobrenadante de caudato bovino obtido depois da precipitação com ácido, neutralização e diálise do homogeneizado total conjuntamente com a identificação das fracções biologicamente activas. As condições de preparação foram descritas acima. Todas as fracções foram ensaiadas relativamente à sua actividade biológica cora concentrações de proteína variáveis entre 0,01 e 10 ug/ral. Obssrvou-se actividade nas fracçoes indicadas pela linha horizontal na Figura 1.

A molécula biologicamente activa presente nas fracções activas obtidas a partir da coluna de Sephadex G-150 são eluídas da coluna TSx<-Cl-l-3Si·?, a uma concentração de tampão de acetato de amónio igual a cerca de 1 M (Figura 2).

A Figura 2 representa uma curva típica do perfil de eluição durante a cromatografia em fase líquida sob alta pressão usando uma coluna de TSk-Ci'í-3Sk, dos eluídos activos obtidos a partir de uma coluna de S_ephadex G-150. Ag condições de purificação são descritas. T_odas as fracções foram examinadas relativamente à sua actividade biológica com concentrações de proteína gue variam entre 0,001 e 0,3 ug/ml. A actividade representada pela linha horizontal foi observada

— em fracções eluídas com solução de acetato de amónio cerca de 1 molar.

A última fracção de eluição no tempo é semelhante à de citocrómio C, indicando que o ponto isoeléctrico ia molécula activa é semelhante ao ponto isoeléctrico da citocrómia G, isto e_t aproximadamente 10 - 10,5. £sta característica distingue a molécula activa da de GNT.F que tem um pi igual a cerca de 5.

A electroforese realizada em SDS-PRGE de acordo com método de V. Lee e col., (Neuroscience, 6:2773, 1981), usando geles de poliacrilamida a 12,5 % em peso/volume e SDS contendo tampão descontínuo de acordo com o método de U. K. Laemmli (Nature, 227:680, 1970) do material biologicamente activo obtido nas operações importantes da maneira de proceder de purificação (extracto sobrsnadante obtido a seguir à precipitação com ácido, neutralização e diálise do homogeneizado total numa coluna de Sephadex G-150 e numa coluna TSK-CM-3SW) está representada na Figura 3A.

A Figura 3xA apresenta exemplos de electrosforese depois do manchamento com prata com proteínas normalizadas BioRad (pistas 1 e 5) e de material activo (5 ug de proteína/pista) derivadas das fases mais importantes da maneira de proceder de purificação, isto é, extracco sobrenadante obtido depois da precipitação com ácido, neutralização e liofilização do homogeneizado total (pista 2) e do eluído aceivo da coluna de Sephadex G-150 (pista 3) e da coluna de TSX<-CM-3SW (pista 4).

Os indicadores de peso molacular padrão usados foram miosina (peso molecular 200 000), β-galactosidase (peso molecular 116 250), fosforilase b (peso molecular 92 500), albumina de soro de bovinos (peso molecular 66 200), albumina de ovo (peso molecular 45 000), carbono-anidrase (peso . molecular 31 000), inibidor de tripsina de soja (peso molecular 1 21 500) e lisózima (peso molecular 14 400).

- 16 0 tampão da amostra para a electroforese consistia em uma solução 62,5 mM de tris £ tri-(hidroximetil)-aminometano? (pH 6,8), 10% em peso/volume de glicerol, 2% em peso/volume de SDS (dodecil-sulfato de sódio), 2,5 mH de EDTA, 2,5 mM de EGTA, 0,01% de azul de bromofenol e 5% de β-mercapto-etanol.

material biologicamente accivo obtido a partir da coluna de TSK-CM-3SW migra sob a forma de uma única banda com um peso molecular semelhante ao da lisózima (BioRad) utilizada como padrão e tendo um peso molecular igual a cerca de 14 400 dalton. Este peso molecular distingue a respectiva molécula activa dos outros factores neutronotróficos identificados (NGF, CNTF, BDNF). Na realidade, o material activo eluído da coluna de TSK-CM-3SW não migra depois ca electroforese em gel de SDS-FAGE numa posição semelhante ao de β-NGF de glândulas salivares de rato (Figura 3B).

A Figura 3B ilustra um exemplo do resultado da electroforese em gel de SDS-PAGS depois do manchamento com prata com indicadores BioRad padrão (pistas 1 e 4), com 2,5 ug de β-NGF de glândula submandibular de rato (pista 2) e com 2,5 ug de material activo da coluna de TSK-CM-3SW (pista 3). Usou-se a mesma proteína padrão que se indica na Figura 3A.

NGF migra para uma posição abaixo da posição de migração da molécula activa eluída a partir da coluna de TSK-CM-3SW. I_ndicou-se que o BONF migra no movimente, electroforético em SDS para uma posição semelhante à do NGF. Isso constitui uma outra indicação de que a molécula activa eluída da coluna de TSK-CM-3SW pode ser distinta de BDNF.

c. Actividade Biológica

A actividade biológica do material derivado das operações mais importantes da maneira de proceder de

purificação (o extracto sobrenadante bruto obtido depois da precipitação com áciõo, neutralização e diálise do homogeneizado total, os eluídos obtidos da coluna G-150 e os eluícos obtidos da coluna de TSK-CM-3SW) é usualmente estabelecida controlando os seus efeitos sobre a sobrevivência de células mesencefálicas primárias dissociadas de feto de rato, conservadas em cultura isenta de soro. Além disso, fizeram-se determinações da absorção específica de H-dopamina em neurónios GABAérgicos presentes no sistema de cultura, de modo a corroborar ou confirmar os critérios morfológicos.

Em seguida, esboçaram-se os métodos de preparação de cultura de células, de avaliação d. sobrevivência de células e dos parâmetros de absorção específicos juntamente com as características da preparação da cultura de células e os efeitos do material obtido nas fases mais importantes da maneira de proceder de purificação.

1. Método de Preparação da Cultura de Células e Critérios Imunocruímicos Utilizados para a Avaliação dos Tfpos de células In Vitro¹¹

DissEou-se tegumento mesencefálico rostral de cérebros de embriões de ratos de treze dias sob condições esterifiEadas. A_s áreas de cérebro reunidas foram mecanicamente dissociadas em PBS com a seguinte composição milimolar : NaCl = 136,8; KC1 = 2,7; Na₂HFO₄.7H₂O - 8; KH FO^ = 1,5 e contendo glucose (6 mg/ml) e albumina de soro bovino (0,1 mg/ml) (pH 7,4). As células foram seguidamente contrifugadas (45 rotações por mii^uto, durante quatro minutos), ressuspensas no meio de cultura, passadas através de um filtro de 20 um Nytex, contadas com um contador de células de Culter e placadas em placascle plástico de cultura de tecidos Falcon de 35 mm.

C_ada placa foi revestida com colagénio de pele de bovino (vitrogen, 100 um de proteína), usando meio basal de E^gle (Bi-iS), NaíICO-, e NaOH, de modo a fazer subir a O

força iónica e o pH (T. Elsdale e col., J. Cell Bjol.,

54:626, 1972).

meio de cultura consistia numa mistura de BME e de F12 de Ham (1 í 1), suplementada com glucose (33 mM), glutamina (2 mM, NaHCO^ (15 mM), I-íEPES (ácido N-2-hidroxietil-pipepazino-N'-2-etano-sulfónico) (10 mM), suplementado como è referido por U. Di Po^zio e col., (Nature 288:370, 1980), com insulina (25 ^jig/ml), transferrina (100 /íg/ml), putrescina (60 >iM), progesterona (20 mM), selenito de sódio (30 nM), penicilina G (0,5 U/ml) e estreptomicina (0,5^ig/ml); e contendo T^ (3,3’,5'-tri-iodo-DL-tironina) (30 nM) (J. Puymirat e col., Neuroscience 10:801, 1983). Tipicamente, adicionaram-se a cada placa 2 ml de meio de cultura contendo o número pretendido de células dissociadas.

A identificação ócs tipos de células in vitro realizou-se por imunofluorescencia indirecta, utilizando anticorpo monoclonal RT97 contra proteínas de neurofilamentos (B. H. A_nderton e col., N_ature 298:84, 1982), um indicador específico de células de neurónios in vitro, como é referido por P. Doherty e col. (J. Neurochem., 42:1116, 1984). Resumidamente, as culturas foram fixadas durante sete minutos com metanol a -20°0. A_s culturas fixadas foram permeabilizadas por tratamento durante trinta minutos com 0,1% (em volume/volume) de Triton x-100 (um éter de polioxietileno) em PBS e, em seguida, incubou-se durante sessenta minutos com 10% de soro de feto de vitela (FCS), contendo PBS para bloguear os sítios de ligação da proteína não específicos. A incubação com anticorpo anti-neurofilamentos (diluição 1 : 500 em PBS realizou-se durante sessenta minutos â temperatura ambiente e foi seguida por três lavagens com PBS contendo 10% de FCS.

Adicionou-se em seguida IgG purificada de elevado afinidade de anti-rato de cabra conjugada com rodamina (diluição 1 : 10'3) à cultura durante sessenta minutos à temperatura ambiente e, depois de três lavagens em PBS com

10% de FCS, recobriu—se com glicerol/PBS (1 : 1) e examinou-se no fotornicroscópio Zeiss III equipado com epifluorescencia de rodamina e um conjunto óptico de contraste de fase.

Realizou-se o ensino de imunofluorescencia indirecta usando GFAP (proteína acídica fibrilar glial) de anti-soro de rato (para marcar especificamente as células astrociticas in vitro e IgG conjugada de rodamina purificada por alta afinidade de anti-rato de cabra, de acordo com a maneira de proceder de M. C. Raff e col. (Brain Res., 174:283, 1979).

2. Método de Determinação .da Sobrevivência de células na Cultura em Função do Tampo

Verificou-se a sobrevivência de células por critério morfológicos (isto é, observação com microscópio de contraste de fase do número de células sobreviventes de acordo com o tempo in vitro) juntamente com a avaliação bioquímica do teor de DNA e do número de células dopaminérgicas sobreviventes por placa de acordo com o tempo in vitro. 0 teor de DNA estabelecido d? acordo com o método indicado por B. G. Erwin e col., (Anal. Biochem., 110:291, 1981), enquanto o número de células dapaminérgicas por placa, foi determinado depois da absorção específica de dopamina e por visualização dos neurónios fluorescentes de acordo com o método de fluorescência provocada por ácido glioxílico (GIF), descrito por G. Bolstad e col. (Comp. Biochom. Physiol., 62:ól, 1979). Para esta última finalidade as células foram observadas com um fotomicroscópico Zeiss III equipado com óptica de epifluorescencia de catacolamina e de contraste de fase. Utilizando coordenadas pré-fixadas, contou-se o número de neurónios positivos a GIF que correspondem a, pelo menos, 3% da área superficial total.

3. Método de Determinação da Absorção Especí'fica de

Dopamina e de GABA

A determinação da absorção especifica de H-dopamina realizou-se como descrito por B. Berger e col. (Neuroscience, 7:193, 1982). A_s células foram lavadas uma vez com PBS pré-aquecido suplementado com glucose (5 nM)_t CaCl₂ (1 nh), MgSO₄ (1 nM), ácido ascórbico (0,1 mO, pargilina (0,1 nií) e pré-incubaram-se durante cinco minutos com 0,8 ml de solução acima mencioAada. Quando necessário, adicionaram-se ao meio de incubação benzotropina (5 u.í), desmetil-imipramina (5 um) ou fluoxetina (1 ui-1). Como

-se então 0,2 ml de H-dopamina (concentração

S.A. (actividade específica) 22 - 33 Ci/nd) e rotina, adicionou· final 50 nm, continuou-se a incubação durante quinze minutos, a 37°C. Interrompeu-se a absorção removendo a mistura de incubação seguida por quatro lavagens rapidas com PBS arrefecida com gelo. 3xtraíu-se então a H-dopamina de cada cápsula por duas vezes (quinze minutos cada) com 0,5 ml de HCIO^ 0,4 2-1 mais etanol absoluto (3:1 em volume/volume).A recuperação foi superior a 95%. Dgterrainou-se a radioactividade depois da adição de 10 ml de I_nstagel II (um fluído de contagem de cintilação líquido) usando um contador de cintilação Packard IriC^rb (modelo 460 c). Sm amostras separadas, obtidas no fim da incubação e depois das lavagens, extraíu-se a radioactividade intracelular com 0,5 mlde ácido perclórico (0,4 N) e analisou-se por cromatografia em base líquida sob alta pressão (HPLC) (C. Kotake e col.,

J. Neurosci., 2:1307, 1982; A. Shum e col., 7. Chromatog., 228:123, 1982).

Mais do que 95% da radioactividade injectada estava associada com a fracção reunida no momento da retenção da dopamina.

Ensaiou-se a absorção específica de

C-GABA como foi descrito por A. P_rocniantz e col. (Nature

293 : 570, 1981), com adição de 0,1 uíí de xjj j. *^13 jTj (225 mCi.nmol) durante quinze minutos a 37°C. Utilizou-se ácido aminóxi-acético (10 uM) para evitar o catabolismode GABA. Quando necessário, adicionou-se ácido diaminobutírico (10~ H), que é um inibidor

a absorção de GABA. A_s maneiras de proceder de lavagem e de extracção são as gue se descreveram para os estudos da absorção da H-dopamina. A identificação de GABA realizou-se por cromatografia em camada fina (R. S. Lasher, Brain Res., 69s235, 1974). Mais de 90% da radioactividade estava associada com uma mancha que migra simultaneamente com GZC3A autentica.

4. Dpterminaçao Morfológica, Vitalidade e Características Bioquímicas do Sistema de Cultura de Células

Ao fim de quatro e de oito dias in vitro, mais de 98% das células viáveis aderentes presentes na cápsula eram positivamente imuno-reactivas e imuno-citoguímicas de acordo com o mancharnento com anticorpo monoclonal RT97. Também, menos de 1% das células de cultura eram, ao fira dos tempos considerados, imuno-reactivos ao mancharnento com anti-soro GFAP. Isto indica que mais de 98% das células de cultura podem ser classificadas como elementos de neurónios. A visualização do número de neurónios depaminoérgicos no sistema de cultura indicou que estas células eram aproximadamente de 0,1 -0,2 % da população total de células presentes in vitro.

A viabilidade das células no sistema de cultura utilizado não sofreu modificações ate quatro dias in vitro. No entanto, entre quatro e oito dias in vitro, a viabilidade diminuiu em cerca de 60 - 80%. I_sto era evidente não só depois da avaliação morfológica como também a seguir à determinação do teor de DNA e do número de células doparainérgicas por cásula. Isso significa que a viabilidade das células de neurónios messncefálicos nas condições de cultura era limitada e que não ocorrem variações notáveis na viabilidade dos diferentes tipos de células presentes no sistema de cultura (veja- se Figura 4).

A Figura 4 é um gráfico que representa as variações em função do tempo dos neurónios totais, dos neuró• nios d GIF positivos e da absorção de dopamina sensível a BGT. - As células mesencefálicas foram semeadas a uma densidade de 1 x

10° células/cápsula de 35 mm/2 ml de meio de cultura·

A_s indicações da Figura 4 são as seguintes :

ΌΝΑ/cápsula ( o — 0); absorção de dopamina sensíveu a ΒΖ.Τ (0 — 0); número de células GIF /cápsulas (histogramas de bloco); absorção de dopamina sensíveis a BZT/ 3 4· /10 células GIF (histograma a linha tracejada).

Semelhantemente à determinação da viabilidade de células na cultura, a absorção específica de a14

-dopamina e de C-CABA diminuiu em cerca de 6o - 80% entre o quarto e o oitavo dia in vitro. Este facto sugere igualmente que não há uma diferença aparente de comportamento entre os vários tipos de células presentes in vitro e permite concluir que aqueles parâmetros de absorção são indicadores apropriados da viabilidade das células in vitro.

5. Actividade Biológica do erial Derivado das Fases mais Importantes do Processo de Purificação

Para esta finalidade, imediatamente antes da utilização, ressuspendem-se partes alíquotas do material liofilizado derivado das fases mais importantes de purificação em 1/10 do volume inicial usando água destilada. Ayaliou-se o teor de proteína de acordo com G. L. Peterson (Anal. Biochem., 83s346, 1977). A_s amostras foram então diluídas com meio de cultura, filtradas através de filtros Millex de 0,45 mícron e pré-saturadas com albumina de soro bovino (1 mg/ml). Adicionaram-se então quantidades apropriadas de material filtrado à cultura de células mesencefálicas no dia da pia agem. Adicionaram-se também quantidades equivalentes de albumina de bovino às culturas de células de controlo.

Em todas estas culturas, o meio foi substituído cada dois dias ou, como alternativa, ressuplementado com material derivado das operações de purificação ou com - 23 -

albumina, no caso das culturas de controlo. 0 material derivado de todas as mais importantes fases de purificação - o extracto sobrenadante bruto obtido depois da precipitação com ácido do homogeneizado total, as fracções obtidas a partir da coluna contendo S_ephadex G-150 e eluídas dentro da gama de peso molecular de 10 até 30 quilodalton e as fracções obtidas da coluna de TSK-CM-3SW aluída com acetato de amónio a cerca de 1 H - são todas capazes de aumentar a viabilidade, isto é, a sobrevivência e o desenvolvimento de células de neurónios mesencefalicos de feto dissociadas na cultura.

A aparência morfológica no oitavo dia da cultura das células in vitro depois da adição do meio de cultura no dia da placagem, (dia 0), ou de a fracção sobrenadante bruta ou de albumina (cultura de controlo) está representada na Figura 5A e 5B.

E_stas Figuras representam a aderência típica de células mesencefálicas de feto de rato no oitavo dia in vitro, depois da adição de 10 _zug/ml de albumina na cultura de controlo (Figura 5A) e de 10 jig/ml de extracto de sobrenadante obtido a seguir à precipitação com ácido e à diáliss do homogeneizado total (Figura 5B).

S_ste efeito foi também evidente a partir da determinação do teor de DNA total e do número de células dopaminérgicas por cápsula (Figura 6) e também da absorção ,3 14 especifica H-doparaina e de CGABxA em função do tempo in vitro.

A Figura 6 representa uma avaliação do numero de células de CIF (isto é, DA dopaminérgicas) e do teor de DNA por cápsula no oitavo dia in vitro, depois da adição de 10 _zug/ml de albumina à cultura de controlo (histogramas em bloco) e de 10 ug/ml do líquido sobrenadante obtido a seguir à precipitação com ácido e à diálise do homogeneizado total (histogramas de linhas tracejadas). Os valores indicados são valores médios í erro quadrático médio da média de análises em

triplicado

A Figura 7 mostra que o efeito do líquido sobrenadante acima referido sobre a absorção da dopamina depende da concentração, Este facto foi observado a partir das determinações da absorção de GABA e de DNA por cápsula.

E_specificamente, a Figura 7 mostra o efeito de adição de várias concentrações de extracto bovino (obtido a seguir à precipitação com ácido e a diálise do homogeneizado total) por absorção de dopamina sensível a BLT. As células mesencefálicas foram semeadas com. uma densidade de 0,5 x 10 células/1 ml de meio de cultura conjunto (24 mm). As quantidades indicadas de eutractos bovinos foram adicionadas no momento da placagem no volume de 50 ^ul. Quando isso for necessário, as amostras foram suplementadas com albumina de soro bovino, de modo a at.ingir-se concentrações finais de 40 /ig/ml de proteína. Os parâmetros de absorção foram calculados no quarto dia in vitro. Os valores são indicados com a média - desvio padrão de amostras em triplicado.

Em conjunto, estes resultados indicam que o material activo é capaz de aumentar a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de vários tipos de neurónios, em particular, os presentes nas culturas utilizadas. Embora se tivessem detectado efeitos semelhantes quando se ensaia a actividade trófica do extracto sobrenadante, na reunião das fracções de Sephadexi G-150 eluídas entre 10 e 30 quilodalton e no grupo de fracções da coluna de TSK-CM-3SW eluídas usando acetato de amónio aproximadamente 1 M, a quantidade cfe material necessário para se obter esses efeitos diferia. Em particular, enquanto o extracto sobrenadante bruto apresentada uma actividade biológica semi-máxima quando adicionado in vitro a concentrações de cerca de 6 ug/ml, a actividade semi-máxima das fracções obtidas a partir de S_ephadex G-150 e de TSK-CM-3SW era detectável a cerca de 0,3 ug/ml e 10 ng/ml, respectivamente . (ver Tabela 1).

ensaio da actividade biológica noutros tipos de culturas de células de neurónios in .vitro, em particular, de células de neurónios dissociados provenientes do estirato de feto de rato, indicou que a molécula activa era efectiva em melhore C a sobrevivência e provocar o desenvolvimento de vários tipos de neurónios presentes em diferentes área do sistema nervoso, em particular, do sistema nervoso central (CNS). Além disso, o material activo era efectivo em aumentar o desenvolvimento neurítico in vitro de neurónios de gânglios da raiz dorsal de embriões de pintos com doze dias mas não em embriões de oito dias. E_ste efeito indica também que o factor neuronotrófico pode ser distinguido do β-NGF derivado das glândulas salivares de rato. Na realidade, a adição de várias concentrações (desde 1 ng até 300 ng/ml) de β-NGF das glândulas salivares de rato não tem çrualquer efeito sobre a sobrevivência de células mesencefálicas dissociadas de ratos usadas rotineiramente na cultura.

IV. APLICAÇÃO IN VIVO DO FACTOR NEURONOTRÓFICO DERIVADO., DE

CÉREBRO DE MAMÍFEROS

Um outro objecto da presente invenç-ão refere-se à aplicação in vivo do factor neuronotrófico (SDNF) derivado do cérebro de mamíferos. Como se referiu acima, sabe-se hoje que os factores neuronotróficos regulam a sobrevivên cia de células de neurónios e a plasticidade de neurónios (definida como a capacidade de uma célula nervosa sofrer modificações morfafiuncionais em resposta a alterações do seu micro-ambiente) não só durante o desenvolvimento do sistema nervoso mas também, presumivelmente, no estado adulto. N_a realidade, acumularam-se já factos gue sugerem que os factores neuronotróficos controlam provavelmente os neurónios dos adultos relativamente a:

I. Manutenção, comportamento funcional e envelhecimento de células normais (S. Varon, Discussions in . Neuroscience, Vol. II, Numero 3, 1985) - isto é, deve haver um 1 abastecimento suficiente e uma utilização suficiente de facto- 26 -

envolvida no processo morte em algumas isto é, podem assoficos para contrabalançar as variações nonmais sóiíioa adultos in vivo pode reflectir um inadequado por agentes tráficos· !

Processos de reparação e regeneração células lesionadas química ou mecanicamente (S. Varon, ibid, , a lesão axonal origina um deficiente abastecifactores neronotróficos às células dos neurónios e 9 a morte de células de neuronios se segue a lesões ou patologógicas e pode ser mento·

Degenerescência e tológicas (S. Varon, ibid), tntes condições patológicas comsituações de dep©dem obter-se como resultado ou ser devidas a tráficos derivados ou de um declínio no suporte ivo ou de um aumento das necessidades tróficas estes fáctos.

Γϊ·

T_endo em vista o que acima se refere, a - presente invenção também se refere às seguintes aplicações do factor neuronotrófico conhecida como SDNF, em particular, administração por via parentérica (incluindo, embora não de * maneira exclusiva, administração peridural, intracisternal, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramuscular, . subcutânea, gengival, sublingual, rectal e nasal) das molácu...de SDNF ou sozinhas ou em associação com gangliósidos <om particular, misturas de gangliósidos de cérebro bovino, ^F espécies de gangliósidos individuais de cérebro bovino, preferivelmente GM^ e derivados de gangliósidos semi-sintéticos, preferivelmente derivados de ésteres internos de gangliósidos) çu fosfolípidos (em particular, misturas de fosfolípidos de Ò^rebrc bovino, espécies de fosfolipidos de cérebro de bovinos . sozinho, preferivelmente, fosfotidil-serina e derivados semi-Sjfcntéticoã de fosfolípidos), em condições neuropatológicos que derivam det

X< danificação aguda, subaguda ou crónica

B·™'' t·-; ;í _f do sistema nervoso, incluindo a danificação traumatica, a danificação química, a danificação dos vasos e deficientes como ataques conjuntamente com danificações infecciosas/ /inflamatórias e

K” .η;? ·. / : . · !

XI.

eluindo a doença provocadas por tumores;

envelhecimento do sistema nervoso, inde Alzheimer;

doenças neurodegenerativas crónicas do nervoso;

doenças imunologícas crónicas do sistema ou que afectam o sistema nervoso.

.™,_o e

A associação da utilização das molécu_n las d· SDNF com gangllósidos e fosfolípidos é substanciada . pela evidencia que indica que os gangllósidos do cérebro de £bovinos e os fosfolípidi respostas c elulares a factores neuronofróficos in mnlto provauelmente in vivo.

los do cérebro de bovinos potenciam as o e

À Tabela seguinte resume o efeito de

ΤΑΒΕΣΛΑ2

Senaínel absorção -DA fmol 15 mins a BZT de ³Hplaca

Sensível a DABA absorção de ^C-GABA pmol/placa 15 mins h Albumina

F (Albumina + xtracto da extracto d· estrias + ♦^GMi

29,51 69,14 í

104,68 í

140,58 5,78

3,38

7,60

17,82

0,56

1,04

2,41

0,14

0,05

Ο, 27

4,56 - 0,10 || Cultivaram-se células mesencefálicas

μ. (1 x loVplaca) num meio isento de soro que continha albumif na (15 ug/ml) ou extracto estriatal (15 ug/ml), sozinho ou em / presença de 10^-7 M de GM^. Realizaram-se estudos de absorção - ao quarto dia de acordo com os métodos referidos na secção

Ulc. Os valores médios são os valores da média - desvio padrão de análises em triplicado·

extracto de estrias de bovino foi .' lo oomo se referidu anteriormente (ver secção Illa) ·

L.

A formulação de composições farmaceuti8 contendo a molécula de SDNF derivada de cérebro de mamíb/· -b. ..π·.· j ro# descrita a este respeito sem e possivelmente também com gangllosIdos e fosfolípidos, incluiu os métodos conhecidos para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis opriadas para a administração efectiva ao paciente, por meio qual se combina uma quantidade efectiva da molécula de

SDNF era miaturaa com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os veículos aceitáveis e a sua formulaincluindo outras proteínas são descritos, por exemplo, . no livro Remington'3 Pharmaceutical Sciences (Remington’» Riarmaceutlcal Sciences, Mack Publiahing Conrpany, Easton, Estados Unidos da América, 1985). E_stes veículos incluem formulações de depósito injectáveis.

Ρθο f

Com base no qu^ se refere acima, a formulação farmacêutica inclui, embora não exclusivamente, soluções de SDNF ou um pó liofilizado de EDNT em associação com um ou maia veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis • estava contida em meios tamponizados com um valor apropriado âe pH e iso-oemético com os fluídos fisio^isos.

U : A'

A Tabela 3, mais adiante, mostra, com fins apenas ilustrativos e sem quaisquer efeitos limitativos, as composições possíveis de formulações que podem ser preparadas sob a forma de soluções para o tratamento de perturbações do sistema nervoso. No caso das preparações liofilizadas, podem usar*-se excipientes de suporte, tais como, mas não c^jclusivamente, manitol ou glicina e as soluções tamponizadas apropriadas com o volume pretendido serão proporcionadas de irem-se soluções tamponizadas isotónicas adequadas »retendido. Também se podem usar soluções semelhani composições farmacêuticas da molécula de SDNF em iotónicas com o volume pretendido e incluem, mas vamente, o uso de soluções salinas tamponizadas com fosfato ou citrato, a concentrações apropriadas, de modo a obter-se em todos os casos preparações farmacêuticas isoti^:'-77 ·:- -7,tónicas com o pH pretendido, por exemplo, o pH neutro.

soluções i* não «xcluai ¹

Igualmente com finalidades ilustrativas, as Tabelas 4A e 4B referem algumas composições farmacêuticas possíveis para o tratamento de perturbações do sistema K i>·;· “ ·;--Ι^!ν· 3-y, nervoso. Aã composições farmacêuticas indicad as nas Tabelas 4A e 4B são preparações com dois frascos por dose individual, . h

Itável, tal como glicina ou manitol. O segundo frasco coni um dissolvente preparado com o volume pretendido de solui salina tamponizada com fosfato ou citrato. Os conteúdos í dois frascos são misturados imediatamente antes da admi^Jamente para se obter a solução injectável. A T_abela 4B também apresenta um exemplo possível de uma composição farmaceutica para injeoções subcutâneas (Sistema Número 5).

í -.-í’

Cluem, mas sem serem limitadas pelos mesmos, supositórios isto e» solúvel em água, auto-emulsionável de glico-gela-

para finalidades ilustrativas, de preparações para supositoΙ/Ι'ΙφΒ. possífels para o tratamento de perturbações do sistema L nervoso.

·· |r Além disso, as preparações farmacêuticas , de SDNF quer sob a forma liofilizada quer sob a forma de soρβά·|| incluir fos foi ípidos ou gangllósidos como se desL.....creveu aci||a em doses efecti^ás, Por exemplo, as doses podem

[.....ser (se bem que não exclusivamente) semelhantes às geralmente | «íÉía·· «λ para o tratamento de reparações nervosas ou

. perturbações devidas ao envelhecimento, respectivamente, e podem depender da via de administração.

- 31 - 31 -

A dosagem das preparações farmacêuticas \ de SUWF e os tempos de administração dependem do efeito pretendido (determinado por ensaios clínicos) e a via de admnis’P®< exemplo, a dosagem e o número de administração por ₍ 4ia podem ser semelhantes (muito embora não exclusivamente)

As vulgarmgnte utilizadas em estudos com outros agentes neuroÓotróflcos, tais como NGF.

TABELA 3

Sxemplos de Composições Farigaceuticag para SnluçSea Ini ectáveia . 1

Um* ampola de 2 mililitros contém:

Substância activa _Λ Cloreto de sódio

Tampão de citrato de pH - 7 com água destilada apirogénica q.b.

(500 TU) mg ml ' Una ampola de 2 mililitros contém:

; Substância activa _xug

Cloreto de sódio mg . Τ,ηρ&ο da olorldrato de pH « 7 ml ' com água destilada apirogénica q.b.

100 (10 000 TU)

A unidade t&ófica (TU) e definida como na

T_abela

1.

TABELA 4A

Exemplos de Sistemas deComposições Farmacêuticas

SISTEMA NS 1

a)	Um frasco de 2 ml	contém:
	Substância activa	liofilizada	7^	5(500 TU)
	Glicina			mg	30
b)	Um frasco de 2 ml	de	dissolvente	contém:
	Cloreto de sódio			mg	16
	Tampão de citrato	em	água	ml	2

Água destilada apirogénica g.b.

SISTEMA N2 2

a)	Um frasco de 2 ml	contém:
	Substância activa	liofilizada	/ig	5 (500 TU)
	Manitol		mg	40
b)	Um frasco de 2 ml	de dissolvente	contém:
	Cloreto de sódio		mg	16
	Tampão de citrato	em água	ml	2

água destilada apirogénica g.b.

SISTEMA NS 3

a)	Um frasco de 3 ml contém:
	Substância activa	liofilizada:		100 (10 000
	Glicina		mg	45

b) Um frasco de 3 ml ôe dissolvente contém;

Cloreto de sódio

Tampão de citrato em água

mg ml

Água destilada apirogénica q.b.

A unidade trófica (TU) é definida com-o na Tabela 1.

TABEXjA 4B

Exemplos de Sistemas de Composições Farmacêuticas

SISTEMA NS 4

a) Um frasco.de 3 ml contém Substância activada liofilizada jag 100(10 000 TU)

Manitol mg 60

b) Um frasco de 3. ml de dissolvente contém;

Cloreto de sódio mg 24

Tampão de citrato em água ml 3

Água destilada apirogénica q.b.

SISTEMA Ns 5 (Exemplo de composição para injecção subcutânea)

a) Um frasco de 2 ml contém;

Suostância activa liofilizada pg 10 (1 000 TU)

Glicina mg 30

b) Um frasco de 2 ml de dissolvente, contém.:

Cloreto de sódio mg 16

Tampão de citrato em água ml 2 água destilada apirogénico q.b.

A unidade trófica (TU) é definida como na Tabela 1.

TABELA 5

Exemplos de Composições Farmacêuticas com a

Forma de Supositórios para Administração por

Via Rectal

PREPARAÇÃO N2 1

Substância activa

Manteiga de cacau

PREPARAÇÃO N2 2

Substância activa

Carbowax 1540

C^rbowax 6000

FREPARAÇÃO M2 3

Substância activa Tween 61 Lanolina

PREPARAÇÃO N2 4

Substância activa Glicerina

Água

Gelatina

A unidade trófica (TU) ;ig 100 (10000 TU) g 2,5 yg loo (lo ooo tu) g 1,75 g 0,75 ug loo (lo ooo tu) / g 2,125 g o, 25 /ig 100 (10 000 TU) g 1,5 g 0,75 g 0,25 ó definida como na Tabela 1.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   Processo para a preparação dum novo factor neuronotrófico que é uma proteína básica tendo um peso polecular igual a cerca de 14 400 dalton, caracterizado por compreender as fases que consistem em

   a) se homogeneizar tecido de cérebro de um mamífero,

   b) se precipitar com ácido o homogeneizado assim produzido,

   c) se submeter a diálise o sobrenadante resulante com uma membrana de diálise que tem uma restrição de peso molecular entre 5 e 10 quilodalton e

   d) se fraccional por cromatografia o srbrenadante dialisado de maneira a separar os componentes do sobrenadante de acordo com o peso molecular.

   - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda operação que consiste em e) se purificar as fracções neuronotroficamente activas assim obtidas por cromatografia de permuta de catiões com um gradiente de tampão de acetato de amónio.

   - 33 _

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o tecido de cérebro de mamífero ser tecido de cérebro bovino.

   36 <

   ; -ΐί...-^.....·λ<- · · .......

   -4â -

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se submeter às referidas fases do processo núcleos caudatos de cérebros bovinos.

   -5ã -

   Processo de acordo com a reivindicação

   1, caracterizado pelo facto de a fase b) se realizar a um pH compreendido entre 4 e 5.

   -6â -

   Processo de acordo com a reivindicação

   1, caracterizado pelo facto de a operação de fraccionamento cromatográfico d) se realizar com um peneiro molecular com um agente eluente tamponizado diluído com uma concentração de 10 mM a 30 mM.

   - 7â -

   Processo de acordo com a reivindicação

   6, caracterizado pelo facto de o fraccionamento se realizar usando uma fase estacionária com uma gama de fraccionamento de entre 5 000 e 150 000 dalton.

   - 8ã -

   Processo de acordo com a reivindicação
2. 2, caracterizado pelo facto de as fracçoes neuronotroficamente activas serem eluídas da coluna de cromatografia de permuta de catiões com um gradiente de tampão de acetato de amónio ten. do uma concentração desde 0,1 M até 1 M e um valor de pH desde

   6 até 7

   - 93 _

   Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se efectuar as operações do processo a uma temperatura desde 0^o até 6°c.

   - 10 a -

   Processo de acordo com as reivindicações

   1 ou 2, caracterizado pelo facto de se reunir as fracções neuronotroficamente activas e se liofilizar a mistura.

   - lia Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de o factor neuro notrofico obtido ser uma proteína básica tendo um peso molecular de cerca de 14 000 dalton.

   - 12â -

   Processo de acordo com a reivindicação

   11, caracterizado pelo facto de a referida proteína ter um ponto de isoeléctrico de cerca de 10.

   - 13a -

   Processo de acordo com a reivindicação

   11, caracterizado pelo facto de o factor neuronotrófico obtido ter uma actividade específica de, pelo menos, cerca de 0,01 ng/unidade trófica, em que a mencionada unidade trófica é a

   38 concentração de proteína (ug/ml) que favorece a sobreviência de metade do número máximo de neurões sobreviventes em resposta à concentração saturante do material activo.

   - I4â -

   Processo de acordo com a reivindicação

   11, caracterizado pelo facto de o factor neuronotrófico obtido ser uma proteína básica derivada do núcleo caudato do cérebro de mamíferos tendo actividade neuronotrófica e um peso molecular de cerca 14 400 dalton.

   - 15- -

   Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o factor neuronotrófico obtido ter um ponto isoeléctrico igual a cerca de 10.

   - 16« _

   Pr°^GeSí3° cie acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o factor neuronotrófico obtido ser capaz de aumentar a sobrevivência e diferenciação de células de neurónios.

   - 178 _

   Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade neurotroficamente activa de um facto neuronotrófico, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, num excipiente ou numa mistura veicular diluente farmaceuticamente aceitáveis.

   18^

   Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se ad cionar pelo menos um gangliosido ou pelo menos um fosfolípido.

   A requerente declara que os primeiros pedi-dos desta patente foram apresentados na Itália em 7 de Agosto de 1986 e em 23 de Dezembro de 1986, sob os n2s. 4837O-A/86 e 48782-A/86, respectivamente.