PT101051A - Uso de nt-3, de anticorpo neutralizante anti-nt-3 e de molecula de ribozima ou anti-sentido no fabrico de um medicamento para o tratamento de desordens do sistema nervoso e processo de analise relacionados com nt-3 - Google Patents

Description

74 584 6526-080-118 MEMÓRIA DESCRITIVA 'o' 1. Introdução 0 presente invento refere-se à neurotrofina-3 (NT-3), um membro da família dos genes NGF/BDNF/NT-3/NT-4, e a métodos terapêuticos e de diagnóstico que utilizam a neurotrofina-3 no tratamento de distúrbios neurológicos. 2. Antecedentes do Invento

Os factores neurotroficos desempenham um papel importante tanto no desenvolvimento como na manutenção do sistema nervoso dos vertebrados onde apoiam a sobrevivência e a diferenciação neuronal. A morte difundida das células neuronais acompanha o desenvolvimento normal dos sistemas nervosos central e periférico e, aparentemente, desempenha um papel crucial na regulação do número de neurónios projectados para um dado campo alvo (Berg, D.K.f 1982, Neuronal Development 297-331; Cowan et al., 1984, Science 225:1258-1265). Estudos de ablação e de transplante de tecidos periféricos alvo, durante o desenvolvimento, mostraram que a morte das células neuronais resulta da competição, entre neurónios, por quantidades limitantes de factores neurotróficos produzidos nos seus campos de projecção.

Foi identificada uma família de factores neurotróficos que inclui o factor de crescimento do nervo β (NGF), o factor neurotrofico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3, também conhecida como factor neurotrofico derivado do hipocampo, HDNF) e a neurotrofina-4 (NT-4). 0 factor de crescimento do nervo (NGF) é de longe o factor neurotrófico melhor caracterizado (Levi-Montalcini e Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534-569; Thoenen e Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284-1335). A verificação de que a glândula submaxilar do ratinho macho é uma fonte rica de NGF, permitiu a purificação e a análise sequencial de aminoácidos do NGF de ratinho (Angeletti et al., 1973, Biochemistry 12.:100-115) bem como a análise da sequência

74 584 6526-080-118 -2- do ADN do NGF do ratinho e do Homem (Scott et al., 1983, Nature 302:538-540; Ullrich, et al., 1983, Nature 303.:821-825). A comparação do NGF do ratinho com o do homem, mostrou que a proteína encontra-se conservada nos animais e, em apoio disto, foram isoladas, de várias espécies, actividades do tipo NGF (Harper e Thoenen, 1981, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 21.:205-229). Depois disso foram determinadas sequências de ADN do NGF no touro (Meier, et al., 1986, EMBO J. 5.:1489-1493); no pinto (Meir, et al., 1986, EMBO J. 5.:1489-1493? Ebendal et al., 1986, EMBO J. 5.: 1483-1487; Wion et al., 1986, FEBS Letters 203:83-86); na cobra (Selby, et al., 1987, J. Neurosci. Res. 18:293-298); na ratazana (Whittemore, et al., 1988, J. Neurosci. Res. 20.:403-410); e na cobaia (Schwartz, et al., 1989, Neuro-chem. 52:1203-1209). 0 factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) foi primeiro isolado a partir do cérebro do porco (Barde et al., 1982, EMBO J. 1.:549-553) e mais tarde clonado como um ADNc a partir deste tecido (Leibrock et al., 1989, Nature 341:149-152; pedido PCT número PCT/US90/04915, apresentado em 29 de Agosto de 1990). 0 gene para a NT-3, que apresenta semelhanças estruturais com o NGF e com o BDNF, foi isolado a partir do ratinho (Hohn, et al., 1990, Nature 344:339-341); da ratazana (Maisonpierre, et al., 1990, Science 247:1446-1451; Ernfors et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87.:5454-5458), e do homem (Rosenthal, et al., 1990, Neuron 4:767-773; pedido PCT N= PCT/US90/04916, apresentado em 29 de Agosto de 1990, Publicação Na W091/03569; Maisonpierre et al., 1991, Genomics 10:558-568)♦

Os três factores apresentam entre si uma semelhança de aminoácidos de aproximadamente 55%, e a maior parte das diferenças entre sequências apresentam-se em cinco regiões que contêm motivos de aminoácidos característicos de cada proteína.

Todos os três factores são expressos em conjuntos específicos de neurónios no cérebro? os níveis mais elevados de -3- 74 584 6526-080-118 ^ <r ARNm, para todos os três factores, foram observados no hipocampo (Ayer-LeLievre# et al., 1988, Science 240:1339-1341; Ernfors et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87.:5454-5458; Ernfors, et al., 1990, Neuron 5.:511-526; Whetmore, et al., 1991, Neurol. 109:141-152; Hofer et al., 1990. EMBO J. 9:2459-2464; Phillips et al., 1990, Science 250:290-294. A localização do ARNm de NT-3 por análise por transferência de Northern ou por hibridação in situ. revela uma distribuição heterogénea, com níveis elevados no coração, baço, pele, intestinos, cérebro, pulmão, fígado e músculo (Hohn et al., 1990, Nature 344:339-341; Ernfors et al., 1990, Neuron 5.:511-526; Maisonpierre, et al., 1990, Neuron 5,:501-509; Maisonpierre et al., 1990, Science 247:1446-1451). 0 NGF, o BDNF e a NT-3 apoiam o crescimento de conjuntos, tanto sobrepostos como únicos, de populações neuronais, o que foi medido in vitro em gânglios explantados de pintos ou em culturas neuronais dissociadas (Hohn et al., 1990, Nature 344:339-341; Maisonpierre, et al., 1990, Science 247:1446-1451; Ernfors, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5454-5458; Rosenthal, et al., 1990, Neuron 4.:767-773). O NGF apoia o desenvolvimento e a manutenção dos neurónios sensoriais derivados da cristã neural e do simpático periférico (revisto por Thoenen e Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284-1325; Levi-Montalcini, 1987, Science 237:1154-1162). Verificou-se que o BDNF apoia a sobrevivência de neurónios sensoriais derivados da cristã neural como dos placódios (Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-262). Verificou-se que, no cérebro, o NGF apoia os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal (revisto por Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res., 434:439-464; Thoenen, et al., 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105:145-178; Ebendal, 1989 , Prog. Growth Factor Res. 1.:143-159) e verificou-se que o BDNF estimula a sobrevivência destes neurónios in vitro (Alderson, et al., 1990, Neuron .5.:297-306). Verificou-se que a NT-3 apoia o crescimento e a sobrevivência de certos subconjuntos de neurónios centrais e periféricos (Maisonpierre, et al., 1990, Neuron 5.:501-509; Maisonpierre, et al., 1990, Science 247:1446-1451; Rosenthal, et al., 1990, Neuron 4.: 767-773; Hohn, et al., 1990, Nature 344:339-341). 74 584 6526-080-118 4

Os efeitos das três proteínas são mediados pela sua interacção com receptores específicos presentes nas células sensitivas. Os membros trkA, trkB e trkC das tirosina-proteína--cinases foram identificados como receptores, respectivamente, do NGF, BDNF e de NT-3 (trkA: Kaplan, et al., 1991, Nature 350:158-160: Klein, et al., 1991, Cell 65.: 189-197); (trkB: Klein, et al., 1989, EMBO J. 8.:3701-3709: Squinto, et al., Cell 65:885-893); e (trkC: Lamballe, et al., 1991, Cell 66:967-979). A existência de proteína-cinases trk que servem preferencialmente como receptores de alta afinidade para o NGF, BDNF e NT-3, respectivamente, indica distribuições no cérebro únicas, até agora desconhecidas, de locais de ligação de elevada afinidade para estes três factores neurotróficos. Ainda que a ligação de [·*·25Ι]ΝΤ-3 a fibroblastos 3T3 transfectados com trkC seja altamente específica e associada a estas células com afinidades altas e baixas (Lamballe, et al., 1991, Cell 66.:967-979), não havia informação disponível, antes do presente invento, que se referisse aos locais de ligação de [125I]NT-3 no cérebro ou em outros tecidos dos mamíferos. 3. Sumário do Invento O presente invento refere-se a processos de diagnóstico e de tratamento de distúrbios neurológicos que envolvem as células-alvo de NT-3. Descrevem-se os padrões de expressão in vivo de NT-3 e a distribuição de locais de ligação de receptores deslocáveis específicos dos tecidos para a NT-3, em mamíferos. O invento baseia-se, em parte, na verificação de que existem elevadas densidades de ligação dos receptores de NT-3, em secções do cérebro dos mamíferos no núcleo anterior do bulbo olfactivo, na camada 1 do neocórtex, no núcleo do tracto olfactivo lateral, na fáscia dentada, em CAI, CA3 e CA4 do hipocampo e no putâmen caudado. Existem densidades de ligação, moderadas a baixas, ao receptor de NT, no neocórtex, nucleus accumbens, medula cinzenta, amígdala basolateral, núcleo interpeduncular, colículo superior, septo médio e cerebelo. 0 invento baseia-se ainda na verificação de que o ARNm que ii, -5- 74 584 6526-080-118 codifica o receptor de NT-3, trkc, é expresso no corpo éstriadõ' ("striatum"). Os estados patológicos que envolvem estas regiões que apresentam níveis elevados de expressão de NT-3 e/ou densidade moderada a alta de receptores de NT-3 podem ser diagnosticados ou tratados de acordo com o invento.

Como o corpo estriado é uma área do cérebro envolvida num certo número de distúrbios neurológicos, incluindo a corea de Huntington, em concretizações particulares o presente invento proporciona processos de diagnóstico e de tratamento de distúrbios do corpo estriado que utilizam NT-3, fragmentos de NT-3, derivados de NT-3 ou anticorpos que se liguem à NT-3 ou aos receptores de NT-3. O invento baseia-se também na verificação de que a NT-3 é transportada retrogradamente por certos neurónios sensoriais bem como por neurónios do hipocampo e do neoestriado. Assim, o presente invento, em concretizações particulares, proporciona processos de diagnóstico e de tratamento de distúrbios dos neurónios sensoriais, do hipocampo e do neoestriado que utilizam NT-3, fragmentos de NT-3, derivados de NT-3 ou anticorpos que se liguem à NT-3 ou receptores de NT-3.

Nas aplicações de diagnóstico, podem, por exemplo, ser marcados NT-3, fragmentos de NT-3, derivados de NT-3 ou anticorpos que se ligam especificamente aos receptores de NT-3 e utilizados num protocolo de formação de imagem ("imaging") para localizar células e tecidos no corpo, que expressem o receptor de NT-3 in vivo. Os anticorpos anti-NT-3 podem igualmente ser utilizados para representar a ligação natural de NT-3 à superfície daquelas células alvo. Os padrões de expressão aberrante obtidos pelo uso destas técnicas, podem ser analisados para diagnóstico de estados patológicos.

Para aplicações terapêuticas, as composições de NT-3 ou anticorpos anti-NT-3 podem ser usados para potenciar ou para bloquear o efeito biológico da NT-3 sobre as células e tecidos alvo in vivo. As doenças específicas que podem ser 74 584 6526-080-118 -6-

diagnosticadas e/ou tratadas de acordo com o invento, estão aqui descritas. 4. Descrição das Ficruras FIGURA 1. Quantidades de [125I]NT-3 ligada a secções horizontais do cérebro de ratazana, durante os ensaios de associação e dissociação de ligação. Cada valor é a média ± e.m.p. fmol de NT-3 ligada por mg de proteína, calculado a partir de dpm por secção de cada 4 animais. (Ao alto) Associação de 200 pM de [125I]NT-3 em sete tempos de incubação. A 300 nM de NT-3 definiu-se uma ligação não deslocável e as secções foram lavadas durante 1 h após incubação. NSB = ligação não específica. SB = ligação específica. (Em baixo) Após 3,5 h de associação em equilíbrio com 200 pM de [125I]NT-3, as secções marcadas foram lavadas durante 5 segundos e colocadas em 70 ml de PBS que continha 200 nM de NT-3. FIGURA 2. (À esquerda) Associação em equilíbrio de ligação total, não específica e específica de [125I]NT-3 a secções horizontais de cérebro (n = 4 secções/ponto). (à direita) Gráfico de ligação versus B/F dos dados de ligação específica na figura adjacente. As duas populações de locais de ligação específica de [125I]NT-3 estão representadas pelas duas funções lineares. Os valores de afinidade e de capacidade para estas curvas separadas e para a curva completa estão dados na Tabela 1. FIGURA 3. Inibição da ligação de [125I]NT-3 a secções horizontais da cérebro pela NT-3 (IC50 = 420 ± 60 pM; nH = 1,2 ± 0,26) e BDNF (IC50 = 230 ± 100 pM para uma gama de 10 - 1000 pM de BDNF; nH = 0,76 ± 0,18; IC50 = 37 ± 2,9 nM para uma gama de 0,2 - 100 nM de BDNF) mas apenas pelo NGF ou CNTF do murino (ic50 > 100 nM. n = 4 secções do cérebro/ponto; e.m.p. = ± 5-20% a cada concentração. FIGURA 4. Incubaram-se secções coronais e horizontais do cérebro da ratazana, em 300 pM de [125I]NT-3 sozinhas ou com 300

74 584 6526-080-118 -7-nM de NT-3, para definir ligações não deslocáveis em secções adjacentes. Note-se os elevados níveis de ligação deslocável na fáscia dentada, nas camadas piramidais CA do hipocampo, no putâmen caudado e no neocórtex superficial. FIGURA 5. Incubaram-se secções coronais do cérebro do gato adulto, em 300 pM de [125I]NT-3 sozinhas ou com 300 nM de NT-3 para definir as ligações não deslocáveis em secções adjacentes. Note-se a semelhança de ligações com as observadas na ratazana, indicadas na Figura 4. FIGURA 6. Obtiveram-se secções horizontais através dos gânglios basais de dois seres humanos adultos e incubaram-se em [125I]NT-3 sozinha ou com 300 nM de NT-3, como nas Figuras 4 e 5. No núcleo caudado, no putâmen, no neocórtex e no claustrum esteve presente uma marcação intensa e altamente deslocável. FIGURA 7. Análise por transferência de Northern de neurónios do hipocampo (faixa A), astrócitos do hipocampo (faixa B) cérebro adulto (faixa C) utilizando sondas marcadas com 32P, específicas para (A) trkA; (B) trkB; (C) trkC. trk A = 2,6 Kb de Fragmento Xhol; trk B = 1,1 Kb de Fragmento Hpa/Sca; trk C = 800 pb de Fragmento Eco RI. FIGURA 8. Análise por transferência de Northern descrevendo o efeito ao longo do tempo de NGF, BDNF e NT-3 sobre a indução de C-FOS. C-FOS = 1,1 Kb de Fragmento Pstl; GAPD4 = 1,25 Kb de Fragmento Pstl. FIGURA 9. Análise por transferência de Northern do trkB no cérebro de ratazana. A banda predominante (seta, aproximadamente de 7,0 até 9,0 Kb) foi medida por varrimento densitométrico, como se mostra na Figura 11. FIGURA 10. Análise por transferência de Northern da expressão de ARNm de trkC no cérebro de ratazana. A banda predominante (seta, aproximadamente a 15 Kb) foi medida por varrimento densitométrico, como se indica na Figura 11.

74 584 6526-080-118 -8- PIGURA 11. Quantificação do transcrito de trkB predominante no desenvolvimento do corpo estriado de ratazana. Para se obterem os resultados usou-se varrimento densitométrico de uma exposição de uma semana de uma transferência de Northern. Os níveis estão padronizados em relação ao cérebro total de ratazana adulta. FIGURA 12. Quantificação do transcrito de trkC predominante no desenvolvimento do corpo estriado de ratazana. Para se obterem resultados usou-se varrimento densitométrico de uma exposição de uma semana de uma transferência de Northern. Os níveis estão padronizados em relação ao cérebro total de ratazana adulta. FIGURA 13. Gráficos de barras mostram a resposta do desenvolvimento máximo de fibras de embrião de pinto E6, E8 e E10 ao NGF, BDNF e NT-3, determinada a partir de curvas de dose-resposta plenas (não indicadas). Barras a branco = NGF; barras a tracejado = BDNF; barras a preto = NT-3. Cada barra é a média ± o e.m.p. de 5 ou mais gânglios a cada nível verificado às 24 h. S, L, T e C são gânglios sacros, lombares, toráxicos e cervicais respectivamente. 0 NGF foi purificado a partir da glândula salivar do ratinho; BDNF e NT-3 eram ambos proteínas recombinantes humanas produzidas e purificadas até à homogeneidade por Amgen inc. (obtidas junto do Dr. James Miller). FIGURA 14. Curvas de dose-resposta, indicando a sobrevivência de neurónios DRG lombares ou toráxicos, de embriões de pintos E8, cultivados durante 48 h com NGF, BDNF ou NT-3. Eixo horizontal = concentração do factor neurotrófico (ng/ml); eixo vertical = % de células portadoras de neurite. FIGURA 15. Indução, in vitro. dependente da dose, da expressão de C-FOS em culturas de cerebelo dissociado pela neurotrofina-3. FIGURA 16. Indução, in vitro. dependente da dose, da 74 584 6526-080-118 -9- e<t expressão de C-FOS em culturas de cerebelo dissociado pelo factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). FIGURA 17. Indução, in vitro. dependente da dose, da expressão de C-FOS em culturas de cerebelo dissociado pelo factor de crescimento dos nervos (NGF). FIGURA 18. Efeito de NT-3 sobre a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos in vitro. Prepararam-se culturas do mesencéfalo ventral de E14, como se descreveu anteriormente (Hyman, et al., 1991, Nature 350:230-233). Depois de um período de 4 horas de ligação, o meio de cultura foi mudado para o de uma formulação isenta de soro, altura em que se juntou NT-3 recombinante, purificada, humana, às concentrações indicadas. Mantiveram-se as culturas durante 7 dias in vitro e depois processaram-se por imunocitoquímica TH. Cada concentração de NT-3 foi ensaiada em placas em triplicado. FIGURA 19. Efeito de NT-3 sobre a incorporação de dopamina in vitro. Prepararam-se as culturas como na Figura 18. Juntou-se NT-3 recombinante, purificada, humana, na altura da mudança do meio de cultura como se descreveu na Figura 18. Cada concentração de NT-3 foi ensaiada em conjuntos de 5 placas replicadas. Mantiveram-se as culturas durante 7 dias in vitro altura em que foram processadas para medir a incorporação de dopamina de alta afinidade. FIGURA 20. Efeito de NT-3 sobre a incorporação in vitro de GABA. Prepararam-se culturas como na Figura 18. Juntou-se NT-3 recombinante, purificada, humana, às culturas na altura em que se mudou o meio, como atrás se descreveu. Cada concentração de NT-3 foi ensaiada em conjuntos de 5 placas replicadas. Mantiveram-se as culturas in vitro durante 7 dias e depois processaram-se para medir a incorporação de GABA de alta afinidade. FIGURA 21. Efeito de NT-3 sobre a actividade de GAD in vitro. Prepararam-se culturas como na Figura 18. Juntou-se NT-3

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-10- recombinante, purificada, humana, na altura em que se mudaram os meios, como atrás se descreveu. Cada concentração de NT-3 foi ensaiada em conjuntos de 5 placas replicadas. Mantiveram-se as culturas durante 7 dias in vitro e depois processaram-se para medir a actividade de GAD. FIGURA 22. Efeito da concentração da neurotrofina sobre a actividade da colina-acetil-transferase (CAT) em culturas de E17 de neurónios colinérgicos do septo de ratazana. FIGURA 23. Transporte retrógrado de [125I]NT-3 a partir do nervo ciático direito de ratazanas. A NT-3 foi injectada sozinha ou co-injectada com NGF ou com BDNF. FIGURA 24. Transporte retrógrado de NT-3, BDNF e NGF do nervo ciático direito de ratazanas, de controlo e de ratazanas tratadas com piridoxina. FIGURA 25. Transporte de NT-3 e BDNF no segmento L4-L5 da espinal medula de ratazanas, de controlo e de ratazanas tratadas com piridoxina. 5. Descrição Detalhada do Invento 0 presente invento proporciona o uso de moléculas de NT-3 biologicamente activas, em regime de diagnóstico e terapêutico, para detecção e tratamento de distúrbios neurológicos envolvendo células alvo de NT-3. Os processos do invento proporcionam também a inibição ou neutralização da actividade de NT-3, usando anticorpos anti-NT-3, ribozimas ou ARN anti-sentido.

Para aplicações de diagnóstico, a NT-3, os derivados de NT-3, incluindo os seus fragmentos biologicamente activos, ou anticorpos que se ligam aos receptores de NT-3, incluindo anticorpos anti-idiotípicos que mimetizam a NT-3, podem ser usados para representar as células neuronais que expressam os receptores de NT-3. Os padrões aberrantes da expressão dos receptores podem ser analisados para diagnosticar estados

74 584 6526-080-118 -11-patológicos. Com este fim, as composições de NT-3 ou anticorpos que se ligam aos receptores de NT-3, podem ser conjugados a uma marcação pelo rádio, marcação rádio-opaca, flúor, enzima, etc. Estes conjugados podem ser usados in vitro em protocolos de representação apropriados incluindo, sem que tal constitua restrição, varrimentos CAT, raios X, fluorogramas, varrimentos MRI ou PET, etc., para analisar a distribuição, nos tecidos, do receptor de NT-3 in vivo. Podem, analogamente, ser usados anticorpos anti-NT-3 nestes protocolos de formação de imagem para representar a ligação nativa de NT-3 à superfície destas células alvo. Estes conjugados podem também ser usados para identificar os receptores de NT-3 em amostras de biópsia ou de autópsia.

Para aplicações terapêuticas, a NT-3 ou derivados de NT-3, incluindo os seus fragmentos biologicamente activos, podem ser administrados para potenciar o seu efeito biológico sobre um tecido alvo. É geralmente preferível usar produtos de gene de NT-3, derivados da mesma espécie, para fins terapêuticos ou de diagnóstico, ainda que espécies cruzadas de NT-3 possam ser úteis em certas concretizações específicas do invento. Os distúrbios neurológicos, em que o estímulo das células alvo responsivas à NT-3 corrija os distúrbios, podem ser tratados deste modo. Onde se pretenda a inibição de NT-3 podem usar-se anticorpos neutralizantes anti-NT-3 para bloquear os efeitos da NT-3 nativa sobre as células alvo. Em alternativa podem usar-se ribozimas ou ARN anti-sentido para inibir ou bloquear a produção de NT-3 nativa ou podem utilizar-se péptidos antagonistas de NT-3. Podem ser tratados deste modo os distúrbios neurológicos que envolvam a sobreproliferação de células que expressam os receptores de NT-3 e que respondam à NT-3. Estes protocolos podem por exemplo ser usados para tratar tumores neurológicos que expressam os receptores de NT-3 e que proliferam em resposta à NT-3.

De acordo com o invento podem ser tratados vários distúrbios do tecido neurológico que expressam NT-3 e/ou os receptores de NT-3. Quando estão envolvidos nervos periféricos,

74 584 6526-080-118 -12-pode realizar-se um ensaio clínico para determinar se o estado patológico melhora em resposta à aplicação de NT-3 ou à inibição de NT-3. Quando está envolvido o sistema nervoso central ou o cérebro, a eficácia do tratamento pode ser primeiro avaliada num sistema apropriado de modelo animal.

Os distúrbios que envolvem os tecidos neurológicos que expressam a NT-3 e/ou o receptor de NT-3, que podem ser tratados de acordo com o invento incluem sem a tal estar limitado: (i) distúrbios do olfacto e do paladar, tais como a anosmia e disgeusia; (ii) doenças que afectam o córtex entorrinal superficial, a fáscia dentada e as camadas CAI, CA3 e CA4 do hipocampo, incluindo, mas não se limitando à doença de Alzheimer e defeitos da memória resultantes de isquemia global como ocorre nos sobreviventes de paragem cardíaca; (iii) doenças que afectam o neocórtex, incluindo, mas não se limitando à doença de Alzheimer e os defeitos clínicos produzidos por um ataque bem como doenças de demência predominantemente corticais, incluindo, mas não se limitando à doença de Pick, degenerescência ganglionar cortico-basal, e doença difusa cortical do corpo de Lewy e a doença de Jacob-Creuzfeldt e incluindo também distúrbios que envolvem a camada superficial do neocórtex causadas por lesões ou projecções que comprimam ou invadam o cérebro a partir da sua superfície externa, e incluindo, mas não se limitando às consequências do trauma cerebral como p. ex. uma laceração ou contusão, hematoma subdural, hematoma epidural e metastases de tumor; (iv) doenças que afectam o putâmen caudado, incluindo, mas não se limitando à doença de Huntington, coreia-acantocitose, síndromas coreoatetóticos ou distónicos devidos a hipoxia perinatal, bem como a degenerescência estriato-nigral e a paralisia supranuclear progressiva, também chamados "síndromas Parkinson mais" ("Parkinson-plus syndromes"); 74 584

*ϊ 6526-080-118 -13- (ν) distúrbios das populações neuronais dopaminérgicas e GABAérgicas na substância negra, e (vi) distúrbios dos neurónios sensoriais, em particular os neurónios proprioceptivos das regiões cervical ou lombar da espinal medula. 0 invento é descrito em maior detalhe nas subsecções seguintes. 5.1. Produção de NT-3 A NT-3 utilizada de acordo com o invento pode ser preparada por técnicas de ADN recombinante e/ou por métodos químicos de síntese que são já bem conhecidos dos peritos na arte. Estes métodos estão, p. ex. , descritos no pedido de PCT Na PCT/US90/04916, publicação número W091/03569, apresentado em 29 de Agosto, 1990, aqui incorporado na sua totalidade para referência.

Numa concretização preferida, não limitadora do invento, a NT-3 pode ser preparada a partir de células eucarióticas que expressam a NT-3 recombinante do modo seguinte. O meio condicionado pode ser recolhido de um biorreactor (Charles River) semeado com células eucarióticas que expressem a NT-3 e diluído com água destilada a uma razão de cerca de 1,25:1 e pode depois ser carregado, de modo contínuo a 4°C, numa coluna de 15 ml (1,6 cm d.i.), de S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Pode aplicar-se um volume total de cerca de 10,6 1 (diluído) num período de cerca de 5 dias. A coluna pode ser lavada com 50 ml de tampão 20 mM MES (uma solução de ácido 4-morfolinoetanossul-fónico, cujo pH tenha sido ajustado até cerca de 5,8 com NaOH) seguido de 50 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 250 mM, seguido do mesmo tampão MES sem cloreto de sódio, até que a absorvância a 280 nm atinja o nível da linha de base. A coluna pode então ser lavada com cerca de 25 ml de tampão bicine 20 mM a pH 8,5, seguido de 15 ml do mesmo tampão contendo cloreto de sódio 100 mM. A coluna pode depois ser eluída com 150 ml de 74 584 6526-080-118 -14-

cloreto de sódio em gradiente de 100 mM até 750 mM em tampão bicine 20 mM (pH 8,5). É desejável que o caudal seja de cerca de 2,5 ml/min. A absorvância do eluído pode ser controlada a 280 nm, numa escala de sensibilidade de 0,2 unidades de absorvância. As fracções que contêm NT-3 recombinante podem ser identificadas por bioensaio de explante de gânglios da raiz dorsal (DRG). As fracções com a maior actividade específica podem ser combinadas e concentradas até cerca de 2 ml por ultrafiltração por membrana de alta pressão usando membranas tipo 3 KDa Omega. A amostra concentrada pode depois ser aplicada numa coluna de 120 ml (1,6 cm de d.i.) de filtração de gel Sephacryl S-100HR (Pharmacia), cheia e equilibrada com Tampão HEPES 20 mM, pH 7,6, contendo NaCl 400 mM. A coluna pode ser eluída a cerca de 0,25 ml/min. Podem ser recolhidas fracções de 2 ml e avaliadas quanto à actividade de NT-3 no bioensaio de explante DRG. O presente invento também proporciona fragmentos de NT-3 que são antigénicos ou funcionalmente activos. Os fragmentos funcionalmente activos incluem fragmentos de NT-3 que são agonistas de NT-3, bem como fragmentos que são antagonistas de NT-3. Se for desejável suplementar a actividade de NT-3, pode usar-se um fragmento agonista. Se for desejável inibir a actividade de NT-3, pode usar-se um fragmento antagonista. Os fragmentos agonistas compreendem de preferência pelo menos duas ou três pontes de dissulfureto encontradas na molécula nativa de NT-3 e/ou são capazes de alcançar pelo menos cerca de 30%, e de preferência pelo menos cerca de 50%, da actividade de NT-3 intacta, medida nas mesmas condições, p. ex., num ensaio DRG. 5.2. Produção de Anticorpos NT-3

Podem ser usados vários processos conhecidos na arte para produzir anticorpos que se liguem à NT-3 e neutralizem a sua actividade, ou que se liguem ao receptor de NT-3 ou a anti--idiotipos que simulem a NT-3 ou o seu receptor. Um anticorpo que neutraliza a actividade da NT-3 refere-se aqui a um anticorpo que reduz a actividade de NT-3 nativa no ensaio DRG, descrito abaixo, em pelo menos cerca de 30%. Qualquer dos

mas naoestão^ quiméricos, de 74 584 6526-080-118 -15- anticorpos usados de acordo com o invento incluem limitados a fragmentos policlonais, monoclonais, cadeia simples e Fab.

Para produzir anticorpos, um animal hospedeiro deve ser imunizado usando o imunogénio apropriado, formulado num adjuvante, para aumentar a resposta imunitária. Estes adjuvantes incluem/ mas não estão limitados ao de Freund (completo e incompleto), geles minerais como o hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas como a lisolecitina, poliois plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina de lapa do género Fissurella, dinitrofenol, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corvnebacterium oarvum.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando qualquer técnica que permita a produção de moléculas de anticorpo por linhas contínuas de células em cultura. Estas incluem, sem a tal estarem limitadas, a técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature, 256:495-497)? a técnica mais recente de hibridoma de células-B humanas (Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030); a técnica de hibridoma-EBV (Cole et al., 1985, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, pag. 77-96); a produção de anticorpos quiméricos (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA j81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608: Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). Em alternativa, podem ser usados anticorpos de cadeia simples (Patente US Nfi 4 946 778) ou a construção de bibliotecas de expressão Fab (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281\ para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos monoclonais Fab com a pretendida especificidade. Os fragmentos de anticorpo podem também ser preparados a partir de moléculas inteiras de anticorpo usando técnicas conhecidas como a digestão com pepsina e a redução das ligações de dissulfureto. 5.3. Formulação do Ingrediente Activo 0 ingrediente activo, que pode conter NT-3, um seu derivado 74 584 6526-080-118 -16-

ou fragmento biologicamente activo, ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo preparado como acima se descreveu, deverá ser formulado num portador farmacêutico adequado para a administração in vivo por qualquer via apropriada incluindo, mas sem se limitar a injecções (p. ex. intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, endoneural, perineural, intraspinal, intraventricular, intratecal, etc.)/ por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (p. ex., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.); ou por um implante de libertação sustida, incluindo um implante celular ou de tecido.

Dependendo do modo de administração, o ingrediente activo pode ser formulado num portador líquido como a solução salina, incorporado em lipossomas, microcápsulas, preparações poliméricas ou à base de ceras e de libertação controlada, ou formulado em comprimido, pílula ou cápsula. A concentração do ingrediente activo usado na formulação dependerá da dose eficaz requerida e do modo de administração usado. A dose usada deverá ser suficiente para obter concentrações do ingrediente activo no plasma circulante que sejam eficazes. Por exemplo, quando a NT-3 é o ingrediente activo pode usar-se um nível de concentração, no soro circulante, numa gama de cerca de 1 ng/ml até 10 /ig/ml; de preferência numa gama de cerca de 1 ng/ml até 100 ng/ml. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de dose-resposta derivadas de sistemas in vitro ou de teste em modelos animais. 5.4. Tratamento de Distúrbios Neurológicos

Como se demonstra nos exemplos de trabalho aqui descritos, a expressão de NT-3 e a distribuição de receptores de NT-3 ocorrem de modo específico dos tecidos. Os distúrbios neurológicos que envolvem patologias desses tecidos são passíveis para o diagnóstico e/ou tratamento de acordo com o invento. As doenças ou distúrbios que envolvem células do sistema nervoso (incluindo células neurais bem como células de 74 584 6526-080-118 -17-

dos processos do invento. Ocorrem, por exemplo, elevadas densidades de receptores de NT-3 no núcleo anterior do bulbo olfactivo, na camada 1 do neocórtex, no núcleo do tracto lateral olfactivo, na fáscia dentada, em CAI, CA3 e CA4 do hipocampo e no putâmen caudado. Ocorrem densidades entre baixas e médias, de receptores de NT-3 no nucleus accumbens do neocórtex, na medula cinzenta, na amígdala basolateral, no núcleo interpeduncular, no septo médio, no colículo superior e no cerebelo, Os distúrbios que afectam estas regiões podem ser diagnosticadas ou tratadas usando os métodos do invento.

Os distúrbios neurológicos dos tecidos atrás mencionados em que a célula-alvo de NT-3 esteja inadequadamente representada, ou em que as células portadoras de receptores de NT-3 estejam danificadas ou em processo de degenerescência, podem ser tratados pela administração de uma dose eficaz de NT-3, de um derivado de NT-3 incluindo um fragmento agonista de NT-3 biologicamente activo ou um anticorpo anti-idiotípico que mimetiza a ligação e os efeitos biológicos da NT-3. Tal tratamento estimulará o crescimento ou a diferenciação ou a sobrevivência das células alvo. Os distúrbios neurológicos que envolvem a sobreproliferação de células que expressam o receptor de NT-3 e que proliferam em resposta à NT-3, ou que alcançam um fenotipo indesejável em resultado da exposição à NT-3, podem ser tratados inibindo o efeito ou a produção de NT-3 nativa. Isto pode conseguir-se administrando uma dose eficaz de anticorpo anti-NT-3 neutralizante, para inibir o efeito biológico de NT-3; ou por distribuição de ARN anti-sentido ou ribozimas à fonte celular de NT-3 para inibir a produção de NT-3 nativa; ou pela administração de um antagonista de NT-3.

Por exemplo, se os tecidos que respondem à NT-3 tiverem sido danificados ou estejam em processo de degenerescência, pode ser desejável um tratamento que aumente a actividade de NT-3. Para determinar se o tecido responsivo à NT-3 foi danificado, pode usar-se qualquer método conhecido da arte. Por exemplo, se as técnicas de neuro-representação ("neuroimaging") tais como o -18- 74 584 6526-080-118 /'δ ··" .·' . f/fj _ 6 varrimento CAT, MRI, varrimento PET, etc., localizarem danos numa estrutura que mostre ligações com a NT-3, como se mostra na Tabela 2, abaixo, pode iniciar-se um tratamento para aumentar a actividade da NT-3. Os danos a essas estruturas devem porém ser confirmados por outras técnicas incluindo, sem que tal constitua limitação, a biópsia ou com base no exame ou história clínica, EEG, EMG, etc.

Uma diminuição da actividade da NT-3 pode ser desejável em estados que envolvam quer a proliferação quer a sobreactividade de células ou tecidos que são responsivos à NT-3. Estes estados podem incluir p. ex. tumores onde a NT-3 pode ser utilizada em desvio autócrino, ou epilepsias ou certos distúrbios do corpo estriado que estejam associados à produção de movimento involuntário excessivo. No caso dos tumores poderá ser possível identificar um aumento de receptores de NT-3, NT-3 endógena ou responsividade à NT-3 usando técnicas histológicas e/ou de culturas de células; se for determinado aquele estado, pode ser desejável a diminuição da actividade da NT-3.

Nas sub-secções abaixo estão descritas várias doenças ou estados que ocorrem nos tecidos que podem ser tratadas de acordo com o invento. 5.4.1. Distúrbios do Caminho Olfactivo Central

Existe uma elevada densidade de ligação da NT-3 no núcleo anterior do bulbo olfactivo, no núcleo do tracto olfactivo lateral e nos tubérculos olfactivos. A expressão e ligação da NT-3 dentro do caminho olfactivo indicam aplicações terapêuticas não só nos distúrbios do olfacto como também nos receptores do paladar, da língua, filogeneticamente semelhantes. A título de exemplo e não como limitação, a aplicação de quantidades terapêuticas de moléculas de NT-3 biologicamente activas ou, possivelmente, de anticorpos anti-NT-3, pode ajudar no tratamento de distúrbios como a anosmia (ausência de olfacto) ou a disgeusia (distorção do paladar normal). São exemplos de anosmia que podem ser tratados por aplicações terapêuticas da 74 584 6526-080-118 -19- Φ" ·β[

ΝΤ-3, sem que tais exemplos constituam limites ao trã€ma da cabeça (que pode ser devido ao corte de neurónios que atravessam a placa cribriforme bem como a complicações associadas ao processo normal de envelhecimento), esclerose múltipla, doença de Parkinson ou um tumor do lobo frontal. Os exemplos de disgeusia que podem ser tratados por aplicações terapêuticas de NT-3 incluem, sem a tal estarem limitados, a paralisia de Bell, a disautonomia familiar e a esclerose múltipla, bem como as distorções do paladar que surgem com base na disfunção olfactiva. 5.4.2. Distúrbios do Hipotálamo e do Sistema Límbico

Os exemplos abaixo descritos demonstram a expressão e a ligação ao receptor de NT-3 nas porções lateral, intermédia e média do córtex entorino superficial, da fáscia dentada, na camada granulosa de células do hilo da fáscia dentada, bem como nas camadas piramidais CAI, CA3 e CA4 do hipocampo. A expressão e a ligação de NT-3 nesses tecidos distintos do cérebro indicam aplicações terapêuticas que incluem, sem que tal constitua limitação, défices de memória resultantes de isquemia cerebral global que ocorre nos sobreviventes da paragem cardíaca. Além disso, as aplicações terapêuticas de moléculas de NT-3 biologicamente activas podem ser utilizadas no tratamento da doença de Alzheimer. Esta região do cérebro está desde muito cedo envolvida na patologia da doença e há especulações (Saper e German, 1987, Neuroscience 23.:389-398) de que a doença de Alzheimer pode iniciar-se nesta região do cérebro, espalhar-se pelo córtex e hipocampo, e afectar retrogradamente o prosencéfalo basal e outros núcleos do tronco cerebral.

Os exemplos aqui descritos demonstram o efeito de NT-3 no tecido do hipocampo. Utilizou-se um sistema de cultura in vitro do hipocampo de ratazana para mostrar que o tecido do hipocampo (a) expressa trkB e trkC, (b) a NT-3 induz a expressão em FOS de trkB e de trkC, (c) a NT-3 induz expressão em FOS e proteína de neurofilamento e (d) produz um aumento de células AChE-positivas e calbindina-imunopositivas. Uma vez que os pacientes diagnosti- -20- 74 584 r:... . -> /'/ '-'-v________·") 6526-080-118 cados com doença de Parkinson, doença de Huntington e doença de Alzheimer, mostram um acentuado decréscimo nos transcritos de ARNm e na proteína para a calbindina (Iacopino e Christakos, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA {57.:4078-4082), pode usar-se o tratamento com a NT-3 para aumentar a expressão da calbindina nesses pacientes. 5.4.3. O Neocórtex e as Camadas Superficiais do Neocórtex

Os exemplos abaixo descritos demonstram também a expressão e a ligação de NT-3 no neocórtex e nas camadas superficiais do neocórtex. Os distúrbios que envolvem o neocórtex e que ocorrem em várias doenças, podem ser tratados incluindo mas sem estarem limitadas às vítimas de ataque da doença de Alzheimer e nas doenças de demência predominantemente cortical, incluindo mas sem estar limitado à doença de Pick, a degenerescência ganglionar cortico-basal, a doença do corpo de lewy cortical difusa e a doença de Jacob-Creutzfeld. A patologia das vítimas humanas, em contraste com a de outros modelos animais, é que todas as camadas do córtex são predominantemente afectadas, sendo a distribuição regional determinada pelo território do vaso cerebral bloqueado. Na área que rodeia o enfarte há uma zona, por vezes referida como "penumbra isquémica", onde a barreira sangue-cérebro é relativamente pouco estanque e os neurónios são ameaçados, não de sofrer, mas de danos isquémicos fatais. É dentro desta área que a NT-3 biologicamente activa ou derivado ou fragmento peptídico de NT-3, podem agir para minimizar os défices clínicos produzidos pelo ataque.

Um alvo terapêutico específico das camadas superficiais do neocórtex pode ser as lesões ou os processos que comprimam ou invadam o cérebro a partir da sua superfície externa, incluindo mas sem se limitarem às consequências do trauma cerebral, como a laceração ou a contusão, o hematoma subdural, o hematoma epidural e as metastases de tumor.

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74 584 6526-080-118 -21- 5.4.4. O Putâmen Caudado

Os exemplos abaixo descritos demonstram ainda a expressão e a ligação do receptor de NT-3 dentro do putâmen caudado. As aplicações terapêuticas de NT-3 ao putâmen caudado podem ser utilizadas para tratar, p. ex. e não como limitação, a doença de Huntington, a coreia-acantocite, as síndromes de distomias careoatéticas devidas a hipoxia perinatal e a degenerescência estriatonigral e a paralisia supranuclear progressiva. A doença de Huntington é uma doença não tratável, progressiva, dominantemente herdada com 100% de penetração. A doença de Huntington apresenta-se caracteristicamente numa meia vida precoce, depois de ter terminado a parte reprodutiva do ciclo de vida. A patologia da doença de Huntington consiste principalmente na degenerescência dos chamados neurónios "médios espinais" do núcleo caudado e do putâmen. Nota-se degenerescência também noutras áreas do sistema nervoso, incluindo o córtex frontal, tálamo e núcleos profundos do cerebelo. Estas perdas de células resultam em decréscimos das quantidades do aminoácido neurotransmissor GABA, bem como de vários neuropéptidos (revistos por Martin, 1984, Neurology 34.:1059-1072). Os sintomas incluem deterioração do comportamento (distúrbios psiquiátricos incluindo depressão, psicoses esquizofreniformes bem como demência? Mayeux et al., 1986, Ann. Neurol 20.:727-731), movimentos motores involuntários e perda progressiva de coordenação motora incluindo perda eventual da capacidade de falar e de engolir. A doença é uniformemente fatal. Correntemente estima-se existirem mais de 20 000 vitimas da doença de Huntington só nos Estados Unidos. Este número não inclui indivíduos que não estejam sob cuidados médicos por falta de opções de tratamento disponível ou aqueles que transportam o gene mas não manifestam ainda sintomas. 0 gene da doença de Huntington foi localizado na parte distai do cromossoma humano 4p (Gusella et al., 1983, Nature 306:234-238) mas a natureza exacta do produto do gene da doença permanece ainda indeterminado. A possibilidade de dispor de um marcador genético poderia permitir o tratamento da doença antes dos pacientes se

74 584 6526-080-118 -22-tornarem sintomáticos, optimizando-se assim a oportunidade de salvamento pelos factores neurotróficos dos neurónios em degenerescência ou que estão para se degenerar. Observações recentes sugerem que há de facto um padrão progressivo e geográfico para a perda dos neurónios do corpo estriado na doença de Huntington; isto é, o processo da doença não atinge células ao acaso nas áreas afectadas do cérebro, a todo o momento da doença. Assim o tratamento na ocasião de risco ou aos primeiros períodos sintomáticos, poderia suspender o decurso da doença no seu caminho. As observações de Carrasco e Mukherji (1986, Lancet 1:1388-1389) indicam que os indivíduos em risco mas sem sintomas declarados da doença podem já apresentar perda de células até 80% no núcleo caudado e 40% de perda no putâmen. Uma vez que a neurodegenerescência em resultado da doença de Huntington é mais proeminente nos gânglios basais, mais em particular no corpo estriado — área que aqui se demonstra expressar elevados níveis de transcritos de NT-3 e receptores de alta densidade de NT-3 — o tratamento com NT-3 ou com os seus derivados ou fragmentos, biologicamente activos, pode ser usado segundo o invento, para tratar a doença de Huntington. A coreia-acantocitose é um síndroma coreático hereditário de adultos jovens que não têm a grave deterioração intelectual ou os distúrbios de comportamento da doença de Huntington. Alguns pacientes têm ataques epilépticos. Há perda de células neuronais no núcleo caudado e no putâmen. A doença distingue-se pela sua hereditariedade recessiva autossómica, enfraquecimento muscular, grande curvatura nos pés e eritrócitos acantocíticos em esfregaços de sangue periférico. Não há normalmente tratamento para este distúrbio. Contudo, o tratamento terapêutico com NT-3 biologicamente activa, ou um seu derivado ou um fragmento peptídico de NT-3, pode ser eficaz a combater a perda de células neuronais no núcleo caudado e putâmen. O presente invento envolve também aplicações terapêuticas no tratamento de síndromes de distonia coreoatetótica provocada por hipoxia perinatal. Os gânglios basais constituem o principal alvo do dano hipóxico-isquémico perinatal de que resultam os

74 584 6526-080-118 -23-danos neurológicos da "paralisia cerebral". Há três variantes clínicas principais da paralisia cerebral: hemiplegia espasmódica, diplegia espasmódica e "atetose dupla". Nas primeiras duas síndromes a incapacidade deve-se a uma lesão tipo ataque de um ou de ambos os tractos corticospinais descendentes, respectivamente. Na "atetose dupla" os sintomas são na realidade os da coreoatetose distónica bilateral devida à necrose isquémica dos neurónios intrínsecos do núcleo caudado e putâmen. A cicatriz resultante dá a esta região uma aparência malhada em amostras patológicas. Uma vez nos Estados Unidos a maior parte dos nascimentos ocorre nos hospitais e aí se reconhecem os factores de risco do dano cerebral hipóxico, as intervenções agudas devem ser possíveis. Uma administração precoce de NT-3, na altura em que o dano neonatal está em progresso ou em que acaba de ocorrer, pode ter como resultado a salvação de neurónios potencialmente danificáveis neste distúrbio.

As aplicações terapêuticas do invento também incluem o tratamento da degenerescência estriato nigral e a paralisia supranuclear progressiva (Síndrome de Steele-Richardson--Olszewski), que são chamadas "síndromes Parkinson mais", com características clínicas da doença de Parkinson que não respondem à medicação antiparkinson convencional. A razão desta resistência à droga é que os neurónios do putâmen caudado, sobre os quais estas drogas devem agir para exercer os seus efeitos terapêuticos, estão já mortos ou degenerados. Estes distúrbios atingem até 10% dos pacientes nas principais clínicas da doença de Parkinson (Stacy e Jankovic, Neurol. Clin. North America 2.:473-487). Uma administração, realizada cedo, de NT-3 biologicamente activa ou de um derivado ou de um fragmento peptídico de NT-3, está portanto indicada para tratamento. 5.4.5. O Efeito de NT-3 na Sobrevivência e Desenvolvimento da Neurite nos Neurónios Sensoriais

Como se mostra nos exemplos abaixo, a NT-3 promove a sobrevivência da neurite e o seu desenvolvimento ("outgrowth") nos neurónios de culturas de gânglios da raiz dorsal. As

74 584 6526-080-118 -24-culturas in vitro. enriquecidas em gânglios lombares ou cervicais são mais responsivas à NT-3, em relação às culturas in vitro enriquecidas quer com gânglios sacros quer toráxicos de idades semelhantes. Estes resultados indicam que a NT-3 pode actuar preferencialmente sobre neurónios proprioceptivos de fibras grandes, de grande diâmetro, como os que se encontram nos gânglios lombares e cervicais. A NT-3 pode portanto ser útil no tratamento de neuropatias periféricas que afectem estes neurónios sensoriais maiores que ocorrem em pacientes com diabetes ou em pacientes que são submetidos a quimioterapia para tratamento do cancro ou da SIDA (p. ex. taxol, vincristina, cisplatina, didesoxinosina). 5.5. Aolicacões em Diagnóstico

Pode ser usado um certo número de testes de diagnóstico in vitro ou in vivo. que envolvam o ensaio de NT-3 ou dos receptores de NT-3, para ajudar a diagnose e o desenvolvimento de um regime terapêutico. Por exemplo, a NT-3 pode ser ensaiada em vários tecidos de biópsia ou de autópsia, por métodos já conhecidos na arte. Assim, os imunoensaios de anticorpos anti-NT-3 podem ser usados para detectar a expressão da proteína de NT-3. Estes ensaios incluem, mas não se limitam a ELISA, radioimunoensaios, imunoensaios competitivos e não competitivos, imunoensaios de desloção, processos imuno-histológicos, etc. Em alternativa, podem usar-se sondas nucleotídicas que sejam complementares à sequência de NT-3, nos processos de hibridação de ARN, in situ. para detectar a expressão dos transcritos de ARNm de NT-3 na amostra da biópsia ou da autópsia. Estas técnicas podem incluir o uso de PCR (reacção em cadeia de polimerase). As concentrações, nos tecidos, da proteína e dos transcriptos do ARNm de NT-3, podem ser correlacionadas com a doença.

Em alternativa, pode ensaiar-se o receptor de NT-3 em amostras da biópsia ou da autópsia ou in vivo. Com este fim, a NT-3 ou os derivados de NT-3, podem ser modificados para a sua detecção, p. ex., por marcação com um isótopo radioactivo, um

74 584 6526-080-118 -25-composto radio-opaco, um flúor, um enzima, etc. Estes conjugados podem ser usados para a formação de imagem do receptor de NT-3 em amostras da biópsia ou da autópsia in vitro ou para a formação de imagem in vivo. Numa outra concretização, os anticorpos que mimetizam a NT-3 e/ou se ligam aos receptores de NT-3 nas amostras da biópsia ou da autópsia, in vitro ou in vivo podem ser usados para a formação de imagem da distribuição do receptor de NT-3. As técnicas de formação de imagem já bem conhecidas na arte podem ser usadas para este fim, p. ex., o varrimento CAT, raios X, etc. As aberrações na distribuição dos receptores podem ser correlacionadas com a doença. 5.5.1. Diagnose de Distúrbios dos Neurónios Sensoriais

Como se demonstra nos exemplos descritos abaixo, a NT-3 acumula-se preferencialmente nos gânglios lombares e cervicais, fornecendo assim um método de diagnose de distúrbios dos neurónios sensoriais. Uma amostra de biópsia destes neurónios de paciente, pode ser utilizada para determinar o nível de proteína de NT-3 e para comparar com o nível de NT-3 de uma amostra análoga de um indivíduo normal. Uma aberração no nível de NT-3 pode correlacionar-se com a presença de um distúrbio dos neurónios sensoriais. A determinação real do nível de proteína de NT-3 pode realizar-se por um processo que compreenda pôr em contacto uma amostra com um anticorpo anti-NT-3 de modo a que possa ocorrer a ligação imunoespecífica. 5.5.2. Transporte Axonal Retrógrado de NT-3 e Aplicações Terapêuticas e de Diacmóstico

Nos exemplos abaixo descreve-se o transporte axonal retrógrado de NT-3 nos neurónios sensoriais e do sistema nervoso central. Este fenómeno pode ser ensaiado e utilizado para planear terapias eficazes para os distúrbios dos neurónios sensoriais. Com este fim, administra-se a um paciente necessitado de tratamento uma quantidade eficaz de uma proteína, derivado ou factor peptídico de NT-3, para apoiar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação dos neurónios 74 584 6526-080-118 -26 j^Lscr^sm

sensoriais. O transporte retrógrado específico de NT-3 pode ser usado para indicar se os neurónios respondem à NT-3 nos estados normais ou de doença. 0 presente invento proporciona, portanto, um processo de diagnóstico de distúrbios no sistema nervoso periférico relacionados com a NT-3, que compreende injectar uma proteína ou péptido de NT-3, detectavelmente marcado, num nervo periférico e determinar se a proteína ou péptido, marcado, de NT-3 é transportado retrogradamente, processo este em que um falhanço em ser positiva e retrogradamente transportado está correlacionado com falta de responsividade de NT-3 e indica a presença de um distúrbio no sistema nervoso periférico relacionado com a NT-3. 0 presente invento proporciona também um processo para diagnosticar um distúrbio no sistema nervoso central. A avaliação do transporte retrógrado pode realizar-se por qualquer processo já conhecido na arte, incluindo, mas não se limitando a varrimentos MRI, CAT ou por cintilação como abaixo se discute. Estes processos podem ser usados para identificar a localização de uma lesão no sistema nervoso, pois que o transporte retrógrado deverá diminuir substancialmente após atingir a lesão. O invento proporciona ainda conjuntos para esta avaliação retrógrada, que compreende uma proteína, derivado ou fragmento de NT-3, marcado detectavelmente, num recipiente. O marcador pode ser um isótopo radioactivo ou outro marcador conhecido da arte. 0 presente invento também proporciona um processo para tratar distúrbios nos neurónios sensoriais, que compreende a administração, a um doente carenciado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de uma proteína, derivado ou fragmento peptídico de NT-3, capaz de apoiar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação dos neurónios motores, como se demonstrou em sistema de cultura in vitro.

Nas concretizações in vitro. incluindo, mas não se limitando às abaixo descritas, pode ser desejável determinar as 74 584 6526-080-118

-27- •jíiSSBSSQ&b quantidades eficazes de factor neurotrófico numa base caso a caso, pois que os neurónios sensoriais de diferentes fontes de tecidos ou de diferentes espécies podem mostrar diferentes sensibilidades ao factor neurotrófico. Para qualquer cultura em particular, pode ser desejável construir uma curva de dose-resposta que correlacione a concentração do factor neurotrófico com a resposta do neurónio motor. Para avaliar a sobrevivência dos neurónios sensoriais, o seu crescimento e/ou diferenciação, podem-se comparar os neurónios motores expostos a uma proteína, derivado ou fragmento peptídico de NT-3 com os neurónios sensoriais não expostos a uma proteína, derivado ou fragmento peptídico de NT-3, usando, p. ex., corantes vitais para avaliar a sobrevivência, microscopia de contraste de fase e/ou manchas de neurofilamentos, para medir o desenvolvimento da neurite, ou técnicas que meçam a bioactividade de compostos associados aos neurónios motores, como p. ex. a colina-acetiltransferase (CAT) ou quaisquer outros métodos já conhecidos na arte. 6. Exemplo: Locais de Ligação de Alta Afinidade no Cérebro de Ratazan. Gato e Homem 6.1. Materiais e Métodos 6.1.1. Produção e Purificação de NT-3

Produziu-se NT-3 purificada, pelo processo preferido acima descrito na Secção 5.1. Alíquotas de NT-3 foram controladas quanto ao teor em proteína por análise de aminoácidos e quanto a actividade biológica usando o sistema de cultura de explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG), utilizando como padrão NGFmu. 6.1.2. Iodação da NT-3 A NT-3 foi iodada pelo método da lactoperoxidase. A [125l]NT-3 foi marcada até uma actividade específica de 2800--4400 cpm/fmol (1872-2876 Ci/mmole de NT-3) e guardada a uma concentração de 80-100 nM a 2-8°C. A [^-2^I]NT-3 foi usada no

para se evitar o 74 584 6526-080-118 -28- prazo de 1 a 5 dias, em todos os estudos aumento observado de ligações não deslocáveis da [125l]NT-3, que ocorrem após aquele prazo. A actividade biológica da [125I]NT-3 foi também estabelecida com o ensaio de DRG que mostrou que ela era pelo menos tão activa como a sua congénere não marcada. O transporte retrógrado, demonstrável, da [-*-2^I]NT-3 do nervo ciático esmagado até ao gânglio da raiz dorsal que foi especificamente bloqueado pela NT-3 não marcada (DiStefano et al., 1991, Soc. Neurosci. Ab. 17:1121) e as potências indistinguíveis da NT-3 e da [125I]NT-3 no ensaio DRG, indicam ambos que a NT-3 radio-iodada usada era biologicamente activa. 6.1.3. Preparação de Seccões de Cérebro de Ratazana. Gato e Homem

Ratazanas Sprague-Dawley macho (200-250 gramas, Zivic-Miller), mantidos num ciclo de luz:escuridão de 12:12 horas e com acesso ad libitum a comida e água, foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono. Nos primeiros 5 min após morte, o cérebro de cada ratazana foi congelada em isopentano a -15°C e usaram-se estes tecidos para análises de associação, dissociação e de saturação em equilíbrio. Colheram-se séries de secções coronais e horizontais, de 12 /zm de espessura, em intervalos de 0,30-0,50 mm a partir do córtex frontal até à medula, ao nível do núcleo motor dorsal do vagos (secções coronais) ou através dos bulbos olfactivos, putâmen caudado e cerebelo (secções horizontais). As secções foram montadas descongeladas sobre lâminas de vidro de microscópia revestidas com gelatina e armazenadas congeladas até um mês, a -70 °C. 0 cérebro de um gato macho adulto foi seccionado coronalmente a partir do córtex frontal até à medula e colheram-se secções de 22 níveis, como se descrevem para a ratazana. Colheram-se secções de 20 /zm de espessura de um cérebro de homem, através dos gânglios basais e incluíram o caudado,

74 584 6526-080-118 -29- putâmen, neocórtex e feixes de fibras adj acentes. 6.1.4. Ensaios de Ligação da r12^11NT-3

Realizaram-se ensaios de ligação de acordo com o procedimento de Richardson et al. (1986, Neurosci. 20.:23-26) e com as modificações de autorradiografia de película seca da [125I]NGFrh (Altar, et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88.: 281-285).

Depois de descongelar, cada secção foi pré-incubada durante 1 h a 22"C em solução salina tamponada com fosfato 100 mM, pH 7,4, contendo MgC^ 0,5 mM e PMSF 0,5 mM. Observou-se uma ligação equivalente para as secções que foram pré-incubadas durante 1, 3 ou 24 h. As secções foram depois incubadas em meio de cultura de tecidos DMEM contendo elevado teor em glucose, 10% de soro de vitela fetal inactivado pelo calor (70°C durante 0,5 h), tampão HEPES 25 mM, leupeptina 4 μg/ml, PMSF 0,5 mM, (BRL, Gaithersburg, MD, primeiramente dissolvido a 0,1 mg/ml em álcool isopropílico) , MgCl2 0,5 mM e [·*-2^Ι]ΝΤ-3 de 10 pM a 10 mM (análise de saturação em equilíbrio) ou [125I]NT-3 de 200 a 300 pM (em todos os outros ensaios), baseada numa massa molecular dimérica de 26 000. As lâminas que continham secções adjacentes do cérebro foram incubadas nas mesmas soluções com a adição de 300 nM de NT-3 para definir as ligações deslocáveis. Uma gama de concentrações de NGFmu, CNTFh e de BDNF foi usada para competir com a ligação da [125I]NT-3 em diversas experiências. Após incubação, as secções foram lavadas durante 0,5 h em tampão fosfato. Na ausência de excesso de NT-3 não marcada, obtiveram-se quantidades equivalentes de ligações totais e não deslocáveis aos 3 min, 10 min e 2 h de lavagens com tampão não marcado. A associação e dissociação da ligação da [125I]NT-3 300 pm, após 1 h de lavagem (experiência de associação) ou de 3,5 h de incubação (experiência de dissociação), foi também determinada. Após lavagem, as secções foram fixadas durante 10 min em paraformaldeído a 4%, a 22°C, lavadas durante 2 segundos em água

74 584 6526-080-118 -30- a 22°C e secas em 5 min por uma corrente de ar à temperatura ambiente. As secções marcadas e os padrões de radioactividade contendo 125i (Amersham, Inc.) foram expostos à temperatura ambiente durante 2-5 dias ([125I]NT-3) a filme sensível a 125i (Hyperfilm, Amersham, Inc.). 6.1.5. Análise de Dados

Após obtenção das autorradiografias, as secções horizontais foram raspadas das lâminas com uma lâmina de barbear, colocadas em tubos de vidro de boro-silicato 12 x 75 mm e contadas quanto ao declínio radioactivo, usando um contador gama. Calcularam-se as determinações cinéticas dos valores de para 4 cérebros usados nas experiências de associação e dissociação (Weiland e Molinoff, 1981, Life Sei. 2£:313-330). As constantes das velocidades de dissociação e associação, em equilíbrio, foram obtidas em condições de pseudo primeira ordem, visto que muito menos do que 10% de ligando livre estava ligado às secções após 3h de incubação. Calcularam-se os valores Kd e Bmax por análise de saturação no equilíbrio, com cada um dos 4 cérebros de acordo com o melhor ajustamento a uma parábola por análise de regressão não linear iterativa (Rodbard e Lewald, 1970, Acta Endocrinol. 147: 79-103). Os valores IC50 foram calculados pelo método de Bliss e James (1966, Biometrics 22, 573-580). Realizaram-se análises estatísticas, para comparações entre grupos, com o teste t de Dunnet seguindo uma análise de variância de uma via. 6.2. Resultados

Em estudos preliminares, verificou-se que concentrações de 40 a 400 pM de [·*-25Ι]ΝΤ-3 marcam optimamente uma população, densa e heterogeneamente distribuída, de locais de ligação nas secções horizontais e coronais do cérebro de ratazana. Esta ligação era deslocada em 70-90% por uma concentração 1000 vezes maior de NT-3, enquanto que se obtiveram níveis de ligação não específica 10-15% mais altos com concentrações de ligando mais altas. Como a ligação era particularmente robusta e deslocável no caudado putâmen, neocórtex e hipocampo, usaram-se as secções

e'.- 74 584 6526-080-118 —31— horizontais que continham estas áreas para subsequentes estudos quantitativos com [125I]NT-3 200-300 pM. A [12^I]NT-3 associou-se e dissociou-se dos seus locais de ligação deslocável nas secções horizontais (n = 4 cérebros) de modo consistente através das regiões do cérebro. A ligação variou de 4-20% (e.m.p.) nos tempos de associação e de 10-25% nos tempos de dissociação. A associação da [125I]NT-3 200 pM aumentou até às 2hf altura em que se atingiu o equilíbrio ao longo do tempo e onde não se obtiveram ligações adicionais durante mais 6 h (Figura 1, topo). A constante da velocidade de associação para a ligação a estas secções foi de 0,0074 x 109 min”1 mole”1. Secções incubadas durante 3,5 h com [125I]NT-3 200 pM, lavadas em tampão contendo NT-3 200 nM durante 2 min a 18 h, revelaram uma dissociação de ligações específicas da [125I]NT-3 a uma velocidade de 19,4 x 10”4 min”1(Figura 1, em baixo). A razão das constantes de dissociação e associação derivadas cineticamente (k^/k-^; Weiland e Molinoff, 1981, Life Sei. 29.:313-330) deu um valor de 227 ± 28 pM para a constante de dissociação média em equilíbrio (¾).

Outras secções horizontais do cérebro, e equilibradas com concentração de [125I]NT-3, variando de 10 pM até 9 nM de [125I]NT-3, revelaram ligação saturável deslocável que era nitidamente bifásica no gráfico da isotérmica de saturação (Figura 2, à esquerda) e no gráfico inverso de B/F (Figura 2, à direita). A saturação nas ligações deslocáveis de 10 a 750 pM permitiu um bom ajustamento dos valores e Bmax por análise de regressão não linear. 0 valor de foi 269 ± 64 e a capacidade de ligação foi de 26 ± 3 fmol/mg de proteína (Tabela 1). Uma segunda gama de concentrações, de 0,75 a 9 nM, revelou uma segunda plataforma de ligação específica o que mostra um local de afinidade mais baixa (Kd = 2,8 ± 0,34 nM) e de maior capacidade (Bmax = 170 ± 14 fmol/mg de proteína (Tabela 1). O valor de Bmax, calculado para toda a gama de 10 pM a 9 nM, foi aproximadamente uma função aditiva dos valores separados de Bmax para os locais de alta e baixa afinidades (Tabela 1), Em contraste, o [125I]NGFrh associou-se mais rapidamente e

74 584 6526-080-118 -32-dissociou-se mais lentamente do que o fez a [125I]NT-3 e ligou--se com uma afinidade de cerca de 4 a 10 vezes maior (Tabela 1). A NT-3 competiu com a [125I]NT-3 300 pM numa população única de locais de ligação (nH = 1,2.± 0,26) com uma IC50 de 420 ± 60 pM (Figura 3). 0 BDNF também competiu com a maior parte das ligações da [125I]NT-3 300 pM mas fê-lo de modo bifásico (valores de IC50 de 230 ± 100 pM; nH = 0,76 ± 0,18; e 37 ± 2,9 nM; nH = 0,94 ± 0,05) (Figura 3). Em contraste, as ligações da [125I]NT-3 não foram evitadas por coincubação tanto com CNTF como NGFmu, ambos até 100 nM.

TABELAI CAPACIDADE E AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE BAIXA E ALTA AFINIDADE DA [125I]NT-3 E [125I]NGFrh

-¾ 269 pM ± 64 2,8 nM ± 0,341 3,0 nM ± 0,281 69 pM ± 9,7 [125I]NT-3 0,0074 X 109 M-1 min-1 19,4 x IO-4 min-1 227 ± 28 pM

Gama de concentrações

[125I]NT-3 10 - 750 pM 0,75 - 10 nM 10 pM - 10 nM

[125I]NGFrh2 (4-294 pM)

Determinações

Cinéticas

Associação

Dissociação k.^

Kd (k^Ai) —Bmax ..(fmol/mq...prot) 26 ± 3 170 ± 151 200 ± 61 9.9 ± 1,8 [125I]NGFrh2 0,066 x 109 M-1 min-1

8.9 x 10"4 min-1 28 ± 11 pM 1

Sei. USA 88:281-285. 2

Valores médios de Altar et al., 1991, Proc. Natl. Acad. 74 584 6526-080-118 33-

Secções horizontais do prosencéfalo de ratazana (n = 4/grupo), como se mostra na figura 4, foram incubadas em 10 pM até 10 nM de [125I]NT-3, com ou sem NT-3 300 nM para definir a ligação não específica. Os valores de Kd e Bmax são calculados como média ± e.m.p. ** p < 0,01 versus ligação de alta afinidade da [125l]NT-3, teste t de student.

As autorradiografias de secções coronais ou de secções horizontais revelaram um padrão de ligação específica da [125I]NT-3 que era nitidamente diferente do observado no [125i]Nqf 30 murino ou do homem (Riopelle, et al., 1987, Neurochem. Res. 12.: 923-928; Richardson, et al., 1986, J. Neurosci. 6.:2312-2321; Ravich e Kreutzberg, 1987, Neurosci. 20:23-36; Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88.:281-285,- Altar et al., 1991, J. Neurosci. 11:828-836). Os níveis de ligação mais elevados foram encontrados nas vias olfactivas (núcleo anterior do bulbo olfactivo, núcleo do tracto lateral olfactivo), no hipocampo (fáscia dentada, CAI, 3 e 4), no putâmen caudado e no neocórtex (Tabela 2). Em particular, a primeira camada do neocórtex encontrava-se distintamente marcada nas regiões frontal, parietal e cingulada. A camada 1 encontrava-se também muito marcada em todo o córtex entorrinal. Estavam presentes níveis intermédios de ligação no nucleus accumbens, na amígdala basolateral, no núcleo interpeduncular, nos cornos ventrais e dorsais da medula espinal e no colículo superior. Quantidades mais pequenas de ligações específicas estiveram presentes no geniculado lateral, septo médio e cerebelo. Não se detectaram ligações deslocáveis em feixes de fibras brancas incluindo o corpo caloso, na comissura anterior, na cápsula interna, na cápsula interna interbulbar ou no globo pálido, na maior parte dos núcleos talâmicos, no hipotálamo ou em outras regiões da ponte, medula ou outros núcleos amigdaloides. Não se encontraram locais de ligação da [125l]NT-3 nos orgãos circum-ventriculares como o plexo coroide ou nas camadas de células ependimais. As ligações específicas estavam também ausentes no fígado, músculos, rins, pâncreas e coração.

74 584 6526-080-118 -34- ΤΑΒΕΙΑ 2

DISTRIBUIÇÃO RELATIVA DOS LOCAIS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA DA

[125i]nt-3 no cérebro de ratazana

Ligação Elevada Núcleo anterior do bulbo olfactivo Núcleo do tracto lateral olfactivo Porções laterais, intermédias e médias do córtex superficial entorrinal Fáscia dentada

Camada piramidal CAI, CA3, CA4 do hipocampo Camada de células granulares do hilo da fáscia dentada Córtices da camada 1, frontal, parietal e cingulada Tubérculo olfactivo

Ligação Média

Neocórtex (camadas 2-6) Núcleo accumbens Caudado putâmen Amígdala basolateral Núcleo interpeduncular Medula cinzenta Colículo superior

Ligação Baixa

Geniculado superior Septo médio Cerebelo

Ligação Não Detectável Globo pálido

Parte compacta ou reticulada da substância negra Lemnisco médio

74 584 6526-080-118 -35- Tálamo Cápsula interna Camada ependimal Plexo coroide Corpo caloso

Comissura anterior interbulbar Paredes do ventrículo Músculo esquelético, fígado, rim, pâncreas, coração

As quantidades relativas de ligação de NT-3 foram avaliadas a partir da avaliação visual de autorradiografias obtidas com [125i]nt—3 300 pM. As ligações não específicas definidas com a NT-3 300 nm mostraram-se uniformes em todas as partes das secções do cérebro e representam apenas 10-20% da quantidade total de ligando ligado. Isto permitiu que as quantidades relativas de ligação específica fossem estimadas a partir das imagens de representação das ligações totais. 6.3. Discussão A autorradiograf ia de receptores com [-*-^^I]NT-3 biologicamente activa revelou que este ligando se liga ao cérebro de ratazana com elevada afinidade, de um modo saturável, reversível e farmacologicamente específico. A distribuição semelhante no cérebro de ratazana, do gato (ver Figura 5) e do homem (ver Figura 6), sugere que este local de ligação heterogénea do cérebro seja, todavia, filogeneticamente conservado. Estes mapas ilustram as regiões do cérebro em que a NT-3 endógena pode funcionar como um factor neurotrófico e fornecem também a base dos estudos, tanto in vitro como in vivo, para avaliar as especificidades neuronais e os alvos terapêuticos da NT-3. Assim, far-se-ão considerações sobre a cinética, farmacologia e localização destes locais.

74 584 6526-080-118 -36- I~|NT-3 aos seus**Locais 6.3.1. Caracteristicas da Ligação da [125 de Alta Afinidade A ligação deslocável da [3NT—3 variava de 60 a 90% da ligação total. A topografia uniforme dos 10-40% de ligação não deslocável representa a associação do marcador, independente do receptor de NT-3, aos diversos componentes dos tecidos incluindo feixes de fibras mielinadas e locais de ligação não específica de proteínas. Contudo, nem os feixes de fibras nem diversas regiões do cérebro se ligam à [125I]NT-3, o que demonstra a selectividade regional deste ligando para locais discretos. Observou-se uma quantidade proporcionalmente maior de ligações não deslocáveis na ligação de [12^I]NGFmu a secções de tecidos (Riopelle, et al., 1987, Neurichem. Res. 2.:928-928; Richardson, et al., 1987, J. Neurosci. 6.:2312-2321), e células de cultura (Landreth e Shooter, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4751--4755; Meakin e Shooter, 1991, Neuron 6.:153-163). 0 decréscimo da ligação não específica de [125I]NGFrh, medida em secções da medula espinal (Jakeman, et al., 1990, Abstract, p. 21. Development and Plasticity of the Spinal Cord, Columbus, OH) e no cérebro (Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. 88,:281-285; Altar, et al., 1991, J. Neurosci. 11:882-836) com os transportadores adicionais de proteína usados actualmente, deve ter contribuído para a elevada especificidade do sinal de NT-3 aqui obtido. Contudo, a ligação da [125I]NT-3 era mais facilmente deslocável na presença de ligando homólogo não marcado (80-90%) do que o obtido com [•L25I]NGFrh (60-85%; Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:281-285: Altar, et al., 1991, J. Neurosci. 11:828-836) em idênticas condições.

0 deslocamento da [125I]NT-3, após a sua associação às secções do cérebro, foi mímimo na ausência de NT-3 não marcada e continuou durante várias horas na presença de um excesso de 1000 vezes de NT-3. Esta exigência de excesso de ligando homólogo para promover a dissociação da ligação de alta afinidade do ligando-neurotrofina já tinha sido relatada para o NGFmu (Sutter et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:5972-5982). NGFrh (Alter, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:281-285), e para o BDNF

74 584 6526-080-118 -37- (Rodriguez-Tebar, et al., 1990, Neuron 4.:487-492). A [-*-2^I]NT-3 Hgou-se a dois sítios diferentes em secções do cérebro de ratazana que eram, cada uma, deslocadas, na sua maior parte por NT-3 300 nM. O local de alta afinidade foi caracterizado rigorosamente porque a sua constante de afinidade 227-269 pM se aproxima das concentrações de 200 a 300 pM usadas para definir a cinética, a farmacologia e a distribuição das ligações da [125I]NT-3, para o cérebro de ratazana, de gato e de Homem. 0 local é ocupado, preferencial e completamente, pela NT-3. É interessante notar que parte da [125I]NT-3 foi deslocada por uma concentração igual de BDNF e nem mesmo por NGF ou CNTF 100 nM. A capacidade da NT-3 e do BDNF, mas não do NGF, de reconhecerem o receptor trkB (Squinto, et al., 1991, Cell 65.:885—893; Kaplan, et al., 1991, Nature 360:158-160: Bothwell, 1991, Cell 65.:915-918) é consistente com o perfil farmacológico da ligação da [-*-2^I]NT-3. A capacidade dos locais de ligação de alta e de baixa afinidade de NT-3 foi de 26 e 170 fmol/mg de proteína, respectivamente. Assim, o local de alta afinidade é pelo menos duas vezes mais denso do que para o NGFrh (Altar, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88.: 281-285; Altar, et al., 1991 J. Neurosci. 11:828-836). Os locais de ligação de alta afinidade para o [125I]BDNF parecem ser ainda mais numerosos e mais ubiquamente localizados do que os do NGF ou da NT-3. 6.3.2. Distribuição dos Locais de Ligação de NT-3 A topografia da ligação da [125I]NT-3 a secções de cérebro de ratazana não se assemelha à distribuição de ligações do [125I]NGFrh a secções semelhantes (Richardson, et al., 1986, J. Neurosci. 6.:2312-2321; Ripopelle, et al., 1987, Neurochem. Res. 12.: 923-928; Ravich e Kreutzberg, 1987, Meurosci. 20:23-36: Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:281-285). Por exemplo, nenhum dos núcleos proeminentes colinérgicos da banda diagonal, do septo médio, do núcleo basal, do núcleo do 58 nervo craniano ou do globo pálido (Kasa, 1986, Nature, 331:261-262)

74 584 6526-080-118 -38- foi marcado pela [125l]NT-3 enquanto que estas árefe sãâ distintamente marcadas com [12^I]NGFrh ou por imunotransferência com o 192 MAb à subunidade de baixa afinidade do receptor de NGF (eg.f Woolf, et al., 1989, Neurosci. 30:143-152; Pioro e Cuello, 1990, Neurosci. 34.:57-87). Algumas áreas do rombencéfalo, que se sabe conterem marcadores colinérgicos, são destituídas de locais de ligação tanto de NGF (Woolf, et al., 1989, Neurosci. 30:143-152) como de NT-3. Estas áreas colinérgicas "pobres em receptores de NT-3/NGF", incluem os núcleos III e IV do nervo craniano, a pedunculopontina ou projecções colinérgicas parabraquiais para o tálamo, hipotálamo e colículo inferior, é'a projecção dos neurónios colinérgicos magnocelulares preópticos para a área tegumental ventral. As projecções colinérgicas (Kasa, 1986, Proc. Neurobiol. 26.:211-272) da banda diagonal para o córtex piriforme, habenula e córtex entorrinal, pobres em receptores de NGF (Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88.:281-285), podem contribuir para as ligações relativamente intensas de NT-3, observadas nestas áreas. Em alternativa, os sistemas glutamatérgico e outros sistemas neurotransmissores no córtex piriforme e entorrinal que se projectam para o hipocampo, podem conter estes locais de ligação de NT-3. A relativa escassez de locais de ligação de NT-3 no cerebelo do adulto está em nítido contraste com a densa marcação do cerebelo pelo [125I]NGF (Cohen-Cory, et al., 1989, Exp. Neurol. 105:104-109: (Altar, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88.:281-285) ou pela imunotransferência para o receptor de NGF (Pioro e Cuello, 1988, Brain Res. 455:182-186; Pioro e Cuello, 1990, Neurosci. 34.:57-87). Ainda que a autorradiografia de emulsão ajude a resolver a presença de locais de ligação de NT-3 nesta e em diversas outras regiões, é evidente que os receptores de NT-3 são relativamente escassos no cerebelo de ratazana adulta e noutras áreas em que os locais de ligação do NGF e a imunotransferência de receptores sejam bastante densos. A camada de células granulares do cerebelo é também a área mais densamente marcada, seguindo, in situ. hibridação com sonda anti-sentido de trkC. 0 forte sinal residual do trkC criado com a sonda de ARNc com sentido de trkC (Lamballe, et al., 1991,

74 584 6526-080-118 -39-

Cell 66.:967-979) ou uma tradução relativamente diminuída da mensagem do trkC para o receptor funcional, são duas explicações possíveis para a presença da mensagem anti-sentido de trkC, mas não para a ligação de NT-3 na camada de células granulares do cerebelo. Todavia, a expressão do trkC é também muito pronunciada no hipocampo, no neocórtex e no neoestriado (Lamballe, et al., 1991, Cell 66.J967-979) e estas áreas foram marcadas com muita intensidade pela [125l]NT-3. Nitidamente, a comparação directa do ARNm do trkC e a ligação da [125I]NT-3 às secções adjacentes do cérebro de ratazana, comprova a semelhança destes dois marcadores. A força da ligação da [125I]NT-3 foi também evidente em secções do cérebro do gato e do homem (ver Figura 5 e Figura 6, respectivamente). É importante notar que a topografia destes locais se assemelha muito com o padrão observado no cérebro de ratazana. Vários aspectos mais subtis da ligação da [125I]NT-3 ao cérebro de ratazana, como, p. ex. , a densa marcação do neocórtex superficial e a ligação uniforme por todo o caudado putâmen encontravam-se conservados no cérebro do gato e do homem. De modo diferente da ratazana, a heterogeneidade das ligações encontrava-se algo diminuída no gato, ainda que isto possa ser uma característica aparente devida a variações mais graduais na ligação observada por todo o cérebro de gato, maior. 7. Exemplo: Efeito Comparativo das Neurotrofinas no Hipocampo de Ratazana Embriónica

Os hipocampos foram dissecados de embriões de ratazanas Sprague-Dawley E16-E18, ou E20, e recolhidos em meio FIO. Os tecidos foram moídos, lavados duas vezes com FIO (Gibco) e trip-sinizados com tripsina a 0,25% (Gibco) durante 20 min a 37eC. A tripsina foi inactivada pela adição de um meio contendo soro, composto de meio essencial mínimo (MEM), suplementado com soro de vitela fetal (FCS, 10%), glutamina (2 mM), penicilina (25 U/ml) e estreptomicina (25 μg/ml). As células dissociadas obtidas por trituração cuidadosa foram recolhidas e centrifugadas a baixa velocidade (500 rpm) durante 30 segundos. A centrifugação

74 584 6526-080-118 -40-foi repetida por 2 vezes e as pelotas de células foram depois ressuspensas em meio contendo soro. Os neurónios do hipocampo foram colocados em placa sobre poliornitina-laminina (10 Mg/ml) em DME mais 10% de soro de vitela fetal. Após 4 h de cultura, o meio foi mudado para DME mais 1 mg/ml BSA e meios de suplemento N2 (Bottenstein, et al., Methods Enzymol. 58.:94-109) e piruvato 1 mM, altura em que se juntou, a cada, a respectiva neurotrofi-na. Os meios foram mudados em cada 3 a 4 dias, com re-adição do factor. 7.2. Resultados e Discussão

Os níveis de ARNm para trkA, trkB e trkC foram examinados nestas culturas. Como se mostra na Figura 7(A), apesar de haver um nível detectável de mensagem trkA no cérebro do adulto, não se detectou ARNm de trkA nem nos neurónios do hipocampo nem nos astrócitos. Os níveis de ARNm para trkB e para trkC nas culturas do hipocampo foram comparáveis aos observados no cérebro do adulto, Figura 7(B) e 7(C), mas estiveram ausentes nos astrócitos. A presença de trkB e C, mas não de trkA nestes neurónios do hipocampo, correlaciona-se bem com o facto destas células responderem ao BDNF e à NT-3 mas não ao NGF.

Os efeitos das neurotrofinas sobre a indução de um dos genes precocemente imediatos (fos) foram examinados (Figura 8). A indução de ARNm fos pelo BDNF e NT-3 teve um máximo a cerca de 1 h, seguido de uma indução de proteína de fos que teve um máximo a cerca de 2-3 h e que persistiu durante pelo menos 6 h. Cerca de 40% das células do hipocampo mostraram uma resposta de fos ao BDNF e à NT-3. Os efeitos de BDNF e NT-3 sobre a indução de fos não eram aditivos. Todas as células que mostraram resposta de fos ao BDNF e NT-3 eram neurónios. O manchamento duplo com fos e calbindina mostraram que se encontravam células imunopositivas à calbindina entre a população de células que respondia com indução de fos.

Verificou-se que o BDNF e a NT-3 induziam um aumento (50%) na quantidade de proteína dos neurofilamentos. Produziam também 74 584

6526-080-118 -41-um aumento no número de células positivas a AChE e imunopositivas à calbindina. Em contraste, o NGF não apresentava efeito aparente. Estudos de resposta à dose, do BDNF e NT-3 sobre o número de células imunopositivas à calbindina, mostraram que a resposta se saturava a cerca de 3 ng/ml. A NT-3 produziu um aumento de 20 x no número de células positivas à calbindina, o que foi acompanhado por um aumento nos níveis de ARNm-calbindina. 0 atraso da adição de NT-3 às culturas durante 4 dias, pareceu não afectar o aumento do número de células positivas à calbindina, o que sugere que a NT-3 actua induzindo o fenotipo-calbindina em vez de actuar como um factòr“dê sobrevivência. Os perfis de desenvolvimento do aumento de células positivas à calbindina produzidas pelo BDNF e NT-3 foram ainda comparados. 0 efeito de NT-3 foi muito mais notável para os neurónios do hipocampo no início do desenvolvimento (E16-E18) e declinou no desenvolvimento ulterior (E20), enquanto que foi observado o efeito inverso com o BDNF. Como se indica resumidamente na Tabela 3, as únicas populações de células que parecem responder tanto ao BDNF como à NT-3 incluem assim as células positivas ao AChE e positivas à calbindina. Outras populações de células examinadas que não parecem responder ao BDNF e NT-3, em termos de sobrevivência, incluem as células GABAérgicas, células glutamatérgicas e células positivas à somatostatina.

Observaram-se decréscimos até 60-80% nos níveis tanto da mensagem como da proteína da calbindina no hipocampo de pacientes que foram diagnosticados como tendo a doença de Parkinson, ou de Huntington ou de Alzheimer (Iacopino e Christakos, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4078-4082). Além disto, mostrou-se recentemente que a presença de calbindina em regiões específicas da formação do hipocampo pode ser correlacionada positivamente com a resistência relativa desses neurónios a danos neuronais induzidos por ataque (Sloviter, J. Comp. Neurol. 290;183-196). Este exemplo mostra que o BDNF e, em maior extensão, a NT-3, foram capazes de induzir a proteína da calbindina nos neurónios do hipocampo. Este aumento da capacidade de ligação de Ca pode ter implicações fisiológicas

74 584 6526-080-118 -42-signif icativas uma vez que pode ser importante na prevenção da morte de células em certas populações seleccionadas de neurónios do hipocampo. TABELA 3

NEURÓNIOS DO HIPOCAMPO TRKA -TRKB + TRKC + + 8. Exemplo: Efeito das Neurotrofinas sobre os Neurónios do Coroo Estriado NGF BDNF NT-: - + + - + + - ++ + — + +++

INDUÇÃO DE FOS NEUROFILAMENTO INCORPORAÇÃO DE GABA CÉLULAS POSITIVAS A GABA INCORPORAÇÃO DE GLUTAMATO CÉLULAS POSITIVAS A AChE CÉLULAS POSITIVAS À CALBINDINA CÉLULAS POSITIVAS A SST VIP-IR 0 efeito das neurotrofinas nos neurónios cultivados do corpo estriado tem interesse para desenvolver um modelo de aplicação terapêutica dirigida à doença de Huntington (acima discutida na Secção 5.1.4.). A doença de Huntington é um estado autossómico dominante que resulta numa neurodegenerescência progressiva, reflectida em defeitos da cognição, do controlo motor e do afecto. A deterioração é mais proeminente nos gânglios basais, particularmente no corpo estriado que parece ser o local do inicio da doença. Este exemplo mostra os níveis de expressão do ARNm, por análise de transferência de Northern, para as neurotrofinas e seus receptores in vivo e in vitro.

74 584 6526-080-118 -43- 8.1. Materiais e Métodos 8.1.1. Dissociação dos Tecidos e Culturas

Dissecaram-se tecidos do cérebro de ratazanas Sprague-Dawley nos seguintes estágios de desenvolvimento: 17 dias embriónicos (E17), 1 dia postnatal (Pl), 7 dias postnatal, 14, 20 e adulto. Os tecidos para análise in vivo foram imediatamente congelados em gelo seco.

Prepararam-se culturas neuronais do corpo estriado a partir de cérebros de ratazana E17 do modo seguinte: o tecido do corpo estriado foi moído em solução de sal equilibrado de Hank, isenta de cálcio e de magnésio e dissociado por tratamento enzimático com tripsina a 0,25% e ADNase (0,2 mg/ml), seguido de trituração mecânica. As células dissociadas foram semeadas, a uma densidade de 8 x 106 células, em placas de 100 mm que tinham sido previamente revestidas com polilisina e laminina. Após uma incubação inicial de 4h num meio composto por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco e 10% de soro de vitela fetal (DME-FCS), o meio foi substituído por meio N2 isento de soro (Bottenstein, et al., 1979, Meth. Enzymol. 58:94-109^.

Prepararam-se culturas de astrócitos do corpo estriado e do hipocampo a partir de cérebros de rato Pl, do modo seguinte: os tecidos foram moídos e dissociados enzimaticamente por tratamento com tripsina a 0,25% e ADNase a 0,2 mg/ml. Após 5 min de centrifugação a baixa velocidade e de 5 min adicionais de centrifugação a 300 rpm, a suspensão de células foi dissociada mecanicamente por trituração. As células foram então passadas por um filtro Nitex e semeadas a uma densidade de 71 000 células/cm2 em frascos de cultura de tecidos T75 em DME-FCS. O meio foi substituído nos dias 1, 3, 5, 7, e 9 após a sementeira. Nos dias 7 e 9, os frascos foram agitados para remover neurónios, macrófagos e células progenitoras 02-A. Os astrócitos foram mudados aos 10 dias in vitro (DIV).

74 584 6526-080-118 -44- 8.1.2. Manchamento Imunocitolóaico

Usou-se o manchamento imunocitoquímico para determinar a pureza das culturas de astrócitos e de neurónios. Usaram-se anticorpos da proteína acida fibrilar glial (específica para astrócitos) e da proteína de neurofilamentos (específica para neurónios), em combinação com outros marcadores específicos dos tipos de células para delinear a composição celular das culturas.

8.1.3. Isolamento do ARN

Preparou-se ARN total a partir de culturas neuronais do corpo estriado (a 4 DIV), de culturas de astrócitos do corpo estriado (a 28 DIV) e de culturas de astrócitos do hipocampo (a 28 DIV), por extracção (Chomczynski e Rougeon, 1980, Anal. Biochem 162:156-159). Preparou-se ARN total a partir de amostras do corpo estriado ou de tecidos do cérebro completo, por extracção em LiCl 0,3 M/ ureia 6 M, seguida de extracção por fenol/clorofórmio (Auffray e Rougeon, 1980, Eur. J. Biochem 107:303-314). Os ARN (10 μg/faixa) foram fraccionados por electroforese em geles de agarose-formalfeído a 1% (Bothwell, et al., 1990, in: Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, pag. 42-43, ed. Jones e Bartlett, Boston), seguida de transferência capilar para membranas de nylon. Marcaram-se sondas para trkB (lfl kb, abarcando o domínio da tirosina--cinase intracitoplasmática) e para o trkC (800 bp, abarcando o domínio da tirosina-cinase intracitoplasmática), por marcação aleatória de hexâmeros com 32P dCTP (Stratagene Prime It). Durante a noite hibridaram-se as membranas em tampão de fosfato de sódio 0,5, pH 7,9, contendo 1% de albumina de soro bovino, 7% SDS e 100 μ/ml de esperma sonicado de salmão a 65°C. As cargas foram rapidamente passadas por 2 x SSC e 0,1% de SDS e depois lavadas duas vezes em 1 x SSC e 0,1% de SDS e expostas a película de raio X durante uma semana. A quantificação dos níveis dos transcritos foi executada por varrimento densitométrico num densitómetro laser LKB.

74 584 6526-080-118 -45- 8.2. Resultados e Discussão 0 exame da expressão de trkB no corpo estriado de ratazana revelou que a expressão pode ser detectada no cérebro embriónico do 17a dia, com um aumento muito importante na expressão, que ocorre entre E17 e o dia pós-natal 1 (Figura 9). Observou-se um máximo na expressão no dia pós-natal 14. A expressão de ARNm de trkB foi detectada em neurónios (4 DIV) do corpo estriado de E17, cultivados, mas não em astrócitos (28 DIV) preparados a partir de corpo estriado PI ou de hipocampo Pl. A quantificação densitométrica dos níveis de transcritos (Figura 11) mostrou que a expressão do ARNm do trkB em P14 é 1,15 vezes mais elevada em relação aos níveis no cérebro inteiro do adulto. A expressão do ARNm do trkC foi detectada no corpo estriado de ratazana tão cedo quanto E17 (Figura 10). A expressão do ARNm do trkC alcança um máximo entre P7 e P20, onde se detecta um aumento de 1,5-1,9 vezes no nível do transcrito, em relação ao cérebro inteiro de ratazana adulta (Figura 12). A expressão decai fortemente na idade adulta. De modo semelhante ao da expressão do trkB, o ARNm do trkC expressa-se nos neurónios do corpo estriado cultivados (4 DIV) mas não nos astrócitos do corpo estriado ou do hipocampo (28 DIV). A expressão, corpo estriado de ratazana em desenvolvimento, do ARNm para trkB e trkC, sugere que o BDNF e a NT-3 podem actuar como factores tróficos no corpo estriado. 9. Exemplo: Efeito Comparativo da Neurotrofina-3 na Sobrevivên- cia e no Desenvolvimento da Neurite nos Neurónios Sensoriais Esoinais Localizados nos Gânalios

Lombares. Cervicais. Sacros e Toráxicos

Quando cultivados como explantes ou como culturas enriquecidas em neurónios dissociados, os neurónios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal do pinto (DRG) são responsivos em maior ou menor grau ao NGF, BDNF, NT-3, NT-4 e CNTF. Os neurónios DRG do embrião do pinto morrem nas primeiras 24 h se

74 584 6526-080-118 -46- colocados em cultura na ausência de qualquer factor neurotrófico. Cada um dos factores acima referidos pode apoiar a sobrevivência e o desenvolvimento de neurites de alguns destes neurónios, entre 10 e 60%, dependendo do factor, fase de desenvolvimento neuronal, etc. Parece que cada um dos referidos factores neurotróficos tem especificidades, tanto distintas como em sobreposição, em relação às subpopulações de neurónios DRG, ainda que não haja uma evidência nítida quanto aos subtipos de neurónios sensoriais que são apioados por cada factor neurotrófico. Este exemplo define a especificidade comparativa de NT-3, NGF e BDNF. 9.1. Materiais e Métodos 9.1.1. Culturas de Exolantes

Recolheram-se DRG de embriões de pinto em fases de desenvolvimento de E6 a E10. Começando na região sacra, recolheram-se gânglios dos lados direito e esquerdo, aos pares, ao longo de todo o eixo neural. Explantaram-se em matriz de gel de colagéneo 5 a 6 gânglios de cada nível ou misturas de gânglios sacros, lombares, toráxicos ou cervicais, (Lindsay e Peter, 1984, Neuroscience, 12.:45-51). Os gânglios foram cultivados em meio F14 + soro de cavalo a 5% na presença ou na ausência de 5 ng/ml de NGF, BDNF ou NT-3. Após 24 h mediu-se a extensão do desenvolvimento das fibras numa escala arbitrária de 0 a +5, representando 0 virtualmente nenhuma fibra, representando +5 um halo profuso de fibras (nível de saturação observado com NGF, o mais potente dos factores neste ensaio). 9.1.2. Culturas Enriquecidas em Neurónios Dissociados

Recolheram-se, separadamente, gânglios lombares e toráxicos, de embrião E8, dissociaram-se com 0,25% de tripsina e libertaram-se de células não neuronais (Lindsay, et al., 1985, Develop. Biol. 112:319-328). Os neurónios purificados foram semeados num substrato de poliornitina-laminina, a 8 000 neurónios por placa de 35 mm. Cultivaram-se as células na

74 584 6526-080-118 -47-presença de meio F14 contendo 5% de soro de cavalo. Estabeleceu-se a resposta a doses de 1 pg a 10 ng do NGF, BDNF ou NT-3. Após 48 h determinou-se, em culturas em triplicado, o número de neurónios com projecções (Lindsay, et al., 1985, Develop. Biol. 12:319-328). 9.2. Resultados e Discussão

Como se mostra na Figura 13, os efeitos do NGF sobre explantes DRG a partir de DRG E6, E8 ou E10, foram muito uniformes e independentes do nível do segmento: os gângliõs sacros, lombares, toráxicos e cervicais mostraram uma resposta igualmente elevada, com pontuação de 4 a 5, nos níveis de saturação do NGF (barras a branco na Figura 13). 0 BDNF foi menos potente do que o NGF, com pontuação 2-3, mas os efeitos do BDNF foram uniformes ao longo do eixo neural, mostrando os gângliõs sacros, lombares, toráxicos e cervicais, essencialmente a mesma resposta. Em contraste com o NGF e BDNF, os efeitos de NT-3 variaram de modo dependente do nível do segmento do DRG. Os gângliõs sacros e toráxicos mostraram apenas fraco desenvolvimento das fibras em resposta à NT-3, em todas as idades entre E6 e E10. Os gângliõs lombares e cervicais responderam muito mais à NT-3, sendo os gângliõs lombares os que melhor respondem, com pontuação de 3-4. Este efeito diferencial de NT-3 sobre os gângliõs lombares e cervicais comparado com o dos gângliõs sacros e toráxicos, foi semelhante em todas as idades estudadas.

Em condições mais exigentes de culturas enriquecidas em neurónios dissociados, obtiverem-se resultados semelhantes aos observados com explantes, como se mostra na Figura 14. 0 NGF apoiou a sobrevivência de uma percentagem semelhante de neurónios de DRG lombares ou toráxicos (40-50%). Ainda que o BDNF fosse menos eficaz do que o NGF, os efeitos do BDNF foram essencialmente os mesmos em relação aos neurónios lombares ou toráxicos - apioando a sobrevivência de cerca de 30% dos neurónios. Em contraste, a NT-3 apoiou a sobrevivência de 2,5 vezes mais os neurónios de DRG lombares (30%) do que os

74 584 L.

6526-080-118

-48- neurónios toráxicos.

Os DRG das expansões lombares e cervicais contêm mais neurónios sensoriais proprioceptivos de fibras grandes e de grande diâmetro do que os dos gânglios sacros ou toráxicos. Estes resultados indicam assim que a NT-3 tem actividade selectiva sobre os neurónios de DRG de grande diâmetro e grande fibra. 10. Exemplo: Indução de Proteína FOS após Tratamento com Neurotrofinas no Cerebelo in vitro 10.1. Materiais e Métodos 10.1.1. Dissociação e Cultura de Tecidos

Os cerebelos de ratazanas Sprague-Dawley adultas, de tempo de gravidez controlado, (Zivic-Miller, PA) foram retirados no dia 16 de gestação (E16) e dissecados, em gelo, e libertos dos tecidos circundantes, os cerebelos de 3-4 crias da mesma idade, determinada pelo comprimento da ponta da cabeça às nádegas, foram misturados e lavados três vezes em F 10 de Ham, frio, suplementado com meio de Hepes 25 mH e L-glutamina, antes de serem moídos numa placa de 35 mm de cultura de tecidos. Obteve-se uma única suspensão de células incubando o tecido com tripsina a 0,25% (GIBCO) em F 10 de Ham, durante 15 min a 37°C. A suspensão de células foi depois transferida para uma solução inibidora de tripsina, contendo meio de crescimento (ver abaixo) e 50 μg/ml de desoxirribonuclease tipo I (Sigma). Após 5 min de inactivação à temperatura ambiente, as células foram dissociadas em meio de crescimento BME (GIBCO) suplementado com 6 g/1 de glucose (Sigma), 5% de soro de cavalo (GIBCO), 1% (v/v) de aditivos N2 (Bottenstein, 1983 em "Advances in Cell. Neurobiol. Vol. 4, Federoff e Hertz, eds., Academic Press, New York, pag. 333-379), 0,5% (v/v) de glutamina (2 mM, GIBCO) e 0,25% (v/v) de penicilina-estreptomicina (10 U/ml e 10 /ig/ml respectivamente, GIBCO), fazendo passar, repetidamente, os fragmentos por uma ponta afilada de uma pipeta de Pasteur. Recolheram-se as sus- 74 584 6526-080-118 49

pensões de células únicas após três triturações e depois centri-fugaram-se por 2 vezes a 55 x g durante 45 segundos. As pelotas de células soltas foram juntas e ressuspensas em meio de crescimento. Avaliou-se a densidade e viabilidade das células usando, respectivamente, um hemocitómetro e coloração pelo azul de tri-pano. Diluiram-se as células até aproximadamente 106 células/ml e colocaram-se em placa, em meio de crescimento (ver acima) em placas de cultura de 24 poços (Falcon) pré-revestidas com poli-ornitina (10 Mg/ml, Sigma) e laminina (10 /xg/ml). Trocou-se o meio por meio de crescimento isento de soro (meio definido) 5-6 h depois da colocação na placa e depois mudou-se após 4 dias. Mantiveram-se as células em ambiente humidificado com 5% C02, a 37°C, durante 8 dias. A densidade usada na placa nas experiências do presente estudo foi de 1500-1600 células/mm2.

10.1.2. Imuno-histocfuímica FOS

As células foram tratadas durante 30-300 min com BDNF, NT-3 ou NGF, a uma concentração de 0,1-1 ng/ml no fim do período de cultura. As células foram enxaguadas uma vez por BME e pré-fixadas durante 10 min em 2% paraformaldeído em BME antes da fixação à temperatura ambiente em 4% de paraformaldeído em PBS durante 30 min. Após permeabilização com 0,1% de triton durante 10 min e de bloqueamento em 10% de soro normal de cabra (NGS) e 1% de bsa durante 90 min, as células foram incubadas durante 2 dias a 4°C com anticorpo anti-FOS (Oncogene) diluído a 1/2000 em PBS com 5% NGS. Depois de várias lavagens em PBS, incubaram-se as culturas com IgG de cabra anti-coelho, biotina-do, (Vector lab, ABC-Elite Kit), a 1/1000 em PBS com 1% de NGS durante 90 min à temperatura ambiente. 0 complexo ABC foi diluído a 1/200 em PBS e incubado durante 40 min. Como substrato usou-se o hidrocloreto de 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma) a uma concentração final de 0,3 mg/ml em acetato 0,2 M/imidazolo lOmM/tampão de NiS04 80mM. 10.2 Resultados A neurotrofina-3 e o BDNF induziram expressão de proteína 74 584 6526-080-118 -50-

C-FOS, em modo dependente da dose, ao longo do tempo em cultura (Figura 15 e Figura 16, respectivamente). Após 150 min obteve-se o número máximo de células manchadas quanto à proteína C-FOS. Contudo não se obteve resposta após tratamento com NGF (Figura 17). 11. Exemplo: Efeito da Neurotrofina-3 em Culturas Mesencefál i cas Ventrais de E14

Este exemplo mostra a eficácia da neurotrofina-3 no apoio à sobrevivência ou na expressão de marcadores fenotípicos de populações neuronais tanto dopaminérgicas como de GABA, presentes no desenvolvimento da substância negra. 11.1. Materiais e Métodos 11.1.1. Dissociação e Cultura de Tecidos A preparação de culturas do cérebro de ratazana E14 realizou-se como foi descrito por Hyman, et al., 1991, Nature 350:230-233. Resumidamente, todas as culturas foram preparadas a partir do mesencefalo ventral dissecado, de ratazanas embriónicas de 14 dias de idade (Έ14). Normalmente, os tecidos misturados de 2 ou 3 crias de embriões de ratazana, de ratazanas Sprague Dawley acasaladas em tempo controlado, foram tripsinizados (0,125%; Worthington) em meio F12 (GIBCO) durante 20 min a 37°C. Depois de lavados em meio de crescimento contendo de 7,5% FCS, os tecidos foram centrifugados a baixa velocidade durante 5 min e a pelota foi dissociada por trituração. Depois de permitir que os aglomerados de células não dispersas assentassem durante 1 a 2 min, a suspensão de células isoladas foi semeada sobre placas de 35 mm (pré-revestidas com poliornitina e laminina) contendo meio de crescimento, de modo a obter-se uma densidade de 5 x 104 células cm“2. Após uma incubação durante a noite em meio MEM suplementado com glutamina (2 mM) , glucose (6 mg/ml), penicilina G (0,5 U/ml), estreptomicina (5 j^g/ml) e FCS (7,5%) para permitir a fixação das células, as células foram cultivadas na presença ou na 74 584 6526-080-118 © Μ \.r* -r- ' Íhbh8S£ -/ -51- & ausência de BDNF em meio definido isento de soro (Hyman, et al., 1991, Nature 350:230-232) excepto em que a insulina foi incluída a 20 ng/ml. Para visualizar as células dopaminérgicas, fixaram-se as culturas com paraformaldeído a 4%, lavaram-se intensamente, permeabilizaram-se com 0,02% saponina em tampão de Sorensen com 1,5% de soro de cavalo, e marcaram-se com um anticorpo monoclonal de ratinho para ratazana TH (Boehringer-Mannheim). A ligação anticorpo principal foi visualizada usando um conjunto de Vectastain ABC (Vector Labs).

11.1.2. Ensaio da Actividade do Enzima GAP A actividade do enzima GAD foi determinada de acordo com o método de Kimura e Kuriyama (1975, Jpn. J. Pharm. 25:189-195). medindo a libertação de 14C02 do ácido L-[1-14C] glutâmico. Células em placas de 35 mm foram lisadas com 30 μΐ de uma solução contendo KH2P04 50 mM (pH 7,2) e 0,25% de Triton X-100, raspadas e recolhidas. Cinco microlitros do lisado de células foram ensaiados quanto à actividade do enzima GAD. Num ensaio típico, a mistura reaccional continha 0,57 mM de ácido L-[l-14C] glutâmico (NEN, NEC-715, 52,6 mCi/mmol), ácido glutâmico (3 mM), fosfato de piridoxal (0,2 mM) e AET (1 mM), num tampão de KH2P04 (50 mM, pH 7,2). Nestas condições de reacção, verificou-se que a reacção enzimática era linear até às 2,5 h. A incubação prosseguiu durante um período de 2 h a 37 °C e terminou pela injecção de 25 μΐ de H2S04 8N na mistura reaccional. Continuou-se então a incubação durante mais 60 minutos. O 14CQ2 libertado foi capturado em solução básica de Hyamine e foi contado.

11.1.3. Ensaio da Incorporação de GABA/DA A incorporação simultânea de GABA e DA foi medida no seguinte tampão de incubação: NaCl 125 mM, KC1 5 mM, glucose 5,6 mM, CaCl 1 mM, KH2P04 1,2 mM, MgS04 1,2 mM, HEPES 25 mM, ajustado a pH 7,4 e armazenou-se à temperatura ambiente. No dia da utilização, levou-se o tampão de incubação a conter pargilina 100 nM, ascorbato 1 mM, ácido aminooxiacético 10 nM e beta-ala-

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74 584 6526-080-118 -52- nina 2 mM. Dividiu-se o tampão em 4 alíquotas, das quais duas foram levadas a conter mesilato de benzotrofina (BZT) 5 nM e ácido 2 ,4—diamino-n—butirico (DABA) 1 mM. Duas aliquotas (+ e - BZT e DABA) foram aquecidas a 37 °C e as duas restantes foram guardadas num frigorífico. Cada grupo de tratamento estava em 5 placas de 35 mm, três das quais foram marcadas com (-) e duas (+). Todas as placas de cultura foram lavadas uma vez com tampão de incubação e uma vez com tampão aquecido contendo +/-BZT e DABA conforme apropriado. A cada placa de cultura juntou-se 0,8 ml de tampão +/- BZT e DABA antes de incubar a 37 °C durante 5 min; seguiu-se a adição de 0,2 ml de 3H-DA (concentração final de 50 nM) e de 14C-GABA (concentração final de 500 nM). A incorporação de 3H-DA + 14C-GABA foi deixada prosseguir a 37°C durante 15 min. As placas de cultura foram então colocadas em gelo e a solução de incubação foi retirada por aspiração. As placas de cultura foram depois lavadas 3 x com solução de incubação, fria, (+/- BZT e DABA) e uma vez com o PBS padrão, frio. A cada amostra juntaram-se 0,5 ml de NaOH 0,5 N e incubaram-se as amostras à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h, após o que se juntou toda a amostra a 10 ml de Ultima gold e se contou 3H e 14C no programa #15 de um contador de cintilações Packard.

As culturas foram lavadas 3 x com um tampão de incubação com a seguinte composição: pargilina 100 /iM, ascorbato 1 mM, ácido aminooxiacético 10 μΜ e beta-alanina 2 mM. As culturas foram depois pré-incubadas durante 5 min a 37 °C em tampão de incubação; culturas em replicado foram pré-incubadas em tampão contendo adicionalmente benzotrofina 5 μΚ (BZT) e ácido 2,4--diamino-n-butírico (DABA) 1 mM. Juntou-se depois 3H-DA 50 nM e 14C-GABA 500 nM, durante 15 min a 37°C. Parou-se a incorporação de marcador colocando as placas em leito de gelo e lavando com tampão gelado. Solubilizaram-se as amostras com NaOH 0,5 N e mediu-se 3H e -*-4C por contagem de cintilação líquida. A incorporação específica foi definida como a diferença entre a incorporação medida na ausência de BZT e DABA (total) e a incorporação medida na presença de BZT e DABA. 74 584 6526-080-118 -53-

Os marcadores dopaminérgicos foram também analisados por manchamento imunocitoquímico quanto à tirosina-hidroxilase (Hy-man, et al., 1991, Nature 350;230-233). 11.2. Resultados e Discussão

Realizou-se um teste de resposta à dose de NT-3 para determinar se as células cultivadas na presença deste factor mostrariam uma maior sobrevivência de neurónios dopaminérgicos no decurso de 7 dias in vitro (Figura 18). O tratamento de culturas com NT-3 provocou uma elevação de aproximadamente 2,5 vezes no número de neurónios dopaminérgicos (detectados por mancha com anticorpo para TH) após 7 dias in vitro. Este efeito foi saturável a uma concentração de 5 /xg/ml. Às concentrações de 25 e 50 ng/ml, o efeito era significativamente reduzido.

Quando a incorporação de 3H-DA, de alta afinidade, foi medida num teste de resposta à dose de NT-3, houve um aumento de aproximadamente 2 vezes nesta actividade, após tratamento de culturas com NT-3 durante 7 dias in vitro (Figura 19). Este efeito teve um perfil de resposta à dose semelhante ao da experiência de manchamento imunocitoquímico com TH acima descrito.

Para determinar se o tratamento das culturas com a NT-3 exerce efeitos sobre outras populações de neurónios que não as células dopaminérgicas, realizaram-se ensaios que avaliam a actividade e/ou sobrevivência dos neurónios GABAérgicos. Culturas que tinham sido expostas a concentrações variáveis de NT-3 durante um período de 7 dias in vitro. foram processadas para se medir a incorporação de GABA de alta afinidade e a actividade do GAD. A NT-3 induziu um efeito máximo de um aumento de 2,8 vezes na actividade de incorporação de 3H-GABA, quando incluída no meio de cultura a uma concentração de 20 ng/ml, durante um período de 7 dias in vitro (Figura 20).

& 74 584 6526-080-118 -54-

Quando se mediu a actividade do enzima GAD em culturas expostas a concentrações variáveis de NT-3 durante 7 dias, obteve-se um aumento máximo de 2,3 vezes em culturas mantidas na presença de 50 ng/ml de NT-3 (Figura 21).

Este exemplo mostra que a NT-3 afecta as populações neuronais dopaminérgicas e CABAérgicas na substância negra embriónica da ratazana. No caso do sistema dopaminérgico, os resultados mostram efeitos semelhantes de aumento nos ensaios conduzidos para examinar as actividades de marcadores fenotípicos independentes indicando que a NT-3 actua com actividade promotora da sobrevivência destes neurónios. No caso da população de neurónios GABAérgicos, há um aumento mais pronunciado na actividade da incorporação de GABA, de alta afinidade, do que o observado na medição da actividade do GAD. Este conjunto de dados sugere que a NT-3 possa estimular a actividade de incorporação de GABA das células (uma medida da sua actividade metabólica) independentemente de exercer o seu efeito sobre a actividade do GAD. 12. Exemplo: Efeito da Neurotrofina-3 na Actividade da Colina-acetiltransferase (CAT) em Culturas E17 de Neurónios Colinérqicos Septais da Ratazana 12.1. Materiais e Métodos 12.1.1. Dissociação e Cultura de Tecidos A região septal de ratazanas Sprague-Dawley após 17, dias de gestação, foi dissecada tornando-a livre dos tecidos circundantes. Os fragmentos do tecido foram misturados, lavados 3 x com F—10 de Ham e depois transferidos para uma placa de cultura de tecidos, de 35 mm, e moídos. Preparou-se uma suspensão de células únicas incubando o tecido com 0,25% de tripsina durante 20 min a 37°C. Após inactivação da tripsina por uma incubação de 5 min à temperatura ambiente, em meio de crescimento (abaixo), contendo 50 μg/ml de desoxiribonuclease tipo 1 (Sigma), as células foram dissociadas fazendo passar os

74 584 6526-080-118 -55-fragmentos repetidamente pela ponta afilada de uma pipeta de Pasteur. As células dissociadas foram depois centrifugadas a 500 x g durante 45 segundos. Removeu-se o sobrenadante e recentrifugou-se. As pelotas de células soltas foram ressuspensas e combinadas em meio de crescimento, e determinou-se o rendimento em células usando um hemocitómetro. Finalmente, as células foram colocadas em placas de poços de 6 mm que tinham sido revestidos com poliornitina (10 Mg/ml) e laminina (10 /ig/ml). A viabilidade das células foi verificada, após 24 h em cultura, pela capacidade das células excluírem o azul de tripano. 0 meio normal de crescimento, 5HS/N3, para as culturas compostas de neurónios e de glia continham: 5% (v/v) de soro de cavalo (Gibco), 1% de aditivos N3 (v/v) (Romijn, et al., 1982, Dev. Brain Res. 2:583-589), 0,5% (v/v) de glutamina (200 mM, Gibco) e 0,25% (v/v) de penicilina-estreptomicina (10 000 unidades/ml, 10.000 mcg/ml, respectivamente, Gibco) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Prepararam-se culturas enriquecidas de neurónios por substituição do meio de crescimento, 5 a 6 h após colocação na placa, por DMEM contendo: 1% de aditivos N3, 0,5% de glutamina e 0,25% de penicilina e estreptomicina. Em ambas as condições, usou-se o tratamento com citosina-arabinósido (1 μΜ durante 24 h) para limitar a proliferação de células gliais. 12.1.2. Ensaio da Actividade da Colina-acetiltransferase

Removeu-se o meio de crescimento das culturas clonando as células duas vezes por 100 μΐ de PBS. As células foram lisadas por um ciclo de congelação-descongelação e por ima incubação por 15 min a 37°C em 50 mM ΚΗ2Ρ04, pH 6,7, contendo NaCl 200 mM e 0,25% (v/v) de Triton X-100. Retiraram-se dois microlitros do lisado de células e ensaiaram-se quanto à actividade de CAT, de acordo com o processo micro-Fonnum (Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24.:407-409). A composição final do substrato consistia em [:L4C] Acetil-CoA 0,2 mM (NEN, 54,4 mci/mmol), NaCl 300 mM, brometo de colina 8 mM, ácido etilenodiaminotetraacético 20 mM e 74 584 6526-080-118 -56-

neostigmina 0,1 mM em tampão NaH2P04 50 mM (pH 7,4). Nestas condições de enzima e de substrato, a reacção enzimática foi linear durante 90-120 min. Ensaiou-se a especificidade da indução para a colina-acetiltransferase pela adição de um inibidor específico da actividade de CAT, o N--hidroxietil-4-(l-naftilvinil)pirídio (HNP), durante o ensaio (White e Cavallito, 1970, J. Neurochem. 17:1579-1589). 12.2. Resultados A neurotrofina-3 aumentou ligeiramente o nível de actividade da CAT, após um período de 7 dias de tratamento, a uma concentração de 100 ng/ml (Figura 22). 13. Exemplo: Transporte Axonal Retrógrado da Γ125Ι1ΝΤ-3 nos

Neurónios Sensoriais 0 fundamento lógico para a determinação do transporte retrógrado de NT-3 em neurónios que respondem à NT-3, deriva de estudos que mostram que a neurotrofina relacionada, o factor de crescimento dos nervos (NGF), é um factor de sobrevivência derivado do alvo, transportado retrogradamente, para os neurónios sensoriais e simpáticos periféricos (Thoenen e Barde, 1980, Physiolog. Rev. .60.:1284). Estudos quantitativos do transporte retrógrado de NGF exógeno (Hendry, et al., 1974, Brain Res. £8.:103) e endógeno (Korsching e Thoenen, 1983, Neurosci. Lett. 39:1) mostraram que o transporte é específico e saturável. A elucidação dos mecanismos de transporte de NT-3 e de neurotrofinas aparentadas, farão compreender melhor (1) as vias de administração de NT-3 e (2) as classes específicas de neurónios que podem responder à NT-3 no decorrer da regeneração ou na degenerescência patogénica. 13.1. Materiais e Métodos 13.1.1. Tratamentos em Animais

Ratazanas macho Sprague-Dawley (200-250 g) foram

74 584 6526-080-118 -57-anestesiados com uma mistura de hidrato de cloral e pentobarbital. 0 nervo ciático direito foi exposto e nele se fez um esmagamento a 0,3 cm de distância do tendão do músculo interno obturador. Injectou-se [-^5χ]NT-3 no local do esmagamento com uma seringa de Hamilton, num volume de 2 μΐ ao longo de um período de tempo de 2 min. As feridas foram suturadas e os animais deixados recuperar durante 18 h. Nesta altura sacrificaram-se as ratazanas, removeram-se o 4a e o 5a (L4 e L5) gânglios da raiz dorsal (DRG), do lado direito (ipsilateral) e do lado erquerdo (contralateral), imergiram-se em 1% de SDS e foram contados durante 1 min num contador gama. Num outro grupo de animais os gânglios foram excisados e fixados por imersão em 4% de paraformaldeído, para processamento dos DRG para autorradiografia. Os resultados quantitativos são expressos em cpm nos DRG L4 mais L5 e comparados com o cpm de L4, L5 cpm no lado não injectado. 13.1.2. Preparação de Neurotrofina Marcada com Γ125Ι1

Seis a 10 /íg de NT-3 purificada foram iodados pelo método da lactoperoxidase (Marchalonis, 1969, Biochem. J. 113:299-305). A incorporação de iodo foi rotineiramente de 70 a 80% e as actividades específicas variaram entre 150-200 cpm/pg. A NT-3 foi tratada em 1,0% de BSA contendo 0,01% de sulfato de protamina em solução salina tamponada com fosfato. 13.2. Resultados A [125I]NT-3 mostrou ser transportada retrogradamente do nervo ciático esmagado de ratazana adulta para os DRG L4, L5 (Figura 23). O transporte foi específico pois que um excesso de 100 vezes de NT-3 não marcada foi capaz de bloquear 80-90% do transporte. É interessante notar que o transporte de NT-3 foi apenas parcialmente inibido por um excesso de 100 vezes de BDNF ou de NGF, o que indica um componente de transporte específico para a NT-3, que não é sensível às outras neurotrofinas.

74 584 r» 5>>- .

6526-080-118 -58- '-1 14. Exemplo: Uso do Transporte Axonal Retrógrado da NT-3 para

Controlar o Défice de Neurónios Sensoriais em Ratazanas Tratadas com Piridoxina 14.1. Materiais e Métodos 14.1.1. Tratamento em Aninais

Aa ratazanas-fêmea Sprague-Dawley (200-250 g) administra-ram-se 800 mg/kg de piridoxina-HCl, intraperitonealmente, diariamente durante 12 dias. Depois das injecções as ratazanas foram anestesiados com hidrato de cloral (170 mg/kg) misturado com pentobarbital (35,2 mg/kg). 0 nervo ciático direito foi exposto e injectaram-se 2 μ.1 de NT-3 ou BDNF ou NGF marcados com [125I] , no nervo ao nivel do tendão interno obturador. Suturaram-se as feridas e deixaram-se as ratazanas recuperar durante 18 h. Nesta altura, as ratazanas foram mortas por decapitação e retiraram-se os gânglios da raiz dorsal (DRG) 4a lombar (L4) e 5 a dorsal, e colocaram-se em 4% de paraformaldeído. 0 segmento da medula espinal L4-L5 foi também dissecado e contado em fixador. As amostras foram contadas num contador gama durante 1 min e determinadas as contagens por minuto dos DRG L4 e L5. 14.1.2. Preparação de Neurotrofina Marcada com Γ125Ι1 A NT-3, BDNF e NGF foram purificados e radio-iodados usando o método da lactoperoxidase. 0 iodo livre foi removido de cada preparação por diálise. As actividades específicas das neurotrofinas marcadas com [125I] variavam entre 2800-5800 cpm/fmol. Todas as proteínas marcadas com [125I] eram 90-99% tão activas como as suas congéneres não marcadas tal como avaliado no ensaio de desenvolvimento de neurite nos DRG de pinto E8. 14.2. Resultados e Discussão A Figura 24 mostra que todas as três neurotrofinas marcadas foram transportadas para os DRG ipsilateral (direito) mas não

74 584 6526-080-118 -59-contralateral (esquerdo) quando injectadas nos nervos ciáticos direitos de ratazanas de controlo. A Figura 24 mostra também que o transporte da [125I]NT-3 e [12^I]BDNF nos DRG, foi reduzido de 71% e 60%, respectivamente, em ratazanas tratadas com piridoxina (p < 0,01). Não se observou alteração significativa para o [125I]NT-3 em ratazanas tratadas com piridoxina. É interessante notar, que o transporte de NT-3 e BDNF não foi significativamente alterado nas medulas espinais das ratazanas tratadas com piridoxina quando comparados com os controlos (Figura 25).

Os resultados demonstram que o exame do transporte retrógrado das neurotrofinas pode dar pistas de diagnóstico dos mecanismos degenerativos neurais subjacentes em neuropatias periféricas, quer sejam induzidos quimicamente (como no caso presente), mecânica ou geneticamente. 15. Exemplo: Transporte Retrógrado da f125I]NT-3 no Sistema Nervoso Central 15.1. Materiais e Métodos 15.1.1. Tratamentos em Animais

Ratazanas macho Sprague-Dawley foram anestesiadas com hidrato de cloral/pentobarbital e fixadas num dispositivo estereotáxico. injectaram-se pequenos volumes de factores tróficos (0,2-0,5 μΐ), marcados com [125I], lentamente no hipocampo ou neoestriado por meio de uma micropipeta de vidro de boro-silicato. Injectaram-se quantidades equivalentes de [125i]ngf em animais de controlo para verificar a especificidade dos padrões de transporte no SNC. Fecharam-se as feridas e deixaram-se os animais recuperar. Aproximadamente 24 h mais tarde, os animais foram sacrificados, os cérebros retirados, áreas específicas do SNC excisadas e contadas durante 1 min num contador gama. Noutras experiências, os animais foram submetidos a perfusão, os cérebros retirados, seccionados e processados para autorradiografia por película e emulsão. As injecções no

.A .A (í)

74 584 6526-080-118 -60-hipocampo foram centradas na região da fáscia dentada/CA4-hilar. As injecções no corpo estriado foram localizadas centralmente no caudado putâmen rostral. 15.1.2. Preparação de Neurotrofina Marcada com C125I] A neurotrofina-3 foi radio-iodada como acima se descreveu na Secção do Exemplo 14.1.2. 15.2 Resultados e Discussão

Experiências envolvendo microdissecações e contagens (Tabela 4) indicam que, como previamente se demonstrou para o NGF, a NT-3 é transportada retrogradamente do hipocampo para os neurónios do septo médio/banda diagonal, ainda que proporcionalmente fossem transportadas muito menos contagens para a NT-3 do que para o NGF. Experiências de autorradiografia por película e emulsão (Tabela 5) mostraram que a marcação associada a ambos os factores neurotróficos estava bem localizada nos neurónios magnocelulares do septo médio e da banda diagonal, células que são conhecidas por fornecerem a entrada ("input") colinérgica ao hipocampo. Os neurónios magnocelulares estavam muito densamente marcados e eram bastante mais numerosos em animais injectados com NGF em comparação com os animais injectados com NT-3. Contudo, verificou-se que a NT-3 também era transportada por uma população de neurónios mais pequenos no septo médio/banda diagonal. A marcação associada ao NGF transportado localizou-se exclusivamente nos neurónios que eram imunorreactivos com a co-lina-acetiltransferase (CAT) e com o receptor de NGF de baixa afinidade (LNGFR), o que confirma a identidade destas células como colinérgicas. Identicamente ao NGF, a NT-3 foi também transportada por grandes neurónios colinérgicos no septo médio/banda diagonal. Contudo, as células mais pequenas que transportaram a NT-3, mas não o NGF, eram imunonegativas para os marcadores colinérgicos acima referidos. Esta observação indica que os núcleos do septo médio/banda diagonal contêm uma

74 584 6526-080-118 -61-população de neurónios não colinérgicos que podem responder à NT-3 mas não ao NGF.

Experiências envolvendo microdlssecações e contagens (Tabela 4) indicam que o NGF e a NT-3 são transportados do corpo estriado para o mesencéfalo ventral, a região do cérebro que contém a substância negra. Esta observação é nova no que se refere a ambos os factores tróficos. O exame de autorradiogramas em filme apoia esta conclusão, mostrando nitidamente áreas circunscritas de maior densidade cobrindo a substância negra. Contudo, o padrão de distribuição do marcador associado ao NGF e NT-3 é nitidamente diferente dentro desta estrutura. Nas experiências onde se injectou NGF, os grânulos de prata distribuiram-se difusamente pela parte reticulada da substância negra, indicando transporte anterógrado deste factor trópico. Após as injecções de NT-3, localizaram-se agregados de grânulos de prata sobre os corpos das células neuronais na parte compacta, indicando que a NT-3, mas não o NGF, era transportada retrogradamente por estas células. Virtualmente todas as células que transportaram NT-3 eram imunorreactivas com tirosina--hidroxilase, um marcador de neurónios dopaminérgicos da parte compacta. 0 exame de autorradiogramas de película e emulsão mostram nitidamente que o NGF e a NT-3 são transportados para regiões do cérebro que anteriormente se não suspeitava conterem neurónios sensíveis a estes factores trópicos.

Para o NGF, estas novas áreas parecem ser bastante limitadas. Actualmente, além das áreas acima referidas, observámos transporte de NGF apenas para o núcleo supramamilar do hipotálamo, após injecções no hipocampo.

Por outro lado, a NT-3 foi transportada para vários outros locais do prosencéfalo de ratazana, como no caso do NGF, demonstrámos o transporte de NT-3 radiomarcada para o núcleo supramamilar, mas aqui o padrão de marcação é mais intenso do que é aparente para o NGF. Além disso, a NT-3 foi transportada

74 584 6526-080-118 -62-para certas regiões do cérebros que não parecem de modo algum transportar NGF. Após injecções na fáscia dentada do hipocampo, encontravam-se presentes bilateralmente algumas células marcadas no CA4/hilus (Tabela 5). Eram também aparentes células marcadas retrogradamente no tálamo dorsal (intralaminar e parafasicular/núcleos posteriores) após injecções no corpo estriado.

Tabela 4

CONTAGENS DE NT-3 E NGP RADIO-IODADOS EM REGIÕES ESPECÍFICAS DO CÉREBRO

Inieccões no HiDocamoo Factor HPC(r) HPC(l) MS/DB(r) MS/DB(l) Cerebelo Trófico NGF T-9 401721 1106 2381 1835 136 NT-3 T-16 739701 557 193 37 14 Inieccão no CorDO estriado Factor CorDO Estriado CorDO estriado V.Mes. V.Mes Cerebelo Trófico (r) (r) (r) (l) NGF T-24 588004 269 2041 94 64 T-25 652932 131 1868 137 35 NT-3 T-18 909235 67 1398 80 73 T-21 810140 133 1328 50 99 HPC, hipocampo dorsal; MS/DB, septo médio/banda diagonal de Broca; V.Mes., mesencéfalo ventral; r, lado direito; 1. lado esquerdo. Todas as injecções (no corpo estriado e no hipocampo) foram efectuadas no lado direito do cérebro. Números com o prefixo T, na coluna do factor trófico, são números de código de 74 584 6526-080-118 r . . -63- •'/C/ /./ animais. Todos os outros números representam cpm na área indicada do cérebro. Tabela 5 MARCAÇÃO NEURONAL RETRÓGRADA-INJECÇÕES NO HIPOCAMPO DE NGF E NT-3 RADIO-IODADOS Área do Cérebro NGF NT-3 Prosencéfalo Basal Septo médio ++++ ++ Banda Diagonal (v) ++++ ++ Banda Diagonal (h) ++ + Nuc. Basal Meynert + — Hipocampo Hilus/CA 4 - ++ CA 1 - - CA 2 - - CA 3 - + Fáscia Dentada ? 7 Subículo - - Hilus/CA 4 - + (contra) Outros Núcleo ++

Supramam.

Os resultados acima indicados derivam de 6 experiências de autorradiografia em emulsão. Sinais "+" representam números relativos de células marcadas numa certa área, indicando desde ,,++++H muitas células marcadas, até ,,+n algumas células. O sinal indica que não se observaram células marcadas. 0 sinal "?" indica áreas difíceis de avaliar, dada a sua proximidade do local da injecção. Várias publicações são aqui citadas, e são aqui incorporadas na sua totalidade para referência. -64” 74 584 6526-080-118

Lisboa, 12. 1992

Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Claims (30)

1. 74 584

   tf . 6526-080-118 -1- REIVINDICAÇÕES 1 - Uso de NT-3 que promove a sobrevivência, crescimento ou diferenciação das células do sistema nervoso que expressam o receptor de NT-3, caracterizado por ser para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença ou desordem do sistema nervoso.
2. 2 - Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do núcleo anterior do bulbo olfactivo.
3. 3 - Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso das camadas superficiais do neocórtex.
4. 4 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do núcleo do tracto olfactivo lateral.
5. 5 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso da faseia dentada.
6. 6 - Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do CAI, CA3 ou CA4 do hipocampo.
7. 7 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do putâmen caudado.
8. 8 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso que são neurónios sensoriais.
9. 9 - Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os neurónios sensoriais estarem localizados na medula espinal 74 584

   6526-080-118 cervical.
10. 10 - Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os neurónios sensoriais estarem localizados na medula espinal lombar.
11. 11 - Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado por a desordem ser a doença de Alzheimer, doença de Pick ou doença de Jacob-Creuzfeldt.
12. 12 - Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a desordem ser causada por uma lesão cerebral.
13. 13 - Uso de acordo com a reivindicação 1/ caracterizado por a desordem ser a doença de Huntington ou síndromes Parkinson mais.
14. 14 - Uso de um anticorpo neutralizante anti-NT-3 que inibe a sobrevivência, crescimento ou diferenciação das células do sistema nervoso que expressam o receptor de NT-3, por contacto do NT-3 nativo com o referido anticorpo, caracterizado por ser para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença ou desordem do sistema nervoso.
15. 15 - Uso de molécula de ribozima ou anti-sentido que inibe a sobrevivência, crescimento ou diferenciação das células do sistema nervoso que expressam o receptor de NT-3, por distribuição à fonte celular de produção de NT-3 nativo, inibindo a expressão de NT-3 nativo, caracterizado por ser para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença ou desordem do sistema nervoso.
16. 16 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do núcleo anterior do bulbo olfactivo.
17. 17 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema -3- 74 584 / j 6526-080-118 nervoso das camadas superficiais do neocórtex.
18. 18 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracteri-zado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do núcleo do tracto olfactivo lateral.
19. 19 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso da faseia dentada.
20. 20 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caractéri-zado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do CAI, CA3 ou CA4 do hipocampo.
21. 21 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por a doença ou desordem envolver células do sistema nervoso do putâmen caudado.
22. 22 - Uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracteri-zado por a doença ou desordem ser um neoplasma.
23. 23 - Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o neoplasma ser um tumor maligno,
24. 24 - Processo para analisar a distribuição de receptores de NT-3 em tecido neurológico caracterizado por compreender: (a) contactar o tecido neurológico com um composto detectável que se liga especificamente ao receptor de NT-3; e (b) determinar a ligação do composto de NT-3 detectável ao tecido neurológico, indicando a ligação a presença de receptores de NT-3 no tecido neurológico.
25. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto detectável ser NT-3 marcado com um isótopo radioactivo, um composto radio-opaco, um flúor ou um enzima.
26. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o composto detectável ser um anticorpo marcado com um -4- 74 584 6526-080-118 isótopo radioactivo, um composto radio-opaco, um flúor ou um enzima.
27. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 24r caracteri-zado por ser conduzido numa amostra de biópsia ou de autópsia.
28. 28 - Processo para analisar a expressão de NT-3 em tecido neurológico caracterizado por compreender: (a) contactar o tecido neurológico com um composto detectável que se liga especificamente a NT-3; e (b) determinar a ligação do composto detectável ao tecido neurológico, indicando a ligação a expressão de NT-3 pelo tecido neurológico.
29. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o composto detectável ser um anticorpo marcado com um isótopo radioactivo, um composto radio-opaco, um flúor ou um enzima.
30. 30 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por ser conduzido numa amostra de biópsia ou de autópsia. Lisboa, 12. 1992 Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -